CN103620025A - 病毒或细菌的新型稳定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种稳定病毒或细菌的方法,所述方法包括将所述病毒或细菌包埋在水溶液中,其中,所述溶液包含:(i)至少3种不同氨基酸或(ii)至少一种二肽或三肽,并且其中所述溶液不含或基本上不含糖、硅烷和蛋白。
Description
本发明涉及一种稳定病毒或细菌的方法,所述方法包括将所述病毒或细菌包埋在水溶液中,其中,所述溶液包含:(i)至少3种不同氨基酸;或(ii)至少一种二肽或三肽,并且其中所述溶液不含或基本上不含糖、硅烷和蛋白。
在本说明书中,引用了多篇文献,包括专利申请和制造商的手册。这些文献的公开内容虽然据认为与本发明的专利性无关,但还是通过参考方式整体并入本文。更具体而言,所参考的所有文献以等同于各篇文献明确且单独指出通过参考方式整体并入本文的方式并入本文。
所有病毒的共性在于它们需要宿主细胞以进行复制。因此,病毒需要感染细胞或细菌,并在细胞或细菌中立即启动宿主细胞的复制机构或保持不确定时间的静默。为了感染宿主细胞,病毒已经进化出了附着至细胞膜的机制,在细胞膜处病毒包膜或衣壳中的分子与宿主细胞膜的特异性分子相互作用,这是后续入侵步骤的先决条件。在该步骤中,病毒可利用不同策略。例如,在具有包膜的RNA和DNA病毒的情况下,病毒的包膜融合形成含有病毒基因组的亚细胞区室。然后病毒基因组被释放到宿主细胞中,在那里(例如在DNA病毒如疱疹病毒的情形中)病毒DNA可合并到宿主细胞DNA中。当基因组由基因组型RNA组成时,例如脊髓灰质炎病毒的情形,RNA被直接翻译以合成病毒特异性蛋白和病毒聚合酶。有一些已经得到充分描述的细胞侵袭的机制和复制机制,其可用于病毒分类。此外,在不同病毒类型之间,病毒的合成步骤和病毒由宿主细胞释放所涉及的机制(如细胞溶解)也有差异。
宿主细胞入侵和复制均取决于病毒和宿主细胞之间的分子相互作用。在附着过程中,病毒包膜上的粘附分子可以例如与宿主细胞膜上的相应配对物通过紧密结合而相互作用。例如,鼻病毒的分子可结合至宿主细胞膜上的细胞间附着分子-1。在甲型流感的情况下,病毒分子神经氨酸酶和血凝素对于宿主细胞膜相互作用和病毒基因组解包是重要的。
换言之,病毒携带大量的分子,这些分子使得感染和复制以复杂顺序的生物分子反应来进行。因此,当单一的分子反应不发生或不正确地发生时,这些反应是不充分的。一般来说,病毒在如离体等非生理状态下非常不稳定。如高温等物理条件、干燥条件或照射通常导致病毒灭活,而包膜病毒通常比非包膜病毒对这些条件更敏感。
病毒已经进化出免疫逃逸机制,以便在成功感染宿主细胞和复制之后避免被宿主免疫系统杀害。类似地,免疫系统也已经进化出了识别病毒或病毒感染的细胞的机制。重要作用的是通过主要组织相容性复合体(MHC)系统将病毒抗原肽呈递在抗原呈递细胞如树突状细胞或单核细胞/巨噬细胞等的表面膜上。对于许多病毒而言,已经鉴定了具有抗原潜力的分子,并用于疫苗的开发。这些抗原被宿主的抗原呈递细胞加工以与表面上的MHC分子一起呈递。如CD4和CD8淋巴细胞等免疫细胞识别所呈递的病毒肽,并且通过抗原呈递细胞表面膜上的共刺激分子的支撑,病毒特异性淋巴细胞扩增以形成对抗病毒的防线。因此,与疫苗开发相关的病毒抗原需要处于天然条件下,从而在宿主中引发强力的免疫反应。
作为另一种选择,已开发出了经遗传修饰的生物(GMO)如携带疫苗相关基因的病毒载体。例如,腺病毒、巨细胞病毒、牛痘病毒被用于细胞转染和免疫疗法。病毒载体可以携带对具有较高作为抗病毒或抗癌疫苗的潜力的蛋白进行编码的基因。用于接种的GMO应该在体外和体内均保持其感染性,并且必须使所转染基因的蛋白生物合成能触发靶特异性蛋白的表达和免疫反应。
在疫苗的开发和生产中需要考虑的基本方面有(Morefield GL,A rationaleapproach for the development of vaccine formulations,AAPS Journal,2011;DOI:10.1208/s12248-011-9261-1):(1)进行病毒的体外繁殖和储存的正确条件,以避免感染性和复制的丧失、机械损伤或物理损坏。在这方面,期望的是产生大量的具有高稳定性、感染性、复制和抗原性的病毒。(2)出于安全原因,灭活步骤(即减毒)是重要的,但缺点是抗原改变继而导致抗原性丧失的可能性增加。(3)储存条件应该允许大量的病毒能够恢复。(4)在使用适当的佐剂和稳定剂配制疫苗时需要确保病毒疫苗的安全和疗效。(5)疫苗的生产应越经济越好。
US2011/0081380描述了一种疫苗组合物,其包含灭活的全病毒和包含有多种成分的复杂的稳定用赋形剂,所述多种成分包括缓冲溶液、必需和非必需氨基酸的混合物、二糖、多元醇、螯合剂、脲或脲衍生物和非离子型表面活性剂。据描述此组合物具有优点,因为它取代了含有动物来源的产品(如蛋白)的现有技术的赋形剂,以便降低可能的生物安全问题和/或与使用这样产品相关的过敏风险。
EP2119451A1描述了流感疫苗的冷冻干燥制剂,其中所述疫苗得到稳定化。如EP2119451A1的实施例所示,在特定的pH和成分比例的条件下,在冷冻干燥制剂中可维持流感HA疫苗的活性。EP0090886A2也显示蛋白水解物、氨基酸及其组合对病毒疫苗成分(即神经氨酸酶)有稳定化效果。然而,EP2119451A1和EP0090886A2均关注病毒组分(即,流感HA疫苗或神经氨酸酶)的稳定,而不是针对保持其感染性、复制能力和/或抗原性的整个病毒的稳定。
WO2010/115835描述了一种包含氨基酸或二肽/三肽的组合物,其用于稳定固定在固体载体上的生物分子,其中,生物分子可以是包含在例如细胞、组织、病毒以及其片段(例如细胞器、膜或衣壳)等结构中或所述结构上的分子等等。另外,国际申请WO2010/112576描述了封闭的无菌容器,其包含作为稳定剂的载体和可逆地附着至所述载体的至少一种生物分子。所述生物分子例如可以是包含在例如细胞、组织、病毒以及其片段等结构中或所述结构上的分子。然而,这些申请中尚未设想对于全病毒或细菌的稳定,特别是对其生活力和生物活性(例如繁殖、感染性及抗原性)的维持。
WO2009/059784描述了制造携带有生物材料的固体涂布载体的方法,其中,所述生物材料是通过硅烷或类似的适当偶联剂与载体偶联。因此,该生物材料包埋在载体上的保护性基质中,其例如用于治疗(如体液的解毒),或用于诊断(例如体液中毒素或特定的细胞群的检测)。由于生物材料固定在固体载体上,因此所附着的生物材料无需释放进入体液中即可实现所述治疗或诊断效果,从而将由活性生物物质的循环所引起的药代动力学的问题最小化。
尽管为提供适当的存储病毒和细菌的方法进行了大量的研究,但现有技术中已知方法有相关的显著缺点,例如,它们涉及使用动物来源的物质或未明确限定的组分,要求困难的制备步骤,是成本密集型的,而且最重要的是不能保持病毒或细菌的所需特性。因此,仍然需要提供用于储存此类生物体(例如在免疫制剂和疫苗中应用的生物体)的制剂,所述生物体可长时间地在各种应激条件下存储,而不会丧失生活力和/或生物体复制的能力和/或生物体感染的潜力。
该需要通过提供权利要求书中限定的实施方式而得到解决。
因此,本发明涉及一种稳定病毒或细菌的方法,所述方法包括将所述病毒或细菌包埋在水溶液中,其中,所述溶液包含:(i)至少3种不同氨基酸;或(ii)至少一种二肽或三肽,并且其中所述溶液不含或基本上不含糖、硅烷和蛋白。
