CN103561764B

CN103561764B - 含有瓜氨酸的佐剂组合物

Info

Publication number: CN103561764B
Application number: CN201280022634.6A
Authority: CN
Inventors: 野崎周英; 上仲一义; 松田纯一
Original assignee: Common financial group legal person chemical and serum therapy research institute
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 2011-03-11
Filing date: 2012-03-09
Publication date: 2015-09-16
Anticipated expiration: 2032-03-09
Also published as: CN103561764A; US9381242B2; EP2684572A1; EP2684572B1; ES2731636T3; EP2684572A4; WO2012124631A1; TR201910409T4; US20170239348A1; US10556005B2; KR101847848B1; KR20140012115A; JP5914458B2; US20140065179A1; JPWO2012124631A1

Abstract

提供了新的佐剂组合物，其与传统的佐剂如明矾相比在安全性和便利性方面极佳。提供了包含瓜氨酸的佐剂组合物，其为活体中存在的水溶性物质，和/或其盐；包含所述佐剂组合物和抗原的疫苗组合物；用于制备所述佐剂组合物和所述疫苗组合物的方法；和用于施用所述佐剂组合物和所述疫苗组合物的方法。

Description

含有瓜氨酸的佐剂组合物

技术领域

本发明涉及包含瓜氨酸的佐剂组合物、包含瓜氨酸和抗氧化剂（例如抗坏血酸）的佐剂组合物，和包含所述佐剂组合物和抗原的疫苗组合物。

背景技术

疫苗可以包含与抗原物质一起的佐剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂和缓冲液。具体而言，佐剂是与抗原一起施用的物质，并可以增强针对所施用抗原的免疫应答。佐剂根据其种类可以通过多种方式起作用，例如（1）其吸附抗原，以加速其摄入抗原呈递细胞中；（2）其将抗原长时间保留在局部区域中，以逐渐释放抗原，延长抗原刺激；或（3）其直接激活免疫活性细胞。因此，佐剂对于减少疫苗施用的剂量和次数或疫苗中含有的抗原量非常有利。因而，至今已经进行了关于佐剂（其可以增强疫苗的作用）的多项研究。然而，实际上用于医疗环境中的佐剂却非常少。

典型的佐剂包括已经用于多种疫苗中的氢氧化铝（下文称为“明矾佐剂”）。然而由于它的不溶解性，其几乎不能与抗原均匀地混合并且其不能容易地与用于鼻腔或经皮肤施用的装置组合，从这些不便利的观点上看，明矾佐剂不是理想的佐剂。除明矾佐剂外，还存在使用角鲨烯或MPL（单磷酸脂）的佐剂。然而，尽管它们可以发挥强的佐剂活性，但是它们也显示严重的不良副作用并且不利地是在水中不能溶解。因此在医疗环境中，希望开发这样的佐剂，其可以在人体中诱导升高的免疫反应，可以产生很少不良副作用，并且可以显示增强的便利性。

另一方面，瓜氨酸（一种氨基酸）是构成尿素循环的化合物之一，并且在动物，具体而言在哺乳动物中是普遍的[化学式：C6H13N3O3, 2-氨基-5-(氨甲酰氨基)-戊酸,分子量：175.2 g/mol]。瓜氨酸是在1930年日本从西瓜中发现的并命名为西瓜（Citrullus vulgaris），这是西瓜的学名。

尽管瓜氨酸不是活体中组成蛋白质的氨基酸，但它是尿素循环的中间化合物之一。瓜氨酸是与一氧化氮（NO）一起从精氨酸产生的，已知所述一氧化氮是具有血管舒张剂活性的物质并与天冬氨酸缩合以再生精氨酸。已知瓜氨酸展示有用的活性，如加速铵代谢（非专利参考文献1）、因血管舒张而改善血流（非专利参考文献2）、降低血压（非专利参考文献3）、神经传递（非专利参考文献4）和消除活性氧（专利参考文献1）。

因而，日本在2007年已经批准瓜氨酸作为食物材料，如补充剂。海外更早期就已经使用瓜氨酸。在美国，瓜氨酸可以作为补充剂通过商业途径获得用于改善血流、防止动脉硬化和能量增强，并且在欧洲，瓜氨酸-苹果酸盐可以作为药剂通过商业途径获得用于从疲劳中恢复。

尽管已经报道了瓜氨酸的多种活性，但还不知道瓜氨酸具有佐剂活性。还未报道过包含瓜氨酸和抗原的疫苗以及包含瓜氨酸的佐剂。同样，没有关于发现瓜氨酸和抗氧化剂可一起用作佐剂的报道。

专利参考文献1：日本专利公开号2002-226370

专利参考文献2：日本专利公开号53-075387

专利参考文献3：日本专利公开号63-068091

专利参考文献4：WO 2011024748

专利参考文献5：WO 2008133208

非专利参考文献1：Cell Biochemistry and Function, "Effect of arginine, ornithine and citrulline supplementation upon performance and metabolism of trained rats", 2003,第21卷, 第85-91页

非专利参考文献2：European Journal of Pharmacology, "L-Citrulline mediated relaxation in the control and lipopolysaccharide-treated rat aortic rings", 2001,第431卷, 第61-69页

非专利参考文献3：Journal of Clinical Investigation, "L-arginine abrogates salt-sensitive hypertension in Dahl/Rapp rats", 1991,第88卷,第1559-1567页

非专利参考文献4：Gastroenterology, "L-citrulline recycling in opossum internal anal sphincter relaxation by nonadrenergic, noncholinergic nerve stimulation", 1997, 第112卷,第1250-1259页

非专利参考文献5：The Journal of Biological Chemistry, "A SIMPLE SYNTHESIS OF dl-CITRULLINE", 1938, 第122卷,第477-p484页

非专利参考文献6：The Journal of Organic Chemistry, "THE SYNTHESIS OF d,l-CITRULLINE FROM NON-BIOLOGICAL PRECURSORS", 1941,第6卷,第410-416页。

发明内容

本发明待解决的技术问题

本发明人已经研究了这样的佐剂，其避免了明矾佐剂的缺点（由于不溶解性等的不便利）和新佐剂如角鲨烯的缺点（严重的不良副作用）。因此，本发明目的在于提供可以增强抗原的免疫性，对人体高度安全并具有提高的便利性的佐剂。

（解决问题的方法）

观察上文情况，本发明人已经认真研究了可以发挥充分的抗体产生活性，高度安全并具有提高的便利性的佐剂，并且结果发现了迄今为止还没有报道的非常新的发现，即瓜氨酸可以发挥极好的佐剂活性。此外，因为在哺乳动物的活体中或多种食物产品中含有瓜氨酸，它（作为水溶性的物质）可以容易地与抗原混合并且高度安全。因而，根据本发明，通过使用瓜氨酸提供抗体产生活性极好、安全并便利的疫苗或佐剂变得可能。

