CN109982716A - 在加工过程中稳定生物制药药物产品的新方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生产包含感兴趣的生物分子的生物制药药物产品的方法，所述方法包括：(a)制备感兴趣的生物分子的药物物质的第一阶段，所述第一阶段包括选自以下的至少一种加工步骤：(a1)收集，(a2)纯化，(a3)再缓冲和(a4)富集，其中该第一阶段中的所述至少一种加工步骤在包含至少三种氨基酸的组合物的存在下进行，其中所述至少三种氨基酸的组合提供至少一个带正电的官能团、至少一个抗氧化官能团、至少一个渗透功能和至少一个缓冲功能，和(b)进一步加工(a)中制备的药物物质以获得生物制药药物产品的第二阶段，所述第二阶段包括选自以下的至少一种加工步骤：(b1)再缓冲，(b2)冷冻，(b3)解冻和(b4)填充；其中该第二阶段中的所述至少一种加工步骤在组合物的存在下进行，所述组合物包含(i)至少三种氨基酸，其中所述至少三种氨基酸的组合提供至少一个带正电的官能团、至少一个抗氧化官能团、至少一个渗透功能和至少一个缓冲功能；和(ii)一种或多种糖；氨基酸:糖的比率为10:1至1:100(w/w)。本发明还涉及通过本发明的方法获得或可获得的生物制药药物产品。

Description

在加工过程中稳定生物制药药物产品的新方法
本发明涉及生产包含感兴趣的生物分子的生物制药药物产品的方法，所述方法包括：(a)制备感兴趣的生物分子的药物物质的第一阶段，所述第一阶段包括选自以下的至少一种加工步骤：(a1)收集，(a2)纯化，(a3)再缓冲和(a4)富集，其中该第一阶段中的所述至少一种加工步骤在包含至少三种氨基酸的组合物的存在下进行，其中所述至少三种氨基酸的组合提供至少一个带正电的官能团、至少一个抗氧化官能团、至少一个渗透功能和至少一个缓冲功能，和(b)进一步加工(a)中制备的药物物质以获得生物制药药物产品的第二阶段，所述第二阶段包括选自以下的至少一种加工步骤：(b1)再缓冲，(b2)冷冻，(b3)解冻和(b4)填充；其中该第二阶段中的所述至少一种加工步骤在组合物的存在下进行，所述组合物包含(i)至少三种氨基酸，其中所述至少三种氨基酸的组合提供至少一个带正电的官能团、至少一个抗氧化官能团、至少一个渗透功能和至少一个缓冲功能；和(ii)一种或多种糖；氨基酸:糖的比率为10:1至1:100(w/w)。本发明还涉及通过本发明的方法获得或可获得的生物制药药物产品。
在本说明书中，引用了许多文件，包括专利申请和生产商手册。这些文件的公开内容以其整体援引加入本文，但不被认为与本发明的专利性有关。更具体地，所有参考文件援引加入，相同的程度如同明确地且单独地指出各单独文件援引加入。
生物制药产品领域以及它们的生产方法领域正在迅速增长。通常，在大规模生产感兴趣的生物分子后，生物制药药物产品通过两个主要的后续下游阶段获得。在早期第一阶段，制备所谓的药物物质(本文也称为原料(bulk)物质或原料药物质)。因此，本文中的术语药物物质不仅是活性药物成分，而且是加工过的原料，也含有例如缓冲剂、盐和稳定剂。在第二后期阶段，将所述药物物质进一步加工成生物制药药物产品。
生物制药药物产品生产中的一个关键方面是所用生物分子的稳定性。药物蛋白质和肽以及包含不同种类分子(诸如核酸、多肽、蛋白质、多糖和在包膜病毒或病毒样颗粒情况下的磷脂)的更复杂的生物分子颗粒，已知在各加工步骤期间经受物理和化学压力。这些压力可导致不期望的分子变化，其接着通常导致功能丧失，并且在某些情况下甚至导致严重的安全问题。最终的生物制药药物产品的稳定性还受到取决于各自的储存条件的老化过程的挑战。
整个制备过程中在这样的生物制药药物产品中发生的分子变化是累积的。换句话说，生产初始药物物质的单独制备步骤、其储存和运输，从药物物质到药物产品(包括填充和完成操作)的后续开发步骤，随后药物产品的运输和储存，以及其最终应用的制备所需的步骤的组合变化——它们都会在药物产品中加入许多不期望的分子变化。因此，避免这样的分子变化是一个重要目标，不仅在配制最终药物产品阶段，而且在药物物质制备的早期下游阶段。
药物物质制备过程通常以收集感兴趣的生物分子开始作为第一步骤，例如，来自生产细胞系或者在分泌的生物分子的情况下来自生长培养基。然后将从含有粗生物分子原料药物质的细胞培养物或培养基中收集的生物分子进一步纯化和表征。通常，含有药物物质的溶液在标准缓冲液中经过加工步骤，诸如超速离心或几个色谱步骤。通常优化这些缓冲液以实现令人满意的密度梯度纯化或色谱纯化，但是它们通常不含有为单个生物分子特定选择的任何稳定化赋形剂。由于这些操作，生物分子或药物物质通常在生物药物制备的早期阶段就已经暴露于物理和化学压力。特别地，纯化步骤通常与大的物理和化学压力有关。因此，通常需要尽可能早地引发最大稳定化，优选在收集和/或纯化期间。
可以通过几种潜在的分析方法中的一种(或多种)进行以下表征收集的生物分子的步骤。对于这些分析方法的可操作性而言重要的是，其中存在所收集的生物分子或药物物质的缓冲液不含有可能干扰分析操作并且可能导致对生物分子或药物物质的分子完整性和纯度误解的组分。因此，重要的是避免所有在药物产品制备期间的进一步下游加工步骤不需要的赋形剂，同时在收集、纯化和/或表征期间或之后尽可能早地实现药物物质的最大稳定性。
一旦确认药物物质满足分子完整性和纯度的要求，则将纯化和表征的药物物质分配在赋形剂中，赋形剂旨在在药物物质后续加工步骤(诸如，过滤、填充、冻干、包装、储存和运输)期间维持产品质量和完整性。
通常，药物物质作为冷冻材料储存。冷冻的缺点是在这些冻融操作中可能发生冷变性(Privalov PL.Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.,1990)和蛋白质去折叠效应。虽然大量冻融提供了许多操作和产品质量益处，但是由于预冷冻浓缩(cryo-concentration)机制也证明其可对药物物质稳定性有害。这些机制包括pH变化(Pikal-Cleland KA等人,J.Pharm.Sci.,2002)和赋形剂和生物分子的不受控制的渐进富集，其可导致生物分子结构的改变(Rathore N和Rajan RS.Biotechnol.Prog.,2008:Webb SD et.al,BioPharm,2002；Lashmar UT等人,BioProcess Int,2007；Glaser V.Gen.Eng.Biotechnol.News,2005)。此外，冷冻原料物质必须先进行解冻才能进一步加工。解冻会对药物物质产生额外的压力和损伤，例如在冰-液体界面和在重结晶期间。在许多情况下，在解冻操作中包括另外的混合过程。在这些情况下，必须仔细调整混合参数以避免通过剪切应力、发泡和/或产生气泡导致在液体-空气界面等处的药物物质损伤的进一步生物分子损伤(Rathore N和RajanRS.Biotechnol.Prog.,2008)。
上述对任何特定产品的大量冻融效果对于所用的分别的生物分子是特异的，因此可能影响某些药物物质制剂的产品质量而不影响其它药物物质制剂的产品质量。因此，在进行大规模加工之前，建议评估多重冻融循环对各单独的感兴趣产品的产品质量的影响。这通常在具有标准化参数的规模缩小的实验中进行以模拟大规模过程，并且通常包括进一步的系统选择步骤以鉴定最合适的稳定化赋形剂。
一旦获得药物物质，则将其进一步加工成药物产品。这些后续加工步骤，通常也称为“制剂步骤”，包括例如按需浓缩所选赋形剂、调节pH、以及调节电导率和生物分子浓度(即生物制药产品的富集)(Scott C.,BioProcess Int.,2006)。在开发阶段期间，进一步加工还可包括诸如稀释步骤或缓冲液交换(再缓冲)的步骤。对于缓冲液交换，通常选择进行超滤或渗滤操作以限制生物分子-溶质相互作用并且其已知会导致药物物质的表面上吸附事件和随后的分子完整性丢失(Stoner MR等人,J Pharm.Sci,2004)。因此，当再缓冲或进行缓冲交换(例如采用渗析)时另一个目的应该是减少或避免液体与膜相互作用期间已知的药物物质分子完整性丢失和吸附。
在蛋白质的情况下，另外的加工步骤诸如无菌过滤和药物产品填充经常使药物物质的生物分子经受高剪切应力和表面上吸附，可导致蛋白质去折叠(Maa Y和HsuCC.Biotechnol.Bioeng.,1997)。报道了由于在固-液界面存在下的剪切，治疗性抗体显著水平的蛋白质聚集和沉淀(Biddlecombe等人,Biotechnol.Prog.,2007)。此外，当填充过程不在氮气下进行时，它们可能涉及生物分子的氧化和脱酰胺(Sharma B.,Biotechnol.Adv.,2007)。
为了优化储存并实现可接受的货架期，通常将生物制药药物产品冻干。冻干涉及三个主要步骤，即冷冻、初级干燥和二级干燥：这些步骤的每一个都可导致不稳定性，其可导致生物制药药物产品的生物分子的结构的不可逆变化和/或更高水平的聚集。例如，从生物分子周围去除大量水可以减少通常使生物分子结构保持其正确折叠形式的疏水效应的大小。此外，生物制药药物物质或药物产品中的生物分子吸附到冰/水界面可导致变性(Strambini GB和Gabellieri E.,Biophys.J.,1996)。因此，为了避免对生物制药药物物质或药物产品中的生物分子的显著损伤，选择适当的药物赋形剂和适当的冻干循环参数是重要的。除稳定性问题外，成饼(cake formation)和重构是成功生成药物产品的重要参数(Rathore N和Rajan RS.Biotechnol.Prog.,2008)。
物理压力也可能在随后的处理过程中发生，诸如填充、包装和标签，特别是在没有适当温度控制的情况下进行标签，或者如果样品在标签、储存、运输和向个体递送/给药期间经受机械压力的时候。特别是在储存和运输期间，剪切应力、热应力和有限的光稳定性是严重的物流和经济问题，尤其是对于具有冷链问题的递送场所。因此，高温可使生物分子经受热应力，导致基于蛋白质的生物分子的热去折叠和聚集。此外，光与溶解氧的组合的存在可导致过氧自由基的形成，其可导致肽骨架的光降解(Davies MJ和Dean RT.,OxfordUniversity Press,1997)。在这些处理步骤中可发生的物理压力必须取决于制剂是液体制剂或干燥制剂而被考虑：通常，干燥制剂比液体制剂更稳定。
最后，对于生物制药药物产品在医学(包括人类或动物健康)中的应用，在选择最终生物制药药物产品的组合物时，包括适当的赋形剂的选择，必须考虑预期的给药途径。例如，高浓度治疗性抗体的静脉内、透皮、皮内、皮下或肌内给药需要适当的条件，诸如充分的可灌注性、可注射性、足够的渗透压和低粘度，以便能够容易且无痛地给药。另一方面，当涵盖口服、肺部或鼻内给药时，适用不同的要求。例如，口服给药需要使药物产品通过胃肠道而不被消化分子丧失活性的制剂，而肺部给药需要其在通过上呼吸道和下呼吸道期间是稳定的干燥制剂，并且在溶液时，其通过各自的粘膜。
国际申请WO2005/007185旨在稳定蛋白质药物而不添加常用的稳定剂人血清白蛋白(HSA)。相反，稳定化溶液包含(i)表面活性物质，其优选非离子型洗涤剂，即表面活性剂和(ii)至少两种氨基酸的混合物，其中所述至少两种氨基酸为谷氨酸和谷氨酰胺或天冬氨酸和天冬酰胺。该申请的目的主要在于在储存，特别是在升高温度下长期储存超过六个月期间，稳定低浓度药物化合物。然而，没有描述在加工和制备期间的具体稳定化。
在国际申请WO 2008/000780中，含有蛋白质的喷雾干燥粉末被稳定化，当包括至少30％或至少40％苯丙氨酸时，其被描述为具有有利的空气动力学行为。由于在粉末中加入苯丙氨酸，改变了粉末的内聚和粘合性能以减少颗粒之间的相互作用。通过使粉末颗粒的表面更加疏水，粉末的空气动力学性能得到改善，从而使其更适合于肺部应用。因此，WO2008/000780的目的主要是调整最终的“准备给药”产品，而没有讨论制备期间的一般稳定化和改进的生产操作。
欧洲专利申请EP 1789019描述了用于肺部应用的蛋白质药物的喷雾干燥粉末，其通过添加新型寡糖混合物而稳定化。没有解决在加工期间氨基酸组合的明确保护作用。相反，该申请旨在稳定或优化所述喷雾干燥的粉末，以使它们适合于肺部给药。
国际申请WO 2010/151703公开了用于肽或多肽增加稳定性、减少聚集或减少免疫原性的药物组合物，其包含至少一种烷基糖苷。没有描述包含氨基酸或特定氨基酸组合的组合物用于加工药物组合物。
美国专利申请US 2014/0127227描述了含有至少一种氨基酸的蛋白质制剂以解决甚至高浓度制剂的稳定性和粘度。该申请关注于市售的生物制药产品制剂的稳定性，而没有解决在早期开发阶段和药物物质制备期间赋形剂对生物药物的影响。
国际申请WO 2013/001044描述了基于氨基酸的组合物在干燥和重构期间用于防止去折叠并且能够有效重折叠甚至复杂的生物分子(诸如IgM抗体)的优点。国际申请WO2010/115835描述了含有氨基酸的组合物甚至在辐射和最终灭菌期间用于保护固定在材料表面上的生物分子的优点。同样在WO 2010/112576中，公开了含有氨基酸的组合物在辐射和最终灭菌期间保护生物分子的优点，这里的生物分子在密闭容器中。在国际申请WO2013/001034中，描述了含有氨基酸的组合物在储存和运输期间保护活病毒的优点。最后，在WO 2015/059284中，描述了含有氨基酸的组合物在热应力、喷雾干燥和最终灭菌期间保护市售疫苗(例如，针对流感的疫苗)的优点。然而，在任何这些应用中都没有解决在抗体生产的各加工步骤期间(包括早期加工步骤)和最终配制成药物产品期间的稳定化。
总之，迄今为止可用的大多数稳定化方法集中于生产过程中的一个特定步骤，改进储存条件或优化制剂用于预期给药途径。到目前为止，没有考虑在生物制药药物物质和药物产品制备期间避免早期分子变化，以及在进一步加工期间避免这些早期不稳定性的潜在增加。此外，开发这些方法都没有通过考虑整个制备过程，即目的是在整个大部分或甚至所有生产、下游加工和制剂步骤中提供改善的保护，同时最小化这些步骤所需的不同稳定化组合物的量。因此，仍然需要改进现有的制剂设计以改进生物制药药物物质和药物产品的制备。
通过提供权利要求中表征的实施方案来解决这种需要。
因此，本发明涉及生产包含感兴趣的生物分子的生物制药药物产品的方法，所述方法包括：(a)制备感兴趣的生物分子的药物物质的第一阶段，所述第一阶段包括选自以下的至少一种加工步骤：(a1)收集，(a2)纯化，(a3)再缓冲和(a4)富集，其中该第一阶段中的所述至少一种加工步骤在包含至少三种氨基酸的组合物的存在下进行，其中所述至少三种氨基酸的组合提供至少一个带正电的官能团、至少一个抗氧化官能团、至少一个渗透功能和至少一个缓冲功能；和(b)进一步加工(a)中制备的药物物质以获得生物制药药物产品的第二阶段，所述第二阶段包括选自以下的至少一种加工步骤：(b1)再缓冲，(b2)冷冻，(b3)解冻和(b4)填充；其中该第二阶段中的所述至少一种加工步骤在组合物的存在下进行，所述组合物包含(i)至少三种氨基酸，其中所述至少三种氨基酸的组合提供至少一个带正电的官能团、至少一个抗氧化官能团、至少一个渗透功能和至少一个缓冲功能；和(ii)一种或多种糖；氨基酸:糖的比率为10:1至1:100(w/w)。
如本文所用，术语“生物制药药物产品”是公知的并且涉及制药药物产品，其中所述药物产品基于一种或多种生物分子(本文也称为基于生物分子的制药产品)。所述术语包括任何基于生物分子的制药产品，其在生物来源中制备、从生物来源提取或从生物来源半合成，或合成，例如，化学合成或通过体外系统合成(诸如，体外翻译的蛋白质)等。术语“生物制药产品”也可与术语“生物药物”、“药物产品”、“生物医药产品”、“生物制品”或“生物制剂”互换使用。
生物制药药物产品包含感兴趣的生物分子。如本文所用，术语“生物分子”涉及通常存在于生物体中的任何分子。优选的生物分子是大的高分子，诸如蛋白质、碳水化合物、脂质和核酸，以及小分子，诸如初级代谢产物、次级代谢产物和天然产物。会理解术语“生物分子”不限于一种类型的生物分子，还可以包括一种以上的生物分子，即其也指“一种或多种生物分子”。
本发明的方法涉及这样的生物制药药物产品的生产，其中所述生产包括两个阶段。在第一阶段中，制备感兴趣的生物分子的药物物质。在第二阶段中，进一步加工所述药物物质以获得生物制药药物产品。
术语“药物物质”在本文中可与术语“原料物质”或“原料药物质”互换使用。这些术语在本领域中是公知的并指代表药物使用和当用于药物的制备、加工或包装时成为药物活性成分或成品剂型的任何物质。根据FDA定义，该术语不包括用于合成这样的物质的中间体。
本发明的生产方法的所述第一阶段包括选自以下的至少一种加工步骤：(a1)收集，(a2)纯化，(a3)再缓冲和(a4)富集。
如本文所用，术语“包含”表示除了所述步骤和/或组分外还可包括其它步骤和/或组分。例如，在优选实施方案中，该术语包含在组合物中存在糖，诸如步骤(a)的组合物。然而，该术语还包括所要求保护的主题恰好由所述步骤和/或组分组成。
如本文所用，术语“至少”指具体列举的量或数量，但也指超过具体列举的量或数量。例如，术语“至少一种”还包括至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10，诸如至少20、至少30、至少40、至少50等。此外，该术语还包括恰好1、恰好2、恰好3、恰好4、恰好5、恰好6、恰好7、恰好8、恰好9、恰好10、恰好20、恰好30、恰好40、恰好50等。在所述加工步骤的上下文中，术语“选自……的至少一种加工步骤”包括进行所述加工步骤的一种、两种、三种、四种或五种，也包括进行所有的六种加工步骤。会理解，列出这些加工步骤的顺序没有特别限制，但优选在进行多于一种步骤的那些情况下，所述步骤以所述顺序进行。还会理解的是，某些加工步骤，例如再缓冲，在本发明的方法的所述第一阶段中制备药物物质的过程中可以进行多于一次。
如文本所用，术语“收集”涉及从生产感兴趣的生物分子的来源获得感兴趣的生物分子的加工步骤。大多数市售的治疗性蛋白质，诸如重组人胰岛素、人生长激素、促红细胞生成素(EPO)、凝血因子、单克隆抗体和干扰素，通过例如使用微生物(诸如枯草杆菌(Bacillus subtilis)和大肠杆菌(Escherichia coli)、酵母和其它真菌)或哺乳动物细胞作为来源大规模发酵来生产。哺乳动物细胞培养作为治疗性蛋白质的重要来源的突出实例是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和幼仓鼠肾(BHK)细胞。所述来源可以分泌生物分子到培养基中，或可以在细胞内表达生物分子。在后一种情况下，收集操作通常更复杂，因为还需要破坏细胞以收集蛋白质。此外，还可以从如动物组织、体液和植物来源收集生物分子。
收集过程中采用的典型方法包括离心、过滤和微滤，以及色谱法。这些方法在本领域中是公知的。