本文所用的术语“病毒”是指只能在生物体的活细胞内复制的小型感染剂。病毒感染从动物和植物到细菌和古细菌的所有类型的生物。病毒颗粒有不同的形状和大小(0.02微米至0.3微米),并包含形成病毒基因组的双链或单链的RNA或DNA。病毒有不同的结构,但核酸总位于由蛋白外衣(衣壳或外壳)包围的病毒粒子内。核酸和蛋白的复合物(核苷酸衣壳)可以是病毒的整个结构(例如(RNA细菌病毒)或(DNA细菌病毒)),但也存在更复杂的结构。该包膜病毒可以具有围绕衣壳的脂质和蛋白膜,而复杂的病毒不仅具有二十面体头部也具有螺旋尾部,在该尾部内有多达20种蛋白。病毒的非限制性实例包括流感病毒、脊髓灰质炎病毒、和腺病毒、虫媒病毒、星状病毒、噬菌体、肠病毒、胃肠炎病毒、汉坦病毒、柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒(例如,爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)和单纯疱疹病毒ES(HSV))、诺瓦克病毒、脊椎动物痘病毒亚科(即,5型正痘病毒、牛痘病毒、MVA、NYVAC、禽痘病毒、金丝雀痘病毒、ALVAC、ALVAC(2)、禽痘病毒)、弹状病毒、呼肠孤病毒、鼻病毒、轮状病毒、逆转录病毒、杆状病毒科、杯状病毒科、花椰菜花叶病毒科、冠状病毒科、丝状病毒科、黄病毒科、嗜肝病毒科、野田村病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳头瘤毒科、细小病毒科、藻类去氧核糖核酸病毒科、微小核糖核酸病毒科和披膜病毒科,以及源自这些病毒的修饰病毒。其它适合的病毒是本领域中已知的,例如Fields等在Virology(第34版,Lippincott Williams&Wilkins(2001))中所描述。
如本文所用,术语“细菌”涉及通常只有几微米长度的原核细胞,其具有宽范围的形状,包括例如球状、棒状和螺旋状。一些细菌物种以单细胞形式存在,另一些以特定方式缔合:奈瑟菌属例如形成二重体(对),链球菌属形成链,葡萄球菌属成簇团聚在一起。细菌也可以伸长形成丝状,例如放线菌属。丝状细菌往往由含有许多个体细胞的鞘包围。细菌通常被表征为革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌,并且大多数细菌可被分类为属于以下四组中的一组:革兰氏阳性球菌、革兰氏阳性杆菌、革兰阴性球菌和革兰氏阴性杆菌。细菌的非限制性实例包括埃希氏菌属物种、克雷伯氏菌属物种、沙门氏菌属物种、芽孢杆菌属物种、链霉菌属物种、链球菌属物种、志贺氏菌属物种、葡萄球菌属物种和假单胞菌属物种。这些属的物种的非限制性实例包括埃希氏大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、枯草芽孢杆菌、伤寒沙门氏菌、金色链霉菌、变异链球菌、肺炎链球菌和丁香假单胞菌。
术语病毒和细菌在本文中也称为"本发明的生物体"。
根据本发明,术语“稳定”涉及本发明的生物体的生物活性的维持。对病毒或细菌的这种保护在存储过程中特别有用,例如在冷冻或干燥本发明的生物体时。当本发明的生物体在包埋到本发明溶液中后具有与所述生物的天然存在的活性相同或基本相同的活性时,所述本发明的生物体被认为保持它的“生物活性”。生物活性取决于所采用的特定的病毒或细菌,并且包括例如复制的能力和/或它们的感染能力和/或它们的抗原性。术语“基本上相同的生物活性”是指所述生物的生物活性是该生物天然存在的生物活性的至少75%、更优选至少85%、最优选至少95%。更优选地,该生物的生物活性是该生物天然存在的生物活性的至少98%,更优选100%。测试生物是否稳定的方式是本领域技术人员公知的,包括但不限于:测试的病毒传染性潜力(感染性);培养中的病毒或细菌(即复制速率)或其抗原性。示例性方法在如所附实施例中所示。
如本文使用的术语“包埋(embedding)”涉及将本发明的生物体插入到所述溶液中。优选地,所述材料被完全包埋在该溶液中。
如本文使用的术语“水溶液”是本领域技术人员众所周知的,涉及其中溶剂是水的溶液。
术语“氨基酸”根据本发明涉及具有羧基、氨基和侧链的有机分子,侧链随不同的氨基酸而不同。氨基酸是蛋白的基本构成单位。按照本发明,术语“氨基酸”是指至未相互结合形成低聚或聚合物(如二肽、三肽、寡肽或多肽)的游离氨基酸。
本发明的溶液所含的氨基酸可选自天然存在的氨基酸以及人工氨基酸或这些天然存在或人工氨基酸的衍生物。
天然存在的氨基酸例如有20种蛋白氨基酸:甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苏氨酸和色氨酸。其他天然存在的氨基酸例如有肉毒碱、肌酸、肌酸酐、胍基乙酸、鸟氨酸、羟基脯氨酸、同型半胱氨酸、瓜氨酸、羟基赖氨酸或β-丙氨酸。
人工氨基酸是具有不同侧链长度和/或侧链结构和/或在不同于α-C原子的位置具有胺基的氨基酸。
氨基酸的衍生物包括但不限于N-乙酰基色氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基苏氨酸、膦酰基酪氨酸、黑色素、精氨琥珀酸及它们的盐以及DOPA。
在与本发明相关联时,所有术语还包括各氨基酸的盐。
根据本发明,溶液中包含3种以上彼此不同的氨基酸。例如,术语“至少3种不同氨基酸”还涉及至少4种不同的氨基酸,如至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种不同的氨基酸或更多,例如至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17或至少18种不同的氨基酸。该术语还包括恰好3种、恰好4种、恰好5种、恰好6种、恰好7种、恰好8种、恰好9种、恰好10种、恰好11种、恰好12种、恰好13种、恰好14种、恰好15种、恰好16种、恰好17种或恰好18种不同的氨基酸。本领域技术人员容易理解的是,当本文提到氨基酸时,涵盖了多于一个分子的所述氨基酸。因此,所叙述种数的不同氨基酸是为了限制不同类型的氨基酸的种数,而非限制一类氨基酸的分子数目。因此,例如术语“3种不同氨基酸”是指3种不同类型的氨基酸,其中,单独每种氨基酸的量没有特别的限制。优选的是,不同的氨基酸的种数不超过18种不同的氨基酸。
如本文所用的术语“二肽或三肽”分别涉及由2个或3个氨基酸构成的肽。示例性二肽有甘氨酰谷氨酰胺(Gly-Gln,与单独的谷氨酰胺相比稳定性增加)、甘氨酰酪氨酸(Gly-Tyr,与单独酪氨酸相比在水中的溶解度增加)、丙氨酰谷氨酰胺(Ala-Gln,与单独的谷氨酰胺相比在水中的溶解度增加)和甘氨酰甘氨酸。
天然存在的二肽的其它非限制性实例是肌肽(β-丙氨酰-L-组氨酸)、N-乙酰基肌肽(N-乙酰基(β-丙氨酰-L-组氨酸))、鹅肌肽(β-丙氨酰-N-甲基组氨酸)、同型鹅肌肽(N-(4-氨基丁酰)-L-组氨酸)、京都啡肽(L-酪氨酰-L-精氨酸)、蛇肌肽(或蛇肉肽)(β-丙氨酰-Nτ-甲基组氨酸)、格里肽(N-丙酰基-γ-L-谷氨酰-L-鸟氨酸-δ-乳酸乙酯)和巴蒂肽(环[(6-溴-8-烯色氨酸)精氨酸])。