本发明包括以下发明。

[1]包含瓜氨酸的佐剂组合物。

[2]根据[1]的佐剂组合物，其中所述瓜氨酸是选自L-瓜氨酸、D-瓜氨酸、L-硫瓜氨酸、L-硫代高瓜氨酸、S-甲基-L-硫代-瓜氨酸和S-乙基-L-硫瓜氨酸的一种或两种或更多种。

[3]根据[2]的佐剂组合物，其中所述瓜氨酸是L-瓜氨酸或D-瓜氨酸。

[4]根据[1]-[3]任一项的佐剂组合物，其中含有1 mg/mL-50 mg/mL的所述瓜氨酸。

[5]根据[1]-[4]任一项的佐剂组合物，其是用于肽抗原的一种组合物。

[6]根据[1]-[5]任一项的佐剂组合物，其还包含抗氧化剂。

[7]根据[6]的佐剂组合物，其中所述抗氧化剂是抗坏血酸。

[8]根据[6]或[7]的佐剂组合物，其中所述瓜氨酸与所述抗氧化剂的重量比例是1:2-2:1。

[9]根据[6]-[8]任一项的佐剂组合物，其包含1-10 mg/mL的所述抗氧化剂。

[10]疫苗组合物，其包含[1]-[9]任一项中阐明的包含瓜氨酸的佐剂组合物和抗原。

[11]根据[10]的疫苗组合物，其中所述抗原与所述瓜氨酸的重量比例是1:N，其中N是100或更高。

[12]根据[10]的疫苗组合物，其中所述抗原是来自流感病毒的抗原。

[13]根据[12]的疫苗组合物，其中来自流感病毒的所述抗原是选自血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质1(M1)、基质2(M2)和核蛋白质(NP)的至少一种或两种或更多种。

[14]根据[13]的疫苗组合物，其中来自流感病毒的所述抗原是血凝素(HA)。

[15]根据[13]的疫苗组合物，其中来自流感病毒的所述抗原是基质2(M2)。

[16]根据[12]-[15]任一项的疫苗组合物，其中来自流感病毒的所述抗原与所述瓜氨酸的重量比例是1:N，其中N是300或更高。

[17]根据[10]的疫苗组合物，其中所述抗原是肽。

[18]根据[17]的疫苗组合物，其中所述肽与所述瓜氨酸的重量比例是1:N，其中N是100或更高。

[19]根据[17]的疫苗组合物，其中所述肽是M2e肽、添加或插入一个或几个半胱氨酸的M2e肽、或添加含半胱氨酸肽的M2e肽。

[20]根据[19]的疫苗组合物，其中所述肽是通过将半胱氨酸残基分别插入从M2e肽N末端数第20位-第21位、第21位-第22位，和第22位-第23位之间位置中制备的合成肽。

[21]根据[19]或[20]的疫苗组合物，其中所述M2e肽与所述瓜氨酸的重量比例是1:N，其中N是200或更高。

[22]根据[17]的疫苗组合物，其中所述肽是淀粉状蛋白β(Aβ)肽、由淀粉状蛋白β(Aβ)肽部分的氨基酸序列组成的肽，或添加或插入一个或几个半胱氨酸的所述肽。

[23]根据[22]的疫苗组合物，其中所述肽是由从淀粉状蛋白β(Aβ)肽的N末端至C末端数28个氨基酸残基组成的肽，在其C末端添加了一个半胱氨酸。

[24]根据[22]或[23]的疫苗组合物，其中所述淀粉状蛋白β肽与所述瓜氨酸的重量比例是1:N，其中N是100或更高。

[25]根据[10]的疫苗组合物，其中所述抗原是由选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5的氨基酸序列中的至少一种或两种或更多种组成的肽。

[26]用于制备具有针对所述疫苗中含有的抗原产生抗体的增强能力的疫苗的方法，其包括向疫苗中添加瓜氨酸作为佐剂。

[27]根据[26]的方法，其中所述瓜氨酸是选自L-瓜氨酸、D-瓜氨酸、L-硫瓜氨酸、L-硫代高瓜氨酸、S-甲基-L-硫代-瓜氨酸和S-乙基-L-硫瓜氨酸的一种或两种或更多种。

[28]根据[27]的方法，其中所述瓜氨酸是L-瓜氨酸或D-瓜氨酸。

[29]根据[26]-[28]任一项的方法，其中以1 mg/mL-50 mg/mL添加所述瓜氨酸。

[30]根据[26]-[29]任一项的方法，其中所述抗原与所述瓜氨酸的重量比例是1:N，其中N是100或更高。

[31]根据[26]-[29]任一项的方法，其中所述抗原是来自流感病毒的抗原。

[32]根据[31]的方法，其中来自流感病毒的所述抗原是选自血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质1(M1)、基质2(M2)和核蛋白质(NP)的至少一种或两种或更多种。

[33]根据[32]的方法，其中来自流感病毒的所述抗原是血凝素(HA)。

[34]根据[32]的方法，其中来自流感病毒的所述抗原是基质2(M2)。

[35]根据[31]-[34]任一项的方法，其中来自流感病毒的所述抗原与所述瓜氨酸的重量比例是1:N，其中N是300或更高。

[36]根据[26]的方法，其中所述抗原是肽。

[37]根据[36]的方法，其中所述肽与所述瓜氨酸的重量比例是1:N，其中N是100或更高。

[38]根据[36]的方法，其中所述肽是M2e肽、添加或插入一个或几个半胱氨酸的M2e肽、或添加含半胱氨酸肽的M2e肽。

[39]根据[38]的方法，其中所述肽是通过将半胱氨酸残基分别插入从M2e肽N末端数第20位-第21位、第21位-第22位，和第22位-第23位之间位置中制备的合成肽。

[40]根据[38]或[39]的方法，其中所述M2e肽与所述瓜氨酸的重量比例是1:N，其中N是200或更高。

[41]根据[36]的方法，其中所述肽是淀粉状蛋白β(Aβ)肽、由淀粉状蛋白β(Aβ)肽部分的氨基酸序列组成的肽，或添加或插入一个或几个半胱氨酸的所述肽。

[42]根据[41]的方法，其中所述肽是由从淀粉状蛋白β(Aβ)肽的N末端至C末端数28个氨基酸残基组成的肽，在其C末端添加了一个半胱氨酸。

[43]根据[41]或[42]的方法，其中所述淀粉状β肽与所述瓜氨酸的重量比例是1:N，其中N是100或更高。

[44]根据[26]的方法，其中所述抗原是由选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5的氨基酸序列中的至少一种或两种或更多种组成的肽。