如本文所用，术语“纯化”涉及用于分离感兴趣的生物分子的技术。纯化通常在生物药物制备的早期阶段进行以回收高纯的药物物质用于进一步加工，即除感兴趣的生物分子外没有或基本上没有任何其它物质的产物。通常为了纯化生物分子而进行的方法和步骤可包括，例如浓缩生物分子和/或澄清以除去外来(宿主细胞)蛋白质，例如通过离心、沉淀、过滤/超速离心或色谱法(诸如离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱和分子排阻色谱)；以及进一步精制步骤，例如，除去降解产物，产物衍生物诸如产物的氧化形式、脱酰胺形式或降解形式，和污染物诸如热源物质，例如通过分子排阻色谱。
如本文所用，术语“再缓冲”涉及改变现有制剂以获得药物物质或最终药物产品的适合的或优化的环境的方法。进行再缓冲的一种可能方式是通过添加例如水或缓冲液来稀释现有制剂。或者，现有制剂可以通过添加特定赋形剂(如下文所述的赋形剂)来改变。进行再缓冲的特别优选的方法是通过透析。透析是本领域公知的方法，其中半透性透析膜用于使小分子溶质扩散穿过膜，由此交换液体组分，生物分子保留于透析盒中，其取决于分子量和透析膜所应用的截留分子量。
如本文所用，术语“富集”涉及相应分子(例如生物分子、药物物质或生物制药药物物质或药物产品，取决于制备阶段)的浓度的增加。优选地，将浓度增加至对应于使用相应的富集的产物的最终浓度和剂量的水平。
本发明的生产方法的第一阶段在特定组合物(即包含至少三种氨基酸的组合物)的存在下进行，其中所述至少三种氨基酸的组合提供至少一个带正电的官能团、至少一个抗氧化官能团、至少一个渗透功能和至少一个缓冲功能。该组合物在本文中也称为“第一阶段组合物”或“早期阶段组合物”。
所述组合物的特征在于存在至少三种氨基酸。选择这三种氨基酸使得它们提供所述的四种官能团。会理解术语“至少三种氨基酸”指三种不同的氨基酸。
如本文所用，术语“氨基酸”是本领域公知的。氨基酸是蛋白质的基本结构单元。根据本发明，术语“氨基酸”指游离氨基酸，它们彼此不结合形成寡聚体或聚合物，诸如二肽、三肽、寡肽或蛋白质(本文也称为多肽)。它们可分类为具有以下的赋形剂的特征组：非极性，脂肪族；极性，不带电；带正电和/或负电和/或芳香族R基团(Nelson D.L.&Cox M.M.,"Lehninger Biochemie"(2005),pp.122-127)。
根据本发明的氨基酸可选自天然存在的氨基酸以及人工氨基酸或这些天然存在或人工氨基酸的衍生物。天然存在的氨基酸是例如20种蛋白质氨基酸，甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苏氨酸和色氨酸。其它天然存在的氨基酸是例如，肉碱、肌酸、肌酐、胍乙酸、鸟氨酸、羟脯氨酸、高半胱氨酸、瓜氨酸、羟赖氨酸或β-丙氨酸。人工氨基酸是具有不同侧链长度和/或侧链结构和/或在不同于α-C-原子的位置具有胺基的氨基酸。氨基酸的衍生物包括但不限于，N-乙酰基-色氨酸、膦酰丝氨酸、膦酰苏氨酸、膦酰酪氨酸、黑色素、精氨基琥珀酸以及其盐和DOPA。有关于本发明，所有术语还包括分别的氨基酸的盐。
提供带正电的官能团的氨基酸(即通过其相应侧链)是本领域公知的，包括，例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸和非蛋白质氨基酸，例如鸟氨酸。
如本文所用，术语“提供渗透功能的氨基酸”涉及具有提供渗透性质的氨基酸。这样的氨基酸也是本领域公知的，包括，例如甘氨酸、丙氨酸和谷氨酸，以及分别地蛋白质氨基酸和非蛋白质氨基酸的衍生物，例如甜菜碱、肉碱、肌酸、肌酐和β-丙氨酸。
如本文所用，术语“提供抗氧化官能团的氨基酸”涉及通过其侧链(之一)提供抗氧化性质的氨基酸。这样的氨基酸也是本领域公知的，包括，例如甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸，以及蛋白质氨基酸和非蛋白质氨基酸的衍生物，例如N-乙酰基-色氨酸、N-乙酰基-组氨酸或肌肽。
术语“提供缓冲功能的氨基酸”涉及通过其一个或多个官能团提供缓冲能力的氨基酸。这样的氨基酸也是本领域公知的，包括，例如甘氨酸、精氨酸和组氨酸。
会理解，一种氨基酸也可能组合几种所述官能团和/或功能，例如，分别组合两个、三个或甚至全部四个官能团和功能。本文还涵盖氨基酸可以重叠提供这样的官能团和/或功能，即提供抗氧化官能团的氨基酸也可提供缓冲功能，例如，组氨酸。
在某些实施方案中，即当组合物由恰好三种氨基酸组成时，要求所有四个官能团和功能分别由所述三种氨基酸提供。换句话说，至少一种氨基酸分别提供两个(或更多个)官能团和功能。例如，甘氨酸提供渗透功能以及缓冲功能，而组氨酸提供抗氧化官能团以及缓冲功能。
在优选的实施方案中，该第一阶段组合物仅由氨基酸组成，即它除含有氨基酸、表面活性剂、稳定化蛋白质或肽之外不含任何其它赋形剂，诸如糖(包括糖醇)、螯合剂和抗氧化剂。甚至更优选地，第一阶段组合物由恰好三种氨基酸组成，其分别提供四个所述官能团和功能。
在可选地优选实施方案中，该第一阶段组合物包含至少一种糖。在更优选的实施方案中，第一阶段组合物由如上所述的氨基酸和至少一种糖组成。
包含在根据本发明的第一阶段组合物中的至少三种氨基酸的优选量为5mg/ml至100mg/ml，更优选10mg/ml至75mg/ml，甚至更优选15mg/ml至50mg/ml和最优选量为约20mg/ml。会理解，这些优选的量指溶液中存在的所有氨基酸的总和。
如本文所用，术语“约”包含明确列举的值以及由此的小偏差。换句话说，“约20mg/ml”的氨基酸的量包括但不必恰好是所述的20mg/ml的量，但可以相差几mg/ml，因此包括例如21mg/ml或19mg/ml。
本领域技术人员知道，这样的值是不需要完全精确的相对值，只要该值大致对应于所列举的值即可。因此，术语“约”包含与所述值的偏差，例如15％，更优选10％和最优选5％。这些偏差为15％，更优选10％和最优选5％适用于其中使用术语“约”的本发明的所有实施方案。
本发明的方法要求第一阶段中所述的加工步骤在该第一阶段组合物“存在下”进行。换句话说，使原料药物质与第一阶段组合物接触。例如，若将感兴趣的生物分子直接收集到第一阶段组合物中可实现；其通过用第一阶段组合物交换现有溶剂；或通过将至少三种氨基酸添加到现有溶剂中，例如在抗体的情况下在第一纯化柱期间或在病毒载体的情况下在超速离心期间。
然后将在该第一阶段中获得的药物物质进一步进行第二阶段的进一步加工步骤，以将药物物质配制成生物制药药物产品。在该第二阶段中，进行选自以下的至少一种加工步骤：(b1)再缓冲，(b2)冷冻，(b3)解冻和(b4)填充。
除非另有定义，否则上文关于第一阶段提供的定义和优选实施方案加以必要的改变后适用。例如，术语“包含”，“至少”，“再缓冲”，“透析”，“氨基酸”，“在……存在下”等如上所定义。
如本文所用，术语“冷冻”涉及将样品转化至固体冷冻状态的过程。通常采用冷冻来制备用于储存的样品，因为例如污染的风险在这种状态下减少。
如本文所用，术语“解冻”涉及将样品从固体冷冻状态转化至非冷冻状态的过程。在大多数情况下，解冻的样品会以液相存在，但在干燥产品冷冻的那些情况下，解冻的产品会返回为干燥的非冷冻状态，随后可以将其重构用于进一步加工。一旦解冻，该产品可用于进一步的开发或制备过程，例如填充。
如本文所用，术语“填充”涉及将液体或干燥产品转移至(a)特别容器中的过程，用于进一步加工或作为最终产品用于运输、储存和/或给药。
本发明的生产方法的第二阶段也在特定组合物的存在下进行，在这种情况下组合物包含至少三种氨基酸和一种或多种糖。该组合物在本文中也称为“第二阶段组合物”。
所述组合物的特征在于存在至少三种氨基酸，其中必需存在的官能团和功能如第一阶段组合物所定义。然而，氨基酸的实际选择不限于与第一阶段组合物中是相同的氨基酸；相反，一些或所有氨基酸可与第一阶段组合物的氨基酸不同。本文也包含第二阶段组合物的至少三种氨基酸与第一阶段组合物的至少三种氨基酸是相同的。
此外，第二阶段组合物中存在一种或多种糖。
如本文所用，术语“糖”指任何类型的糖，即碳水化合物的单糖、二糖或寡糖形式，以及糖醇或糖衍生物，诸如氨基糖，例如葡糖胺或N-乙酰基葡糖胺。合适的糖的实例包括但不限于海藻糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇。
根据本发明的溶液中包含的糖的优选量为5至200mg/ml，更优选10至100mg/ml，甚至更优选15至80mg/ml，和最优选量为约30mg/ml。当使用不同类型的糖混合物时，这些优选量指溶液中所有糖的总和。
根据本发明，第二阶段组合物中存在的所述氨基酸和糖之间的比率为10:1至1:100。该比率指氨基酸和糖的浓度，其通常以mg/ml表示。优选地，比率为5:1至1:50，更优选为2.5:1至1:25，和最优选为1:1至1:2。
根据本发明，开发用于生产生物制药药物产品的改进方法。开发该方法的重点是在整个生产过程中提供简单但有效的保护，同时减少在支持组合物(supportingcomposition)中对重复、步骤依赖性变化的需求。为此，在该方法的早期阶段使用简单的氨基酸组合物。令人惊讶的是，发现该氨基酸组合物足以在收集后和初始纯化步骤期间立即稳定药物物质。此外，发现在这些早期阶段就已经稳定药物物质导致在整个制备过程、储存和给药中改善的产品质量和稳定性。
该方法提供另外的优点，在该药物物质生产期间该方法早期阶段中稳定化组合物仅需要存在少数量的氨基酸，即三种氨基酸(或任选地更多种)，其在药物物质开发期间不干扰期间通常需要的分析操作。
这些发现特别令人惊讶，因为之前的工作，例如WO 2013/001044、WO 2010/115835、WO 2010/112576、WO 2013/001034或WO 2015/059284已经证明氨基酸的各种组合(有或没有进一步的稳定化赋形剂)在不同压力条件下对特定生物分子的三维结构提供保护效果。这些压力条件例如是在高温储存期间以及生物分子灭菌期间生物分子的干燥和/或重构。然而，尽管这些组合物在这些压力条件下是有效的，但本文令人惊讶地发现，当在药物物质制备的早期阶段(例如直接通过从细胞培养系统中收集以及例如在第一次超速离心步骤后)就使用时，并非所有这些组合物都提供与根据本发明的“早期阶段组合物”相同的优异效果。
如下面实施例2中所示，早期添加“早期阶段”的稳定化组合物可以在其整个制备操作中对生物制药药物产品的稳定性具有强烈影响。因此，发现早期应用根据本发明的稳定化组合物在整个生产过程中对特定生物分子具有显著的稳定作用。
这些发现在例如实施例3至5和实施例7中进一步证实，其显示根据本发明的几种组合物对生产过程期间的加工步骤中(诸如使用透析再缓冲或浓缩最终治疗性抗体制剂)通常涉及的压力暴露的稳定功效。与原始供应商制剂中类似制备步骤相比，发现低浓度的治疗性抗体制剂(实施例3和4)以及高浓度的治疗性抗体制剂(实施例5)当在根据本发明的各种组合物中制备时显示减少的聚集体形成。
此外，如实施例7中所示，将市售液体曲妥珠单抗制剂的浓度增加至200mg/ml的浓度以制备高浓度的液体治疗性抗体制剂，其导致不希望的聚集体形成增加。相反，在根据本发明的组合物中的另外再缓冲步骤之后浓缩该治疗性抗体足以避免这种聚集体形成增加。在实施例8、9和10中所示的进一步数据证实在生物药物制备和加工步骤中根据本发明的组合物的稳定功效。实施例表明，当单克隆抗体曲妥珠单抗在再缓冲和随后的浓缩步骤和搅拌(作为机械压力的模型)期间受到应力时，根据本发明的组合物优于原始供应商液体制剂。
作为在药物物质的不同生产步骤期间的再缓冲、透析和浓缩的模型的上述实施例显示，在该早期阶段本发明的组合物的稳定功效并不特别取决于氨基酸和糖之间的浓度比。令人惊讶的是，在后面的下游加工阶段，例如在液体储存期间(在升高温度下液体储存(参见例如实施例3至7))，氨基酸与糖(或糖混合物)的浓度比和/或氨基酸与药物物质的浓度比引起强烈的药物产品稳定功效，以及对粘度的功效，特别是在高浓度的抗体制剂的情况下(参见例如实施例5和7)。
在所述方法的早期阶段，稳定化氨基酸组合物的简单性具有进一步的优点，其在进一步的加工步骤中可以被容易地调节至药物物质的要求以获得相应的药物产品。通过例如添加其它赋形剂(诸如糖和/或糖混合物)的方法改进初始简单的稳定化制剂，能通过避免或限制另外的再缓冲步骤容易地调整到最终制剂。因此，在整个生产和制剂过程中需要较少处理和较少的压力加工步骤；从而减少施加的压力并增加生物制药药物产品的稳定性，同时减少与生物制药药物物质和药物产品制备有关的工作和成本。
此外，在所要求保护的生产过程中使用本文所述的组合物导致最终生物制药药物产品的渗透压低于450mOsmol/kg。一些研究者报道了高渗透压与注射部位的疼痛和副作用有关。因此，通常认为肠胃外施用的溶液的渗透压应低于450mOsmol/kg，优选接近275至320mOsmol/kg的生理范围。通过本发明的方法获得的药物产品满足了向人和动物给药的制药药物产品的这种要求。
总之，本发明人令人惊讶地发现，使用基于非常简单的氨基酸组合物的本发明的早期阶段组合物，为生物制药药物物质和药物产品制备中所需的后续加工步骤提供理想的起点。使用该早期阶段组合物作为基础，模块化和开发阶段特定的制剂方法是可能的，其仅需要对组合物进行最小的调整同时实现良好平衡的稳定作用。这样的平衡的制剂可以根据后续步骤的具体要求特别定制，诸如特定生物制药药物产品的不同储存和/或给药目的。
根据本文提供的本发明方法的所有实施方案，在根据本发明方法的药物物质生产的早期阶段期间使用的优选组合物包含选自精氨酸、甘氨酸、色氨酸和组氨酸的任三种氨基酸，或所述四种氨基酸的组合。此外，根据本文提供的本发明方法的所有实施方案，优选的后期阶段组合物包含选自精氨酸、甘氨酸、色氨酸和组氨酸的任三种氨基酸，或所述四种氨基酸的组合，但氨基酸与糖或糖混合物(诸如海藻糖和蔗糖)组合。任选地，可加入螯合剂和/或抗氧化剂。用于生产的后期阶段更优选的组合物另外包含螯合剂EDTA和/或抗氧化剂抗坏血酸。
在本发明方法的优选实施方案中，进一步加工(b)中获得的生物制药药物产品以作为液体制剂用于储存和/或给药。
根据本发明，“储存”指将不立即用于后续加工步骤或向个体给药的药物物质或药物产品保持在规定的条件下。因此，如本文所用，术语“储存”不受特别限制，包括例如在使用前将药物物质或药物产品储存在制备场所、研究实验室、医学研究所或实践地，运输/装运药物物质或药物产品，也包含准备步骤，例如等分生物制药产品。
储存条件取决于药物物质或药物产品的类型，以及如果产品用于给药时的预期给药途径。例如，应该考虑和控制药物产品的无菌性和稳定性。许多药物物质必须分别保持冷和/或在黑暗中以防止温度或紫外线介导的降解过程。另外，作为液体制剂给药的药物产品优选保持为液体直至使用，以避免在应用前必须进行另外的重构步骤。
可以通过任何合适的加工步骤加工生物制药药物产品以进行储存和/或给药。这样的加工步骤的非限制性实例包括，例如，无菌填充，即将制剂转移至预先制备的无菌容器中填充，使得生物制药药物产品适合于之后的给药操作。
在液体制剂的情况下，生物制药药物产品的浓度，例如，经填充，优选选择使其对应于给药所需的最终浓度。此外，特别优选选择稳定产品的制剂，从而避免或最小化在填充、储存和给药期间分子完整性和功能的丢失。
在干燥制剂的情况下，用于储存和/或给药的加工涉及必须调整药物产品的浓度，使得在之后用少量重构物(例如，注射用水；WFI)重构时，通过简单操作(优选不通过任何另外的加工步骤再缓冲和/或调整浓度)实现最终剂量。
在生物制药药物产品作为冷冻产品存在的情况下，所述冷冻产品在填充之前必须解冻。所得液体必须部分等分成最终剂量。在该阶段必须考虑冷冻和解冻可导致分子完整性和功能性的丢失，从而可能必须相应地调整最终剂量。
根据本发明方法的该优选实施方案，将生物制药药物产品加工成液体制剂。所述液体制剂可以在任何合适的小瓶或容器或载体中储存和/或供于给药，诸如，实验管或冷冻管、注射器、微针、分配器、透皮贴剂等。
通常，生物制药药物产品的储存在规定条件下进行。这样的规定的条件包括例如特定温度曲线、湿度和其它储存条件，例如由美国食品和药品管理局(FDA)的“良好储存实践”指南和人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)指南中规定的。然而，在生物制药药物产品的运输/装运期间以及在给药期间可出现问题，其可能不总是有可能观察这样的严格的条件。例如，冷链在运输中会中断，特别是在第三世界国家，样品可能会暴露在光线下，或由于搅动而可能暴露于机械压力下。这对于液体制剂尤其重要，其由于这样的不利条件比干燥制剂更容易损伤。
生物制药药物产品在储存期间的稳定性部分取决于对上述储存条件的观察，但也受适当的稳定化赋形剂的存在以及生物制药药物产品本身的性质和浓度的影响。因此，提供合适的液体制剂的生物制药药物产品可以保护生物制药药物产品免受不利条件的影响，从而增强其稳定性。
因此，在本发明方法的优选实施方案中，液体制剂用于以0.001至<100mg/ml的浓度储存和/或给药生物制药药物产品，且其中制剂的特征在于其包含(i)至少三种氨基酸，其中所述至少三种氨基酸的组合提供至少一个带正电的官能团、至少一个抗氧化官能团、至少一个渗透功能和至少一个缓冲功能；和(ii)一种或多种糖；其中氨基酸和糖之间的比率调整为4:1至1:2(w/w)。
该优选实施方案涉及以低浓度的液体形式储存生物制药药物产品。如上文所定义，这样的低浓度是生物制药药物产品的浓度低于100mg/ml。
为了给这样的低浓度液体制剂提供改善的稳定性，调整制剂使其包含至少三种氨基酸和一种或多种糖。“至少三种氨基酸”和“糖”的定义和优选实施方案如上文关于本发明方法所提供。然而，氨基酸的实际选择不限于与上文定义的第一和/或第二阶段组合物中的氨基酸相同；相反，一些或所有氨基酸可不同于第一和/或第二阶段组合物的氨基酸。本文还包括的是该优选实施方案的至少三种氨基酸与第一和/或第二阶段组合物的至少三种氨基酸相同。这对于糖同样适用。
重要的是，将氨基酸和糖之间的比率调整至4:1至1:2(w/w)。在本领域公知如何进行这样的调整。优选地，通过调整氨基酸和糖之间的重量与重量比来进行调整。基于知道的已经存在于溶液中的赋形剂的量以及其已知分子量，可以计算需要添加多少另外的赋形剂以获得稀释中使用的所述比率。
如下面对应于低浓度治疗性抗体制剂的实施例3和4中所示，令人惊讶地发现将通过本发明方法获得的药物物质与所述至少三种氨基酸和糖以氨基酸与糖的比率为4:1至1:2(w/w)来组合，在升高温度下的早期生产过程和随后的液体储存期间，就聚集和片段化而言提供了优异的结果。该稳定化组合物也已在实施例2中显示防止在生产过程的早期加工步骤期间以及在生产过程的各个阶段期间模拟冷冻和解冻事件的多次冷冻和解冻循环之后功能丢失和分子完整性丢失。由于在这些加工步骤期间通过基于氨基酸的制剂与糖的组合避免产物丢失，可以避免另外的再缓冲和透析步骤。