人工二肽的实例包括但不限于:阿斯巴甜(N-L-a-天冬氨酰-L-苯丙氨酸1-甲酯)和假脯氨酸。
示例性三肽是谷胱甘肽(γ-谷氨酰基半胱氨酰甘氨酸)及其类似物眼晶体酸(L-γ-谷氨酰-L-α-氨基丁酰甘氨酸)以及去甲眼晶体酸(γ-谷氨酰基丙氨酰基甘氨酸)。三肽的其它非限制性实例包括异亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸(IPP)、甘脯谷肽(Gly-Pro-Glu)、促甲状腺激素释放激素(TRH,促甲状腺素释放素或普罗瑞林)(L-焦谷氨基-L-组氨酸基-L-脯氨酰胺)、促黑素抑制素(脯氨酰亮氨酰甘氨酰胺)、亮抑酶肽(N-乙酰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-精氨醛)和Eisenin三肽(pGlu-GLN-ALA-OH)。优选所述至少一种二肽或三肽、更优选的是所有二肽或三肽在结合医学应用使用时,不发挥任何的药理学性质。
优选的是,至少一种二肽选自由肌肽、甘氨酰酪氨酸、甘氨酰甘氨酸和甘氨酰谷氨酰胺组成的组。
根据本发明,该溶液包含一种或多种二肽或三肽。例如,术语“至少一种二肽或三肽”还涉及至少2种二肽或三肽,如至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种或至少9种二肽或三肽。该术语还包括恰好1种、恰好2种、恰好3种、恰好4种、恰好5种、恰好6种、恰好7种、恰好8种或恰好9种二肽或三肽。当溶液中包含超过一种二肽或三肽时,其明确涵盖了二肽和三肽的混合物。二肽和三肽的种数可彼此独立地选择,例如该溶液可能包含2种二肽和3种三肽。本领域技术人员容易理解,当本文提及一定种数的二肽和三肽时,所述种数的目的是限制不同类型的二肽和三肽的量,而不是二肽或三肽中某一种的分子数目。因此,例如,术语“4种二肽或三肽”是指4种不同类型的二肽和/或三肽,其中,每种单独的二肽和/或三肽的量没有特别的限制。优选的是,(不同的)二肽或三肽的种数不超过9种二肽或三肽。
所采用的氨基酸、二肽和/或三肽的优选量为0.1mg/ml至150mg/ml/,优选1mg/ml至100mg/ml,更优选10mg/ml至50mg/ml,进而更优选20mg/ml至35mg/ml,最优选的量是25mg/ml。
术语“不含或基本上不含糖”,按照本发明是指溶液避免或基本上避免了任何类型的糖,即,糖类的单糖、二糖或低聚糖形式以及糖醇。病毒配制方法中常用但不存在于本发明中的糖的例子包括但限于蔗糖、海藻糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、山梨糖醇或甘露糖醇。如果溶液包含小于0.1%(重量/体积)的糖,更优选小于0.01%(重量/体积)、甚至更优选小于0.001%(重量/体积)且最优选小于0.0001%(重量/体积),则该溶液被认为基本上不含糖。
本文使用的术语“不含或基本上不含硅烷”是指溶液不含或基本上不含任何硅烷,例如烷氧基硅烷、有机官能性硅烷、氢硅(氧)烷、硅氧烷和有机硅烷(包括带有其它官能团的甲硅烷基化合物)。如果溶液包含小于0.01%(重量/体积)硅烷、更优选小于0.001%(重量/体积)、最优选小于0.0001%(重量/体积),则该溶液被认为是基本上不含硅烷。
如本文所用的术语“不含或基本上不含蛋白”是指除了与本发明的生物体天然相关的蛋白之外,溶液不包含或基本上不包含任何其他蛋白。本领域技术人员可以理解,可以存在例如与溶液污染物相关的微量的蛋白,对溶液不含蛋白的要求并不排除这种情况。因此,如果溶液包含小于0.1%(重量/体积)的所要保护的生物体非天然相关的蛋白、更优选小于0.01%(重量/体积)、甚至更优选小于0.001%(重量/体积)、最优选小于0.0001%(重量/体积),则认为该溶液基本上不含蛋白。
按照本发明,令人惊奇地发现,如本文所定义的溶液在贮存期间稳定病毒或细菌。换句话说,该材料在存储期间得到保护从而避免丧失生活力、丧失其复制能力和/或丧失抗原性。本领域中已知的病毒的存储介质,例如由Hardy Diagnostics提供的病毒输送介质(目录号R99)或Millipore提供的Universal Transport Medium(UTM-RT)(目录号350CM)可提供最高至4天的最大保持时间。不过,本发明的溶液在各种温度(例如在37℃或在-20℃)提供了更长的贮存时间。如下面实施例1所示,本发明的溶液提供长达4周的保护,而当病毒被存储在PBS中时则实现显著较少的保护。
改善的稳定性、尤其是在升高的温度(如37℃)的改善的稳定性使得可以在不制冷的条件长期储存,例如在热气候和保持维护本领域产品状态所需要的冷链的可能性不足的国家中。
此外,在真核细胞存储中测试溶液时,发现当二甲亚砜(DMSO)完全或部分地由本发明的溶液代替来稳定病毒或细菌时,悬浮于同一溶液中的真核细胞在冷冻和解冻后不能存活。已知DMSO可防止在冷冻干燥过程中形成结晶,从而减少了细胞内结构损伤和细胞死亡。因此,本发明溶液对病毒和细菌的保护效果的发现更令人惊讶。不希望被理论束缚,本发明人推测,水的量以及真核细胞与病毒和细菌之间在细胞内细胞器和结构的复杂性上的差异可能对以下作出解释:在冷冻和解冻真核细胞时本发明溶液缺乏保护效果,从而导致真核细胞内这些结构的破坏,与本发明溶液在胞外的存在无关。
然而,也已知病毒对物理应激极其敏感。尤其是包膜病毒(如HSV-1)的滴度在冷冻和解冻后通常迅速下降。因此,本文所观察到的对病毒和细菌的感染性、复制和抗原性的稳定代表了本领域技术人员不能预期的令人惊讶的发现。
最后,本发明的溶液的另一优点在于缺少本领域通常采用的添加剂,这带来的额外优点在于,使用病毒或细菌之前不必去除所述添加剂,以及稳定用溶液的制备简化且成本更低。
优选的是,该溶液还不含明胶和/或磷酸盐缓冲液。最优选的是,该稳定病毒或细菌的方法包括将病毒或细菌包埋在水溶液中,其中,该溶液由(i)至少3种不同氨基酸或(ii)至少一种二肽或三肽以及皂苷或脂肪酸组成。甚至更优选的是,所述稳定病毒或细菌的方法包括将病毒或细菌包埋在水溶液中,其中,该溶液由(i)至少3种不同氨基酸或(ii)至少一种二肽或三肽组成。
本发明的方法的另一优选的实施方式中,所述至少3种氨基酸选自由(a)具有非极性的脂肪族R基团的氨基酸;(b)具有极性的不带电荷的R基团的氨基酸;(c)具有带正电荷的R基团的氨基酸;(d)具有带负电荷的R基团的氨基酸和(e)具有芳香族R基团的氨基酸组成的组。
天然存在的氨基酸,以及除了天然存在的氨基酸之外的氨基酸,例如人工氨基酸,可以分类为以上特征组(Nelson D.L.&Cox M.M.,"Lehninger Biochemie"(2005),第122-127页),从中可以选择至少三种氨基酸以用于本发明的溶液。
在更优选的实施方式中,所述至少三种氨基酸选自(a)~(e)的不同组。换言之,在该优选实施方式中,当溶液中包含三种氨基酸时,所述三种氨基酸可以选自至少两个不同组,更优选的是,选自三个不同组,以使一个来自(a)组,一个来自(b)组,一个来自(c)组。本文还明确设想诸如(b)-(c)-(d)、(c)-(d)-(e)、(e)-(a)-(b)、(b)-(d)-(e)等另外的组合。当溶液中包含四种氨基酸时适用相同的考虑,在该情况下氨基酸必须来自选自(a)~(e)中的至少两个不同组,更优选选自至少三个不同组,最优选选自至少四个不同组。特别是,当溶液中包含五种氨基酸时,氨基酸必须来自选自(a)~(e)中的至少两个不同组,更优选选自至少三个不同组,更优选选自至少四个不同组,最优选选自至少五个不同组。当溶液中包含超过五种氨基酸(例如六种或七种氨基酸)时适用相同的考虑,在该情况下这些氨基酸选自(a)~(e)中的至少两个不同组,更优选选自至少三个不同组,还更优选选自至少四个不同组,最优选选自至少五个不同组。