[45]根据[26]-[44]任一项的方法，其包括除瓜氨酸外还添加抗氧化剂。

[46]根据[45]的方法，其中所述抗氧化剂是抗坏血酸。

[47]根据[45]或[46]的方法，其中以1:2-2:1的重量比例添加所述瓜氨酸和所述抗氧化剂。

[48]根据[45]-[47]任一项的方法，其中以1-10 mg/mL添加所述抗氧化剂。

[49]瓜氨酸作为佐剂的用途。

[50]根据[49]的用途，其中所述瓜氨酸是选自L-瓜氨酸、D-瓜氨酸、L-硫瓜氨酸、L-硫代高瓜氨酸、S-甲基-L-硫代-瓜氨酸和S-乙基-L-硫瓜氨酸的一种或两种或更多种。

[51]根据[50]的用途，其中所述瓜氨酸是L-瓜氨酸或D-瓜氨酸。

[52]根据[49]-[51]任一项的用途，其中以1 mg/mL-50 mg/mL向疫苗中添加所述瓜氨酸。

[53]根据[49]-[52]任一项的用途，其中还使用抗氧化剂。

[54]根据[53]的用途，其中所述抗氧化剂是抗坏血酸。

[55]根据[53]或[54]的用途，其中以1:2-2:1的重量比例向疫苗添加所述瓜氨酸和所述抗氧化剂。

[56]根据[53]-[55]任一项的用途，其中以1 -10 mg/mL向疫苗中添加所述抗氧化剂。

发明效果

根据本发明，与单独施用抗原相比，通过一起施用瓜氨酸和抗原，增强免疫原性变得可能。据发现，瓜氨酸发挥与传统佐剂（明矾佐剂）相同程度的抗体产生效应，并且当抗原是肽时发挥比明矾佐剂高的抗体产生效应。据还发现，通过使用瓜氨酸和抗氧化剂（例如抗坏血酸）的组合作为佐剂与单独使用瓜氨酸作为佐剂相比提高了抗体产生效应。

此外，因为瓜氨酸是在活体中天然存在的水可溶解物质，所以它与传统明矾佐剂或油性佐剂相比，可以容易地与抗原混合，由此减少不良副作用的风险。因而，本发明的包含瓜氨酸的佐剂组合和疫苗组合物具有提高的便利性并且对人体高度安全。此外，因为瓜氨酸可以通过化学合成或微生物大量生产而制备，所以它们可以作为佐剂而提供用于在生产药学制剂生产规模中的疫苗。

附图简述

图1显示了当以1-5mg/身体向小鼠施用瓜氨酸时针对HA抗原的抗体效价的测量结果。

图2显示了当以4mg/身体向小鼠施用瓜氨酸时针对M2e抗原的抗体效价的测量结果。

实施本发明的最佳方式

本发明的第一个实施方案是包含瓜氨酸的佐剂组合物。

本发明的佐剂组合物中含有的瓜氨酸包括瓜氨酸、瓜氨酸衍生物和瓜氨酸的盐。瓜氨酸包括L-瓜氨酸和D-瓜氨酸，优选L-瓜氨酸。瓜氨酸衍生物包括L-硫瓜氨酸、L-硫代高瓜氨酸、S-甲基-L-硫代-瓜氨酸和S-乙基-L-硫瓜氨酸。因此，本发明的瓜氨酸包括L-瓜氨酸、D-瓜氨酸、L-硫瓜氨酸、L-硫代高瓜氨酸、S-甲基-L-硫代-瓜氨酸和S-乙基-L-硫瓜氨酸。

本发明的佐剂组合物中含有的瓜氨酸可以是瓜氨酸的盐。瓜氨酸的盐包括酸加成盐、金属盐、铵盐、有机胺加成盐、氨基酸加成盐等。酸加成盐包括无机酸盐如氢氯化物、硫酸盐、硝酸盐和磷酸盐，以及有机酸盐如醋酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐、乳酸盐、α-酮戊二酸盐、葡萄糖酸盐和辛酸盐。金属盐包括碱金属盐如钠盐和钾盐；碱土金属盐如镁盐和钙盐；铝盐、锌盐等。铵盐包括铵、四甲铵等。有机胺加成盐包括吗啉、哌啶等。氨基酸加成盐包括甘氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等的盐。

可通过化学合成、发酵等获得瓜氨酸。瓜氨酸的化学合成包括例如在Gastroenterology, 1997,第 112卷, 第1250-1259页(非专利参考文献4)和The Journal of Biological Chemistry, 1938, 第122卷, 第477-p484页(非专利参考文献5)中描述的那些。L-瓜氨酸的发酵生产包括例如在日本专利公开号53-075387（专利参考文献2）和日本专利公开号63-068091（专利参考文献3）中公开的那些。还可以通过购买市售产品，包括例如L-瓜氨酸(Sigma-Aldrich: Code No.27510和C7629), L-硫瓜氨酸(Sigma-Aldrich: Code No.88544, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.: Code No.205-13861)和S-甲基-L-硫瓜氨酸(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.: Code No.139-12611)获得瓜氨酸。

适当时，根据抗原的种类、剂量形式、施用方式、患者等，本发明佐剂组合物中含有的瓜氨酸的浓度可以变化。本发明的佐剂组合物可以包含A mg/mL-B mg/mL的瓜氨酸，其中A和B是选自1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95和100的不同数值并且其中A小于B。

适当时，根据抗原的种类、剂量形式、施用方式等，本发明佐剂组合物使用的瓜氨酸的剂量可以变化。

本发明的佐剂组合物除瓜氨酸外还可以包含抗氧化剂。抗氧化剂包括例如，抗坏血酸（维生素C）、α-生育酚（维生素E）、谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸、丁基羟基茴香醚、儿茶素、槲皮素、尿酸、胆红素、葡萄糖、黄酮类化合物、ceruloplasmine、白蛋白、铁蛋白、金属硫蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽转移酶、过氧化氢酶和硫氧还蛋白，优选抗坏血酸和α-生育酚。

在疫苗组合物或佐剂组合物除瓜氨酸外还包含抗氧化剂的情况下，瓜氨酸与抗氧化剂的重量比例可以是1：2-2:1，优选1:1。本发明的佐剂组合物可以包含1-10 mg/mL，优选5 mg/mL的抗氧化剂。

本发明的第二个实施方案是包含佐剂组合物（其包含瓜氨酸）和抗原的疫苗组合物。

抗原可以是疫苗中通常含有的任何抗原，其包括例如，碳水化合物、糖脂、糖蛋白、脂质、脂蛋白、磷脂、肽、多肽、蛋白质、多核苷酸、寡核苷酸及其衍生物。如本文所用，“肽”指由2个至几十个氨基酸组成的那些，然而“多肽”指由几十个至更多个氨基酸组成的那些。在上文列出的抗原中，蛋白质、多肽和肽是优选的。肽可以优选用作抗原，因为尤其当肽作用抗原时，包含瓜氨酸的本发明的佐剂组合物可以发挥抗体产生效应。