在本发明方法的可选地优选实施方案中，液体制剂用于以100至500mg/ml的高浓度储存和/或给药生物制药药物产品，且其中制剂的特征在于其包含以下赋形剂：(i)至少三种氨基酸，其中所述至少三种氨基酸的组合提供至少一个带正电的官能团、至少一个抗氧化官能团、至少一个渗透功能和至少一个缓冲功能，和(ii)一种或多种糖；其中氨基酸和糖之间的比率调整为4:1至1:1(w/w)。
该可选地优选实施方案涉及以高浓度的液体形式储存生物制药药物产品。如上文所定义，这样的高浓度是生物制药药物产品的浓度为100至500mg/ml。
为了给这样的高浓度液体制剂提供改善的稳定性，调整制剂使其包含至少三种氨基酸和一种或多种糖。“至少三种氨基酸”和“糖”的定义和优选实施方案如上文关于本发明方法所提供。
同样，氨基酸的实际选择不限于与上文定义的组合物中的氨基酸相同；相反，一些或所有氨基酸可不同于上文定义的组合物的氨基酸。本文还包括的是该优选实施方案的至少三种氨基酸与上述定义的组合物之一的至少三种氨基酸相同。这对于糖同样适用。
重要的是，将氨基酸和糖之间的比率调整至4:1至1:1(w/w)，包括例如3:1和2:1(w/w)。更优选地，比率为1:1(w/w)。如上所讨论，用于调整比率的方法在本领域是已知的。优选地，通过调整氨基酸和糖之间的重量与重量比来进行调整。基于知道的已经存在于溶液中的赋形剂的量以及其已知分子量，可以计算需要添加多少另外的赋形剂以获得稀释中使用的所述比率。
根据本发明方法的该优选实施方案还涵盖，在液体制剂中可包含另外的赋形剂。这样的另外的赋形剂优选选自螯合剂、另外的抗氧化剂和表面活性剂。
如本文所用，术语“螯合剂”涉及将金属离子捕获在制剂中的赋形剂，以避免，例如在制剂中金属离子催化的氧化反应。螯合剂的非限制性实例包括得斯芬(desferal)、二乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸(EDTA)或去铁胺(DFO)。这样的螯合剂通常用于螯合疗法，通过将有毒金属剂诸如汞[Hg]、砷[As]和铅[Pb]转化为化学惰性形式来解毒，其可以被排泄而不进一步与身体相互作用。会理解，螯合剂根据本发明以低浓度使用，例如，0.3至0.5mg/ml，不会引起治疗效果，而是在例如储存期间稳定生物制药产品。
如本文所用，术语“另外的抗氧化剂”涉及但不限于甲硫氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、色氨酸、组氨酸、抗坏血酸和在此列出的剂的任何衍生物。
如本文所用，术语“表面活性剂”涉及表面-活性剂。该术语还包括润湿剂、乳化剂和助悬剂，其取决于它们的性质和用途。表面-活性剂是在低浓度下吸附到系统表面或界面上并改变表面或界面自由能和表面或界面张力的物质。因为它们可溶于有机溶剂和水两者，所以它们被称为“两亲的”。根据本发明的优选表面活性剂包括但不限于聚山梨酯20(吐温20)和聚山梨酯80(吐温80)。
如下面的实施例5至7中所示，令人惊讶地发现，与原始供应商制剂相比，将生物制药药物产品(例如通过本发明方法获得的高浓度的治疗性抗体制剂)与所述至少三种氨基酸和糖以氨基酸与糖的比率为4:1至1:1(w/w)来组合，在该治疗性抗体加工期间，特别是在通过透析和/或浓缩的再缓冲期间，导致较少聚集。此外，该制剂在随后升高温度下液体储存期间减少聚集和片段化。实施例8和9进一步证实这一发现。例如，当与美国专利US 9,364,542 B2中概述的优选制剂相比以及与原始液体供应相比时，我们突出根据本发明的我们的制剂的更好的稳定功效。
此外，储存期间液体储存时间动力学的定量统计分析表明，由根据本发明的组合物的稳定作用是统计学上显著的。
最重要的是，在实施例5和7中令人惊讶地发现这样的高浓度的生物制药产品的液体制剂具有特别低的粘度，这对于例如最终产品给药的可注射性是非常重要的因素。特别地，实施例5显示对应于本发明的高浓度的治疗性抗体制剂，含有浓度为120mg/ml的相应抗体，与原始供应商制剂中测量的粘度(约5mPa*s)相比，其粘度显著小于4mPa*s。此外，在实施例7中，对应于本发明的高浓度的治疗性抗体制剂，含有浓度为200和220mg/ml的抗体，其显示粘度显著小于20mPa*s。总之，在所有实施方案中，发现粘度低于原始供应商制剂中的粘度，因此这些值低于相应的现有技术制剂。
因此，在以高浓度的液体形式储存生物制药药物产品的该实施方案的特别优选的实施方案中，高浓度的生物制药药物产品的粘度低于20mPa*s；当高浓度的生物制药药物产品的浓度为100mg/ml至120mg/ml时，粘度<4；当高浓度的生物制药药物产品的浓度为120mg/ml至150mg/ml时，粘度<8mPa*s；当高浓度的生物制药药物产品的浓度为150mg/ml至220mg/ml时，粘度<20mPa*s。
在本发明方法的更优选的实施方案中，进一步调整液体制剂使得感兴趣的生物分子与(i)的至少三种氨基酸之间的比率为3.5:1至1:2(w/w)。比率的调整优选以重量与重量比进行。上文关于调整感兴趣的生物分子和糖之间的比率所提供的详细描述加以必要的改变后适用于该实施方案，其关于另外调整感兴趣的生物分子与至少三种氨基酸之间的比率。
在本发明方法的优选实施方案中，高浓度的药物物质的液体制剂不包含脯氨酸。实施例8证实根据本发明的稳定功效优于根据美国专利US 9,364,542 B2的含有脯氨酸的制剂。通过CEX-HPLC方法分析的有限的化学降解证实了这一点。在优选的实施方案中，氨基酸和糖之间的比率为10:1至1:100。此外，生物分子和赋形剂之间的优选比率为1:1至1:500。这些比率在其它实施方案中也是优选的。
在本发明方法的另一优选实施方案中，所述方法还包括(c)干燥(b)中获得的生物制药药物物质以获得干燥的生物制药药物产品的第三步骤，其中在该第三阶段中的所述干燥步骤在组合物存在下进行，所述组合物包含(i)至少三种氨基酸，其中所述至少三种氨基酸的组合提供至少一个带正电的官能团、至少一个抗氧化官能团、至少一个渗透功能和至少一个缓冲功能；和(ii)一种或多种糖；且其中感兴趣的生物分子和总赋形剂之间的比率调整为1:1至1:10(w/w)。
根据该优选的实施方案，通过本发明方法获得的生物制药药物产品还进行另外的干燥步骤以获得干燥的生物制药药物产品。如果液体含量被除去或减少至小于体积的20％，例如小于体积的10％、例如小于体积的5％、更优选小于体积的3％、如小于2％或小于1％，则认为生物制药药物产品是干燥的。最优选地，液体减少至0.5％或更少。合适的干燥方法包括但不限于冻干法(冷冻干燥)、喷雾干燥、冷冻-喷雾干燥、对流干燥、传导干燥、气流干燥、鼓式干燥、真空干燥、介电干燥(例如通过射频或微波)、表面干燥、空气干燥或泡沫干燥。
根据本发明方法的实施方案，所述干燥步骤在组合物存在下进行，所述组合物包含(i)至少三种氨基酸和(ii)一种或多种糖。同样，“至少三种氨基酸”和“糖”的定义和优选实施方案如上文关于本发明方法所提供。同样，氨基酸的实际选择不限于与上文定义的组合物中的氨基酸相同；相反，一些或所有氨基酸可与上文定义的组合物的氨基酸不同。本文还包括的是该优选实施方案的至少三种氨基酸与上文定义的组合物的至少三种氨基酸相同。这对于糖同样适用。
重要的是，感兴趣的生物分子和总赋形剂之间的比率调整为1:1至1:10(w/w)，还包括例如比率为1:2、1:5、1:8(w/w)等之间。最优选地，比率为1:2(w/w)。如上所讨论，用于调整比率的方法在本领域中是已知的。同样关于该优选实施方案，优选通过调整感兴趣的生物分子和总赋形剂之间的重量与重量比来进行调整。基于知道的已经存在于溶液中的赋形剂的量以及其已知分子量，可以计算需要添加多少另外的赋形剂以获得稀释中使用的所述比率。
根据本发明方法的该优选实施方案还涵盖，在用于干燥步骤的组合物中可包含另外的赋形剂。这样的另外的赋形剂优选选自螯合剂、另外的抗氧化剂和表面活性剂。上文提供的所述另外的赋形剂的定义和优选实施方案加以必要的改变后适用。
如下面实施例1中所示，令人惊讶地发现，将通过本发明方法获得的生物制药药物物质与所述至少三种氨基酸和糖以感兴趣的生物分子与总赋形剂的比率为1:1至1:10(w/w)组合，为干燥的感兴趣的生物分子提供优异的稳定性。在实施例1中，已经在早期阶段下游步骤和随后冷冻干燥期间腺病毒载体制剂与根据本发明的组合物的组合导致病毒颗粒的感染滴度和流体动力学半径的完全保留。相反，冷冻干燥原始供应商制剂中相应的腺病毒载体制剂导致感染性显著丢失和粒径的增加。与常见的磷酸盐缓冲盐水(PBS)组合的类似操作在冷冻干燥后已经导致感染性的完全丢失和粒径的大大增加。最重要的是，这样的生物制药药物物质或药物产品的干燥制剂适用于各种进一步操作步骤，如等分、分配、装运、储存等。
在本发明方法的甚至更优选的实施方案中，(b)中获得的生物制药药物产品的干燥是通过冷冻干燥、喷雾干燥或喷雾-冷冻干燥。
冷冻干燥，也称为冻干法，是本领域公知的，包括以下步骤：冷冻样品并随后降低周围压力同时添加足够的热量以使材料中的冷冻水直接从固相升华至气相，接着是二次干燥阶段。优选地，然后将冻干制剂密封以防止再吸收水分。
喷雾干燥在本领域中也是公知的，是在一个单一处理步骤中将溶液、悬浮液或乳液转化成固体粉末的方法。通常，将液体产品的浓缩物泵送到雾化装置，在其中被破碎成小液滴。这些液滴暴露在热空气流中并且在仍悬浮在干燥空气中的同时非常快速地失去其水分。通过离心作用将干粉与旋风分离器中的潮湿空气分离，即稠密的粉末颗粒被迫朝向旋风壁，而较轻的潮湿空气被引导通过排气管。
喷雾干燥通常是选择的方法，因为它与冻干法相比避免了冷冻步骤并且需要更低的能量成本。由于与高温的短接触时间及其特殊的过程控制，喷雾干燥也被证明是特别有利的适用于生物分子的干燥操作。因此，因为喷雾干燥仅在一步中产生可分散的干粉，所以当涉及生物分子的干燥技术时，相比冷冻干燥通常更偏好喷雾干燥。
喷雾-冷冻干燥在本领域中也是公知的，是结合冷冻干燥和喷雾干燥常用的加工步骤的方法。将提供的样品喷雾到低温介质(例如液氮)中，其产生骤冷(shock-frozen)液滴的分散体。然后将该分散体在冷冻干燥器中干燥。
在本发明方法的另一优选实施方案中，将步骤(c)中获得的干燥的生物制药药物产品灭菌，优选最终灭菌。
如本文所用，术语“最终灭菌”涉及将步骤(c)获得的产物进行灭菌的过程，其中所述灭菌过程是在用于其预期用途的制备(如重构以能够例如给药至个体，如下文所讨论)之前处理该样品的最后(即最终)过程。
灭菌生物制药产品的手段和方法在本领域中是公知的。例如，干燥的样品可以置于或引入容器或小瓶中，然后将容器或小瓶封闭并持续暴露于灭菌条件下以足以基本上灭活病原体，尤其是细菌和病毒。灭菌条件的非限制性实例包括照射如β、X射线或γ照射、环氧乙烷处理、热灭活、高压蒸汽灭菌和等离子体灭菌。
优选地，通过照射或环氧乙烷处理进行灭菌。
在本发明方法的另一优选实施方案中，所述方法还包括重构步骤(c)中获得的干燥的生物制药药物产品以获得液体制剂的步骤，其特征在于在组合物中将干燥的生物制药药物产品重构以获得液体生物制药药物产品，所述组合物包含(i)至少三种氨基酸，其中所述至少三种氨基酸的组合提供至少一个带正电的官能团、至少一个抗氧化官能团、至少一个渗透功能和至少一个缓冲功能；和(ii)一种或多种糖；氨基酸和糖之间的比率为4:1至1:1(w/w)。
因此，将根据本发明方法的优选实施方案获得的干燥的生物制药药物产品随后重构以获得液体制剂。在产生包含至少三种氨基酸和一种或多种糖的溶液中进行重构。同样，粘度程度、“至少三种氨基酸”和“糖”的定义和优选实施方案如上文关于本发明方法所提供，但氨基酸的实际选择不限于与上文定义的组合物中的氨基酸相同；相反，一些或所有氨基酸可与上文定义的组合物的氨基酸不同。本文还包括该优选实施方案的至少三种氨基酸与上文定义的组合物的至少三种氨基酸相同。这对于糖同样适用。
重要的是，氨基酸和糖之间的比率为4:1至1:1(w/w)，还包括例如3:1或2:1(w/w)之间。最优选地，比率为1:1(w/w)。如上所讨论，用于调整比率的方法在本领域是已知的。同样关于该优选实施方案，优选通过调整氨基酸和糖之间的重量与重量比来进行调整。基于知道的已经存在于溶液中的赋形剂的量以及其已知分子量，可以计算需要添加多少另外的赋形剂以获得稀释中使用的所述比率。
根据本发明方法的该优选实施方案还涵盖，在用于干燥步骤的组合物中可包含另外的赋形剂。这样的另外的赋形剂优选选自螯合剂、另外的抗氧化剂和表面活性剂。上文提供的所述另外的赋形剂的定义和优选实施方案加以必要的改变后适用。这样的另外的赋形剂可以选择与前述步骤之一中使用的另外的赋形剂(如果有的话)相同，但也可以独立地选择，使得它们可能不同。
在本发明方法的优选实施方案中，步骤(a)中的组合物含有0.5mg/ml至10mg/ml的色氨酸和0.5mg/ml至30mg/ml的组氨酸。
如实施例2至7中所示，溶液在色氨酸和组氨酸之间的平衡的重量:重量比中导致药物物质的稳定性增加，并且与糖组合使药物产品的稳定性增加。
在本发明方法的另一优选实施方案中，感兴趣的生物分子选自蛋白质和肽及其混合物。
如本文所用，术语“肽”描述由至多30个氨基酸组成的一组分子，而“蛋白质”由多于30个氨基酸组成。肽和蛋白质可以进一步形成二聚体、三聚体和更高寡聚体，即由多于一个可相同或不同的分子组成。因此，相应的更高级结构称为同二聚体或异二聚体，同三聚体或异三聚体等。术语“肽”和“蛋白质”(其中“蛋白质”可与“多肽”互换使用)也指天然修饰的肽/蛋白质，其中修饰是通过例如糖基化、乙酰化、磷酸化等实现的。这样的修饰在本领域中是公知的。此外，本文还包含这样的肽和蛋白质的肽模拟物，其中氨基酸和/或肽键被功能类似物取代。这样的功能类似物包括除20种基因编码的氨基酸外的所有已知氨基酸，诸如硒代半胱氨酸。合适的蛋白质或肽的特定、优选的实例在下文详述。
蛋白质和肽的优选实例是抗体和激素。
根据本发明的抗体可以是，例如，多克隆抗体或单克隆抗体。如本文所用，术语“抗体”还包括实施方案诸如嵌合抗体(人源恒定结构域，非人源可变结构域)单链抗体和人源化抗体(除非人源CDR之外的人抗体)以及抗体片段，例如，尤其是，Fab、Fab’、Fd、F(ab')2、Fv或scFv片段或纳米抗体，即单个单体可变抗体结构域；参见，例如Harlow和Lane"Antibodies,A Laboratory Manual",Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988以及Harlow和Lane“Using Antibodies:A Laboratory Manual”Cold Spring HarborLaboratory Press,1999。
用于生产抗体的技术在本领域中是公知的，并且已经描述于，例如，Harlow和Lane(1988)和(1999),loc.cit。
优选地，抗体是能够引发治疗效果的抗体。优选抗体的非限制性实例包括英利昔单抗(Infliximab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、雷珠单抗(Ranibizumab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、雷珠单抗(Ranibizumab)、帕利珠单抗(Palivizumab)、阿巴伏单抗(Abagovomab)、阿昔单抗(Abciximab)、阿克托克单抗(Actoxumab)、阿达木单抗(Adalimumab)、阿非莫单抗(Afelimomab)、阿夫土珠(Afutuzumab)、Alacizumab、培化阿珠单抗(Alacizumab pegol)、ALD518、阿仑单抗(Alemtuzumab)、阿力罗克单抗(Alirocumab)、阿仑单抗(Alemtuzumab)、阿妥莫单抗(Altumomab)、阿姆土西单抗(Amatuximab)、麻安莫单抗(Anatumomab mafenatox)、安芦珠单抗(Anrukinzumab)、阿泊珠单抗(Apolizumab)、阿西莫单抗(Arcitumomab)、阿塞珠单抗(Aselizumab)、阿缇努单抗(Altinumab)、阿特立单抗(Atlizumab)、阿托木单抗(Atorolimiumab)、托珠单抗(Tocilizumab)、巴匹珠单抗(Bapineuzumab)、巴利昔单抗(Basiliximab)、巴土昔单抗(Bavituximab)、贝妥莫单抗(Bectumomab)、贝利木单抗(Belimumab)、Benralizumab、柏替莫单抗(Bertilimumab)、贝索单抗(Besilesomab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、贝茨罗特斯单抗(Bezlotoxumab)、比西单抗(Biciromab)、比伐单抗(Bivatuzumab)、莫比伐单抗(Bivatuzumab mertansine)、兰妥莫单抗(Blinatumomab)、布鲁宗津单抗(Blosozumab)、布妥昔单抗(Brentuximab vedotin)、布雷奴单抗(Briakinumab)、布达路单抗(Brodalumab)、卡那单抗(Canakinumab)、莫坎妥珠单抗(Cantuzumab mertansine)、莫坎妥珠单抗(Cantuzumab mertansine)、卡普兰珠单抗(Caplacizumab)、卡罗单抗喷地肽(Capromab pendetide)、卡鲁单抗(Carlumab)、卡妥索单抗(Catumaxomab)、CC49、西利珠单抗(Cedelizumab)、赛妥珠单抗(Certolizumab pegol)、西妥昔单抗(Cetuximab)、泊西他珠单抗(Citatuzumab bogatox)、西妥木单抗(Cixutumumab)、克莱赞珠单抗(Clazakizumab)、克立昔单抗(Clenoliximab)、克莱维足单抗(Clivatuzumab tetraxetan)、可那木单抗(Conatumumab)、克雷内治单抗(Crenezumab)、CR6261、达西珠单抗(Dacetuzumab)、达克珠单抗(Daclizumab)、达罗土珠单抗(Dalotuzumab)、达拉土姆单抗(Daratumumab)、地莫米佐单抗(Demcizumab)、地舒单抗(Denosumab)、地莫单抗(Detumomab)、阿托度单抗(Dorlimomab aritox)、德罗图单抗(Drozitumab)、杜力戈图单抗(Duligotumab)、杜丕璐单抗(Dupilumab)、依美昔单抗(Ecromeximab)、依库珠单抗(Eculizumab)、埃巴单抗(Edobacomab)、依决洛单抗(Edrecolomab)、依法珠单抗(Efalizumab)、依夫单抗(Efungumab)、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)、艾西莫单抗(Elsilimomab)、埃文单抗(Enavatuzumab)、培戈赖莫单抗(Enlimomab pegol)、艾诺克单抗(Enokizumab)、艾诺克单抗(Enokizumab)、艾诺提克单抗(Enoticumab)、艾诺提克单抗(Enoticumab)、埃斯托西单抗(Ensituximab)、西依匹莫单抗(Epitumomab 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如本文所用，术语“激素”在本领域中是公知的，涉及用于治疗代谢紊乱的一组治疗性生物分子。非限制性实例包括特立帕肽或雌激素。特立帕肽是生长激素甲状旁腺激素的重组形式，通常用于治疗骨代谢受损诸如骨质疏松症。雌激素通常用于治疗绝经期紊乱，并与孕酮联合使用以降低子宫癌的风险。
