MX2012010728A - Composiciones de anticuerpos de factor de anti-crecimiento de nervios (ngf). - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones estables de anticuerpos anti-NGF y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y sus usos en la prevención y/o tratamiento de varias enfermedades y desórdenes en los cuales la actividad de NGF es perjudicial, por ejemplo en desórdenes de dolor.

Description

COMPOSICIONES DE ANTICUERPOS DE FACTOR DE ANTI- CRECIMIENTO DE NERVIOS ÍNGF) Solicitud relacionada Esta solicitud reclama la prioridad a la solicitud de patente estadounidense provisional no. 61/314,984, presentada el 17 de marzo de 2010, cuyos contenidos son incorporados en la presente por referencia.

Antecedentes de la invención El factor de crecimiento de nervios (NGF) es una proteína secretada que fue descubierta hace alrededor de 50 años como una molécula que promueve la supervivencia y diferenciación de neuronas sensoriales y simpatéticas. La cadena beta de NGF es únicamente responsable de la actividad estimulante de crecimiento de nervios de NGF. La cadena beta homodimeriza y es incorporada en un complejo de proteína más grande. El NGF es un miembro de una familia de factores neurotróficos conocido como neurotrofinas. La estructura y función de NGF es revisada en, por ejemplo, Sofroníew, M.W. et al. (2001) Annu. Rev. Neurosci.24:1217-1281; Weismann, C. y de Vos, A.M. (2001) Cell. Mol. Life Scie. 58:748-759; Fahnestock, M. (1991) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 165:1-26.

Aunque NGF fue identificado originalmente por su capacidad para promover la supervivencia y diferenciación de las neuronas, existe evidencia creciente que estos efectos en desarrollo son solo un aspecto de la biología de NGF. En particular, NGF ha sido implicado en la transmisión y mantenimiento de dolor persistente o crónico. Por ejemplo, se ha mostrado que tanto la administración local como sistémica de NGF provocan hiperalgesia y alodinia (Lewin, G.R. et al. (1994) Euro. J. Neurosci. 6:1903-1912). La infusión intravenosa de NGF en humanos produce una mialgia de cuerpo entero mientras que la administración local evoca hiperalgesia y alodinia de sitio de inyección además de los efectos sistémicos (Apfel, S.C. et al. (1998) Nuerology 51:695-702). Adicionalmente, en ciertas formas de cáncer, el NGF en exceso facilita el crecimiento e infiltración de las fibras de nervios con inducción de dolor de cáncer (Zhu, Z. et al. (1999) J. Clin. Oncol. 17:241-228).

El involucramiento de NGF en dolor crónico ha conducido a interés considerable en aproximaciones terapéuticas con base en inhibir los efectos de NGF (ver, por ejemplo, Saragovi, H.U. y Gehring, K. (2000) Trends Pharmacol. Sci. 21:93-98). Por ejemplo, una forma soluble del receptor de TrkA se usó para bloquear la actividad de NGF, la cual mostró reducir significativamente la formación de neuronas, responsable de dolor neuropático, sin dañar los cuerpos celulares de las neuronas lesionadas (Kryger, G.S. et al. (2001) J. Hand Surg. (Am.) 26:635-644).

Otra aproximación para neutralizar la actividad de NGF es el uso de anticuerpos anti-NGF, ejemplos de los cuales han sido descritos (ver, por ejemplo, publicaciones de PCT nos. WO 2001/78698, WO 2001/64247, WO 2002/096458, WO 2004/032870, WO 2005/061540, WO 2006/131951, WO 2006/110883, patente estadounidense no. 7,449,616; publicaciones estadounidenses nos. US 20050074821 , US 200800331 57, US 200801 82978 y US 20090041 71 7). En modelos animales de dolor neuropático (por ejemplo, ligación de nervio espinal o tronco de nervios), la inyección sistémica de anticuerpos neutralizantes para NGF previene tanto alodinia como hiperalgesia (Ramer, . S. y Bisby, M.A. (1999) Eur. J. Neurosci. 1 1 :837-846; Ro, L.S. et al. (1 999) Pain 79:265-274). Adicionalmente, el tratamiento con un anticuerpo anti-NGF neutralizante produce reducción de dolor significativa en un modelo de dolor de cáncer de murino (Sevcik, M .A. et al. (2005) Pain 1 1 5: 128- 141 ).

Formulaciones previas conteniendo anticuerpos anti-NGF (por ejemplo, PG 1 10) han sufrido de inestabilidad física del anticuerpo en la formulación, como es reflejado por severos fenómenos de formación de partículas visibles y precipitación. Así, existe la necesidad en la técnica de Formulaciones conteniendo anticuerpos anti-NGF, los cuales mantengan la estabilidad física y los cuales reduzcan la susceptibilidad a formación de partículas.

Breve descripción de la invención La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de novedosas Formulaciones conteniendo anticuerpos anti-NGF (por ejemplo, el anticuerpo PG 1 1 0 humanizado), dichas Formulaciones son físicamente estables y o sufren de susceptibilidades de formación de partículas.

De acuerdo con esto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas comprendiendo: (a) un anticuerpo de factor anti-crecimiento de nervios (NGF) , o fragmento de unión a antígeno del mismo, (b) un amortiguador de histidina a una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 60 mM; y (c) polisorbato 80 a una concentración de aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 0.1 %; en donde el pH de la composición es aproximadamente 5.0 a aproximadamente 6.0. En ciertas modalidades, la composición comprende además un azúcar y/o poliol, tal como aquéllos descritos en la presente. En otras modalidades, la composición no comprende un poliol o azúcar. Todavía en otras modalidades, la composición no comprende metionina.

En ciertas modalidades, la presente invención proporciona unas composiciones farmacéuticas consistiendo de, o consistiendo esencialmente de, (a) un anticuerpo de factor de anti-crecimiento de nervios (NGF) , o fragmento de unión a antígeno del mismo, (b) un amortiguador de histidina a una concentración de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 60 mM; y (c) polisorbato 80 a una concentración de aproximadamente 0.01 % hasta aproximadamente 0.1 %; en donde el pH de la composición es aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 6.0.

En ciertas modalidades, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas consistiendo de, o consistiendo esencialmente de, (a) un anticuerpo de factor anti-crecimiento de nervios (NGF), o fragmento de unión a antígeno del mismo, (b) un amortiguador de histidina a una concentración de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 60 mM; (c) polisorbato 80 a una concentración de aproximadamente 0.01% hasta aproximadamente 0.1% y (d) un poliol y/o un azúcar; en donde el pH de la composición es aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 6.0.

En ciertas modalidades, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas consistiendo de, o consistiendo esencialmente de, (a) un anticuerpo de factor anti-crecimiento de nervios (NGF), o fragmento de unión a antígeno del mismo, (b) un amortiguador de histidina a una concentración de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 60 mM; (c) polisorbato 80 a una concentración de aproximadamente 0.01% hasta aproximadamente 0.1%, y (d) un poliol en donde el pH de la composición es aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 6.0.

En ciertas modalidades, la presente invención proporciona una composición farmacéutica consistiendo de, o consistiendo esencialmente de, (a) un anticuerpo de factor anti-crecimiento de nervios (NGF), o fragmento de unión a antígeno del mismo, (b) un amortiguador de histidina a una concentración de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 60 mM; (c) polisorbato 80 a una concentración de aproximadamente 0.01% hasta aproximadamente 0.1%, y (d) un azúcar; en donde el pH de la composición es aproximadamente 5.0 a aproximadamente 6.0.

En ciertas modalidades, la composición farmacéutica de la invención es una composición farmacéutica líquida. En otras modalidades, la composición farmacéutica es adecuada para liofilización. De acuerdo con esto, la invención proporciona además composiciones farmacéuticas liof ilizadas comprendiendo (a) aproximadamente 1 hasta aproximadamente 240 mg de un anticuerpo anti-NFG, o fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 mg de histidina; y (c) aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 0.4 mg de polisorbato 80. En ciertas modalidades, la composición liofilizada comprende además un azúcar y/o poliol. En otras modalidades, la composición liofilizada no comprende un poliol o azúcar.

En ciertas modalidades, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que consiste de, o consiste esencialmente de, (a) aproximadamente 1 hasta aproximadamente 240 mg de un anticuerpo anti-NGF, o fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 mg de histidina; y (c) aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 0.4 mg de polisorbato 80.

En otras modalidades, la presente invención proporciona una composición farmacéutica consistiendo de, o consistiendo esencialmente de, (a) aproximadamente 1 hasta aproximadamente 240 mg de un anticuerpo anti-NGF, o fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 mg de histidina; (c) aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 0.4 mg de polisorbato 80; y (d) aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 mg de un poliol y/o aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 mg de un azúcar.

En otras modalidades, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que consiste de, o consiste esencialmente de, (a) aproximadamente 1 hasta aproximadamente 240 mg de un anticuerpo anti-NGF, o fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 mg de histidina; (c) aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 0.4 mg de polisorbato 80; y (d) aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 mg de un poliol.

Todavía en otras modalidades, la presente invención proporciona una composición farmacéutica consistiendo de, o consistiendo esencialmente de, (a) aproximadamente 1 hasta aproximadamente 240 gm de un anticuerpo anti-NGF, o fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 mg de histidina; (c) aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 0.4 mg de polisorbato 80; y (d) aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 mg de un azúcar. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-NGF, o porción de unión a antígeno del mismo, se une a NGF humano. En otras modalidades, el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, comprende una región constante de lgG4 humana, en donde la región constante de lgG4 humana comprende una mutación de región de gozne. De preferencia, la mutación de región de gozne en la región constante de lgG4 comprende mutación de serina en la posición de aminoácido 108 de SEQ ID NO:9 (la cual muestra la secuencia de aminoácidos tipo natural de la región constante de lgG4 humana). Más preferiblemente, la serina en la posición de aminoácido 108 de SEQ ID NO:9 es mutada a prolina. En una modalidad preferida, la región constante de lgG4 humana del anticuerpo anti-NGF comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

Un anticuerpo anti-NGF preferido contenido en las composiciones de la invención es anticuerpo PG 1 1 0, la secuencia de aminoácidos de cadena pesada la cual es mostrada en SEQ I D NO: 1 3 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera la cual es mostrada en SEQ ID NO: 16. En otra modalidad, la invención proporciona composiciones conteniendo un anticuerpo anti-NGF comprendiendo una cadena pesada codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 1 1 y una cadena ligera codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 14. En otra modalidad, el anticuerpo anit-NGF comprende una región variable de cadena pesada comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 1 (la cual muestra la región variable de cadena pesada de PG 1 1 0). En otra modalidad, el anticuerpo anti-NGF comprende una región variable de cadena ligera comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 2 (la cual muestra la región variable de cadena ligera de PG 1 10). Todavía en otra modalidad , el anticuerpo anti-NGF comprende una región variable de cadena pesada comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 2. Todavía en otra modalidad, el anticuerpo anti-NGF compite por la unión a NGF con un anticuerpo comprendiendo una región variable de cadena pesada comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

En otra modalidad, el anticuerpo antiNGF comprende una región variable de cadena pesada comprendiendo CDRs 1 , 2 y 3 teniendo las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NOs: 3, 4 y 5, respectivamente (en donde SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 muestran las CDRs de región variable de cadena pesada 1, 2 y 3, respectivamente, de PG110). En otra modalidad, el anticuerpo anti-NGF comprende una región variable de cadena ligera comprendiendo CDRs 1, 2 y 3 teniendo las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, respectivamente (en donde SEQ ID NOs: 6, 7 y 8 muestran las CDRs de región variable de cadena ligera 1, 2 y 3, respectivamente, de PG110). Todavía en otra modalidad, el anticuerpo anti-NGF comprende una región variable de cadena pesada comprendiendo CDRs 1, 2 y 3 teniendo las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, respectivamente, y comprende una región variable de cadena ligera comprendiendo CDRs 1, 2 y 3 teniendo las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, respectivamente.

Todavía en otras modalidades, el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, tiene una o más de las siguientes propiedades funcionales: a) se une a NGF humano pero no se une a factor neurotrófico derivado de cerebro humano (BDNF), neurotrofina humana 3 (NT-3) o neurotrofina humana 4 (NT-4); b) se une a NGF de humano o rata con una KD de 100 pM o menos; c) inhibe la unión de NGF a TrkA o p75NTR; d) inhibe la proliferación dependiente de NGF de células TF-1; e inhibe la supervivencia de ganglios de raíz dorsal de pollo dependiente de NGF; f) inhibe la excrecencia de neuritas de células PC12 dependiente de NGF.

Todavía en otras modalidades, el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, es seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado con CDR, un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fv, un Fv enlazado a disulfuro, un scFv, un anticuerpo de dominio simple, un diacuerpo, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo específico dual, un anticuerpo biespecífico, o un anticuerpo en el cual los epitopes de células T potenciales han sido eliminados. En una modalidad adicional, el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, es humanizado; En una modalidad particularmente preferida, la invención proporciona composiciones conteniendo un anticuerpo anti-NGF que tiene las características ventajosas combinadas de una vida media de eliminación terminal extendida y una duración prolongada de alivio de dolor. De acuerdo con esto, la invención también proporciona un anticuerpo antiNGF comprendiendo una región constante de lgG4 humana, en donde la región constante de lgG4 humana comprende una mutación (de preferencia una mutación de región de gozne), en donde el anticuerpo tiene una vida medida de eliminación terminal en un mono cinomolgo de al menos 15 días, más preferiblemente de al menos 21 días, y en donde el anticuerpo alivia el dolor por una duración de al menos aproximadamente una semana hasta aproximadamente doce semanas después de la administración de una sola dosis del anticuerpo a un sujeto.

La invención también se refiere a métodos para inhibir la actividad de NGF en un sujeto humano que sufre de una enfermedad o condición relacionada a NGF al administrar al sujeto humano una composición farmacéutica de la invención. En otras modalidades, un segundo agente farmacéutico, como se describe en la presente, es administrado al sujeto. En ciertas modalidades, la enfermedad o condición relacionada a NGF es dolor. Ejemplos no limitantes de enfermedades y condiciones relacionadas con NGF incluyen dolor inflamatorio, dolor post-operatorio, dolor neuropático, dolor de fractura, dolor de articulación de gota, neuralgia post-herpética, dolor de cáncer, dolor de osteoartritis o artritis reumatoide, ciática, dolores asociados con crisis de células falciformes, dolores de cabeza, dismenorrea, endometriosis, dolor músculo esquelético, dolor crónico de espalda baja, fibromialgia, esguinces, dolor visceral, quistes ováricos, prostatitis, cistitis, cistitits intersticial, dolor incisional, migraña, neuralgia trigeminal, dolor de quemaduras y/o heridas, dolor asociado con trauma, dolor asociado con enfermedades musculoesqueléticas, espinodilitis anquilosante, patologías periarticulares, dolor de metástasis ósea, dolor de HIV, eritromelalgia o dolor provocado por pancreatitis o piedras de riñon. Otros ejemplos de enfermedades y condiciones relacionadas con NGF incluyen melanoma maligno, síndrome de sjogren y asma, tal como asma no controlada con severa hiper-sensibilidad de vías respiratorias, y tos intratable. Enfermedades y condiciones particularmente preferidas para tratamiento de acuerdo con los métodos de la invención incluyen dolor inflamatorio (en particular dolor de osteoartritis o artritis reumatoide), dolor musculoesquelético (en particular dolor crónico de espalda baja), dolor neuropático (en particular, neuropatía diabética), dolor de cáncer y dolor de metástasis ósea, cistitis intersticial/síndrome de vejiga dolorosa, dolor asociado con prostatitis abacteriana crónica, dolor asociado con endometriosis y/o fibroides uterinos y dolor post-operatorio. De preferencia, el dolor es seleccionado del grupo que consiste de dolor de osteoartritis, dolor crónico de espalda baja, dolor neuropático diabético, dolor de cáncer, dolor de metástasis ósea, cistitis intersticial, síndrome 5 de vejiga dolorosa, dolor asociado con prostatitis abacteriana crónica, dolor asociado con endometriosis, dolor asociado con fibroides uterinos y dolor post-operatorio.

La composición farmacéutica de la invención puede ser administrada, por ejemplo, de manera intravenosa, subcutánea (por Q ejemplo, vía una pluma de inyección o implante subcutáneo), intramuscular o intra-articular, aunque otras rutas adecuadas de administración son descritas en la presente.

Los kits o artículos de fabricación comprendiendo una composición farmacéutica de la invención también son provistos en la presente. 5 Breve descripción de los dibujos La Figura 1 es una comparación gráfica de la estabilidad de Formulación 1 y Formulación 2 en el tiempo.

Descripción detallada de la invención La presente invención pertenece a com posiciones mejoradas (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) de anticuerpos anti-NGF, o porciones de unión a antígeno de los mismos, teniendo estabilidad mejorada. Las composiciones de la presente invención generalmente comprenden un anticuerpo anti-NGF, o fragmento de unión a antígeno del mismo, un amortiguador adecuado (por ejemplo, un amortiguador de histidina), un excipiente adecuado (por ejemplo, polisorbato 80) y teniendo un pH de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 6.0. Las composiciones de la presente invención pueden ser líquidas, adecuadas para liofilización, y/o liofilizadas.

Con el fin de que la presente invención pueda ser más fácilmente entendida, ciertos términos son definidos primero. Las definiciones adicionales son expuestas a lo largo de la descripción detallada.

I· Definiciones Los artículos "un" y "una" son usados en la presente para referirse a uno o a más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A manera de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma como para permitir que la actividad biológica del o los ingredientes activos sea inequívocamente efectiva, y que no contiene componentes adicionales que sean significativamente tóxicos a los sujetos a los cuales se administraría la formulación.

La frase "portador farmacéuticamente aceptable" es reconocida en la técnica por incluir un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, adecuado para administración a mamíferos, tales como humanos. Tales portadores incluyen relleno líquido o sólido, diluyente, excipiente, solvente o material encapsulante, involucrados en portar o transportar el agente en cuestión desde un órgano, o porción del cuerpo, a otro órgano o porción del cuerpo. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la composición y no perjudicial a, o impactar en la seguridad de, el sujeto humano.

"Amortiguador" se refiere a una solución amortiguada que resiste cambios en pH mediante la acción de sus componentes conjugados de ácido-base. Los amortiguadores de la invención tienen un pH en el rango desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 8. Ejemplos de amortiguadores que controlarán el pH en este rango incluyen fosfato, acetato (por ejemplo, acetato de sodio) , succinato (por ejemplo, succinato de sodio) , gluconato, glutamato, histidina, citrato, y otros amortiguadores de ácido orgánico. Él término "excipiente" se refiere a un agente que puede ser adicionado a una composición para proporcionar una consistencia deseada, por ejemplo, al alterar las propiedades a granel, para mejorar la estabilidad, y/o para ajustar la osmolalidad . Ejemplos de excipientes comúnmente usados incluyen, pero no están limitados a azúcares, polioles, aminoácidos, surfactantes y poloxámeros. "Excipientes farmacéuticamente aceptables" (por ejemplo, vehículos, aditivos) son aquéllos que pueden ser razonablemente administrados a un sujeto de mamífero, por ejemplo, humano, para proporcionar una dosis efectiva del ingrediente activo empleado.

Como se usa en la presente, un "poliol" es una substancia con múltiples grupos hidroxilo, e incluye alcoholes de azúcares y ácidos de azúcares. Los polioles particulares tienen un peso molecular que es menor que aproximadamente 600 D (por ejemplo, en el rango desde aproximadamente 120 hasta aproximadamente 400 D). Ejemplos no limitantes de polioles incluyen fructosa, mañosa, maltosa, lactosa, arabinosa, xilosa, ribosa, ramnosa, galactosa, glucosa, sorbosa, melezitosa, rafinosa, mantiol, xilitol, eritritol, treitol, sorbitol, glicerol, L-gluconato y sales metálicas de los mismos.

Un "azúcar" es un carbohidrato con un sabor característicamente dulce. Los azúcares pueden ser clasificados como monosacáridos, disacáridos y polisacáridos. Los "monosacáridos" son los azúcares simples, por ejemplo, fructosa, levulosa, glucosa y dextrosa, o azúcar de uva. "Disacáridos" incluyen lactosa o azúcar de la leche, maltosa o azúcar de malta, disacárido cristalino, sacarosa y trehalosa (también conocida como micosa o tremalsoa). Sobre hidrólisis, una molécula de disacárido produce dos moléculas de monosacárido. "Polisacáridos" incluyen substancias tales como celulosa, dextrina, glicógeno y almidón. Los polisacáridos con compuestos poliméricos hechos de los azúcares simples y pueden ser hidrolizados para producir azúcares simples. Los disacáridos son algunas veces agrupados con los polisacáridos más simples (usualmente aquéllos hechos de tres o cuatro unidades de azúcares simples) para formar una clase de carbohidratos llamados "oligosacáridos".

Un "azúcar" también puede ser clasificado como un "azúcar reductor" o un "azúcar no reductor". Los azúcares reductores son distinguidos por el hecho de que debido a sus grupos de aldehido o cetona libres, o potencialmente libres, poseen la propiedad de reducir fácilmente soluciones alcalinas de muchas sales metálicas, tales como aquéllas de cobre, plata, bismuto, mercurio y hierro. Los azúcares reductores incluyen , por ejemplo, maltosa, latosa, celobiosa, gentiobiosa, melibiosa y turanosa. Ejemplos no limitantes de azúcares no reductores incluyen sacarosa, trehalosa, rafiosa , melezitosa, estaquiosa y verbascosa.

El término "surfactante" generalmente incluye aquéllos agentes que protegen una proteína en una composición a partir de tensiones inducidas por interfase de aire/solución y tensiones inducidas de solución/superficie. Por ejemplo, un surfactante puede proteger la proteína de agregación. Los surfactantes adecuados pueden incluir, por ejemplo, polisorbatos, polioxietilen alquil éteres, tales como Brij 35. RTM. ; o poloxámeros, tales como Tween 20, Tween 80 o poloxamer 188. Los detergentes preferidos son polioxietilen alquil éteres, por ejemplo, Brij 35. RTM. , Cremophor A25, Sympatens ALM/230; polisorbatos/Tweens, por ejemplo, Polisorbato 20, Polisorbato 80, Mirj, y poloxámeros, por ejemplo poloxamer 188, poloxamer 407 y Tweens, por ejemplo, Tween 20 y Tween 80.

Una composición "estable" es una en la cual el ingrediente activo, por ejemplo, un anticuerpo, en el mismo retiene esencialmente su estabilidad física y/o estabilidad qu ímica y/o actividad biológica durante el proceso de fabricación y/o sobre almacenamiento. Varias técnicas analíticas para medir la estabilidad de proteína están disponibles en la técnica y son revisadas en Peptide and Protein Drug Delivery (Entrega de medicamento de péptido y proteína) , 247-301 , Vincent Lee Ed. , Marcel Dekker, Inc. , New Yor, N.Y. , Pubs. ( 1 991 ) y Jones ( 1993) Adv. Drug Delivery Rev. 1 0:29-90.

Un anticuerpo "retiene su estabilidad física" en una composición farmacéutica si substancialmente no muestra signos de, por ejemplo, agregación, precipitación y/o desnaturalización sobre examinación visual de color y/o claridad, o como se mide mediante dispersión de luz UV o por cromatografía de exclusión por tamaño. La agregación es un proceso por el cual las moléculas de proteína individuales o complejos asociados covalente o no covalentemente para formar agregados. La agregación puede proceder al grado de que un precipitado visible es formado. La estabilidad física de una composición farmacéutica conteniendo un anticuerpo anti-NGF puede ser determ inada, por ejemplo, de acuerdo con el porcentaje de proteína de monómero en la solución, con un bajo porcentaje (por ejemplo, menos de 3%) de proteína degradada (por ejemplo, fragmentada) y/o ag regada indicando que la composición es estable.

Un anticuerpo "retiene su estabilidad química" en una composición farmacéutica de la invención, si la estabilidad química a un tiempo dado es tal que el anticuerpo es considerado por retener su actividad biológica como se define más adelante. La estabilidad química puede ser valorada al, por ejemplo, detectar y cuantificar formas qu ímicamente alteradas del anticuerpo. La alteración qu ímica puede involucrar la modificación de tamaño (por ejemplo, sujeción) que puede evaluarse usando cromatografía de exclusión por tamaño, SDS-PAGE y/o espectrometría de masa de ionización/tiempo de vuelo de desorción láser asistida por matriz (MALDI/TOF MS) . Otros tipos de alteración química incluyen alteración de carga (por ejemplo, ocurriendo como un resultado de desamidación u oxidación), la cual puede ser evaluada mediante, por ejemplo, cromatografía de intercambio de iones.

Un anticuerpo "retiene su actividad biológica" en una composición farmacéutica de la invención, si el anticuerpo en una composición farmacéutica es biológicamente activo para su fin pretendido. Por ejemplo, la actividad biológica es retenida si la actividad biológica del anticuerpo en la composición farmacéutica está dentro de aproximadamente 30%, aproximadamente 20%, o aproximadamente 10% (dentro de los errores del ensayo) de la actividad biológica exhibida en el momento en que la composición farmacéutica fue preparada (por ejemplo, como es determinado en un ensayo de unión a antígeno). Las actividades biológicas de los anticuerpos anti-NGF contenidas dentro de las Formulaciones de la invención incluyen, pero no están limitadas a, unión a NGF humano, inhibiendo la unión de NGF a TrkA o p75NTR, inhibiendo la proliferación dependiente de NGF de células TF-1 , inhibiendo la supervivencia dependiente de NGF y diferenciación de neuronas e inhibiendo la transducción de dolor dependiente de NGF. El término "actividad" incluye además actividades tales como la especificidad/afinidad de unión de un anticuerpo para un antígeno, por ejemplo, un anticuerpo anti-NGF que se une a un antígeno de NGF.

El término "inhibición" como se usa en la presente, se refiere a cualquier disminución estadísticamente significativa en la actividad biológica, incluyendo bloqueo completo de la actividad. Por ejemplo, "inhibición" puede referirse a una disminución de aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%; 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% en la actividad biológica.

Los términos "factor de crecimiento de nervios" o "NGF" son usados de manera intercambiable en la presente e incluyen variantes, isoformas, homólogos, ortólogos y parólogos. Por ejemplo, un anticuerpo específico para NGF humano puede, en ciertos casos, reaccionar cruzado con NGF de especie diferente a humana. En otras modalidades, el anticuerpo específico para NGF humano puede ser completamente específico para NGF humano y puede o exhibir reactividad cruzada de especie u otro tipo de reactividad cruzada. El término "NGF humano" se refiere a NGF de secuencia humana, tal como que comprende la secuencia de aminoácidos de cadena de NGF-ß humana, la forma precusora que tiene el número de acceso de Genbank NP_002497, codificada por la secuencia de nucleótidos de número de acceso de Genbank NM_002506. La secuencia de cadena NGF-ß humana puede diferir de NGF-ß humana de no. de acceso de Genbank NP_002497 al tener, por ejemplo, substituciones conservadas o substituciones en regiones no conservadas, en donde el NGF-ß humano tiene substancialmente la misma función biológica que el NGF-ß humano de no. de acceso de Genbank NP_002497. El término "NGF de rata" se refiere al NGF de secuencia de rata, tal como que comprende la secuencia de aminoácidos de cadena de NGF-ß de rata, la forma precursora la cual tiene el número de acceso de Genbank XP_227525, codificada por la secuencia de nucleótidos de número de acceso de Genbank XP_227525. El término "NGF de ratón" se refiere al NGF de secuencia de rata, la forma precursora que tiene el número de acceso de Genbank XP_227525, codificada por la secuencia de nucleótidos de número de acceso de Genbank XP_227525. El término "NGF de ratón" se refiere a NGF de secuencia de rata, tal como que comprende la secuencia de aminoácidos de cadena de NGF-ß de ratón, la forma precursora que tiene número de acceso de Genbank NP_038637, codificada por la secuencia de nucleótidos de número de acceso de Genbank NM_01 3609.

El término "receptor de TrkA", como se usa en la presente, se refiere a un receptor de NGF también conocido en la técnica como receptor de tropomiosina cinasa A y el receptor de tirosina cinasa neurotrófico tipo 1 (NTRK1 ). Secuencias no limitantes ejem plares para receptor de TrkA humano incluyen las secuencias de aminoácidos de número de acceso de Genbank NP_001 012331 (isoforma 1 ), NP_0025250 (isoforma 2) y NP_001007793 (isoforma 3).