可通过遗传重组、化学合成或从天然发生的物质获得抗原。

抗原可以是病原体（病毒、细菌、真菌、寄生微生物）、病毒样颗粒、病毒小体、癌细胞、变应原或衍生自自身分子的抗原。

衍生自病原体的抗原可以是亚基抗原、肽抗原、灭活的病原体、减毒病原体或重组抗原。

病毒包括例如,肝炎病毒、RS病毒、腺病毒、禽副粘病毒（avulavirus）、isavirus、犬瘟热病毒、流感病毒A-C、马动脉炎病毒、埃博拉病毒、肠道病毒、嵌杯样病毒、冠形病毒、猴免疫缺陷病毒、索戈托病毒、Deng病毒、披膜病毒、禽传染性滑膜囊疾病病毒、禽肺病毒（以前是火鸡鼻气管炎病毒）、nipah病毒、新城疫病毒、肺病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫白血病病毒、诺瓦克病毒、乳头状瘤病毒、乳多空病毒、副流感病毒1-3型、细小病毒、微小核糖核酸病毒、人巨细胞病毒、人免疫缺陷病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒、黄病毒、亨尼帕病毒、肝脱氧核糖核酸病毒、疱疹病毒、Hendra病毒、脊髓灰质炎病毒、马立克病病毒、偏肺病毒、麻疹病毒、鼻病毒、腮腺炎病毒、呼吸道病毒、逆转录病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、传染性鼻气管炎病毒、牛瘟麻疹病毒、狂犬病病毒、水痘病毒、脑炎病毒、风疹病毒、麻疹病毒和腮腺炎病毒，优选流感病毒。

流感病毒是属于正粘病毒科家族的具有约100 nm病毒颗粒大小的RNA包膜病毒并且根据内部蛋白质的抗原性被划分成A、B或C型，其中A型可在人和动物中引起感染并显示高度多样性。A型具有两种类型的被膜糖蛋白、血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）。由于抗原性的差异，HA具有16种亚型，NA具有9种亚型。这些亚型的组合产生A型流感病毒的许多血清型。当以过去未出现的亚型组合的流感病毒出现时，由于其中缺少免疫性，流感变得极其普遍，即所谓的流感大流行。

如本文用作为抗原的流感病毒可以是任何类型、亚型或种类。衍生自流感病毒的抗原包括HA、NA、M1、M2和NP，最优选HA和M2。原因是，因为HA在传统流感疫苗组合物中用作抗原，所以包含HA作为抗原的疫苗可以具有多样性。此外如在WO 2011024748 (专利参考文献4)中所公开，从可以赋予针对广泛流感病毒免疫性的观点上看，流感病毒中其氨基酸序列中具有更少突变的M2蛋白质可以是有用的。M2蛋白质可以是对应于从M2去除疏水跨膜结构域后产生的23个氨基酸残基组成的区域的肽(M2e;SEQ ID NO: 1; N-末端SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD C-末端)，或是为增强M2e肽的抗原性目的添加或插入1个或几个半胱氨酸残基的M2e肽，或添加含半胱氨酸肽的M2e肽。如上用半胱氨酸修饰的M2e肽包括在WO 2011024748（专利参考文献4）中公开的那些肽，具体是合成肽M2eC212223 (SEQ ID NO: 2; N-末端SLLTEVETPIRNEWGCRCNCDCSCSD C-末端)，其中半胱氨酸残基分别插入到从M2e的N末端数第20位-第21位、第21位-第22位，和第22位-第23位之间。

为了从流感病毒制备抗原，可以不受具体限制地使用任何已知方法。例如，从感染了流感病毒的动物或患有流行性感冒的患者中分离的病毒菌株可以以常规方式感染鸡蛋或细胞用于培养，并且可以从纯化的病毒贮存液中制备抗原。或者，还可以从遗传重组的病毒或在多种细胞中产生或表达的具体抗原中制备抗原。

用作抗原的自身分子包括淀粉状蛋白β肽或由淀粉状蛋白β肽的部分氨基酸序列组成的肽。淀粉状蛋白β肽或由淀粉状蛋白β肽的部分氨基酸序列组成的肽可以是添加或插入1个或几个半胱氨酸残基或添加含半胱氨酸肽的那些肽。这些肽包括在WO 2008133208（专利参考文献5）中公开的那些。具体是，淀粉状蛋白β肽可以是由42个氨基酸残基组成的淀粉状蛋白β肽 (SEQ ID NO: 3;

N-末端 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA C-末端)。由淀粉状蛋白β肽的部分氨基酸序列组成的肽可以是由从N末端数28个氨基酸残基组成的肽(SEQ ID NO: 4;

N-末端 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK C-末端)。添加1个或几个半胱氨酸残基的肽可以是28AACys肽(SEQ ID NO: 5;

N-末端 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKC C-末端),其中一个半胱氨酸残基添加到由从N末端数28个氨基酸残基组成的肽的C末端。

细菌包括例如，胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）、耳炎紧密球菌（Alloiococcus otitis）、流感细菌(Influenza bacteria )（包括那些类型可分类的和那些非类型可分类的）、小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia bacteria）、鹦鹉热衣原体（Chlamydia psittaci）、弯曲杆菌（Campylobacter）、肺炎衣原体病原体（Chlamydia pneumonia pathogen）、梭状芽孢杆菌（Clostridia）种、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）、猪霍乱沙门氏菌（ Salmonella choleraesuis）、贾第鞭毛虫（Giardia）、白喉杆菌（diphtheria bacteria）、假单胞菌（Pseudomonas）种、戈登链球菌（Streptococcus gordonii）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、牛链球菌（Streptococcus bovis）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）、鸟分枝杆菌（Mycobacterium avium）组、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、溶血巴斯德氏菌（Pasteurella haemolytica）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）、结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、猪链球菌（Streptococcus suis）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）、睡眠嗜血杆菌（Haemophilus somnus）、幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori）、伯疏氏螺旋体（Borrelia burgdorferi）、鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum）、卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis）、钩端螺旋体（Leptospira interrogans）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）、脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）、志贺氏菌（Shigella）、马链球菌（Streptococcus equi）、大肠杆菌（Escherichia coli）、炭疽（anthrax）、伤寒杆菌（typhoid bacteria）、破伤风杆菌（Clostridium tetani）、肺炎双球菌（Streptococcus pneumoniae）、百日咳杆菌（Bordetella pertussis）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、粪链球菌（Streptococcus faecalis）、草绿色链球菌（Streptococcus viridans）和淋球菌（Neisseria gonorrhoeae）。

寄生虫包括例如，溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）、疟原虫（Plasmodium）、硕大利什曼原虫（Leishmania major）、蛔虫（Ascaris）、鞭虫（Trichuris）、贾第虫（Giardia）、血吸虫（Schistosoma）、隐孢子虫（Cryptosporidium）、滴虫（Trichomonas）、弓形体（Toxoplasma）和卡氏肺囊虫（Pneumocystis carinii）。