在本发明方法的更优选实施方式中,溶液包含选自以下每组的至少一种氨基酸:(a)具有非极性的脂肪族R基团的氨基酸;(b)具有极性的不带电R基团的氨基酸;(c)具有带正电R基团的氨基酸;(d)具有带负电R基团的氨基酸;和(e)具有芳香族R基团的氨基酸。
本领域技术人员还理解,在根据本发明使用的溶液中不必要存在相同数量的各组氨基酸。相反,可以选择氨基酸的任何组合,只要存在每组中的至少一种氨基酸即可。
此外,在溶液中氨基酸可以以单分子和/或以二肽和/或三肽的形式存在。
在本发明方法的另一优选实施方式中,溶液包含至少以下氨基酸:(a)丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸和色氨酸;(b)天冬氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸和缬氨酸;(c)脯氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苏氨酸和苯丙氨酸;(d)酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸和缬氨酸;或(e)精氨酸、甘氨酸、组氨酸、丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、色氨酸。在另一优选实施方式中,溶液包含至少以下氨基酸:(f)丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸。
根据该实施方式,在本发明的溶液中至少存在(a)、(b)、(c)、(d)或(e)组中的上述氨基酸。换言之,当在本发明溶液中可以包含多于上述氨基酸时,需要存在至少所述氨基酸。更优选的是,溶液正好包含所述氨基酸,不包含其他氨基酸。相同的考虑比照适用(f)组的氨基酸。
在本发明的另一优选实施方式中,一种或多种氨基酸选自由天然非蛋白氨基酸和合成氨基酸组成的组。
根据本发明,术语“非蛋白氨基酸”涉及未被天然引入多肽和蛋白质中的氨基酸。非蛋白性氨基酸可以通过翻译后修饰由蛋白氨基酸(其是L-α-氨基酸)衍生。此类非蛋白氨基酸例如是羊毛硫氨酸、2-氨基异丁酸、脱氢丙氨酸和神经递质(γ-氨基丁酸)。蛋白L-氨基酸的D-对映异构体也代表非蛋白氨基酸。此外,非蛋白氨基酸的非限制实例包括是肉毒碱、肌酸、肌苷酸、胍基乙酸、鸟氨酸、羟脯氨酸、同型半胱氨酸、瓜氨酸、羟赖氨酸或β-丙氨酸。
本文所用的术语“合成氨基酸”涉及不是自然中天然存在的氨基酸。合成氨基酸的非限制性实例包括(2R)-氨基-5-膦酰基戊酸、D-苯基甘氨酸或(S)-和(R)-叔亮氨酸。
在本发明的方法另一优选的实施方式中,所述溶液还包含两性分子。
根据本发明,术语“两性分子”涉及同时具有亲水性(即,近水性)和亲脂性(即,近脂性)的分子。两性分子的非限制性实例包括皂苷、脂肪酸、磷脂、胆固醇、糖脂和胆汁酸。优选的是稳定用溶液中所用的两性分子在与医药应用结合使用时,不表现任何药学性质。
皂苷是一类形成二级代谢物的化学化合物,其见于天然来源中、衍生自天然来源或能够化学合成。据发现,皂苷在各种植物物种中特别丰富。皂苷是两性糖苷,在现象学上通过其在水性溶液中摇晃时所产生的肥皂样泡沫归类,而在结构上通过其组成(一种或多种亲水性糖苷部分与亲脂性甾体或三萜类苷元的结合)而归类。他们的结构多样性反映在他们的物理化学性质和生物性质上。皂苷的实例有甘草次酸、甘草酸、葡萄糖醛酸、七叶皂苷、常春藤苷(hederacoside)和洋地黄皂苷。
脂肪酸是具有长的无支链的脂肪链(尾部)的羧酸,所述脂肪链可以是饱和或不饱和的。他们是重要的能量来源,因为他们的代谢产生大量的ATP。大多数天然存在的脂肪酸具有偶数碳原子(4~28)的链,通常源自三甘油酯或磷酯。脂肪酸具有不同长度,其用于将脂肪酸分类成短链、中链或长链脂肪酸。短链脂肪酸(SCFA)是具有小于6个碳的脂肪族尾部的脂肪酸,中链脂肪酸(MCFA)是具有6~12个碳的脂肪族尾部的脂肪酸(其可形成中链甘油酯),长链脂肪酸(LCFA)是具有大于12个碳的脂肪族尾部的脂肪酸,超长链脂肪酸(VLCFA)是具有大于22个碳的脂肪族尾部的脂肪酸。脂肪酸的非限制性实例包括诸如肉豆蔻油酸、棕榈油酸、杉皮酸、油酸、亚油酸、α-亚油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸和二十二碳六烯酸等不饱和脂肪酸,以及诸如月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、木蜡酸(lignoceric acid)和蜡酸等饱和脂肪酸。
磷脂是这样一类脂质:其是所有细胞膜的主要组分,这是因为它们能形成脂双层。大部分的磷脂含有甘油二酯、磷酸基团和简单的有机分子,如胆碱。一个例外是鞘磷脂,它是由鞘氨醇代替甘油而衍生出。磷脂的非限制性实例是磷脂酰胆碱(卵磷脂)、磷脂酸(磷脂)、磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇磷酸、磷脂酰肌醇二磷酸、磷脂酰肌醇三磷酸、神经酰胺磷酸胆碱和神经酰胺磷酸甘油。
胆固醇是存在于细胞膜和在所有动物的血浆中运输的类固醇代谢产物。它是哺乳动物细胞膜的重要结构组分,在其中需要它建立适当的膜渗透性和流动性。此外,胆固醇是制造胆汁酸、类固醇激素和维生素D的重要组分。胆固醇具有以下结构:
糖脂是附着糖类的脂质。其天然作用是提供能量和充当细胞识别标记。糖脂的非限制性实例包括半乳糖脂、硫脂、硫苷脂、脑苷脂、半乳糖脑苷脂、葡萄糖脑苷脂、glucobicaranateoet、神经节苷脂、红细胞糖苷脂、糖磷酸鞘脂和糖基磷脂酰肌醇。
胆汁酸是主要存在于哺乳动物的胆汁中的类固醇酸。两种主要的胆汁酸是胆酸和鹅脱氧胆酸。胆汁酸的其他非限制性实例是甘氨胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸和石胆酸。
如所附的实施例中所示,在稳定溶液中添加两性分子(例如甘草酸)可进一步提高在-20℃贮藏长达4周后的病毒滴度。
在本发明方法的更优选的实施方式中,两性分子选自由皂苷或脂肪酸或其衍生物组成的组。
在本发明方法的另一更优选实施方式中,皂苷是甘草酸或其衍生物。
甘草酸(glycyrrhizic acid)还称为甘草酸(glycyrrhicic acid)、甘草素或甘草次酸(glycyrrhizinic acid),并具有以下结构:
甘草酸是水溶性的,并且作为可能的阴离子存在,该阴离子能够是与阳离子性分子活性成分形成经典结合的络合物的潜在配体。不希望受理论限制,本发明假设,阴离子性甘草酸与本发明的溶液中存在的氨基酸(即精氨酸或赖氨酸)通过静电相互作用和/或氢键形成络合物。据信该络合增强本发明的溶液稳定存储的病毒或细菌的能力。此外,甘草酸与阳离子性分子活性成分形成络合物的能力能够产生在储存期间与蛋白质表面上暴露出的阳离子性侧链的相互作用。