El término "receptor p75NTR", como se usa en la presente se refiere a un receptor de neurotrofina, con un peso molecular de aproximadamente 75 kDa, que une NGF y otras neurotrofinas, dicho receptor es descrito en, por ejemplo, Botwell, M: ( 1 996) Science 272:506-507. Una secuencia no limitante ejemplar para receptor p75NTR humano es la secuencia de aminoácidos de número de acceso de Genbank NP_002498, codificado por la secuencia de nucleótidos de número de acceso de Genbank NM_002507.

El término "vida media de eliminación terminal", como se usa en la presente con respecto a los anticuerpos anti-NGF, se refiere a la cantidad de tiempo necesario para la concentración del anticuerpo, como se mide en el suero de un sujeto al cual el anticuerpo ha sido administrado, para reducirse a la mitad una vez que tanto la absorción como la redistribución del anticuerpo estén completas. Cuando un grupo de sujetos es usado, el promedio geométrico de la vida media de eliminación terminal en los sujetos puede usarse como la medida de la vida media de eliminación terminal del anticuerpo.

El término "vida media farmacológica", como se usa en la presente con respecto a los anticuerpos anti-NGF, se refiere a la cantidad promedio de tiempo para mantener el efecto de medicamento in vivo (MRT para efecto de medicamento). Puede calcularse como la proporción de área de la curva de efecto corregido de línea de base de primer momento-tiempo (AUMEC) vs efecto de medicamento corregido de línea de base acumulada en el tiempo (área bajo la curva de efecto-tiempo, AUEC), usando la siguiente fórmula: Vida media farmacológica = AUMEC = f E(t)tdt AUEC J E(t)dt Cuando un grupo de sujetes es usado, el promedio geométrico de la vida media farmacológica en los sujetos puede ser usada como la medida de la vida media farmacológica del anticuerpo.

El término "inhibición" como se usa en la presente, se refiere a cualquier disminución estadísticamente significativa en la actividad biológica, incluyendo bloqueo completo de la actividad. Por ejemplo, "inhibición" puede referirse a una disminución de aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%; 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% en actividad biológica.

El término "anticuerpo" o "inmunoglobulina", como se usa intercambiablemente en la presente, incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión de antígeno (es decir, "porción de unión a antígeno") o cadenas simples de los mismos que retiene la capacidad para unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, NGF). En un anticuerpo de longitud completa, cada cadena pesada está comprendida por una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está comprendida por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está comprendida por una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como LCV o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está comprendida por un dominio, CL. Las regiones de VH y VL pueden ser subdivididas adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de complementaridad (CDR), intercaladas con regiones que son más conservadas, llamadas regiones de estructura (FR). Cada VH, VI está compuesta de tres CDRS y cuatro FRs, arregladas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras conteniendo un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos huéspedes o factores, incluyendo varias células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primero componente (Clq) del sistema de complemento clásico. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, lgG 1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2) o subclase.

El térm ino "porción de unión a antigeno" o "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo") se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad a unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, NGF), tales modalidades de anticuerpo también pueden ser formatos biespecíficos, específicos duales o multi-específicos; uniéndose específicamente a dos o más antígenos diferentes. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente consistiendo de dominios VL, VH, CL y CH 1 ; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente comprendiendo dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro a la región de gozne; (iü) un fragmento Fd consistiendo de los dominios de VH y CH 1 ; (iv) un fragmento Fv consisiendo de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al. ( 1989) Nature 341 : 544-546, Winter et al. , publicación de PCT WO 90/05144 A1 ), la cual comprende un dominio de variable simple; y (vi) una región determinante de complementaridad aislada (CDR). Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificadas por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite hacerse como una cadena de proteína simple, en la cual el par de regiones VL y VH forman moléculas monovalentes (conocido como Fv de cadena simple (scFv) ; ver, por ejemplo, Bird et al. ( 1 988) Science 242:423-426 y Huston et al. (1 988) Proc. Nati. Acad. Sci, USA 85:5879-5883) . Otras formas de anticuerpos de cadena simple, tales como diacuerpos también son abarcados. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíficos, en los cuales los dominios VH y VL son expresados en una cadena de polipéptidos simple, pero usando un enlazador que es demasiado corto para formar parejas entre los dos dominios en la misma cadena, forzando por ello los dominios a que formen parejas con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígeno (ver por ejemplo, Holliger et al . ( 1 993) Proc. Nati. Acad. Scie. US 90:6444-6448, Poljak et al. (1994) Structure 2: 1 1 21 -1 1 23) . Tales anticuerpos de cadena simple también pretenden ser abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo como es bien sabido en la técnica (Kontermann y Dubel eds. , Antibody Engineering (2001 ) Springer-Verlag. New York, 790 (ISBN 3-540-41 354-5).

El término "mutación de región de gonze", como se usa en la presente, se refiere a una mutación, tal como una mutación, substitución, adición o supresión puntual, en la región de gozne de un dominio constante de inmunoglobulina.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales comprendiendo la población son idénticos excepto por mutación o es que posiblemente ocurren de manera natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un sitio antigénico simple. Adicionalmente, en contraste con preparaciones de anticuerpo (policlonal) convencionales las cuales normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopes), cada anticuerpo monoclonal es dirigido contra un solo determinante sobre el antígeno. Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados usando cualquier técnica reconocida en el área, por ejemplo, un método de hibridoma, como se describe por Kohler et al. (1975) Nature, 256:495, un animal transgénico, como se describe mediante, por ejemplo, (ver por ejemplo, Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859), métodos de DNA recombinante (ver por ejemplo, patente estadounidense no. 4,816,567), o usando genotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas en, por ejemplo, Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991). Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos y anticuerpos humanizados y pueden ocurrir de manera natural o ser producidos de manera recombinante.

El término "anticuerpo recombinante", se refiere a anticuerpos que son preparados, expresados, creados o aislados por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosóm ico para genes de inmunoglobulinas (por ejemplo, genes de inmunoglobulina humana) o un hibridoma preparado a partir de los mismos, (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una genoteca de anticuerpo combinacional, recombinante (por ejemplo, conteniendo secuencias de anticuerpos humanos) usando despliegue de fagos, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que involucran empalme de secuencias de genes de inmunoglobulinas (por ejemplo, genes de inmunoglobulinas humanos) a otras secuencias de DNA. Tales anticuerpos recombinantes pueden tener regiones constantes y variables derivadas de secuencias de inmunoglobulinas de línea germinal humanas. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes pueden ser sujetados a mutagénesis in vitro y así las secuencias de aminoácidos de las regiones de VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas de y relacionadas con secuencias de VH y VL de línea germinal humanas, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de l ínea germinal de anticuerpo humano in vivo.

El término "inmunoglobulina quimérica" o anticuerpo se refiere a una inmunoglobulina o anticuerpo cuyas regiones variables se derivan de una primera especie y cuyas regiones constantes se derivan de una segunda especie. Las inmunoglobulinas o anticuerpos quiméricos pueden ser construidos, por ejemplo, mediante ingeniería genética, a partir de segmentos de genes de inmunoglobulina pertenecientes a las diferentes especies.

El término "anticuerpo humanizado" o "inmunoglobulina humanizada" se refiere a un anticuerpo o inmunoglobulina que incluye al menos una cadena de inmunoglobulina o anticuerpo humanizada (es decir, al menos una cadena ligera o pesada humanizada). El término "cadena de inmunoglobulina humanizada" o "cadena de anticuerpo humanizado" (es decir, una "cadena ligera de inmunoglobulina humanizada" o "cadena pesada de inmunoglobulina humanizada") se refiere a una cadena de inmunoglobulina o anticuerpo (es decir, una cadena ligera o pesada, respectivamente) teniendo una región variable que incluye una región de estructura variable substancialmente de una inmunogloblina o anticuerpo humano y regiones determinantes de complementaridad (CDRs) (por ejemplo, al menos una CDR, de preferencia dos CDRs, más preferiblemente es CDRs) substancialmente de un anticuerpo o inmunoglobulina no humano, e incluye además regiones constantes (por ejemplo, al menos una región constante o porción de la misma , en el caso de una cadena ligera y de preferencia tres regiones constantes en el caso de una cadena pesada). El término "región variable humanizada" (por ejemplo, "región variable de cadena ligera humanizada" o "región variable de cadena pesada humanizada") se refiere a una región variable que incluye una región de estructura variable substancialmente de un anticuerpo o inmunoglobulina humano y regiones determinantes de complementaridad (CDRs) substancialmente de un anticuerpo o inmunoglobulina no humano.

En una modalidad, el término "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo o una variante, derivado, análogo o fragmento del mismo, el cual se une inmunoespecíficamente a un antígeno de interés y el cual comprende una región de estructura (FR) teniendo substancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano y regiones determinantes complementarias (CDRs) teniendo substancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo no humano. Como se usa en la presente, el término "substancialmente" en el contexto de una CDR se refiere a una CDR teniendo una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% , al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de una CDR de anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado comprende substancialmente todo de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables (Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) en los cuales todas o substancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquéllas de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donador) y todas o substancialmente todas las regiones FR son aquéllas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. En una modalidad, un anticuerpo humanizado también comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), normalmente aquélla de una inmunoglobulina humana. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado contiene tanto la cadena ligera así como al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir regiones de CH 1 , gozne, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. En una modalidad , un anticuerpo humanizado solo contiene una cadena ligera humanizada. En otra modalidad, un anticuerpo humanizado solo contiene una cadena pesada humanizada. En una modalidad particular, un anticuerpo humanizado solo contiene un dominio variable humanizado de una cadena ligera y/o cadena pesada humanizada. El anticuerpo humanizado puede ser seleccionado de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG , IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo sin limitación IgG 1 , lgG2, lgG3 e lgG4. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo, y dominios constantes particulares pueden ser seleccionados para optimizar las funciones efectoras deseadas usando técnicas bien conocidas en la técnica.

El término "epitope" incluye cualquier determinante x (por ejemplo, polipéptido) capaz de unión específica a una ¡nmunoglobulina. En ciertas modalidades, los determinantes de epitope incluyen agrupamientos de superficie químicamente activa de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, fosforilos, sulfonilos y, en ciertas modalidades, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, y/o características de carga específica. Un epitope es una región de un antígeno que es unido por un anticuerpo. En ciertas modalidades, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno, cuando reconoce preferencialmente su antígeno objetivo en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.

El término "anticuerpo humano", como se usa en la presente, pretende incluir anticuerpos teniendo regiones variables en las cuales tanto las regiones de estructura como CDR son derivadas de secuencias de inmunoglobulinas de l ínea germinal humanas como se describe, por ejemplo, por Kabat et al . (Ver Kabat, et al. (1 991 ) Sequences of proteins of Immunological I nterest (Secuencias de proteínas de interés inmunológico), quinta edición , U.S. Department of Health and Human Services, NI H Publication no. 91 -3242). Adicionalmente, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también es derivada de secuencias de inmunoglobulinas de línea germinal humanas. Los anticuerpos humanos pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulinas de línea germinal humanas (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis específica de sitio o aleatoria in vitro o mediante mutación somática in vivo). Sin embargo, el término "anticuerpo humano", como se usa en la presente, no pretende incluir anticuerpos en los cuales las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, han sido injertadas sobre secuencias de estructura humanas.

Un "anticuerpo aislado", como se usa en al presente, pretende referirse a un anticuerpo el cual está substancialmente libre de otros anticuerpos teniendo diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a NGF está substancialmente libre de anticuerpos que unen específicamente antígenos diferentes de NGF) . Además, un anticuerpo aislado es normalmente substancialmente libre de otro material celular y/o químico.

Como se usa en la presente, los términos "unión específica" "une específicamente", "unión selectiva" y "une selectivamente", significa que un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, exhibe una apreciable afinidad por un antígeno particular o epitope y, en general, no exhibe reactividad cruzada significativa con otros antígenos y epitopes. "Apreciable" o unión preferida incluye unión con una afinidad de al menos 106, 107, 108, 109 M" 1 o 1010 M" 1. Las afinidades mayores que 107 M"1 , de preferencia mayores que 1 08 M"1 son más preferidas. Los valores intermedios de aquéllos expuestos en la presente también pretenden estar dentro del alcance de la presente invención y una afinidad de unión preferida puede ser indicada como un rango de afinidades, por ejemplo, 1 06 a 1 010 M \ de preferencia 1 07 a 1010 M" 1 , más preferiblemente 108 a 1010 M~ 1. Un anticuerpo que "no exhibe reactividad cruzada significativa" es uno que no se unirá apreciablemente a una entidad indeseable (por ejemplo, una entidad proteinácea indeseable). La unión específica o selectiva puede ser determinada de acuerdo con cualquier medio reconocido en la técnica para determinar tal unión , incluyendo, por ejemplo, de acuerdo con análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva.

El término "KD" como se usa en la presente, pretende referirse a la constante de equilibrio de disociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular o la afinidad de un anticuerpo para un antígeno, por ejemplo, obtenida en una medición de titulación en equilibrio, o al dividir la constante de velocidad de disociación (Koff) mediante la constante de velocidad de asociación (Kon). La constante de velocidad de asociación (Kon), la constante de velocidad de disociación (Koff) y la constante de disociación de equilibrio (K) son usadas para representar la afinidad de unión de un anticuerpo a un antígeno. Los métodos para determinar las constantes de velocidad de asociación y disociación son bien conocidos en la técnica. Técnicas basadas en fluorescencia ofrecen alta sensibilidad y la capacidad para examinar muestras en los amortiguadores fisiológicos en equilibrio. Otras aproximaciones experimentales e instrumentos tales como un ensayo BIAcore® (análisis de interacción biomolecular) pueden ser usados (por ejemplo, instrumento disponible de BIAcore International AB, un GE Healthcare Company, Uppsala, Suecia). Adicionalmente, un ensayo KinExA® (Kinetic Exclusión Assay), disponible de Sapidyne Instruments (Boise, Idaho) también puede ser usado.

En una modalidad, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención se une a antígeno (por ejemplo, NGF) con una afinidad (KD) de aproximadamente 100 pM o menos (es decir, o mejor) (por ejemplo, aproximadamente 90 pM o aproximadamente 80 pM o aproximadamente 70 pM o aproximadamente 60 pM o aproximadamente 50 pM o aproximadamente 40 pM o aproximadamente 30 pM) , como se mide usando un ensayo de resonancia de plasmón de superficie o un ensayo de unión celular. En una modalidad preferida, el anticuerpo une NGF con una afinidad (KD) en un rango de aproximadamente 25-35 pM.

Los términos "Kass", "Ka" y "Kon" , como se usa en la presente, pretenden referirse a la constante de velocidad de asociación para la asociación de un anticuerpo en el complejo de anticuerpo/antígeno. Este valor indica la velocidad de unión de un anticuerpo a su antígeno objetivo o la velocidad de formación de complejo entre un anticuerpo y antígeno como es mostrado por la ecuación a continuación: Anticuerpo ("Ab") + Antígeno ("Ag") - Ab-Ag Los términos "Kdiss", "Kd" y "Koff", como se usa en la presente, pretenden referirse a la constante de velocidad de disociación para la disociación de un anticuerpo del complejo de anticuerpo/antígeno. Este valor indica la velocidad de disociación de un anticuerpo de su antígeno objetivo o separación de complejo de Ab-Ag durante el tiempo en anticuerpo y antígeno libres como es mostrado por la ecuación a continuación: Ab + Ag <- Ab-Ag El término " IC50", como se usa en la presente, se refiere a la concentración de un anticuerpo que inhibe una respuesta, ya sea en un ensayo in vitro o in vivo, a un nivel que es 50% de la respuesta inhibitoria máxima, es decir, la mitad entre la respuesta inhibitoria máxima y la respuesta sin tratar.

Los términos "tratar", "tratando" y "tratamiento", como se usa en la presente, se refieren a medidas terapéuticas o preventivas descritas en la presente. Los métodos de "tratamiento" emplean administración, a un sujeto, de un anticuerpo de la presente invención, por ejemplo, un sujeto teniendo una enfermedad o condición relacionada con NGF, con el fin de prevenir, curar, retrasar, reducir la severidad de, o mejorar uno o más síntomas de la enfermedad o condición.

El término "enfermedad o condición relacionada a NGF", como se usa en la presente, se refiere a enfermedades y condiciones en las cuales la actividad de NGF es involucrada con , o asociada con, o media o promueve uno o más síntomas de la enfermedad o condición.

Como se usa en la presente, el término "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. En una modalidad particular, el sujeto es un humano. El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mam íferos y no mam íferos, tales como primates no humanos, borregos, perros, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.

Como se usa en la presente, el término "efecto de rebote" se refiere a la eficacia disminuida de agentes secuestrantes de NGF, tal como un anticuerpo anti-NGF, que ocurre en un sujeto después de un periodo inicial de efectividad después de administración simple o repetición. Por ejemplo, el tratamiento con un anticuerpo anti-NGF puede aliviar inicialmente el dolor, por ejemplo, debido a la inflamación o daño de nervios u otra etiolog ía, la cual es seguida entonces por un periodo de eficacia analgésica disminuida en la cual el dolor eventualmente se vuelve aproximadamente tan intensa o más intensa que antes del tratamiento. En otro ejemplo, un anticuerpo anti-NGF puede exhibir una efectividad inicial en un sujeto durante un periodo después de administración simple o repetida, tal como un periodo de una semana después de la administración (por ejemplo, d ías 1 -7 después de la administración), la cual es seguida entonces por un periodo de eficacia disminuida, tal como durante un periodo de 1 -2 semanas después de la administración (por ejemplo, d ías 7-14 después de la administración) . Este periodo de "rebote" puede ser seguido por un periodo de recuperación de eficacia del anticuerpo anti-NGF. Por ejemplo, puede haber un perfil bifásico de analgesia después de administración simple o repetida de un anticuerpo anti-NGF, con un periodo intermediario de eficacia reducida o incluso sensación de dolor exagerada. Este efecto de rebote puede ser valorado, en por ejemplo, estudios clínicos de dolor, modelos experimentales de dolor y/u otros modelos de eficacia anti-NGF. Este efecto de rebote puede ser asociado con, por ejemplo, dolor incrementado en el sujeto y/o eventos adversos incrementados (tales como sensaciones anormales, que varían de alodinia a disestesia, parestesia e hiper- o hipoestesia) durante el periodo de rebote. Aunque no se pretende limitar a un mecanismo, el efecto de rebote puede ser provocado por la expresión de NGF alterada, expresión de receptor de TrkA o p/5 o señalización o cualquier otro mecanismo que resulte en eficacia disminuida transiente después de administración simple o repetida de un anti-NGF después de un periodo inicial de eficacia.

Varios aspectos de la invención son descritos con más detalle en las siguientes sub-secciones.

I I . Composiciones farmacéutica de la invención La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas líq uidas y liofilizadas comprendiendo un anticuerpo anti-NGF o fragmento de unión a antígeno del mismo, teniendo propiedades mejoradas como se compara con composiciones reconocidas en la técnica. Las composiciones de la invención son capaces de mantener solubilidad y estabilidad del anticuerpo anti-NGF o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, durante la fabricación , almacenamiento y/o pasos de procesamiento repetidos de congelación/descongelación o exposición prolongada a interfases aire-l íqu ido incrementadas (por ejemplo, no muestran opalescencia, agregación o precipitación significativas) . Por ejemplo, las composiciones de la invención mantienen un bajo nivel de agregación de proteína (es decir, menos de 3%) , a pesar de que contienen altas cantidades (por ejemplo, aproximadamente 1 0 hasta aproximadamente 240 mg/ml), del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. Las composiciones de la invención también mantienen una baja viscosidad dentro de rangos adecuados para inyección subcutánea , a pesar de contener altas cantidades (por ejemplo, aproximadamente 1 0 hasta aproximadamente 240 mg/ml) del anticuerpo. Adicionalmente , las composiciones de la invención mantienen solubilidad, mantienen u na baja viscosidad adecuada para inyección subcutánea o intravenosa, y mantienen estabilidad sobre un rango de pH de, por ejemplo, aproximadamente pH 5.0 a aproximadamente pH 6.0. Así, las composiciones de anticuerpo de la invención superan un número de retos conocidos para composiciones de anticuerpo, incluyendo retos de estabilidad, viscosidad , turbidez y degradación física .

De acuerdo con esto, en un aspecto, las composiciones farmacéuticas comprenden u n anticuerpo a nti-NG F o fragmento de unión a antígeno del mismo, un amortiguador y un excipiente, las cuales son suficientes para mantener la estabilidad del anticuerpo anti-NG F o fragmento de unión a antígeno del mismo en forma líquida y/o liofilizada .

Los anticuerpos anti-NG F y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que pueden ser usados en las composiciones de la invención y métodos para hacer tales anticuerpos, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, son descritos en detalle en la presente. La cantidad del anticuerpo presente en la composición es determinado, por ejemplo , al considerar la dosis deseada , volumen o volúmenes y modo o modos de administración . En ciertas modalidades de la invención , las composiciones de la invención , por ejemplo composiciones líq uidas y/o liofilizadas (sobre reconstitución) comprenden una concentración de proteína de aproximadamente 1 0 hasta aproximadamente 240 mg/ml , aproximadamente 20 hasta aproximadamente 120 mg/ml, aproximadamente 40 hasta aproximadamente 240 mg/ml, aproximadamente 50-1 50 mg/ml, aproximadamente 15 hasta aproximadamente 75 mg/ml o aproximadamente 1 0 hasta aproximadamente 20 mg/ml de los anticuerpos de anti-NG F humano, o fragmentos de u nión a antígeno de los mismos. Aunque las modalidades preferidas de la invención son composiciones comprendiendo altas concentraciones de proteína , también se contempla que las composiciones de la invención pueden comprender una concentración de anticuerpo entre aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 240 mg/ml, entre aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 1500 mg/ml o entre aproximadamente 50 mg/ml y aproximadamente 150 mg/ml está entre aproximadamente 30 mg/ml y aproximadamente 50 mg/ml. En una modalidad de la invención, la concentración del anticuerpo es aproximadamente 100 mg/ml. En una modalidad de la invención, la concentración del anticuerpo es aproximadamente 60 mg/ml. En una modalidad de la invención, la concentración del anticuerpo es aproximadamente 30 mg/ml. En otra modalidad, la concentración del anticuerpo es aproximadamente 20 mg/ml. En otra modalidad, la concentración del anticuerpo es aproximadamente 10 mg/ml. En otra modalidad de la invención, las composiciones, comprenden una concentración del anticuerpo de aproximadamente 55 mg/ml.

Los rangos intermedios, por ejemplo, a los rangos antes declarados, por ejemplo, 75-90 mg/ml, también pretenden ser parte de esta invención. Por ejemplo, rangos de valores usando una combinación de cualquiera de los valores antes declarados como límites superior y/o inferior pretenden ser incluidos. Además, las concentraciones de intermediario de anticuerpo anti-NGF a las cantidades y concentraciones antes declaradas también pretenden ser parte de esta invención (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 56, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82,83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 1221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239 o aproximadamente 240 mg/ml).

En algunas modalidades de la invención, las composiciones, por ejemplo composiciones liofilizadas, comprendiendo aproximadamente 1-100 mg, 1.75 mg, 1-55, mg, 1-30 mg, 1-20 mg, 1-10 mg, 10-20 mg, 15-75 mg, 100-150 mg, 110-150 mg, 100-140 mg, 110-140 mg, 120-140 mg, 130-140 mg del anticuerpo anti-NGF. En otras modalidades, las composiciones, por ejemplo, composiciones liofilizadas, comprenden aproximadamente 40-240, 40-200, 40-180, 40-160, 40-140, 40-120 mg, 45-100 mg, 50-80 mg, o 55-70 mg del anticuerpo. En una modalidad, las composiciones por ejemplo, composiciones liofilizadas, comprendiendo aproximadamente 10 mg del anticuerpo. En otra modalidad, las composiciones por ejemplo, composiciones liofilizadas, comprenden aproximadamente 20 mg del anticuerpo.

Los rangos intermedios a los rangos antes declarados, por ejemplo, 132-138, o 55-65, también pretenden ser parte de esta invención. Por ejemplo, rangos de valores usando una combinación de cualquiera de los valores antes declarados como límites superior y/o inferior pretenden ser incluidos. Además, las cantidades y concentraciones del intermediario de anticuerpo anti-NGF a las cantidades y concentraciones antes declaradas también pretenden ser parte de esta invención (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 56, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82,83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, o aproximadamente 150 mg del anticuerpo).

Los amortiguadores usados en las composiciones farmacéuticas de la invención son aquéllas adecuadas para mantener el pH de la composición en un rango desde aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 8.0, desde aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 7.0, desde aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 6.5, desde aproximadamente 5.5 hasta aproximadamente 7.0. De preferencia, el amortiguador mantiene el pH de la composición farmacéutica de la invención en un rango desde aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 6.0, desde aproximadamente 6.0 hasta aproximadamente 7.0, desde aproximadamente 5.5 hasta aproximadamente 6.0, desde aproximadamente 6.0 hasta aproximadamente 6.5, desde aproximadamente 5.75 hasta aproximadamente 6.25 y desde aproximadamente 5.25 hasta aproximadamente 5.75. En una modalidad, el pH de las composiciones de la invención es aproximadamente 6.0. En una modalidad, el pH de las composiciones de la invención es aproximadamente 5.0. Los rangos y valores intermedios a los pHs antes declarados también pretenden ser parte de esta invención (por ejemplo, pHs de 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3 o 6.4). Los rangos de valores usando una combinación de cualquiera de los valores antes declarados como límites superior y/o inferior pretenden ser incluidos.

Ejemplos de amortiguadores que controlarán el pH dentro del rango de aproximadamente 5.5 hasta aproximadamente 7.0 incluyen fosfato, acetato (por ejemplo, acetato de sodio), succinato (por ejemplo, succinato de sodio), arginina, gluconato, glutamato, histidina, citrato y otros amortiguadores de ácido orgánico.

En una modalidad, el amortiguador es histidina. En ciertas modalidades de la invención, la concentración de la histidina en la composición es aproximadamente 1-100 mM, aproximadamente 1-30 mM; aproximadamente 5-30 mM, aproximadamente 10-30 mM, aproximadamente 30-60 mM, aproximadamente 30-40 mM, aproximadamente 10-50 mM, aproximadamente 15-60 mM; aproximadamente 15-45 mM, aproximadamente 15-30 mM, aproximadamente 15-25 o aproximadamente 15-20 mM. En una 5 modalidad, la concentración de la histidina en la composición es aproximadamente 20 mM. En otra modalidad, la concentración de la histidina en la composición es aproximadamente 15 mM. En otra modalidad, la concentración de la histidina en la composición es aproximadamente 30 mM. Las concentraciones y rangos \0 intermediarios de histidina a las concentraciones antes declaradas también pretenden ser parte de esta invención (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 56, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 15 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82,83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, o aproximadamente 100 mM de histidina). Los rangos de concentraciones usando una combinación de cualquiera de los valores antes declarados como 2Q límites superior y/o inferior pretenden ser incluidos.

En otras modalidades de la invención, las composiciones, por ejemplo, composiciones liofilizadas, comprenden aproximadamente 1-10 mg de histidina, o aproximadamente 2-5 mg de histidina. En una modalidad, las composiciones comprenden aproximadamente 6 25 mg, por ejemplo, aproximadamente 5.7 mg, de histidina. En una modalidad, las composiciones comprenden aproximadamente 2-3 mg de histidina . Las cantidades y rangos intermediarios de histidina a las cantidades antes declaradas también pretenden ser parte de esta invención (por ejemplo, aproximadamente 1 , 1 .5, 2 , 2.2 , 2.3, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 , 5, 5. 1 , 5.2 , 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.5, 7 , 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, o aproximadamente 1 0 mg de histidina) . Los rangos de cantidades usando una combinación de cualquiera de los valores antes declarados como límites superior y/o inferior pretenden ser incluidos.