在本发明方法的更优选实施方案中，感兴趣的生物分子是抗原，诸如用作疫苗的抗原。
如本文所用，术语“抗原”指能够在宿主生物体中诱导免疫应答的分子。通常，抗原是蛋白质和多糖。然而，当与蛋白质和多糖组合时，脂质或核酸也可以是抗原性的。抗原通常源自细菌、病毒和其它微生物的部分，例如其包衣、荚膜、细胞壁、鞭毛、菌毛或毒素。抗原也可以是非微生物的，例如自身抗原或外源(非自身)抗原，诸如，花粉，蛋清，或来自移植组织/器官或输血细胞表面的蛋白质。根据本发明，术语“抗原”包括但不限于(i)由一种特定分子类型的抗原代表的抗原，诸如一种特定蛋白质；(ii)不同分子类型抗原的抗原混合物，诸如不同蛋白质的混合物或蛋白质与多糖的混合物；以及(iii)包含其它组分的抗原制剂，例如在裂解病毒抗原中，其是其中的病毒被例如洗涤剂或其它方法破坏而没有进一步去除其它病毒组分的制剂。
优选地，抗原用作疫苗。用于疫苗制备的合适抗原是本领域公知的，并且在本领域中通常应用的选择用于疫苗生产的抗原的考虑因素加以必要的改变后适用于选择用作根据本发明的疫苗的合适的抗原。因此，可以使用本领域已经存在的抗原以及新抗原。
特别优选的抗原实例是亚单位抗原或病毒载体，包括例如病毒样颗粒和活病毒(life viruses)。
“病毒载体”是高分子的复杂超分子集合体，其在制备、储存和分配时易受各种化学和物理降解途径影响。根据本发明，术语“病毒载体”涉及载体，即源自病毒的“载体”。根据本发明的“病毒载体”包括源自天然存在的或修饰的病毒以及病毒样颗粒(VLP)的载体。当病毒是载体开发的起始材料时，需要满足诸如安全性和特异性的某些要求以确保它们适合在动物或人类患者中临床使用。一个重要方面是避免病毒载体的不受控制的复制。这通常通过删除对病毒复制至关重要的病毒基因组的一部分来实现。这样的病毒可以感染靶细胞而不会随后产生新的病毒粒子。此外，病毒载体应该对靶细胞的生理学没有影响或只有极小的影响，并且不应发生病毒载体基因组的重排。源自天然存在的或修饰的病毒的这样的病毒载体是本领域公知的，并且通常使用的病毒载体的非限制性实例包括例如修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒或腺病毒。
源自病毒样颗粒的载体也是本领域公知的，并且已经在例如Tegerstedt等人(Tegerstedt等人(2005),Murine polyomavirus virus-like particles(VLPs)asvectors for gene and immune therapy and vaccines against viral infections andcancer.Anticancer Res.25(4):2601-8.)中描述。VLP的一个主要优点是当活减毒病毒用作病毒载体时它们与任何可能的重组风险无关，因此，它们代表根据本发明的“复制缺陷型病毒载体”。VLP生产具有另外的优点，即一旦感兴趣的特定病毒株的基因序列可获得，它可以比传统疫苗的生产更早开始。
VLP含有病毒表面蛋白的重复高密度展示，其呈递构象病毒表位，可引发强T细胞和B细胞免疫应答。VLP已被用于开发用于乙型肝炎和人乳头瘤病毒的FDA批准疫苗，此外，VLP已被用于开发针对奇昆古尼亚病毒的临床前疫苗。证据还表明针对流感病毒的VLP疫苗在预防流感病毒方面可能优于其它疫苗。在早期临床试验中，用于流感的VLP疫苗似乎提供针对甲型流感病毒亚型H5N1和1918流感的完全预防。
在本发明方法的另一优选实施方案中，进一步调整最终的生物制药制剂用于肌内、皮下、皮内、透皮、口服、经口、经鼻和/或吸入施用。当涵盖口服、肺部或鼻内给药时，适用不同的要求。例如，口服给药需要使药物产品通过胃肠道而不被消化分子丧失活性的制剂，而肺部给药需要其在通过上呼吸道和下呼吸道期间是稳定的干燥制剂，并且在溶液时，其通过相应的粘膜。对于其它给药途径，诸如皮下或肌内注射，必须考虑渗透压、粘度、可注射性和可灌注性。例如，少量赋形剂是优选的以限制渗透压和粘度，以例如减少注射部位的疼痛和不良事件。
如上文所讨论的，在要求保护的生产过程中使用本文所述的组合物导致最终的生物制药药物产品的渗透压低于450mOsmol/kg。一些研究者报道了高渗透压与注射部位的疼痛和副作用有关。因此，通常认为肠胃外施用的溶液的渗透压应低于450mOsmol/kg，优选接近275-320mOsmol/kg的生理范围。通过本发明的方法获得的药物产品满足了用于人和动物给药的制药药物产品的这种要求。
本发明还涉及通过本发明方法获得或可获得的生物制药药物产品。
在本发明的生物制药药物产品的优选实施方案中，所述产品用于肌内、皮下、皮内、透皮、口服、经口、经鼻和/或吸入施用。在本发明的生物制药药物产品的另一优选实施方案中，所述产品用于研究、治疗和/或预防目的。
根据本发明的优选实施方案，药物产品用于疫苗接种。会理解，用于疫苗接种的药物产品可以以其原样使用，即以其本身使用，或与佐剂组合使用，所述佐剂可以与药物产品同时给药或分开给药，即在药物产品给药之前或之后。如本文所用，术语“佐剂”涉及一种或多种增强受体对疫苗的免疫应答的化合物。通常添加佐剂以促进对疫苗的更早、更有效的反应和/或更持久的免疫应答，这通常允许更低的疫苗剂量。佐剂的非限制性实例包括例如，氢氧化铝和磷酸铝，有机化合物角鲨烯，以及化合物诸如Toll样受体的配体、QS21、氢氧化铝衍生物、油浸(oil immersion)、脂质A及其衍生物(例如单磷酰脂质A(MPL))、CpG基序、聚I:C dsRNA、胞壁酰二肽(MDP)、弗氏完全佐剂(FCA，仅用于非人类用途)、弗氏不完全佐剂(FIA，仅用于非人类用途)或MF59C。这些佐剂是本领域公知的。
根据本发明配制的药物产品-疫苗具有优异的热稳定性，因此即使在不能保证冷链的情况下也可以经历长期储存和运输。此外，药物产品-疫苗的较高稳定性可以减少所需佐剂的量，或者甚至可以使佐剂是不必要的。这提供了另外的优点，因为本领域通常认为佐剂对于充分的疫苗接种效果是必须的，但也已知其经常引起严重的副作用。
本发明涉及生产包含感兴趣的生物分子的生物制药药物物质的方法的替代方案，所述方法包括选自以下的至少一种加工步骤：(a1)收集，(a2)纯化，(a3)再缓冲和(a4)富集，其中所述至少一种加工步骤在包含至少三种氨基酸的组合物存在下进行，其中所述至少三种氨基酸的组合提供至少一个带正电的官能团、至少一个抗氧化官能团、至少一个渗透功能和至少一个缓冲功能。
上文关于本发明方法提供的所有定义和优选实施方案加以必要的改变后适用本发明的该替代方法。例如，上述用于组合物中存在的氨基酸的选择和/或量的优选实施方案、优选的生物分子选择等，同样适用于该替代方法。
本发明的步骤特别引人关注，因为在下游加工期间稳定生物分子通常在填充和完成步骤期间解决，而不是在收集后的早期步骤期间解决。
根据本发明的该替代方法，在优选实施方案中该方法包括进一步加工药物物质以获得生物制药药物产品的第二步骤，所述第二步骤包括选自以下的至少一种加工步骤：(b1)再缓冲，(b2)冷冻，(b3)解冻和(b4)填充；其中所述至少一种加工步骤在组合物存在下进行，所述组合物包含(i)至少三种氨基酸，其中所述至少三种氨基酸的组合提供至少一个带正电的官能团、至少一个抗氧化官能团、至少一个渗透功能和至少一个缓冲功能；和(ii)一种或多种糖；氨基酸:糖的比率为10:1至1:100(w/w)。
上文关于本发明方法提供的所有定义和优选实施方案加以必要的改变后适用本发明的该替代方法。例如，上述用于组合物中存在的氨基酸的选择和/或量的优选实施方案、优选的生物分子选择、优选比率等，同样适用于该替代方法。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。如有冲突，以专利说明书(包括定义)为准。
关于在本说明书中表征的实施方案，特别是在权利要求中，其旨在将从属权利要求中提到的各实施方案与所述从属权利要求从属于的各权利要求(独立的或从属的)的各实施方案组合。例如，在独立权利要求1列出3个可选方案A、B和C，从属权利要求2列出3个可选方案D、E和F，权利要求3从属于权利要求1和2并且列出3个可选方案G、H和I的情况下，会理解，本说明书明确地公开了相应的组合的实施方案：A、D、G；A、D、H；A、D、I；A、E、G；A、E、H；A、E、I；A、F、G；A、F、H；A、F、I；B、D、G；B、D、H；B、D、I；B、E、G；B、E、H；B、E、I；B、F、G；B、F、H；B、F、I；C、D、G；C、D、H；C、D、I；C、E、G；C、E、H；C、E、I；C、F、G；C、F、H；C、F、I，除非另有特别说明。
类似地，同样在独立和/或从属权利要求没有列出可选方案的那些情况下，会理解，如果从属权利要求回引多个前述权利要求，则认为由此涵盖的主题的任何组合是被明确公开的。例如，在独立权利要求1的情况下，从属权利要求2回引权利要求1，从属权利要求3回引权利要求2和1两者，其结果是权利要求3和1的主题的组合是被清楚和明确地公开的，如同权利要求3、2和1的主题的组合一样。在存在另外的从属权利要求4的情况下，其引用权利要求1至3中任一项，其结果是权利要求4和1，权利要求4、2和1，权利要求4、3和1以及权利要求4、3、2和1的主题的组合是被清楚和明确公开的。
上述考虑因素加以必要的改变后适用于所有所附权利要求。为了给出非限制性实例，鉴于权利要求结构，权利要求10、6和1的组合是清楚且明确地涵盖的。这同样适用于例如权利要求10、2和1的组合等。
附图显示：
图1：动态光散射(DLS)测定冷冻干燥前腺病毒载体组合物的流体动力学半径，作为药物物质稳定性的评估模型。(A)评估作为对照的腺病毒原液的使用通过DynaPro DLS软件正则化拟合的DLS实验中记录的相关函数，(B)评估通过稀释与组合物1混合后即刻腺病毒载体制剂的相关函数和(C)评估通过稀释与组合物2混合后即刻腺病毒载体制剂的相关函数。计算的组合物1和2中的腺病毒载体制剂的流体动力学半径与未处理原液中的腺病毒颗粒的测量半径一致，并且与文献中已知的值一致。
图2：动态光散射(DLS)测定冷冻干燥前腺病毒载体组合物的流体动力学半径，作为药物物质稳定性的评估模型。(A)评估与原始供应商制剂混合后即刻腺病毒载体制剂的使用通过DynaPro DLS软件正则化拟合的DLS实验中记录的相关函数和(B)评估与PBS混合后即刻腺病毒载体制剂的相关函数。与前图相反，与未处理原液相比，与原始供应商制剂混合和与PBS混合后的腺病毒颗粒的流体动力学半径增加。
图3：在不同制剂中冷冻干燥后腺病毒载体的体外感染性，作为药物物质稳定性的评估模型。腺病毒载体制剂通过稀释配制，并随后在组合物1和2中冷冻-干燥。重构冷冻-干燥的载体后，在HEK 293细胞中进行体外感染性试验，使用腺病毒六邻体蛋白的基于抗体的比色检测以表明感染细胞中腺病毒的成功扩增。观察到在组合物1和2中配制的腺病毒载体制剂的感染滴度完全保留(与阳性对照相比每ml的感染单位；以虚线表示)。相反，在原始供应商制剂中稀释的冷冻干燥的腺病毒载体导致感染滴度的显著丢失，并且在PBS中稀释的冷冻干燥的腺病毒载体导致相应的感染滴度的完全丢失。
图4：动态光散射(DLS)测定冷冻干燥后相应的腺病毒载体制剂中腺病毒颗粒的流体动力学半径，作为药物物质稳定性的评估模型。(A)评估在组合物1中冷冻干燥后的腺病毒载体制剂的使用通过DynaPro DLS软件的正则化拟合的DLS实验中记录的相关函数，(B)评估在组合物2中冷冻干燥后的腺病毒载体制剂。计算的组合物1和2中的腺病毒载体制剂的流体动力学半径与未处理原液中的腺病毒颗粒的测量半径(图1A)一致，并且与文献中已知的值一致。
图5：动态光散射(DLS)测定冷冻干燥后相应的腺病毒载体制剂中腺病毒颗粒的流体动力学半径，作为药物物质稳定性的评估模型。(A)评估在原始供应商制剂中冷冻干燥后即刻腺病毒载体制剂的使用通过DynaPro DLS软件的正则化拟合的DLS实验中记录的相关函数和(B)评估在PBS中冷冻干燥后即刻腺病毒载体制剂的相关函数。与前图相反，与未处理原液(图1A)相比，在原始供应商制剂中和在PBS中冷冻干燥后的腺病毒颗粒的流体动力学半径增加，其与更高级聚集体形成有关。
图6：在不同制剂中冷冻干燥并随后在升高温度下储存干燥制剂后的腺病毒载体的体外感染性，作为药物物质稳定性的评估模型。t＝0d(左侧的黑色柱)显示在储存之前冷冻干燥和重构后即刻的体外感染性。虚线显示未处理的阳性对照的相应感染滴度。(A)通过在组合物1和2中稀释再缓冲并随后在25℃和60％残余湿度下储存冷冻-干燥的制剂21天(中间的一组柱)和42天(右侧的一组柱)后的腺病毒载体组合物的体外感染性，其相比于原始供应商缓冲液和PBS。(B)通过在组合物1和2中稀释再缓冲并随后在40℃和75％残余湿度下储存冷冻-干燥的制剂7天(中间的一组柱)和28天(右侧的一组柱)后的腺病毒载体组合物的体外感染性，其相比于原始供应商缓冲液和PBS。在组合物1和2中制备的样品中观察到腺病毒感染性的完全保留，而在原始供应商缓冲液或PBS中的储存导致腺病毒感染性的完全丢失。
图7：动态光散射(DLS)测定冷冻干燥并随后在40℃下储存14天后的相应腺病毒载体制剂中的腺病毒颗粒的流体动力学半径，作为药物物质稳定性的评估模型。(A)评估干燥的制剂在组合物1中在40℃下储存14天后的腺病毒载体制剂的使用通过DynaPro DLS软件的正则化拟合的DLS实验中记录的相关函数和(B)评估干燥的制剂在组合物2中在40℃下储存14天后的腺病毒载体制剂。计算的组合物1和2中的腺病毒载体制剂的流体动力学半径与未处理原液中的腺病毒颗粒的测量半径(图1A)一致，并且与文献中已知的值一致。
图8：动态光散射(DLS)测定冷冻干燥并随后在40℃下储存14天后的相应腺病毒载体制剂中的腺病毒颗粒的流体动力学半径，作为药物物质稳定性的评估模型。(A)评估冷冻干燥并随后在原始供应商制剂中在40℃下储存14天后的腺病毒载体制剂的使用通过DynaPro DLS软件的正则化拟合的DLS实验中记录的相关函数和(B)评估冷冻干燥并随后在PBS中在40℃下储存14天后的腺病毒载体制剂的相关函数。与前图相反，与未处理原液相比，冷冻干燥并随后在原始供应商制剂中和在PBS中在升高温度下储存后的腺病毒颗粒的流体动力学半径增加，其与更高级聚集体形成有关。
图9：在加工步骤1或加工步骤2期间制备的药物物质稳定化组合物1和2中配制后的腺病毒载体制剂的体外感染性，作为药物物质稳定性的评估模型。分别在通过CsCl密度超速离心(加工步骤1)之后即刻，或者制备过程后期(加工步骤2)中，通过在组合物1和2中透析再缓冲腺病毒制剂。在加工步骤1中，与阳性对照(以虚线描绘)相比，观察到在两种组合物中透析后感染滴度的完全保留。相反，在加工步骤2期间当在组合物2中进行透析时导致感染滴度显著丢失接近两个对数水平，而在组合物1中透析导致感染滴度的完全保留，类似于加工步骤1所得结果。
图10：DLS测定在加工步骤1或加工步骤2期间的稳定化组合物1和2中的相应腺病毒载体药物物质制剂中的腺病毒颗粒的流体动力学半径，作为药物物质稳定性的评估模型。在加工步骤1或2中使用透析再缓冲组合物1中的腺病毒载体颗粒制剂导致颗粒的流体动力学半径的保留，(A)和(C)。在加工步骤1中的制备期间再缓冲组合物2中的腺病毒颗粒导致腺病毒载体的流体动力学半径的完全保留，(B)。相反，在加工步骤2中的制备期间再缓冲组合物2中的腺病毒颗粒导致颗粒的流体动力学半径的增加和有关的大聚集体的形成，(D)。
图11：反复实施冻融循环后腺病毒载体制剂的体外感染性，作为药物物质稳定性的评估模型。(A)在加工步骤1中的制备期间通过透析再缓冲腺病毒载体制剂。(B)在加工步骤2中的制备期间通过透析再缓冲腺病毒载体制剂。在两种制备操作(加工步骤1和2)中，与虚线描绘的阳性对照相比，组合物1中再缓冲导致透析后即刻(初始滴度)和在实施5个和10个冻融循环后感染性的完全保留，(A)和(B)。在制备过程(加工步骤1)的早期步骤期间在组合物2中再缓冲也导致透析后即刻感染性的完全保留(初始滴度；A，左侧组的柱)和实施反复冻融循环后感染滴度的轻微丢失，(A)。相反，在加工步骤2的制备期间在组合物2中再缓冲导致透析后即刻感染滴度的显著减少(B；左侧组的柱)。进一步实施反复冻融循环导致感染滴度的进一步显著降低(B；中间和右侧组的柱)。
图12：动态光散射(DLS)测定在实施5个或10个冻融循环后的稳定化组合物1中的腺病毒颗粒的流体动力学半径，作为药物物质稳定性的评估模型。在加工步骤2中使用透析再缓冲组合物1中的腺病毒载体颗粒制剂导致(A)实施5个冻融循环后和(B)实施10个冻融循环后的颗粒的流体动力学半径的保留。
图13：动态光散射(DLS)测定在实施5个冻融循环后在加工步骤1或加工步骤2期间的稳定化组合物1和2中的腺病毒颗粒的流体动力学半径，作为药物物质稳定性的评估模型。在加工步骤1或2中使用透析再缓冲组合物1中的腺病毒载体颗粒制剂导致实施5个冻融循环后颗粒的流体动力学半径的保留，(A)和(B)。相反，在加工步骤1或2中的制备期间再缓冲组合物2中的腺病毒颗粒导致在实施5个冻融循环后，颗粒的流体动力学半径的增加以及有关的更高级聚集体的形成，(C)和(D)。
图14：再缓冲后低浓度的曲妥珠单抗制剂的SE-HPLC色谱图，作为药物物质到药物产品加工的模型。将曲妥珠单抗的冷冻-干燥制剂重构并随后分别在冷冻-干燥产品的原始供应商制剂的组合物中或在本发明组合物Her_1或Her_9(A)和Her_1或Her_2(B)中通过透析再缓冲(曲妥珠单抗-25mg/ml)。在约16分钟的洗脱时间的主峰对应于抗体的结构完整单体分子，在14分钟的洗脱时间的更早洗脱的小峰对应于聚集体特别是二聚体，在11分钟的在原始供应商制剂(黑线)中的更早的峰是更高级聚集体。原始供应商制剂中的再缓冲导致以二聚体和甚至更高级聚集体形式的增加的聚集体形成。相反，本发明组合物中的再缓冲导致与曲妥珠单抗标准品相当量的聚集体，以及在抗体的二聚体峰和单体峰之间的清楚的基线分离。