根据抗原的种类、疫苗组合物的施用方式、剂量形式等，本发明的疫苗组合物中含有的抗原浓度可以适当地变化。

本发明的疫苗组合物中含有的抗原和瓜氨酸的重量比例可以是1：N，其中N优选为100或更高、200或更高、300或更高、333或更高、400或更高、800或更高、3000或更高、3333或更高、6000或更高、6666或更高、10000或更高、13000或更高、13333或更高、160000或更高、或16666或更高。抗原和瓜氨酸的重量比例还可以是1：A-1：B，其中A和B是选自100、200、300、333、400、800、3000、3333、6000、6666、10000、13000、13333、16000和16666的不同数值并且其中A小于B。

在抗原是HA蛋白质的情况下，本发明的疫苗组合物中含有的抗原和瓜氨酸的重量比例可以是1：N，其中N优选为300或更高、333或更高、3000或更高、3333或更高、6000或更高、6666或更高、10000或更高、13000或更高、13333或更高、160000或更高、或16666或更高。抗原和瓜氨酸的重量比例还可以是1：A-1：B，其中A和B是选自300、333、3000、3333、6000、6666、10000、13000、13333、16000和16666的不同数值并且其中A小于B。

在抗原是肽的情况下，本发明的疫苗组合物中含有的抗原和瓜氨酸的重量比例可以是1：N，其中N优选为100或更高、200或更高、400或更高、或800或更高。抗原和瓜氨酸的重量比例还可以是1：A-1：B，其中A和B是选自100、200、400和800和16666的不同数值并且其中A小于B。

在抗原是M2e肽的情况下，本发明的疫苗组合物中含有的抗原和瓜氨酸的重量比例可以是1：N，其中N优选为200或更高。

在抗原是淀粉状蛋白β肽的情况下，本发明的疫苗组合物中含有的抗原和瓜氨酸的重量比例可以是1：N，其中N优选为100或更高、200或更高、400或更高、或800或更高。抗原和瓜氨酸的重量比例还可以是1：A-1：B，其中A和B是选自100、200、400和800和16666的不同数值并且其中A小于B。

根据抗原的种类、疫苗组合物的施用方式、剂量形式等，本发明的疫苗组合物的抗原的剂量可以适当地变化。

本发明的疫苗组合物可以包含单个抗原或多个抗原的组合。在本发明的疫苗组合物包含多个抗原的组合的情况下，其可以包含来自同一病毒或细菌来源的不同类型的多个抗原或来自不同病毒或细菌来源的多个抗原。在流感病毒的疫苗组合物的情况下，其可以优选包含来自A型和B型流感病毒的不同类型的抗原。

疫苗组合物的剂量形式可以是使得瓜氨酸和抗原配制在单个容器中，或者包含瓜氨酸的佐剂组合物和包含抗原的免疫原组合物配制在不同的容器中。配制后的剂量形式可以是例如，液体、粉末（冻干粉末、干燥粉末）、胶囊、片剂、冻干形式等。

佐剂组合物和疫苗组合物的剂量形式可以是例如，液体、粉末（冻干粉末、干燥粉末）、胶囊、片剂、冻干形式等。

佐剂组合物和疫苗组合物除了瓜氨酸和抗原之外还可以包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可以是一般用于生产疫苗的任何载体。尤其是，所述载体包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、等渗水缓冲液及其组合。佐剂组合物和疫苗组合物适当时还可以包含乳化剂、防腐剂（例如硫柳汞）、等渗剂、pH调节剂和灭活剂（例如福尔马林）。

待予施用佐剂组合物和疫苗组合物的目标可以是可以免疫的任何生物，包括人和其他哺乳动物（例如家畜、宠物和野生动物）。

佐剂组合物和疫苗组合物的施用途径包括例如，经皮、舌下、滴眼剂、皮内、肌内、口腔、肠内、经鼻、静脉内、皮下、腹膜内、从口吸入肺等。

可以利用例如支架、导管、透皮贴剂、显微针、可移植的缓释装置、注射器、具有显微针的注射器、无针装置或喷雾施用佐剂组合物和疫苗组合物。在将抗原和佐剂组合物配制到单独的容器中的情况下，可以同时施用所述抗原和佐剂组合物或施用其中一种，然后在确定的间隔内施用另一种。

通过以下实施例更详细地解释本发明，而不对其进行限制。

实施例1

如下所述制备用作佐剂的瓜氨酸溶液。将L-瓜氨酸(Sigma, C7629-1G)以80 mg/mL的终浓度溶解在蒸馏溶液中用于注射（由Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.制备）。所述溶液利用0.22 μm进行无菌过滤并通过冻干储存在-20℃，直至使用。

（1）制备包含瓜氨酸的组合物

对于抗原,制备了流感病毒的HA抗原(菌株:A/Solomon;成分1200 μg/mL HA)。将HA抗原与多种浓度的瓜氨酸混合，以制备如表1中显示的组合物1-4（组合物1不含有瓜氨酸）。作为对照，制备HA抗原和明矾佐剂(Imject Alum (PIERCE)或ALHYDROGEL (BRENNTAG))的混合物（表1中的对照）。

表1

（2）小鼠免疫和血清回收

如下文所述，以每只小鼠100 μL向小鼠施用组合物1-4或对照（在表1中描述了每只小鼠的剂量）。为6周龄的雌性BALB/c小鼠称重并均匀地分成4组，每组由三只小鼠组成。利用动物标记物识别每只单独的小鼠。在施用测试样品的日期，在利用异氟烷吸入麻醉后使用毛细管从小鼠的眼窝窦中取得血液。离心后，将血清的等分试样装入管中。各自0.1 mL的测试样品装入一次性1 mL注射器(Terumo)中并在小鼠的颈后部经皮下施用。在施用测试样品后的第14天，在用异氟烷吸入麻醉后对小鼠进行剖腹手术并从腹膜中的下腔静脉取出全血。将血在室温下保持超过30分钟并在离心（3000 rpm，10分钟）后分离血清。如上所述通过ELISA测量因此获得的血清中针对HA抗原的抗体。

（3）通过ELISA测量抗HA抗体效价

以 50 μL/孔向ELISA板中加入以1 μg/mL用于免疫的相同抗原并在 4℃保持过夜用于通过自然吸附的固定。利用PBS（当天制备的）洗涤所述板三次并以 200 μL/孔向其中加入PBS中的BlockerTM Casein(Thermo)用于在室温下反应1小时。利用PBS洗涤所述板三次后，以 50μL/孔向该板加入利用PBS中的BlockerTM Casein稀释200倍的抗血清（第0天、第14天）用于在室温下反应2小时。以 50μL/孔加入利用PBS中的BlockerTM Casein稀释2000倍的抗小鼠IgG-POD标记的抗体(Thermo)用于在室温下反应1小时。利用PBS洗涤四次后，以50μL/孔加入底物TMB(BioFX)用于在室温下反应15分钟。然后，以50μL/孔加入1N H₂SO₄，以终止反应。测量450 nm处的吸光值。

