KR20140012115A

KR20140012115A - 시트룰린을 함유하는 애주번트 조성물

Info

Publication number: KR20140012115A
Application number: KR1020137025814A
Authority: KR
Inventors: 치카테루 노자키; 가츠요시 가미나카; 주니치 마츠다
Original assignee: 잇빤 자이단호진 가가쿠오요비겟세이료호겐쿠쇼
Priority date: 2011-03-11
Filing date: 2012-03-09
Publication date: 2014-01-29
Also published as: TR201910409T4; ES2731636T3; EP2684572A4; US9381242B2; US20140065179A1; US20170239348A1; EP2684572A1; JPWO2012124631A1; CN103561764A; KR101847848B1; CN103561764B; WO2012124631A1; JP5914458B2; US10556005B2; EP2684572B1

Abstract

Alum 등의 기존의 애주번트와 비교해서 안전성 및 편리성이 뛰어난 신규한 애주번트 조성물을 제공한다. 생체 내에 존재하는 수용성 물질인 시트룰린류 및/또는 그 염을 함유하는 애주번트 조성물, 및 당해 애주번트 조성물과 항원을 함유하는 백신 조성물, 당해 애주번트 조성물 및 백신 조성물의 제조방법, 및 당해 애주번트 조성물 및 백신 조성물의 투여방법을 제공한다.

Description

시트룰린을 함유하는 애주번트 조성물{ADJUVANT COMPOSITION CONTAINING CITRULLINE}

본 발명은 시트룰린류를 함유하는 애주번트 조성물, 시트룰린류와 항산화 물질(예를 들면, 아스코르브산)을 함유하는 애주번트 조성물, 상기 애주번트 조성물과 항원을 함유하는 백신 조성물에 관한 것이다.

백신은 항원성 물질과 함께, 애주번트, 희석제, 보존제, 안정화제 및 완충화제를 필요에 따라서 포함할 수 있다. 특히, 애주번트는 항원과 함께 투여되고, 투여된 항원에 대한 면역응답을 증강하는 물질이다. 그 작용은, (1) 항원을 흡착해서 항원 제시세포로의 합입을 높이거나, (2) 항원을 국소에 장시간 머물게 하고, 서서히 방출하는 것에 의해 항원자극을 지속시키거나, (3) 직접 면역담당 세포를 활성화시키는 등 애주번트의 종류에 따라 다양하다. 따라서 애주번트는 백신의 용량이나 투여 횟수, 백신 중의 항원량을 저감시키는 점에서 매우 유용하다. 그 때문에 지금까지 백신의 작용을 증강시키는 애주번트에 관한 다양한 연구가 이루어지고 있지만, 실제로 의료현장에서 사용되고 있는 것은 매우 적다.

대표적인 애주번트로서 많은 백신에 이용되고 있는 것이 수산화 알루미늄(이하, 「Alum 애주번트」라고 한다)이지만, 가용성이 아니기 때문에, 항원과의 균일한 혼합화가 곤란하고, 경비 또는 경피 투여용 디바이스와의 조합이 어렵다는 등의 편리성의 관점으로부터, 이상적인 애주번트라고는 말할 수 없다. Alum 애주번트 이외에서는, 스쿠알렌이나 MPL(monophosphoryl lipid) 등을 이용한 것이 있지만, 애주번트 활성이 강한 반면, 부반응도 강하고, 물에 녹기 어렵다는 약점을 가지고 있다. 그 때문에 의료현장에서는 인체에 높은 면역반응을 야기하고, 부작용이 적고, 편리성이 향상된 애주번트의 개발이 갈망되고 있다.

한편, 시트룰린(citrulline)은 아미노산의 일종으로 요소회로를 구성하는 화합물의 하나이고, 동물, 특히 포유류에서 널리 존재한다(화학식: C₆H₁₃N₃O₃, 별명: 2-아미노-5-(카바모일아미노)펜탄산, 분자량: 175.2g/mol). 시트룰린은 1930년에 일본에서 수박에서 발견되었고, 수박의 학명 Citrullus vulgaris로부터 명명된 것이다.

시트룰린은 생체내의 단백질을 구성하는 아미노산은 아니지만, 요소회로의 중간체의 하나로, 아르기닌으로부터 혈관확장작용을 가지는 물질로 알려지는 일산화질소(NO)와 함께 생성되고, 또 아스파라긴산과 축합해서 아르기닌으로 재생된다. 시트룰린에는 암모니아 대사촉진(비특허문헌 1)이나 혈관확장에 의한 혈류개선(비특허문헌 2), 혈압저하(비특허문헌 3), 신경전달(비특허문헌 4), 활성산소 소거(특허문헌 1) 등의 유용한 작용이 알려져 있다.

그 때문에 시트룰린은 일본에서는 2007년부터 사플리먼트 등의 식품소재로서 새롭게 사용이 인정되고 있다. 또, 해외에서는 그것 이전부터 사용되고 있으며, 미국에서는 혈류개선, 동맥경화 예방, 정력증강 등을 목적으로 한 사플리먼트, 유럽에서는 시트룰린-말릭산염이 피로회복의 의약품으로서 판매되고 있다.

이와 같이 시트룰린은 다양한 작용이 보고되고 있음에도 불구하고, 시트룰린이 애주번트 활성을 가지는 것은 알려지고 있지 않고, 시트룰린과 항원을 함유시킨 백신이나 시트룰린을 함유하는 애주번트의 보고도 아직 되어 있지 않다. 또, 시트룰린과 항산화 물질을 병용해서 애주번트로 하는 지견도 보고되고 있지 않다.

일본 공개특허공보 2002-226370호 일본 공개특허공보 S53-075387호 일본 공개특허공보 S63-068091호 국제공개 2011024748호 팸플릿 국제공개 2008133208호 팸플릿

Cell Biochemistry and Function,"Effect of arginine, ornithine and citrulline supplementation upon performance and metabolism of trained rats", 2003년, 제21권, p.85-91 European Journal of Pharmacology,"L-Citrulline mediated relaxation in the control and lipopolysaccharide-treated rat aortic rings", 2001년, 제431권, p.61-69 Journal of Clinical Investigation,"L-arginine abrogates salt-sensitive hypertension in Dahl/Rapp rats", 1991년, 제88권, p.1559-1567 Gastroenterology,"L-citrulline recycling in opossum internal anal sphincter relaxation by nonadrenergic, noncholinergic nerve stimulation", 1997년, 제112권, p.1250-1259 The Journal of Biological Chemistry,"A SIMPLE SYNTHESIS OF dl-CITRULLINE", 1938년, 제122권, p.477-p484 The Journal of Organic Chemistry,"THE SYNTHESIS OF d,l-CITRULLINE FROM NON-BIOLOGICAL PRECURSORS", 1941년, 제6권, p.410-416

본 발명자들은 종래부터 범용되고 있는 Alum 애주번트의 결점(불용성에 수반하는 나쁜 편리성 등), 스쿠알렌 등의 새로운 애주번트의 결점(부반응이 강함)을 극복할 수 있는 것 같은 애주번트를 검토했다. 즉, 본 발명은 항원의 면역원성을 높이고, 인체에로의 안전성에 부가해서, 편리성이 향상된 애주번트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

이러한 실정을 감안해서, 본 발명자들은 충분한 항체 생산능을 발휘하고, 안전성이 뛰어나고, 편리성이 향상된 백신 및 애주번트를 예의 검토한 결과, 시트룰린이 뛰어난 애주번트 효과를 발휘한다는 종래의 보고에 없는 매우 새로운 지견을 발견했다. 부가해서, 시트룰린은 수용성 물질이기 때문에, 항원과의 조제가 용이하고, 포유동물의 체내나 각종 식료품에도 포함되기 때문에, 인체에 대한 안전성도 우수하다. 그 때문에 본 발명에서는 시트룰린을 사용함으로써, 항체 생산능, 안전성, 및 편리성이 뛰어난 백신 또는 애주번트를 제공하는 것이 가능하게 되었다.

본원발명은 이하에 나타내는 바와 같다.

[1] 시트룰린류를 함유하는 애주번트 조성물.