图15：再缓冲后低浓度的曲妥珠单抗制剂的SE-HPLC色谱图，作为药物物质到药物产品加工的模型。将曲妥珠单抗的冷冻-干燥制剂重构并随后在液体原始供应商制剂的组合物中通过透析再缓冲。将重构的冷冻-干燥曲妥珠单抗(在-80℃储存)的等分试样分别在本发明组合物11_1和11_1+海藻糖中通过透析再缓冲(曲妥珠单抗-20mg/ml)。在约17分钟的洗脱时间的主峰对应于抗体的结构完整单体分子，在14.5分钟的洗脱时间的更早洗脱的小峰对应于聚集体特别是二聚体。与冷冻-干燥产品的原始供应商制剂相比，应用液体原始制剂通常降低使用透析的制备操作中抗体的聚集倾向(实施例3；图14)。但是，组合物11_1和11_1+海藻糖中抗体的再缓冲导致聚集体形成的进一步轻微减少。
图16：再缓冲后高浓度的曲妥珠单抗制剂的SE-HPLC图谱，作为药物物质到药物产品加工的模型。与组合物3和4中液体原始曲妥珠单抗制剂再缓冲后的样品相比，分析直接来自原始容器的未处理的曲妥珠单抗的液体制剂(曲妥珠单抗-120mg/ml)的SE-HPLC图谱，产生可比较的峰图谱。在约16.5分钟的洗脱时间的主峰对应于抗体的结构完整单体分子，在14分钟的洗脱时间的更早洗脱的小峰对应于聚集体特别是二聚体。微量片段在20分钟的洗脱时间洗脱。组合物3和4中的抗体的所得SE-HPLC图谱完全与未处理的原始供应商制剂中的抗体的相应色谱图相当。
图17：再缓冲和/或浓缩后的高浓度的曲妥珠单抗制剂的SE-HPLC图谱，作为药物物质到药物产品加工的模型。与未处理的起始材料相比，浓缩液体、市售的曲妥珠单抗制剂(曲妥珠单抗-120mg/ml)至200mg/ml的浓度导致聚集体形成的显著增加，从在16.5分钟的主峰的洗脱之前的15分钟的洗脱时间洗脱的明显肩峰可以看出。相反，在根据本发明的三种组合物(组合物4_3、4_4或4_5)中的任一种中再缓冲液体曲妥珠单抗制剂并随后浓缩至200mg/ml导致未处理的原始液体曲妥珠单抗制剂的SEC图谱完全保留(图8)以及在根据抗体的二聚体的13分钟峰和16分钟洗脱时间处的单体峰之间的清楚的基线分离。微量片段在20分钟的洗脱时间洗脱。
图18：在透析后即刻的时间点t＝0处和随后在45℃储存21天和28天后的低浓度的曲妥珠单抗制剂的SE-HPLC图谱，作为药物产品稳定性的模型。在(A)原始供应商制剂、(B)组合物Her_1、(C)组合物Her_2和(D)组合物Her_9中使用透析再缓冲后储存低浓度的液体治疗性抗体制剂(曲妥珠单抗-25mg/ml)。与在根据本发明的制剂中的抗体的储存相比，在原始供应商制剂中的储存导致聚集体(在13分钟洗脱)和片段(在>20分钟洗脱)的形成增加。
图19：在时间点t＝0处和在指定的分析时间点在升高温度下液体储存后的高浓度的曲妥珠单抗制剂的SE-HPLC图谱，作为药物产品稳定性模型。在稳定化组合物3和4中使用透析再缓冲后将高浓度的曲妥珠单抗-120mg/ml在40℃下液体储存1.5天(A)、在40℃下液体储存12天(B)、或在30℃下液体储存21天(C)，与未处理的原始供应商制剂(曲妥珠单抗-120mg/ml)的平行液体储存相比。在根据本发明的组合物中的储存降低了抗体的聚集倾向(聚集体在14分钟洗脱)，在组合物4的情况下，另外观察到片段化的轻微减少(片段在21分钟洗脱)。
图20：与未处理的液体原始曲妥珠单抗(120mg/ml)制剂相比，使用透析在组合物3和4中再缓冲后的高浓度的曲妥珠单抗制剂的动态粘度，作为药物产品粘度的模型。与在未处理的原始液体供应商制剂中的高浓度的曲妥珠单抗的测量粘度相比，在组合物3和4中(曲妥珠单抗-120mg/ml)再缓冲液体原始曲妥珠单抗制剂(曲妥珠单抗-120mg/ml)导致粘度显著降低，特别是在组合物4中，在组合物3中也是但程度较低。
图21：液体储存后的高浓度的曲妥珠单抗制剂的SE-HPLC图谱，作为药物产品稳定性的模型。将曲妥珠单抗的冷冻-干燥制剂重构，分别在原始液体供应商制剂的组合物中和在组合物3、4_1和4_2中经透析再缓冲，随后浓缩至在原始液体供应商制剂中曲妥珠单抗-135mg/ml、在组合物3中曲妥珠单抗-145mg/ml、在组合物4_1中曲妥珠单抗-150mg/ml和在组合物4_2中曲妥珠单抗-151mg/ml。(A)在40℃下液体储存8天后的曲妥珠单抗制剂的SE-HPLC图谱和(B)在30℃下液体储存1个月后的曲妥珠单抗制剂的SE-HPLC图谱。在原始液体供应商制剂中在30℃和40℃下液体储存曲妥珠单抗指定时间段导致在14分钟洗脱的聚集体的形成增加，在聚集体峰和16分钟处的单体峰之间形成肩峰，片段形成，具有在单体峰和在20分钟洗脱的略微增加的片段峰之间的肩峰。相反，抗体分别在组合物3、4_1和4_2中在40℃下储存8天和在30℃下储存1个月导致聚集减少，在聚集体峰和单体峰之间具有清楚的基线分离，并且片段化减少。
图22：液体储存后的高浓度的曲妥珠单抗制剂的SE-HPLC图谱，作为药物产品稳定性的模型。将曲妥珠单抗的冷冻-干燥制剂重构，分别在原始液体供应商制剂的组合物中和在组合物3、4_1和4_2中经透析再缓冲，随后浓缩至在原始液体供应商制剂中曲妥珠单抗-135mg/ml、在组合物3中曲妥珠单抗-145mg/ml、在组合物4_1中曲妥珠单抗-150mg/ml和在组合物4_2中曲妥珠单抗-151mg/ml。(A)在25℃下液体储存6个月后的曲妥珠单抗制剂的SE-HPLC图谱和(B)在2-8℃下液体储存6个月后的曲妥珠单抗制剂的SE-HPLC图谱。与在组合物3、4_1和4_2中液体储存抗体相比，在2-8℃和25℃下(特别在25℃的情况下)在原始液体供应商制剂中液体储存抗体指定时间段导致在14分钟洗脱的聚集体的形成增加，为二聚体，在二聚体峰和16分钟处的单体峰之间形成肩峰，导致在17分钟处的单体峰和20分钟处之间作为肩峰洗脱的片段的形成增加。在组合物3、4_1和4_2中配制的抗体的SE-HPLC图谱显示在聚集峰和单体峰之间清楚的基线分离。在2-8℃液体储存6个月的情况下，片段化仅是所有制剂中的少数事件。
图23：在40℃下液体储存后的高浓度的曲妥珠单抗制剂的SE-HPLC图谱，作为药物产品稳定性的模型。将液体、市售的液体曲妥珠单抗制剂(曲妥珠单抗-120mg/ml)浓缩至200mg/ml的浓度，并在根据本发明的三种组合物(组合物4_3、4_4或4_5)中的任一种中再缓冲液体曲妥珠单抗制剂(曲妥珠单抗-120mg/ml)，随后浓缩至200mg/ml。(A)在40℃下液体储存3天后的SE-HPLC图谱和(B)在40℃下液体储存14天后的SE-HPLC图谱。在这样高浓度的抗体储存期间，片段化仅是少数事件。与原始供应商制剂相比，在根据本发明的组合物中的聚集倾向大大降低，进一步观察到在14分钟洗脱的聚集体峰与在16分钟洗脱的单体峰之间具有清楚的基线分离。
图24：在升高温度下液体储存后的高浓度的曲妥珠单抗制剂的SE-HPLC图谱，作为药物产品稳定性的模型。将液体、市售的液体曲妥珠单抗制剂(曲妥珠单抗-120mg/ml)浓缩至200mg/ml的浓度，并在根据本发明的三种组合物(组合物4_3、4_4或4_5)中的任一种中再缓冲液体曲妥珠单抗制剂(曲妥珠单抗-120mg/ml)，随后浓缩至200mg/ml。(A)在30℃下液体储存42天后的SE-HPLC图谱和(B)在25℃下液体储存3个月后的SE-HPLC图谱。在这样高浓度的抗体储存期间，片段化仅是少数事件。与原始供应商制剂相比，在根据本发明的组合物中的聚集倾向大大降低，进一步观察到在14分钟洗脱的聚集体峰与在16分钟洗脱的单体峰之间具有清楚的基线分离。
图25：高浓度的曲妥珠单抗制剂的动态粘度，作为药物产品粘度的模型。将液体原始供应商曲妥珠单抗制剂(曲妥珠单抗-120mg/ml)浓缩至220mg/ml，在组合物4_3、4_4或4_5中经透析再缓冲液体原始供应商曲妥珠单抗制剂(曲妥珠单抗-120mg/ml)并随后浓缩至220和200mg/ml。高浓度的曲妥珠单抗制剂的动态粘度以200mg/ml(白色柱)和220mg/ml(黑色柱)两种不同浓度测量；对于原始供应商制剂，仅测量浓度为220mg/ml的抗体制剂的粘度。与相同浓度的原始供应商制剂中的动态粘度相比，抗体浓度为220mg/ml的对应于组合物4_3和4_4的抗体制剂的动态粘度显著降低。在组合物4_4中，测得的动态粘度略微增加。在抗体浓度为200mg/ml的样品的评估的动态粘度中显示了类似的趋势。
图26：在液体储存期间高浓度的曲妥珠单抗的SE-HPLC分析。描绘了通过SE-HPLC获得的聚集体峰(顶部)、单体峰(中间)和片段峰(底部)的相对AUC。(A)与原始制剂相比，在F2-1和F2-2中在30℃下液体储存3个月期间120mg/mL曲妥珠单抗的SE-HPLC峰的相对AUC。(B)与原始制剂相比，在F2-3和F2-4中在25℃下液体储存6个月期间150mg/mL曲妥珠单抗的SE-HPLC峰的相对AUC。(C)与原始液体制剂相比，在F2-5、F2-6和F2-7中在25℃下液体储存3个月期间200mg/mL曲妥珠单抗的SE-HPLC峰的相对AUC。原始：(120mg/mL)F0制剂(F0)。
图27：在液体储存期间曲妥珠单抗的阳离子交换色谱(CEX-HPLC)分析。(A)与原始制剂相比，在F2-1和F2-2中在30℃下液体储存3个月期间120mg/mL曲妥珠单抗的CEX-HPLC峰的相对AUC。(B)与原始制剂相比，在F2-3和F2-4中在25℃下液体储存6个月期间150mg/mL曲妥珠单抗的CEX-HPLC峰的相对AUC。(C)与原始液体制剂相比，在F2-5、F2-6和F2-7中在25℃下液体储存3个月期间200mg/mL曲妥珠单抗的CEX-HPLC峰的相对AUC。原始：(120mg/mL)F0制剂(F0)。(A-C)酸性物质(顶部)、主峰物质(中间)和碱性物质(底部)。
图28：再缓冲和随后将抗体浓度浓缩至高达200mg/ml后的高浓度的曲妥珠单抗制剂的SE-HPLC图谱，作为药物物质到药物产品加工的模型。将曲妥珠单抗的冷冻-干燥制剂重构，分别在原始液体供应商制剂的组合物中和组合物4_1、4_3和4_5中经透析再缓冲，随后将曲妥珠单抗浓度浓缩至高达200mg/ml。与组合物4_1、4_3和4_5中配制的抗体浓度相比，原始液体供应商制剂中的抗体浓度导致在14分钟的保留时间处洗脱的聚集体的形成增加。
图29：液体储存后的高浓度的曲妥珠单抗制剂的SE-HPLC图谱，作为药物产品稳定性的模型。将曲妥珠单抗的冷冻-干燥制剂重构，在原始液体供应商制剂的组合物中和在其中该制剂另外含有氨基酸甘氨酸和脯氨酸(其浓度描述于美国专利US 9,364,542B2中)的冷冻-干燥产品的原始供应商制剂中经透析再缓冲(实施例16)。为了比较，分别在组合物4_1、4_3和4_5中经透析另外再缓冲重构的曲妥珠单抗随后将所有制剂浓缩至曲妥珠单抗浓度为200mg/ml。(A)和(B)，分别与原始液体供应商制剂相比(A)和与具有甘氨酸和脯氨酸的原始供应商制剂相比(B)，组合物4_1、4_3和4_5中配制的曲妥珠单抗在55℃下液体储存24小时后的SE-HPLC图谱。(C)和(D)，分别与原始液体供应商制剂相比(C)和与具有甘氨酸和脯氨酸的原始供应商制剂相比(D)，组合物4_1、4_3和4_5中配制的曲妥珠单抗在40℃下液体储存14天后的SE-HPLC图谱。(E)和(F)，分别与原始液体供应商制剂相比(E)和与具有甘氨酸和脯氨酸的原始供应商制剂相比(F)，组合物4_1、4_3和4_5中配制的曲妥珠单抗在40℃下液体储存28天后的SE-HPLC图谱。特别是与根据所述美国专利的具有添加剂甘氨酸和脯氨酸的冷冻-干燥产品的原始制剂相比，在升高温度下液体储存不同时间后所描绘的SE-HPLC色谱图显示组合物4_1、4_3和4_5有效地防止聚集体的形成。
图30：液体储存后的高浓度的曲妥珠单抗制剂的CEX-HPLC分析，作为药物产品稳定性的模型。将曲妥珠单抗的冷冻-干燥制剂重构，在原始液体供应商制剂的组合物中和在其中该制剂另外含有氨基酸甘氨酸和脯氨酸(其浓度描述于美国专利US 9,364,542 B2中)的冷冻-干燥产品的原始供应商制剂中经透析再缓冲(实施例16)。为了比较，分别在组合物4_1、4_3和4_5中经透析另外再缓冲重构的曲妥珠单抗随后将所有制剂浓缩至曲妥珠单抗浓度为200mg/ml。峰的相对百分比面积增加的过程对应于酸性电荷变体的形成，(A)在55℃下液体储存期间在指定的分析时间点，(B)在40℃下液体储存期间在指定的分析时间点和(C)在25℃下液体储存期间在指定的分析时间点。所描述的抗体分子的酸性电荷变体形成的过程进一步强调了组合物4_1、4_3和4_5对抗抗体分子中化学变化的稳定功效。特别地，对抗酸性电荷变体形成的稳定化表明组合物4_1、4_3和4_5对抗脱酰胺作用(其已知为在升高温度下液体储存期间曲妥珠单抗分子中的主要化学变化，和由此产生的对酸性电荷变体的形成的量的主要贡献)的更高的稳定功效。相反，根据美国专利实例的具有氨基酸甘氨酸和脯氨酸作为添加剂的冷冻-干燥产品的原始供应商制剂显示，高的抗体浓度在升高温度下液体储存过程中具有显著更高的酸性电荷变体形成趋势。
实施例阐明了本发明。
实施例1：冷冻-干燥以及随后储存的腺病毒载体的功能和结构完整性的体外研究显示，在用于评估下游加工早期阶段药物物质稳定性的模型中，基于氨基酸和糖的组合物稳定腺病毒载体。
1.1材料与方法
组合物1和2含有丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸、组氨酸和色氨酸7种氨基酸，其浓度相当于40g/l的总氨基酸。但在组合物1中，相比于组合物2，在减少其它氨基酸精氨酸、甘氨酸、赖氨酸浓度并保持丙氨酸浓度的情况下，5倍增加色氨酸浓度和1.667倍增加组氨酸和谷氨酸浓度，产生根据40g/l的总氨基酸的相同浓度。此外，与组合物2不同，在组合物1中加入浓度为0.05g/l的另外的表面活性剂聚山梨酯80。两种组合物都含有海藻糖作为相应的糖，氨基酸与海藻糖的比率为1:2(w/w)。将所有组合物的pH值调节至7。
使用在原始供应商制剂(Firma Sirion；Martinsried/Munich；Germany)中在-80℃下储存的浓度为7.5×1010 IFU/ml的腺病毒原液。
1.1.1样品制备和冷冻干燥
通过用组合物1或组合物2将原液稀释至1×108 IFU/ml的浓度来再缓冲腺病毒载体原液。为了比较，用原始供应商制剂或PBS将原液稀释至相同浓度。
为了制备用于冷冻干燥的样品，将不同的腺病毒制剂在500μl体积的2R冷冻干燥小瓶(Schott AG；Mainz；Germany)中等分，随后使用以下干燥参数冷冻-干燥：
冷冻干燥后，目视检查样品，将样品的一部分在2-8℃下短时间储存直至在时间点t＝0时分析初始感染滴度。样品的另一部分根据国际协调会(ICH)指南在25℃、60％残余湿度的环境条件下储存21天或42天，或在40℃、75％残余湿度的环境条件下储存7天或28天。
1.1.2细胞培养物中腺病毒载体感染滴度的测定
为了分析腺病毒载体制剂的感染滴度，应用在HEK293细胞培养物中基于抗体的病毒滴定实验，在感染细胞中成功扩增腺病毒后使用腺病毒六邻体蛋白的检测。将2.5×105HEK 293(CCS)细胞(Firma Sirion；Martinsried/Munich；Germany)以500μl的体积接种于24孔微量滴定板的每个孔中。腺病毒载体制剂在冷冻干燥后即刻重构或在25℃和40℃下储存后在指定时间点重构。使用原始供应商制剂(Firma Sirion；Martinsried/Munich；Germany)中在-80℃下储存的浓度为7.5×1010 IFU/ml的腺病毒原液的等分试样作为阳性对照。随后，制备腺病毒样品的连续稀释液，并将每孔50μl所得稀释液用于感染细胞。将板在37℃下孵育42小时。感染后，将细胞用甲醇固定，与第一抗-六邻体蛋白抗体(Santa CruzBiotechnology,Inc.；Dallas；Texas:USA)一起孵育，随后与对第一抗体特异的辣根过氧化物酶(HRP)偶联的第二抗-鼠抗体(Cell Signaling Technology；Danvers；Massachusetts；USA)一起孵育，并进行与二氨基联苯胺(Carl Roth GmbH和Co.KG；Grafrath；Germany)的HRP酶促反应，其中棕色表示感染的细胞。通过在显微镜下计数棕色细胞来定量感染的细胞的数量，其中各感染的细胞计为一个感染性病毒颗粒。
1.1.3动态光散射(DLS)测量
与对应于在-80℃下储存的腺病毒原液的等分试样的未处理阳性对照相比，对冷冻干燥前再缓冲后即刻取的样品以及腺病毒载体制剂重构后的样品进行DLS。在后一种情况下，DLS在冷冻干燥后立即(t＝0)进行，或在25℃(21天、42天)和在40℃(7天、28天)下储存后的相关时间点进行。
为此，将5μl样品移液到特殊的DLS吸收池中，并在DynaPro Nanostar DLS仪器(Wyatt Technology Europe GmbH；Dernbach；Germany)中分析。对于各实验制剂，在相同条件下进行空白测量。在10或20个循环中以20至40秒的采集时间进行DLS测量。使用DynaProDLS软件分析所得的相关曲线。
1.2结果
有趣的是，与在原始原液中未处理的腺病毒颗粒(图1A)相比，在将腺病毒载体制剂与根据本发明的溶液(组合物1或组合物2)混合后即刻在DLS实验中记录的相关函数的评估表明腺病毒载体的流体动力学半径完全保留(图1B和C)。与未处理的腺病毒载体(图1A)相比，在冷冻干燥前样品的制备过程期间腺病毒原液通过稀释与原始供应商制剂或PBS类似地混合已经导致测量的腺病毒载体的流体动力学半径的显著增加(图2A和B)。
冷冻干燥后的体外感染性试验显示已经在早期阶段缩小规模的步骤和随后冷冻干燥期间在稳定化组合物1和2中的腺病毒载体制剂导致感染滴度相当于图1中虚线所示的阳性对照。因此，在冷冻干燥后观察到感染滴度的完全保留。相反，当在原始供应商制剂中再缓冲的腺病毒载体被冷冻-干燥时，观察到感染滴度的显著丢失，并且在PBS中的冷冻干燥甚至导致相应的感染滴度的完全丢失(图3)。
腺病毒制剂的干燥产品重构后的体外感染性结果与动态光散射实验的流体动力学半径的平行测定结果很一致。已经在早期阶段缩小规模的步骤和随后冷冻干燥期间腺病毒载体制剂与根据本发明的组合物1和2的组合导致病毒颗粒的流体动力学半径的完全保留(实施例1；图4A和B)。相反，在原始供应商制剂中冷冻干燥相应的腺病毒载体制剂导致粒径的增加(实施例1；图5A)。与常见的磷酸盐缓冲盐水(PBS)的组合的类似的样品制备操作已经在冷冻干燥后导致粒径的大幅增加(实施例1图5B)并且形成显著量的更高级聚集体。
这些差异在冷冻-干燥制剂储存后甚至更加显著。观察到在原始供应商制剂中冷冻-干燥的病毒载体的功能完全丢失(图6)，类似于在PBS中获得的结果。相反，即使在25℃或甚至在40℃下储存后，在生产过程早期在稳定化组合物1和2中配制的冷冻-干燥的腺病毒载体组合物保留了与阳性对照(即，在冷冻-干燥之前的腺病毒载体(图6的图表中以虚线所示))几乎相同的病毒活性。