Un detergente o surfactante también puede ser ad icionado a las composiciones de anticuerpo de la invención como un excipiente. Detergentes ejemplares incluyen detergentes no iónicos tales como polisorbatos (por ejemplo, polisorbatos 20,80, etc. ) o poloxámeros (por ejemplo, poloxamer 1 88) . La cantidad de detergente adicionada es tal q ue reduce la agregación del anticuerpo formulado y/o minimiza la formación de particulados en la composición y/o reduce la adsorción . Surfactantes adecuados pueden incluir, por ejemplo, polisorbatos, polioxietilen alquil éteres, tales como Brij 35. RTM. ; o poloxámeros, tales como Tween 20, Tween 80, o poloxamer 1 88. Los detergentes preferidos son polioxietilen alq uil éteres, por ejemplo, Brij 35. RTM . , Cremophor A25, Sympatens ALM/230; polisorbatos/Tweens, por ejemplo , Polisorbato 20, Polysorbato 80, Mirj , y poloxámeros, por ejemplo, Poloxamer 1 88 , Polloxamer 407 y Tweens, por ejemplo, Tween 20 y Tween 80.

En una modalidad preferida de la invención , la composición incluye un surfactante, el cual es un polisorbato. En otra modalidad preferida de la invención , la composición contiene el detergente polisorbato 80. En una modalidad , la composición contiene entre aproximadamente 0.01 y aproximadamente 2.0 mg/ml, aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 0.05 hasta aproximadamente 2.0 mg/ml, aproximadamente 0.05 hasta aproximadamente 1 .0 mg/ml, aproximadamente 0.05 hasta aproximadamente 0.5 mg/ml, aproximadamente 0.05 hasta aproximadamente 0.1 mg/ml de polisorbato 80. En una modalidad , la composición comprende aproximadamente 1 mg/ml de polisorbato 80. En otra modalidad, la composición comprende aproximadamente 0.1 mg/ml de polisorbato 80. Todavía en otra modalidad , la composición comprende aproximadamente 0.05 mg/ml de polisorbato 80. En una modalidad, la composición comprende entre aproximadamente 0.001 % y aproximadamente 0.1 % , entre aproximadamente 0.005% y aproximadamente 0.08% , entre aproximadamente 0.007% y aproximadamente 0.06% , entre aproximadamente 0.01 % y aproximadamente 0.04% , entre aproximadamente 0.01 % y aproximadamente 0.03%, o entre aproximadamente 0.01 % y 0.02% de polisorbato 80. En una modalidad , la composición comprende aproximadamente 0.01 % de polisorbato 80. En u na modalidad , la composición comprende aproximadamente 0.02% de polisorbato 80. En otras modalidades de la invención , sin embargo, las composiciones están esencialmente libres de o no contienen un surfactante, tal como Tween o polisorbato.

En ciertas modalidades de la invención, las composiciones, por ejemplo, composiciones lifoilizadas, pueden comprender entre aproximadamente 0.01 y 0.5 mg, por ejemplo, aproximadamente 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45 o aproximadamente 0.5 mg de un surfactante. En una modalidad, las composiciones, por ejemplo, composiciones liofilizadas, comprenden aproximadamente 0.20 mg de un surfactante, por ejemplo, polisorbato 80. En una modalidad, las composiciones por ejemplo, composiciones liofilizadas, comprenden aproximadamente 0.10 mg de un surfactante, por ejemplo, polisorbato 80. Los rangos y cantidades intermedias a las concentraciones antes declaradas y cantidades de surfactantes también pretenden ser parte de esta invención, por ejemplo, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 y 2.0 mg/ml de un surfactante. Además, los rangos de valores usando una combinación de cualquiera de los valores antes declarados como límites superior y/o inferior pretenden ser incluidos, por ejemplo, 0.04 a 1.8 mg/ml de un surfactante. l-as composiciones de la invención también pueden comprender un poliol. Los polioles útiles en las composiciones de la invención incluyen, pero no están limitadas a, uno o más de trehalosa, fructosa, mañosa, maltosa, lactosa, arabiosa, xilosa, ribosa, ramnosa, galactosa, glucosa, sorbosa, melezitosa, rafinosa, manitol, xilitol, eritritol, treitol, sorbitol, glicerol, L-gluconato y sales metálicas de los mismos .

En una modalidad, el poliol es seleccionado del grupo que consiste de sorbitol , glicerol , trehalosa y manitol o combinaciones de los mismos. En una modalidad , el poliol no es manitol. En ciertas modalidades, la concentración del poliol en las composiciones de la invención es aproximadamente 1 hasta aproximadamente 1 00 mg/ml, aproximadamente 1 0 hasta aproximadamente 90 mg/ml, aproximadamente 20 hasta aproximadamente 80 mg/ml, aproximadamente 30 hasta aproximadamente 70 mg/ml, aproximadamente 40 hasta aproximadamente 60 mg/ml, o aproximadamente 50 hasta aproximadamente 60 mg/ml . En otras modalidades, las composiciones , por ejemplo, composiciones liofilizadas, de la invención comprenden un poliol a una concentración de aproximadamente 1 0-1 00 mg , aproximadamente 10 hasta aproximadamente 90 mg/ml, aproximadamente 20 hasta aproximadamente 80 mg/ml, aproximadamente 30 hasta aproximadamente 70 mg/ml, aproximadamente 40 hasta aproximadamente 60 mg/ml, o aproximadamente 50 hasta aproximadamente 60 mg/ml . En otras modalidades, las composiciones de la invención , por ejemplo, composiciones adecuadas para liofilización , comprenden aproximadamente 1 -50 mg/ml, aproximadamente 1 0-30 mg/ml o aproximadamente 20-25 mg/ml de un poliol .

Todavía en otras modalidades, las composiciones de la invención , por ejemplo, composiciones liofilizadas , comprenden aproximadamente 10-120, aproximadamente 20-120, aproximadamente 30-120, aproximadamente 40-120, aproximadamente 50-120, aproximadamente 60-120, aproximadamente 10-110, aproximadamente 10-100, aproximadamente 10-90, aproximadamente 10-80, aproximadamente 10-70 mg de un poliol o combinación de los mismos. Las concentraciones y rangos de polioles intermedios a las concentraciones antes declaradas también pretenden ser parte de esta invención (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 56, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82,83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, o aproximadamente 100 mg/ml de poliol). Los rangos de concentraciones de polioles usando una combinación de cualquiera de los valores antes declarados como límites superior y/o inferior pretenden ser incluidos, por ejemplo, 35-70 mg/ml de poliol.

En una modalidad, un poliol adecuado para usarse en las composiciones de la invención es un alcohol de azúcar, por ejemplo, sorbitol. Las composiciones de la invención pueden comprender aproximadamente 20-60 mg/ml, aproximadamente 30-60 mg/ml, aproximadamente 20-50 mg/ml, o aproximadamente 35-45 mg/ml de sorbitol. En una modalidad, las composiciones comprenden aproximadamente 40 mg/ml de sorbitol.

En otra modalidad , un poliol adecuado para uso en las composiciones de la invención es man itol. Las composiciones de la invención pueden comprender aproximadamente 1 -50 mg/ml, aproximadamente 1 0-40 mg/ml, aproximadamente 20-30 mg/ml, aproximadamente 20-25 mg/ml de manitol . En gna modalidad , las composiciones comprenden aproximadamente 20 mg/ml de manitol. En una modalidad , las composiciones de la invención , por ejemplo, composiciones adecuadas para liofilización , comprenden aproximadamente 1 -50 mg/ml , aproximadamente 10-30 mg/ml o aproximadamente 20-25 mg/ml de manitol , y de preferencia comprenden 20 mg/ml de manitol . Todavía en otras modalidades , las composiciones de la invención , por ejemplo, composiciones liofilizadas, comprenden aproximadamente 40-60 mg, aproximadamente 45-55 mg , o aproximadamente 48-52 mg de manitol. En una modalidad , las composiciones comprenden aproximadamente 50 mg , por ejemplo, aproximadamente 49.5 mg , de manitol.

En otra modalidad , un poliol adecuado para uso en las composiciones de la invención es glicerol . Las composiciones de la invención pueden comprender aproximadamente 1 -50 mg/ml, aproximadamente 1 0-40 mg/ml , aproximadamente 20-30 mg/ml, aproximadamente 20-25 mg/ml , o aproximadamente 20 mg/ml de glicerol.

Una o más azúcares también pueden ser adicionadas a las composiciones de la invención. Ejemplos no limitantes de azúcares que son útiles en las composiciones de la invención incluyen maltosa, lactosa, celobiosa, gentiobiosa, melibiosa y turanosa, fructosa, levulosa, glucosa y dextrosa, lactosa, sacarosa y trehalosa (también conocidas como micosa o tremalosa), rafinosa, melezitosa, estaquiosa y verbascosa. En ciertas modalidades, la concentración de azúcar es aproximadamente 1 hasta aproximadamente 120 mg/ml, aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 10 hasta aproximadamente 90 mg/ml, aproximadamente 20 hasta aproximadamente 80 mg/ml, aproximadamente 30 hasta aproximadamente 70 mg/ml, aproximadamente 40 hasta aproximadamente 60 mg/ml, o aproximadamente 50 hasta aproximadamente 60 mg/ml. En otras modalidades, las composiciones de la invención, por ejemplo, composiciones liofilizadas, comprenden aproximadamente 10-120, aproximadamente 20-120, aproximadamente 30-120, aproximadamente 40-120, aproximadamente 50-120, aproximadamente 60-120, aproximadamente 10-110, aproximadamente 10-100, aproximadamente 10-90, aproximadamente 10-80, aproximadamente 10-70 mg de un azúcar.

En ciertas modalidades, el azúcar es sacarosa y está presente en las composiciones de la invención a aproximadamente 10-100 mg/ml, aproximadamente 10-90 mg/ml, aproximadamente 10-80 mg/ml, aproximadamente 10-70 mg/ml, aproximadamente 29-90 mg/ml, aproximadamente 20-80 mg/ml, aproximadamente 20-70 mg/ml, aproximadamente 30-70 mg/ml, o aproximadamente 25-65 mg/ml de sacarosa. En una modalidad, las composiciones comprenden aproximadamente 70 mg/ml de sacarosa. En una modalidad, las composiciones, por ejemplo, composiciones adecuadas para liofilizacion, comprenden aproximadamente 5 mg/ml de sacarosa. En una modalidad, las composiciones, por ejemplo, composiciones adecuadas para liofilizacion, comprenden aproximadamente 45 mg/ml de sacarosa. En otra modalidad, las composiciones, por ejemplo, composiciones adecuadas para liofilización, comprenden aproximadamente 45 mg/ml de sacarosa.

Todavía en otras modalidades, las composiciones de la invención, por ejemplo, composiciones liofilizadas, comprenden aproximadamente 1-00, aproximadamente 1-70, aproximadamente 1-50, aproximadamente 10-120 mg, aproximadamente 10-100 mg, aproximadamente 10-50 mg, aproximadamente 10-20 mg, o aproximadamente 12 mg, por ejemplo, aproximadamente 12.25 mg, de sacarosa. En una modalidad, las composiciones, por ejemplo, composiciones liofilizadas, comprenden aproximadamente 50-120 mg, aproximadamente 75-120 mg o aproximadamente 100-120 mg de sacarosa, por ejemplo, aproximadamente 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 o 120 mg de sacarosa. En una modalidad, las composiciones, por ejemplo, composiciones liofilizadas, comprenden aproximadamente 113 mg, de sacarosa. En otra modalidad, las composiciones, por ejemplo, composiciones liofilizadas, comprenden aproximadamente 70 mg, de sacarosa. En otra modalidad, las composiciones, por ejemplo composiciones liofilizadas, comprenden aproximadamente 20 mg, de sacarosa. En otra modalidad, las composiciones, por ejemplo composiciones liofilizadas, comprenden aproximadamente 10 mg, de sacarosa. En otra modalidad, las composiciones, por ejemplo, composiciones liofilizadas, comprenden aproximadamente 5 mg, de sacarosa.

En otra modalidad, el azúcar es trehalosa. La trehalosa puede estar presente en las composiciones a aproximadamente 10-100 mg/ml, aproximadamente 10-90 mg/ml, aproximadamente 10-80 mg/ml, aproximadamente 10-70 mg/ml, aproximadamente 29-90 mg/ml, aproximadamente 20-80 mg/ml, aproximadamente 20-70 mg/ml, aproximadamente 30-70 mg/ml, aproximadamente 25-65 mg/ml, o aproximadamente 35-55 mg/ml. En una modalidad, las composiciones, por ejemplo composiciones adecuadas para liofilización, comprenden aproximadamente 40-50 mg/ml, por ejemplo, aproximadamente 45 mg/ml de trehlaosa.

Las concentraciones y rangos de azúcares intermedios a las concentraciones antes declaradas también pretenden ser parte de seta invención (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 o aproximadamente 120 mg/ml de azúcares). Los rangos de concentraciones de azúcares usando una combinación de cualquiera de los valores antes declarados como límites superior y/o inferior pretenden ser incluidos, por ejemplo, 35-70 mg/ml de azúcares.

En otras modalidades, cualquier combinación de uno o más de los azúcares anteriores y uno o más de los polioles anteriores puede incluirse junto con una composición de la invención. Por ejemplo, una composición de la invención, por ejemplo, una composición adecuada para liofilización, puede comprender un poliol, por ejemplo, manitol, y un azúcar, por ejemplo, sacarosa. En ciertas modalidades, la proporción molar del anticuerpo anti-NGF, o fragmento de unión a antígeno del mismo, a poliol (por ejemplo, manitol), azúcar (por ejemplo, sacarosa) o combinaciones de los mismos (por ejemplo, manitol y sacarosa) es mayor que aproximadamente 1:1200, de preferencia mayor que aproximadamente 1:1400, más preferiblemente entre aproximadamente 1:1400 y 1:1500, o mayor que aproximadamente 1:1500.

En ciertas modalidades de la invención, las composiciones comprenden además un aminoácido, por ejemplo, metionina. En una modalidad, las composiciones comprenden aproximadamente 1-10 mM, aproximadamente 2-10 mM, aproximadamente 2-9 mM, aproximadamente 2-8 mM, aproximadamente 2-7 mM, aproximadamente 2-6 mM, aproximadamente 2-5 mM, aproximadamente 3-8 mM, aproximadamente 3-7 mM; aproximadamente 3-6 mM, o aproximadamente 3-5 mM de metionina. En una modalidad, las composiciones comprenden aproximadamente 4 mM metionina. En otra modalidad, las composiciones comprenden aproximadamente 5 mM metionina. En una modalidad, las composiciones comprendiendo metionina también comprenden un poliol, por ejemplo, manitol y/o un azúcar, por ejemplo, sacarosa. En una modalidad, las composiciones comprenden metionina, manitol y sacarosa. En una modalidad, las composiciones no comprenden un aminoácido, por ejemplo, metionina.

En ciertas modalidades de la invención, las composiciones, por ejemplo, composiciones liofilizadas, pueden comprender entre aproximadamente 0.1-10 mg, 0.5-9 mg, 1.0-8 mg, 1-6 mg, 1-5 mg, 1-4 mg, 1-3 mg o 1-2 mg, por ejemplo, aproximadamente 1.5, 1.6, 1.7, 1.75, 1.8, 1.82, 1.83, 1.84, 1.85, 1.9 o 2.0 mg de metionina. En una modalidad, las composiciones, por ejemplo composiciones liofilizadas, comprenden aproximadamente 1.8 mg, por ejemplo, 1.83 mg, de metionina. Los rangos y cantidades intermedias a las concentraciones y cantidades de metionina antes declaradas también pretenden ser parte de esta invención, por ejemplo, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 y 10 mM. Además, los rangos de valores usando una combinación de cualquiera de los valores antes declarados como límites superior y/o inferior pretenden ser incluidos, por ejemplo, 3.5-9 mM.

En una modalidad, la composición está esencialmente libre de conservadores, tales como alcohol bencílico, fenol, m-cresol, clorobutanol y bencetonio Cl. En otra modalidad , un conservador puede ser incluido en la composición . Uno o más portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables diferentes, tales como aquéllos descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences (Ciencias farmacéuticas de Remington), 16a edición , Osol. A. Ed . ( 1 980) pueden ser incluidos en la composición siempre que no afecten adversamente de manera significativa las características deseadas de la composición. Portadores , excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos a los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen : agentes amortiguadores adicionales; co-solventes; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina ; agentes quelantes , tales como EDTA; complejos de metal (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) ; polímeros biodeg radables, tales como poliésteres; y/o contraiones formadores de sales, tal como sodio.

En modalidades particulares, las composiciones farmacéuticas de la invención son formuladas como un liq uido ya sea comprendiendo, consistiendo esencialmente de, o consistiendo de (a) aproximadamente 1 -10, 5- 1 5, 1 0-20, 10-30, 20-50 o 20-75 mg/ml de un anticuerpo anti-NG F , o fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) aproximadamente 5-50, 5-30, 5-20 o 1 0-20 m M histidina; y (c) aproximadamente 0.01 -0.02% polisorbato 80; en donde el pH de la composición es aproximadamente 5.0-6.0 o aproximadamente 5.5. En ciertas modalidades preferidas, el anticuerpo anti-NGF es PG 100 o un fragmento de u nión a antígeno de PG 1 1 0. En ciertas modalidades preferidas, la concentración de histidina es aproximadamente 10 o 15 mM.

En modalidades particulares, las composiciones farmacéuticas de la invención son formuladas como un líquido ya sea comprendiendo, consistiendo esencialmente de, o consistiendo de (a) aproximadamente 1-10, 5-15, 10-20, 10-30, 20-50 o 20-75 mg/ml de un anticuerpo anti-NGF, o fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) aproximadamente 5-50, 5-30, 5-20 o 10-20 mM de histidina; (c) aproximadamente 0.01-0.2% de polisorbato 80; y (d) aproximadamente 20-80, 30-80 o 40-80 mg de un poliol; en donde el pH de la composición es aproximadamente 5.0-6.0 o aproximadamente 5.5. En ciertas modalidades preferidas, el anticuerpo anti-NGF es PG100 o un fragmento de unión a antígeno de PG110. En ciertas modalidades preferidas, la concentración de histidina es aproximadamente 10 o 15 mM. En ciertas modalidades preferidas, el poliol es manitol o sorbitol. En otras modalidades preferidas, la concentración de poliol es 20, 30 o 40 mg/ml. En otras modalidades preferidas, la composición comprende además un azúcar, de preferencia sacarosa o trehalosa, a aproximadamente 10-20, 20-50 o 30-80 mg/ml.

En modalidades particulares, las composiciones farmacéuticas de la invención son formuladas como un líquido ya sea comprendiendo, consistiendo esencialmente de, o consistiendo de (a) aproximadamente 1-10, 5-15, 10-20, 10-30, 20-50 o 20-75 mg/ml de un anticuerpo anti-NGF, o fragmento de unión a antígeno del mismo: (b) aproximadamente 5-50, 5-30, 5-20 o 1 0-20 mM de histidina ; (c) aproximadamente 0.01 -0.2% de polisorbato 80; y (d) aproximadamente 20-80, 30-80 o 40-80 mg/ml de un azúcar; en donde el pH de la composición es aproximadamente 5.0-6.0 o aproximadamente 5.5. En ciertas modalidades preferidas, el anticuerpo anti-NG F es PG 1 00 o un fragmento de unión a antígeno de PG 1 1 0. En ciertas modalidades preferidas, la concentración de histidina es aproximadamente 10 o 1 5 mM . En ciertas modalidades preferidas, el azúcar es sacarosa o trehalosa. En otras modalidades preferidas, la concentración de azúcar es 70 o 80 mg/ml . En modalidades particulares, las composiciones farmacéuticas de la invención son provistas en forma liofilizada adecuada para reconstitución a forma líquida. Para cada mi de líquido reconstituido, las composiciones liofilizadas comprenden , consisten esencialmente de, o consisten de (a) aproximadamente 1 -1 0, 5-1 5, 10-20, 1 0-30, 20-50 o 20-75 mg de un anticuerpo anti-NGF, o fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) aproximadamente 1 -20, 1 -1 0, 1 -5 o 2-4 mg de histidina ; y (c) aproximadamente 0.1 a 0.2 mg de polisorbato 80. En ciertas modalidades preferidas, las composiciones contienen aproximadamente 1 0, 20 o 50 mg de PG 1 00 o un fragmento de u nión a antígeno de PG 1 1 0. En ciertas modalidades preferidas, la composición contiene aproximadamente 2-3 mg de histidina . En ciertas modalidades preferías, la composición contiene 0.1 mg de polisorbato 80.

En modalidades particulares, las composiciones farmacéuticas de la invención son provistas en forma liofilizada adecuada para reconstitución a forma l íquida . Para cada mi de líquido reconstituido, las composiciones liofilizadas comprenden , consisten esencialmente de, o consisten de (a) aproximadamente 1 -1 0, 5-1 5, 10-20, 1 0-30, 20-50 o 20-75 mg de un anticuerpo anti-NG F, o fragmento de un ión a antígeno del mismo; (b) aproximadamente 1 -20, 1 -10, 1 -5 o 2-4 mg de histidina ; (c) aproximadamente 0.1 a 0.2 mg de polisorbato 80; y (d) aproximadamente 20-80, 30-80 o 49-80 mg de un poliol . En ciertas modalidades preferidas, las composiciones contienen aproximadamente 1 0, 20 o 50 mg de PG1 00 o un fragmento de unión a antígeno de PG 1 1 0. En ciertas modalidades preferidas, la composición contiene aproximadamente 2-3 mg de histid ina. En ciertas modalidades preferidas, la composición contiene 0.1 mg de polisorbato 80. En ciertas modalidades preferidas, la composición contiene 10, 20, 30 o 40 mg de manitol o sorbitol. En ciertas modalidades preferidas, la composición contiene además aproximadamente 1 0-40 mg de un azúcar, de preferencia sacarosa o trehalosa.

En modalidades particulares, las composiciones farmacéuticas de la invención son provistas en forma liofilizada adecuada para reconstitución a forma líquida. Para cada mi de líquido reconstituido, las composiciones liofilizadas comprenden , consisten esencialmente de , o consisten de (a) aproximadamente 1 -1 0, 5,-1 5, 1 0-20, 1 9-30, 20-50 o 29-75 mg de un anticuerpo anti-NGF, o fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) aproximadamente 1 - 20, 1 -10, 1 -5 o 2-4 mg de histidina ; (c) aproximadamente 0.1 a 0.2 mg de polisorbato 80; y (d) 20-80, 30-80 o 40-80 mg/ml de un azúcar. En ciertas modalidades preferías, las composiciones contienen aproximadamente 1 0, 20 o 50 mg de PG 1 00 o un fragmento de unión a antígeno de PG 100. En ciertas modalidades preferidas , la composición contiene aproximadamente 2-3 mg de histidina . En ciertas modalidades preferías, la composición contiene 0.1 mg de polisorbato 80. En ciertas modalidades preferidas , la composición contiene aproximadamente 20, 40 , 70 u 80 mg de un azúcar, de preferencia sacarosa o trehalosa.

Las composiciones de la invención también pueden ser combinadas con uno o más agentes terapéuticos diferentes según sea necesario para la indicación particular siendo tratada, de preferencia aq uéllas con actividades complementarias que no afectan adversamente el anticuerpo de la composición. Tales agentes terapéuticos están presentes convenientemente en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido .

Las composiciones a ser usadas para administración in vivo deben ser estériles. Esto es fácilmente logrado mediante filtración a través de membranas de filtración estériles antes de, o siguiendo, la preparación de la composición .

Como se describe antes, las composiciones de la invención, por ejemplo, líquidas, adecuadas para liofilización y composiciones liofilizadas, tienen propiedades de estabilidad y almacenamiento ventajosas. La estabilidad de la composición l íqu ida no es dependiente de la forma de almacenamiento e incluye, pero no está limitada a, composiciones las cuales son congeladas, liofilizadas, secadas por aspersión , o composiciones en las cuales el ingrediente activo es suspendido. La estabilidad puede medirse a una temperatura seleccionada du rante un periodo de tiempo seleccionado. En un aspecto de la invención , la proteína en las composiciones líqu idas es estable en una forma l íquida durante al menos aproximadamente 3 meses; al menos aproximadamente 4 meses, al menos aproximadamente 5 meses; al menos aproximadamente 6 meses; al menos aproximadamente 1 2 meses; al menos aproximadamente 1 8 meses o más . Los ra ngos intermed ios a los periodos de tiempo antes declarados también pretenden ser parte de esta invención , por ejemplo, aproximadamente 9 meses y así sucesivamente. Además, los rangos de valores usando una combinación de cualquiera de los valores antes declarados como límites superior y/o inferior pretenden ser incluidos .

De preferencia , la composición es estable a temperatura ambiente , o a aproximadamente 30°C , o a aproximadamente 40°C durante al menos aproximadamente 1 mes y/o estable a aproximadamente 2-8°C durante al menos aproximadamente 1 año, o más preferiblemente estable a aproximadamente 2-8°C durante al menos aproximadamente 2 años. Adicionalmente , la composición es de preferencia estable siguiendo congelación (a, por ejemplo, -80°C) y descongelación de la composición , de aqu í en adelante referido como un "ciclo de congelación/descongelación". En una modalidad , la composición es estable siguiendo u no, dos, tres o más ciclos de congelación -descongelación .

La estabilidad de una proteína en una composición l íquida también puede ser definida como el porcentaje de monómero, agregado o fragmento , o combinaciones de los mismos, de la proteína en la composición , por ejemplo, como se mide mediante dispersión de luz UV o mediante cromatografía de exclusión por tamaño. En un aspecto de la invención , una composición líquida estable es una composición teniendo menos de aproximadamente 10%, y de preferencia menos de aproximadamente 5% y más preferiblemente menos de aproximadamente 2% de la proteína estando presente como ag regado en la composición .

En una modalidad, la estabilidad física de una composición líquida es determinada al determinar la tu rbidez de la composición siguiendo un ensayo de tensión de agitación , por ejemplo, ensayo de tensión de agitación de 24 horas o 48 horas. Por ejemplo, un ensayo de tensión de agitación puede ser realizado al colocar un volumen adecuado de u na composición líquida en un vaso de laboratorio con un agitador mag nético, por ejemplo, (H P multipoint, 550 rpm), remover alícuotas en cualquier momento adecuado, por ejemplo, a T0-T48 (h) y realizar ensayos adecuados seg ún se desee sobre las alícuotas. Las muestras de una composición bajo las mismas condiciones pero sin agitación sirven como control. Las mediciones de turbidez pueden ser realizadas usando un sistema de medición de turbidez de laboratorio de Hach (Alemania) y son reportadas como unidades nefelométricas (NTU) .

Las composiciones de la invención también tienen propiedades de tolerabilidad ventajosas. La tolerabilidad es evaluada con base en valoración de dolor de sitio de inyección percibido por el sujeto usando la Escala Análoga Visual de Dolor (VAS) . U n (VAS) es un instrumento de med ición que mide el dolor como varía a través de un continuo de valores, por ejemplo, desde ninguno hasta una cantidad extrema de dolor. Operacionalmente, un VAS es una l ínea horizontal , aproximadamente 100 mm de longitud , anclado por descriptores numéricos y/o de palabras, por ejemplo , 0 o 1 0, o "sin dolor" a "dolor agud ísimo", opcionalmente con descriptores de palabras o numéricos adicionales entre los extremos, por ejemplo, suave, moderado y severo; o 1 a 9) (ver, por ejemplo, Lee et al. (2000) Acad . Emerg . Med . 7:550) .

Los indicadores adicionales de tolerabilidad que pueden medirse incluyen , por ejemplo, la Escala Draize (hemorragia, petequia , eritema , edema, prurito) y moretones.

I II . Anticuerpos anti-NG F Los anticuerpos anti-NGF q ue pueden ser usados en las composiciones farmacéuticas de la invención son descritos, por ejemplo, en la publicación de PCT no. WO/201 0/1 28398 , publicación de PCT no. WO 2001 /78698 , publicación de PCT No. WO 2001 /64247, publicación de PCT No. Wo 2002/096458, publicación de PCT No. WO 2004/032870 , publicación de PCT No. WO 2004/058184, publicación de PCT No. WO 2005/061540, publicación de PCT No. WO 2005/019266, publicación de PCT No. WO 2006/077441, publicación de PCT No. WO 2006/131951, publicación de PCT No. WO 2006/110883, publicación de PCT No. WO 2009/023540, patente estadounidense no. 7,449,616; publicación estadounidense no. US 20050074821, publicación estadounidense no. US 20080033157, publicación estadounidense no. US 20080182978 o publicación estadounidense no. US 20090041717, cuyos contenidos enteros de cada uno son incorporados en la presente por referencia, en particular, los contenidos como se relacionan a anticuerpos anti-NGF.