甘草酸的衍生物是本领域公知的,并且包括通过在羧基和羟基处转化甘草酸、通过将氨基酸残基缀合到糖部分或将2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖胺引入甘草酸的糖苷链中而产生的那些衍生物。其他衍生物有甘草酸的酰胺、甘草酸与两个氨基酸残基以及游离30-COOH官能团的缀合物,以及甘草酸分子的碳水化合物部分中氨基酸烷基酯中的至少一个残基的缀合物。具体衍生物的实例可在例如Kondratenko等(RussianJournal of Bioorganic Chemistry,第30(2)卷,(2004),第148-153页)中发现。
根据本发明,令人惊奇地发现在上述溶液中添加甘草酸进一步有助于病毒和/或细菌的稳定。因此,甘草酸的添加有助于保持储存期间的病毒和/或细菌的生物活性。
在本发明方法的另一更优选实施方式中,脂肪酸选自由短链脂肪酸和中链脂肪酸组成的组。
由于其与具有更长链的脂肪酸相比具有更佳的水中溶解度,特别优选短链脂肪酸和中链脂肪酸。
在本发明方法的另一优选实施方式中,溶液的赋形剂和病毒或细菌之间的重量比是约1:1~约500:1。
根据该实施方式,溶液的赋形剂是溶液的非水性组分,其不是待稳定的病毒或细菌。
更具体而言,溶液组分和病毒或细菌之间的重量比为约1:1~约350:1,例如约5:1~约200:1或约10:1~约100:1。最优选的是,该重量比为约2:1。应该理解的是,落入这些范围比率之间的任何值也在本文明确想到。此外,本文所用的术语“约”包括明确提到的比值以及与其偏差±10%的值。
本发明的方法另一优选的实施方式中,病毒或细菌保持其感染性和/或其复制的能力。
本文所用的术语“感染性(infectivity)”涉及病毒或细菌在宿主或宿主细胞中建立感染的能力。更具体地讲,感染性是病毒或细菌水平传播的能力,即它在宿主之间的散布,而不是从父母至子女的散布。用于确定病毒或细菌是否保持其感染性的手段在本领域中是众所周知的,并且包括但不限于测试获自宿主的细胞培养物中病毒的复制、PCR分析、动物模型以及电子-光学分析。下文中所附实施例提供了其他方法。当感染性的量是在将其包埋在本发明的溶液中之前所述生物体的感染性的至少30%时,根据本发明,病毒或细菌被认为保持其感染性。更优选的是,感染性的量是在将其包埋在本发明的溶液中之前所述生物体的感染性的至少50%,更优选至少70%,如至少95%,最优选至少98%。
病毒和细菌通过拷贝它们的遗传物质来复制,从而使自己繁殖。与其他生物相反,病毒需要宿主细胞才能够复制,这是因为它们不具备自身的代谢。如果生物体在进行本发明的方法之后可以繁殖自己,则保持了复制能力。优选的是,在进行稳定生物体的方法之后,本发明方法最初所用生物体中至少30%能够繁殖。更优选的是,在进行稳定生物体的方法之后,发明方法最初所用生物体中至少50%,更优选至少70%,如至少95%,最优选至少98%能够繁殖。最优选的是,在进行稳定生物体的方法之后,所有最初所用生物体(即100%)能够繁殖。测试病毒或细菌是否保持其复制的能力的方法是本领域中已知的,主要包括带有许可宿主细胞的细胞培养模型,但也包括PCR分析、动物实验、鸡胚中复制、电子-光学分析、血凝试验,以及通过斑块滴度测定病毒量。
根据本发明,已经发现包埋在溶液中的病毒不仅能够长时间生存,并且还保持其感染能力和其繁殖的能力。
在本发明的方法另一优选的实施方式中,所述方法还包含随后在选自约-90℃至约45℃的温度储存经稳定的病毒或细菌的步骤。更优选的是,经稳定的病毒或细菌随后储存在选自约-90℃至约-70℃、约-30℃至约-10℃、约1℃至约10℃、约30℃至约43℃的温度。更优选的是,经稳定的病毒或细菌随后储存在选自约-85℃至约-75℃、约-25℃至约-150℃、约2℃至约8℃和约35℃至约40℃的温度。最优选的是,经稳定的病毒或细菌随后储存在选自约-80℃、约-20℃、室温、约4℃和约37℃的温度。
本领域技术人员可以理解,本文所用的术语“约”涵盖了明确叙述的值,以及与之具有较小偏差的值。换句话说,“约-90℃”的温度包括-90℃但无需恰好为-90℃,而是可相差几度,因此包括例如-91℃、-92℃、-89℃或-88℃。本领域技术人员知道,这样的值不需要完整的精度,只要这些值近似地对应于所述值即可。因此,术语“约”涵盖了与所述值例如15%、更优选为10%、最优选5%的偏差。
在本发明方法的另一优选的实施方式中,所述经稳定的病毒或细菌用于作为液体制剂储存。
在本发明方法的另一优选的实施方式中,所述经稳定的病毒或细菌用于作为干燥制剂储存。
如下文所述,如此储存的病毒和细菌(作为液体或干燥制剂)随后可用于制备抗原物质。
本文所用术语“干燥制剂”是指其中液体内容物已被去除或减少的制剂。干燥的病毒或细菌制剂的合适的方法包括但不限于:冻干(冷冻干燥)、喷雾干燥、冷冻喷干、空气干燥或泡沫干燥。
如果液体被减少至小于体积的20%,例如小于体积的10%,例如小于体积的5%,更优选小于体积的3%,例如小于2%或小于1%,则认为液体内容物已减少。最优选的是,液体被减少至0.5%以下。
冻干也称为冷冻干燥,是本领域熟知的,并且包括以下步骤:冻结生物体,随后降低周围压力,同时加入足够的热使材料中的冷冻水直接从固相升华为气相。优选的是,冻干制剂随后密封以防止再吸收水分。
喷雾干燥也是本领域中公知的,其是在单个工艺步骤中将溶液、悬浮液或乳液转化成固体粉末的方法。通常,液体产品的浓缩物被泵送至雾化装置,在那里被破碎成小液滴。这些液滴遇到热空气流,它们非常迅速地失去水分,同时仍悬浮于干燥空气中。在旋流器中干燥粉末通过离心作用与潮湿空气分离,致密的粉末颗粒被强制移向旋流器壁,而较轻的潮湿空气被引导经排气管离开。
喷雾冷冻干燥也是本领域众所周知的,是将冷冻干燥和喷雾干燥共有的处理步骤结合的方法。在本发明溶液中提供的生物体被雾化于低温介质(如例如液态氮)中,其产生急剧冷冻液滴的分散体。该分散体随后在冻干机中干燥。
泡沫干燥是用于在干燥状态下保存敏感的生物治疗剂的可规模化的技术。在中等温度和压力下稳定的治疗性生物分子(如促红细胞生成素、酶和疫苗)通常利用真空泡沫干燥(VFD)在防护剂(例如通常可得的冻干剂)存在下被稳定化。通过在冰点以上但远低于100℃的真空下沸腾,生物材料的悬浮液或溶液被转化为泡沫。所述泡沫由其中水可以在升高的温度被有效去除的材料的薄膜构成。该工艺基于低温真空蒸发的原理。
根据该实施方式,病毒或细菌在本发明溶液中得到稳定,随后进行干燥步骤。降低的水含量抑制诸如可降解有机物的酶的作用,因此提供了额外的保护。此外,存在于病毒包膜或覆层上的或细菌细胞膜上的表面抗原以及对宿主细胞结合必要的蛋白在干燥步骤期间得到保护,从而保持了病毒或细菌的抗原性以及与宿主细胞的相互作用。因此,重构后,通过表面抗原的呈递,病毒和细菌可用作活疫苗,或用作减毒疫苗或灭活疫苗。
最优选的是,本发明方法随后没有灭活步骤,从而保持了本发明生物体的生活力和复制活性。