（4）结果

ELISA的结果显示于表1中。在利用瓜氨酸和抗原免疫的组中，特别是以100 μg/身体-1000 μg/身体施用瓜氨酸的组中，与单独施用抗原的组相比，明显地观察到佐剂效应。尤其是，与单独施用抗原的组相比，施用100 μg/身体瓜氨酸的组中抗体产生效应高约1.3倍，施用1000 μg/身体瓜氨酸的组中抗体产生效应高约1.9倍。具体而言，在施用1000 μg/身体瓜氨酸的组中观察到的佐剂效应与明矾佐剂的效应程度相同。还观察到，抗体产生随瓜氨酸剂量的增加而增加。

实施例2

由于可以看到实施例1的结果中显示的瓜氨酸的佐剂效应，所以研究了其最适量。在实施例1中，当检查10-1000 μg/身体的不同剂量时，发现1000 μg/身体瓜氨酸的剂量显示最高的佐剂效应。因此，研究了更高剂量瓜氨酸的效应。

（1）制备包含瓜氨酸的组合物

利用实施例1中描述的方法，制备具有不同浓度瓜氨酸的组合物5-10（表2；不含瓜氨酸的组合物5）。

表2

（2）小鼠免疫和血清回收

利用实施例1中描述的方法，以每只小鼠100 μL向小鼠施用组合物5-10并回收血清（在表2中描述了每只小鼠的剂量）。

（3）通过ELISA测量抗HA抗体效价

利用实施例1中描述的ELISA方法，测量抗体效价。

（4）结果

ELISA的结果显示于图1中。在施用瓜氨酸的所有组中观察到佐剂效应。在该范围内，在一定程度上可以看到剂量依赖性。

实施例3

（1）制备包含瓜氨酸的组合物

对于抗原，使用合成肽M2eC212223 (SEQ ID NO: 2; N-末端SLLTEVETPIRNEWGCRCNCDCSCSD C-末端)，其中将半胱氨酸残基分别插入从A型流感病毒的M2蛋白质的23个氨基酸残基组成的区域的N末端数第20位-第21位、第21位-第22位，和第22位-第23位之间，所述区域在病毒表面上呈现（M2e; SEQ ID NO: 1; N-末端SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD C-末端）。

如在WO 2011024748（专利参考文献4）中所述，M2eC212223肽是合成的。利用含有 1 mM EDTA的氮气置换的蒸馏水制备5 mg/mL的合成肽用于注射并作为贮存液储存在低于 -80℃下直至使用。制备不含瓜氨酸作为测试物质的组合物11和与实施例1中制备的瓜氨酸溶液混合的组合物12（表3）。

表3

（2）小鼠免疫和血清回收

如下文所述进行对小鼠的免疫。将7周龄的雌性BALB/c小鼠分成2组，每组由5只小鼠组成。利用动物标记物识别每只单独的小鼠。测试样品装入一次性的1 mL 注射器(Terumo)中并以每只小鼠0.1 mL在小鼠的颈后部经皮下施用（在表3中描述了每只小鼠的剂量）。以2周间隔施用所述测试样品两次。在第二次施用后的一周，在用戊巴比妥(Kyoritsu Seiyaku Corporation)麻醉后对小鼠进行剖腹手术并从腹膜中的下腔静脉获取全血。如在实施例1中所述进行血清的分离。

（3）通过ELISA测量抗M2e抗体效价

按照如WO 2011024748（专利参考文献4）中描述的程序，测量血清中针对M2e的抗体效价。具体是，利用0.1 M碳酸盐缓冲液，pH9.6将M2e稀释至2 μg/mL，以100 μL/孔加入到96孔板(Nunc, Immobilizer Amino) 中并保持在4℃过夜以固定。第二天，用含有0.05% Tween 20的300 μL磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤各个孔三次。加入用0.1 M碳酸盐缓冲液，pH9.6稀释至10 mM的单乙醇胺(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)各300 μL/孔，并将板在室温下保持1小时。然后，彻底去除10 mM单乙醇胺并以100 μL/孔加入PBST稀释的样品（各样品一式两份）。在室温下反应1小时后，丢弃所加入的稀释血清并利用PBST以300 μL/孔洗涤板三次。洗涤后，彻底去除各孔中的洗涤溶液并以100 μL/孔加入利用PBST稀释2000倍的HRP-标记的抗小鼠IgG山羊抗体(American Qualax, A131PS)，以在室温下反应1小时。反应后，丢弃标记抗体的稀释溶液并利用PBST以300 μL/孔洗涤板两次并利用相同量的蒸馏水洗涤两次。以100 μL/孔加入显色底物TMB+ (Dako)的溶液用于在室温避光反应30分钟。然后，以100μL/孔加入1N硫酸，以终止显色。测量450 nm(OD450)处的吸光值。

（4）结果

ELISA的结果显示于图2中。使用瓜氨酸作为佐剂的抗体产生效应比不使用瓜氨酸时高约14倍。这证明瓜氨酸不仅对流感病毒的HA抗原还对合成肽M2eC212223可以显示佐剂效应。

实施例4

（1）制备包含瓜氨酸的组合物

对于抗原，使用合成肽28AACys (SEQ ID NO: 5;

N-末端 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKC C-末端),其中一个半胱氨酸残基添加到由从N末端数28个氨基酸残基组成的肽(SEQ ID NO: 4;

N-末端 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK C-末端)的C-末端,其为由42个氨基酸残基组成的淀粉状蛋白β肽的部分(SEQ ID NO: 3;

N-末端 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA C-末端)。

合成肽如在WO 2008133208(专利参考文献5)中所述合成(Hokkaido System Science Co., Ltd.)并用盐水作为贮存液制备为5 mg/mL，并储存在低于 -80℃中直至使用。对于应用,以10 μg/身体制备溶液。

如下所述制备用作佐剂的瓜氨酸溶液。以50 mg/mL的终浓度将L-瓜氨酸(Sigma, C7629-1G)溶解在盐水中（Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.）。通过冻干将溶液储存在-30℃，直至使用。同样，以50 mg/mL的终浓度将L-抗坏血酸(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)溶解在盐水(Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.)中并将溶液储存在4℃冷藏，直至使用。对于对照，使用明矾(ALHYDROGEL)。将瓜氨酸溶液、28AACys和抗坏血酸溶液混合在一起，以制备表4中显示的对照1和2以及组合物13-18。

表4

（2）小鼠免疫和血清回收

如下文所述进行对小鼠的免疫。将7周龄的雄性C57BL/6小鼠分成8组，每组由4只小鼠组成。利用动物标记物识别每只单独的小鼠。使用用于结核菌素(Terumo; SS-01T2613S)的1 mL注射器以每只200 μL向小鼠的腹部经皮下施用组合物（在表4中描述了每只小鼠的剂量）。以2周间隔免疫小鼠两次。在第二次免疫后第14天，从戊巴比妥钠(Kyoritsu Seiyaku Corporation; Somnopentyl)麻醉后的腹膜中的下腔静脉获取血，并将小鼠处死。将所取得的血转移到Microtina (BECTON DICKINSON)中并在室温下充分凝固，然后离心（5000rpm，10分钟）。将分离的血清分配到两个 0.5 mL管中并储存在-80℃中，直至测量。如下所述通过ELISA测量血清中针对Aβ的抗体。

（3）通过ELISA测量抗Aβ IgG抗体效价

将利用0.1 M碳酸盐缓冲液,pH9.6稀释至10 μg/mL的Aβ肽(1-40氨基酸序列:N-末端DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV (SEQ ID NO: 6)，由Hokkaido System Science Co., Ltd.合成)以100 μL/孔加入到8孔条(Nalgen-Nunc, Immobilizer Amino)中并在4℃保持过夜用于固定。第二天，用含有0.05% Tween 20的300 μL的PBS（PBST）洗涤各个孔三次。加入各300μL/孔的10 mM乙醇胺并将板在室温保持1小时。然后，彻底去除10 mM乙醇胺并以100 μL/孔加入PBST稀释50倍至10000倍的样品（各样品一式两份）。在室温下反应1小时后，丢弃所加入的稀释血清并利用PBST以300 μL/孔洗涤板三次。洗涤后，彻底去除各孔中的洗涤溶液并以100 μL/孔加入利用样品稀释液稀释2000倍的HRP-标记的抗小鼠IgG山羊抗体(American Qualax, A131PS)，用于在室温下反应1小时。反应后，丢弃标记抗体的稀释溶液并利用PBST以300 μL/孔洗涤板两次并利用相同量的蒸馏水洗涤两次。以100 μL/孔加入显色底物TMB+ (Dako)的溶液用于在室温避光反应30分钟。然后，以100μL/孔加入1N硫酸，以终止显色。测量450 nm(OD450)处的吸光值。

市售抗Aβ单克隆抗体(CHEMICON; MAB1560)用作标准血清。利用PBST将标准血清稀释至0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5、5和10 ng/mL，以制备标准用于测量抗体效价。测量一式两份的各稀释样品的OD450，同时测量各样品小鼠血清中抗Aβ IgG抗体。从所获得的标准单位和OD450的标准线计算各样品小鼠血清中的抗Aβ IgG抗体效价。

（4）结果

各免疫组中小鼠血清中所计算的抗Aβ抗体效价示于表4中。施用瓜氨酸的组（组合物13-16和18）与不施用佐剂的组（对照1）相比显示增强的抗体产生效应。尤其是，与不施用佐剂的组相比，施用1 mg/身体（组合物13）的组观察到高约11.6倍，施用2 mg/身体（组合物14）的组高约42.2倍，施用4 mg/身体（组合物15）的组高约125.8倍，和施用8 mg/身体（组合物16）的组高约141.7倍极其增强的抗体产生效应。

单独施用L-抗坏血酸的组显示几乎没有抗体产生效应（从对照1和组合物17的比较得知）。然而，施用L-抗坏血酸和瓜氨酸的组与单独施用瓜氨酸的组相比显示高约4.0倍的增强抗体产生效应（从组合物13和18的比较得知），与单独施用L-抗坏血酸的组相比显示高约12.1倍（从组合物17和18的比较得知），与施用明矾的组相比显示高约39.4倍（从对照2和组合物18的比较得知），和与不施用瓜氨酸的组相比高约46.9倍（从对照1和组合物18的比较得知）。

施用瓜氨酸的组与施用瓜氨酸和抗坏血酸两者的组均比施用明矾的组显示更高的抗体产生效应，即对组合物13而言高约9.8倍，对组合物14而言高约35.5倍，对组合物15而言高约105.6倍，对组合物16而言高约119倍，对组合物18而言高约39.4倍，因此证明与传统明矾佐剂相比具有极好的抗体产生效应。

从实施例1、2、3和4显示的结果明显地观察到瓜氨酸具有佐剂效应，不管抗原种类如何。对于具体浓度的瓜氨酸，效应与传统明矾佐剂的效应相同。具体而言，在肽抗原的情况下，效应比传统明矾佐剂的效应高。除此之外，据发现当瓜氨酸与抗坏血酸组合使用时，其显示增强的抗体产生效应。

此外，瓜氨酸高度安全，因在施用瓜氨酸的小鼠中既没有发现异常也没有发现硬化，在施用明矾的局部区域中看到所述异常和硬化。

工业应用性

本发明提供包含瓜氨酸的佐剂组合物和包含所述佐剂组合物和抗原的疫苗组合物。因为瓜氨酸对活体有用并且是水溶性物质，所以提供与传统明矾佐剂或油性佐剂相比高度安全和混合便利性上极佳的佐剂组合物和疫苗组合物变得可能。

序列表

<110> THE CHEMO-SERO-THERAPEUTIC RESEARCH INSTITUTE

<120> 包含瓜氨酸的佐剂组合物

<130> 670771

<150> JP 2011-053658

<151> 2011-03-11

<160> 6

<170> PatentIn版本3.4

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 1

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys

1 5 10 15

Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp

20

<210> 2

<211> 26

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 通过将半胱氨酸插入来自流感病毒M2蛋白质的肽中获得修饰的肽

<400> 2

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys

1 5 10 15

Arg Cys Asn Cys Asp Cys Ser Cys Ser Asp

20 25

<210> 3

<211> 42

<212> PRT

<213> 人类

<400> 3

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala

35 40

<210> 4

<211> 28

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 合成肽

<400> 4

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys

20 25

<210> 5

<211> 29

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 合成肽

<400> 5

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Cys

20 25

<210> 6

<211> 40

<212> PRT

<213> 人类

<400> 3

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val

35 40

Claims

1.包含瓜氨酸的佐剂组合物，其中所述瓜氨酸是选自L-瓜氨酸、D-瓜氨酸、L-硫瓜氨酸、L-硫代高瓜氨酸、S-甲基-L-硫代-瓜氨酸和S-乙基-L-硫瓜氨酸的一种或两种或更多种，并且其中含有1 mg/mL-50 mg/mL的所述瓜氨酸。

2.根据权利要求1的佐剂组合物，其中所述瓜氨酸是L-瓜氨酸或D-瓜氨酸。

3.根据权利要求1的佐剂组合物，其是用于肽抗原的一种佐剂组合物。

4.根据权利要求1-3任一项的佐剂组合物，其还包含抗氧化剂，其中所述瓜氨酸与所述抗氧化剂的重量比例是1:2-2:1。

5.根据权利要求4的佐剂组合物，其中所述抗氧化剂是抗坏血酸。

6.根据权利要求4的佐剂组合物，其包含1-10 mg/mL的所述抗氧化剂。

7.疫苗组合物，其包含权利要求1-6任一项中阐明的包含瓜氨酸的佐剂组合物和抗原。

8.根据权利要求7的疫苗组合物，其中所述抗原与所述瓜氨酸的重量比例是1:N，其中N是100或更高。

9.根据权利要求7的疫苗组合物，其中所述抗原是来自流感病毒的抗原。

10.根据权利要求9的疫苗组合物，其中来自流感病毒的所述抗原是选自血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质1(M1)、基质2(M2)和核蛋白质(NP)的至少一种或两种或更多种。

11.根据权利要求10的疫苗组合物，其中来自流感病毒的所述抗原是血凝素(HA)。

12.根据权利要求10的疫苗组合物，其中来自流感病毒的所述抗原是基质2(M2)。

13.根据权利要求9-12任一项的疫苗组合物，其中来自流感病毒的所述抗原与所述瓜氨酸的重量比例是1:N，其中N是300或更高。

14.根据权利要求7的疫苗组合物，其中所述抗原是肽。

15.根据权利要求14的疫苗组合物，其中所述肽与所述瓜氨酸的重量比例是1:N，其中N是100或更高。

16.根据权利要求14的疫苗组合物，其中所述肽是M2e肽、添加或插入一个或几个半胱氨酸的M2e肽、或添加含半胱氨酸肽的M2e肽。

17.根据权利要求16的疫苗组合物，其中所述肽是通过将半胱氨酸残基分别插入从M2e肽的N末端数第20位-第21位、第21位-第22位，和第22位-第23位之间位置中制备的合成肽。

18.根据权利要求16或17的疫苗组合物，其中所述M2e肽与所述瓜氨酸的重量比例是1:N，其中N是200或更高。

19.根据权利要求14的疫苗组合物，其中所述肽是淀粉状蛋白β(Aβ)肽、由淀粉状蛋白β(Aβ)肽部分的氨基酸序列组成的肽，或添加或插入一个或几个半胱氨酸的所述肽。

20.根据权利要求19的疫苗组合物，其中所述肽是由从淀粉状蛋白β(Aβ)肽的N末端至C末端数28个氨基酸残基组成的肽，在其C末端添加了一个半胱氨酸。

21.根据权利要求19或20的疫苗组合物，其中所述淀粉状蛋白β肽与所述瓜氨酸的重量比例是1:N，其中N是100或更高。

22.根据权利要求7的疫苗组合物，其中所述抗原是由选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5的氨基酸序列中的至少一种或两种或更多种组成的肽。

23.用于制备具有针对所述疫苗中含有的抗原产生抗体的增强能力的疫苗的方法，其包括向疫苗中添加瓜氨酸作为佐剂，其中所述瓜氨酸是选自L-瓜氨酸、D-瓜氨酸、L-硫瓜氨酸、L-硫代高瓜氨酸、S-甲基-L-硫代-瓜氨酸和S-乙基-L-硫瓜氨酸的一种或两种或更多种，并且其中以1 mg/mL-50 mg/mL添加所述瓜氨酸。

24.根据权利要求23的方法，其中所述瓜氨酸是L-瓜氨酸或D-瓜氨酸。

25.根据权利要求23或24的方法，其中所述抗原与所述瓜氨酸的重量比例是1:N，其中N是100或更高。

26.根据权利要求23的方法，其中所述抗原是来自流感病毒的抗原。

27.根据权利要求26的方法，其中来自流感病毒的所述抗原是选自血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质1(M1)、基质2(M2)和核蛋白质(NP)的至少一种或两种或更多种。

28.根据权利要求27的方法，其中来自流感病毒的所述抗原是血凝素(HA)。

29.根据权利要求27的方法，其中来自流感病毒的所述抗原是基质2(M2)。

30.根据权利要求26-29任一项的方法，其中来自流感病毒的所述抗原与所述瓜氨酸的重量比例是1:N，其中N是300或更高。

31.根据权利要求23的方法，其中所述抗原是肽。

32.根据权利要求31的方法，其中所述肽与所述瓜氨酸的重量比例是1:N，其中N是100或更高。

33.根据权利要求31的方法，其中所述肽是M2e肽、添加或插入一个或几个半胱氨酸的M2e肽、或添加含半胱氨酸肽的M2e肽。

34.根据权利要求33的方法，其中所述肽是通过将半胱氨酸残基分别插入从M2e肽的N末端数第20位-第21位、第21位-第22位，和第22位-第23位之间位置中制备的合成肽。

35.根据权利要求33或34的方法，其中所述M2e肽与所述瓜氨酸的重量比例是1:N，其中N是200或更高。

36.根据权利要求31的方法，其中所述肽是淀粉状蛋白β(Aβ)肽、由淀粉状蛋白β(Aβ)肽部分的氨基酸序列组成的肽，或添加或插入一个或几个半胱氨酸的所述肽。

37.根据权利要求36的方法，其中所述肽是由从淀粉状蛋白β(Aβ)肽的N末端至C末端开始数28个氨基酸残基组成的肽，在其C末端添加了一个半胱氨酸。

38.根据权利要求36或37的方法，其中所述淀粉状蛋白β肽与所述瓜氨酸的重量比例是1:N，其中N是100或更高。

39.根据权利要求23的方法，其中所述抗原是由选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5的氨基酸序列中的至少一种或两种或更多种组成的肽。

40.根据权利要求23的方法，其包括除瓜氨酸外还添加抗氧化剂，其中以1:2-2:1的重量比例添加所述瓜氨酸和所述抗氧化剂。

41.根据权利要求40的方法，其中所述抗氧化剂是抗坏血酸。

42.根据权利要求40或41的方法，其中以1-10 mg/mL添加所述抗氧化剂。

43.瓜氨酸作为佐剂在制备疫苗中的用途，其中所述瓜氨酸是选自L-瓜氨酸、D-瓜氨酸、L-硫瓜氨酸、L-硫代高瓜氨酸、S-甲基-L-硫代-瓜氨酸和S-乙基-L-硫瓜氨酸的一种或两种或更多种，并且其中以1 mg/mL-50 mg/mL向疫苗中添加所述瓜氨酸。

44.根据权利要求43的用途，其中所述瓜氨酸是L-瓜氨酸或D-瓜氨酸。

45.根据权利要求43或44的用途，其中还使用抗氧化剂，其中以1:2-2:1的重量比例向疫苗添加所述瓜氨酸和所述抗氧化剂。

46.根据权利要求45的用途，其中所述抗氧化剂是抗坏血酸。

47.根据权利要求45的用途，其中以1 -10 mg/mL向疫苗中添加所述抗氧化剂。