En una modalidad, los anticuerpos anti-NGF a ser usados en las composiciones farmacéuticas son caracterizados al tener estabilidad in vivo intensificada, como es evidenciado por la vida media de eliminación terminal larga observada in vivo. Aunque no se pretende que esté limitado por mecanismo, se piensa que la vida media de eliminación terminal extendida del anticuerpo resulta de una velocidad de eliminación reducida del anticuerpo en lugar de un aumento en el volumen de distribución del anticuerpo. De preferencia, los anticuerpos a ser usados en las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden una región constante de lgG45 humana que comprende una mutación. Una mutación preferida es una mutación de región de gozne. De preferencia, la mutación de región de gozne comprende mutación de serina en la posición de aminoácidos 108 de SEQ ID NO: 9 (en donde SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia de aminoácidos de la región constante de lgG4 humana tipo natural). De manera más preferible, la mutación de región de gozne comprende mutación de la serina en la posición de aminoácido 108 de SEQ ID NO: 9 a prolina. En una modalidad preferida, la región constante de lgG4 humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

En una modalidad, un anticuerpo anti-NGF a ser usado en las composiciones farmacéuticas de la invención exhibe una vida media de eliminación terminal inesperadamente larga, tal como una vida media de eliminación terminal en un mono cinomolgo de al menos 15 días y normalmente en el rango de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 22 días (o en un rango de 15-22 días), o en un rango de aproximadamente 15 días hasta aproximadamente 28 (o en un rango de 15-28 días) o en un rango de aproximadamente 21 días hasta aproximadamente 28 días (o en un rango de 21-28 días). Este anticuerpo anti-NGF estabilizado también exhibe una vida media de eliminación terminal en ratas de al menos 8 días, normalmente en el rango de aproximadamente 8 hasta aproximadamente 9 días (o en un rango de 8-9 días).

En una modalidad, un anticuerpo anti-NGF preferido para uso en composiciones farmacéuticas de la invención, PG110, exhibe una vida media de eliminación terminal promedio en monos cinomolgos de al menos 15 días y normalmente más larga. Por ejemplo, en un estudio de monos cinomolgos, una vida media de eliminación terminal promedio en un rango de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 22 d ías fue observada . En otro estudio de mono cinomolgo, una vida media de eliminación terminal promedio en un rango de aproximadamente 21 hasta aproximadamente 28 d ías fue observada . Adicionalmente, PG 1 1 0 exhibe u na vida media de eliminación terminal promedio en ratas de aproximadamente 8 hasta aproximadamente 9 días. Aú n adicionalmente, como es sabido en la técnica que la vida media de eliminación terminal de IgG en humanos es aproximadamente dos veces aquélla de los monos, se predice que los anticuerpos anti-NG F de la invención , tal como PG 1 10, tend rá vida media de eliminación terminal en humanos de al menos 1 0-30 días, o más preferiblemente al menos 30 d ías o al menos 40 d ías, o en un rango de aproximadamente 1 0 d ías hasta aproximadamente 40 días (o en un rango de 1 0-40 d ías) o en un rango de aproximadamente 1 5 hasta aproximadamente 30 d ías (o en un rango de 1 5-30 d ías). Adicional o alternativamente, el anticuerpo puede exhibir una vida media farmacológica promedio en humanos de al menos 30 días, o al menos 35 d ías, o al menos 40 d ías, o en un rango de al menos cuatro a seis semanas (o en u n rango de cuatro a seis semanas) , o en un rango de al menos cuatro a seis semanas (o en un rango de cuatro a seis semanas), o en un rango de al menos cuatro a siete semanas (o en u n rango de cuatro a siete semanas) o en un rango de al menos cuatro a ocho semanas (o en un rango de cuatro a ocho semanas). Como se describe adicionalmente en el Ejemplo 8, u n anticuerpo anti-NGF de la invención ha mostrado tener una vida media farmacológica promedio en humanos en los rangos antes mencionados.

La vida media de eliminación terminal par PG110 en monos cinomolgos es considerablemente mayor que la vida media que ha sido reportada en la técnica para otros anticuerpos de lgG4 en monos cinomolgos. Por ejemplo, una vida media de aproximadamente 40-90 horas (aproximadamente 1.6-3.8 días) en monos cinomolgos ha sido reportada para CDP571, un anticuerpo anti-TNF de lgG4 (ver Stephens, S. et al. (1995) Immunol. 85:668-674). De manera similar, una vida media de aproximadamente 3 'días en monos cinomolgos ha sido reportada para natalizumab, un anticuerpo anti-integrina de lgG4 (ver Refusal CHMP Assessment Report for Natalizumab, European Medicines Agency, Londres, 15 de noviembre de 2007, Doc. Ref. EMEA/CHMP/8203/2008).

En una modalidad, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden anticuerpos anti-NGF, en donde la mutación de región de gozne preferida es una mutación de serina a prolina en la posición 108 en SEQ ID NO: 9. Esta mutación ha sido descrita previamente en la técnica (ver Angal, S. et al. (1993) Mol. Immunol. 30:105-108) y reportada como que elimina la heterogeneidad de moléculas de lgG4, en particular la formación de medios anticuerpos conteniendo una sola cadena pesada y una sola cadena ligera. De acuerdo con esto, la substitución de un aminoácido diferente de prolina en la posición 108 de SEQ ID NO: 9 también es abarcada por la invención, en donde la substitución logra el mismo efecto que la mutación de Ser a Pro para eliminar la heterogeneidad de la molécula de lgG4 (por ejemplo, la formación de medios anticuerpos). La capacidad de una mutación en la posición 108 para eliminar la heterogeneidad de la molécula de lgG4 puede ser valorada como se describió en Angal et al. (1993), supra.

Además de, o alternativo a, la modificación en la posición 108 de SEQ ID NO: 9, se han descrito otras mutaciones de región de gozne de IgG que mejoran la afinidad de la interacción de FcRn-lgG, resultando en una vida media extendida para la IgG modificada. Ejemplos de tales modificaciones adicionales o alternativas incluyen mutaciones en uno o más residuos de región constante de IgG correspondientes a: Thr250, Met252, Ser254, Thr256, Thr307, Glu308, Met428, His433 y/o Asn434 (como se describe adicionalmente en Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Petkava, S.B. et al. (2006) Int. Immunol. 18:1759-1769; Hinton, P.R. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:6213-6216; Kamei, D.T. et al. (2005) Biotechnol. Bioeng. 92:748-760; Vacaro, C. et al. (2005) Nature Biotechnol. 23:1283-1288; Hinton, P.R. et al. (2006) J. Immunol. 176:346-356).

Todavía adicionalmente, alternativas a mutaciones de región de gozne, otras modificaciones estabilizantes de la región constante de lgG4 han sido descritas. Por ejemplo, en otras modalidades, la mutación de la región constante de lgG4 humana comprende la substitución de la región CH3 de lgG4 con una región de CH3 de lgG1, la substitución de las regiones CH2 y CH3 de lgG4 con las regiones CH2 y CH3 de lgG1 o substitución de la arginina en la posición 409 de la región constante de lgG4 (de acuerdo con la numeración de Kabat) con una lisina, como se describe adicionalmente en la publicación de patente estadounidense 20080063635. Todavía en otras modalidades, la mutación de la región constante de lgG4 humana comprende la substitución de Arg409, Phe405 o Lys370 (de acuerdo con la n umeración de Kabat), tal como substitución de Arg409 con Lys , Ala, Th r, Met o Leu , o substitución de Phe405 con Ala , Val , G ly o Leu , como se describe adicionalmente en la publicación de PCT WO 2008/1 45142.

Una mutación deseada puede ser introducida en el dominio de región constante de lgG4 h umana usando técnicas de DNA recombinantes estándares, tal como mutagénesis de sitio dirigido o mutagénesis mediada por PCR de un ácido nucleico q ue codifica la región constante de lgG4 humana . Adicionalmente, el DNA que codifica una región variable de cadena pesada de anticuerpo puede ser introducida en un vector de expresión que codifica una región constante de lgG4 humana mutada , de manera que la región variable y región constante se vuelven enlazadas operativamente, para crear por ello el vector q ue codifica una cadena pesada de inmunoglobulina de longitud completa, en la cual la región constante es una región constante de lgG4 h umano mutada . El vector de expresión puede ser usada entonces para expresar la cadena pesada de inmunoglobulina de longitud completa usando métodos de expresión de prote ína recombinante estándares. Por ejemplo, un anticuerpo anti-NGF de la invención puede ser construida como se describe con más detalle en el Ejemplo 1 .

La vida media de eliminación terminal de un anticuerpo puede ser determinada usando métodos estándares conocidos en la técnica. Por ejemplo, después de la administración del anticuerpo a un sujeto (por ejemplo, un mono cinomolgo, una rata Sprague-Dawley) , las muestras de sang re pueden ser obtenidas a varios puntos en el tiempo después de la admin istración y la concentración de anticuerpo en el suero de las muestras de sang re puede ser determinada usando una técnica conocida en el área pa ra determinar la concentración de anticuerpo (tal como un ensayo ELISA) . El cálculo de la vida media terminal del anticuerpo puede lograrse usando métodos farmacocinéticos conocidos, por ejemplo, usando un sistema de computadora y programa de cómputo diseñados para calcular parámetros farmacocinéticos (un ejemplo no limitante de los cuales es SNBL USA Pharmacokintics Analysis System con programa de cómputo WinNonlin).

En una modalidad , las composiciones farmacéuticas de la invención contienen u n anticuerpo anti-NG F, o porción de unión a antígeno del mismo, comprendiendo las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo PG1 1 0. La región variable de cadena pesada de PG 1 10 es mostrada en SEQ I D NO : 1 y la región variable de cadena ligera de PG 1 1 0 es mostrada en SEQ I D NO: 2. De acuerdo con esto, en una modalidad , el anticuerpo a nti-NG F de la invención comprende una región variable de cadena pesada comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 1 . En otra modalidad, el anticuerpo anti-NGF de la invención comprende una región variable de cadena ligera comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Todavía en otra modalidad, el anticuerpo anti-NGF de la invención comprende una región variable de cadena pesada comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.

La secuencia de aminoácidos de longitud completa de la cadena pesada de PG110 (regiones variables y constantes) es mostrada en SEQ ID NO:13. Esta cadena pesada puede ser preparada a partir de una cadena pesada precursora, la cual incluye una secuencia de señal o líder, tal como la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12. La cadena pesada precursora de SEQ ID NO>: 12 es codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:11.

La secuencia de aminoácidos de longitud completa de la cadena ligera de PG110 (regiones variables y constantes) es mostrada en SEQ ID NO: 16. Esta cadena ligera puede ser preparada a partir de una cadena ligera precursora, la cual incluye una secuencia de señal o líder, tal como la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 15. La cadena ligera precursora de SEQ ID NO: 15 es codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 14.

De acuerdo con esto, en otra modalidad, el anticuerpo anti-NGF para uso en las composiciones farmacéutica de la invención comprenden una cadena pesada comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13, en donde el anticuerpo tiene una vida media de suero en un mono cinomolgo de al menos 15 días. En otra modalidad, la vida media de suero en un mono cinomolgo puede estar en un rango de aproximadamente 15 días hasta aproximadamente 22 días (o en un rango de 15-22 días). En otras modalidades, la vida media de suero en una rata puede ser al menos 8 días o en un rango de aproximadamente 8 días hasta aproximadamente 9 días (o en un rango de 8-9 días). Todavía en otras modalidades, la vida media de suero en un humano puede ser al menos 10-30 días, o al menos 10 días, o al menos 15 días, o al menos 20 días, o al menos 25 días, o al menos 30 días, o al menos 40 días o en un rango de aproximadamente 10 días hasta aproximadamente 40 días (o en un rango de 10-40 días) o en un rango de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30 días (o en un rango de 15-30 días). Adicional o alternativamente, el anticuerpo puede exhibir una vida media farmacológica promedio en humanos de al menos 30 días, o al menos 35 días, o al menos 40 días, o en un rango de al menos cuatro a seis semanas (o en un rango de cuatro a seis semanas), o en un rango de al menos cuatro a siete semanas (o en un rango de cuatro a siete semanas) o en un rango de al menos cuatro a ocho semanas (o en un rango de cuatro a ocho semanas). De preferencia, la cadena pesada es codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 11. De preferencia, la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. De preferencia, la cadena ligera es codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 14.

Todavía en otra modalidad, el anticuerpo anti-NGF para uso en las composiciones farmacéuticas de la invención comprende una cadena pesada comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y una cadena ligera comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

Todavía en otra modalidad, el anticuerpo anti-NGF para uso en las composiciones farmacéuticas de la invención comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 14.

Dado que la especificidad de unión de PG110 es provisto por las regiones determinantes de complementaridad (CDRs) del dominio variable, en otra modalidad, el anticuerpo anti-NGF para uso en las composiciones farmacéuticas de la invención comprende las CDRs de la cadena pesada de PG110, la cadena ligera de PG110 o ambas.

Las CDRs de cadena pesada 1, 2 y 3 de PG110 son mostradas en SEQ ID NOs: 3, 4, y 5, respectivamente. Las CDRs de cadena ligera 1, 2 y 3 de PG110 son mostradas en las SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, respectivamente. Las CDRs de cadena ligera 1, 2 y 3 de PG110 son mostradas en SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, respectivamente. De acuerdo con esto, en una modalidad, el anticuerpo anti-NGF de la invención comprende una región variable de cadena pesada comprendiendo CDRs 1, 2 y 3 teniendo las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 4 y 5, respectivamente. En otra modalidad , el anticuerpo anti-NG F para uso en las composiciones farmacéuticas de la invención comprende una región variable de cadena ligera comprendiendo CDRs 1 , 2 y 3 teniendo las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, respectivamente. Todavía en otra modalidad , el anticuerpo anti-NG F para uso en las composiciones farmacéuticas de la invención comprende una región variable de cadena pesada comprendiendo CDRs 1 , 2 y 3 teniendo las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NOs : 3, 4, y 5, respectivamente, y comprende una región variable de cadena ligera comprendiendo CDRs 1 , 2 y 3 teniendo las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NOs: 3, 4 y 5 , respectivamente, y comprende una región va riable de cadena ligera comprendiendo CDRs 1 , 2 y 3 teniendo las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NOs: 6, 7 y 8, respectivamente .

Todavía en otra modalidad , un anticuerpo anti-NG F para uso en las composiciones farmacéuticas de la invención puede comprender regiones variables de cadena pesada y ligera comprendiendo secuencias de aminoácidos que son homologas a las regiones variables de cadena pesada y/o ligera de PG 1 1 0, y en donde los anticuerpos retienen la estabilidad in vivo intensificada exhibida por PG 1 1 0. Por ejemplo, la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-NGF puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% homologa , más preferiblemente al menos 95% homologa, más preferiblemente al menos 97% homologa y aún más preferiblemente al menos 99% homologa a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1. La región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-NGF puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% homologa, más preferiblemente al menos 95% homologa, más preferiblemente al menos 97% homologa y aún más preferiblemente al menos 99% homologa a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

Como se usa en la presente, el porcentaje de homología entre dos secuencias de aminoácidos es equivalente al porcentaje de identidad entre las dos secuencias. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = # de posiciones idénticas/# total de posiciones x 100), considerando el número de aberturas, y la longitud de cada abertura, que necesitan ser introducidas para alineamiento óptimo de las dos secuencias. La comparación de secuencias y determinación de porcentaje de identidad entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matemático. Por ejemplo, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede ser determinada usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)), que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad de longitud de abertura de 12 y una penalidad de abertura de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede ser determinada usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Bio. 48:444-453 (1970)), el cual ha sido incorporado en el programa GAP y en el paquete de programas de cómputo GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando ya sea una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de abertura de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.

Todavía en otra modalidad, un anticuerpo anti-NGF para uso en las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender regiones variables de cadena pesada y ligera comprendiendo las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y/o ligera de PG110, pero en donde una o más substituciones conservadoras han sido introducidas en la o las secuencias, todavía el anticuerpo retiene la estabilidad in vivo intensificada exhibió por PG110. Por ejemplo, la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-NGF puede comprender una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 excepto por 1, 2, 3, 4 o 5 substituciones de aminoácidos conservadores como se compara con SEQ ID NO: 1. La región variable de cadena ligera del anticuerpo anti-NGF puede comprender una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 excepto por 1, 2, 3, 4 o 5 substituciones de aminoácidos conservadores como se compara con SEQ ID NO: 2.

Como se usa en la presente, el término "substitución de aminoácidos conservadora" pretende referirse a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión o estabilidad del anticuerpo conteniendo la secuencia de aminoácidos. Tales modificaciones conservadoras incluyen substituciones, adiciones y supresiones de aminoácidos. Las modificaciones pueden ser introducidas en un anticuerpo de esta descripción mediante técnicas estándares conocidas en la técnica, tal como mutagénesis de sitio dirigido y mutagénesis mediada por PCR. Las substituciones de aminoácidos conservadores son unos en los cuales el residuo de aminoácido es reemplazado con un residuo de aminoácido teniendo una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos teniendo cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Así, uno más residuos de aminoácidos dentro de las regiones variables de PG110 pueden ser reemplazadas con otros residuos de aminoácidos de la misma familia de cadena lateral y el anticuerpo alterado puede ser probado por función retenida usando los ensayos funcionales descritos en la presente.

Todavía en otra modalidad, un anticuerpo anti-NGF para uso en las composiciones farmacéuticas de la invención comprende regiones de unión a antígeno (es decir, regiones variables) que se unen al mismo epitope en NGF como el anticuerpo PG110 o que compiten cruzado por unión a NGF con PG110. De acuerdo con esto, en una modalidad, el anticuerpo anti-NGF de la invención compite para unirse a NGF con un anticuerpo comprendiendo una región variable de cadena pesada comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

Tales anticuerpos de competencia cruzada pueden ser identificados con base en su capacidad para competencia cruzada con PG110 en ensayos de unión de NGF estándares. Por ejemplo, los ensayos de ELISA estándares pueden ser usados en los cuales una proteína de NGF recombinante (por ejemplo, NGF-ß humano) es inmovilizado sobre la placa, uno de los anticuerpos es etiquetado de manera fluorescente y la capacidad de anticuerpos no etiquetados para competir por la unión del anticuerpo etiquetado es evaluada. De manera adicional o alternativa, el análisis BIAcore puede ser usado para valorar la capacidad de los anticuerpos para competencia cruzada. Los ensayos de unión adecuados que pueden ser usados para probar la capacidad de un anticuerpo para competir por la unión a NGF con un anticuerpo comprendiendo una región variable de cadena pesada comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, se han descrito previamente (por ejemplo, WO/2010/128398).

Todavía en otras modalidades, un anticuerpo anti-NGF útil en las composiciones de la invención exhibe una o más propiedades funcionales del anticuerpo PG110. Por ejemplo, un anticuerpo anti-NGF de la invención puede exhibir una o más de las siguientes propiedades funcionales: • se une a NGF humano pero no se une a factor neurotrófico derivado de cerebro humano (BDNF), neurotrofina humana 3 (NT-3) o neurotrofina humana 4 (NT-4); • se une a NGF humano o de rata con una KD de 100 pM o menos; • inhibe la unión de NGF a TrkA o p75NTR; • inhibe la proliferación dependiente de NGF de las células TF-1; · inhibe la supervivencia de ganglios de raíz dorsal de pollo dependiente de NGF; • inhibe la excrecencia de neuritas de células PC12 dependiente de NGF.

Estas propiedades funcionales pueden ser valoradas usando los ensayos in vitro conocidos en la técnica y descritos en, por ejemplo, WO/2010/128398. Con respecto a la unión especifica del anticuerpo a NGF humano, como se usa en la presente, el término "no se une a factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), neurotrofina humana 3 (NT-3) o neurotrofina humana 4 (NT-4)" pretende significar que la cantidad de unión observada del anticuerpo a BDNF, NT-3 o NT-4, en un ensayo de unión estándar (por ejemplo, ELISA, u otro ensayo in vitro adecuado como se describe en los Ejemplos) es comparable con los niveles de soporte de unión (por ejemplo, para un anticuerpo de control), por ejemplo no más de 2 veces por arriba de los niveles de soporte, o menos de 5% de unión a BDNF, NT-3 o NT-4 como se compara con unión a NGF humano (en donde el nivel de unión a NGF humano es fijado como 100% de unión).

Todavía en otra modalidad, el anticuerpo de factor de crecimiento anti-nervios (NGF) para uso en las composiciones farmacéuticas de la invención comprende una región constante de lgG4 humana, en donde la región constante de lgG4 humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (o en donde la región constante de lgG4 humana comprende una mutación de serina en la posición de aminoácido 108 de SEQ ID NO: 9, de preferencia una mutación de serina a prolina en la posición 108); y en donde el anticuerpo se une a NGF humano o de rata con una KD de 100 p o menos (o de manera alternativa, con una KD de 300 pM o menos, 200 pM o menos, 150 mP o menos, 75 pM o menos o 50 pM o menos), inhibe la unión de NGF a TrkA o p75NTR con una IC50 de 250 pM o menos (o, de manera alternativa, con una IC50 de 500 pM o menos de 400 pM o menos, 300 pM o menos o 200 pM o menos), e inhibe la proliferación dependiente de NGF de las células TF-1 con una IC50 de 50 ng/ml o menos (o de manera alternativa, con una IC50 de 150 ng/ml o menos, 100 ng/ml o menos, 75 ng/ml o menos o 40 ng/ml o menos). De preferencia, el anticuerpo tiene una vida media de eliminación terminal promedio en humanos de al menos 10-30 días, o al menos 10 días, o al menos 15 días, o al menos 20 días, o al menos 25 días, o al menos 30 días o en un rango de aproximadamente 10 días hasta aproximadamente 40 días (o en un rango de 10-40 días) o en un rango de aproximadamente 15 días hasta aproximadamente 30 días (o en un rango de 15-30 días). Adicional o alternativamente, el anticuerpo puede exhibir una vida media farmacológica promedio en humanos de al menos 30 días, o al menos 35 días, o al menos 40 días, o en un rango de al menos cuatro a seis semanas (o en un rango de cuatro a seis semanas), o en un rango de al menos cuatro a siete semanas (o en un rango de cuatro a siete semanas) o en un rango de al menos cuatro a ocho semanas (o en un rango de cuatro a ocho semanas). De manera adicional o alternativa, el anticuerpo puede exhibir una vida media de eliminación terminal promedio en un mono cinomolgo de al menos 15 días y normalmente en el rango de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 22 días (o en un rango de 15-22 días), o en un rango de aproximadamente 15 días hasta aproximadamente 28 días (o en un rango de 15-28 días) o en un rango de aproximadamente 21 días hasta aproximadamente 28 días (o en un rango de 21-28 días). Adicional o alternativamente, el anticuerpo puede exhibir una vida media de eliminación terminal en ratas de al menos 8 días, normalmente en el rango de aproximadamente 8 hasta aproximadamente 9 días (o en un rango de 8-9 días). El anticuerpo puede exhibir adicionalmente una o más propiedades funcionales adicionales, tal como unir a NGF humano pero sin unir a factor neurotrófico derivado de cerebro h umano (BDN F) , neurotrofina humana 3 (NT-3) o neurotrofina humana 4 (NT-4); inhibir la supervivencia de ganglios de raíz dorsal de pollo dependiente de NGF; y/o inhibir la excrecencia de nueritas de células PC 1 2 dependiente de NGF. De preferencia , el anticuerpo alivia el dolor por una du ración de al menos aproximadamente una semana hasta aproximadamente doce semanas después de la administración de una sola dosis del anticuerpo anti-NG F a un sujeto. De preferencia, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada comprendiendo CDRs 1 , 2 , y 3 teniendo las secuencias de aminoácidos de S EQ I D NOs: 3, 4 y 5, respectivamente, o el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera comprendiendo CDRs 1 , 2 y 3 teniendo las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NOs: 6, 7 y 8, respectivamente, o el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada comprendiendo C DRs 1 , 2 y 3 teniendo las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NOs: 3, 4 y 5, respectivamente, y una región variable de cadena ligera comprendiendo CDRs 1 , 2 y 3 teniendo la secuencias de aminoácidos de SEQ I D NOs: 6, 7 y 8, respectivamente. De preferencia , el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 1 o el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 , o el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 1 y u na región variable de cadena ligera comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO : 2 , o el anticuerpo compite por unirse a NGF con un anticuerpo comprendiendo una región variable de cadena pesada comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO : 1 y la región variable de cadena ligera comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 2.

Todavía en otra modalidad , el anticuerpo a nti-NG F para uso en las composiciones farmacéuticas de la invención no exhibe un efecto de rebote cuando se administra a un sujeto (por ejemplo, el anticuerpo es admin istrado a una dosificación y a una frecuencia de manera que el efecto de rebote es evitado en el sujeto) . Un efecto de rebote, en el cual un anticuerpo anti-NG F exhibe eficacia disminuida en un sujeto después de u n periodo inicial de efectividad después de administración simple o repetida , ha sido reportado tanto en modelos animales como estudios clínicos de otros anticuerpos anti-NG F. Por ejemplo, tal efecto, referido como un "fenómeno de rebote", fue reportado para un anticuerpo de NGF anti-rata en un modelo de lesión de constricción (CC I) en ratas (Ro, L-S . et al. ( 1999) Dolor 79:265-274). Adicionalmente, los estudios de dolor cínicos con el anticuerpo anti-NG F tanezumab (también conocido como RN624, E3, CAS registro no. 880266-57-99 han sido reportados, en los cuales se observó u n periodo de eventos adversos incrementados, tal como sensibilidad a tacto y una sensación de "alfileres y agujas", después de un periodo analgésico inicial (ver la presentación por Hefti , Franz F. , Rinat Neuroscience, LSU HSC, Shreveport, Louisiana , Septiembre 26, 2006) . Aunque no se pretende limitar mediante mecanismo, se piensa que la vida media de eliminación terminal prolongada de los anticuerpos anti-NG F descritos en la presente les permite evitar exhibir un efecto de rebote. Así , otras ventajas de los anticuerpos anti-NG F usados en las composiciones de la invención incluyen una actividad más consistente y prolongada in vivo como se compara con otros anticuerpos anti-NGF de la técnica anterior. Dada la vida media de eliminación terminal prolongada de tales anticuerpos anti-NGF, pueden usarse menores dosificaciones (como se compara con otros anticuerpos anti-NG F) y composiciones conteniendo el anticuerpo pueden ser usadas a intervalos más frecuentes si es necesario, de manera q ue los regímenes de tratamiento de dosificación y tiempo pueden ser elegidos de manera q ue se evite un efecto de rebote en el sujeto.

Todavía en otra modalidad, el anticuerpo anti-NG F para uso en las composiciones farmacéuticas de la invención es capaz de aliviar ©I dolor por una duración larga en un sujeto, por ejemplo, el anticuerpo es capaz de aliviar el dolor por una du ración de al menos aproximadamente una semana hasta aproximadamente doce semanas (o por una semana a doce semanas) , después de la administración de una sola dosis del anticuerpo anti-NGF a un sujeto. En una modalidad , el anticuerpo alivia el dolor por una duración de al menos aproximadamente u na semana (o al menos una semana) después de la administración de una sola dosis del anticuerpo anti-NGF a un sujeto. En otra modalidad , el anticuerpo alivia el dolor por una d uración de al menos aproximadamente dos semanas (o al menos dos semanas) después de la administración de una sola dosis del anticuerpo anti-NG F a u n sujeto. En otra modalidad, el anticuerpo alivia el dolor por una duración de al menos aproximadamente cuatro semanas (o al menos cuatro semanas) después de la administración de u na sola dosis del anticuerpo anti-NGF a un sujeto. En otra modalidad, el anticuerpo alivia el dolor por una duración de al menos aproximadamente ocho semanas (o al menos ocho semanas) después de la admin istración de una sola dosis del anticuerpo anti-NG F a un sujeto. En otra modalidad, el anticuerpo alivia el dolor por una duración de al menos aproximadamente doce semanas (o al menos doce semanas) después de la administración de una sola dosis del anticuerpo anti-NGF a un sujeto. En otra modalidad , el anticuerpo alivia el dolor por una duración de al menos aproximadamente cuatro semanas hasta aproximadamente doce semanas (o por cuatro semanas a doce semanas) después de la administración de una sola dosis del anticuerpo anti-NGF a un sujeto. En otra modalidad , el anticuerpo alivia el dolor por una duración de al menos aproximadamente ocho semanas a aproximadamente doce semanas (o por ocho semanas a doce semanas) después de la administración de una sola dosis del anticuerpo anti-NG F a un sujeto.