体外感染性实验的这些结果与平行进行的DLS实验很好地对应。例如，图7和图8中描绘了在40℃下储存14天后，分别在根据本发明的组合物1和2中或在原始供应商制剂和PBS中储存干燥的腺病毒载体组合物后记录的DLS相关函数的评估。在稳定化组合物1和2中储存的干燥的腺病毒载体制剂导致测定的腺病毒颗粒的流体动力学半径的保留(实施例1；图7A和B)，其与在原始供应商制剂和在PBS中储存的腺病毒颗粒(实施例1；图8A和8B)相反。
实施例2：冷冻和解冻压力后不同腺病毒载体制剂的功能和结构完整性的体外研究显示，在用于评估下游加工早期阶段药物物质稳定性的模型中，特定氨基酸组合物展现出优于其它组合物的稳定化功效。
2.1材料与方法
2.1.1样品制备和进一步加工
含有编码eGFP蛋白的DNA的腺病毒5型载体的高滴度腺病毒载体原液。用腺病毒颗粒转导5×108 HEK293细胞。转导后48小时，收集细胞并通过Na-脱氧胆酸和DNase I处理进行病毒颗粒的释放。通过CsCl梯度超速离心纯化病毒颗粒，然后通常在PD10柱上在原始供应商制剂中进行缓冲液交换，随后测定感染滴度。随后将得到的高滴度腺病毒原液等分并在-80℃下储存。
样品制备-加工步骤1：在CsCl梯度超速离心后立即再缓冲制备的腺病毒载体来制备腺病毒载体制剂。收集获得的腺病毒载体，并在2-8℃下在组合物1或组合物2中透析(如1.1中所述)。将所得制剂等分并在-80℃下储存。
样品制备-加工步骤2：将冷冻(-80℃)的腺病毒原液(7.5×1010 IFU/ml；Sirion,Martinsried/Munich,Germany)在原始供应商缓冲液中解冻(室温；RT)，随后在2-8℃下在组合物1和组合物2中透析。
2.1.2来自加工步骤1和步骤2制备的腺病毒样品反复冻融循环
为了分析在随后的压力条件期间腺病毒载体制剂的稳定性，将在组合物1或组合物2中配制的50μl的腺病毒载体进行反复冷冻(-80℃)和解冻(RT)循环。通过在HEK 293细胞培养物中的病毒滴定(在1.1.2中描述)，在初始时间点t＝0和5次冻融循环以及10次冻融循环后测定体外感染性(在1.1.2中描述)。平行地，通过DLS测量腺病毒颗粒的流体动力学半径(在1.1.3中描述)。
2.2结果
体外感染性试验显示，与阳性对照(图9中虚线)相比，组合物1完全保留了来自加工步骤1和步骤2中腺病毒载体制剂的感染滴度(图9)。在组合物2中超速离心步骤(加工步骤1)后立即再缓冲腺病毒载体制剂也完全保留了腺病毒载体制剂的感染性。有趣的是，在加工步骤2之后使用的组合物2导致初始滴度约2个对数水平的丢失(图9)。
经另外的冻融循环(5次和10次)，无论生产加工步骤和再缓冲的时间点如何，组合物1都保留了完全的感染滴度(图11A和B)。相反，当在两种不同的加工步骤1和2中制备时，组合物2导致显著不同的效果。根据加工步骤2获得的组合物2样品的感染滴度在5次冻融循环后显著进一步降低，在10次冻融循环后甚至降低更大(图11B)。当在组合物2中在较早加工步骤1中配制腺病毒载体，在5次冻融循环后观察到仅较小的滴度丢失。10次冻融循环导致更大的降低，但与加工步骤2中的制剂相比程度较小(图11A)。
与在反复冻融循环之前和之后感染滴度的测定平行，使用动态光散射(DLS)分析相应腺病毒颗粒的流体动力学半径(图10、12和13)。使用超速离心(制备步骤1)纯化步骤后即刻再缓冲腺病毒载体制剂导致两种组合物中的病毒颗粒的流体动力学半径的完全保留(图10A和B)，确证相应的体外感染性的完全保留(图9)。在组合物1的情况下，根据加工步骤2再缓冲腺病毒载体制剂后，观察到流体动力学半径的轻微增加(图10C)，其与图9中显示的感染性结果一致。相反，在相应于加工步骤2的组合物2中再缓冲腺病毒载体制剂导致腺病毒颗粒的流体动力学半径的显著增加(图10D)，伴随着更高级聚集体的形成，其可以解释体外感染性测试中功能的丢失(图9)。
在5次和10次反复冻融循环后，通过DLS测量病毒颗粒(特别是组合物2中)的流体动力学半径的变化。当在加工步骤1和2期间制备时，组合物1中没有观察到显著的增加。例如，图12中描绘了实施5次和10次冻融循环后组合物1中腺病毒颗粒大小的DLS结果。当在加工步骤1期间使用组合物2时，已经5次冻融循环后的流体动力学半径显著增加，伴随更高级聚集体的形成，10次冻融循环后和在加工步骤2中使用时，其由于半径的进一步增加和更高级的聚集体的形成超出了DLS测量限制而无法测量(图13C和D)。图13A至D描绘了实施5次冻融循环后在加工步骤1或2期间制备的组合物1和2中的腺病毒颗粒大小的表现。
总之，组合物1在两种实施的早期生产步骤期间通常对腺病毒载体颗粒展现出优异的稳定功效。相反，尽管组合物2在超速离心后即刻使用时显示出稳定功效，但与组合物1相比在生产过程的后期使用时观察到降低的稳定功效。
DLS数据与实施例1中显示的体外感染性数据对应。这得出结论，在病毒载体组合物的生产过程的早期使用基于氨基酸的特别定制的稳定化组合物对于生物制药制备的进一步加工步骤期间的稳定性是重要的。此外，在降低溶液的多分散性方面基于病毒载体的组合物的稳定化导致溶液具有高体外感染性。
实施例3：在加工和液体储存期间对低浓度的治疗性抗体制剂的分子完整性的分析显示，在用于药物物质到药物产品加工的模型中，特定氨基酸和糖的组合物降低了抗体聚集倾向和特别是片段化倾向。
3.1材料与方法
组合物Her_1和Her_2含有丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸、组氨酸和色氨酸7种氨基酸，其浓度根据总氨基酸为30.6g/l，在组合物Her_1的情况下与9.4g/l的海藻糖组合，在组合物Her_2的情况下与9.4g/l的甲硫氨酸组合，导致总赋形剂浓度为40g/l。总氨基酸与海藻糖的比率为3.25:1。组合物Her_9仅含有4种碱性氨基酸，较高浓度的精氨酸、甘氨酸、色氨酸以及缓冲液浓度的组氨酸，其浓度根据总氨基酸为20g/l，与10g/l的海藻糖和10g/l的甲硫氨酸的组合。4种碱性氨基酸的总和与海藻糖的相应比率为2:1。在所有实施例中，IgG与赋形剂(重量:重量)的比率为1:1.6。在原始供应商制剂的情况下，IgG与赋形剂的比率为1:1。将所有组合物的pH值调节至6。
作为模型蛋白质，使用市售的冷冻-干燥的(Roche；Basel；Switzerland)，其为治疗性人源化IgG1单克隆抗体(曲妥珠单抗)。在期望体积的水中重构冷冻-干燥的药物产生抗体浓度为25mg/ml IgG1，作为原始供应商制剂(24g/l海藻糖；0.9mg/ml组氨酸缓冲液约5mM；0.1g/l聚山梨酯20；pH 6)。
3.1.1样品制备
在2-8℃下在原始供应商制剂的组合物以及各种基于氨基酸的组合物Her_1、Her_2和Her_9中透析所获得的制剂后，将所有制剂无菌过滤并等分到无菌小瓶中用于液体储存。将样品在37℃和45℃下储存，并使用分子排阻色谱法(SEC)在储存之前、样品制备后即刻以及指定时间点分析蛋白质聚集和片段化。
3.1.2分子排阻色谱法(SEC)
通过SEC定量蛋白质聚集和片段化。在UHPLC系统UltiMate3000(ThermoScientific；Darmstadt；Germany)上进行分析，其配备有UV-280nm检测器和TSK-gelG3000SWXL7.8×300mm柱(Tosoh Bioscience,Tokyo,Japan)，30℃，流速0.5ml/min。在SEC分析之前，使用SEC运行缓冲液PBS将根据其它实施例的含有25mg/ml抗体或更高浓度的样品稀释至达到2.5mg/ml IgG的浓度，并等分到特殊HPLC小瓶中。注射体积为25μl。SEC的运行缓冲液是Dulbecco的PBS，pH 7.1(PAA Laboratories,Pasching,Austria)。在每个序列中运行分子量标准品(BSA,Thermo Scientific；Waltham,MA,USA)和安慰剂缓冲液。通过使用Chromeleon7色谱数据软件(Thermo Scientific,Germany)比较单体峰、高分子量物质的总和以及低分子量物质的总和的曲线下面积来确定聚集和片段化的定量百分数％。
3.2结果
样品制备
透析后即刻的分子排阻色谱法(SEC)分析的峰型显示原始制剂中聚集体形成增加至聚集体峰的面积百分比为约1.55％，甚至形成更高分子量的聚集体。相应的曲妥珠单抗标准品中聚集体的通常含量为约0.4％。原始制剂中对应于完整抗体分子的单体峰的面积百分比伴随着降低至约98.44％。
相反，对应于未处理的曲妥珠单抗标准品制剂，分别在各种基于氨基酸的组合物Her_1、Her_2和Her_9中使用透析再缓冲初始IgG1制剂，导致聚集体量的保留，约0.4％，没有任何较高分子量聚集体形成。相应单体峰的面积百分比分别保持在约99.6％(图14)。
在45℃下液体储存
在原始供应商制剂中液体储存抗体21天后，发现聚集体峰的面积百分比增加至1.76％，并且28天后聚集体形成进一步增加至约2.53％(为比较，相同原液的未处理的曲妥珠单抗标准品含有0.4％聚集体)。此外，21天后片段化增加至约1.92％并且28天后增加至约2.78％。在45℃下储存过程中，聚集和片段化的动力学相似。所有基于氨基酸的组合物Her_1、Her_2和Her_9在45℃下液体储存期间降低了抗体聚集和片段化程度，但是降低的程度不同。含有7种氨基酸的组合物与海藻糖和/或甲硫氨酸(组合物Her_1和Her_2)组合在45℃下液体储存期间显著降低了抗体的聚集。例如，由7种氨基酸组成的组合物Her_2与甲硫氨酸组合在储存21天期间降低聚集体形成至约0.56％(相比于原始制剂的1.76％)。在45℃下储存21天后的1.32％片段化略微更明显，但与原始制剂中的储存(1.92％)相比显著降低。在进一步储存至28天后，聚集没有改变(0.52％；相比于原始制剂的2.53％)，片段略微增加至1.49％，相比于原始制剂的2.78％。在缓冲浓度下，减少氨基酸含量至精氨酸、甘氨酸、色氨酸和组氨酸4种碱性氨基酸，与海藻糖(氨基酸与海藻糖的比率为2:1)和甲硫氨酸组合，导致在45℃下储存21天后相当量的聚集体，但是抗体片段形成倾向降低(1.02％)。在45℃下储存28天后，聚集体的含量进一步降低至约0.39％，但片段化增加至约1.56％(图18)。
因此，将氨基酸的量从7种氨基酸减少至4种氨基酸，将氨基酸与海藻糖的比率从3.25:1(7种氨基酸与海藻糖)调整至2:1(4种氨基酸与海藻糖)，并且添加甲硫氨酸作为抗氧化剂，降低了在升高温度下储存期间抗体的聚集倾向和特别是片段化倾向。
实施例4：在加工和液体储存期间对低浓度的治疗性抗体制剂的分子完整性的分析显示，在用于药物物质到药物产品加工的模型中，特别定制氨基酸和糖的组合物降低了抗体聚集倾向和特别是片段化倾向。
4.1材料与方法
组合物11_1含有精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、色氨酸、甲硫氨酸和β-丙氨酸6种氨基酸，其浓度为48g/l的相应的总氨基酸，在组合物11_1+海藻糖的情况下，与96g/l的海藻糖组合。在该组合物中氨基酸与海藻糖的比率为1:2。pH值调节至6。不添加海藻糖时抗体与赋形剂的比率为1:2.4(重量:重量)，添加海藻糖后的比率为1:7.2。在原始液体供应商组合物的情况下，抗体与赋形剂的比率为1:3.4。
作为模型蛋白质，使用市售的冷冻-干燥的(Roche；Basel；Switzerland)，其为治疗性人源化IgG1单克隆抗体(曲妥珠单抗)。在期望体积的水中重构冷冻-干燥的药物导致原始供应商制剂中的抗体浓度为50mg/ml IgG1(48g/l海藻糖；1.8mg/ml组氨酸缓冲液约10mM；0.2g/l聚山梨酯20；pH 6)。
4.1.1样品制备
在2-8℃下在原始液体供应商制剂的组合物(79.45g/l海藻糖；3.13mg/ml组氨酸缓冲液20mM；1.49g/l甲硫氨酸；0.4g/l聚山梨酯20；pH 6)中使用透析再缓冲所获得的制剂，随后部分稀释，产生原始液体供应商制剂中抗体最终浓度为25g/l和50g/l的制剂。
平行地，在重构的等分并在-80°下储存的抗体浓度为20mg/ml的冷冻-干燥的市售的等分试样解冻后，在基于氨基酸的组合物11_1和11_1+海藻糖中使用透析进行再缓冲。
使用分子排阻色谱法(SEC)在样品制备后即刻分析蛋白质聚集和片段化。
4.1.2分子排阻色谱法(SEC)
根据3.1.2段进行SEC。
4.2结果
样品制备
在原始液体供应商组合物中透析后，与先前实施例相比，聚集体形成减少(0.4％聚集体)。但是，在进一步基于氨基酸的组合物11_1(没有海藻糖和以氨基酸与海藻糖比率为1:2添加海藻糖)中透析后，导致聚集进一步降低至约0.3％(图15)。
液体储存
在整个实施例的过程中，以氨基酸与海藻糖比率为1:2添加海藻糖至基于氨基酸的制剂(组合物11_1)中，与不含海藻糖的相应组合物相比，导致在37°下储存过程中片段的面积百分比显著降低，并且在海藻糖存在下聚集倾向略微降低(数据未显示)。
因此，最后两个实施例已经显示，氨基酸与海藻糖的组合显然是在升高温度下液体储存期间降低抗体聚集体形成和特别是片段化的先决条件。
在用低浓度的曲妥珠单抗制剂的该液体储存实验过程中，已经观察到抗体:赋形剂的比率对抗体的聚集和片段化行为的影响。在IgG浓度为50mg/ml时，含有4种碱性氨基酸的基于氨基酸的组合物与海藻糖和抗氧化剂组合的制剂，其比率与先前实验的组合物Her_9相当，其浓度为25g/l、50g/l和75g/l，SEC色谱图显示，在37℃下储存42天后，随着赋形剂浓度的增加，聚集体形成减少，并且随着赋形剂浓度的增加，片段化增加。抗体与赋形剂的最高比率2:1导致最低的片段形成和最高的聚集体形成(数据未显示)。
总之，实施例3和4的这些结果表明，将氨基酸的量从7种氨基酸减少至4种碱性氨基酸，以平衡比率与海藻糖组合，添加抗氧化剂(例如甲硫氨酸)，以及抗体与赋形剂的平衡比率，在升高温度下液体储存过程中对抗体的聚集和片段化都有影响。
实施例5：在加工和液体储存期间对高浓度的治疗性抗体制剂的分子完整性和粘度的分析显示，在用于药物物质到药物产品加工的模型中，特定氨基酸和糖的组合物降低了抗体聚集倾向和特别是片段化倾向。
5.1材料与方法
组合物3和4含有精氨酸、甘氨酸、色氨酸和组氨酸4种碱性氨基酸，其浓度根据总氨基酸为50g/l。在组合物3的情况下，氨基酸组合物与80g/l海藻糖组合，在组合物4的情况下与32.2g/l海藻糖组合。作为另外的化合物，组合物3和4含有1.5g/l甲硫氨酸和0.4g/l聚山梨酯20。组合物4含有两种另外的化合物，螯合剂EDTA和抗氧化剂抗坏血酸。所得总赋形剂在组合物3的情况下为131.5g/l，在组合物4的情况下为85g/l。组合物3中总的碱性氨基酸与海藻糖的比率为1:1.55(w/w)，海藻糖过量，而在组合物4中，碱性氨基酸与海藻糖的比率为1.6:1(w/w)，氨基酸过量。抗体与总赋形剂的比率在组合物3中为1:0.9(w/w)，在组合物4中为1:1.4(w/w)。将pH值调节至5.5。
作为模型蛋白质，使用市售液体治疗性高浓度的抗体(Roche；Basel；Switzerland)，其含有曲妥珠单抗，在原始供应商制剂(79.45g/l海藻糖；3.13g/l组氨酸缓冲液20mM；1.49g/l甲硫氨酸；0.4g/l聚山梨酯20；0.024g/l rHuPh20(重组人透明质酸酶)，pH 5.5)中浓度为120mg/ml。
5.1.1样品制备
将原始液体供应商制剂中未处理的抗体制剂样品直接等分到来自原始容器的无菌HPLC小瓶中，在25℃、30℃和40℃下储存。120mg/ml抗体浓度的曲妥珠单抗的原始液体供应商制剂的另一部分在2-8℃下使用透析再缓冲到根据本发明的组合物中。将所得制剂无菌过滤，等分至无菌HPLC小瓶中，并在25℃、30℃和40℃下储存。在储存前、样品制备后即刻和储存期间指定时间点使用SEC分析聚集和片段化。
5.1.2分子排阻色谱法(SEC)
根据3.1.2段进行SEC。
5.1.3粘度测定法
根据5.1.1段的样品制备之后，使用落球粘度计(Anton Paar GmbH；Ostfildern-Schamhausen；Germany)测定基于氨基酸组合物3和4的高浓度的抗体制剂的粘度相对于未处理的液体原始供应商制剂的粘度。在测定高浓度的蛋白质样品的密度(120mg/ml)并用70°的下降角在20℃下用水校准毛细管后，将球引入毛细管中并将约500μl的抗体制剂小心地填充到毛细管中。将填充的毛细管插入仪器的毛细管区，并用在20℃和70°的下降角以十次单独试验来测量样品。
5.2结果
样品制备
来自原始容器的未处理的液体曲妥珠单抗制剂的SEC图谱显示仅0.19％的小聚集体峰、99.77％的单体峰和0.04％的片段。在根据5.1段的基于氨基酸的组合物3和4中再缓冲该制剂后，分析相当的SEC图谱，表明在再缓冲过程期间基于氨基酸的制剂对抗体的稳定作用(图16)，其在随后的升高温度储存期间更为明显(图19和下一段)。
液体储存
在原始未处理的液体供应商制剂中在40℃下已经储存1.5天后，测定聚集体形成增加(0.22％)并发现片段化的略微增加(0.09％)。单体峰略微减少至99.69％。相反，抗体在根据5.1段的两种不同的基于氨基酸的组合物3和4中在40℃下储存1.5天显示抗体聚集倾向降低以及较小程度的片段化(图19A)。在组合物3中，海藻糖过量于氨基酸(氨基酸与海藻糖的比率为1:1.55(w/w))导致在40℃下储存1.5天后的聚集体含量为约0.16％，片段为0.06％。在含有1.6:1的氨基酸与海藻糖比率(氨基酸过量)的组合物4中在40℃下储存1.5天导致形成0.16％的聚集体和0.05％的片段。在原始液体供应商制剂中在40℃下储存12天后，聚集体和片段进一步增加(0.26％聚集体和0.27％片段)。在组合物3中，在40℃下储存12天后，聚集体仅增加至0.20％，片段增加至0.29％。在组合物4中，聚集体的含量仅为0.18％，片段的含量仅增加至0.20％(图19B)。在30℃下储存21天后，在原始供应商制剂中聚集体含量也增加至0.26％，片段化为0.13％。在组合物3以及组合物4中在30℃下储存21天显示抗体的聚集倾向降低(组合物3中为0.18％，组合物4中为0.16％)。组合物3中抗体片段化的增加(0.15％)与原始制剂相当，在组合物4中，片段含量降低至0.09％(图19C)。在40℃下长期储存后的数据确证了这些观察。在原始制剂中在40℃下储存42天后聚集增加至0.53％，片段化增加至0.8％。相反，在组合物3和组合物4中，在该储存期后聚集体的含量为0.37％和0.36％。另外，其片段化分别仅为0.72％和0.66％。
这些结果表明，在40℃和30℃下的储存期间基于氨基酸的制剂比原始制剂在对抗聚集体形成和片段化形成(特别是组合物4)方面具有更强的稳定功效。结果进一步表明，特别是组合物4，其具有氨基酸过量于海藻糖，显示出相比于组合物3在对抗聚集和片段化方面更好的稳定性。该观察在30℃下储存3个月后得到确证。原始制剂的聚集体含量为0.35％，而组合物3的聚集体含量为0.26％，组合物4中聚集体含量为0.20％。原始制剂中片段化为0.40％，组合物3中为0.46％，组合物4中仅为0.33％。在30℃下在加速老化条件下3个月，定量统计分析高浓度的抗体制剂(120mg/ml)的液体储存过程进一步证实了上述发现。与组合物3和组合物4相比，原始液体制剂中的加速老化(图26)证明显著(p<0.01)更高程度的聚集(图26A)，与制剂粘度一致(参见下文和图26)。相反，储存期间的片段形成在原始制剂和组合物3之间是相似的，但在组合物4中显著降低(p<0.05)(图26A)。单体峰的相关降低在组合物3中是有限的(p<0.01)，在组合物4中甚至更少(p<0.01)(图26A)。
具有氨基酸与海藻糖比率为1.6:1(w/w)的组合物4的稳定功效通过以下实施例确证。
分析源自根据实施例4的4.1段的组合物11_1的另外的组合物1的稳定功效，仅含有氨基酸精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、色氨酸、甲硫氨酸和β-丙氨酸，与二肽组合，不含糖。在如上所述的各分析时间点，抗体的聚集也是显著降低的，但抗体显示出相比根据5.1段的组合物3和特别是组合物4的更强的片段化倾向，证实了氨基酸与海藻糖之间的平衡比率导致聚集和片段化降低的观察结果(数据未显示)。
此外，使用CEX-HPLC，相比于原始制剂，在组合物3和4中，分析在30℃下在加速老化条件下3个月的高浓度的抗体制剂(120mg/mL)的液体储存过程中的化学降解模式，进一步强调了调整碱性氨基酸组合物的有利效果，例如，通过以适当比率添加糖和一种或多种抗氧化剂。由于具有较高浓度(120mg/mL)的曲妥珠单抗，组合物3导致碱性种质的减少(图27；p<0.05)。因此，平衡的氨基酸:糖比率能够在高浓度的曲妥珠单抗液体储存期间限制碱性化学降解产物。
该数据进一步证实了所要求保护的发明，即根据特定生物分子的要求(例如，药物产品的最终浓度和粘度)调整在早期药物物质加工步骤期间使用的所应用的碱性氨基酸组合物(其由至少三种氨基酸(精氨酸、甘氨酸、组氨酸和/或色氨酸)组成)在进一步加工(诸如填充、冷冻干燥、干燥或液体产品的储存)期间稳定生物分子。
粘度测量
发现与未处理的液体原始供应商制剂的相应粘度相比在基于氨基酸的高浓度的抗体制剂中测量的动态粘度显著降低。组合物3中的动态粘度为4mPa*s，组合物4中的动态粘度为3.5mPa*s。相反，高浓度的液体原始供应商制剂中的动态粘度为4.8mPa*s(图20)。
组合物4和原始供应商制剂以大约相当的抗体与赋形剂的比率1.4:1(w/w)含有抗体。但是，在组合物4中，调整氨基酸与海藻糖的比率以及伴随的相应抗体与赋形剂的比率，相比于原始制剂，其导致对在升高温度下液体储存期间的稳定功效和制剂粘度显著降低的影响。在组合物3中已经调整了氨基酸与海藻糖的比率，与原始制剂相比，所得抗体与赋形剂比率导致增加的稳定功效和制剂粘度降低，但与组合物4中进一步调整所得的效果相比是较小程度的。
因此，这些数据进一步证实了这样的发现，氨基酸与海藻糖以平衡的比率组合并且同时调整抗体与总赋形剂的比率，就在升高温度下液体储存期间的抗体聚集和特别是片段化而言，对制剂的稳定功效具有强烈影响。此外，除了上述稳定功效外，以这种方式调整组合物导致高浓度的治疗性抗体制剂的制剂粘度显著降低。
实施例6：在加工和液体储存期间对高浓度的治疗性抗体制剂的分子完整性的分析显示，在用于药物产品稳定性的模型中，特定氨基酸和糖的组合物以及氨基酸与糖的比率(w/w)降低了抗体的聚集倾向和特别是片段化倾向。
6.1材料与方法
组合物3和4_1是根据5.1段在实施例5中应用的类似制剂。但是在组合物4_1的情况下，使用HCl代替柠檬酸将pH调节至pH 5.5。根据实施例5中5.1段，两种组合物含有相似的总氨基酸与海藻糖比率。组合物4_2也是根据实施例5的5.1段的组合物4的变体。组合物4_2含有4种碱性氨基酸，精氨酸、甘氨酸、色氨酸和组氨酸，加入另外的氨基酸丙氨酸。组合物4_2中，糖的部分是海藻糖与蔗糖以3:1(w/w)的比率的混合物。甲硫氨酸的量略微增加至3.5g/l，进一步提供另外赋形剂，例如，螯合剂EDTA和抗坏血酸。
组合物4_2中氨基酸与糖的比率略微降低至1:1(w/w)。在原始制剂中，抗体与赋形剂的比率为1.6:1(w/w)，组合物3中比率为1:1.1(w/w)，组合物4_1中比率为1.76:1(w/w)，组合物4_2中为1.12:1(w/w)。将pH调节至5.5。
作为模型蛋白质，根据3.1段和4.1段，使用市售的冷冻-干燥的(Roche；Basel；Switzerland)。通过在期望体积的水中重构市售的冷冻-干燥的来进行样品的制备。
6.1.1样品制备
所得制剂在2-8℃下对原始液体制剂的组合物(79.45g/l海藻糖；3.13g/l组氨酸缓冲液(20mM)；1.49g/l甲硫氨酸；0.4g/l聚山梨酯20；pH 5.5)和对根据6.1段的基于氨基酸的组合物透析。随后浓缩所得IgG制剂获得在原始制剂中135mg/ml抗体，在组合物3中145mg/ml抗体，在组合物4_1中150mg/ml抗体和在组合物4_2中151mg/ml抗体。随后，将制剂无菌过滤，等分到无菌HPLC小瓶中，并在5℃、25℃、30℃和40℃下储存。在储存前、样品制备之后即刻和储存期间指定时间点使用SEC分析聚集和片段化。
6.1.2分子排阻色谱法
根据3.1.2段进行SEC。
6.2结果
液体储存
在原始制剂中已在40℃下的初始储存时间8天后，聚集体和片段的形成显著增加(0.77％聚集体和0.75％片段，分别相比于液体储存之前的0.35％聚集体和无片段)。相反，在测试的所有基于氨基酸的制剂中，在40℃下储存8天明显限制了聚集和片段化。在组合物3中，聚集为0.39％和片段化为0.51％。在组合物4_1中，聚集为0.38％，有趣的是，片段化进一步降低至0.31％。在组合物4_2中，检测到聚集和片段化的进一步略微降低(0.36％聚集和0.28％片段化)，如图21A中所描绘。
该数据确证了先前实验的结果，涉及组合物4(该实施例6中的组合物4_1)进一步降低特别是液体储存期间片段形成的功效。
在30℃下储存1个月后发现可比较的结果。在原始制剂中储存导致0.53％聚集体和0.50％片段。组合物3的相应SEC分析显示0.4％聚集体和0.51％片段。在组合物4_1中在30℃下液体储存1个月导致聚集体形成(0.35％)和片段形成(0.30％)的显著减少。可比较的结果显示在组合物4_2中，具有0.32％的聚集体形成和0.31％的片段形成(图21B)。
在25℃下液体储存6个月后，原始制剂中抗体的聚集增加至0.98％，片段化达到1.00％。在组合物3中，显示较小的增加聚集至0.71％和片段化至0.9％。在组合物4_1和4_2两者中，与原始制剂相比，发现仅接近一半的聚集和片段化；组合物4_1：0.58％聚集体和0.53％片段，组合物4_2：0.58％聚集体和0.56％片段(图22A)。
在2-8℃下液体储存6个月后发现可比较的结果，与在25℃下储存相比，聚集和片段化的变化更小(图22B)。
定量统计分析在组合物4_1和4_2中在25℃下6个月高浓度的抗体制剂(150mg/mL)的整个储存过程，与原始制剂相比，显示聚集体和片段的显著减少(p<0.01)并且在25℃下储存6个月期间保留了稳定的单体峰(图26B)。
使用CEX HPLC另外分析在组合物4_1和4_2中在25℃下储存6个月期间的高浓度的抗体制剂的化学降解图谱，与原始制剂相比，强调了先前的SEC结果和先前实施例的结果。在25℃下储存150mg/mL曲妥珠单抗六个月后，与原始制剂相比，观察到组合物4_1和4_2的更低量的碱性物质(p<0.05，p<0.01)(图27B)。有趣的是，连同限制碱性物质的增加，与实施例5中所示的组合物3和4相比，相同制剂的组合物4_1和4_2也限制了酸性物质的增加。因此，主峰的相对AUC在高浓度的曲妥珠单抗储存期间是稳定的，特别是通过组合物4_2。
总之，这些结果确证氨基酸和糖的平衡的混合物对于在液体储存期间防止抗体聚集和片段化是必要的，并且调整氨基酸与糖的比率为至少氨基酸过量，更优选氨基酸与糖的比率为约1:1(w/w)，导致稳定功效的进一步增加。
实施例7：在加工和液体储存期间对高浓度的治疗性抗体制剂的分子完整性和粘度的分析显示，在用于药物产品稳定性的模型中，特定氨基酸和糖的组合物以及氨基酸与糖的比率(w/w)以及调整色氨酸和组氨酸的浓度和比率(w/w)降低了抗体聚集倾向和特别是片段化倾向。
7.1材料与方法
通过浓缩来自在先实施例的组合物4_2获得组合物4_3、4_4和4_5。组合物4_3与根据实施例6中6.1段的组合物4_2类似，但是在组合物4_3中，总赋形剂从135g/l减少至90g/l。氨基酸与糖混合物的比率保持在1:1(w/w)，抗体与赋形剂的比率为2.22:1(w/w)。在组合物4_4中，使用与实施例6中6.1段的组合物4_2以及该实施例7中的组合物4_3相比类似的氨基酸与糖混合物的混合物，但是氨基酸与糖的比率增加至3.4:1(w/w)，抗体与赋形剂的比率增加至3.33:1(w/w)。在组合物4_5中，也使用相同的赋形剂混合物，但是组氨酸的氨基酸浓度增加且色氨酸的浓度降低。与先前实验中的3:1(w/w)相比，海藻糖与蔗糖的比率降低至2:1(w/w)，氨基酸与糖的比率降低至1.5:1(w/w)。抗体与赋形剂的比率与组合物4_3相当，调整至2.22:1(w/w)。在原始液体供应商制剂的情况下，抗体与赋形剂的比率为2.4:1(w/w)。将pH值调节至5.5。
作为模型蛋白质，使用根据实施例5中5.1段的市售液体治疗性高浓度的抗体(Roche；Basel；Switzerland)。
7.1.1样品制备
为了获得与实施例5和6相比更高浓度的曲妥珠单抗制剂，将原始液体供应商制剂中的抗体浓缩以获得200mg/ml，将组合物4_3、4_4和4_5中的抗体在2-8℃下的另外透析步骤之后浓缩。通过无菌过滤制备高浓度的制剂用于随后的储存实验，并随后等分到无菌HPLC小瓶中。将高浓度的样品在5℃、25℃、30℃和40℃下储存。使用SEC在储存之前、样品制备后即刻以及储存期间指定时间点分析聚集和片段化。
7.1.2分子排阻色谱法
根据3.1.2段进行SEC。
7.1.3高浓度的抗体制剂的粘度测量
根据实施例5中5.1.3段落使用落球粘度计测量根据该实施例的高浓度的抗体制剂的粘度。
7.2结果
样品制备
来自原始容器的未处理的液体曲妥珠单抗制剂的SEC图谱显示仅0.19％的小聚集峰、99.77％的单体峰和0.04％的片段(实施例5；图16)。相反，在将该市售液体治疗性高浓度的浓缩至抗体浓度为约200mg/ml(0.04mg/ml rHuPH20)后，相应的SEC图谱导致显著不同的浓缩样品的SEC图谱。聚集体形成增加至对应聚集体峰的约1.9％的面积百分比。相应的单体峰的面积百分比相应地降低至98.07％。片段化没有改变。在使用透析的另外再缓冲步骤后的，在基于氨基酸的稳定化组合物中配制的相似浓度的抗体，导致与未处理的原始液体曲妥珠单抗制剂相当的SEC图谱，其具有0.16％至0.19％的聚集体，并且片段化没有改变。单体峰的面积百分比为约99.8％。此外，相应的SEC色谱图显示在14分钟的洗脱时间处的峰(其对应抗体的聚集体(二聚体))和在约16.5分钟的洗脱时间处的主峰(其对应结构完整的抗体单体)之间的清楚的基线分离(图17)。
液体储存
有趣的是，在这些特定高浓度的制剂在不同温度下的液体储存的整个过程中，抗体的片段化在原始制剂以及根据本发明的基于氨基酸的组合物中仅是少数事件。该效果可能是抗体与赋形剂比率增加的结果，并且已经在先前的低浓度的曲妥珠单抗制剂中观察到(实施例4；数据未显示)。
在40℃下液体储存3天导致原始制剂中的聚集增加至2.11％聚集体和0.1％片段。在组合物4_3中，该储存期间导致约0.22％的聚集和约0.07％的片段化。在组合物4_4中在40℃下储存3天导致聚集体形成至约0.26％和片段形成为约0.06％。在组合物4_5中，聚集体的含量仅为0.18％和片段化分析为约0.08％(图23A)。
在40℃下进一步液体储存14天导致原始制剂中的聚集体含量为约2.28％和片段化为0.33％。在组合物4_3中，聚集仅为0.43％和片段化接近于0.33％。组合物4_4中获得相当的结果，具有约0.40％的聚集和约0.33％的片段化。同样在组合物4_5中，发现聚集体形成(0.27％)和0.34％的片段形成的相当的结果(图23B)。
在原始制剂中在30℃下长期液体储存一个半月后，聚集体形成为1.84％和片段形成为0.25％。在组合物4_3中，聚集仅为0.28％和片段化为0.23％，与原始制剂相当。在组合物4_4中，聚集体形成略微增加至0.38％和片段形成为约0.22％。在组合物4_5中，在30℃下储存一个半月后，聚集仅为0.22％和片段化达到0.25％(图24A)。
在25℃下实时液体储存3个月导致在原始制剂中约1.89％的聚集体形成和0.25％的片段化。在组合物4_3中，在25℃下长期储存导致0.35％的聚集体和0.22的片段。在25℃下储存3个月后组合物4_4中的聚集略微增加至0.40％，片段形成保持在0.22％。在组合物4_5中，发现0.27％的最低聚集，并且实现相当的片段化为0.25％(图24B)。
在不同温度下抗体的液体储存期间的所有分析时间点，组合物4_5显示出最佳的抗聚集稳定功效。在组合物4_3和组合物4_4中，在不同温度下液体储存期间，抗体的聚集倾向或多或少是相当的，而在组合物4_5中抗体在指定的分析时间点处显示出最低的聚集体形成。组合物4_3和组合物4_4之间，前者显示出稍微更优的稳定功效。
评估高浓度的抗体制剂(200mg/mL)在组合物4_3、4_4和4_5中在25°下3个月储存期间的抗体聚集倾向和片段化倾向以及相关的单体峰丢失，相比于原始制剂，进一步确证了上述详细结果。
对应于抗体二聚体的聚集体峰(洗脱时间≈14分钟)，与原始制剂相比，在组合物4_5中显著降低(p<0.01；p<0.0001)，在组合物4_3和组合物4_4中降低较小程度(p<0.01,p<0.001)(图26C)。在组合物4_4中(最高抗体:赋形剂比率为3.33:1)，与组合物4_3和特别是组合物4_5相比，发现略微更强的聚集，伴随着制剂粘度的增加(图26C；图4)。对200mg/mL没有观察到相关的片段化(图26C)，这可能是由于增加的抗体与赋形剂比率，其已经在低浓度制剂中观察到(参见下文和图25)。基于氨基酸的制剂中的单体峰在25℃下的液体储存期间几乎完全保留。与原始制剂和组合物4_5相比，组合物4_3和4_4证明片段化的最低增加(p>0.05；图26C)。
这些结果表明，组合物改变、组氨酸和色氨酸的浓度改变以及海藻糖于蔗糖比率改变都对稳定功效有积极影响，特别是对聚集。在含有缓冲液浓度中的更高浓度的色氨酸和组氨酸(相比于组合物4_5，参见先前实施例以及组合物4_3和4_4)的基于氨基酸的组合物中，片段化略微减少。相比于源自先前实验的组合物4_2的组合物4_3中的1:1(w/w)，氨基酸:海藻糖/蔗糖混合物的比率在组合物4_4中略微增加(1.5:1(w/w))。
因此，调整色氨酸和组氨酸的浓度与调整氨基酸与糖的比率相一致对于在抗体液体储存期间共同防止聚集和片段化是重要的。此外，组合物4_4中抗体与赋形剂比率大大增加至3.3:1(w/w)导致在液体储存期间抗体的聚集倾向略微增加。平行调整抗体与赋形剂比率显示对根据本发明的基于氨基酸的组合物的稳定功效具有影响。
通过分析在升高温度下液体储存期间抗体的化学降解来进行类似观察。为此，将样品在25℃下储存3个月并使用CEX分析。相比于原始制剂，组合物4_4和4_5导致不显著的酸性电荷变体形成的增加(组合物4_5中的程度最低)，但是碱性电荷变体的形成减少，特别是组合物4_3和4_4(p<0.05)的情况下。主峰面积的丢失部分地被组合物4_3和4_4防止(p>0.05)，并且与组合物4_5中的原始制剂相当(图27C)。两种选定的氨基酸组氨酸和色氨酸之间的w/w比率反复改变，导致改进的酸性和碱性电荷变体形成(图27C)。
粘度测量
为了分析与实施例5相比更高浓度的抗体制剂的动态粘度，根据该实施例的7.1.1段中的样品制备方法将制剂的浓度调整至200mg/ml和220mg/ml(图25)。原始液体供应商制剂中的高浓度的抗体制剂(220mg/ml)的动态粘度评估为20.53mPa*s。根据本发明的含有220mg/ml抗体浓度的组合物4_3和4_5中，测量的动态粘度在组合物4_3中显著降低至15.2mPa*s，在组合物4_5中显著降低至17.6mPa*s。在组合物4_4的情况下，评估的粘度略微增加，为22.4mPa*s。这可以是与组合物4_3和4_5相比，在该组合物中的3.7:1的高抗体与赋形剂比率的结果。抗体浓度为200mg/ml的相应制剂的粘度测量也导致明显降低的粘度，在组合物4_3中为11.2mPa*s，在组合物4_4中为15.4mPa*s和在组合物4_5中为11.6mPa*s。在抗体浓度为200mg/ml的情况下，组合物4_4也显示出与其它制剂相比略微增加的粘度，表明在具有220mg/ml抗体浓度的组合物4_4中评估的相同趋势。与高浓度的抗体(200mg/ml)的液体储存期间组合物4_4的略微降低的稳定功效一起，这些数据进一步证实了发现除了平衡调整氨基酸与糖的比率外，平衡调整抗体与赋形剂的比率也对稳定功效和制剂粘度两者具有显著影响。
实施例8：在加工期间和随后液体储存期间对高浓度的抗体制剂的分子完整性以及化学稳定性的分析显示，不包含脯氨酸的特定氨基酸和糖的组合物能在加工期间以及随后液体储存期间降低聚集倾向。特别是与包含甘氨酸和脯氨酸的冷冻干燥产品的原始曲妥珠单抗制剂相比，化学变化显著降低。
8.1材料与方法
组合物4_1对应于实施例6中应用的制剂，组合物4_3和4_5对应于实施例7中应用的制剂。将这些制剂的稳定功效与原始液体供应商制剂(79.45g/l海藻糖；3.13g/l组氨酸缓冲液20mM；1.49g/l甲硫氨酸；0.4g/l聚山梨酯20；pH 5.5)相比。将这些制剂中的pH调节至5.5。此外，将本发明组合物的稳定效果与根据美国专利US 9,364,542 B2的教导添加氨基酸甘氨酸和脯氨酸的冷冻-干燥产品的原始供应商制剂(20g/l海藻糖；0.9mg/ml组氨酸缓冲液约5mM；0.1g/l聚山梨酯20；pH 6)比较(实施例16；图29和30)。
作为模型药物，使用市售的冷冻-干燥的(Roche；Basel；Switzerland)，其为治疗性人源化IgG1单克隆抗体(曲妥珠单抗)。在期望体积的水中重构冷冻-干燥的药物产生原始供应商制剂(20g/l海藻糖；0.9mg/ml组氨酸缓冲液约5mM；0.1g/l聚山梨酯20；pH6)中的抗体浓度为21mg/mL。