然而,在替代性实施方式中,在不需要活疫苗时,本发明的方法随后可以有灭活步骤。如所附实施例(见实施例2和3)所示,在本发明溶液的存在下在以β-照射(25kGy)灭活后,保持了表面蛋白的抗原性。因此,即使照射致使诸如腺病毒和猪细小病毒等病毒的复制活性丧失,但它们仍然能保持其抗原性。因此,在疫苗生产步骤的背景下,本发明的方法为制备稳定安全的病毒或细菌抗原的提供了起点,其中,病毒或细菌首先被稳定为其天然一致性,然后灭活,同时保持其天然存在的三维外观。因此,并且优选的是,抗原通常存在于病毒或细菌表面上的情况保持不变,因为没有发生病毒或细菌的片段化。
本领域技术人员可以理解,灭活是本领域中常用的术语,包括例如照射、甲醛灭活或β-丙内酯灭活等技术。
根据本发明,病毒可以是有覆层的DNA病毒、无覆层的DNA病毒、有覆层的RNA病毒和无覆层的RNA病毒。
本文使用的术语“DNA病毒”是指以DNA作为其遗传物质并且利用DNA依赖性DNA聚合酶复制的病毒。其核酸可以是双链DNA(dsDNA)或单链DNA(ssDNA)。DNA病毒属于病毒的巴尔的摩分类体系中的组I或组II。双链DNA病毒的非限制性实例包括:肌尾噬菌体科,如肠道细菌噬菌体T4;短尾病毒科;长尾噬菌体科,如肠杆菌细菌噬菌体λ;疱疹病毒科;腺病毒科;杆状病毒科;虹彩病毒科;乳头状瘤病毒科;多瘤病毒科,如猿猴病毒40;痘病毒科,如牛痘病毒或天花;而单链DNA病毒的非限制性实例包括:丝杆噬菌体病毒科;微小病毒科和细小病毒科,如细小病毒B19。
本文所用放入术语“RNA病毒”是指以RNA作为遗传物质的病毒。该核酸可以是单链RNA(ssRNA)或双链RNA(dsRNA)。RNA病毒归类为那些属于病毒分类的巴尔的摩分类体系的III组、IV组或V组的病毒。单链RNA病毒的非限制性实例包括:冠状病毒科,例如冠状病毒或SARS;杆状套病毒科;小核糖核酸病毒科,如脊髓灰质炎病毒、普通感冒病毒或甲肝病毒;黄病毒科,如黄热病病毒、西尼罗河病毒、丙型肝炎病毒、登革热病毒;披膜病毒科,如风疹病毒或罗斯河病毒;肝炎病毒属,如戊型肝炎病毒;烟草斑纹病毒属,包括例如烟草花叶病毒;博尔纳病毒科,包括如博尔纳病病毒;丝状病毒科,如埃博拉病毒或马尔堡病毒;副粘病毒科,其包括如麻疹病毒或腮腺炎病毒;弹状病毒科,如狂犬病病毒;以及正粘病毒科,如流感病毒;而双链RNA病毒的非限制性实例包括:双RNA病毒科;金色病毒科;囊状噬菌科;低毒病毒科;分体病毒科;呼肠孤病毒科,如罗塔岛病毒和全病毒科。
有覆层的病毒具有外面的蛋白覆层,也称为衣壳。衣壳包围病毒的遗传信息并保护基因组免受环境影响,并帮助病毒与宿主细胞附着。一些病毒另有包膜,即,衣壳包覆有脂质膜,也称为病毒包膜。包膜由衣壳从宿主细胞的胞内膜获得,例如从内部核膜、高尔基体膜或细胞外膜获得。
在本发明的方法的优选的实施方式中,病毒选自由流感病毒、脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒-1、牛痘病毒和腺病毒组成的组。
流感病毒是正粘病毒科家族的一部分,属于第V组病毒((-)ssRNA)。流感病毒已知有三个属:甲型、乙型和丙型流感病毒,其根据其核蛋白和基质蛋白的抗原性差异而鉴定。甲型流感病毒感染人类、其它哺乳动物和鸟类,并导致流感大流行;乙型流感病毒感染人类和海豹,丙型流感病毒染人类和猪。
脊髓灰质炎病毒是脊髓灰质炎的致病剂,并且是小核糖核酸病毒科中的人肠道病毒。脊髓灰质炎病毒由RNA基因组(第IV组((+)ssRNA))和蛋白衣壳组成。基因组是具有约7500个核苷酸的单链正义RNA基因组。
单纯疱疹病毒1(HSV-1)也称作人疱疹病毒1(HHV-1),是疱疹病毒科疱疹病毒属的成员,感染人并且属于第I组(dsDNA)。HSV-1产生唇疱疹,并且遍及各处且具有接触感染性。
牛痘病毒(VACV或VV)是大型复杂的包膜病毒,属于痘病毒科。其具有约190kbp长的直链的双链DNA基因组,编码约250个基因。牛痘病毒最著名的是其作为消除天花疾病的疫苗,使得天花成为首个通过科学成功根治的人类疾病。
腺病毒是中等大小(90nm至100nm)的非包膜二十面体病毒,由核衣壳和双链直链DNA基因组(第I组(dsDNA))构成。腺病毒例如导致呼吸疾病、结膜炎以及胃肠炎。腺病毒也用作进行靶向治疗的载剂,例如以重组DNA或蛋白形式使用。
根据本发明,细菌可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。
在本发明的方法的优选的实施方式中,细菌选自由百日咳菌、破伤风杆菌、白喉棒状杆菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、霍乱弧菌、沙门氏菌和炭疽芽孢杆菌组成的组。
除非另外限定,本文采用的所有科技术语具有属于本领域的普通技术人员所通常理解的含义。在抵触的情况下,以包含定义的本发明说明书为准。
附图显示:
图1:在存在或不存在本发明的保护溶液的情况下在不同储存条件下(室温、4℃、-20℃、37℃)将HSV-1储存不同时间(0天、7天、14天、21天、28天)。随后,将HSV-1用于接种细胞培养物,并对病毒滴度进行滴定。
图2:即使在病毒高度稀释时,如通过网格形成(无可见的红色纽状)所示,通过本发明的保护程序制备的病毒制剂中,甲型流感的活性更高。
图3:第5型腺病毒(Ad5)感染性测试。(A/B)Ad5样品在具有和不具有纳米覆层的情况下以(A)25kGy和(B)40kGy进行β-照射。显示了照射前后的感染性病毒颗粒的滴度。(C/D)在相同的设置下,照射IgM抗体。显示了照射前后的相对抗原结合能力。
图4:(A)SDS-PAGE;第1道:OVA对照,第2道:降解OVA,第3道:(OVA+本发明溶液)SD,第3道:标记(PagerulerTM);(B)OVA对照、降解OVA和(OVA+本发明溶液)SD的CD图谱(仅蛋白的图谱)。
图5:与OVA结合时ANS荧光强度的增强。
图6:与ANS结合后,OVA对照和(OVA+本发明溶液)SD的荧光强度(仅蛋白的图谱)。
图7:应激条件下不同组合物对血凝素功能性的影响。
对抗不同类型应激(如冻干和40kGy的β照射)的以保护溶液的不同组合物配制的灭活甲型流感病毒H1N1裂解疫苗的活性,各自的血凝反应活性。甲型流感病毒H1N1裂解疫苗在本发明的组合物中重新缓冲,所述组合物含有7种氨基酸(氨基酸混合物1:Ala、Arg、Gly、Glu、Lys、His、Trp)或5种氨基酸(分别为氨基酸混合物2:Ala、Arg、Gly、Glu、Lys和氨基酸混合物3:Ala、Gly、Glu、His、Trp),分别补充有二肽肌肽、其它二肽和甘草酸。
以下实施例阐释了本发明:
实施例1:液体储存后感染性的检测
HSV-1在细胞培养物中繁殖。在通过滴定确定病毒滴度后,将病毒分为不同样品,用于在含甘草酸和不含甘草酸的保护溶液存在或不存在的情况下的不同储存条件(室温、4℃、-20℃、37℃)。作为对照,使用PBS。在实验建立后的不同时间(0天、7天、14天、21天、28天),将HSV-1用于接种细胞培养物以及对滴度的滴定。最大观察期为4周。
实施例2:显示抗原性保持的甲型流感HA测试
以本发明的保护溶液在2℃至8℃对灭活的甲型流感病毒进行透析。(病毒/保护溶液的赋形剂)重量比为1:10至1:100。在100μl体积中完成冻干,对冻干物以25kGyβ-照射进行照射。对于如表1所示的各种不同组成的保护溶液获取了另外的数据。另外,作为替代性方式,以40kGyβ-照射进行照射。