[2] 상기 [1]에서, 상기 시트룰린류가 L-시트룰린, D-시트룰린, L-티오시트룰린, L-호모티오시트룰린, S-메틸-L-티오시트룰린 및 S-에틸-L-티오시트룰린으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1종 또는 2종 이상인 애주번트 조성물.

[3] 상기 [2]에서, 상기 시트룰린류가 L-시트룰린 또는 D-시트룰린이인 애주번트 조성물.

[4] 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에서, 상기 시트룰린류가 1㎎/㎖∼50㎎/㎖로 포함되는 애주번트 조성물.

[5] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에서, 애주번트 조성물이 펩티드 항원용 애주번트 조성물 애주번트 조성물.

[6] 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에서, 항산화 물질을 추가로 포함하는 애주번트 조성물.

[7] 상기 [6]에서, 상기 항산화 물질이 아스코르브산 애주번트 조성물.

[8] 상기 [6] 또는 [7]에서, 상기 시트룰린류와 항산화 물질의 중량비가 1:2∼2:1인 애주번트 조성물.

[9] 상기 [6] 내지 [8] 중 어느 하나에서, 상기 항산화 물질이 1∼10㎎/㎖로 포함되는 애주번트 조성물.

[10] 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 시트룰린류를 함유하는 애주번트 조성물과 항원을 함유하는 백신 조성물.

[11] 상기 [10]에서, 상기 항원과 시트룰린류의 중량비가 1:N이고, N이 100 이상 백신 조성물.

[12] 상기 [10]에서, 상기 항원이 인플루엔자 바이러스 항원 백신 조성물.

[13] 상기 [12]에서, 상기 인플루엔자 바이러스 항원이 헤마글루티닌(HA), 노이라미니다제(NA), 매트릭스1(M1), 매트릭스2(M2), 및 핵 단백(NP)으로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 1종 또는 2종 이상의 항원인 백신 조성물.

[14] 상기 [13]에서, 상기 인플루엔자 바이러스 항원이 헤마글루티닌(HA)인 백신 조성물.

[15] 상기 [13]에서, 상기 인플루엔자 바이러스 항원이 매트릭스2(M2) 백신 조성물.

[16] 상기 [12] 내지 [15] 중 어느 하나에서, 상기 인플루엔자 바이러스 항원과 시트룰린류의 중량비가 1:N이고, N이 300 이상인 백신 조성물.

[17] 상기 [10]에서, 상기 항원이 펩티드 백신 조성물.

[18] 상기 [17]에서, 상기 펩티드와 시트룰린류의 중량비가 1:N이고, N이 100 이상인 백신 조성물.

[19] 상기 [17]에서, 상기 펩티드가 M2e펩티드, M2e펩티드에 1 혹은 수 개의 시스테인이 부가 혹은 삽입된 펩티드, 또는 M2e펩티드에 시스테인을 포함하는 펩티드가 부가된 펩티드인 백신 조성물.

[20] 상기 [19]에서, 상기 펩티드가 M2e펩티드에 있어서, N말단으로부터 카운트해서 20번째와 21번째의 사이, 21번째와 22번째의 사이, 및 22번째와 23번째의 사이에 각각 시스테인 잔기를 삽입한 합성 펩티드인 백신 조성물.

[21] 상기 [19] 또는 [20]에서, 상기 M2e펩티드와 시트룰린류의 중량비가 1:N이고, N이 200 이상인 백신 조성물.

[22] 상기 [17]에서, 상기 펩티드가 아밀로이드β(Aβ) 펩티드, 아밀로이드β(Aβ) 펩티드의 일부의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 또는 상기 펩티드에 1 혹은 수 개의 시스테인이 부가 혹은 삽입된 펩티드인 백신 조성물.

[23] 상기 [22]에서, 상기 펩티드가 아밀로이드β(Aβ) 펩티드의 N말단으로부터 카운트해서 28개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드의 C말단에 시스테인 잔기를 1개 부가한 펩티드인 백신 조성물.

[24] 상기 [22] 또는 [23]에서, 상기 아밀로이드β펩티드와 시트룰린류의 중량비가 1:N이고, N이 100 이상인 백신 조성물.

[25] 상기 [10]에서, 상기 항원이 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 1종 또는 2종 이상의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드인 백신 조성물.

[26] 백신에 애주번트로서의 시트룰린류를 첨가하는 것으로 이루어지는 그 백신에 포함되는 항원에 대한 항체 생산능이 증강된 백신의 제조방법.

[27] 상기 [26]에서, 상기 시트룰린류가 L-시트룰린, D-시트룰린, L-티오시트룰린, L-호모티오시트룰린, S-메틸-L-티오시트룰린 및 S-에틸-L-티오시트룰린으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1종 또는 2종 이상인 방법.

[28] 상기 [27]에서, 상기 시트룰린류가 L-시트룰린 또는 D-시트룰린인 방법.

[29] 상기 [26] 내지 [28] 중 어느 하나에서, 상기 시트룰린류를 1㎎/㎖∼50㎎/㎖로 첨가하는 방법.

[30] 상기 [26] 내지 [29] 중 어느 하나에서, 상기 항원과 시트룰린류의 중량비가 1:N이고, N이 100 이상인 방법.

[31] 상기 [26] 내지 [29] 중 어느 하나에서, 상기 항원이, 인플루엔자 바이러스 항원인 방법.

[32] 상기 [31]에서, 상기 인플루엔자 바이러스 항원이 헤마글루티닌(HA), 노이라미니다제(NA), 매트릭스1(M1), 매트릭스2(M2) 및 핵 단백(NP)으로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 1종 또는 2종 이상의 항원인 방법.

[33] 상기 [32]에서, 상기 인플루엔자 바이러스 항원이 헤마글루티닌(HA)인 방법.

[34] 상기 [32]에서, 상기 인플루엔자 바이러스 항원이 매트릭스2(M2)인 방법.

[35] 상기 [31] 내지 [34] 중 어느 하나에서, 상기 인플루엔자 바이러스 항원과 시트룰린류의 중량비가 1:N이고, N이 300 이상인 방법.

[36] 상기 [26]에서, 상기 항원이 펩티드인 방법.

[37] 상기 [36]에서, 상기 펩티드와 시트룰린류의 중량비가 1:N이고, N이 100 이상인 방법.

[38] 상기 [36]에서, 상기 펩티드가 M2e펩티드, M2e펩티드에 1 혹은 수 개의 시스테인이 부가 혹은 삽입된 펩티드, 또는 M2e펩티드에 시스테인을 포함하는 펩티드가 부가된 펩티드인 방법.

[39] 상기 [38]에서, 상기 펩티드가 M2e펩티드에 있어서, N말단으로부터 카운트해서 20번째와 21번째의 사이, 21번째와 22번째의 사이, 및 22번째와 23번째의 사이에 각각 시스테인 잔기를 삽입한 합성 펩티드인 방법.

[40] 상기 [38] 또는 [39]에서, 상기 M2e펩티드와 시트룰린류의 중량비가 1:N이고, N이 200 이상인 방법.

[41] 상기 [36]에서, 상기 펩티드가 아밀로이드β(Aβ)펩티드, 아밀로이드β(Aβ)펩티드의 일부의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 또는 상기 펩티드에 1 혹은 수 개의 시스테인이 부가 혹은 삽입된 펩티드인 방법.

[42] 상기 [41]에서, 상기 펩티드가 아밀로이드β(Aβ)펩티드의 N말단으로부터 카운트해서 28개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드의 C말단에 시스테인 잔기를 1개 부가한 펩티드인 방법.

[43] 상기 [41] 또는 [42]에서, 상기 아밀로이드β펩티드와 시트룰린류의 중량비가 1:N이고, N이 100 이상인 방법.

[44] 상기 [26]에서, 상기 항원이 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 및 서열번호 5로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 1종 또는 2종 이상의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드인 방법.

[45] 상기 [26] 내지 [44] 중 어느 하나에서, 시트룰린류와 함께 항산화 물질도 첨가하는 방법.

[46] 상기 [45]에서, 상기 항산화 물질이 아스코르브산인 방법.

[47] 상기 [45] 또는 [46]에서, 상기 시트룰린류와 항산화 물질을 중량비 1:2∼2:1로 첨가하는 방법.

[48] 상기 [45] 내지 [47] 중 어느 하나에서, 상기 항산화 물질을 1∼10㎎/㎖로 첨가하는 방법.

[49] 애주번트로서의 시트룰린류의 용도.

[50] 상기 [49]에서, 상기 시트룰린류가 L-시트룰린, D-시트룰린, L-티오시트룰린, L-호모티오시트룰린, S-메틸-L-티오시트룰린 및 S-에틸-L-티오시트룰린으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1종 또는 2종 이상인 용도.

[51] 상기 [50]에서, 상기 시트룰린류가, L-시트룰린 또는 D-시트룰린인 용도.

[52] 상기 [49] 내지 [51] 중 어느 하나에서, 1㎎/㎖ ∼50㎎/㎖의 상기 시트룰린류를 백신에 첨가하는 용도.

[53] 상기 [49] 내지 [52] 중 어느 하나에서, 항산화 물질을 병용하는 용도.

[54] 상기 [53]에서, 상기 항산화 물질이 아스코르브산인 용도.

[55] 상기 [53] 또는 [54]에서, 상기 시트룰린류와 항산화 물질을 중량비 1:2∼2:1로 백신에 첨가하는 용도.

[56] 상기 [53] 내지 [55] 중 어느 하나에서, 1∼10㎎/㎖의 상기 항산화 물질을 백신에 첨가하는 용도.

본 발명에 의하면, 시트룰린류와 항원을 함께 투여함으로써, 항원 단독으로 투여했을 경우와 비교해서, 면역원성을 향상시키는 것이 가능하게 된다. 또, 시트룰린류는 기존의 애주번트(Alum 애주번트)과 비교해도 동일 정도의 항체 생산효과를 얻을 수 있고, 펩티드를 항원으로 하는 경우에는 Alum 애주번트와 비교해도 뛰어난 항체 생산효과가 발견되었다. 또, 시트룰린류와 항산화 물질(예를 들면, 아스코르브산)을 병용해서 애주번트로 사용하는 것에 의해서, 시트룰린류를 단독으로 애주번트에 사용하는 경우와 비교해서, 항체 생산효과가 향상하는 것이 발견되었다.

또, 시트룰린은 생체 내에 원래 존재하는 수용성의 물질이기 때문에, 종래의 Alum 애주번트나 오일계 애주번트와 비교해서, 항원과의 조제도 용이하고, 부작용 발생의 리스크가 경감된다. 그 때문에 본 발명의 시트룰린류를 함유하는 애주번트 조성물이나 백신 조성물은 종래의 애주번트나 그것을 함유하는 백신과 비교해서, 편리성이 향상하고, 인체에로의 안전성이 우수하다. 또, 시트룰린류는 화학합성이나 미생물 등에 의한 양산화도 가능하기 때문에, 의약품의 제조규모에서 백신용 애주번트로서 제공하는 것도 가능하다.

도 1은 시트룰린을 1∼5㎎/body로 마우스에 투여했을 때의 HA항원에 대한 항체가의 측정결과이다.
도 2는 시트룰린을 4㎎/body로 마우스에 투여했을 때의 M2e에 대한 항체가의 측정결과이다.

본 발명의 제1 형태는 시트룰린류를 함유하는 애주번트 조성물이다.

본 발명의 애주번트 조성물에 포함되는 시트룰린류로서는 시트룰린, 시트룰린의 유도체, 시트룰린의 염이 포함된다. 상기의 시트룰린으로서는 L-시트룰린 및 D-시트룰린이 포함되고, 바람직하게는 L-시트룰린이다. 상기의 시트룰린 유도체로서는 L-티오시트룰린(L-thiocitrulline), L-호모티오시트룰린(L-thiohomocitrulline), S-메틸-L-티오시트룰린(S-methyl-L-thiocitrulline), S-에틸-L-티오시트룰린을 들 수 있다. 즉, 본 발명의 시트룰린류에는 L-시트룰린, D-시트룰린, L-티오시트룰린, L-호모티오시트룰린, S-메틸-L-티오시트룰린, S-에틸-L-티오시트룰린이 포함된다.

본 발명의 애주번트 조성물에 포함되는 시트룰린류는 시트룰린의 염일 수도 있다. 시트룰린류의 염으로서는 산부가염, 금속염, 암모늄염, 유기 아민 부가염, 아미노산 부가염 등을 들 수 있다. 산부가염으로서는 염산염, 황산염, 질산염, 인산염 등의 무기산염, 아세트산염, 말레산염, 푸마르산염, 시트르산염, 말릭산염, 락트산염, α-케토글루탈산염, 글루콘산염, 카프릴산염 등의 유기산염을 들 수 있다. 금속염으로서는 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 마그네슘염, 칼슘염 등의 알칼리토금속염, 알루미늄염, 아연염 등을 들 수 있다. 암모늄염으로서는 암모늄, 테트라메틸암모늄 등의 염을 들 수 있다. 유기 아민 부가염으로서는 모르폴린, 피페리딘 등의 염을 들 수 있다. 아미노산 부가염으로서는 글리신, 페닐알라닌, 리신, 아스파라긴산, 글루탐산 등의 염을 들 수 있다.

시트룰린류는 화학적으로 합성하는 방법, 발효생산하는 방법 등에 의해 취득할 수 있다. 시트룰린류를 화학적으로 합성하는 방법으로서는 예를 들면, Gastroenterology, 1997년, 제112권, p.1250-1259(비특허문헌 4)나 The Journal of Biological Chemistry, 1938년, 제122권, p.477-p484(비특허문헌 5)에 기재된 방법을 들 수 있다. 또, L-시트룰린을 발효생산하는 방법으로서는 예를 들면, 일본 공개특허공보 S53-075387호(특허문헌 2)나 일본 공개특허공보 S63-068091호(특허문헌 3)에 기재된 방법을 들 수 있다. 또, 시트룰린류는 시판품을 구입하는 것에 의해 취득할 수 있고, 일례로서, L-시트룰린(Sigma-Aldrich: Code No. 27510 이나 C7629), L-티오시트룰린(Sigma-Aldrich: Code No.88544 , Wako Pure Chemical Industries, Ltd.: Code No. 205-13861) , S-메틸-L-티오시트룰린(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.: Code No. 139-12611) 을 들 수 있다.

본 발명의 애주번트 조성물에 포함되는 시트룰린류의 농도는 항원의 종류, 제형, 투여방법, 대상환자 등에 따라서 적시변경할 수 있지만, 시트룰린류를 A㎎/㎖∼B㎎/㎖로 포함할 수 있다(A 및 B는 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 다른 수치이고, A는 B보다도 작은 수치임).

본 발명의 애주번트 조성물을 사용한 시트룰린류의 투여량은 항원의 종류, 약제의 제형, 투여방법 등에 따라서 적시변경할 수 있다.

본 발명의 애주번트 조성물은 시트룰린류에 첨가하고, 항산화 물질을 포함할 수 도 있다. 이러한 항산화 물질로서는 예를 들면, 아스코르브산(비타민C), α-토코페롤(비타민E), 글루타티온, N-아세틸시스테인, 부틸하이드록시아니솔, 카테킨, 퀘르세틴, 요산, 빌리루빈, 글루코스, 플라보노이드, 셀룰로프라스민, 알부민, 페리틴, 메탈로티오네인, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 글루타티온 페록시다아제, 글루타티온 트랜스페라아제, 카탈라아제, 티오레독신을 들 수 있다. 아스코르브산 및 α-토코페롤이 바람직하다.

백신 조성물이나 애주번트 조성물에 시트룰린류에 첨가해서 항산화 물질을 포함하는 경우에는, 시트룰린류와 항산화 물질의 중량비는 1:2∼2:1, 바람직하게는 1:1일 수 있다. 또, 본 발명의 애주번트 조성물에 포함되는 항산화 물질은 1∼10㎎/㎖, 바람직하게는 5㎎/㎖일 수 있다.

본 발명의 제2 형태는 상기의 시트룰린류를 함유하는 애주번트 조성물과 항원을 함유하는 백신 조성물이다.

상기 항원으로서는 통상, 백신에 포함되는 것이면 어떠한 것 (이)라도 되고, 예를 들면, 탄수화물, 당지질, 당 단백질, 지질, 리포단백질, 인 지질, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 또는 이것들의 유도체를 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 「펩티드」란 2∼수 십개의 아미노산으로 이루어지는 것을 가리키고, 「폴리펩티드」란 수 십개 이상의 아미노산으로 이루어지는 것을 가리킨다. 상기 항원 중에서도 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드가 바람직하다. 본 발명의 시트룰린류를 함유하는 애주번트 조성물은 펩티드를 항원으로 사용했을 경우에 특히 뛰어난 항체생산 효과가 인정되므로, 펩티드를 항원으로 사용하는 것이 특히 바람직하다.

상기 항원의 구입방법은 유전자재조합, 화학합성, 또는 천연물로부터 취득하는 방법의 어떤 것일 수도 있다.

상기 항원은 병원체(바이러스, 세균, 진균, 기생충 미생물), 바이러스 유사입자, 비로솜, 암세포, 알레르겐, 또는 자기분자를 유래로 하는 항원일 수도 있다.

상기한 병원체를 유래로 하는 항원은 서브유닛 항원, 펩티드 항원, 불활성화한 병원체, 약독화한 병원체, 재조합체 항원일 수도 있다.

상기 바이러스로서는 예를 들면, 간염바이러스, RS바이러스, 아데노바이러스, 아불라바이러스(avulavirus), 아이사바이러스(isavirus), 개디스템퍼 바이러스, 인플루엔자 바이러스A-C, 말동맥염 바이러스, 에볼라 바이러스, 엔테로바이러스, 캘리시바이러스, 코로나 바이러스, 원숭이면역부전 바이러스, 토고토바이러스(thogotovirus), 뎅바이러스(Deng virus), 토가바이러스, 새 감염성 활액낭 질병 바이러스, 새 폐렴 바이러스(이전은 칠면조 코기관염 바이러스), 니파바이러스, 뉴캐슬병바이러스, 뉴모바이러스, 고양이 감염성 복막염 바이러스, 고양이 백혈병바이러스, 노워크 바이러스(Norwalk virus), 파필로마 바이러스, 파포버바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 타입1-3, 파보바이러스, 피코르나바이러스, 인간 시토메갈로바이러스, 인간 면역부전증 바이러스, 돼지 호흡 상해ㆍ번식 증후군 바이러스, 플라비바이러스, 헤니파바이러스(henipavirus), 헤파드나바이러스, 헤르페스 바이러스, 헨드라바이러스, 폴리오바이러스, 마릭병 바이러스, 메타뉴모바이러스, 모빌리바이러스, 라이노바이러스, 루불라바이러스(rubulavirus), 레스피로바이러스(respirovirus), 레트로바이러스, 로타바이러스, 백시니아 바이러스, 황열 바이러스, 감염성 코기관염 바이러스, 우역 바이러스, 광견병바이러스, 수두바이러스, 뇌염바이러스, 풍진바이러스, 홍역바이러스, 유행성 이하선염 바이러스를 들 수 있다. 바람직하게는 인플루엔자 바이러스이다.

상기 인플루엔자 바이러스는 오르토믹소 바이러스과에 속하는 직경 약 100nm의 입자경 사이즈를 가지는 RNA 엔벨로프 바이러스이고, 내부 단백질의 항원성에 의거해서 A, B 및 C형으로 나눌 수 있다. 그 중에서 인간과 동물의 양쪽에 감염하는 것이 A형이고 다양성도 많다. 그 A형은 헤마글루티닌(HA) 및 노이라미니다제(NA)의 2종류의 엔벨로프 당 단백질을 가지고, 항원성의 차이에 의해 HA에서는 16종류, NA에서는 9종류가 존재하기 때문에, 그 조합에 보다 많은 종류의 A형 인플루엔자 바이러스가 존재한다. 과거에 발생하지 않는 조합의 인플루엔자 바이러스가 출현했을 때에는, 그것에 대한 면역이 없기 때문에 대유행이 된다. 소위, 인플루엔자 팬더믹이다.

본 발명에서 항원으로 하는 인플루엔자 바이러스는 형, 아형, 주의 종류는 특별하게 한정되지 않는다. 인플루엔자 바이러스를 유래로 하는 항원으로서는 HA, NA, M1, M2, NP을 들 수 있다. 특히 바람직한 것은 HA, M2이다. 그 이유는 현상의 인풀루엔자백신 조성물로 사용되고 있는 항원이 HA이기 때문에, HA를 항원으로 함유하는 백신은 범용성이 높기 때문에다. 또, 국제공개 2011024748호(특허문헌 4)에 개시되어 있는 것 같이, 인플루엔자 바이러스 사이에서 아미노산 서열에 돌연변이가 적은 M2단백질은 광역의 인플루엔자 바이러스에 대한 면역을 부여하는 관점에서 항원으로서 유용하다. M2 단백질은 소수성막 관통 도메인을 제거한 23 아미노산 서열로 이루어지는 영역에 상당하는 펩티드(M2e, 서열번호 1: N말단-SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD-C말단)이나, M2e펩티드의 항원성을 높이는 목적으로, 1 혹은 수 개의 시스테인이 부가 혹은 삽입된 M2e펩티드 또는 시스테인을 포함하는 펩티드가 부가된 M2e펩티드일 수도 있다. 상기의 시스테인으로 변형된 M2e펩티드로서는 국제공개 2011024748호(특허문헌 4)에 기재된 펩티드를 들 수 있고, 구체적으로는 N말단으로부터 카운트해서 20번째와 21번째의 사이, 21번째와 22번째의 사이, 및 22번째와 23번째의 사이에 각각 시스테인 잔기를 삽입한 합성 펩티드M2eC212223(서열번호 2: N말단-SLLTEVETPIRNEWGCRCNCDCSCSD-C말단)을 들 수 있다.

상기 인플루엔자 바이러스 항원의 조제방법은 특별히 한정되는 것은 아니고, 공지의 방법을 모두 사용할 수 있다. 예를 들면, 인플루엔자 감염 동물 또는 인플루엔자 환자로부터 단리된 바이러스주를 계란이나 세포 등에 감염시켜서 통상의 방법에 의해 배양하고, 정제한 바이러스 원액으로부터 항원을 조제해서 좋다.또, 유전자공학적으로 재조합 바이러스 혹은 특정한 항원을 가지가지인 세포에서 생산 혹은 발현시킨 것을 재료로서 항원을 조제하는 것도 가능한다.

상기 항원에 사용되는 자기분자로서는 아밀로이드β펩티드, 또는 아밀로이드β펩티드의 일부의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 들 수 있다. 아밀로이드β펩티드 또는 상기 일부의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드는 1 혹은 수 개의 시스테인이 부가 혹은 삽입된 펩티드 또는 시스테인을 포함하는 펩티드가 부가된 펩티드일 수 있다. 상기 펩티드로서는 국제공개 2008133208호(특허문헌 5)에 개시되어 있는 펩티드를 들 수 있다. 구체적으로는 아밀로이드β펩티드는 42아미노산으로 이루어지는 아밀로이드β펩티드(서열번호 3: N말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA-C말단), 아밀로이드β펩티드의 일부의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드는 N말단으로부터 카운트해서 28아미노산으로 이루어지는 펩티드(서열번호 4: N말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-C말단), 시스테인이 부가된 펩티드는 N말단으로부터 카운트해서 28아미노산으로 이루어지는 펩티드의 C말단측에 시스테인 잔기를 1개 부가한 펩티드28AACys(서열번호 5: N말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKC-C말단)일 수 있다.

상기 세균으로서는 예를 들면, Actinobacillusㆍpleuropneumoniae, Alloiococcus otitis, 인풀루엔자균(형분류 가능 및 형분류 불가능의 양쪽), 예르시니아, 앵무병 클라미디아, 캄필로박터, 클라미디아 폐렴병원체, 클로스트리디아종, 콜레라균, 살모넬라 콜레라스이스, 지알디아, 디프테리아균, 슈우도모나드종, 스트렙토코커스 고도니, 스트렙토코커스 서모필루스, Strepococcus bovis, 스트렙토코커스 아갈락티아, 클라미디아 트라코마티스, 새 결핵균군, 쥐티푸스균, 파스퇴렐라 헤몰리티카, 파스퇴렐라 멀토시다, 인간 결핵균, 돼지 연쇄 구균, 프로테우스 불가리스, 프로테우스 미라빌리스, 헤모필러스 솜누스, 헬리코박터피로리, 보렐리아 부르그도르페리, 마이코플라즈마 갈리셉티컴, 모락셀라 카타랄리스, 렙토스피라 인테로간스, 황색포도상구균, 화농연쇄구균, 수막염균, 적리균, 선역균, 대장균, 단소균, 장티푸스균, 파상풍균, 폐렴연쇄 구균, 백일해균, 표피 포도상구균, 분변연쇄 구균, 녹색연쇄 구균, 임균을 들 수 있다.

상기 기생충으로서는 예를 들면, 적리아메바, 플라스모디움족, 삼림형 열대 리슈마니아, 회충속, 편충속, 지알디아속, 주흡혈충속, 크립토스포리디움속, 트리코모나스속, 톡소플라즈마, 뉴모시스티스 카리니를 들 수 있다.

본 발명의 백신 조성물에 포함되는 항원의 농도는 항원의 종류, 백신 조성물의 투여 형태나 제형 등에 따라서 적당하게 변경할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물에 포함되는 항원과 시트룰린류의 중량비는 1:N이고, 바람직하게는 N이 100이상, 200이상, 300이상, 333이상, 400이상, 800이상, 3000이상, 3333이상, 6000이상, 6666이상, 10000이상, 13000이상, 13333이상, 160000이상, 또는 16666이상이다. 항원과 시트룰린류의 중량비는 또, 1:A∼1:B이다(A 및 B은 100, 200, 300, 333, 400, 800, 3000, 3333, 6000, 6666, 10000, 13000, 13333, 16000, 16666로부터 선택되는 다른 수치이고, A는 B보다도 작은 수치임).

항원이 HA단백질인 경우, 백신 조성물에 포함되는 항원과 시트룰린류의 중량비는 1:N이고, 바람직하게는 N이 300이상, 333이상, 3000이상, 3333이상, 6000이상, 6666이상, 10000이상, 13000이상, 13333이상, 160000이상, 또는 16666이상이다. 항원과 시트룰린류의 중량비는 또, 1:A∼1:B이다(A 및 B은 300, 333, 3000, 3333, 6000, 6666, 10000, 13000, 13333, 16000, 16666로부터 선택되는 다른 수치이고, A는 B보다도 작은 수치임).

항원이 펩티드인 경우, 백신 조성물에 포함되는 항원과 시트룰린류의 중량비는 1:N이고, 바람직하게는 N이 100이상, 200이상, 400이상, 800이상이다. 항원과 시트룰린류의 중량비는 또, 1:A∼1:B이다(A 및 B은 100, 200, 400, 800로부터 선택되는 다른 수치이고, A는 B보다도 작은 수치임).

항원이 M2e펩티드인 경우, 백신 조성물에 포함되는 항원과 시트룰린류의 중량비는 1:N이고, 바람직하게는 N이 200이상이다.

항원이 아밀로이드β펩티드인 경우, 백신 조성물에 포함되는 항원과 시트룰린류의 중량비는 1:N이고, 바람직하게는 N이 100이상, 200이상, 400이상, 800이상이다. 항원과 시트룰린류의 중량비는 또, 1:A∼1:B이다(A 및 B은 100, 200, 400, 800로부터 선택되는 다른 수치이고, A는 B보다도 작은 수치임).

또, 본 발명의 백신 조성물에 있어서의 항원의 투여량은 항원의 종류, 백신 조성물의 투여 형태나 제형 등에 따라서 적당하게 변경할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 단일 항원을 포함할 수도 있고, 또는 복수 종의 항원의 조합을 포함할 수도 있다. 복수 종의 항원의 조합을 포함하는 경우, 동일한 바이러스나 세균 등에서 서로 다른 형의 항원을 복수종 포함할 수도 있고, 다른 바이러스나 세균 등의 항원을 복수종 포함할 수도 있다. 인플루엔자 바이러스백신 조성물의 경우, 인플루엔자 바이러스A형과 B형이 서로 다른 형의 항원을 포함하고 있는 것이 바람직하다.

상기 백신 조성물의 제형은 시트룰린류와 항원이 단일용기에서 제제화된 것 일 수도 있고, 시트룰린류를 함유하는 애주번트 조성물과 항원을 함유하는 면역원성 조성물이 각각 개별의 용기에 제제화된 것 일 수도 있다. 또, 제제화될 때의 제형은 예를 들면, 액상, 분말상(동결건조분말, 건조분말), 캡슐 상, 정제, 동결상태 등일 수 있다.

상기 애주번트 조성물 및 백신 조성물의 제형은 예를 들면, 액상, 분말상(동결건조분말, 건조분말), 캡슐상, 정제, 동결상태 등일 수 있다.

상기 애주번트 조성물 및 백신 조성물은 시트룰린류나 항원 이외에, 의약으로서 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 의약으로서 허용되는 담체로서는 백신의 제조에 통상 사용할 수 있는 담체라면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 등장수성완충액 및 그것들의 조합을 들 수 있고, 추가로, 유화제, 보존제(예, 티메로살), 등장화제, pH조정제 및 불활화제(예, 포르말린) 등을 적당하게 배합할 수 있다.

상기 애주번트 조성물 및 백신 조성물의 투여대상으로서는 면역 가능한 임의의 생물, 특히, 인간 및 다른 포유동물(예를 들면, 가축, 애완동물, 및 야생동물)을 들 수 있다.

상기 애주번트 조성물 및 백신 조성물의 투여경로로서는 예를 들면, 경피투여, 설하투여, 점안투여, 피내투여, 근육내투여, 경구투여, 경장투여, 경비투여, 정맥내투여, 피하투여, 복강내투여, 입으로부터 폐로의 흡입투여 등을 들 수 있다.

상기 애주번트 조성물 및 백신 조성물의 투여방법은 예를 들면, 스텐트, 카테터, 경피적 패치, 마이크로 니들, 이식 가능한 서방성 디바이스, 시린지, 마이크로 니들이 있는 시린지, 무바늘장치, 스프레이에 의한 것일 수 있다. 또, 항원과 애주번트 조성물이 개별의 용기에서 제제되고 있는 경우에는, 제제된 항원과 애주번트 조성물을 동시에 투여할 수도 있고, 혹은, 항원 또는 애주번트 조성물을 투여해서 일정기간 후에 다른 한쪽을 투여할 수도 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이것들의 실시예에 전혀 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

애주번트로서 사용한 시트룰린 용액은 아래와 같이 해서 조제했다. L-시트룰린(Sigma, C7629-1G)을 주사용 증류수(Otsuka Pharmaceuticla co., Ltd.)에 용해하고, 최종농도 80㎎/㎖로 했다. 이것을 0.22㎛로 무균 여과하고, 사용시까지 -20℃로 동결 보존했다.

(1) 시트룰린 함유 조성물의 조제

항원으로서, 인플루엔자 바이러스HA항원을 작성했다(스트레인: A/Solomon주, 조성: 1200㎍/㎖ HA). HA항원을 다양한 시트룰린 농도가 되도록 혼합하고, 표 1의 조성물 1∼4을 작성했다( 조성물 1은 시트룰린을 포함하지 않는다). 비교대조로서, HA항원과 Alum 애주번트(Imject Alum(PIERCE사) 또는 ALHYDROGEL(BRENNTAG사))의 혼합액을 작성했다(표 1의 비교대조).

(2) 마우스로의 면역과 혈청회수

상기의 조성물 1∼4, 또는 비교대조를 하기의 방법에서 마우스 1마리당 100㎕로 투여했다(마우스 1마리당의 투여량은 표 1에 기재). BALB/c 마우스 6주령의 암컷의 체중을 측정하고, 균등하게 되도록 1그룹 3마리, 4그룹으로 나누었다. 각 개체는 애니멀마커로 개체식별했다. 피험물 투여 당일, 이소플루란 흡입마취 하에서 안와정맥총보다, 모세관을 사용해서 채혈했다. 원심분리 후, 혈청을 튜브에 분취했다. 시험물은 디스포저블의 1㎖용 시린지(TERUMO CORPORATION)에 0.1㎖ 취하고, 마우스의 경배부 피하에 투여했다. 피험물 투여후 14일째에 이소플루란 흡입마취 하에서 개복하고, 복강내후 대정맥에서 전체 채혈했다. 혈액은 실온에서 30분 이상 스탠딩한 후, 원심해서(3000rpm, 10분간) 혈청을 분리했다 .이렇게 해서 수득된 혈청중의 HA항원에 대한 항체를 하기의 ELISA법으로 측정했다.

(3) ELISA에 의한 항HA항체가의 측정

면역한 항원과 동일한 것을 1㎍/㎖ 농도로 ELISA 플레이트에 50㎕/well 투입하고, 자연흡착에 의해 4℃에서 하룻밤 스탠딩해서 고상화했다. PBS(당일조제)로 3회 세정후, Blocker^TM Casein in PBS(Thermo사)을 200㎕/well로 투입하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. PBS로 3회 세정후, 항혈청(day0, 14)을 Blocker^TM Casein in PBS로 200배 희석하고, 50㎕/well로 투입하고, 실온에서 2시간 반응시켰다. 항 마우스IgG-POD표지항체(Thermo사)를 BlockerTM Casein in PBS로 2000배로 희석한 것을 50㎕/well 투입하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. PBS로 4회 세정후, 기질 TMB(BioFX사)를 50㎕/well 투입하고, 실온에서 15분 반응후, 1N H₂SO₄를 50㎕/well 투입해서 반응을 정지시켰다. 450nm의 흡광도를 측정했다.

(4) 결과

ELISA의 결과를 표 1에 나타냈다. 시트룰린과 항원을 함께 면역한 그룹에 있어서, 특히 시트룰린을 100㎍/body, 1000㎍/body로 투여한 그룹에서는, 항원만을 면역한 그룹과 비교해서 분명하게 시트룰린의 애주번트 효과가 인정되고, 100㎍/body 투여그룹에서는 약 1.3배, 1000㎍/body 투여그룹에서는 약 1.9배의 항체생산 효과가 인정되었다. 특히, 시트룰린을 1000㎍/body 투여한 그룹에서는, Alum 애주번트와 동등 정도의 애주번트 효과가 인정되었다. 또, 시트룰린 투여량의 증가에 따라서 항체의 증가도 인정되었다.

실시예 2

실시예 1의 결과로부터, 시트룰린에 애주번트 효과가 인정되었으므로, 그 최적량을 검토했다. 실시예 1에서는 시트룰린의 투여량을 10∼1000㎍/body로 변화시킨 결과, 1000㎍/body가 가장 높은 애주번트 효과를 나타냈으므로, 추가로 시트룰린의 투여량을 늘렸을 경우의 효과를 조사했다.

(1) 시트룰린 함유 조성물의 조제

실시예 1의 조제방법과 동일한 방법으로 시트룰린의 농도가 다른 조성물 5∼10을 작성한 (표 2; 또, 조성물 5는 시트룰린을 포함하지 않음).

(2) 마우스에로의 면역과 혈청회수

실시예 1과 동일한 방법으로, 마우스 1마리당 조성물 5∼10을 100㎕ 투여하고, 혈청을 회수했다(마우스 1마리당 투여량은 표 2에 기재).

(3) ELISA에 의한 항HA항체가의 측정

실시예 1의 ELISA와 동일한 방법으로 항체가을 측정했다.

(4) 결과

ELISA의 결과를 도 1에 나타냈다. 모든 시트룰린 투여그룹에 있어서 애주번트 효과가 인정되고, 이 범위 내에서는 어느 정도의 용량의존성이 인정되었다.

실시예 3

(1) 시트룰린 함유 조성물의 조제

항원으로서, A형 인플루엔자 바이러스의 M2단백질 중 바이러스 표면에 제시되는 23아미노산으로 이루어지는 영역(M2e, 서열번호 1: N말단-SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD-C말단)에 있어서, N말단으로부터 카운트해서 20번째와 21번째의 사이, 21번째와 22번째의 사이, 및 22번째와 23번째의 사이에 각각 시스테인 잔기를 삽입한 합성 펩티드M2eC212223(서열번호 2: N말단-SLLTEVETPIRNEWGCRCNCDCSCSD-C말단)을 사용했다.

국제공개 2011024748호(특허문헌 4)에 기재되어 있는 바와 같이, M2eC212223펩티드를 합성했다. 합성한 각 펩티드는 1mM EDTA를 함유하는 질소가스 치환한 주사용 증류수로 5㎎/㎖로 조제하고, 이것을 원액으로 사용시까지 -80℃ 이하로 보존했다. 피험물질로서 시트룰린을 포함하지 않는 조성물 11, 실시예 1에서 조제한 시트룰린 용액을 혼합한 조성물 12를 작성했다(표 3).

(2) 마우스에로의 면역과 혈청회수

마우스에의 면역은 다음과 같이 실시했다. BALB/c 마우스 7주령의 암컷을 1그룹 5마리, 2그룹으로 나누었다. 각 개체는 애니멀마커로 개체 식별했다. 피험물은 디스포저블의 1㎖용 시린지(TERUMO CORPORATION)에 있어서, 마우스의 경배부 피하에 1마리당 0.1㎖ 투여한 (마우스 1마리당의 투여량은 표 3에 기재). 피험물을 2주 간격으로 2회 투여하고, 2회째의 투여로부터 1주 후에 Somopentyl(Kyoritsu Seiyaku Corporation)마취 하에서 개복하고, 복강내후 대정맥에서 전체 채혈했다. 혈청분리는 실시예 1과 동일하게 실시했다.

(3) ELISA에 의한 항M2e항체가의 측정

혈청 중의 M2e에 대한 항체가을 국제공개 2011024748호(특허문헌 4)에 기재된 방법으로 측정했다. 즉, M2e를 0.1M Carbonate buffer, pH 9.6에서 2㎍/㎖에 희석하고, 96-well plate(Nunc사, Immobilizer Amino)에 100㎕/well 첨가하고, 4℃에서 하룻 밤 스탠딩해서 고상화했다. 다음날, 각 well을 300㎕의 0.05% Tween20 함유 인산완충액(PBST)으로 3회 세정하고, 0.1M Carbonate buffer, pH9.6에서 10mM으로 희석한 모노에탄올아민(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)을 300㎕/well씩 첨가하고, 실온에서 1시간 스탠딩했다. 그 후에 10mM 모노에탄올아민을 충분하게 제거하고, PBST로 검체를 희석해서 100㎕/well로 첨가했다(각 검체 duplicate). 실온, 1시간의 반응의 후, 첨가한 각 희석혈청을 버리고, 300㎕/well의 PBST로 3회 세정했다. 세정후, well내의 세정액을 충분하게 제거하고, PBST로 2000배 희석한 HRP 표지 항마우스IgG 염소항체(American Qualax사, A131PS)를 100㎕/well 첨가하고, 실온, 1시간 반응했다. 반응후, 표지항체 희석액을 버리고, 300㎕/well의 PBST로 2회, 동량의 증류수로 2회 세정하고, 발색 기질액 TMB+(Dako사)를 100㎕/well 첨가해서 차광 하, 실온에서 30분간 반응했다. 그 후에 1N 황산을 100㎕/well 첨가해서 발색을 정지하고, 450nm의 흡광도(OD450값)을 측정했다.

(4) 결과

ELISA의 결과를 도 2에 나타냈다. 시트룰린을 애주번트로 사용한 경우에는, 시트룰린을 포함하지 않은 경우와 비교해서, 약 14배의 항체 생 효과가 인정되었다. 이에 따라 시트룰린은 인플루엔자 바이러스 HA항원뿐만 아니라, 합성 펩티드인 M2eC212223에 대해서도 애주번트 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4

(1) 시트룰린 함유 조성물의 조제

항원으로서, 42아미노산잔기로 이루어지는 아밀로이드β(Aβ)펩티드(서열번호 3: N말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA-C말단) 중, N말단으로부터 카운트해서 28개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드(서열번호 4: N말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-C말단)의 C말단에 시스테인 잔기를 1개 부가한 합성 펩티드 28AACys(서열번호 5: N말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKC-C말단)을 사용했다.

상기의 합성 펩티드를 국제공개 2008133208호(특허문헌 5)에 기재한 바와 같이 합성하고(Hokkaido System Science Co., Ltd.), 생리식염액로 5㎎/㎖로 조제해서 이것을 원액으로 하고, 사용시까지 -80℃ 이하로 보존했다. 투여시에는 10㎍/body가 되도록 조제했다.

애주번트로서 사용한 시트룰린 용액은 아래와 같이 해서 조제했다. L-시트룰린(Sigma, C7629-1G)을 생리식염액(Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.)에 용해하고, 최종농도 50㎎/㎖로 했다. 사용시까지 -30℃로 동결 보존했다. L-아스코르브산(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)도 동일하게 생리식염액(Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.)에 용해하고, 최종농도 50㎎/㎖로 하고, 사용시까지 4℃로 냉장 보존했다. 또, 대조로서 Alum(ALHYDROGEL)을 사용했다. 상기의 시트룰린 용액, 28AACys, 아스코르브산 용액을 혼합해서 표 4의 비교대조 1과 2, 및 조성물 13∼18을 제작했다.

(2) 마우스에로의 면역과 혈청회수

마우스에의 면역은 다음과 같이 실시했다. C57BL/6 마우스 7주령의 수컷을 1그룹 4마리, 8그룹으로 나누었다. 각 조성물을 마우스 1마리당 200㎕씩 1㎖ 투베르쿨린용 주사기(Terumo, SS-01T2613S)릉 사용하고, 복부피하 내에 투여했다(마우스 1마리당의 투여량은 표 4에 나타낸다). 마우스에로의 면역은 2주 간격으로 2회의 면역을 실시했다. 2회째 면역으로부터 14일째에 펜토바르비탈나트륨(Kyoritsu Seiyaku Corporation, Somopentyl) 마취 하, 복부대정맥에서 채혈해서 살처분했다. 채취한 혈액은 Microtina(BECTON DICKINSON사)로 이동하고, 실온에서 충분하게 응고시킨 후, 원심분리했다(5000회전, 10분간). 분리한 혈청은 각각 0.5㎖튜브 2개에 분주하고, 측정까지 -80℃에서 보존했다. 혈청 중의 Aβ펩티드에 대한 항체를 하기의 ELISA법으로 측정했다.

(3) ELISA에 의한 항AβIgG항체가의 측정

Aβ펩티드(1-40의 아미노산 서열: N말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(서열번호 6), Hokkaido System Science Co., Ltd. 합성)을 0.1M Carbonate buffer, pH9.6에서 10㎍/㎖로 희석하고, 8well strips(Nalgen-Nunc사, Immobilizer Amino)에 100㎕/well 첨가하고, 4℃에서 하룻 밤 스탠딩해서 고상화했다. 다음날, 각 well을 300㎕의 0.05% Tween20 함유 PBS(PBST)로 3회 세정하고, 10mM ethanolamine을 300㎕/well 씩 첨가하고, 실온에서 1시간 스탠딩했다. 그 후에 10mM ethanolamine을 충분하게 제거하고, PBST로 검체를 50배∼10000배로 희석해서 100㎕/well로 첨가했다(각 검체 duplicate). 실온에서 1시간의 반응의 후, 첨가한 각 희석 혈청을 버리고, 300㎕/well의 PBST로 3회 세정했다. 세정후, well내의 세정액을 충분하게 제고하고, 검체 희석액을 사용해서 2000배 희석한 HRP표지 항마우스IgG 염소항체(American Qualax사, A131PS)를 100㎕/well로 첨가하고, 실온에서 1시간 반응했다. 반응후, 표지항체 희석액을 버리고, 300㎕/well의 PBST로 2회, 동량의 증류수로 2회 세정하고, 발색 기질액TMB+(Dako사)를 100㎕/well 첨가해서 차광 하, 실온에서 30분간 반응했다. 그 후에 1N 황산을 100㎕/well 첨가해서 발색을 정지하고, 450nm의 흡광도(OD450값)을 측정했다.

시판의 Aβ에 대한 모노클로널 항체(CHEMICON사; MAB1560)를 표준혈청으로 사용했다. 표준혈청을 PBST로 0.156, 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10ng/㎖가 되도록 희석하고, 항체가 측정시의 스탠더드를 조제했다. 각 피검 마우스 혈청의 항AβIgG 항체 측정과 동시에, 각 희석 검체를 duplicate로 그것들의 OD450값을 측정했다. 수득된 스탠더드의 단위와 OD450값의 표준직선에서 각 피검 마우스 혈청의 항AβIgG 항체가를 산출했다.

(4) 결과

산출한 각 면역그룹에 있어서의 마우스 혈청 중의 항Aβ항체가을 표 4에 나타냈다. 시트룰린을 첨가한 그룹(조성물 13∼16, 18)에서는, 애주번트 미투여 그룹(비교대조 1)과 비교해서, 항체생산 효과가 증강하고 있었다. 즉, 애주번트 미투여 그룹과 비교해서, 1㎎/body 투여그룹에서 약 11.6배(조성물 13), 2㎎/body투여그룹에서 약 42.2배(조성물 14), 4㎎/body 투여그룹에서 약 125.8배(조성물 15), 8㎎/body 투여그룹에서 약 141.7배(조성물 16)와 같은 매우 현저한 항체생산 효과가 인정되었다.

또, L-아스코르브산 단독을 투여한 그룹에서는 거의 항체생산 효과는 인정되지 않았지만(비교대조 1과 조성물 17의 비교), L-아스코르브산과 시트룰린을 병용해서 첨가한 그룹에서는, 시트룰린 단독투여그룹과 비교해서 약 4.0배(조성물 13과 18의 비교), L-아스코르브산 단독투여그룹과 비교해서 약 12.1배(조성물 17과 18의 비교), Alum투여그룹과 비교해서 약 39.4배(비교대조 2와 조성물 18), 시트룰린 미투여그룹과 비교해서 약 46.9배(비교대조 1과 조성물 18), 항체 생산효과가 증강하고 있었다.

시트룰린 투여그룹 및 시트룰린과 아스코르브산의 병용 투여그룹 중 어느 경우에 있어서도, Alum투여그룹보다도 항체 생산효과가 우수하며(조성물 13에서 약 9.8배, 조성물 14에서 약 35.5배, 조성물 15에서 약 105.6배, 조성물 16에서 약 119배, 조성물 18에서 약 39.4배), 기존의 Alum 애주번트와 비교해도 매우 뛰어난 항체생산 효과를 나타냈다.

실시예 1, 2, 3 및 4의 결과로부터, 항원의 종류를 막론하고, 시트룰린에는 분명한 애주번트 효과가 관찰되었다. 그 효과는 시트룰린의 농도에 따라서는 기존의 Alum 애주번트와 동등한 효과를 가지고 있어, 특히 펩티드 항원에서는 기존의 Alum 애주번트보다도 뛰어난 항체 생산효과를 나타내고 있었다. 또, 시트룰린은 아스코르브산과 병용해서 사용하는 것에 의해서, 애주번트 효과가 향상하는 것이 발견되었다.

부가해서, 시트룰린을 투여된 마우스에는 이상은 인정되지 않고, Alum사용그룹에 인정되는 투여국소의 경결도 인정되지 않았기 때문에, 안전성이 우수하다.

(산업상의 이용 가능성)

본 발명에서는 시트룰린류를 함유하는 애주번트 조성물, 당해 애주번트 조성물과 항원을 함유하는 백신 조성물을 제공한다. 시트룰린은 생체에 있어서도 유용하고, 수용성의 물질이기 때문에, 종래의 Alum 애주번트나 오일계 애주번트와 비교해서, 안전성이 높고, 조제면에서 편리성이 우수한 애주번트 조성물 및 백신 조성물을 제공하는 것이 가능하게 된다.

SEQUENCE LISTING <110> THE CHEMO-SERO-THERAPEUTIC RESEARCH INSTITUTE <120> An adjuvant composition comprising citrullin <130> 670771 <150> JP 2011-053658 <151> 2011-03-11 <160> 6 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 1 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys 1 5 10 15 Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 2 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A modified peptide obtained by inserting cysteines into the peptide derived from Influenza virus M2 protein <400> 2 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys 1 5 10 15 Arg Cys Asn Cys Asp Cys Ser Cys Ser Asp 20 25 <210> 3 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 4 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthesized Peptide <400> 4 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 20 25 <210> 5 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthesized Peptide <400> 5 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Cys 20 25 <210> 6 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 35 40

Claims

시트룰린류를 함유하는 애주번트 조성물.
제 1 항에 있어서, 시트룰린류가, L-시트룰린, D-시트룰린, L-티오시트룰린, L-호모티오시트룰린, S-메틸-L-티오시트룰린 및 S-에틸-L-티오시트룰린으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1종 또는 2종 이상인 애주번트 조성물.
제 2 항에 있어서, 시트룰린류가 L-시트룰린 또는 D-시트룰린인 애주번트 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 시트룰린류가 1㎎/㎖∼50㎎/㎖로 포함되는 애주번트 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 애주번트 조성물이 펩티드 항원용의 애주번트 조성물인 애주번트 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 항산화 물질을 추가로 포함하는 애주번트 조성물.
제 6 항에 있어서, 항산화 물질이 아스코르브산인 애주번트 조성물.
제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 시트룰린류와 항산화 물질의 중량비가 1:2∼2:1인 애주번트 조성물.
제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 항산화 물질이 1∼10㎎/㎖로 포함되는 애주번트 조성물.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 시트룰린류를 함유하는 애주번트 조성물과 항원을 함유하는 백신 조성물.
제 10 항에 있어서, 항원과 시트룰린류의 중량비가 1:N이고, N이 100 이상인 백신 조성물.
제 10 항에 있어서, 항원이 인플루엔자 바이러스 항원인 백신 조성물.
제 12 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 항원이 헤마글루티닌(HA), 노이라미니다제(NA), 매트릭스1(M1), 매트릭스2(M2) 및 핵 단백(NP)으로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 1종 또는 2종 이상의 항원인 백신 조성물.
제 13 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 항원이 헤마글루티닌(HA)인 백신 조성물.
제 13 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 항원이 매트릭스2(M2)인 백신 조성물.
제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 항원과 시트룰린류의 중량비가 1:N이고, N이 300 이상인 백신 조성물.
제 10 항에 있어서, 항원이 펩티드인 백신 조성물.
제 17 항에 있어서, 펩티드와 시트룰린류의 중량비가 1:N이고, N이 100 이상인 백신 조성물.
제 17 항에 있어서, 펩티드가 M2e펩티드, M2e펩티드에 1 혹은 수 개의 시스테인이 부가 혹은 삽입된 펩티드, 또는 M2e펩티드에 시스테인을 포함하는 펩티드가 부가된 펩티드 백신 조성물.
제 19 항에 있어서, 펩티드가, M2e펩티드에 있어서, N말단으로부터 카운트해서 20번째와 21번째의 사이, 21번째와 22번째의 사이, 및 22번째와 23번째의 사이에 각각 시스테인 잔기를 삽입한 합성 펩티드인 백신 조성물.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, M2e펩티드와 시트룰린류의 중량비가 1:N이고, N이 200 이상인 백신 조성물.
제 17 항에 있어서, 펩티드가 아밀로이드β(Aβ)펩티드, 아밀로이드β(Aβ)펩티드의 일부의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 또는 상기 펩티드에 1 혹은 수 개의 시스테인이 부가 혹은 삽입된 펩티드인 백신 조성물.
제 22 항에 있어서, 펩티드가 아밀로이드β(Aβ)펩티드의 N말단으로부터 카운트해서 28개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드의 C말단에 시스테인 잔기를 1개 부가한 펩티드인 백신 조성물.
제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, 아밀로이드β펩티드와 시트룰린류의 중량비가 1:N이고, N이 100 이상인 백신 조성물.
제 10 항에 있어서, 항원이 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 1종 또는 2종 이상의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드인 백신 조성물.
백신에 애주번트로서의 시트룰린류를 첨가하는 것으로 이루어지는 상기 백신에 포함되는 항원에 대한 항체 생산능이 증강한 백신의 제조방법.
제 26 항에 있어서, 시트룰린류가 L-시트룰린, D-시트룰린, L-티오시트룰린, L-호모티오시트룰린, S-메틸-L-티오시트룰린 및 S-에틸-L-티오시트룰린으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1종 또는 2종 이상인 방법.
제 27 항에 있어서, 시트룰린류가, L-시트룰린 또는 D-시트룰린인 방법.
제 26 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 시트룰린류를 1㎎/㎖∼50㎎/㎖로 첨가하는 방법.
제 26 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 항원과 시트룰린류의 중량비가 1:N이고, N이 100 이상인 방법.
제 26 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 인플루엔자 바이러스 항원인 방법.
제 31 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 항원이 헤마글루티닌(HA), 노이라미니다제(NA), 매트릭스1(M1), 매트릭스2(M2) 및 핵 단백(NP)으로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 1종 또는 2종 이상의 항원인 방법.
제 32 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 항원이 헤마글루티닌(HA)인 방법.
제 32 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 항원이 매트릭스2(M2)인 방법.
제 31 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 항원과 시트룰린류의 중량비가 1:N이고, N이 300 이상인 방법.
제 26 항에 있어서, 항원이 펩티드인 방법.
제 36 항에 있어서, 펩티드와 시트룰린류의 중량비가 1:N이고, N이 100 이상인 방법.
제 36 항에 있어서, 펩티드가 M2e펩티드, M2e펩티드에 1 혹은 수 개의 시스테인이 부가 혹은 삽입된 펩티드, 또는 M2e펩티드에 시스테인을 포함하는 펩티드가 부가된 펩티드인 방법.
제 38 항에 있어서, 펩티드가 M2e펩티드에 있어서, N말단으로부터 카운트해서 20번째와 21번째의 사이, 21번째와 22번째의 사이, 및 22번째와 23번째의 사이에 각각 시스테인 잔기를 삽입한 합성 펩티드인 방법.
제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, M2e펩티드와 시트룰린류의 중량비가 1:N이고, N이 200 이상인 방법.
제 36 항에 있어서, 펩티드가 아밀로이드β(Aβ)펩티드, 아밀로이드β(Aβ)펩티드의 일부의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 또는 상기 펩티드에 1 혹은 수 개의 시스테인이 부가 혹은 삽입된 펩티드인 방법.
제 41 항에 있어서, 펩티드가 아밀로이드β(Aβ)펩티드의 N말단으로부터 카운트해서 28개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드의 C말단에 시스테인 잔기를 1개 부가한 펩티드인 방법.
제 41항 또는 제 42 항에 있어서, 아밀로이드β펩티드와 시트룰린류의 중량비가 1:N이고, N이 100 이상인 방법.
제 26 항에 있어서, 항원이 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 및 서열번호 5로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 1종 또는 2종 이상의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드인 방법.
제 26 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 시트룰린류와 함께 항산화 물질도 첨가하는 방법.
제 45 항에 있어서, 항산화 물질이 아스코르브산인 방법.
제 45 항 또는 제 46 항에 있어서, 시트룰린류와 항산화 물질을 중량비 1:2∼2:1로 첨가하는 방법.
제 45 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 항산화 물질을 1∼10㎎/㎖로 첨가하는 방법.
애주번트로서의 시트룰린류의 용도.
제 49 항에 있어서, 시트룰린류가 L-시트룰린, D-시트룰린, L-티오시트룰린, L-호모티오시트룰린, S-메틸-L-티오시트룰린 및 S-에틸-L-티오시트룰린으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1종 또는 2종 이상인 용도.
제 50 항에 있어서, 시트룰린류가 L-시트룰린 또는 D-시트룰린인 용도.
제 49 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 1㎎/㎖∼50㎎/㎖의 상기 시트룰린류를 백신에 첨가하는 용도.
제 49 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 항산화 물질을 병용하는 용도.
제 53 항에 있어서, 항산화 물질이 아스코르브산인 용도.
제 53 항 또는 제 54 항에 있어서, 시트룰린류와 항산화 물질을 중량비 1:2∼2:1로 백신에 첨가하는 용도.
제 53 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서, 1∼10㎎/㎖의 상기 항산화 물질을 백신에 첨가하는 용도.