8.1.1样品制备
将所得制剂在2-8℃下对原始液体制剂(79.45g/l海藻糖；3.13g/l组氨酸缓冲液20mM；1.49g/l甲硫氨酸；0.4g/l聚山梨酯20；pH 5.5)和冷冻-干燥产品的原始供应商制剂(20g/l海藻糖；0.9mg/ml组氨酸缓冲液约5mM；0.1g/l聚山梨酯20；pH 6)的组合物透析，其中该制剂另外含有如美国专利US 9,364,542 B2中所述浓度的氨基酸甘氨酸和脯氨酸(实施例16)。
平行地，如8.1段中所详述的，对本发明的基于氨基酸的组合物进行透析。随后进行浓缩所得IgG制剂以获得200mg/ml抗体。随后，将制剂无菌过滤，等分至无菌HPLC小瓶中，并如美国专利US 9,364,542 B2中所述的在25℃或40℃下储存，或在55℃下短期储存(实施例16；图29和30)。在储存前、样品制备之后即刻和储存期间指定时间点使用SE-HPLC分析聚集和片段化。使用CEX-HPLC分析经液体储存的蛋白质分子中的化学变化。
8.1.2分子排阻色谱法
如上述3.1.2部分所述进行SEC。
8.1.3阳离子交换色谱法
CEX-HPLC(UV-280nm检测器；UHPLC UltiMate3000 Thermo Scientific,Germany)和阳离子交换柱TSK-gel CM-STAT 4.5×100mm(Tosoh Bioscience,Tokyo,Japan)，在45℃下使用，流速0.8ml/min(注射体积为25μl)。在CEX-HPLC分析之前，将样品在运行缓冲液A(10mM磷酸钠缓冲液pH 7.5)中稀释至2.5mg/mL IgG。使用0％至30％缓冲液B(10mM磷酸钠缓冲液pH 7.5；100mM氯化钠)在氯化钠梯度中洗脱固定的曲妥珠单抗分子。用Chromeleon7色谱数据软件(Thermo Scientific)测定相对曲线下面积(％AUC)。
8.2结果
样品制备
在使用透析的样品制备和随后浓缩以获得200mg/mL抗体浓度的过程期间，确证了先前获得的实施例3、5和7的结果。具体地，当制备过程在本发明组合物(组合物4_1、组合物4_3或组合物4_5)之一中进行时，获得与曲妥珠单抗标准品(0.65-0.70％聚集体；99.30-99.35％单体)相当的聚集体和单体的量的保留。这些结果表明，在本发明组合物中制备的抗体的结构完整性的保留与制备前结构完整抗体的水平相当(图28)。
另一方面，在原始液体供应商制剂中制备高浓度抗体的过程导致对应于抗体二聚体的峰(即，在14分钟的保留时间处)的面积百分比增加至约0.84％，单体峰相应减少至约99.16％。此外，冷冻-干燥产品的原始供应商制剂中的高浓度的曲妥珠单抗与另外的氨基酸甘氨酸和脯氨酸组合的相应制备过程也导致聚集体形成大大增加至约0.79％，因此，单体峰减少至99.21％。
液体储存-SE-HPLC
如US 9,364,542 B2中进行的在极端(即生理学和药学上无关的高)温度条件(在55℃下24小时)下短期液体储存抗体，显示了，相比于原始液体供应商制剂以及具有甘氨酸和脯氨酸作为添加剂的冷冻-干燥产品的原始供应商制剂，本发明组合物对聚集和片段化的有效稳定功效。在本发明组合物中，对应于聚集体形成的峰的面积百分比几乎完全保留，特别是在组合物4_3和组合物4_5中，其相当于在-80℃下储存的曲妥珠单抗标准品(0.65-0.70％聚集体；99.30-99.35％单体)。
相反，在具有添加剂甘氨酸和脯氨酸的原始供应商制剂中，更明显的，在原始液体供应商制剂中，在55℃下短期储存24小时，导致聚集的显著增加和单体峰的面积百分比的更明显的降低(图29；表1；2；t＝0)。作为在55℃下短期储存24小时的结果，相比于在本发明组合物中配制的抗体，原始液体供应商制剂以及具有甘氨酸和脯氨酸作为添加剂的冷冻-干燥产品的原始供应商制剂中的片段化也略微增加(表1)。
在40℃/75％RH下分别液体储存7天、14天、28天和42天，显示了在所有制剂中抗体的聚集倾向以及片段化倾向的增加，但增加程度不同。最引人注目的是，与原始液体供应商制剂以及原始供应商制剂与氨基酸甘氨酸和脯氨酸的组合相比，本发明组合物(组合物4_1、组合物4_3和组合物4_5)中的抗体的制剂导致显著减少的聚集和片段化(图29C和D；表1和2)。
此外，在25℃下液体储存14天和28天进一步证实了本发明的溶液能够在环境温度和升高温度下以及甚至在诸如55℃的极端温度条件下的储存过程中防止聚集和片段化的观察结果(表3，4)。
液体储存-CEX-HPLC
美国专利US 9,364,542 B2中，仅分析使用浊度测量的抗体的肉眼可见的不溶性聚集体的形成，并且在一些实施例中，在诸如55℃的生理学和药学上无关的高温条件下短期储存期间使用SE-HPLC分析可溶性聚集体的形成。在此，另外分析了在55℃下短期储存期间以及在40℃和25℃下长期储存期间抗体分子中化学变化的程度。在所有制剂中，已在55℃下短期储存曲妥珠单抗24小时引发不同程度的化学变化。
在添加氨基酸甘氨酸和脯氨酸的冷冻-干燥产品的原始供应商制剂(原始+G/P)中，在55℃下短期储存期间观察到抗体的酸性电荷变体百分比显著增加(>30％)。因此，如表5中所示，该观察结果与主峰面积百分比的显著降低(53.23％)相关。
相反，在根据本发明的组合物中短期储存抗体导致酸性电荷变体的形成显著减少(例如，组合物4_5中<23％)。酸性电荷变体的增加提供了蛋白质脱酰胺或糖化的证据，并且是在工业制造标准中否定选择测试制剂的重要标准。因此，与原始+G/P相比，测试根据本发明的不同组合物以研究在55℃下储存三天、在40℃下储存至21天以及在25℃下储存至两个月期间的酸性电荷变体的改进(图30)。在所有分析时间点和所有储存温度下，根据本发明的所有测试组合物通常导致比原始+G/P显著更低的酸性电荷变体。因此，在所有分析时间点和温度下，根据本发明的所有制剂中的主峰相应地更高(表5)。
实施例9：通过SE-HPLC方法分析高浓度的抗体制剂(200mg/mL)在透析、浓缩和随后储存后的分子完整性，显示单独或与海藻糖组合的至少三种氨基酸的组合对于限制制备相关加工步骤和随后储存中聚集体的增加的相关性。
9.1材料与方法
组合物5含有组氨酸和甲硫氨酸两种碱性氨基酸，并且与组合物8类似，其对应于原始供应商制剂(组氨酸、甲硫氨酸、海藻糖)，除了其不含任何糖。组合物6包含组氨酸、甲硫氨酸和甘氨酸三种氨基酸，不含糖，而组合物9类似但含有海藻糖。组合物7包含组氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、精氨酸和色氨酸五种氨基酸，而组合物10类似但含有海藻糖。
作为模型蛋白质，使用市售液体治疗性高浓度的抗体(Roche；Basel；Switzerland)，其含有曲妥珠单抗，在原始供应商制剂(79.45g/l海藻糖；3.13g/l组氨酸缓冲液20mM；1.49g/l甲硫氨酸；0.4g/l聚山梨酯20；0.024g/l rHuPh20(重组人透明质酸酶)，pH 5.5)中浓度为120mg/ml。
9.1.1样品制备
将液体治疗性高浓度的抗体在2-8℃下对pH 5.5的5mM组氨酸缓冲液透析。在测定蛋白质浓度后，随后将蛋白质浓度调整至100mg/ml，将抗体配制于根据9.1段的组合物以及原始液体供应商制剂中，其通过将透析的高浓度抗体使用1.25倍浓缩的制剂以1比5稀释至20mg/ml的抗体浓度。对于用高浓度的抗体制剂的实验，将选择性组合物和原始液体供应商制剂中配制的抗体浓缩至200mg/ml。随后，将制剂无菌过滤并等分至无菌HPLC小瓶中，并在45℃下储存长达14天。在储存前、透析后即刻、浓缩步骤后即刻和液体储存期间储存7天和14天后，使用SE-HPLC分析聚集和片段化。
9.1.2分子排阻色谱法
根据3.1.2段进行SEC。
9.2结果
液体储存-SE-HPLC
如表6中所示，在之前的透析和浓缩步骤后，在45℃下储存7天后观察到增加的聚集。令人惊讶地发现，与包含三种氨基酸的组合物(7天后为0.53％；14天后为1.11)相比，以及与包含五种氨基酸的组合物(7天后为0.4％；14天后为0.88％)相比，具有两种氨基酸且不含糖的制剂通常展现出最高值(例如，7天后为0.65％；14天后为1.29％)。相应的主峰是稳定的(表6)。当相同的氨基酸组合补充海藻糖时，确证了该观察结果。具体地，与包含三种氨基酸的组合物(7天后为0.43％；14天后为0.93％)相比，以及与包含五种氨基酸的组合物(7天后为0.34％；14天后为0.8％)相比，具有两种氨基酸含海藻糖的制剂(对应于原始制剂)通常展现出最高值(例如，7天后为0.57％；14天后为1.07％)。相应的主峰是稳定的(表6)。
实施例10：
通过SE-HPLC方法分析在不断搅拌长达14天的模型中的机械压力后的曲妥珠单抗(20mg/ml)的分子完整性，显示至少三种定制氨基酸组合对于限制在制备相关加工步骤中的聚集增加的相关性，并且优于原始供应商制剂。
10.1材料与方法
原始供应商制剂含有组氨酸、甲硫氨酸和海藻糖。组合物11含有组氨酸和甲硫氨酸两种碱性氨基酸，不含海藻糖。组合物12含有组氨酸、甲硫氨酸和丙氨酸三种氨基酸。组合物13含有组氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、精氨酸和色氨酸五种氨基酸。
抗体制剂在限定的搅拌模型中经历机械压力。在该模型中，将样品转移到无菌PCR小瓶中并在黑暗中以750转/分钟搅拌长达14天。
作为模型蛋白质，使用市售液体治疗性高浓度的抗体(Roche；Basel；Switzerland)，其含有曲妥珠单抗，在原始供应商制剂(79.45g/l海藻糖；3.13g/l组氨酸缓冲液20mM；1.49g/l甲硫氨酸；0.4g/l聚山梨酯20；0.024g/l rHuPh20(重组人透明质酸酶)，pH 5.5)中浓度为120mg/ml。
10.1.1样品制备
将液体治疗性高浓度的抗体在2-8℃下对原始液体制剂的组合物(79.45g/l海藻糖；3.13g/l组氨酸缓冲液(20mM)；1.49g/l甲硫氨酸；0.4g/l聚山梨酯20；pH 5.5)和对pH 5.5的5mM组氨酸缓冲液透析。在测定蛋白质浓度后，随后将蛋白质浓度调整至20mg/ml，将抗体配制于根据10.1段的组合物中。随后，将制剂转移至PCR小瓶中并根据10.1中概述的方法搅拌。在搅拌前、搅拌14天后通过SE-HPLC分析的聚集和片段化值如表7中所示。
10.1.2分子排阻色谱法
根据3.1.2段进行SE-HPLCC。
10.2结果
液体储存-SE-HPLC
如表7中所示，在搅拌14天后观察到增加的聚集。令人惊讶地发现，具有一种或两种氨基酸且不含糖的制剂通常展现出最高值(例如，在包含组氨酸、甲硫氨酸和海藻糖的原始制剂中为0.32％；在包含组氨酸和甲硫氨酸但不含海藻糖的组合物x中为0.36％)。
相比于具有两种氨基酸的组合物，包含三种氨基酸的组合物展现出更低的聚集值。如表7中代表性所示，具有组氨酸、甲硫氨酸和丙氨酸的组合物#x导致聚集值为0.62％。包含五种氨基酸的组合物导致聚集值为0.24％。相应主峰是稳定的(表7)。
表
表1：在原始液体供应商制剂和添加有氨基酸甘氨酸和脯氨酸的冷冻干燥产品的原始供应商制剂中配制的高浓度的曲妥珠单抗在样品制备后即刻(t＝0)以及在55℃和40℃下液体储存期间的指定时间点的SE-HPLC分析—SE-HPLC色谱图中相应峰下以面积百分比表示的聚集体、单体和片段的定量。
表2：在根据本发明的组合物中配制的高浓度的曲妥珠单抗在样品制备后即刻(t＝0)以及在55℃和40℃下液体储存期间的指定时间点的SE-HPLC分析—SE-HPLC色谱图中相应峰下以面积百分比表示的聚集体、单体和片段的定量。
表3：在原始液体供应商制剂和添加有氨基酸甘氨酸和脯氨酸的冷冻干燥产品的原始供应商制剂中配制的高浓度的曲妥珠单抗在样品制备后即刻(t＝0)以及在25℃下液体储存期间的指定时间点的SE-HPLC分析—SE-HPLC色谱图中相应峰下以面积百分比表示的聚集体、单体和片段的定量。
表4：在根据本发明的组合物中配制的高浓度的曲妥珠单抗在样品制备后即刻(t＝0)以及在25℃下液体储存期间的指定时间点的SE-HPLC分析—SE-HPLC色谱图中相应峰下以面积百分比表示的聚集体、单体和片段的定量。
原始+G/P 组合物_4_1 组合物_4_3 组合物_4_5
t＝0 67,10 68,52 67,99 68,14
24h55℃ 53,23 58,26 57,11 56,87
3d55℃ 32,22 41,72 41,05 40,22
1.5d40℃ 58,97 63,36 63,10 62,96
3d40℃ 56,88 63,44 62,97 62,95
7d40℃ 46,32 55,62 55,61 53,99
14d40℃ 30,53 43,10 43,14 41,87
21d40℃ 21,35 35,05 34,01 33,68
7d25℃ 62,58 66,90 66,47 66,38
14d25℃ 57,02 64,31 64,04 64,01
28d25℃ 48,98 60,93 60,89 60,06
42d25℃ 41,67 55,89 55,79 54,75
2个月25℃ 35,65 50,63 50,44 49,59
表5：在补充有氨基酸甘氨酸和脯氨酸的冷冻干燥产品的原始供应商制剂(原始+G/P)和根据本发明的组合物4_1、4_3和4_5中配制的高浓度的曲妥珠单抗在样品制备后即刻(t＝0)以及在55℃、40℃和25℃下液体储存期间的指定时间点的CEX-HPLC色谱图的主峰。主峰表示为相应色谱图峰下的面积百分比。
表6：在根据本发明的组合物中配制的高浓度的曲妥珠单抗在样品制备后即刻(t＝0)以及在45℃下液体储存期间的指定时间点的SE-HPLC分析—SE-HPLC色谱图中相应峰下以面积百分比表示的聚集体、单体和片段的定量。
表7：在原始供应商制剂或在根据本发明的组合物中配制的曲妥珠单抗(20mg/ml)在样品制备后即刻(t＝0)以及14天搅拌后的SE-HPLC分析—SE-HPLC色谱图中相应峰下以面积百分比表示的聚集体、单体和片段的定量。

Claims (17)

1.生产包含感兴趣的生物分子的生物制药药物产品的方法，所述方法包括：
(a)制备所述感兴趣的生物分子的药物物质的第一阶段，所述第一阶段包括选自以下的至少一种加工步骤：
(a1)收集，
(a2)纯化，
(a3)再缓冲，和
(a4)富集，
其中该第一阶段中的所述至少一种加工步骤在包含至少三种氨基酸的组合物的存在下进行，
其中所述至少三种氨基酸的组合提供至少一个带正电的官能团、至少一个抗氧化官能团、至少一个渗透功能和至少一个缓冲功能；和
(b)进一步加工(a)中制备的所述药物物质以获得生物制药药物产品的第二阶段，所述第二阶段包括选自以下的至少一种加工步骤：
(b1)再缓冲，
(b2)冷冻，
(b3)解冻，和
(b4)填充；
其中该第二阶段中的所述至少一种加工步骤在包含以下的组合物的存在下进行：
(i)至少三种氨基酸，其中所述至少三种氨基酸的组合提供至少一个带正电的官能团、至少一个抗氧化官能团、至少一个渗透功能和至少一个缓冲功能；和
(ii)一种或多种糖；
氨基酸:糖的比率为10:1至1:100(w/w)。
2.权利要求1的方法，其中进一步加工(b)中获得的所述生物制药药物产品以作为液体制剂用于储存和/或给药。
3.权利要求2的方法，其中所述液体制剂用于以0.001至<100mg/ml的浓度储存和/或给药所述生物制药药物产品，且其中所述制剂的特征在于其包含：
(i)至少三种氨基酸，其中所述至少三种氨基酸的组合提供至少一个带正电的官能团、至少一个抗氧化官能团、至少一个渗透功能和至少一个缓冲功能，和
(ii)一种或多种糖；
且其中所述氨基酸和所述糖之间的比率调整为4:1至1:2(w/w)。
4.权利要求2的方法，其中所述液体制剂用于以100至500mg/ml的高浓度储存和/或给药所述生物制药药物产品，且其中所述制剂的特征在于其包含以下赋形剂：
(i)至少三种氨基酸，其中所述至少三种氨基酸的组合提供至少一个带正电的官能团、至少一个抗氧化官能团、至少一个渗透功能和至少一个缓冲功能，和
(ii)一种或多种糖；
且其中所述氨基酸和所述糖之间的比率调整为4:1至1:1(w/w)。
5.权利要求3或4的方法，其中进一步调整所述液体制剂使得所述感兴趣的生物分子与(i)的至少三种氨基酸之间的比率为3.5:1至1:2(w/w)。
6.权利要求1的方法，其还包括：
(c)干燥(b)中获得的所述生物制药药物物质以获得干燥的生物制药药物产品的第三步骤，其中
在该第三阶段中的所述干燥步骤在包含以下的组合物的存在下进行：
(i)至少三种氨基酸，其中所述至少三种氨基酸的组合提供至少一个带正电的官能团、至少一个抗氧化官能团、至少一个渗透功能和至少一个缓冲功能，和
(ii)一种或多种糖；
且其中所述感兴趣的生物分子和总赋形剂之间的比率调整为1:1至1:10(w/w)。
7.权利要求6的方法，其中(b)中获得的所述生物制药药物产品的所述干燥是通过冷冻干燥、喷雾干燥或喷雾-冷冻干燥。
8.权利要求6或7的方法，其中将步骤(c)中获得的所述干燥的生物制药药物产品灭菌，优选最终灭菌。
9.权利要求6至8中任一项的方法，其还包括重构步骤(c)中获得的所述干燥的生物制药药物产品以获得液体制剂的步骤，
其特征在于在组合物中将所述干燥的生物制药药物产品重构以获得液体生物制药药物产品，所述组合物包含：
(i)至少三种氨基酸，其中所述至少三种氨基酸的组合提供至少一个带正电的官能团、至少一个抗氧化官能团、至少一个渗透功能和至少一个缓冲功能，和
(ii)一种或多种糖；
所述氨基酸和所述糖之间的比率为4:1至1:1(w/w)。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其中步骤(a)中的所述组合物含有0.5mg/ml至10mg/ml的色氨酸和0.5mg/ml至30mg/ml的组氨酸。
11.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述感兴趣的生物分子选自蛋白质和肽及其混合物。
12.权利要求11的方法，其中所述感兴趣的生物分子是抗原。
13.通过权利要求1至12中任一项的方法获得或可获得的生物制药药物产品。
14.权利要求13的生物制药药物产品，其用于疫苗接种。
15.权利要求3、4、5、6和9的方法，其中所述氨基酸和所述糖之间的比率调整为10:1至100:1。
16.权利要求5和6的方法，其中所述感兴趣的生物分子和所述总赋形剂之间的比率调整为1:1至1:500。
17.通过权利要求1至16中任一项的方法获得或可获得的生物制药药物产品。
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