照射和重建后,在血凝集反应测试(HA)中评价样品的功能性。如图2所示,与显示出储存缓冲液中甲型流感的抗原性完全丧失的对照不同,在本发明溶液中冻干的甲型流感病毒在重建后几乎完全保持了血凝集活性。
表1提供了实施例中所用的不同组成的本发明保护溶液的概览。使用了具有7种氨基酸(氨基酸混合物1;Ala、Arg、Glu、Gly、Lys、His、Trp)或具有5种氨基酸(分别为氨基酸混合物2;Ala、Arg、Glu、Gly、Lys和氨基酸混合物3:Ala、Gly,Glu、His、Trp)的组成。含有二肽肌肽、甘草酸、额外的二肽及其组合的组成获得了抵御冻干介导的和/或照射介导的功能性丧失的最佳保护。该实验显示,对长期保护时可能具有不如人意的副作用(例如,氧化敏感;吸湿)的氨基酸的排除导致保护降低。当GA和/或肌肽和/或二肽(Gly-Tyr;Gly-GLy;Gly-Gln)补充到这些组成中时,可以增加这些组合物的保护效果。在以二肽和/或GA替换所选的氨基酸后,组合物的摩尔渗透压浓度降低,因此可以有益于治疗目的。
表1.所施用的剂型1至18的组成
实施例3:病毒照射和抗原性保持
利用5型人腺病毒(Ad5)进行病毒灭活研究。具体而言,将50μL的病毒悬浮液在无菌聚苯乙烯管底部于37℃干燥。干燥的病毒随后以50μL保护溶液覆盖,然后再次在37℃干燥。在25kGy或40kGy的β-照射后(对照未被照射),将病毒/保护溶液双层重悬在1mL的MEM中,并利用端点滴定来确定感染性病毒的滴度(图3A/B)。平行地,利用以IgM进行的相同实验设置(LO-MM-3;图3C/D)。
本发明表明β-照射导致Ad5的定量灭活(25kGy,≥99.9%的减少,40kGy≥99.999%的减少;图9A/B),而IgM抗体的功能性得以保持。这些结果证明本发明的溶液选择性地稳定和保护病毒以外的蛋白结构,而同时可使感染性失活。
实施例4:保护溶液不能稳定冷冻和解冻过程中的活真核细胞
所培养的成纤维细胞在达到细胞培养板中的融合后进行收获。在于-80℃冷冻和储存之前将细胞在a)作为标准程序的DMSO或b)在保护溶液中或c)在DMSO与保护溶液(SPS)的不同混合物中进行计数和重建。解冻后,通过台盼蓝分析细胞的生活力和体外形成新培养物的能力。结果如下表2所示。
将样品在以下各介质(所有均在DMEM/20%FKS(v/v))中重建:
1 10%DMSO(v/v)/0%(v/v)SPS(20g/l)=阴性对照
2 7.5%DMSO(v/v)/2.5%(v/v)SPS(20g/l)
3 5%DMSO(v/v)/5%(v/v)SPS(20g/l)
4 2.5%DMSO(v/v)/7.5%(v/v)SPS(20g/l)
5 0%DMSO(v/v)/10%(v/v)SPS(20g/l)
6 0%DMSO(v/v)/0%(v/v)SPS(20g/l)=阳性对照
具有20%FCS的保护溶液:
7 SPS10mg/ml+20%FKS/10%DMSO
8 SPS10mg/ml+20%FKS/0%DMSO
表2:真核细胞在本发明溶液中缺少保护
进一步测试了解冻后24小时细胞如何贴附到培养皿。通过显微术确定了贴附的水平。结果总结在下表3中。
表3:解冻后24小时贴附到至细胞培养皿
贴附 | |
1 | 细胞贴附良好,仅有少量个体未贴附细胞 |
2 | 细胞贴附良好,仅有少量个体未贴附细胞 |
3 | 细胞贴附良好,有一些个体未贴附细胞或细胞碎片 |
4 | 细胞贴附良好,有一些个体未贴附细胞或细胞碎片 |
5 | 只有未贴附细胞或细胞碎片 |
6 | 只有未贴附细胞或细胞碎片 |
7 | 细胞贴附良好,但具有稍圆的形状,仅有少量个体未贴附细胞 |
8 | 只有未贴附细胞或细胞碎片 |
实施例5:材料和方法
保护溶液的制备
以上实施例中采用的保护溶液含有L-丙氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸单盐酸盐和L-色氨酸。
通过具体组合本发明的不同氨基酸以及可选的糖苷赋形剂(此处为甘草酸)达到约100g/L的储备浓度,从而制备保护性溶液。最终溶液的固体含量(1g/L~25g/L)与所要保护的试剂之间的重量:重量(w/w)比大于2:1。所有组分均无毒。氨基酸核准用于静脉内输注(Fong和Grimley),甘草酸已被核准在治疗慢性肝炎中用于静脉应用,并且其安全性在数个临床研究中充分记载。在本发明溶液中,甘草酸可以以1μg/mL至10000μg/mL使用。
病毒感染性测试
对于感染性/灭活研究,第5型腺病毒的Adenoid75株(美国标准培养物保藏所,ATCC-VR-5)在人肺癌细胞系A549(ATTC-CCL-185)中增殖。对于病毒传播,细胞在37℃和5%CO2中在补充有5%胎牛血清(FCS)的最低必需培养基(MEM)中培养。通过终点滴定确定病毒滴度(在96孔微量滴定板中,每种稀释液为8个孔),每孔50μL病毒稀释液和50μL A549细胞(10×103至15×103个细胞)。对于实验,采用的滴度为1.1×109组织培养感染剂量(TCID50)/mL。具体而言,50μL体积的病毒悬浮液在无菌聚苯乙烯管底部于37℃干燥。干燥的病毒随后覆盖有50μL的保护溶液(20g/l)并在37℃再次干燥。在以25kGy或40kGy进行β-照射后(对照不照射),病毒/保护溶液双层重悬在1mL的MEM中。在此按上述方式确定病毒滴度。在接种7天后观察培养物的细胞病变效果(CPE)。
病毒对照以相似方式处理,不同之处在于没有进行β-照射。病毒滴度表示为TCID50/mL(包括标准偏差)。滴度的降低表示为β-照射后病毒滴度与对照病毒滴度之差。
统计学
所有试验均进行至少5次。在相关情况下,数据表示为平均值+/-SEM。通过学生t检验进行统计学分析(GraphPad Prism Program,第5版,GraphPad Software,SanDiego,CA)。P小于0.05被认为具有统计学显著性。
实施例6:喷雾干燥期间卵清蛋白的稳定化
卵清蛋白是免疫学中常用的模型抗原,作为原理性证明来确认本发明溶液在喷雾干燥期间稳定抗原的可用性。然后使用圆二色性(CD)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和荧光色谱表征经干燥的粉末的完整性。
材料和方法
卵清蛋白购自Sigma(St.Louis,MO,USA)。创造性溶液如上所述(参见包埋溶液)。1-苯氨基-8-萘磺酸盐(ANS)也购自Sigma(St.Louis,MO,美国)。所有其他试剂是分析级。
喷雾干燥蛋白的制备
使用Büchi B-290实验室喷雾干燥器(Büchi,Flawil,瑞士)将3%(w/v)的卵清蛋白和6%(w/v)的本发明溶液喷雾干燥。入口空气温度设定为120℃,空气速率为470L/h,泵速率7.5ml/分钟,出口空气温度为50℃至55℃。
SDS-PAGE
使用Bio-Red Mini-Protean3凝胶电泳系统(Bio-Red Laboratories,Hercules,USA)进行SDS-PAGE。与10μl的样品缓冲液温育(95℃,5分钟)后将10μl的蛋白样品(0.5mg/ml)加载至各孔中,在200V电压下进行电泳约55min。使用考马斯亮蓝使蛋白质可视化。
圆二色性(CD)