La capacidad del anticuerpo para aliviar el dolor en un sujeto puede ser valorada usando ensayos establecidos en la técnica. Modelos animales adecuados para valorar la duración de alivio de dolor por un anticuerpo anti-NG F son descritos en , por ejemplo, la publicación de PCT no. WO 200&/1 31 951 y publicación de patente estadounidense 200801 82978. Ejemplos no limitantes de tales modelos animales incluyen un modelo de dolor neuropático evocado por constricción crónica del nervio ciático, un modelo de dolor post-quirúrgico que involucra la incisión de la pata trasera , un modelo de dolor de artritis reumatoide q ue involucra artritis inducida con auxiliar de Freund completo (C FA) y modelos de dolor de cáncer, tal como se describe en Halvorson , K. G. et al. (2005) Cáncer Res. 65:9426-9435 y Sevcik, M .A. et al. (2005) Pain 1 1 5: 128-141 . Adicionalmente, el alivio del dolor puede evaluarse clínicamente en humanos y la duración de alivio de dolor puede determinarse con base en los niveles de dolor reportados por el o los sujetos humanos siendo tratados con el anticuerpo anti-NG F.

Todavía en otras modalidades, un anticuerpo anti-NG F para uso en las composiciones farmacéuticas de la invención puede comprender una región variable de cadena pesada y/o región variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-NG F que es preparado mediante un método estándar conocido en la técnica para elevar anticuerpos monoclonales, tal como la técnica de hibridación de células somáticas estándar descrita por Kohier y M ilstein (1 975) Nature 256: 495 para crear anticuerpos monoclonales no humanos (dichos anticuerpos pueden ser entonces humanizados), así como técnicas o métodos de genoteca de despliegue de fagos usando animales transgénicos expresando genes de inmunoglobulina humana. Las técnicas de genoteca de despliegue de fagos para seleccionar anticuerpos son descritas en, por ejemplo, McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clarkson et al., Nature, 352:624-628 (1991), Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) y Hoet et al (2005) Nature Biotecnology 23, 344-48; patentes estadounidenses nos. 5,223,409; 5,403,484; y 5,571,698 para Ladner et al., patentes estadounidenses nos. 5,427,908 y 5,580,717 para Dower et al., patentes estadounidenses nos. 5,969,108 y 6,172,197 para McCafferty et al., y patentes estadounidenses nos. 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 y 6,593,081 para Griffiths et al. Los métodos para usar animales transgénicos que expresan genes de inmunoglobulina humana para cultivar anticuerpos son descritos en, por ejemplo, Lonbherg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13:65-93, Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546; patentes estadounidenses nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; y 5,770,429; todas para Lonberg y Kay; patente estadounidense no. 5,545,807 para Surani et al.; publicaciones de PCT nos. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13853, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas para Lonberg y Kay; publicación de PCT WO 02/43478 para Ishida et al., patentes estadounidenses nos. 5,9393,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 y 6,162,963 para Kucherlapati et al.

En varias modalidades, un anticuerpo anti-NGF para uso en las composiciones de la invención puede ser un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano. Adicionalmente, el anticuerpo puede ser uno en el cual los epitopes de células T potenciales han sido eliminados. Los métodos para eliminar epitopes de células T potenciales para reducir por ello la inmunogenicidad potencial de un anticuerpo han sido descritos en la técnica (ver, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense no. 20030153043 por Carr et al.).

Un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención puede ser derivado o enlazado a otra molécula funcional (por ejemplo, otro péptido o proteína). De acuerdo con esto, los anticuerpos y porciones de anticuerpo para uso en las composiciones farmacéuticas de la invención pretenden incluir formas derivadas o modificadas de otra manera de los anticuerpos PG110 descritos en la presente. Por ejemplo, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención pueden ser enlazados funcionalmente (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más entidades moleculares diferentes, tal como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), un agente detectable, un agente citotóxico, un agente farmacéutico y/o una proteína o péptido que puede mediar la asociación del anticuerpo o porción de anticuerpo con otra molécula (tal como una región de n úcleo de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina).

Un tipo de anticuerpo derivado es producido al reticular dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de diferentes tipos, por ejemplo, para crear anticuerpos biespecíficos). Los reticuladores adecuados incluyen aquéllos que son heterobifuncionales, teniendo dos grupos distintamente reactivos separados por un separador apropiado (por ejemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) u homobifuncional (por ejemplo, suberato de disuccin imidilo). Tales enlazadores están disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford , I L.

Agentes detectables útiles con los cuales un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención puede derivarse incluyen compuestos fluorescentes. Agentes detectables fluorescentes ejemplares incluyen fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina , cloruro de 5-dimetilamina-1 -naftalensu lfonilo, ficoeritrina y similares . Un anticuerpo también puede ser derivado con enzimas detectables, tales como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa y similares . C uando un anticuerpo es derivado con una enzima detectable, es detectado al adicionar reactivos adicionales que la enzima usa para producir u n producto de reacción detectable. Por ejemplo, cuando el agente detectable peroxidasa de rábano picante está presente, la adición de peróxido de hidrógeno y diamiobencidina conduce a un producto de reacción coloreado, el cual es detectable . Un anticuerpo también puede ser derivado con biotina , y detectado a través de una medición indirecta de unión de avidina o streptavidina.

IV. Producción de anticuerpos Los anticuerpos anti-NG F para uso en las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser producidas usando moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos anti-NG F. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un Usado celular, o en una forma parcialmente purificada o substancialmente pura . Un ácido nucleico es "aislado" o "hecho substancialmente puro" cuando se purifica lejos de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos celula res o proteínas , med iante técnicas estándares, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, bandas de CsCI, cromatografía de columna , electroforesis de gel de agarosa y otros bien conocidos en la técnica. Ver, F. Ausubel , et al . , ed . ( 1 987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley I nterscience, New York. U n ácido nucleico de esta descripción puede ser, por ejemplo, DNA o RNA y puede contener o no secuencias intrónicas. En una modalidad preferida, el ácido nucleico es una molécula de cDNA. Los ácidos nucleicos de esta descripción pueden ser obten idos usando técnicas de biolog ía molecular estándares.

En una modalidad , un anticuerpo anti-NG F para uso en las composiciones farmacéuticas de la invención es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D O : 1 1 . En otra modalidad , un anticuerpo anti-NGF para uso en las composiciones farmacéuticas de la invención es codificado por una molécula de ácido nucleico comprendiendo la secuencia de n ucleótidos de SEQ I D NO : 14.

Una vez q ue los fragmentos de DNA q ue cod ifican los segmentos VH y VL son obtenidos, estos fragmentos de D NA pueden ser manipulados mediante técnicas de DNA recombinantes estándares, por ejemplo, para convertir los genes de región variable a genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, de manera que la región variable es enlazada operativamente a la región constante (ver, por ejemplo, Ejemplo 1 ) . El término "enlazado operativamente", como se usa en este contexto, pretende significar que los dos fragmentos de DNA son unidos de manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de DNA permanecen en marco.

Los anticuerpos para uso en las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser producidos en u na célula huésped usando métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, Morrison , S. ( 1985) Science 229.1202) . Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, los DNAs que codifican las cadenas pesadas y ligeras pueden ser insertados en vectores de expresión , de manera que los genes son enlazados operativamente a secuencias de control de transcripción y traducción. En este contexto, el término "enlazado operativamente" pretende sig nifica r que un gene de anticuerpo es ligado a un vector de manera que las secuencias de control de transcripción y traducción dentro del vector sirven su función pretendida de regular la transcripción y traducción del gene de anticuerpo. El vector de expresión y secuencias de control de expresión son elegidas para ser compatibles con la célula huésped de expresión usada. El gene de cadena ligera de anticuerpo y el gene de cadena pesada de anticuerpo puede insertarse en un vector separado o, más normalmente, ambos genes son insertados en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpo son insertados en el vector de expresión mediante métodos estándares (por ejemplo ligación de sitios de restricción complementarios en el fragmento de gene de anticuerpo y vector, o ligación de extremo romo si no están presentes sitios de restricción). Adicionalmente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido de señal que facilite la secreción de la cadena de anticuerpo de una célula huésped. El gene de cadena de anticuerpo puede ser clonado en el vector, de manera que el péptido de señal es enlazado en marco al extremo amino del gene de cadena de anticuerpo. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de inmunoglobulina o un péptido de señal heterólogo (es decir, un péptido de señal de una proteína no de inmunoglobulina.

Además de los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes normalmente portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadena de anticuerpo en una célula huésped. El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, intensificadores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes de cadena de anticuerpo. Tales secuencias reguladoras son descritas, por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Aquéllos expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a ser transformada, el nivel de expresión de proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para expresión de células huésped de mamífero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteína en células de mamífero, tales promotores y/o intensificadores derivados de citomegalovirus (CMV), virus de simio 40 (SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP) y poliol). De manera alternativa, las secuencias reguladoras no virales pueden ser usadas, tal como el promotor de ubiquitina o promotor de ß-globina. Todavía adicionalmente, los elementos reguladores compuestos de secuencias de diferentes fuentes, tal como el sistema promotor de SRa, el cual contiene secuencias del promotor temprano SV40 y la repetición terminal larga de virus de leucemia de células T humanas tipo 1 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).

Además de los genes de cadena de anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células huésped (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gene marcador seleccionable facilita la selección de células huésped hacia las cuales el vector ha sido introducido (ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017, todos por Axel et al.). Por ejemplo, normalmente el gene marcador seleccionable confiere resistencia a medicamentos, tal como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en la cual el vector ha sido introducido. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gene de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en células huésped dhfr- con selección/amplificación de metotrexato) y el gene neo (para selección G418).

Para expresión de las cadenas ligeras y pesadas, el o los vectores de expresión que codifican las cadenas pesadas y ligeras son transfectados hacia una célula huésped mediante técnicas estándares. Las diversas formas del término "transfección" pretenden abarcar una amplia variedad de técnicas comúnmente usadas para la introducción de DNA exógeno en una célula huésped procariótica o eucariótica, por ejemplo, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, transfección de DEAE-dextrano y similares. Aunque es teóricamente posible expresar los anticuerpos en cualquiera de las células huésped procarióticas o eucarióticas, la expresión de anticuerpos en células eucarióticas, y muy preferiblemente células huésped de mamífero, es lo más preferido debido a que tales células eucarióticas, y en particular células de mamífero, más probablemente que células procarióticas que se asemejen y secreten una anticuerpo apropiadamente doblado e inmunológicamente activo. La expresión procariótica de genes de anticuerpo ha sido reportada como inefectiva para producción de altos rendimientos de anticuerpo activo (Boss, M.A. y Wood, C.R. (1985) Immunology Today 6:12-13).

Las células huésped de mamífero preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes de esta descripción incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO) (incluyendo células CHO dhfr', descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas con un marcador seleccionable DHFR, por ejemplo, como se describe en R.J. Kaufman y P.A. Shrp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. Otro sistema de expresión preferido es el sistema de expresión de gene GS descrito en WO 87/04462 (para Wilson), WO 89/01036 (para Bebbington) y EP 338,841 (para Bebbinton). Cuando vectores de expresión recombinante que codifican genes de anticuerpos son introducidos en células huésped de mamífero, los anticuerpos son producidos al cultivar las células huésped por un periodo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o, más preferiblemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual las células huésped son cultivadas. Los anticuerpos pueden ser recuperados del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteína estándares.

En una modalidad, un anticuerpo anti-NGF para uso en las composiciones farmacéuticas de la invención es producido usando un vector de expresión, en donde el vector comprende la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 11 que codifica una cadena pesada de anticuerpo y la secuencia de nucleotidos de SEQ I NO: 14 que codifica una cadena ligera de anticuerpo. Un vector de expresión preferido comprende el gene GS (glutamina sintetasa). En otra modalidad preferida, la célula huésped preferida de la invención es una célula CHO (ovario de hámster chino).

Todavía en otra modalidad preferida, el anticuerpo anti-NGF para uso en las composiciones farmacéuticas de la invención es producido al cultivar una célula huésped comprendiendo un vector de expresión el cual comprende la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 11 (que codifica una cadena pesada de anticuerpo) y la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 14 (que codifica una cadena ligera de anticuerpo) de manera que un anticuerpo anti-NGF comprendiendo una cadena pesada codifica por SEQ ID NO:11 y una cadena ligera codificada por SEQ ID NO: 14 es producido.

V. Métodos de administración Una composición farmacéutica de la presente invención puede ser administrada por una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como será apreciado por el técnico experto, la ruta y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. En general, una composición farmacéutica de la invención es adecuada para administración intravenosa, intra-articular, subcutánea, intramuscular, parenteral , intra-tumoral, intranasal , intravesicular, intrasinovial, oral, mucosal, sublingual, espinal o epidérmica o mediante instilación en cavidades corporales (por ejemplo, abdomen, cavidad pleural, senos nasales. En ciertas modalidades preferidas, la composición farmacéutica de la invención es adecuada para administración intravenosa, subcutánea (por ejemplo, vía una pluma de inyección) o intra-articular.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser administradas solas o en terapia de combinación, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combi nación puede incl u ir una composición de la presente invención con al menos uno o m ás agentes farmacéuticos adicionales. Por ejemplo, al menos uno o más agentes farmacéuticos adicionales pueden ser administrados por separado o también pueden ser incorporados en las composiciones. En una modalidad preferida, una composición farmacéutica de la invención comprendiendo un anticuerpo anti-NGF o fragmento de unión a antígeno del mismo, es administrada en combinación con un segundo agente farmacéutico, en donde el segundo agente farmacéutico es seleccionado del grupo que consiste de NSAI Ds, analgésicos (incluyendo analgésicos opioides y analgésicos atípicos), anestésicos locales, bloques de nervios, bloques de fenol, anticuerpos terapéuticos, esferoides, anticonvulsionantes, anti-depresivos, capsaicina tópica y agentes antivirales. Una clase particularmente preferida de segundos agentes farmacéuticos para uso en alivio de dolor son los analgésicos opioides.

De manera adicional o alternativa, un segundo régimen de tratamiento puede combinarse con el uso de un anticuerpo de la invención, por ejemplo, en el alivio de dolor. Ejemplos de tales segundos regímenes de tratamiento incluyen radioterapia (por ejemplo, para dolor de cáncer), procedimientos quirúrgicos (por ejemplo, ganglio de Gasser y procedimientos ablativos (aguja) de retro-Gasser para neuralgia trigeminal), hipnosis y acupuntura.

Ejemplos de NSAIDs incluyen salicilatos acetilados incluyendo aspirina; salicilatos no acetilados incluyendo salsalato, diflunisal; ácidos acéticos incluyendo etodolac, diclofenaco, indometacina, cetorolaco, nabumetona; ácidos propiónicos incluyendo fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, cetoprofeno, naproxeno, naproxeno sódico, oxaprozina; fenamatos incluyendo meclofenamato, ácido mefenámico; fenilbutazona, piroxicam; inhibidores de COX-2 incluyendo celecoxib, etoricoxib, valdecoxib, rofecoxib, lumiracoxib. Ejemplos de analgésicos incluyen paracetamol (acetaminofen), tramadol, tapentadol, capsaicina (tópica), analgésicos opioides y analgésicos atípicos. Ejemplos de analgésicos de opioides incluyen morfina, codeína, tebaina, hidromorfona, hidrocodona, oxicodona, oximorfona, desomorfina, diacetilmorfina, nicomorfina, dipropanoilmorfina, bencilmorfina, etilmorfina, fentanil, petidina, metadona, tramadol y propoxifeno. Ejemplos de analgésicos atípicos incluyen anti-depresivos tricíclicos, carbazepina, gabapentina, pregabalina, duloxetina y cafeína. Ejemplos de esferoides incluyen corticosteroides intra-articulares (lACs) y prednisona. Ejemplos de anticuerpos terapéuticos incluyen anticuerpos anti-TNF, tales como Remicade® y Humira®, y anticuerpos antiCD20, tales como Rituxan® y ArzerraMR. Ejemplos de agentes antivirales incluyen aciclovir y fosfato de oseltamivir (Tamiflu®) .

En una modalidad preferida, la terapia de combinación puede incluir una composición farmacéutica de anticuerpo anti-NGF de la presente invención con al menos uno o más inhibidores de TrkA (por ejemplo, compuestos que antagonizan la actividad de TrkA). Los inhibidores de TrkA pueden funcionar, por ejemplo, al interactuar extracelularmente con el receptor de TrkA, o al interactuar intracelularmente con la maquinaria de transducción de señalización de TrkA (por ejemplo, inhibición de actividad de TrkA cinasa). Ejemplos no limitantes de inhibidores de TrkA extracelulares incluyen anticuerpos anti-TrkA (tal como los anticuerpos anti-TrkA humanizados descritos en la publicación de patente estadounidense no. 20090208490 y la publicación de patente estadounidense no. 20090300780) y los imitadores de péptido de NGF que antagonizan TrkA (tal como se describe en Debeir, T. et al. ( 1999) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96:4067-4072). Ejemplos no limitantes de inhibidores de TrkA intracelulares incluyen péptidos penetradores de células que antagonizan función de TrkA (por ejemplo, como se describe en Hirosa, M. et al. (2008) J. Pharmacol. Sci. 1 06: 1 07-1 1 3; Ueda, K. et al. (2010) J . Pharmacol. Sci. , emisión Marzo 30, 2010) y inhibidores de TrkA incluyen ARRY-470 y ARRY-872 (Array Biopharma).

En otra modalidad preferida, la terapia de combinación puede incluir una composición de anticuerpo anti-NGF de la presente invención con al menos uno o más inhibidores de proteína cinasa C (PKC) (por ejemplo, compuestos que antagonizan la actividad de PKC).

Formulaciones inyectables estériles de las composiciones farmacéuticas de la invención pueden prepararse al incorporar el compuesto activo con uno o una combinación de ingredientes (por ejemplo, amortiguador, excipiente, etc.) enumerados antes, según se requiera, seguido por microfiltración de esterilización. Generalmente, las dispersiones son preparadas al incorporar el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquéllos enumerados antes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado a vacío y secado por congelación (liofilizacion) que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada estéril del mismo.

Las formulaciones pueden estar presentadas convenientemente en una forma de unidad de dosificación y puede prepararse por cualquier método conocido en la técnica de farmacia. La forma de unidad de dosificación como se usa en la presente se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a ser tratados; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado.

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse con el fin de obtener una cantidad del ingrediente activo, la cual es efectiva para lograr la respuesta terapéutica para un paciente particular, composición , y modo de administración , sin ser tóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleada, o el éster, sal o amida de las mismas, la ruta de administración, el tiempo de administración , la velocidad de excreción del compuesto particular siendo empleado, la duración del tratamiento, otros medicamentos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historia médica anterior del paciente siendo tratado, y factores similares bien conocidos en las artes médicas. Un médico o veterinario teniendo habilidad ordinaria en la técnica puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad efectiva de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo , el médico o veterinario podría iniciar con dosis de los compuestos de la invención empleados en la composición farmacéutica a niveles menores que aquéllos requeridos con el fin de lograr el efecto terapéutico deseado y gradualmente incrementar la dosificación hasta que el efecto deseado es logrado. En general, una dosis diaria adecuada de una composición de la invención será aquélla cantidad del compuesto, la cual es la dosis más baja efectiva para producir un efecto terapéutico. Tal dosis efectiva generalmente dependerá de los factores descritos anteriores.

En una modalidad, una cantidad efectiva de la composición de la presente invención es una cantidad que inhibe la actividad de NGF en un sujeto que sufre . de un desorden en el cual la actividad de NGF es perjudicial. En una modalidad, la composición proporciona una dosis efectiva de 100 mg por inyección del anticuerpo. En otra modalidad, la composición proporciona una dosis efectiva que varía desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 100 mg de anticuerpo. Si se desea, la dosis diaria efectiva de la composición farmacéutica puede ser administrada como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sub-dosis administradas por separado a intervalos apropiados a lo largo del día, opcionalmente, en formas de dosificación de unidad .

En una modalidad de la invención, la dosificación del anticuerpo en la composición está entre aproximadamente 5 y aproximadamente 150 mg. En otra modalidad , la dosificación del anticuerpo en la composición está entre aproximadamente 25 y aproximadamente 100 mg. En otra modalidad, la dosificación del anticuerpo en la composición está entre aproximadamente 40 y aproximadamente 80 mg . En otra modalidad, la dosificación del anticuerpo en la composición está entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100 mg . En otra modalidad, la dosificación del anticuerpo en la composición está entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 1 00 mg , entre aproximadamente 0.5 y 75 mg, entre aproximadamente 1 .0 y 60 mg, entre aproximadamente 5 y 40 mg , entre aproximadamente 10 y 30 mg, o entre aproximadamente 10 y 20 mg . La composición es especialmente adecuada para grandes dosificaciones de anticuerpo de más de 10 mg. En una modalidad particular de la invención, la composición proporciona un anticuerpo a una dosis de aproximadamente 10 mg o aproximadamente 20 mg . En otra modalidad, la composición proporciona un anticuerpo a una dosis de aproximadamente 80 mg o aproximadamente 1 00 mg .

En una modalidad de la invención, la dosificación del anticuerpo en la composición está entre aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 1 50 mg, 1 hasta aproximadamente 1 50 mg, aproximadamente 5 hasta aproximadamente 145 mg, aproximadamente 10 hasta aproximadamente 140 mg , aproximadamente 1 5 hasta aproximadamente 135 mg, aproximadamente 20 hasta aproximadamente 130 mg, aproximadamente 25 hasta aproximadamente 1 25 mg, aproximadamente 30 hasta aproximadamente 120 mg, aproximadamente 35 hasta aproximadamente 1 1 5 mg , aproximadamente 40 hasta aproximadamente 1 1 0 mg, aproximadamente 45 hasta aproximadamente 105 mg, aproximadamente 50 hasta aproximadamente 100 mg, aproximadamente 55 hasta aproximadamente 95 mg, aproximadamente 60 hasta aproximadamente 90 mg , aproximadamente 65 hasta aproximadamente 85 mg, aproximadamente 70 hasta aproximadamente 80 mg, o aproximadamente 75 mg. En una modalidad, la dosificación del anticuerpo es 10 mg . En una modalidad , la dosificación del anticuerpo es 20 mg. Los rangos intermedios para las dosificación declaradas antes, por ejemplo, aproximadamente 2 hasta aproximadamente 149 mg también pretenden ser parte de esta invención. Por ejemplo, los rangos de valores usando una combinación de cualquiera de los valores antes declarados como l ímites superior y/o inferior pretenden ser incluidos.

Para rutas de administración particulares, un dispositivo de entrega adecuado puede ser elegido para uso. Por ejemplo, para administración subcutánea o intramuscular, una pluma de inyección (por ejemplo, que puede ser auto-administrada) puede ser usada. Tales plumas de inyección , también referidas como inyectores, son conocidos en la técnica, incluyendo aquéllos que contienen una dosis de líquido de anticuerpo (tal como aquél descrito en la publicación de PCT WO 2008/00531 5). Además, para administración subcutánea , puede usarse un implante subcutáneo. Adicionalmente, la entrega transcutánea puede ser lograda mediante el uso de un parche cutáneo tópico (piel) (por ejemplo, parche adhesivo). La entrega transcutánea también puede ser lograda mediante inyección de polvo seco (tales como inyectores comercialmente disponibles de Glide Pharma). Todavía adicionalmente, para entrega en los pulmones (por ejemplo, en el tratamiento de asma o tos intratable), la administración pulmonar puede ser empleada, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y composición con un agente aerosolizante. Ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses nos. 6,019,968; 5.985, 320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; y 4,880,078; y publicaciones de PCT Nos. WO 92/1 9244, WO 97/32572, WO 97/4401 3, WO 98/31 346 y WO 99/66903.

En una modalidad preferida, una composición terapéutica de la invención puede ser administrada con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tal como los dispositivos descritos en las patentes estadounidenses nos. 5,399, 163, 5, 383, 851 , 5,312,335, 5,064,41 3, 4,941 ,880, 4,790,824 o 4, 596,556. Ejemplos de implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente invención incluyen: patente estadounidense no. 4,487,603, la cual describe una bomba de micro-infusión implantable para dispensar medicación a una velocidad controlada; la patente estadounidense no. 4,486, 1 94, la cual describe un dispositivo terapéutico para administrar medicaciones a través de la piel; patente estadounidense no. 4,447, 233, la cual describe una bomba de infusión de medicación para entregar medicación a una velocidad de infusión precisa; patente estadounidense no. 4,447,224, la cual describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para entrega de medicamento continua; patente estadounidense no. 4,439, 1 96, la cual describe un sistema de entrega osmótica de medicamento teniendo compartimientos multi-cámaras; y patente estadounidense no. 4,475, 1 96, la cual describe un sistema de entrega osmótica de medicamento. Muchos otros implantes, sistemas de entrega y módulos son conocidos para aquéllos expertos en la técnica.

En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser formuladas adicionalmente para asegurar una distribución apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera de sangre-cerebro (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrofílicos. Para asegurar que los compuestos terapéuticos de la invención crucen la BBB (si se desea), pueden ser formulados, por ejemplo, en liposomas. Para métodos de fabricación de liposomas, ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses 4, 522, 81 1 ; 5, 374,548; y 5, 399,331 . Los liposomas pueden comprender una o más porciones las cuales son transportadas selectivamente en células u órganos específicos, intensificado así la entrega de medicamento enfocada (ver, por ejemplo, V.V. Ranade (1989) J . Clin. Pharmacol. 29:685). Porciones de enfoque ejemplares incluyen folato o biotina (ver, por ejemplo, la patente estadounidense 5,416,016 para Low et al.); manósidos (Umezawa et al . , ( 1 988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 1 53: 1 038); anticuerpos (P.G. Bloeman et al. ( 1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al. ( 1 995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); receptor de proteína A de surfactante (Briscoe et al. (1 995) Am. J. Physiol. 1 233: 134), diferentes especies de los cuales pueden las formulaciones de la invención, así como componentes de las moléculas inventadas; p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); ver también K. Keinanen ; M. L. Laukkanen ( 1 994) FEBS Lett. 346: 123; J.J . Killion; I .J. Fidler (1 994) Immunomethods 4:273.

Los reg ímenes de dosificación son ajustados para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapeútica). Por ejemplo, un bolo simple puede ser administrado, varias dosis divididas pueden ser administradas en el tiempo o la dosis puede sr reducida o incrementada proporcionalmente según sea indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Una sola dosis simple (la cual puede ser administrada en un programa de dosificación como se describe más delante de manera adicional) pudiera variar desde aproximadamente cualquiera de 0.1 pg/kg hasta 1 pg/kg, hasta 3 pg/kg, hasta 30 pg/kg , hasta 300 pg/kg, hasta 3000 pg/kg (3 mg/kg), hasta 30 mg/k hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores descritos en la presente. Por ejemplo, un anticuerpo anti-NGF puede ser administrado a aproximadamente 1 pg/kgm aproximadamente 10 pg/kg, aproximadamente 20 pg/kg, aproximadamente 50 Mg/kg, aproximadamente 100 pg/kg, aproximadamente 200 Mg/kg, aproximadamente 300 pg/kg , aproximadamente 400 pg/kg, aproximadamente 500 Mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg o aproximadamente 3 mg/kg. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-NGF es administrado a una dosis en un rango desde aproximadamente 3 g/kg hasta aproximadamente 3000 pg/kg. En otra modalidad preferida, el anticuerpo anti-NGF es administrado a una dosis de 1 00 pg/kg . En otra modalidad preferida, el anticuerpo anti-NGF es administrada a una dosis de 200 pg/kg. En otra modalidad preferida, el anticuerpo anti-NGF es administrado a una dosis de 300 pg/kg. En otra modalidad preferida, el anticuerpo anti-NGF es administrado a una dosis de 400 pg/kg.

Para administraciones repetidas sobre varios días, semanas, o meses o más largas, dependiendo de la condición, el tratamiento es sostenido hasta que ocurre una supresión deseada de los síntomas o hasta que se logran niveles terapéuticos suficientes (por ejemplo, para reducir el dolor). Un régimen de dosificación ejemplar comprende administrar una dosis inicial en un rango de aproximadamente 3 pg/kg hasta 500 pg/kg, seguido por una dosis de mantenimiento mensual de aproximadamente 3 pg/kg hasta 500 pg/kg del anticuerpo anti-NGF. En otra modalidad, una dosis de aproximadamente 200 Mg/kg es administrada una vez cada mes. Todavía en otra modalidad , una dosis de aproximadamente 400 pg/kg es administrada una vez cada dos meses. Sin embargo, otros reg ímenes de dosificación pueden ser útiles, dependiendo del patrón de decaimiento farmacocinético que el practicante desea lograr. Por ejemplo, en algunas modalidades, la dosificación de una a cuatro veces a la semana es contemplada. Sin embargo, dado que la larga duración de alivio de dolor por los anticuerpos anti-NGF, puede usarse dosificación menos frecuente. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-NGF es administrado una vez cada semana, una vez cada 2 semanas, una vez cada 3 semanas, una vez cada 4 semanas, una vez cada 5 semanas, una vez cada 6 semanas, una vez cada 7 semanas, una vez cada 8 semanas, una vez cada 9 semanas, una vez cada 1 0 semanas, una vez cada 1 5 semanas, una vez cada 20 semanas, una vez cada 25 semanas, una vez cada 26 semanas, o más. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-NGF es administrado una vez cada 1 mes, una vez cada 2 meses, una vez cada 3 meses, una vez cada 4 meses, una vez cada 5 meses, una vez cada 6 meses o más.

En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-NGF es el anticuerpo PG 1 10 o fragmento de unión a antígeno del mismo, y es administrado (por ejemplo, a un humano) intravenosamente a una dosis en un rango de 0. 1 mg/kg a 0.2 mg/kg, de preferencia 0. 1 5 mg/kg, una vez cada 12 semanas. En otra modalidad preferida, un anticuerpo anti-NGF es administrado (por ejemplo, a un humano) subcutáneamente a una dosis en un rango de 0.2 mg/kg a 0.4 mg/kg, de preferencia 0.3 mg/kg , una vez cada doce semanas. Todavía en otras modalidades, PG 1 10 o fragmento del mismo es administrado a una dosis en un rango de 0.1 mg/kg a 3 mg/kg , o en un rango de 0.1 mg/kg a 30 mg/kg , o en un rango de 0.1 mg/kg a 20 mg/kg , o en un rango de 0. 1 mg/kg a 10 mg/kg, o en un rango de 1 mg/kg a 30 mg/kg , o en un rango de 1 mg/kg a 20 mg/kg o en un rango de 1 mg/kg a 20 mg/kg .

Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma de unidad de dosificación como es usada en la presente se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a ser tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de unidad de dosificación de la invención son dictadas por y directamente dependientes de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a ser logrado, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formación de compuestos, tal como un compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos. Por ejemplo, ejemplos no limitantes de formas de unidad de dosificación incluyen 0.2 mg (correspondientes a una dosis de 3 pg/kg en una persona de aproximadamente 70 kg), 2 mg (correspondiente a una dosis de 30 pg/kg en una persona de aproximadamente 70 kg) y 7 mg (correspondiente a una dosis de 100 pg/kg en una persona de aproximadamente 70 kg) .

VI . Métodos de uso La invención proporciona composiciones de alta concentración, estables, con una vida de anaquel prolongada, las cuales, en una modalidad , son usadas para inhibir la actividad de NG F en un sujeto que sufre de u n desorden en el cual la actividad de NG F es perjudicial . Los métodos generalmente comprenden administrar al sujeto una composición de la invención , de manera que la actividad de NGF en el sujeto es reducida o inhibida . De preferencia , el NGF es NGF humano y el sujeto es un sujeto humano. De manera alternativa , el sujeto puede ser un mam ífero que exprese NGF con el cual un anticuerpo de la invención reacciona cruzado. Aún adicionalmente el sujeto puede ser u n mamífero en el cual se ha introducid h NGF (por ejemplo, mediante administración de hNGF o mediante expresión de un transgene de h NG F). Más aún , una composición de la invención puede ser admi nistrada a un mamífero no humano que expresa un NG F con el cual el anticuerpo reacciona cruzado (por ejemplo, u n primate, cerdo o ratón) para fines veterinarios o como un modelo animal de enfermedad hu mana . Con respecto al último, tales modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de anticuerpos de la invención (por ejemplo, prueba de dosificaciones y euros de administración en el tiempo) .

Una composición de la invención puede ser administrada a un sujeto humano para fines terapéuticos o profilácticos. De acuerdo con esto, en otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar, por ejemplo , atenuar o inhibir, una enfermedad o condición relacionada con NGF en u n sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una composición farmacéutica de la invención. De preferencia , el anticuerpo anti-NGF es usado para atenuar o aliviar dolor, por ejemplo, dolor asociado con una enfermedad o condición en donde el desarrollo o manten imiento del dolor es mediado, al menos en parte, por NG F. Ejemplos no limitantes de enfermedad o condición relacionada con NG F incluyen dolor inflamatorio, dolor post-quirú rgico, dolor post-operatorio (incluyendo dolor dental), dolor neu ropático, neuropatía periférica, neuropatía diabética , dolor de fractu ra, dolor de articulación de gota, neuralgia post-herpética , dolor de cáncer, dolor de osteoa rtritis o a rtritis reumatoide , ciática, dolores asociados con crisis de células falciformes, dolores de cabeza (por ejemplo, mig ra ñas, dolor de cabeza por tensión , dolor de cabeza de cúmulo), dismenorrea, endometriosis, fibroides uterinos, dolor musculoesq uelético, dolor crónico de espalda baja , fibromialgia , esquinces, dolor visceral, quistes ováricos, prostatitis, sínd rome crónico de dolor pélvico, cistitis, cistitis intersticial , síndrome de vejiga dolorosa y/o síndrome de dolor de vejiga, dolor asociado con prostatitis abacteriana crónica, dolor incisional , mig raña , neuralgia trigeminal , dolor de quemaduras y/o heridas , dolor asociado con trauma , dolor asociado con enfermedades musculoesqueléticas, espondilitis anquilosante, patologías periarticulares , dolor de metástasis ósea , dolor de H IV, eritromelalgia o dolor provocado por pancreatitis o piedras en el riñon , melanoma maligno, síndrome de Sjogren , asma, (por ejemplo, asma no controlado con severa hiper-sensibilidad de vías respiratorias), tos intratable, enfermedades desmielinizantes, alcoholismo crónico, apoplej ía, síndrome de dolor talámico, dolor de toxinas, dolor de quimioterapia , fibromialgia , desórdenes de intestino inflamatorio, síndrome de intestino irritable , desórdenes de ojo inflamatorio, desórdenes de vejiga inflamatoria o inestable, psoriasis, quejas de la piel con componentes inflamatorios, q uemadura solar, carditis, dermatitis, miositis, neu ritis, enfermedades vasculares de colágeno, condiciones inflamatorias crónicas, dolor inflamatorio e hiperalgesia asociado y alodinia, dolor neuropático e h iperalgesia asociada o alodinia , dolor de neuropatía diabética , causalgia, dolor simpatéticamente mantenido, síndromes de desaferencíación , daño o disfunción de tejido epitelial , alteraciones de movilidad visceral en regiones respiratorias, genitourinarias, gastrointestinales o vasculares, reacciones alérgicas de la piel, prurito, vitíligo, desórdenes gastrointestinales generales, colitis, ulceración gástrica, úlceras duodenales, rinitis alérgica o vasomotora , desórdenes bronquiales, dispepsia , reflujo gastroesofágico, pancreatitis y visceralgia.

Adicionalmente, el NGF ha sido implicado en la proliferación de cánceres tales como cáncer de próstata, cáncer de tiroide, cáncer de pulmón, prolactinoma y melanoma . De acuerdo con esto, en otra modalidad, la enfermedad o condición relacionada con NGF que puede ser tratada usando una composición farmacéutica de la invención es cáncer, de preferencia cáncer de próstata , cáncer de tiroide, cáncer de pulmón , prolactinoma o melanoma. Así, en otra modalidad , la invención también proporciona un método para tratar cáncer en un sujeto, de preferencia cáncer de próstata , cáncer de tiroide, cáncer de pulmón , prolactinoma o mela noma , que comprende administrar una composición farmacéutica de la invención al sujeto.

Todavía adicionalmente , en otra modalidad , la enfermedad o condición relacionada con NG F puede ser H IV/AI DS. El bloque de NGF usando un anticuerpo anti-NG F de la invención puede bloquear macrófagos infectados con HIV, tratando por ello H IV/AIDS . De acuerdo con esto, en otra modalidad , la invención también proporciona un método para tratar H IV/AI DS en u n sujeto, comprendiendo administrar una composición farmacéutica de la invención al sujeto.

Enfermedades y condiciones particularmente preferidas para tratamiento de acuerdo con los métodos de la invención incluyen dolor inflamatorio (en particular dolor de osteoa rtritis o artritis reumatoide), dolor musculoesquelético (en particula r dolor crónico de espalda baja) , dolor de cáncer, dolor neuropático (en particular dolor neuropático diabético), dolor de metástasis ósea, cistitis intersticial/síndrome de vejiga dolorosa) , dolor asociado con prostatitis abacteriana crónica, dolor de endometriosis y/o fibroides uterinos y dolor post-operatorio.

Dolor y/u otros síntomas asociados con endometriosis y/o fibroides uterinos pueden comprender dismenorrea; dolor pélvico, no menstrual, crón ico; dispareu nia ; disquexia ; menorragia ; dolor de espalda o de abdomen bajo; infertilidad y su bfertilidad ; disuria ; hinchazón o dolor en micción; náusea , vómito y/o dia rrea. Los síntomas también pueden comprender síntomas relacionados con lesiones endometrióticas o fibroides ubicadas fuera de la cavidad peritoneal incluyendo, por ejemplo, síndrome de endometriosis torácico, manifestados como hemoptisis, neumotorax o hemotórax y leiomiosis pulmonar se manifiestan como dispnea y una masa pulmonar.

En una modalidad particularmente preferida, una composición farmacéutica de la invención es usada para tratar dolor. De preferencia , el tipo de dolor tratado es seleccionado del grupo que consiste de dolor de osteoartritis, dolor crónico de espalda baja, dolor neuropático d iabético, olor de cáncer y endometriosis y/o dolor de fibroide uterino. De acuerdo con esto, en una modalidad preferida, la invención proporciona un método para tratar dolor en un sujeto que comprende administrar una composición farmacéutica de la invención , de manera que el dolor en el sujeto es tratado. De preferencia , el dolor es seleccionado del grupo que consiste de dolor de osteoartritis, dolor crónico de espalda baja, dolor neuropático diabético, dolor de cáncer y endometriosis y/o dolor de fibroide uterino. De acuerdo con esto, en una modalidad , la invención proporciona un método para tratar dolor de osteoartritis en un sujeto que comprende administrar u na composición farmacéutica de la invención , de manera que el dolor de osteoartritis en el sujeto es tratado. En otra modalidad , la invención proporciona un método para tratar dolor crónico de espalda baja en un sujeto que comprende administrar una composición farmacéutica de la invención, de manera que el dolor crónico de espalda baja en el sujeto es tratado. Todavía en otra modalidad, la invención proporciona un método para tratar dolor neuropático diabético en un sujeto que comprende administrar una composición farmacéutica de la invención, de manera que el dolor neuropático diabético en el sujeto es tratado. Todavía en otra modalidad, la invención proporciona un método para tratar dolor de cáncer en un sujeto que comprende administrar una composición farmacéutica de la invención, de manera que el dolor de cáncer en el sujeto es tratado. Todavía en otra modalidad, la invención proporciona un método para tratar endometriosis y/o dolor de fibroide uterino en un sujeto que comprende administrar una composición farmacéutica de la invención, de manera que la endometriosis y/o dolor fibroide uterino en el sujeto es tratado.

En una modalidad preferida, la composición farmacéutica de la invención comprende un anticuerpo anti-NGF que comprende una región constante de lgG4 humana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10 y alivia dolor en un sujeto al cual el anticuerpo es administrado por una larga duración. Por ejemplo, en una modalidad, el anticuerpo alivia el dolor por una duración de al menos aproximadamente una semana hasta aproximadamente doce semanas (o durante al menos una semana a doce semanas) después de la administración de una sola dosis del anticuerpo anti-NGF a un sujeto. En otra modalidad, el anticuerpo alivia el dolor por una duración de al menos aproximadamente u na sema na (o al menos una semana) después de la administración de una sola dosis del anticuerpo anti-NG F a un sujeto. En otra modalidad , el anticuerpo alivia el dolor por una d uración de al menos aproximadamente dos semanas (o al menos dos semanas) después de la admin istración de una sola dosis del anticuerpo anti-NG F a u n sujeto. En otra modalidad, el anticuerpo alivia el dolor por una duración de al menos aproximadamente cuatro semanas (o al menos cuatro semanas) después de la administración de una sola dosis del anticuerpo anti-NGF a un sujeto. En otra modalidad, el anticuerpo alivia el dolor por una duración de al menos aproximadamente ocho semanas (o al menos ocho semanas) después de la administración de una sola dosis del anticuerpo antiNG F a un sujeto. En otra modalidad, el anticuerpo alivia el dolor par una du ración de al menos aproximadamente doce semanas (o al menos doce semanas) después de administración de una sola dosis del anticuerpo anti-NG F a un sujeto. En una modalidad , el anticuerpo alivia el dolor por una duración de al menos aproximadamente cuatro semanas a aproximadamente doce semanas (o por cuatro semanas a doce semanas) después de la administración de una sola dosis del anticuerpo anti-NGF a un sujeto. En una modalidad, el anticuerpo alivia el dolor por una du ración de al menos aproximadamente ocho semanas a aproximadamente doce semanas (o por ocho semanas a doce semanas) después de la administración de una sola dosis del anticuerpo anti-NG F a un sujeto.

En otra modalidad , la composición farmacéutica de la invención es administrada ju nto con un segundo agente farmacéutico o un segundo régimen de tratamiento. El anticuerpo y el segundo agente, o el anticuerpo y el segundo régimen de tratamiento, puede ser administrado o realizado simultánea o, alternativamente, el anticuerpo puede ser administrado primero, seguido por el segundo agente farmacéutico o segundo régimen , o el segundo agente farmacéutico o régimen puede ser administrado o realizado primero, seguido por el anticuerpo. Ejemplos no limitantes de segundos agentes farmacéuticos y segundos reg ímenes de tratamiento son expuestos a ntes en la sección sobre composicio nes fa rmacéuticas. Segu ndos agentes farmacéuticos particularmente preferidos para uso en combinación con un anticuerpo de la invención son analgésicos opioides. Otros segundos agentes farmacéuticos preferidos para uso en combinación con un anticuerpo de la invención son inh ibidores de TrkA (por ejemplo, inhibidores de TrkA extracelulares o inhibidores de TrkA intracelulares, como se describe en detalle en la sección sobre composiciones farmacéuticas) e inhibidores de proteína cinasa C (PKC).

Todavía en otro aspecto, la invención proporciona un método para atenuar o inhibir una enfermedad o condición relacionada con factor de crecimiento de nervios (NGF) en un sujeto de manera q ue un efecto de reboto es evitado en el sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una composición farmacéutica de la invención comprendiendo un anticuerpo anti-NGF comprendiendo una región constante de lgG4 humana, en donde la región constante de lgG4 humana comprende una mutación (de preferencia una mutación de región de gozne) y en donde el anticuerpo tiene una vida media de eliminación terminal en un mono cinomolgo de al menos 15 días. En otra modalidad, el anticuerpo tiene una vida media de eliminación terminal en un mono cinomolgo en un rango de aproximadamente 15 días hasta aproximadamente 22 días (o en un rango de 15-22 días), o en un rango de aproximadamente 15 días hasta aproximadamente 28 días (o en un rango de 15-28 días), o en un rango de aproximadamente 21 días hasta aproximadamente 28 días (o en un rango de 21-28 días). En otra modalidad, el anticuerpo tiene una vida media de eliminación terminal en una rata de al menos 8 días. Todavía en otra modalidad, el anticuerpo tiene una vida media de eliminación terminal promedio en humanos de al menos 10-30 días (o al menos 10 días, al menos 15 días, al menos 20 días, al menos 25 días, al menos 30 días, al menos 40 días, o en un rango de aproximadamente 10 días hasta aproximadamente 40 días o en un rango de 10-40 días o en un rango de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30 días o en un rango de 15-30 días). Las mutaciones preferidas incluyen aquéllas descritas en detalle más adelante en la presente. Los anticuerpos preferidos incluyen anticuerpos anti-NGF de las secuencias y/o teniendo las propiedades funcionales descritas en detalle antes en la presente.

VII. Artículos de fabricación También está dentro del alcance de la presente invención una pluma auto-inyectadora, una jeringa pre-llenada, o un dispositivo de administración libre de aguja que comprende la composición farmacéutica líquida de la invención. En una modalidad, la invención caracteriza un dispositivo de entrega comprendiendo una dosis de la composición comprendiendo 100 mg/ml de un anticuerpo de NGF anti-humano, o una porción de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, una pluma auto-inyectadora o jeringa pre-llenada comprende una dosis de aproximadamente 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg, 16 mg, 17 mg, 18 mg, 19 mg, 20 mg, 21 mg, 22 mg, 23 mg, 24 mg, 25 mg, 26 mg, 27 mg, 28 mg, 29 mg, 30 mg, 31 mg, 32 mg, 33 mg, 34, mg, 35 mg, 36 mg, 37 mg, 38 mg, 39 mg, 40 mg, 41 mg, 42 mg, 43 mg, 44 mg, 45 mg, 46 mg, 47 mg, 48 mg, 49 mg, 50 mg, 51 mg, 52 mg, 53 mg, 54 mg, 55 mg, 56 mg, 57 mg, 58 mg, 59 mg, 60 mg, 61 mg, 62 mg, 63 mg, 64 mg, 65 mg, 66 mg, 67 mg, 68 mg, 69 mg, 70 mg, 71 mg 72 mg, 73 mg, 74 mg, 75 mg, 76 mg, 77 mg, 78 mg, 79 mg, 80 mg, 81 mg, 82 mg, 83 mg, 84 mg, 85 mg, 86 mg, 87 mg, 88 mg, 89 mg, 90 mg, 91 mg, 92 mg, 93 mg, 94 mg, 95 mg, 96 mg, 97 mg, 98 mg, 99 mg, 100 mg, 101 mg, 102 mg, 103 mg, 104 mg o 105 mg de la composición.

También dentro del alcance de la presente invención se encuentran kits comprendiendo las composiciones farmacéuticas de la invención en forma líquida o liofilizada, e incluyen opcionalmente instrucciones para uso para tratar una enfermedad o condición relacionada con NG F. Los kits pueden incluir una etiq ueta indicando el uso pretendido de los conten idos del kit. El término etiqueta incluye cualqu ier escritura , materiales de comercialización o material grabado suministrado en o con el kit, o el cual abarq ue de otra manera el kit.

Por ejemplo, la invención también proporciona una composición farmacéutica empacada de la invención empacada dentro de un kit o un artículo de fabricación . El kit o artículo de fabricación de la invención contiene materiales útiles para el tratamiento, incluyendo prevención , tratamiento y/o diag nóstico de u na enfermedad o condición relacionada con NG F en un sujeto . En moda lidades preferidas, la enfermedad o condición relacionada con NGF es dolor inflamatorio (en particu lar dolor de osteoartritis o artritis reumatoide), dolor musculoesquelético (en particu lar dolor crónico de espalda baja), dolor neuropático (en particular dolor neuropático diabético), dolor de cáncer (en particular dolor de metástasis ósea) , dolor asociado con endometriosis y/o fibroides uterinos, y dolor postoperatorio. El kit o artículo de fabricación comprende u n recipiente y una etiqueta o inserción de paquete o material impreso sobre o asociado con el recipiente, el cual proporciona información con respecto al uso del anticuerpo anti-NGF (por ejemplo, PG 1 1 0) , para el tratamiento de una enfermedad o condición relacionada con NGF descrita en la presente.

Un kit o un artículo de fabricación se refieren a un producto empacado comprendiendo componentes con los cuales administrar composiciones farmacéuticas de la invención para tratamiento de una enfermedad o condición relacionada con NGF . El kit de preferencia comprende una caja o recipiente que sostiene los componentes del kit, y también puede inclu ir un protocolo para administrar la composición farmacéutica y/o una "inserción de paquete" . La caja o recipiente sostiene componentes de la invención , los cuales son contenidos de preferencia dentro de recipientes de plástico, polietileno, polipropileno, etileno o propileno. Por ejemplo, recipientes adecuados para la composición farmacéutica de la invención incluyen , por ejemplo, botellas, viales, jeringas, plumas , etc.

El término "inserción de paquete" es usado para referirse a instrucciones incluidas de manera acostumbrada en paquetes comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación , administración, contraindicaciones y/o alertas concernientes al uso de tales productos terapéuticos. En una modalidad , la inserción de paquete de la invención informa al lector, incluyendo un sujeto , por ejemplo, el comprador, q uienes estarán admin istrando la composición farmacéutica de la invención para tratamiento, que la composición farmacéutica de la invención es indicada para tratamiento de una enfermedad o condición relacionada con NG F como se describe en la presente. En una modalidad , la inserción de paquete describe ciertos beneficios terapéuticos de la composición farmacéutica de la invención , incluyendo alivio de dolor. En otra modalidad , la inserción de paquete puede incluir una descripción de la dosificación del anti-NG F en la composición farmacéutica de la invención . En otra modalidad , la inserción de paquete puede incluir una descripción de la ruta y frecuencia de administración de la composición farmacéutica de la invención. En otra modalidad , la inserción de paquete también puede proporcionar información a sujetos quienes estarán recibiendo la composición farmacéutica de la invención con respecto a usos de combinación tanto para fines de segu ridad como de eficacia . Por ejemplo, en ciertas modalidades, el kit comprende además una segunda composición farmacéutica comprendiendo un terapéutico adicional empacado con o copromovido con instrucciones para administración de ambos agentes para el tratamiento de una enfermedad o condición relacionada con NG F. Enfermedades y condiciones para tratamiento particularmente preferidas usando los kits de la invención incluyen dolor inflamatorio (en particular dolor de osteoartritis o artritis reumatoide) , dolor musculoesquelético (en particular dolor crónico de espalda baja) , dolor neuropático (en particular neuropatía diabética) , dolor de cáncer y dolor de metástasis ósea , dolor asociado con endometriosis y/o fibroides uterinos, y dolor post-operatorio.

Otras modalidades de la presente invención son descritas en los siguientes Ejemplos, los cuales no deberían ser interpretados como limitantes de manera adicional. Los contenidos de Listados de secuencias, fig uras y todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas a lo largo de esta solicitud son incorporados expresamente en la presente por referencia .

Ejemplos Los Ejemplos presentados a contin uación detallan experimentos realizados para examinar los efectos de pH de solución , congelación-descongelación , concentración de proteína PG 1 1 0 y varios amortiguadores y excipientes sobre la estabilidad física y qu ímica de PG 1 10 con el fin de desarrollar una formulación adecuada de PG 1 10.

Los siguientes métodos analíticos fueron usados en los experimentos realizados para valorar y monitorear la estabilidad de PG 1 10 en solución.

Métodos generales Las formulaciones de PG 1 10 fueron probadas para parámetros de calidad general (por ejemplo, pH) , parámetros de estabilidad física (por ejemplo, claridad , color, contaminación de partículas y pureza) , y parámetros de estabilidad química, desamidación, oxidación , estabilidad qu ímica general , y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) . Las pruebas ejemplares incluyeron pruebas para contaminación de particulados visibles , pruebas de conteo de partículas de obscurecimiento de luz para partícu las subvisibles, y pruebas para pureza, tal como HPLC de exclusión por tamaño y enfoque isoeléctrico capilar de imágenes.

La contaminación de particulados (por ejemplo, partículas visibles) fue determinada mediante inspección visual. Las partículas subvisibles fueron monitoreadas mediante el método de bloqueo de luz de acuerdo con la United States Pharmacopeia (USP). Además, la estabilidad fisicoquímica de formulaciones fue valorada por SEC, lo cual permite la detección de fragmentos y agregados.

Para monitorear la estabilidad química, se realizaron cromatografía de líquido de alta presión de exclusión por tamaño (SE-HPLC) (para la detección de fragmentos e hidrólisis en un espécimen de una formulación) e icIEF (enfoque isoeléctrico capilar de imágenes).

Métodos de icIEF Los análisis de icIEF fueron realizados usando el sistema de clEF de imagenología ¡CE280 con un automuestreador PrinCE (Covergent Biosciences). La Tabla 1 a continuación lista los reactivos y materiales usados para los análisis de icIEF.

Tabla 1 El instrumento ¡CE280 fue operado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Viales respectivos fueron llenados con soluciones frescas de anolito y catolito, el vial de desecho fue llenado con agua MilliQ HPLC y se encendió la lámpara de UV.

Se prepararon marcadores de pl al diluir tanto marcadores de p| 5.12 como pl 9.22 10 veces con agua MilliQ HPLC y se mezclaron bien.

Las muestras de PG110 para análisis fueron preparadas al diluir las muestras de prueba de PG110 a 1 mg/ml con agua MllliQ HPLC, combinar la solución de anticuerpo diluido con los componentes en la tabla a continuación, y agitar brevemente. Las muestras fueron subsecuentemente transferidas a inserciones de vidrio asentadas en tubos de automuestreador y desgasificadas durante 5 minutos antes de colocarlas en un automuestreador PrinCE.

Tabla 2 Métodos de HPLC de exclusión por tamaño Se usó HPLC de exclusión por tamaño para determinar la pureza de soluciones de PG110. El ensayo se realizó como se señala a continuación.

Una guarda de gel TSK (cat. No. 08543, 6.0 mm x 4.0 cm, 7 pm), se combinó con un gel TSK G3000SW (cat. No.08541, 7.8 mm x 30 cm, 5 pm) y se corrió con un límite de presión de columna superior de 70 bar (70x105 Pa). La fase móvil consistió de 100 mM Na2HP04 / 200 mM Na2S04, pH 7.0. Este amortiguador fue creado al disolver 49.68 g de fosfato ácido disódico anhidro y 99.44 g de sulfato de sodio anhidro en aproximadamente 3300 mi de agua Milli- Q, ajusfar el pH a 7.0 usando ácido fosfórico 1 M, incrementar el volumen de amortiguador a 3500 mi con agua Milli-Q y filtrar la solución a través un filtro de membrana.

Parámetros experimentales fueron como sigue: • 0.3 ml/min de velocidad de flujo • 20 µ? de volumen de inyección (equ ivalente a 20 µg de muestra) • Columna a temperatura ambiente • 2 a 8°C de temperatura de automuestreador • 50 minutos de tiempo de corrida • Gradiente ¡socrático La detección se realizó usando un detector de arreglo de diodo usando una longitud de onda de 21 4 nm (>0.1 min de ancho de pico y 8 nm de ancho de banda) y una longitud de onda de referencia de 360 nm ( 100 nm de ancho de banda).

Las muestras de prueba fueron inyectadas por duplicado. La pureza fue determinada al compara r el área de pico de anticuerpo de PG 1 1 00 al área total de todos los componentes absorbedores de 214 nm en la muestra , excluyendo los picos relacionados al amortig uador. Los agregados de alto peso molecular y fragmentos de anticuerpo fueron resueltos de PG 1 1 0 intacto usando este método.

Obscurecimiento de luz Los ensayos de obscurecimiento de luz fueron realizados para medir el contenido de particulado insoluble de sol uciones de anticuerpo. El equipo de medición de obscu recimiento de luz (contador de partículas, modelo de jeringa , Klotz (Bad Liebenzell, Alemania , series S20037) fue eq uipado con campana de aire laminar (Thermo Electron Corp. , Asheville, NC , modelo no. U LT2586-9-A40) para minimizar contaminación de partículas extrañas durante mediciones. El análisis de obscurecimiento de luz fue realizado como sigue. Una muestra de 3.5 mi fue colocada en un tubo de fondo redondo de 5 mi bajo condiciones de flujo de aire laminar. Las mediciones fueron realizadas de acuerdo con las especificaciones del fabricante en modo n=3 (0.8 mi para medición sencilla), después de un enjuague inicial de 0.8 mi.

Calorimetría de exploración diferencial (DSC) Antes del análisis de DSC, las proteínas son dializadas en un sistema amortiguador adecuado usando cartuchos Slide-A-Lyzer. Este sistema amortiguador (10 mM fosfato, 10 mM citrato) también es usado como una referencia/blanco para la medición de DSC. El anticuerpo es analizado a 1-2 mg/ml. Un VP-DSC automatizado con instrumento de DSC de celda capilar (Microcal) es usado. El desdoblamiento de las moléculas es estudiando aplicando una velocidad de exploración de 1°C/minuto sobre un rango de temperatura de 25°C - 95°C. Otros parámetros de medición son: periodo de ajuste: 16 s, espera pre-exploración: 10 min, modo de retroalimentación: ninguno.

Inspección visual La inspección visual de las muestras de proteína fue realizadas al inspeccionar cuidadosamente la solución de proteína en el recipiente de muestra con el ojo sin ayuda. Normalmente, las muestras son inspeccionadas contra un fondo blanco y uno obscuro/neg ro para identificar más fácilmente materia particulada visible, nebulosidad , opalescencia o precipitado de proteína y partículas visibles y aglomerados. Los recipientes de muestra sensibles para inspección visual pueden variar, y pueden incluir recipientes tales como tu bos de Flacón translúcidos y transparentes, viales de vidrio, violes/tubos de bajo volumen , y cartuchos slide-a-lyzer.

Ejem plo 1 : I mpacto de pH de solución sobre la estabilidad de formulaciones de PG 1 1 0 du rante estudios repetidos de congelación/descongelación (-80°C/30°C) El comportamiento de congelación descongelación del anticuerpo ??? 1 0 a una concentración de proteína de 1 mg/ml en amortiguador de 1 0 mM citrato/1 0 m fosfato fue evaluado al ciclizar la solución de proteína hasta 4 veces entre el estado congelado y el estado líquido a pH 4, pH 5, pH 6, pH 7 y pH 8. La congelación fue realizada por medio de un congelador de temperatu ra controlada de -80°C , y el descongelamiento se realizó por medio de un baño de agua de temperatu ra controlada de 30°C . Las muestras fueron extra ídas después de cada ciclo de congelación/descongelación (F/T) y se analizaron por SEC. Aproximadamente 20 mi de cada solución de PG 1 1 0 fueron colocados en 30 mi de repositorios de PETG para este experimento. La Tabla 3 proporciona una revisión sobre intervalos de prueba para SEC y el nú mero de ciclos de congelación/descongelación realizados. La Tabla 4 muestra el efecto de procesamiento de congelación/descongelación sobre la cantidad de monómero de PG 1 1 0 restante y la cantidad de fragmentos y ag regados formada en las muestras formuladas en estos niveles de pH .

Tabla 3: Intervalos de prueba: n úmero de ciclos de congelación (-80°C) y descongelación (baño de ag ua a 30°C) probados Tabla 4: Estabilidad física de PG 1 1 0 du rante ciclos repetidos de congelación/descongelación como es determinado vía SEC Monómero Agregados Los resultados muestran q ue la cantidad de monómero de PG 1 1 0 disminuyó ligeramente durante el procesamiento repetido de congelación/descongelación (F/T) , sin embargo, solo a u n pequeño grado y más de 95% de monómero i ntacto permaneció estable en solución .

Se condujeron experimentos de obscurecimiento ligero para determinar el n úmero de partículas subvisibles formadas durante cada paso de congelación/descongelación . La tabla 5 proporciona una revisión de intervalos de prueba para obscurecimiento de luz y el número de ciclos de congelación/descongelación realizados. Las Tablas 6 y 7 muestran el efecto de procesamiento de congelación/descongelación sobre el número de partículas de tamaño mayor que o igual a 1 micrómetro/ml y mayor que o igual a 1 0 10 micrómetros, respectivamente.

Tabla 5: Intervalos de prueba: N úmero de ciclos de congelación (- 80°C) y descongelación (baño de agua a 30°C) probados Tabla 6: Estabilidad física de PG110 durante los ciclos repetidos de congelación/descongelación como es determinado vía mediciones de partículas subvisibles mediante técnica de obscurecimiento de luz. Tamaño de partículas mayor que o igual a 1 micra/ml (los datos representan el promedio de dos mediciones) Tabla 7: Estabilidad física de PG 1 1 0 durante los ciclos repetidos de congelación/descongelación como es determinado vía med iciones de partículas subvisibles mediante técnica de obscurecimiento de luz. Tamaño de pa rtícu las mayor que o ig ual a 1 0 micras/ml (los datos representan el promedio de dos mediciones) Ejemplo 2: I mpacto de pH de solución sobre estabilidad físico- qu ímica de form ulaciones de PG 1 1 0 durante el almacenamiento acelerado Factores importantes que influencian la estabilidad de proteína durante el almacenamiento acelerado/de largo plazo de formulaciones líquidas y liofilizadas de proteína son el pH de las formulaciones y la temperatura de almacenamiento. Para valorar el impacto de estos factores , la proteína fue expuesta a almacenamiento a corto plazo a temperaturas elevadas durante las etapas de proyecto de preformulación y formulación con el fin de ganar rápidamente una percepción sobre la factibilidad de formulación para almacenamiento a largo plazo a menores temperaturas (por ejemplo, 2-8°C).

La estabilidad de almacenamiento del anticuerpo PG110 en solución (2 mg/ml, amortiguador de 10 mM citrato/10 mM fosfato) fue evaluada a varias temperaturas durante periodos prolongados a condiciones de temperatura controlada. Después de periodos de almacenamiento definidos, las muestras fueron extraídas y se evaluó el impacto de tiempo de almacenamiento y temperatura de almacenamiento sobre estabilidad de PG110.

Para este estudio de clasificación de pH, PG110 se formuló a pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH 7 y pH 8 a 2 mg/ml en 10 mM fosfato, 10 mM citrato.

Las muestras fueron rellenadas en viales estériles (aprox. 500 µ? cada uno) y se almacenaron bajo condiciones controladas (en cámaras de temperatura y en la ausencia de luz) a 40°C y 50°C. En puntos predefinidos, las muestras de soluciones preparadas fueron extraídas para análisis de acuerdo con el esquema de extracción de muestras provisto en la Tabla 8. Los números se refieren al número de viales que fueron almacenados/extraídos. Los datos resultados son provistos en las Tablas 9 y 10.

Tabla 8: Esquema de extracción de muestra Tabla 9: Contenido de monómeros, agregados y fragmentos de muestras PG110 formuladas a varios pH después de almacenamiento a largo plazo (Datos SEC) cuando se almacenan a 50°C Tabla 10: Contenido de monómeros, agregados y fragmentos de muestras PG110 formuladas a varios pH después de almacenamiento a largo plazo (Datos SEC) cuando se almacenan a varias temperaturas.

Los datos para el enfoq ue iso-eléctrico capilar de imagen para las muestras antes mencionadas de estabilidad acelerada también fueron evaluados. icI EF proporciona información sobre la estabilidad química de la molécula. Tablas 11 y 12 muestran el esquema extracción y los datos, respectivamente.

Tabla 11: Esquema de extracción de muestras Tabla 12: Contenido de la especie principal, ácida y básica de las muestras PG110 formuladas a varios pH después de almacenamiento a largo plazo (iCIEF) cuando se almacenan a varias temperaturas. Los resultados también muestran el pl correspondiente de las moléculas.

Estos datos demuestran que un rango de pH de solución de aproximadamente pH 5-7 mantiene la estabilidad de PG110 mejor a temperaturas incrementadas. Después de 1 semana de almacenamiento a 40°C y 50°C, los niveles de monómero fueron más altos en las muestras formuladas a pH 6.

PG110 a 2 mg/ml fuera de un rango de pH 5-7 indujo claramente la pérdida de estabilidad, reflejado en niveles incrementados de agregados y fragmentos. Los niveles de fragmento revelaron un mínimo de degradación en muestras formuladas a pH de aproximadamente 6. Los datos de icIEF también muestran que un pH de aproximadamente 6 fue mejor para mantener la estabilidad de PG110. Estos datos sugieren que un pH de aproximadamente 5.5- 6.5 mantiene la estabilidad de proteína de PG110 mejor a las condiciones de tensión específicas aplicadas en este experimento.

Ejemplo 3: Impacto de formulaciones sobre la estabilidad de formulaciones de PG110 durante estudios de congelación/descongelación repetidos (-80°C/30°C) a condiciones de 30 mg/ml.

El comportamiento de congelación/descongelación (F/T) del anticuerpo ????10 en una concentración de proteína de 30 mg/ml en diferentes formulaciones, fue evaluado al ciclizar substancia de medicamento hasta 3 veces entre el estado congelado y el estado líquido a pH 5.5. Las formulaciones que fueron evaluadas son: (1) 10 mM acetato + 125 mM cloruro de sodio pH 5.5 (2) 15 mM histidina pH 5.5 (3) 15 mM histidina y 0.01% Tween 80 pH 5.5 La congelación fue realizada por medio de un congelador de temperatura controlada de -80°C y la descongelación fue realizada por medio de un baño de agua de temperatura controlada de 30°C. Las muestras fueron extraídas después de cada ciclo de congelación/descongelación y analizadas mediante SEC e inspección visual. Aproximadamente 1 mi de solución de PG110 fue colocado en repositorios para este experimento. La Tabla 13 proporciona una revisión sobre intervalos de prueba para SEC y el número de ciclos de congelación/descongelación realizados. La Tabla 14 muestra el efecto de procesamiento de congelación/descongelación sobre la cantidad de monómero de PG110 restante y la cantidad de fragmentos y agregados formados en las muestras formuladas a estos niveles de pH.

Tabla 1 3: I ntervalos de prueba: Número de ciclos de congelación (- 80°C) y descongelación (baño de agua a 30°C) probados Tabla 14: Estabilidad física de PG 1 10 durante los ciclos repetidos de congelación/descongelación como es determinado vía SEC La inspección visual de las diversas formulaciones mostró que las formulaciones conteniendo histidina y tween 80 (polisorbato 80) tuvieron mínima formación de partículas incluso después de 3 ciclos F/T, indicando que tanto la histidina como el Tween 80 son excipientes muy adecuados para mantener la estabilidad de PG110. Las otras dos formulaciones mostraron un número mucho mayor de partículas visibles (20-30 partículas visibles por recipiente).

Ejemplo 4: Impacto de parámetros de formulación sobre la estabilidad de formulaciones de PG110 durante estudios de microcalorimetría (estabilidad intrínseca) a condiciones de 1 mg/ml La estabilidad termodinámica (estabilidad intrínseca) del anticuerpo ABT110 a una concentración de proteína de 1 mg/ml en diferentes formulaciones fue evaluada al usar microcalorimetría. El calentamiento fue realizado a u na velocidad de exploración 1 °C/minuto. Los resultados son resumidos en la Tabla 1 5.

Tabla 1 5: Las temperaturas de transición de fusión bajo diferentes condiciones de formulación Estos datos muestran que la estabilidad intrínseca de PG110 es impactada por los parámetros de formulación, por ejemplo, pH de formulación y excipientes.

Ejemplo 5: Impacto de concentración sobre la estabilidad de formulación de PG110 durante estudios de congelación/descongelación repetidos (-80°C/30°C) a condiciones de 100 mg/ml El comportamiento de congelación/descongelación (F/T) del anticuerpo ABT110 a una concentración de proteína de 100 mg/ml fue evaluado al ciclizar la solución de proteína hasta 4 veces entre el estado congelado y el estado líquido a pH 6. Los datos previos indican que la histidina es un amortiguador/excipiente adecuado para estabilización de PG110 y, así, el impacto estabilizante de histidina sobre estabilidad de proteína PG1 0 fue probado a 100 mg/ml de concentración de proteína.

La congelación fue realizada por medio de un congelador de temperatura controlada de -80°C y la descongelación se realizó por medio de un baño de agua de temperatura controlada de 30°C. Las muestras fueron extraídas después de cada ciclo de congelación/descongelación y se analizaron por SEC e inspección visual. La Tabla 16 proporciona una revisión sobre intervalos de prueba para SEC y el número de ciclos de congelación/descongelación realizados. La Tabla 17 muestra el efecto de procesamiento de congelación/descongelación sobre la cantidad de monómero de PG110 restante y la cantidad de freagmentos y agregados formados en las muestras formuladas a estos niveles de pH.

Tabla 16: Intervalos de prueba: Número de ciclos de congelación (- 80°C) y descongelación (baño de agua a 30°C) probados Tabla 17: Estabilidad física de PG110 formulada a alta concentración de proteína (100 mg/ml) en pH 6, 15 mM histidina, durante ciclos de repetidos de congelación/descongelación como es determinado vía SEC Los datos muestra que a 100 mg/ml, las formulaciones de PG110 no experimentan inestabilidad física durante procesamiento de f/t repetido, debido a que los niveles de monómero, agregado y fragmento permanecieron virtualmente sin cambiar a lo largo del experimento de f/t, indicando que la histidina es un excipiente muy adecuado para mantener la estabilidad de PG1 0 durante el procesamiento de f/t.

Ejemplo 6: Impacto de amortiguadores y excipientes sobre la turbidez y morfología de partículas dentro de las formulaciones de PG110 después de diálisis como es determinado mediante inspección visual La experiencia previa con PG110 ha mostrado que la proteína es propensa a inestabilidad física, como es reflejado mediante severa formación de partículas visibles y fenómenos de precipitación cuando se almacenan en una solución de 10 mM acetato, 125 mM NaCI a pH 5.5. Este experimento fue diseñado para verificar si la formación de partículas visibles es inherente a la proteína por sí misma o si una formulación puede ser identificada que mantiene estabilidad física y reduce la susceptibilidad de formación de partículas.

Debido a que las partículas antes mencionadas pueden ser observadas a simple vista, una inspección visual cuidadosa de soluciones de PG110 formuladas con diferentes excipientes es una forma muy informativa para determinar qué condiciones de formulación pueden acelerar o prevenir la formación de partículas.

Para realizar esto, las soluciones de PG110 con los excipientes listados en la Tabla 18 y a una concentración de 1 mg/ml fueron preparados mediante diálisis.

Tabla 18: Amortiguadores y excipientes evaluados por su efecto sobre formación de partículas visibles PG110 en solución (amortiguador universal o UB6 es 10mM fosfato, 10 mM citrato pH 6). • 15 mM fosfato de sodio • 15 mM citrato de sodio • 15 mM succinato de sodio • 15 mM arginina • 15 mM histidina • Formulación de auto-amortiguamiento • 10 mM amortiguador universal y 40 mg/ml manitol • 10 mM amortiguador universal y 40 mg/ml sorbitol • 10 mM amortiguador universal y 80 mg/ml sacarosa • 10 mM amortiguador universal y 0.01% (m/m) polisorbato 80 • 10 mM acetato, 125 mM NaCI La solución de PG110 mayor que 1 mg/ml se insertó en cartuchos de slide-a-lyzer con 10,000 MWCO y dializada contra 1 I del medio objetivo de amortiguador/excipiente durante 1 hora. Posteriormente, el medio de diálisis fue reemplazado mediante medio fresco y la diálisis se continuó durante la noche. Siguiendo la diálisis, la concentración de las soluciones fue medida mediante UV280. Si la concentración fue demasiado alta, las soluciones fueron diluidas con el amortiguador correspondiente a la concentración objetivo. Si la concentración fue demasiado baja, la solución fue concentrada con los tubos de ultra centrífuga Amicon a la concentración objetivo. A continuación, el pH de las soluciones fue verificado. Si el pH no estuvo dentro de ±0.1 de 6, el pH fue ajustado a ese objetivo con 0.1 M NaOH o 0.1 M HCI. La condición de pH 6 fue elegida con base en experimentos anteriores, los cuales determinaron que estaba cercano al pH óptimo para estabilidad química y física. Posteriormente, las soluciones se pasaron a través de filtros de 0.20 µ?? en recipientes de PETG claros. El agua destilada también se pasó a través de los mismos filtros en recipientes de PETG para servir como un control.

Siguiendo este procedimiento, las soluciones de PG110 en los viales de PETG fueron inspeccionados visualmente por partículas. Las botellas fueron mantenidas contra una luz fluorescente suave así como contra un fondo negro. Las botellas también fueron agitadas suavemente para provocar que las partículas fluyan, haciendo así más fácil la inspección visual. Las botellas fueron almacenadas entonces a 4°C durante la noche. El siguiente día, las botellas fueron removidas de almacenamiento e inspeccionadas como antes.

La inspección inmediatamente después de la filtración no reveló partículas visibles en todas las muestras. Sin embargo, después de almacenamiento durante la noche a 4°C, la inspección visual reveló formación de partículas en muchos de los amortiguadores/excipientes. Los hallazgos son resumidos en la Tabla 19.

Tabla 19: Hallazgos de inspección visual de soluciones de PG110 en los amortiguadores/excipientes listados. Las soluciones fueron inspeccionadas después de la filtración y almacenamiento durante la noche a 4°C. UB6 es 10 mM citrato, 10 mM fosfato pH 6 Los datos indican que Tween-80 previene la formación de partículas visibles, justificando su uso . De los excipientes dados q ue tie ne n capacidad amortig uadora a pH 6 (citrato , fosfato, succinato, histidina) , los datos indican que la histidina es mejor para prevenir formación de partícula visible.

Ejemplo 7 : Impacto de amortiguadores y excipientes de formulación sobre la estabilidad de formulaciones de PG 1 0 du rante ciclos de congelación/descongelación repetidos (-80°C/30°C) Este ejemplo describe datos de experimentos cond ucidos para evaluar el potencial de estabilización de varios amortiguadores y excipientes en formulaciones de soluciones de PG 1 1 0 a 2 mg/ml y pH de 6 sobre procesamiento repetido de congelación (congelador de temperatura controlada de -80°C) y descongelación (baño de agua con circulación de temperatu ra controlada de 30°C) . (La condición de pH 6 fue elegida con base en experimentos anteriores, los cuales determinaron q ue estuvo cerca del pH óptimo pa ra estabilidad química y física). Los amortiguadores y excipientes probados son listados en la Tabla 20.

Tabla 20: Amortiguadores y excipientes evaluados por su efecto sobre degradación de DS de PG110 cuando se exponen a congelación-descongelación (amortiguador universal o UB6 es 10 mM fosfato, 10 mM citrato pH 6). • 15 mM fosfato de sodio • 15 mM citrato de sodio • 15 mM succinato de sodio • 15 mM arginina • 15 mM histidina • Formulación de bajo iónico (es decir, formando en agua) • 10 mM amortiguador universal y 40 mg/ml manitol • 10 mM amortiguador universal y 40 mg/ml sorbitol • 10 mM amortiguador universal y 80 mg/ml sacarosa • 10 mM amortiguador universal y 80 mg/ml trehalosa • 10 amortiguador universal y 0.01% (m/m) polisorbato 80 • 10 mM acetato, 125 mM NaCI Las muestras fueron extraídas a T0, T1 (después de un paso de congelación/descongelación), T2 y T3. Un paso de procesamiento de congelación-descongelación abarcó almacenamiento de muestra a -80°C durante al menos 4 horas y descongelación subsecuente de la muestra en un baño de agua con circulación a 30°C. Para analizar muestras de congelación-descongelación , se llenaron tubos de fondo redondo de 5 mi con 3.5 mi de formulación de anticuerpo (usando una pu nta de pipeta de 5 mi que había sido enjuagada con WFI filtrado de 0.2 µ?t?) y sometido a medición de obscu recimiento de luz. Adicionalmente, 0.1 mi de cada muestra fge extra ído para análisis de SEC , y 0.2 mi de muestra fue extra ído y almacenado a -80°C (reservar muestra para caracterización anal ítica adicional opcional) .

Tabla 21 : Esquema de extracción para experimentos de congelación- descongelación "Vial denota depósito de PETG de 30 mi llenado con la solución de muestra El efecto de amortiguadores y excipientes sobre la formación de partículas subvisibles de tamaño = 1 µ?? y > 1 0 m durante el procesamiento de congelación descongelación de PG 1 1 0 es mostrado en las Tablas 22 y 23, respectivamente. Los datos SEC están dados en las Tablas 24, 25 y 26.

En algu nas formulaciones, tales como aquéllos con fosfato, citrato, sorbitol , manitol y sacarosa , el nú mero de partículas > 1 µ?t?/ml incrementó después del primer ciclo de congelación- descongelación solo para dismin uir después del segundo ciclo. En otras formulaciones, tales como aquéllas conten iendo histidina, arginina o simplemente ag ua, el número de partículas = 1 m/ml incrementó después de cada ciclo de congelación-descongelación. Las partículas = 1 0 m/ml incrementó después del primer ciclo de congelación-descongelación , pero disminuyó con ciclos subsecuentes. Después de un ciclo de congelación-descongelación , las formulaciones con sorbitol o man itol tuvieron el mayor número de partículas = 1 pm/ml (al menos > ~200, 000) y también > pm/ml (-25000 promedio) . Sin embargo, después del tercer ciclo de congelación-descongelación , todas las formu laciones revelaron partícu las= 1 pm/ml de menos de 1 00,00 por mi.

El polisorbato 80 fue encontrado por tener un efecto positivo con respecto para mantener estabilidad de PG 1 10, ya que se previene la formación de partículas subvisibles durante el procesamiento de congelación-descongelación de PG 1 10. Esto es atribuido a la capacidad de polisorbato 80 pa ra prevenir la desnatu ralización del anticuerpo en la interfase de hielo-agua . Los azúcares/alcoholes de azúcares incluyendo man itol , sorbitol y sacarosa fueron encontrados como que ind ucen la formación de partículas subvisibles después de ciclos de congelación-descongelación tempra nos. Estas observaciones son soportadas por los datos de SEC los cuales muestran una pérdida notable en % de monómero y u n incremento correspondiente en % de agregado para formulaciones con manitol y sorbitol . (Pa ra todos los demás excipientes, los datos de SEC no se diferencian en términos de estabilidad.) Tabla 22: Número de partículas > 1 µ??/ml medido después de los ciclos de congelación-descongelación listados. F/TO es por debajo de congelación. UB6 es 10 mM fosfato, 10 mM citrato pH6. El agua es agua pura sin proteína.

Tabla 23. Número de partículas > 10 µp?/??? medido después de los ciclos de congelación-descongelación listados. F/TO es por debajo de congelación. UB6 es 10 mM fosfato, 10 mM citrato pH6. El agua es agua pura sin proteína, medios bajo-iónico significa que la proteína es formulada en agua sin excipientes adicionales agregados.

Tabla 24: Porcentaje de monómero de muestras de PG110 formuladas en varios amortiguadores y excipientes después del almacenamiento durante experimentos de congelación/descongelación (datos SEC) (UB6 es 10 mM citrato, 10 mM fosfato pH 6; "bajo iónico" es la proteína en solo agua).

Tabla 25: Porcentaje de agregado de muestras de PG110 formuladas en varios amortiguadores y excipientes después del almacenamiento durante experimentos de congelación/descongelación (datos SEC) (UB6 es 10 m citrato, 10 mM fosfato pH 6; "bajo iónico" significa que la proteína es formulada en agua sin excipientes adicionales agregados).

Tabla 26: Porcentaje de fragmentos de muestras de PG110 formuladas en varios amortiguadores y excipientes después del almacenamiento durante experimentos de congelación/descongelación (datos SEC) (UB6 es 10 mM citrato, 10 mM fosfato pH 6; "bajo iónico" es la proteína en solo agua).

Ejemplo 8: Impacto de amortiguadores y excipientes sobre la estabilidad físico-química de formulaciones de PG110 durante prueba de estabilidad acelerada Ejemplos anteriores han discutidos los factores que afectan la estabilidad de formulaciones de PG110 durante el almacenamiento a largo plazo, incluyendo pH y temperatura de almacenamiento. Además de estos factores extrínsecos, los ingredientes de formulación por si mismos deben ser evaluados por su impacto sobre estabilidad de substancia de medicamento de proteína durante el almacenamiento. Con el fin de realizar esto, la substancia de medicamento de proteína es expuesta a almacenamiento a corto plazo a temperaturas elevadas durante las etapas de proyecto de preformulación y formulación con el fin de ganar rápidamente percepción sobre la factibilidad de formulación para almacenamiento a largo plazo a menores temperaturas (en la mayoría de los casos 2- 8°C).

La estabilidad de almacenamiento del anticuerpo de PG110 en solución se evaluó a varias temperaturas durante periodos prolongados a condiciones de temperatura a pH 6 en diferentes amortiguadores y excipientes. La condición de pH 6 fue elegida con base en los experimentos anteriores, los cuales determinaron que estuvo cerca del pH óptimo para estabilidad química y física. Después de periodos de almacenamiento definidos, las muestras fueron extraídas y el impacto de tiempo de almacenamiento y temperatura de almacenamiento sobre estabilidad de PG110 fue evaluada por SEC e iCIEF.

En este estudio, se formuló PG110 a 2 mg/ml en varios amortiguadores y excipientes listados en la Tabla 27.

Tabla 27. Amortiguadores y excipientes probados por su efecto sobre estabilidad física y química de PG110 sometido a almacenamiento a temperaturas elevadas (el amortiguador universal es 10 mM citrato, 10 mM fosfato pH 6) • 15 mM fosfato de sodio • 15 mM citrato de sodio • 15 mM succinato de sodio • 15 mM acetato de sodio • 15 mM arginina • 15 mM histidina • Formulación de bajo iónico • 10 mM amortiguador universal y 40 mg/ml manitol • 10 mM amortiguador universal y 40 mg/ml sorbitol • 10 mM amortiguador universal y 80 mg/ml sacarosa • 10 mM amortiguador universal y 80 mg/ml trehalosa • 10 mM amortiguador universal y 2.5% (m/m) glicerol • 10 mM amortiguador universal y 15 mM sulfato de amonio • 10 mM amortiguador universal y 20 mM cloruro de sodio • 10 mM amortiguador universal y 200 mM cloruro de sodio • 10 mM amortiguador universal y 0.01% (m/m) polisorbato 80 • 10 mM amortiguador universal y 0.01% (m/m) polisorbato 20 • 10 mM amortiguador universal y 0.01% (m/m) poloxamer 188 Las muestras fueron entonces almacenadas bajo condiciones controladas (en cámaras de temperatura y en la ausencia de luz) a varias temperaturas. En puntos predefinidos, las muestras de soluciones preparadas fueron extraídas para análisis de acuerdo con el esquema de extracción de muestra provisto en las Tablas 28 y 29 para SEC e iCIEF, respectivamente. Los números se refieren al número de viales que fueron almacenadas/extraídas para cada condición de amortiguador/excipiente. Los datos son provistos en las Tablas 30, 31 y 32.

Tabla 28: Esquema de extracción de muestras Tabla 29: Esquema de extracción de muestras Tabla 30: Porcentaje de monómero de muestras de PG110 formuladas en varios amortiguadores y excipientes después de almacenamiento a temperaturas y tiempos especificados (datos SEC) (UB es 10 mM citrato, 10 mM fosfato pH 6; bajo iónico significa que la proteína es formulada en agua sin excipientes adicionales agregados) Tabla 31: Porcentaje de agregado de muestras de PG110 formuladas en varios amortiguadores y excipientes después de almacenamiento a temperaturas y tiempos especificados (datos SEC) (UB es 10 mM citrato, 10 mM fosfato pH 6; bajo iónico significa que la proteína es formulada en agua sin excipientes adicionales agregados) Tabla 32: Porcentaje de fragmento de muestras de PG110 formuladas en varios amortiguadores y excipientes después de almacenamiento a temperaturas y tiempos especificados (datos SEC) (UB es 10 mM citrato, 10 mM fosfato pH 6; bajo iónico significa que la proteína es formulada en agua sin excipientes adicionales agregados) Tabla 33: Porcentaje de varias especies de muestras de PG1 10 formuladas en varios amortiguadores y excipientes después de almacenamiento a temperaturas y tiempos especificados (datos iCEI F) (UB6 es 1 0 m M citrato, 1 0 mM fosfato pH 6; bajo-iónico significa que la proteína es formulada en agua sin excipientes adicionales agregados) .

La estabilidad de PG 1 1 0 disminuyó con temperatura de almacenamiento creciente, el cual es el comportamiento esperado para todas las proteínas. Si n embargo, los datos recolectados hasta ahora indican que formular PG 1 10 usando fosfato, arg inina o glicerol resultaría en desnaturalización potencial . Después de almacenamiento a 50°C durante 7 d ías con glicerol, no se detectó proteína vía SEC , indicando que todo PG 1 10 ha experimentado inestabilidad física y formación de ag regados insolubles , evitando así la detección SEC/UV.

Ejem plo 9: Impacto de amortig uadores y excipientes de formulación sobre la estabilidad de formulaciones de PG 1 1 0 almacenadas a - 80°C Los hallazgos a partir de los ejemplos anteriores condujo a la decisión de que una formulación de 1 5 mM histidina y 0.01 % Tween 80 fue óptima para la prevención de formación de partículas visibles en formulaciones líquidas de la substancia de medicamento (Ejemplo 6) . Tween 80 también previno la formación de partículas subvisibles inducidas por tensión de congelación-descongelación como es detallado en el Ejemplo 7. La prueba de estabilidad acelerada (Ejemplo 8) también determinó que los dos excipientes no provocaron niveles inaceptables de agregación o fragmentación .

Con esto en mente, la siguiente preocupación es si los excipientes provocan desestabilización de la substancia de medicamento cuando se almacenan a -80°C. Para probar esto, soluciones de PG110 de 150 µ? a 1 mg/ml y 10 mg/ml en la formulación original (10 mM acetato 125 mM NaCL), 15 mM histidina pH 6, y 15 mM histidina pH 6 + 0.01% Tween 80 fueron preparadas y almacenadas a -80°C en crioviales. A 5 días, los viales de cada muestra fueron removidos de almacenamiento y la degradación fisicoquímica fue cuantificada por SEC. A 10 días, el vial restante de cada muestra fue removido y analizado de la misma manera. Las Tablas 34, 35 y 36 contienen los resultados de estos experimentos.

Los datos muestran que para formulaciones con histidina o histidina+tween 80, el % de monómero aumenta durante 0 a 5 días y permanece a ese nivel al menos hasta 10 días. En contraste, PG110 a 10 mg/ml en 10 mM acetato y 125 mM NaCI muestra una disminución estable en % de monómero de 0 a 5 días a 10 días, que corresponde a un incremento en % de agregado. En total, los datos indican que una formulación de histidina+tween 80 no desestabiliza la substancia de medicamento cuando se almacena a -80°C.

Tabla 34. Porcentaje de monómero de muestras de PG110 formuladas en varios amortiguadores y excipientes después de almacenamiento a -80°C (datos SEC).

Tabla 35. Porcentaje de agregado de muestras de PG110 formuladas en varios amortiguadores y excipientes después de almacenamiento a -80°C (datos SEC).

Tabla 36. Porcentaje de fragmento de muestras de PG 1 1 0 formuladas en varios amortiguadores y excipientes después de almacenamiento a -80°C (datos SEC) .

Los datos de inspección visual también mostraron que las formulaciones conteniendo histidina incluso a 100 mg/ml no conten ían formación de partículas visibles incluso después de 4 ciclos de F/T, indicando además que la histidina es un excipiente muy adecuado pa ra mantener la estabilidad de PG 1 1 0.

Ejemplo 10: I mpacto de congelación-descongelación , agitación y prueba de estabilidad acelerada sobre la estabilidad de PG110 en varias formulaciones a varias concentraciones.

El impacto de excipientes sobre estabilidad de PG110 fue evaluado en varios experimentos de tensión: 1) procesamiento de congelación-descongelación repetido (baño de agua de -80°C/30°C); 2) agitar para ejercer efectivamente tensión de agitación y a incrementar la interfase de aire-líquido para inducir la inestabilidad física y degradación de PG110 (vial de vidrio 6R, temperatura, aprox. 9 mm barra de agitación recubierta con Teflon, 550 rpm, hasta 48 h de agitación); 3) Prueba de estabilidad acelerada: varias muestras fueron puestas en estabilidad acelerada y tiempo real a 2-5C, 25°C/60% HR y 40°C/60% HR, y el impacto de concentración de proteína y el impacto de concentración de proteína y excipientes estabilizantes sobre el contenido de monómero de PG110 natural fue monitoreado por SEC/UV.

Las siguientes formulaciones de PG110 y composiciones de formulación fueron probadas: Formulación 1: 52 mg/ml PG110, pH 6.0; 2.33 mg/ml histidina; 5.0 mg/ml sacarosa; 20.0 mg/ml manitol; y 0.10 mg/ml polisorbato 80.

Formulación 2: 52 mg/ml PG110, pH 6.0; 2.33 mg/ml histidina; 46 mg/ml sacarosa; y 0.10 mg/ml polisorbato 80.

Formulación 3: 52 mg/ml PG110, pH 6.0; 2.33 mg/ml histidina; 46 mg/ml trehalosa; y 0.10 mg/ml polisorbato 89.

Formulación 4: 20 mg/ml PG110, pH 6.0; 2.33 mg/ml histidina; 5.0 mg/ml sacarosa; 20.0 mg/ml manitol; y 0.10 mg/ml polisorbato 80.

Formulación 5: 20 mg/ml PG110, pH 6.0; 2.33 mg/ml histidina; 46 mg/ml de sacarosa; y 0.10 mg/ml polisorbato 80.

Formulación 6: 20 mg/ml PG110, pH 6.0; 2.33 mg/ml histidina; 46 mg/ml trehalosa; y 0.10 mg/ml polisorbato 80.

La estabilidad de congelación-descongelación del anticuerpo ABT110 a concentraciones de proteína de 52 mg/ml y 20 mg/ml, fueron como sigue después de 2 y después de 4 ciclos f/t, respectivamente.

Tabla 37: Contenido de monómero como es determinado por SEC/UV Los datos anteriores demuestran que la sacarosa, trehalosa y manitol fueron bien adecuados para mantener la estabilidad física de PG110 durante tensión de f/t repetida. Virtualmente no hubo degradación detectada con respecto al contenido de monómero de PG110 natural a lo largo del experimento de tensión.

La estabilidad de tensión de agitación del anticuerpo ABT110 a concentraciones de proteína de 52 mg/ml y 20 mg/ml, fueron como sigue después de 24 y 48 h de agitación, respectivamente.

Tabla 38: Contenido de monómero como es determinado por SEC/UV Los datos anteriores demuestran que la sacarosa, trehalosa y manitol fueron bien adecuados para mantener la estabilidad física de PG110 durante tensión de agitación extensa. Virtualmente no se detectó degradación con respecto al contenido de monómero de PG110 natural a lo largo del experimento de tensión.

La cinética de degradación acelerada del anticuerpo ABT110 a concentraciones de proteína de 52 mg/ml y 20 mg/ml, fue como sigue después de 14 días a 5°C y después de 14 días a 50°C.

Tabla 39: Contenido de monómero como es determinado por SEC/UV Los datos anteriores demuestran que la sacarosa, trehalosa y manitol fueron bien adecuados para mantener la estabilidad física de PG110 durante el almacenamiento a plazo más largo. Incluso cuando se exponen a 50°C durante 14 días, más de 80% de monómero natural estuvo presente en todas las muestras probadas.

Ejemplo 11: Estabilidad a largo plazo de polvo liofilizado de PG110 almacenado bajo diversas condiciones La conveniencia de sacarosa y manitol como estabilizantes durante la liofilización y almacenamiento de PG110 fue estudiada adicionalmente. Dos formulaciones de polvo liofilizado de PG110 para solución de inyección fueron colocadas bajo condiciones de almacenamiento a plazo más largo (2-8°C), condiciones de almacenamiento acelerado de 25*760% HR, y condiciones de tensión de 40°C/75% HR y 50°C. Estos lotes de producto de medicamento de escala de laboratorio fueron producidos y liofilizados a partir de 130 I de substancia de medicamento a escala fabricada de acuerdo con los métodos estándares, por ejemplo, como se muestra en la Tabla 40.

Tabla 40: Condiciones de liofilización para formulaciones 1 y 2 Para prueba, las muestras de las formulaciones fueron resuspendidas en agua estéril, destilada, a temperatura ambiente.

Formulación 1 : Formulación 2: 20 mg/ml PG110, pH 5.5 20 mg/ml PG110, pH 5.5 2.33 mg/ml histidina 2.33 mg/ml histidina 70 mg/ml sacarosa 10 mg/ml sacarosa 0.1 mg/ml polisorbato 80 30 mg/ml manitol 0.1 mg/ml polisorbato 80 Los métodos de prueba relacionados a la calidad, actividad biológica y pureza de la substa ncia de med icamento fueron realizados varios para valorar el perfil de estabilidad de PG 1 10 en cada lote. Los métodos anal íticos usados incluyeron : • Apariencia (visual) • Partículas (visual) • Partículas subvisibles (bloqueo de luz) • pH • enfoque isoeléctrico capilar de imagen formada (icI EF) • SDS PAGE (reducido y no red ucido) • HPLC de exclusión por tamaño • Ensayo de unión a antígeno específica de prod ucto • Bioensayo funciona l específico de prod ucto La prueba de integridad de cierre de recipiente fue realizado usando un método de penetración de tinte, en el cual el vial de producto de medicamento fue expuesto a vacío en una solución de azul de metileno, y entonces se inspeccionó visualmente para coloración azul. El contenido de ag ua fue determinado por U SP, de acuerdo con métodos estándares. Los datos de estabilidad obtenidos para muestras de lote 1 y lote 2 son provistos en las Tablas 41 -48.

Tabla 41: Estabilidad de formulación liofilizada PG110 1 almacenada a 2-8°C Tabla 42: Estabilidad de formulación liofilizada PG110 1 almacenada a 25°C/60% HR Tabla 43: Estabilidad de formulación liofilizada PG110 1 almacenada a 40°C/75% HR Tabla 44: Estabilidad de formulación liofilizada PG110 1 almacenada a 50°C Tabla 45: Estabilidad de formulación liofilizada PG11Q 2 almacenada a 2-8°C Tabla 46: Estabilidad de formulación liofilizada PQ1102 almacenada a 25°C/60% HR Tabla 47: Estabilidad de formulación liofilizada PG1102 almacenada a 40°C/75% HR Tabla 48: Estabilidad de formulación liofilizada PG1102 almacenada a 50°C Todos los datos en las muestras de las Formulaciones 1 y 2 almacenadas en las condiciones de almacenamiento pretendidas de 2 a 8°C, así como las muestras almacenadas a 25°C y 40°C durante 6 meses cumplen los criterios de aceptación y no se observaron cambios significativos en cualquiera de las pruebas de parámetros de estabilidad en estas temperaturas. El almacenamiento a condiciones de tensión más extrema (50°C) durante un mes resultó en un descenso en pureza, lo cual fue evidente solo para icIEF.

Una comparación de las Formulaciones 1 y 2 a 40°C durante 6 meses indicó que el anticuerpo PG110 formulado con solo sacarosa, demostró un mayor nivel de estabilidad que el anticuerpo formulado con una combinación de sacarosa y manitol (Figura 1). Además, se observó de manera sorprendente que la formación de partículas subvisibles y visibles en estas formulaciones, las cuales contienen una proporción molar de azúcar y/o poliol:proteina mayor que 1400 (por ejemplo, Formulación 1 - proteína:azúcar = 1:1515; Formulación 2 - proporción proteína:azúcar+poliol = 1436), no cambia en el tiempo, incluso en estudios de estabilidad acelerada a 40°C.

Incorporación por referencia La presente invención incorpora por referencia en su totalidad, técnicas bien conocidas en el campo de formulación de proteínas. Estas técnicas incluyen, pero no están limitadas a, técnicas descritas en las siguientes publicaciones: Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos actuales en biología molecular), John Wiley & Sons, NY (1993); Ausubel, F.M. et al., eds., Short Protocols In Molecular Biology (Breves protocolos en biología molecular) (4a ed. 1999), John Wiley & Sons, NY. (ISBN 0-471-32938-X). Controlled Drug Bioavailability Drug Product Design and Performance (Diseño y desempeño de producto de medicamento de biodisponibilidad de medicamento controlado), Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Glege, R y Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach (Cristalización de ácidos nucleicos y proteínas, una aproximación práctica), 2a ed., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, N.Y., (1999); Goodson, en Medical Applications of Controlled Reléase (Aplicaciones médicas en liberación controlada), vol. 2, pp. 115-138 (1984), Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (Anticuerpos monoclonales e hibridomas de células T), 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Anticuerpos: Un manual de laboratorio), (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed., 1988); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest ((Secuencias de proteínas de interés inmunológico) (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) y (1991); Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (Secuencias de proteínas de interés inmunológico), quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Kontermann and Dubel eds., (Antibody Engineering (Ingeniería de anticuerpos (2001) Springer-Verlag. New York, 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual (Transferencia y expresión de genes, un manual de laboratorio), Stockton Press, NY (1990); Lu y Weiner eds., Cloning and Expression Vectors for Gene Function Analysis (Vectores de clonación y expresión para análisis de función de genes (2001) BioTechniques Press. Westborough, Mass. 298 pp. (ISBN 1 -881299-2 -X), Medical Applications of Controlled Reléase (Aplicaciones médicas de liberación controlada), Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Ratón, Fia. (1974); Oíd, R.W. & S.B. Primrose, Principies of Gene Manipulation: An Introduction To Genetic Engineering Principios de manipulación genética: una introducción a ingeniería genética (3a ed., 1985), Blackwell Scientific Publications, Boston, Studies in Microbiology; (Estudios en microbiología); V.2:409 pp. (ISBN 0-632-01318-4); Sambrook, J. et al. eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonación molecular: un manual de laboratorio) (2a ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Vols, 1-3 (ISBN 0-87969-309-6); Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems (Sistemas de entrega de medicamento de liberación sostenida y controlada), J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978; Winnacker, E. L. From Genes To Clones: Introduction To Gene Technology (De genes a clones: introducción a tecnología de genes (1987) VCH Publishers, N.Y. (traducidos por Horst Ibelgaufts). 634 pp. (ISBN 0-89573-614-4).

Equivalentes La invención puede ser abarcada en otras formas específicas sin apartarse del espíritu o características esenciales de la misma. Las modalidades anteriores son consideradas por lo tanto en todos los aspectos ilustrativos en lugar de limitantes de la invención descritas en la presente. El alcance de la invención es indicada así mediante las reivindicaciones anexas en lugar de por la descripción anterior y todos los cambios.

Claims (76)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende: (a) un anticuerpo de factor de anti-crecimiento de nervio (NGF), o fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) un amortiguador de histidina a una concentración de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 60 mM; y (c) polisorbato 80 a una concentración de aproximadamente 0.01% hasta aproximadamente 0.1%, en donde el pH de la composición es aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 6.0.

2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde dicha composición comprende aproximadamente 10 hasta aproximadamente 30 mM histidina.

3. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde el pH es aproximadamente 5.5.

4. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde la composición comprende aproximadamente 0.01% hasta aproximadamente 0.02% polisorbato 80.

5. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde la composición comprende además aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 mg/ml de un poliol.

6. La composición farmacéutica de la reivindicación 5, en donde el poliol es seleccionado del grupo que consiste de sorbitol y manitol.

7. La composición farmacéutica de la reivindicación 6, en donde el poliol es manitol.

8. La composición farmacéutica de la reivindicación 7, en donde la composición comprende aproximadamente 10 hasta aproximadamente 30 mg/ml de manitol.

9. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde la composición comprende además aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100 mg/ml de un azúcar.

10. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, en donde el azúcar es sacarosa.

11. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, en donde la composición comprende aproximadamente 10 hasta aproximadamente 70 mg/ml de sacarosa.

12. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde dicha composición no comprende un poliol o un azúcar.

13. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde dicha composición no comprende metionina.

14. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde la concentración del anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, es aproximadamente 1 hasta aproximadamente 240 mg/ml.

15. La composición farmacéutica 1, en donde la concentración del anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, es aproximadamente 20 hasta aproximadamente 120 mg/ml.

16. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y 13-15, en donde la proporción molar de (a) anticuerpo anti-NG F, o fragmento de un ión a antígeno del mismo, a (b) poliol, azúcar o combinación del mismo, es mayor que 1 : 1400.

17. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 , en donde dicha composición comprende: (a) aproximadamente 20 mg/ml del a nticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo; (b) aproximadamente 1 5 mM histidina ; y (c) aproximadamente 0.01 % polisorbato 80; en donde el pH de la formulación es aproximadamente 5.5.

18. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 , en donde dicha composición comprende: (a) aproximadamente 60 mg/ml del anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo; (b) aproximadamente 30 mM histidina ; y (c) aproximadamente 0.02% polisorbato 80; en donde el pH de la formulación es aproximadamente 5.5.

19. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 , la cual es adecuada para liofilización .

20. Una composición farmacéutica liofilizada que comprende: (a) aproximadamente 1 hasta aproximadamente 1 20 mg de un anticuerpo anti-NGF, o fragmento de unión al antígeno del mismo; (b) aproximadamente 1 hasta aproximadamente 1 0 mg de histidina ; y (c) aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 0.4 mg de polisorbato 80.

21 . La composición farmacéutica liofilizada de la reivindicación 20 , en donde la composición comprende: (a) aproximadamente 60 mg de un anticuerpo anti-NG F, o fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) aproximadamente 4.7 mg de histidina ; y (c) aproximadamente 0.2 mg de polisorbato 80.

22. La composición farmacéutica liofilizada de la reivindicación 20, en donde la composición comprende: (a) aproximadamente 20 mg de un anticuerpo anti-NG F, o fragmento de u nión a antígeno del mismo; (b) aproximadamente 2.3 mg de histidina; y (c) aproximadamente 0.1 mg de polisorbato 80.

23. La composición farmacéutica liofilizada de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22 , que comprende además aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 mg de un poliol.

24. La composición farmacéutica liofilizada de la reivindicación 23, en donde el poliol es aproximadamente 1 0 hasta aproximadamente 50 mg de manitol .

25. La composición farmacéutica liofilizada de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, que comprende además aproximadamente 1 hasta aproximadamente 1 00 mg de u n azúcar.

26. La composición farmacéutica liofilizada de la reivindicación 25, en donde el azúcar es aproximadamente 1 hasta 1 00 mg de sacarosa .

27. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo anti-NGF, o porción de unión al antígeno del mismo, se une a NG F humano.

28. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones precedentes , en donde el anticuerpo anti-NGF; o porción de unión a antígeno del mismo, comprende u na región constante de lgG4 humana .

29. La composición farmacéutica de cua lquiera de las reivindicaciones precedentes , en donde el anticuerpo anti-NG F, o porción de unión a antígeno comprende una mutación de región de gozne.

30. La composición farmacéutica de la región 29, en donde la mutación de región de gozne comprende u na mutación de una serina en la posición de aminoácido 1 08 de SEQ I D NO:9.

31 . La composición farmacéutica de la reivindicación 29, en donde la serina en la posición de aminoácido 1 08 de SEQ I D NO:9 es mutada a prolina.

32. La composición farmacéutica de la reivindicación 29, en donde la región constante de lgG4 humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 10.

33. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones precedentes , en donde el anticuerpo , o porción de unión a antígeno del mismo, tiene una o más de las siguientes propiedades fu ncionales: a) se une a NG F humana pero no se une a factor neurotrófico derivado de cerebro humano (BDN F) , neu rotrofina 3 (NT-3) o neurotrofina h umana 4 (NT-4); b) se une a NGF humano o de rata con u na KD de 1 00 pM o menos; c) inhibe la unión de NG F a TrkA o p75NTR; d) inhibe la proliferación dependiente de NGF de células TF-1 ; e) inhibe la supervivencia de ganglios de raíz dorsal de pollo NGF-dependiente; y f) in hibe la excrecencia de neurita de células PC 1 2 NG-dependiente.

34. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones precedentes , en donde el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, no exhibe un efecto de rebote cuando se administra a un sujeto.

35. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, comprende u na región variable de cadena pesada que comprende C DRs 1 , 2 y 3 , teniendo las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NOs: 3, 4 y 5, respectivamente.

36. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones precedentes , en donde el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena ligera que comprende CDRs 1 , 2 y 3, teniendo las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, respectivamente.

37. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones precedentes , en donde el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO : 1 .

38. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones precedentes , en donde el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, comprende una reg ión variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.

39. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, compite por unión a NG F con un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

40. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 -26, en donde el anticuerpo , o porción de unión a antígeno del mismo, comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO : 1 3.

41 . La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 -26 y 40, en donde el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO : 16.

42. Una composición farmacéutica q ue comprende: (a) un anticuerpo de factor anti-crecim iento de nervios (NGF) , o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende (i) una región variable de cadena pesada comprend iendo C DRs 1 , 2 y 3 teniendo las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NOs: 3, 4 y 5, respectivamente, (ii) una región variable de cadena ligera que comprende CDRs 1 , 2 y 3 teniendo las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NOs: 6, 7 y 8 , respectivamente, y (iii) una región constante de lgG4 humana teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 10, en donde la concentración del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, es aproximadamente 1 0 hasta aproximadamente 50 mg/ml; (b) un amortiguador de histidina a una concentración de aproximadamente 1 0 hasta aproximadamente 30 m M histidina ; y (c) polisorbato 80 a una concentración de aproximadamente 0.01 % hasta aproximadamente 0.02% ; en donde el pH de la composición es aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 6.0.

43. Una composición farmacéutica q ue comprende: (a) un anticuerpo de factor anti-crecimiento de nervio (NGF) que comprende (i) una región variable de cadena pesada teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 1 , (ii) una región variable de cadena ligera teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO:2, y (iii) una región constante de lgG4 humana comprendiendo una mutación de región de gozne en la posición 108 de SEQ I D NO:9, en donde la concentración del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, es aproximadamente 1 0 hasta aproximadamente 50 mg/ml; (b) un amortiguador de histidina a u na concentración de aproximadamente 1 0 hasta aproximadamente 30 mM histidina; y (c) polisorbato 80 a una concentración de aproximadamente 0.01 % hasta 0.02% ; en donde el pH de la composición es aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 6.0.

44. Una composición farmacéutica q ue comprende: (a) un anticuerpo de factor anti-crecimiento de nervio (NGF) que comprende una región constante de lgG4 humana , en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 1 3 y u na cadena ligera teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO : 16, en donde la concentración del anticuerpo, o fragmento de u nión a antígeno del mismo, es aproximadamente 1 0 hasta aproximadamente 50 mg/ml; (b) un amortiguador de histidina a una concentración de aproximadamente 1 0 hasta aproximadamente 30 mM histidina; y (c) polisorbato 80 a una concentración de aproximadamente 0.01 % hasta 0.02%; en donde el pH de la composición es aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 6.0.

45. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 42 a 44, que comprende además aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50 mg/ml de manitol .

46. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 42 a 45, que comprende además aproximadamente 5 hasta aproximadamente 70 mg/ml de sacarosa .

47. La composición farmacéutica de cualqu iera de las reivindicaciones 42 a 44, que consiste esencialmente de: (a) aproximadamente 1 0 hasta 30 mg/ml del anticuerpo o fragmento de u nión a antígeno del mismo; (b) aproximadamente 1 5 mM de amortiguador de histidina; y (c) aproximadamente 0.01 % de polisorbato 80; en donde el pH de la composición es aproximadamente 5.5.

48. La composición farmacéutica de la reivindicación 45, que consiste esencialmente de: (a) aproximadamente 1 0 hasta 30 mg/ml del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) aproximadamente 1 5 mM de amortiguador de histidina ; (c) aproximadamente 0.01 % de polisorbato 80; y (d) aproximadamente 1 0 a 30 mg/ml de manitol ; en donde el pH de la composición es aproximadamente 5.5.

49. La composición farmacéutica de la reivindicación 46, q ue consiste esencialmente de: (a) aproximadamente 1 0 a 30 mg/ml del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) aproximadamente 1 5 mM de amortiguador de histidina; (c) aproximadamente 0.01 % de polisorbato 80; y (d) aproximadamente 40 a 70 mg/ml de sacarosa; en donde el pH de la composición es aproximadamente 5.5.

50. La composición farmacéutica de la reivindicación 46, que consiste esencialmente de: (a) aproximadamente 10 a 30 mg/ml del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) aproximadamente 1 5 mM de amortiguador de histidina; (c) aproximadamente 0.01 % de polisorbato 80; (d) aproximadamente 1 0 a 30 mg/ml de manitol; y (e) aproximadamente 5 hasta 1 0 mg/ml de sacarosa; en donde el pH de la composición es aproximadamente 5.5.

51 . La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 42 a 50, en donde la proporción de anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, a poliol y/o azúcar es mayor que 1 : 1400.

52. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 42 a 51 , en donde la composición farmacéutica es liofilizada .

53. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, es seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, u n anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado con CDR, un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fv, un Fv enlazado a disulfuro, un scFv, un anticuerpo de dominio simple, u n diacuerpo, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo específico d ual, y un anticuerpo biespecífico.

54. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, es el anticuerpo PG 1 1 0.

55. La composición farmacéutica de cualqu iera de las reivindicaciones precedentes , en donde la formulación es estable en una forma líquida d urante al menos aproximadamente 3 meses.

56. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la formulación es estable en una forma l íquida durante al menos aproximadamente 1 2 meses.

57. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la formulación es estable durante al menos 3 meses en una forma congelada o liofilizada.

58. La composición farmacéutica de la reivindicación 57, en donde la formulación es estable durante al menos 6 meses en forma congelada o liofilizada .

59. La composición farmacéutica de la reivindicación 57, en donde la formulación es estable du rante al menos 1 2 meses en una forma congelada o liofilizada .

60. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 55 o 56, en donde la formulación es almacenada a 2-8°C .

61 . La composición farmacéutica de las reivindicaciones 57 o 58, en donde la formulaciones almacenada congelada a -80°C .

62. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 57 o 58, en donde la formulación es almacenada en forma liofilizada a 2- 8°C.

63. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 57 o 58, en donde la formulación es almacenada en forma liofilizada a temperatura ambiente.

64. La composición farmacéutica de cualq uiera de las reivindicaciones 55 a 63, en donde existe menos de aproximadamente 1 0% de ag regación del anticuerpo.

65. La composición de cualq uiera de las reivindicaciones 55 a 63, en donde existe menos de aproximadamente 3% de agregación del anticuerpo.

66. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones precedentes , en donde la formu lación es adecuada para administración intravenosa, subcutánea y/o intramuscular.

67. Un dispositivo que comprende la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 -65.

68. El dispositivo de la reivindicación 66 , en donde el dispositivo es seleccionado del grupo que cosiste de una jeringa, una pluma , un implante, un dispositivo de inyección libre de aguja, un dispositivo de inhalación y un parche.

69. Un artículo de fabricación que comprende la composición farmacéutica o dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 -67.

70. El uso de la composición farmacéutica de cualq uiera de las reivindicaciones 1 -65 , o el dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 66-67, para tratar una enfermedad o condición mediada por NGF.

71 . El uso de la reivindicación 69, en donde la enfermedad o condición mediada por NG F es dolor.

72. El uso de la reivindicación 70, en donde el dolor es seleccionado del grupo que consiste de dolor de osteoartritis, dolor crónico de espalda baja, dolor neuropático diabético, dolor de cáncer, dolor de metástasis ósea, cistitis intersticial, síndrome de vejiga dolorosa, dolor asociado con prostatitis abacteriana crónica, dolor asociado con endometriosis, dolor asociado con fibroides uterinos y dolor post-operatorio.

73. El uso de cualq uiera de las reivindicaciones 69-71 , en donde la composición farmacéutica es adecuada para administración del anticuerpo anti-NG F, o fragmento de unión a antígeno del mismo a una dosis en un rango desde 0.1 mg/kg hasta 1 0 mg/kg.

74. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 69-72 , en donde la composición farmacéutica es adecuada para administración de manera intravenosa, subcutánea o intra-articular.

75. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 69-74, en donde la composición farmacéutica es adecuada para administración con u n segundo agente farmacéutico.

76. El uso de la reivindicación 74, en donde el segundo agente farmacéutico es seleccionado del grupo que consiste de NSAI Ds, analgésicos incluyendo analgésicos opioides y analgésicos atípicos, anestésicos locales , bloques de nervios, bloques de fenol, anticuerpos terapéuticos, esferoides, anti-convulsionantes, antidepresivos, capsaicina tópica, agentes antivirales, inhibidores TrkA e inhibidores PKC.