使用Jasco J-715分光偏振计(JASCO International Co.Ltd,Hachioji city,日本)来评估喷雾干燥前后的蛋白质二级结构。在远紫外范围(200nm~250nm)区以1.0nm的取样间隔在0.05cm光径的比色皿中记录CD光谱。将本发明的溶液与使用超滤装置(Vivaspin6,来自Sartorius Stedim biotech,,德国)的蛋白质分开,因为其在CD中具有某些信号。所有光谱是两次扫描的平均值,并且经过背景校正和标准化。然后将光谱与纯/未处理的蛋白质比较。
荧光光谱
在荧光光度计(LS55from PerkinElmer,Waltham,USA)中使用1cm光径的比色皿记录荧光光谱。通过在360nm激发ANS而测定ANS的固有荧光,并且在390nm至550nm范围内记录发射光谱。相对于溶剂的背景光谱校正荧光光谱。
结果
OVA对照和使用本发明溶液进行的喷雾干燥OVA的SDS-PAGE分析示于图4A)中。在两种样品中观察到相同的凝胶图案,并且不存在低分子量带,表明在喷雾干燥时未发生OVA分子的降解。
此外,如图4(B)所示,使用本发明溶液进行喷雾干燥后OVA的CD光谱与OVA对照相似,表明再分散后不能观察到二级结构的改变。
1-苯氨基-8-萘磺酸盐(ANS)在水中实际上是非荧光的,但是当与存在于蛋白质上的疏水性位点结合时显示荧光。因此,当蛋白质变性时该荧光极大地增强,因此充当变性程度的量度(图5)。使用该现象来表征喷雾干燥后OVA的完整性。从图6中看出,对照和使用本发明溶液进行的喷雾干燥OVA具有相同的荧光强度,表明在喷雾干燥期间未发生变性事件。
总之,本发明溶液适于在将卵清蛋白喷雾干燥过程中保持二级结构。
Claims (18)
1.一种稳定病毒或细菌的方法,所述方法包括将所述病毒或细菌包埋在水溶液中,其中,所述溶液包含:
(i)至少3种不同氨基酸;或
(ii)至少一种二肽或三肽,
并且其中,所述溶液不含或基本上不含糖、硅烷和蛋白。
2.如权利要求1所述的方法,其中,所述至少3种氨基酸选自以下组:
(a)具有非极性的脂肪族R基团的氨基酸;
(b)具有极性的不带电荷的R基团的氨基酸;
(c)具有带正电荷的R基团的氨基酸;
(d)具有带负电荷的R基团的氨基酸;和
(e)具有芳香族R基团的氨基酸。
3.如权利要求1或2所述的方法,其中,所述溶液包含选自以下每组的至少一种氨基酸:
(a)具有非极性的脂肪族R基团的氨基酸;
(b)具有极性的不带电荷的R基团的氨基酸;
(c)具有带正电荷的R基团的氨基酸;
(d)具有带负电荷的R基团的氨基酸;和
(e)具有芳香族R基团的氨基酸。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法,其中,所述溶液至少包含以下氨基酸:
(a)丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸和色氨酸;
(b)天冬氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸和缬氨酸;
(c)脯氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸;
(d)酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸;或
(e)精氨酸、甘氨酸、组氨酸、丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、色氨酸;或
(f)丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸。
5.如权利要求1至3中任一项所述的方法,其中,所述氨基酸中的一种或多种选自由天然的非蛋白氨基酸和合成氨基酸组成的组。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法,其中,所述溶液还包含两性分子。
7.如权利要求6所述的方法,其中,所述两性分子选自由皂苷或者脂肪酸或其衍生物组成的组。
8.如权利要求7所述的方法,其中,所述皂苷是甘草酸或其衍生物。
9.如权利要求7所述的方法,其中,所述脂肪酸选自由短链和中链脂肪酸组成的组。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法,其中,所述溶液的赋形剂与所述病毒或细菌之间的重量比为1:1至500:1。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法,其中,经稳定的病毒或细菌保持其感染性和/或其复制的能力和/或其抗原性。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法,所述方法还包括随后将经稳定的病毒或细菌储存在选自约-90℃至约45℃的温度的步骤。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法,其中,经稳定的病毒或细菌以液体制剂供储存。
14.如权利要求1至12中任一项所述的方法,其中,经稳定的病毒或细菌以干燥制剂供储存。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法,所述方法还包括后续的灭活步骤。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法,其中,所述病毒选自由流感病毒、脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒-1、牛痘病毒和腺病毒组成的组。
17.如权利要求1至15中任一项所述的方法,其中,所述细菌选自由百日咳菌、破伤风菌、白喉菌、脑膜炎双球菌、肺炎双球菌、流感嗜血杆菌、霍乱菌、伤寒菌和炭疽菌组成的组。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法,其中,权利要求1的(ii)中所述的至少一种二肽选自由肌肽、甘氨酰酪氨酸、甘氨酰甘氨酸和甘氨酰谷氨酰胺组成的组。
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PB01 | Publication | ||
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C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
CB02 | Change of applicant information |
Address after: German Madingsilide Applicant after: Leukocare GmbH Address before: Munich, Germany Applicant before: Leukocare GmbH |
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C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140305 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |