ES2251124T3 - Vacuna que comprende un antigeno de streptococcus pneumoniae adyuvado por un oligonucleotido cpg. - Google Patents
Vacuna que comprende un antigeno de streptococcus pneumoniae adyuvado por un oligonucleotido cpg.Info
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Abstract
Una composición de vacuna que comprende un oligonucleótido CpG inmunoestimulador y un antígeno polisacárido de Streptococcus pneumoniae. En una realización de la presente invención, es posible aumentar ventajosamente la eficacia de una vacuna neumocócica comercialmente disponible. Esto es particularmente importante en poblaciones de alto riesgo, especialmente en aquéllas que tienen respuestas de anticuerpos contra polisacáridos sub-óptimas. Tales poblaciones pueden incluir, pero no se limitan a, ancianos, pacientes que padecen una de las siguientes enfermedades: esplenectomía, asplenia congénita, hiposplenia, anemia de las células falciformes, neutropenia cíclica, neutropenia inducida por fármacos, anemia aplástica, agammaglobulinemia congénita, hipogammaglobulinemia, deficiencia selectiva de subtipo IgG, mieloma múltiple, leucemia linfocítica crónica, linfoma, infección por VIH, condiciones multifactoriales tales como tratamiento glucocorticoide, malnutrición, cirrosis de hígado, insuficiencia renal, diabetes mellitus, alcoholismo, enfermedad crónica, hospitalización, fatiga, estrés, exposición al frío, infección respiratoria previa, gripe, asma. También se puede incluir a adultos sanos, tales como los profesionales de la salud, reclutas militares, prisioneros u otros, incluyendo asistentes a escuelas o viajantes que deseen garantizarse una cobertura completa de la vacuna.
Description
Vacuna que comprende un antígeno de
Streptococcus pneumoniae adyuvado por un oligonucleótido
CpG.
La presente invención se refiere a nuevas
formulaciones de vacunas, y a procedimientos para su producción y su
uso en medicina.
Se conocen los oligonucleótidos inmunomoduladores
que contienen dinucleótidos CpG no metilados ("CpG") (WO
96/02555, EP 468520). CpG es la abreviatura para los motivos de
dinucleótidos de citosina-guanosina presentes en el
ADN. Históricamente, se observó que la fracción de ADN de la vacuna
BCG podía ejercer un efecto antitumoral. En otros estudios, los
oligonucleótidos sintéticos derivados de secuencias génicas de la
BCG demostraron ser capaces de inducir efectos inmunomoduladores
(tanto in vitro como in vivo). Los autores de estos
estudios concluyeron que determinadas secuencias palindrómicas,
incluyendo un motivo central de CG, transportaban esta actividad
(Tokunaga, T. et al., Microbial. Immunol. 36: 55
(1992)). El papel central del motivo CG en la inmunoestimulación fue
dilucidado más tarde en una publicación de Krieg (Nature, 374
p. 546, 1995). Chu et al.,(J. Exp. Med., 1997, 186:
1623-1631) revelaron que los oligonucleótidos CpG
pueden actuar como adyuvantes Th1. El documento EP855184 revela más
secuencias CpG para ser usadas en composiciones farmacéuticas. El
documento WO 98/37919 revela el uso de secuencias CpG en el
tratamiento de trastornos asociados con los LPS. El análisis
detallado ha demostrado que el motivo CG tiene secuencias que son
comunes en el ADN bacteriano, pero poco comunes en el ADN de los
vertebrados.
Actualmente se cree que esta diferencia evolutiva
permite al sistema inmune de los vertebrados detectar la presencia
de ADN bacteriano (como ocurre durante una infección) conduciendo,
por consiguiente, a la estimulación del sistema inmune. Se ha
demostrado la actividad inmunoestimuladora para secuencias tan
pequeñas como las formadas por 15 bases de nucleótido (Krieg, et
al., Nature 374: 546 (1995)), y en las que el motivo CpG
tiene que estar sin metilar. Se ha postulado que el oligo debería
tener una configuración de hexámero: purina purina CG pirimidina
pirimidina, pero esto no es obligatorio.
La Streptococcus pneumoniae es una
bacteria gram positiva que es patogénica para los humanos, causando
enfermedades invasoras tales como la neumonía, la bacteremia y la
meningitis, y enfermedades asociadas con la colonización, tales como
la otitis media aguda. Los mecanismos mediante los cuales los
neumococos se extienden por los pulmones, el fluido cerebroespinal y
la sangre son poco conocidos. El crecimiento de la bacteria que
alcanza los alvéolos pulmonares normales es inhibido por su sequedad
relativa y por la actividad fagocítica de los macrófagos alveolares.
Cualquier trastorno anatómico o fisiológico de estas defensas
coordinadas tiende a aumentar la susceptibilidad de los pulmones a
ser infectados. La pared celular de la Streptococcus
pneumoniae desempeña un papel importante en la generación de una
respuesta inflamatoria en los alvéolos pulmonares (Gillespie et
al., I&I 65: 3936). La liberación de los componentes de la
pared celular tiene lugar al final del ciclo de crecimiento
neumocócico mediante autolisis debido a la síntesis de la proteína
N-acetil
muramoil-L-alanina amidasa (lytA).
El ADN también será liberado en la zona infectada al realizarse la
autolisis de los neumococos.
Para que el organismo tenga una respuesta inmune
eficaz contra las bacterias invasoras, debe tener mecanismos para
coordinar el tipo de respuesta inmune que, con mayor probabilidad,
detendrá la infección. Para los patógenos intracelulares, la
coordinación parece ocurrir entre la célula mediada o las respuestas
inmunes humorales, y éstas son controladas por las células T del
tipo Th1 y Th2. Sin embargo, las bacterias extracelulares emplean
frecuentemente un polisacárido bien en la forma de cápsula o un
lipopolisacárido para protegerse ellas mismas de los efectos del
complemento de suero que puede lisar las bacterias, o volverlas
accesibles a fagocitos tales como macrófagos y neutrófilos.
En este caso, la respuesta inmune sigue otra
trayectoria, la respuesta inmune T-independiente. La
respuesta inmune T-independiente puede dividirse en
la respuesta de tipo 1 y tipo 2. Los antígenos
T-independientes de tipo 2 poseen las
características expresadas por los antígenos polisacáridos,
incluyendo: gran peso molecular, epitopes antigénicos repetidos,
capacidad de activar la cascada de complementos, degradabilidad
pobre in vivo e incapacidad por estimular la ayuda a células
T-dependientes del complejo MHC tipo II (Mond et
al., Annu. Rev. Immunol. 13: 655-92). Los
antígenos de tipo 1, a diferencia de los polisacáridos, son
mitogénicos para las células B, y están comprendidos por
lipopolisacáridos (LPS). Los antígenos
T-independientes de tipo 2 no pueden estimular las
respuestas en ratones neonatales o ratones CBA/N que presentan
inmunodeficiencia de las células B ligada a X (ratones xid),
mientras que los antígenos de tipo 1 sí pueden.
Los antígenos de tipo 2 inducen a respuestas más
débiles de los anticuerpos en comparación con antígenos
T-dependientes tales como las proteínas. Las
proteínas pueden activar las células B e inducir a la secreción de
anticuerpos mediante su procesamiento en péptidos y su presentación
sobre la superficie de la célula B en el contexto del MHC tipo II,
permitiendo interactuar a la célula B con las células T y recibir
señales adicionales requeridas para la proliferación y maduración
máxima de las células B. No obstante, mientras que los
oligosacáridos, en algunos casos, pueden asociarse con el complejo
MHC tipo II (Ishioka et al., J. Immunol. 148:
2446-2451) y los polisacáridos lipidados parecen
asociarse con el CD1 presente en los linfocitos, (Fairhurst, R. M.,
et al., Immunology Today 19: 257 (1998)), no existe un
mecanismo conocido de presentación para los antígenos de tipo 2
contra las células T.
Sin embargo, la naturaleza de repetición múltiple
del antígeno polimérico polisacárido puede causar el
entrecruzamiento de los receptores sobre la superficie de las
células B, conduciendo a la activación de las células B mediante un
mecanismo que no requiere células T. Por lo tanto, los polisacáridos
son antígenos T-independientes, y se caracterizan en
animales y bebés humanos por la producción de anticuerpos IgM y la
falta de estimulación y de memoria inmunológica. Sólo los humanos
adultos pueden producir cantidades significativas de anticuerpo IgG
contra la mayoría (aunque no todos) los antígenos polisacáridos. La
capacidad para cambiar el isotipo de anticuerpos a IgG coincide con
la aparición del receptor de complemento tipo 2 (CR2) en las células
B de bebés y niños entre 1,5 y 2 años de edad, y esto puede
proporcionar la señal adicional requerida para la activación y la
maduración de las células B.
En un aspecto de la presente invención, se
proporciona la formulación de una vacuna que comprende una secuencia
de oligonucleótidos CpG y un antígeno polisacárido del
Streptococcus pneumoniae que es capaz de aumentar una
respuesta inmune contra un antígeno T-independiente
neumocócico.
La producción de anticuerpos IgG contra los
polisacáridos capsulares de las bacterias es esencial porque los
mecanismos principales de protección frente a estas bacterias, la
lisis mediada por un complemento y la opsonofagocitosis, son más
eficaces con este isotipo de anticuerpo (Maslanka et al.,
Clin. Diag. Lab. Immunol. 4: 156-67, y
Romero-Steiner et al., Clin. Diag. Lab.
Immunol. 4: 415-22).
Las vacunas basadas en antígenos polisacáridos
son conocidas en la técnica, y cuatro de las que han sido
autorizadas para uso humano incluyen el polisacárido Vi de
Salmonella typhi, el polisacárido PRP de Haemophilus
influenzae, la vacuna tetravalente contra meningococos compuesta
por los serotipos A, C, W135 e Y, y la vacuna neumocócica
23-valente compuesta por los polisacáridos
correspondientes a los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V,
10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33.
Las tres últimas vacunas confieren protección
frente a las bacterias causantes de infecciones respiratorias que
resultan en morbosidad grave y mortalidad en bebés, aunque estas
vacunas no han sido autorizadas para su uso en niños menores de dos
años, porque son poco inmunogénicas en este grupo de edad. El
documento EP497525 revela una vacuna neumocócica conjugada de
polisacáridos adyuvada con alumbre.
Las vacunas de polisacáridos autorizadas
anteriormente enumeradas han demostrado tener una eficacia clínica
variable. Se ha estimado que la vacuna de polisacáridos Vi tiene una
eficacia de entre el 55 y el 77% en la prevención de la fiebre
tifoidea confirmada mediante cultivos (Plotkin y Cam, Arch.
Intern. Med. 155: 2293-99). La vacuna de
polisacáridos de meningococos C demostró tener una eficacia del 79%
en condiciones epidémicas (De Wals P, et al., Bull World
Health Organ. 74: 407-411). La vacuna
neumocócica 23-valente ha demostrado una amplia
variación en cuanto a su eficacia clínica, del 0 al 81% (Fedson
et al., Arch. Intern. Med. 154:
2531-2535). La eficacia parece estar relacionada con
el grupo de riesgo que esté siendo inmunizado, tal como el
constituido por ancianos, pacientes con la enfermedad de Hodgkin,
con esplenectomía, con anemia de células falciformes y con
agammaglobulinémicos (Fine et al., Arch. Intern. Med.
154:2666-2677), así como con la manifestación de la
enfermedad. La neumonía neumocócica y la otitis media son
enfermedades que no han mostrado protección mediante la vacuna
23-valente. Está generalmente admitido que la
eficacia protectora de la vacuna neumocócica está más o menos
relacionada con la concentración de anticuerpos inducida por la
vacunación; de hecho, los 23 polisacáridos sólo fueron autorizados
ante la inmunogenicidad de cada componente polisacárido (Ed.
Williams et al., New York Academy of Sciences 1995,
pp. 241-249).
Para aumentar la respuesta de los anticuerpos
contra los polisacáridos neumocócicos que comprenden la vacuna
23-valente, los presentes inventores intentaron
mejorar la respuesta inmune añadiendo los inmunoestimuladores QS21
EP 362 279 y dQS21 WO 96/33739; sin embargo no fue posible medir
ningún aumento en las respuestas de los anticuerpos contra los
polisacáridos en monos Rhesus.
Threadgill et al., han informado
recientemente en "Vaccine" 1998 Vol. 16(1) p. 76 que los
oligonucleótidos CpG inmunoestimuladores inhiben la respuesta de los
anticuerpos específica contra polisacáridos cuando el
oligonucleótido es formulado con polisacárido de Pseudomonas
aeruginosa.
Los presentes inventores han descubierto que,
sorprendentemente, es posible adyuvar la respuesta inmune contra las
vacunas neumocócicas de polisacáridos mediante la formulación con un
oligonucleótido CpG inmunoestimulador, proporcionando tales
formulaciones una respuesta inmune que produce niveles
significativos de anticuerpos IgG.
Según la presente invención, se proporciona la
composición de una vacuna que comprende un antígeno polisacárido
neumocócico adyuvado por un oligonucleótido CpG
inmunoestimulador.
El antígeno polisacárido puede estar o no
conjugado a un vehículo proteico tal que proporcione epitopes
T-ayudantes.
Los oligonucleótidos pueden ser ADN o ARN, pero
preferiblemente contienen un motivo hexámero: purina purina CpG
pirimidina pirimidina. Más preferiblemente, el enlace
internucleotídico es modificado para aumentar la estabilidad del
oligonucleótido. Las modificaciones preferidas son los enlaces de
fosforotioato. La proteína lytA que participa en la degradación
catalítica de la pared celular de los neumococos es producida en el
momento de la autolisis, y forma parte del operón inducido por
competencia (Mol. Microbiol. 29:1125 (1998)). Por definición,
el ARNm que codifica la lytA estará presente en grandes cantidades
durante la síntesis de la proteína lytA. Además, la proteína lytA
contiene una región de unión a la fosforil colina que contiene
secuencias repetidas de ADN (Yother y Briles J., Bacteriol.
174: 601 (1992), y que puede ser encontrada en muchas otras
proteínas de unión a la colina presentes en los estreptococos. Las
siguientes secuencias CpG fueron identificadas desde las regiones de
unión a la fosforil colina de la lytA, y desde la proteína A de
unión a la colina (cbpA) (Rosenow et al., Mol.
Microbiol. 25: 819-829 (1997)).
- OLIGO 1: GCTACTGGTACG TACATTC AGACGGC TCTT (LlytA)
- OLIGO 2: ACTATCTAAACGCTAATGGTGCTATGGCGACAGGATGGCT (cbpA)
y pueden ser utilizadas en la
presente
invención.
Las siguientes secuencias inmunoestimuladoras de
oligonucleótidos también pueden ser usadas como ejemplos
comparativos:
- OLIGO 3: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT
- OLIGO 4: TCT CCC AGC GTG CGC CAT
Las secuencias CpG y flanqueadoras han sido
subrayadas, y hay motivos ACGT, ACG y GCG conservados. Las
secuencias derivadas de las regiones de unión a la colina de las
proteínas neumocócicas tienen dos motivos CpG que repitieron 10 ó 15
bases de nucleótidos por separado, y tiene lugar un motivo basado en
esta distancia entre bases de nucleótidos entre dos CpG tres veces y
cinco veces respectivamente en las proteínas lytA y CbpA. Sin
embargo, las secuencias publicadas tienen dos motivos CpG que son
siete o dos bases de nucleótidos separadas.
En una realización, al combinarse con la vacuna
de polisacáridos 23-valente comercialmente
disponible (Pnuemo-
vax®, Pasteur Merieux), la adyuvación con CpG aumentó significativamente la respuesta inmune (anticuerpo IgG) especialmente contra los polisacáridos de tipo 19F y 14 al ser administrada intramuscularmente.
vax®, Pasteur Merieux), la adyuvación con CpG aumentó significativamente la respuesta inmune (anticuerpo IgG) especialmente contra los polisacáridos de tipo 19F y 14 al ser administrada intramuscularmente.
Por lo tanto, en una realización de la presente
invención, es posible aumentar ventajosamente la eficacia de una
vacuna neumocócica comercialmente disponible. Esto es
particularmente importante en poblaciones de alto riesgo,
especialmente en aquéllas que tienen respuestas de anticuerpos
contra polisacáridos sub-óptimas. Tales poblaciones pueden incluir,
pero no se limitan a, ancianos, pacientes que padecen una de las
siguientes enfermedades: esplenectomía, asplenia congénita,
hiposplenia, anemia de las células falciformes, neutropenia cíclica,
neutropenia inducida por fármacos, anemia aplástica,
agammaglobulinemia congénita, hipogammaglobulinemia, deficiencia
selectiva de subtipo IgG, mieloma múltiple, leucemia linfocítica
crónica, linfoma, infección por VIH, condiciones multifactoriales
tales como tratamiento glucocorticoide, malnutrición, cirrosis de
hígado, insuficiencia renal, diabetes mellitus, alcoholismo,
enfermedad crónica, hospitalización, fatiga, estrés, exposición al
frío, infección respiratoria previa, gripe, asma. También se puede
incluir a adultos sanos, tales como los profesionales de la salud,
reclutas militares, prisioneros u otros, incluyendo asistentes a
escuelas o viajantes que deseen garantizarse una cobertura completa
de
la vacuna.
la vacuna.
En una aplicación preferida, se usa el adyuvante
CpG para aumentar la respuesta contra la vacuna de polisacáridos
cuando se usa como refuerzo en niños entre 6 y 24 meses de edad que
han recibido su primera inmunización con un conjugado
polisacárido-proteína neumocócico polivalente. Tales
vacunas utilizadas para una inmunización primaria también pueden ser
ventajosamente adyuvadas con un oligonucleótido CpG. Por
consiguiente, en una realización, se proporciona un procedimiento de
inmunización de un paciente que comprende administrar una cantidad
eficaz de una vacuna según la invención.
En una segunda realización, se proporciona un
procedimiento de refuerzo de la respuesta inmune en un sujeto que ha
sido previamente cebado contra un antígeno mediante la
administración de un antígeno T-independiente
neumocócico con un oligonucleótido CpG inmunoestimulador.
Otras vacunas basadas en antígenos
T-independientes incluyen, pero no se limitan a, la
vacuna de polisacárido Vi contra Salmonella typhi, la vacuna
tetravalente de polisacáridos de meningococos (que comprende los
tipos A, C, W135 e Y), el polisacárido y los polisacáridos
modificados de los meningococos del grupo B, polisacáridos de
Staphylococcus aureus, polisacáridos de Streptococcus
agalactae, polisacáridos de micobacterias, p.ej.,
Mycobacterium tuberculosis, tales como mannofosfoinisitidas
trehalosas, ácido micólico, arabinomananos cubiertos con manosa, la
cápsula de los mismos y arabinogalactanos, polisacárido de
Cryptococcus neoformans, los lipopolisacáridos del
Haemophilus influenzae no clasificable, los lipopolisacáridos
de Moraxella catharralis, los lipopolisacáridos de
Shigella sonnei, el lipopeptidofosfoglicano (LPPG) de
Trypanosoma cruzi, el cáncer asociado a los gangliósidos GD3,
GD2, el tumor asociado a mucinas, especialmente, el antígeno
T-F y el antígeno sialil T-F, y el
polisacárido asociado al VIH que está estructuralmente relacionado
con el antígeno T-F. Otros antígenos
T-independientes pueden derivar de:
Salmonella, Vibrio cholera, Escherichia,
Chlamydia y antígenos T-independientes de
Plasmodium.
La preparación de la vacuna se describe de forma
general en Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 6 "Vaccine
Design - the subunit and adjuvant approach", editado por Powell y
Newman, Plenum Press, 1995. La Encapsulación en liposomas es
descrita, por ejemplo, por Fullerton, en la patente estadounidense
4.235.877. La conjugación de proteínas a macromoléculas es revelada,
por ejemplo, por Likhite, en la patente estadounidense 4.372.945 y
por Armor et al., en la patente estadounidense 4.474.757.
La cantidad de proteína de cada dosis de vacuna
se selecciona como una cantidad que induzca a una respuesta
inmunoprotectora sin causar efectos secundarios negativos
significativos en las vacunas típicas. Tal cantidad variará en
función del inmunogen específico que se emplee, y cómo se presente.
Generalmente, se espera que cada dosis comprenda
0,1-1.000 \mug de polisacárido o de conjugado de
polisacárido-proteína, preferiblemente,
2-100 \mug, y lo más preferible,
4-40 \mug. Se puede determinar la cantidad óptima
para una determinada vacuna mediante estudios estándar que impliquen
la observación de las respuestas inmunes apropiadas en los sujetos.
Tras una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias
inmunizaciones de refuerzo adecuadamente espaciadas.
Los oligonucleótidos utilizados en la presente
invención son normalmente desoxinucleótidos. En una realización
preferida, el enlace internucleotídico del oligonucleótido es
fosforoditioato, o más preferiblemente, un enlace fosforotioato,
aunque los fosfodiésteres también pertenecen al alcance de la
presente invención. Se pueden usar otros enlaces internucleotídicos
que estabilicen el oligonucleótido.
Los oligonucleótidos CpG utilizados en la
presente invención pueden ser sintetizados mediante cualquier
procedimiento conocido en la técnica (p.ej, EP 468 520).
Convenientemente, tales oligonucleótidos pueden ser sintetizados
utilizando un sintetizador automático. En los documentos US
5.66.153; US 5.278.302 y WO 95/26204, se describen procedimientos
para producir oligonucleótidos de fosforotioato o
fosforoditioato.
La protección contra la infección neumocócica es
mediada por la acción del anticuerpo IgG contra el polisacárido
capsular, junto con la deposición del complemento que vuelve a las
bacterias susceptible de ser matadas por neutrófilos mediante
opsonofagocitosis. Por lo tanto, la eficacia protectora de la vacuna
sólo puede ser estimada en base a la inducción de los anticuerpos
IgG. Se inmunizaron una vez varios grupos de 10 ratones con una
vacuna comercial 23-valente de polisacáridos
neumocócicos a 1/10, 1/50 ó 1/250 de las dosis empleadas en humanos
(57,7; 11,5 y 2,3 \mug de polisacárido total respectivamente), que
fue adyuvada con CpG (50 \mug de oligo 1), CpG+ alumbre. Tras la
inmunización, se midieron las concentraciones de IgG en suero contra
polisacáridos de los cuatro serotipos más importantes (6B, 14, 19F y
23F) mediante ensayos ELISA cada 7 días durante 4 semanas.
Se inmunizaron los siguientes grupos (10 ratones
balb/c por grupo):
- 23 valente a 2,3; 11,5 y 57,5 \mug/dosis (dosis humana de 1/250, 1/50 y 1/10).
- 23 valente + CpG (50 \mug) en el mismo intervalo posológico.
- 23 valente + CpG + Al(OH)_{3} en el mismo intervalo posológico.
Componente | Lote | Concentración \mug/ml | Tampón |
23 valente de Pasteur Mérieux | 95K03-HC56630 | 1.150 | Salino |
(Pnemovax® 23) | |||
CpG | Oligo 3 | 5.000 | H_{2}O |
Al(OH)_{3} | 96A0089 | 10.380 | H_{2}O |
Se diluyó la vacuna Pneumovax en H_{2}O, 10 mM
de PO_{4} 10 veces concentrado y 150 mM de NaCl a pH 6,8 para
obtener 2,3; 11,5 ó 57,7 \mug de antígeno por dosis. Se añadió el
CpG durante 30 min, y para los grupos que contenían
Al(OH)_{3},las formulaciones fueron adsorbidas
durante 30 min sobre Al(OH)_{3} (50 \mug). Se
añadió Tiomersal (50 \mug/ml) como conservante.
Había 10 animales por grupo, pero como las
sangrías fueron realizadas todas las semanas, sólo se
sangraban
5 animales a la semana. El ensayo ELISA y la opsonofagocitosis fueron realizados en una mezcla de suero.
5 animales a la semana. El ensayo ELISA y la opsonofagocitosis fueron realizados en una mezcla de suero.
El ensayo ELISA se realizó para medir el IgG
murino usando el protocolo del taller de la OMS sobre el
procedimiento ELISA para la cuantificación del anticuerpo IgG contra
los polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae en
suero humano. En esencia, el polisacárido capsular purificado es
cubierto directamente sobre la placa de microvaloración. Se
preincuban muestras de suero con polisacárido de pared celular común
a todos los neumococos y que está presente en un 0,5% ca. en los
polisacáridos neumocócicos purificados según la revelación (EP72513
B1). Se emplearon reactivos de los laboratorios Jackson
ImmunoLaboratories Inc. para detectar el IgG murino unido. Las
curvas de valoración fueron referenciadas con respecto a estándares
internos (anticuerpos monoclonales) modelados por la ecuación
logarítmica logística. Los cálculos fueron realizados usando el
programa SoftMax Pro®. Se esperaba que el error absoluto
máximo de estos resultados estaría en un factor de 2. El error
relativo fue
menor del 30%.
menor del 30%.
Se encontraron anticuerpos del isotipo IgG contra
los serotipos 14 y 19G, pero no contra los serotipos 6B y 23F, y en
la figura 1, se presentan los resultados para el serotipo 14. La
respuesta dependió de la dosis, con 1/10 de dosis humana ofreciendo
la respuesta más alta, lo que indicó que la respuesta a IgG era
específica del polisacárido. Esto es poco habitual, pues los ratones
normalmente sólo producen IgM contra los polisacáridos neumocócicos.
La respuesta máxima se produjo a los 14 días de haberse realizado la
inmunización, lo que no es poco habitual, pues los antígenos
T-independientes no inducen a la memoria.
Se llevaron a cabo análisis individuales
adicionales para determinar la varianza y la relevancia estadística
(no se muestran los datos). La respuesta a 1/10 de dosis humana de
la 23-valente sufrió un aumento (estadísticamente)
significativo cuando se adyuvó sólo con CpG (para el tipo 19, CMG de
0,8 comparada con 3,7 \mug/ml p = 0,07; para el tipo 14, CMG de
0,19 comparada con 3,4 \mug/ml, p = 0,001). Esto también se
cumplió para 1/50 y 1/250 de dosis humana cuando se midieron frente
al tipo 14. Además, las respuestas aumentaron significativamente
contra el tipo 14 cuando se adyuvó con CpG + alumbre.
La respuesta más elevada fue inducida cuando la
vacuna fue adyuvada sólo con CpG.
Se seleccionó el modelo de ratas neonatales
porque los datos publicados mostraron que la inmunogenicidad
relativa de 4 conjugados neumocócicos de proteína y polisacárido en
bebés humanos fue más similar a la de las ratas que a la de los
ratones. Es decir, 6B<23F<14<19F para ratas neonatales. Las
ratas neonatales fueron seleccionadas porque su sistema inmune puede
tener una inmadurez del desarrollo similar a la encontrada en los
bebés humanos.
Las ratas neonatales fueron inmunizadas con lotes
de calidad clínica de conjugados neumocócicos tetravalentes de
polisacárido-PD^{(a)} en un intervalo posológico
de 5 veces y con los adyuvantes CpG y AlPO4+CpG. Se usó oligo 1 a
una dosis de 100 \mug. Los animales fueron inmunizados por primera
vez a los 7 días de vida, y recibieron inmunizaciones posteriores 14
y 28 días después. Se realizó un serología de las muestras desde el
día 42 (14 días después de la III) y 56 (28 días después de la
III).
El mejor adyuvante fue el CpG solo: aumentó la
media geométrica de las concentraciones de IgG y los valores
opsónicos contra 6B, 23F y 19F, mientras que los valores para el
serotipo 14 fueron comparables con el resto de las preparaciones
adyuvadas. La formulación realizada solo con CpG también fue capaz
de aumentar significativamente las velocidades de seroconversión
contra el serotipo 6B-PD.
El lote de vacuna DSP0401x contiene los lotes de
calidad clínica PS-PD tetravalentes D6BPJ208 +
D14PDJ202 + D19PJ206 + D23PDJ212 . El ESPL001 contiene los lotes
PS-LPD tetravalentes E6BL040P + E14L66P + E19FL033P
+ E23FL21P.
\vskip1.000000\baselineskip
Grupo | Lote de vacuna | Adyuvante | Dosis (\mug por cada PS) |
1 | Ninguno | CpG | — |
2 | DSP0401x | Ninguno | 0,1 |
3 | DSP0401x | Ninguno | 0,5 |
(Continuación)
Grupo | Lote de vacuna | Adyuvante | Dosis (\mug por cada PS) |
4 | DSP0401x | AlPO_{4} | 0,1 |
5 | DSP0401x | AlPO_{4} | 0,5 |
6 | DSP0401x | AlPO_{4} | 2,5 |
7 | ESPL001 | AlPO_{4} | 0,1 |
8 | ESPL001 | AlPO_{4} | 0,5 |
9 | ESPL001 | AlPO_{4} | 1,25 |
10 | DSP0401x | CpG | 0,1 |
11 | DSP0401x | CpG | 0,5 |
12 | DSP0401x | CpG/AlPO_{4} | 0,1 |
13 | DSP0401x | CpG/AlPO_{4} | 0,5 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Componente | Lote | Concentración \mug/ml | Tampón |
Conjugado PD6B | D6BPDJ208 | 206 | NaCl 0,2M pH 6,5 |
Conjugado PD14 | D14PDJ202 | 186 | NaCl 0,2M pH 6,5 |
Conjugado PD19 | D19PDJ206 | 175 | NaCl 0,2M pH 6,5 |
Conjugado PD23 | D23PDJ212 | 158 | NaCl 0,2M pH 6,5 |
Monovalente PD6B | D6BPDD208 | 100 | NaCl 150 mM pH 6,1 |
Monovalente PD14 | D14PDD202 | 100 | NaCl 150 mM pH 6,1 |
Monovalente PD19 | D19PDD206 | 100 | NaCl 150 mM pH 6,1 |
Monovalente PD23 | D23PDD212 | 96 | NaCl 150 mM pH 6,1 |
Monovalente LPD6B | E6BL040P | 50 | NaCl 150 mM pH 6,1 |
Monovalente LPD14 | E14FL66P | 50 | NaCl 150 mM p14 6,1 |
Monovalente LPD19 | E19FL033P | 50 | NaCl 150 mM pH 6,1 |
Monovalente LPD23 | E23FL21P | 50 | NaCl 150 mM pH 6,1 |
Tetravalente LPD | ESPL001 | 5/valencia | NaCl 150 mM pH 6,1 |
CpG | Oligo 1, WD1001 | 5.000 | H_{2}O |
AlPO_{4} | 97D0045 | 5.040 | NaCl 150 mM pH 6,1 |
\newpage
Se diluyen los cuatro conjugados en H_{2}O y
NaCl 150 mM 10 veces concentrado. Se añade fenoxietanol
(500 \mug/ml) como conservante.
(500 \mug/ml) como conservante.
Si se necesita CpG, se añade el oligonucleótido
al tetravalente no adsorbido. El NaCl garantiza la isotonicidad y la
dilución, en el caso de que sean necesarias.
Se diluyen los cuatro monovalentes adsorbidos
concentrados en H_{2}O y NaCl 150 mM 10 veces concentrado, antes
de la adición de AlPO_{4}. Se añade fenoxietanol (500 \mug/ml)
como conservante.
Si se necesitan diluciones, se diluyen los
tetravalentes en AlPO_{4} a 1 mg/ml. Estos diluyentes son
preparados en NaCl 150 mM.
Si se necesita CpG, se añade el oligonucleótido
al tetravalente adsorbido. La adición de NaCl 1.500 mM garantiza la
isotonicidad, y si se requieren diluciones, se añaden diluyentes de
AlPO_{4} a 1,3 ó 1,8 mg/ml en NaCl.
Todas las formulaciones son preparadas en viales
de vidrio no siliconado.
Las ratas neonatales fueron seleccionadas al azar
de diferentes madres y tenían 7 días de edad cuando recibieron su
primera inmunización. Recibieron inmunizaciones posteriores 14 y 28
días después. Se realizaron sangrías en los días 42 (14 días después
de la III) y 56 (28 días después de la III). Todas las vacunas
fueron inyectadas s.c., y había 10 ratas por grupo de
vacunación.
El ensayo ELISA fue realizado para medir el IgG
en ratas usando el protocolo derivado del taller de la OMS sobre
"el procedimiento ELISA para la cuantificación de anticuerpos IgG
contra los polisacáridos capsulares de Streptococcus
pneumoniae en suero humano". En esencia, el polisacárido
capsular purificado es cubierto directamente sobre la placa de
microvaloración. Se preincuban muestras de suero con polisacárido de
pared celular común a todos los neumococos y que está presente en un
0,5% ca. en los polisacáridos neumocócicos purificados. Se emplearon
reactivos de los laboratorios Jackson ImmunoLaboratories Inc. para
detectar el IgG unido de las ratas. Las curvas de valoración fueron
referenciadas con respecto a la curva de valoración de un modelo
referencial de suero mediante la ecuación logarítmica logística. Los
cálculos fueron realizados usando el programa SoftMax Pro®. Los
sueros estándar fueron calibrados usando un procedimiento de
respuesta corolaria, y se demostró que los valores correspondían
con las estimaciones de las concentraciones de IgG encontradas
mediante inmunoprecipitación (Ref. 21).
El análisis opsonofagocítico fue realizado según
el protocolo CDC (opsonofagocitosis de Streptococcus
pneumoniae usando células HL60 diferenciadas, versión 1.1). La
modificación realizada incluyó el uso de cepas neumocócicas
internas, y las células HL60 fagocíticas fueron reemplazadas por PMN
humanos purificados. Se incluyeron sueros policlonales de rata como
control positivo.
La figura 2 muestra la media geométrica de las
concentraciones de IgG obtenidas contra el serotipo 6B mediante las
combinaciones tetravalentes descritas en el apartado de materiales y
procedimientos. Por motivos de claridad, los ejes se dividen en
adyuvante y dosis. Se obtuvieron resultados similares contra los
serotipos 19F y 23F, pero el tipo 14 tuvo una respuesta más uniforme
frente a todos los adyuvantes y a todas las dosis.
Se midió mediante opsonofagocitosis la actividad
biológica de la mezcla de antisueros de cada grupo adyuvante y de
cada dosis. La actividad opsónica relativa a la concentración de IgG
ofrecerá una estimación de la actividad funcio-
nal de los antisueros. Los valores, mostrados en la tabla 1, demuestran que todos los adyuvantes inducen al anticuerpo, que tiene aproximadamente la misma capacidad de opsonizar neumococos. Así, el CpG ayuda a la inducción del anticuerpo específico y aumenta en el correlato de concentración de anticuerpo con aumentos en la eficacia protectora.
nal de los antisueros. Los valores, mostrados en la tabla 1, demuestran que todos los adyuvantes inducen al anticuerpo, que tiene aproximadamente la misma capacidad de opsonizar neumococos. Así, el CpG ayuda a la inducción del anticuerpo específico y aumenta en el correlato de concentración de anticuerpo con aumentos en la eficacia protectora.
- \bullet
- El AlPO_{4} (en comparación con la ausencia de adyuvante) aumenta significativamente la velocidad de seroconversión, la media geométrica de la concentración de IgG, la actividad opsónica y la memoria inmunológica contra el conjugado PS-PD tetravalente.
- \bullet
- La dosis de AlPO_{4} de 0,1 \mug es significativamente más inmunogénica que la dosis de 0,5 \mug para los conjugados PS-PD de serotipos 6B, 19F y 23F.
- \bullet
- Las concentraciones de IgG aumentan significativamente contra los serotipos 6B, 19F y 23F cuando la vacuna conjugada es adyuvada con CpG en comparación con la adyuvación con AlPO4. Esto queda confirmado por el aumento de las velocidades de seroconversión y el aumento de los valores opsonofa- gocíticos.
\vskip1.000000\baselineskip
Vacuna | Adyuvante | Dosis | Concentración de IgG requerida para | Media por | |||
matar el 50% | adyuvante | ||||||
\mug | 6B | 14 | 19F | 23F | |||
DSP0401x | Ninguno | 0,1 | 0,32 | 0,30 | 0,30 | 0,37 | 0,26\pm0,14 |
0,5 | Nula | 0,015 | Nula | Nula | |||
DSP0401x | AlPO_{4} | 0,1 | 0,02 | 0,31 | 0,40 | 0,09 | 0,20\pm0,15 |
0,5 | Nula | 0,05 | 0,22 | Nula | |||
2,5 | Nula | 0,32 | #VAL | Nula | |||
ESPL001 | AlPO_{4} | 0,1 | 0,08 | 0,46 | Nula | 0,22 | 0,35\pm0,27 |
0,5 | 0,11 | 0,71 | 0,75 | 0,08 | |||
1,25 | 0,10 | 0,55 | 0,66 | 0,20 | |||
DSP0401x | CpG | 0,1 | 0,42 | 0,15 | Nula | 0,20 | 0,24\pm0,10 |
0,5 | 0,21 | 0,30 | Nula | 0,17 | |||
DSP0401x | CpG / AlPO_{4} | 0,1 | 0,27 | 0,10 | Nula | 0,21 | 0,20\pm0,14 |
0,5 | Nula | 0,10 | 0,44 | 0,09 | |||
Media | por serotipo | 0,19\pm0,14 | 0,29\pm0,20 | 0,45\pm0,20 | 0,18\pm0,09 |
\vskip1.000000\baselineskip
El ejemplo 2 mostró que la adyuvación con CpG de
las vacunas conjugadas resultó en aumentos del orden de 5 a 10 veces
más que con los adyuvantes convencionales (aluminio). Para
determinar si estos efectos dependían de la secuencia del oligo, la
dosis o la formulación, se llevaron a cabo más experimentos.
Se seleccionó OLIGO 2 de CpG y se usó en una
dosis más baja, que fue de 1 a 10 \mug. También fue adsorbido
sobre Al(OH)_{3} y combinado con las vacunas
conjugadas.
Además, como las características inmunológicas de
cada polisacárido pueden ser diferentes, se analizaron 11
serotipos.
Serotipo | 1 | 3 | 4 | 5 | 6B | 7F | 9V | 14 | 18C | 19F | 23F |
Número de lote | 017 | 040 | 218 | 024 | 209 | 019 | 222 | 204 | 221 | 207 | 213 |
Para examinar el efecto de varios adyuvantes
avanzados distintos, se mantuvo constante la dosis de conjugado a
0,1 \mug de cada polisacárido, y los adyuvantes AlPO_{4},
Al(OH)_{3} y CpG fueron formulados en diferentes
dosis y combinaciones. En total, se analizaron 10 combinaciones
distintas, incluyendo la exclusión total de adyuvante. Éstas se
encuentran enumeradas numéricamente en la tabla 3 por
referencia.
Se prepararon dos diluyentes en NaCl 150
mM/fenoxi
- A:
- AlPO_{4} a 1 mg/ml.
- B:
- CpG sobre Al(OH)_{3} a 200 y 1.000 \mug/ml respectivamente. Proporción en peso de CpG / Al(OH)_{3} = 1/5.
Se mezclaron los once monovalentes
PS-PD adsorbidos y concentrados en una proporción
correcta. Se añadió el complemento de AlPO_{4}. Cuando fue
necesario, se añadió el CpG (CpG adsorbido sobre
Al(OH)_{3}) o el diluyente.
Se mezclaron los once conjugados
PS-PD y se diluyeron en la proporción correcta en
NaCl 150 mM pH 6,1, fenoxi. Cuando fue necesario, se añadió CpG bien
como solución (no adsorbido) o como CpG adsorbido sobre
Al(OH)_{3}.
Las formulaciones de todas las inyecciones fueron
preparadas 18 días antes de la primera administración.
\vskip1.000000\baselineskip
Grupo | AlPO_{4} | CpG | Al(OH)_{3} | Descripción |
1 | Ninguna | |||
2 | 100 | AlPO_{4} | ||
3 | 1 | CpG bajo | ||
4 | 10 | CpG alto | ||
5 | 1 | 4,5 | CpG ads. bajo | |
6 | 10 | 50 | CpG ads. alto | |
7 | 100 | 1 | CpG bajo conj. ads. | |
8 | 100 | 10 | CpG alto conj. ads. | |
9 | 95 | 1 | 4,5 | CpG y Conj. ads. bajo |
10 | 50 | 10 | 50 | CpG y Conj. ads. alto |
Se seleccionaron al azar ratas OFA neonatales de
diferentes madres, que tenían 7 días de vida cuando recibieron su
primera inmunización. Recibieron 2 inmunizaciones más 14 y 28 días
después. Se realizó una sangría el día 56
(28 días después de la III). Todas las vacunas fueron inyectadas s.c., y había 10 ratas por grupo de vacunación.
(28 días después de la III). Todas las vacunas fueron inyectadas s.c., y había 10 ratas por grupo de vacunación.
El ensayo ELISA fue realizado como se describe en
el ejemplo 2.
El ensayo opsonofagocítico fue realizado según el
protocolo CDC (opsonofagocitosis del Streptococcus pneumoniae
usando células HL60 diferenciadas, versión 1.1). La modificación
realizada incluyó el uso de cepas neumocócicas internas, y las
células HL60 fagocíticas fueron reemplazadas por PMN humanos
purificados. Además, se añadieron perlas de vidrio de 3 mm a los
pozos de microvaloración para aumentar el mezclado, y esto permitió
la reducción de la proporción entre fagocito y bacterias, que era
recomendable que fuera de 400.
Las tablas 4 a 7 de abajo muestran la media
geométrica de la concentración de IgG, la velocidad de
seroconversión y la media aritmética del valor opsonofagocítico
determinado para los 4 serotipos de neumococos tras la inmunización
con una vacuna conjugada de PS-Proteína D
neumocócica 11- valente adyuvada con diferentes formulaciones de
OLIGO 2 de CpG. En comparación con la vacuna sin adyuvante, los 10
\mug de CpG indujeron a concentraciones de IgG significativamente
más elevadas para todos los serotipos. El CpG indujo a
concentraciones de IgG significativamente superiores que las
inducidas por el AlPO_{4} para los serotipos 1, 6B, 18C y 19F.
A modo de comparación, en las tablas, se incluyen
los resultados del ejemplo 2, que usa OLIGO 1. No hay diferencias
significativas en las respuestas de IgG inducidas por las dos
secuencias OLIGO, cuando se usa OLIGO 2 a 10 \mug. Sin embargo, el
OLIGO 2 a 1 \mug no muestra efectos inmunoestimuladores, lo que se
demuestra porque las concentraciones de IgG inducido no son
significativamente diferentes de las que carecen de CpG.
La adsorción del OLIGO 2 sobre
Al(OH)_{3} reduce el efecto inmunoestimulador, y la
inducción de los anticuerpos no es significativamente distinta a la
obtenida cuando se utiliza AlPO_{4} como adyuvante.
Grupo | AlPO_{4} | Oligo 1 | Oligo 2 | CMG | Serocon- | Valor* | CMG | Merocon- | Valor* |
(\mug) | (\mug) | (\mug) | de IgG | versión | Opso. | de IgG | versión | Opso. | |
(\mug/ml) | de 6B | de 6B | (\mug/ml) | de 6B | de 6B | ||||
para 6B | para 6B | ||||||||
Ejemplo 2 | Ejemplo 3 | ||||||||
1 | 0,047 | 2/10 | 12,5 | 0,004 | 1/10 | <6,25 | |||
2 | 100 | 0,048 | 4/10 | 65 | 0,019 | 4/10 | <6,25 | ||
3 | 1 | 0,003 | 1/10 | <6,25 | |||||
4 | 10 | 1,682 | 10/10 | 157 | |||||
100 | 0,63 | 8/10 | 48 | ||||||
5 | 1 \mug | 0,015 | 6/10 | <6,25 | |||||
sobre | |||||||||
Al(OH)_{3} | |||||||||
6 | 10 \mug | 0,007 | 3/10 | <6,25 | |||||
sobre | |||||||||
Al(OH)_{3} |
Grupo | AlPO_{4} | Oligo 1 | Oligo 2 | CMG | Serocon- | Valor* | CMG | Merocon- | Valor* |
(\mug) | (\mug) | (\mug) | de IgG | versión | Opso. | de IgG | versión | Opso. | |
(\mug/ml) | de 6B | de 6B | (\mug/ml) | de 6B | de 6B | ||||
para 6B | para 6B | ||||||||
Ejemplo 2 | Ejemplo 3 | ||||||||
7 | 100 | 1 | 0,029 | 7710 | <6,25 | ||||
8 | 100 | 10 | 0,469 | 9/10 | 77 | ||||
100 | 100 | 0,46 | 7/10 | 75 | |||||
9 | 95 | 1 \mug | 0,040 | 5/10 | 38 | ||||
sobre | |||||||||
Al(OH)_{3} | |||||||||
10 | 50 | 10 \mug | 0,022 | 7/10 | <6,25 | ||||
sobre | |||||||||
Al(OH)_{3} |
Grupo | AlPO_{4} | Oligo 1 | Oligo 2 | CMG | Serocon- | Valor* | CMG | Merocon- | Valor* |
(\mug) | (\mug) | (\mug) | de IgG | versión | Opso. | de IgG | versión | Opso. | |
(\mug/ml) | de 14 | de 14 | (\mug/ml) | de 14 | de 14 | ||||
para 14 | para 14 | ||||||||
Ejemplo 2 | Ejemplo 3 | ||||||||
1 | 0,046 | 3/10 | 64 | 0,022 | 3/10 | <6,25 | |||
2 | 100 | 0,99 | 10/10 | 88 | 0,237 | 8/10 | 27 | ||
3 | 1 | 0,035 | 4/10 | <6,25 | |||||
4 | 10 | 0,361 | 10/10 | 88 | |||||
100 | 0,66 | 9/10 | 295 | ||||||
5 | 1 \mug | 0,093 | 9/10 | <6,25 | |||||
sobre | |||||||||
Al(OH)_{3} | |||||||||
6 | 10 \mug | 0,155 | 9/10 | 27 | |||||
sobre | |||||||||
Al(OH)_{3} | |||||||||
7 | 100 | 1 | 0,134 | 7/10 | <6,25 | ||||
8 | 100 | 10 | 2,028 | 10/10 | 188 | ||||
100 | 100 | 2,3 | 10/10 | 888 |
Grupo | AlPO_{4} | Oligo 1 | Oligo 2 | CMG | Serocon- | Valor* | CMG | Merocon- | Valor* |
(\mug) | (\mug) | (\mug) | de IgG | versión | Opso. | de IgG | versión | Opso. | |
(\mug/ml) | de 14 | de 14 | (\mug/ml) | de 14 | de 14 | ||||
para 14 | para 14 | ||||||||
Ejemplo 2 | Ejemplo 3 | ||||||||
9 | 95 | 1 \mug | 0,140 | 6/10 | 138 | ||||
sobre | |||||||||
Al(OH)_{3} | |||||||||
10 | 50 | 10 \mug | 0,196 | 10/10 | <6,25 | ||||
sobre | |||||||||
Al(OH)_{3} |
Grupo | AlPO_{4} | Oligo 1 | Oligo 2 | CMG | Serocon- | Valor* | CMG | Merocon- | Valor* |
(\mug) | (\mug) | (\mug) | de IgG | versión | Opso. | de IgG | versión | Opso. | |
(\mug/ml) | de 19F | de 19F | (\mug/ml) | de 19F | de 19F | ||||
para 19F | para 19F | ||||||||
Ejemplo 2 | Ejemplo 3 | ||||||||
1 | 0,04 | 2/10 | 64 | 0,021 | 2/10 | <6,25 | |||
2 | 100 | 1,07 | 9/10 | 367 | 0,222 | 7/10 | 79 | ||
3 | 1 | 0,015 | 3/10 | <6,25 | |||||
4 | 10 | 4,287 | 10/10 | 415 | |||||
100 | 12,0 | 10/10 | >1.600 | ||||||
5 | 1 \mug | 0,417 | 9/10 | 32 | |||||
sobre | |||||||||
Al(OH)_{3} | |||||||||
6 | 10 \mug | 1,612 | 9/10 | 94 | |||||
sobre | |||||||||
Al(OH)_{3} | |||||||||
7 | 100 | 1 | 0,441 | 10/10 | 135 | ||||
8 | 100 | 10 | 9,475 | 10/10 | >1.600 | ||||
100 | 100 | 11,0 | 10/10 | >1.600 | |||||
9 | 95 | 1 \mug | 0,438 | 9/10 | 377 | ||||
sobre | |||||||||
Al(OH)_{3} | |||||||||
10 | 50 | 10 \mug | 0,258 | 7/10 | 165 | ||||
sobre | |||||||||
Al(OH)_{3} |
Grupo | AlPO_{4} | Oligo 1 | Oligo 2 | CMG | Serocon- | Valor* | CMG | Merocon- | Valor* |
(\mug) | (\mug) | (\mug) | de IgG | versión | Opso. | de IgG | versión | Opso. | |
(\mug/ml) | de 23F | de 23F | (\mug/ml) | de 23F | de 23F | ||||
para 23F | para 23F | ||||||||
Ejemplo 2 | Ejemplo 3 | ||||||||
1 | 0,06 | 2/10 | <6,25 | 0,152 | 3/10 | <6,25 | |||
2 | 100 | 0,29 | 10/10 | 70 | 0,56 | 8/10 | <6,25 | ||
3 | 1 | 0,114 | 4/10 | <6,25 | |||||
4 | 10 | 1,305 | 9/10 | 192 | |||||
100 | 2,0 | 10/10 | 454 | ||||||
5 | 1 \mug | 0,28 | 7/10 | <6,25 | |||||
sobre | |||||||||
Al(OH)_{3} | |||||||||
6 | 10 \mug | 0,107 | 2/10 | <6,25 | |||||
sobre | |||||||||
Al(OH)_{3} | |||||||||
7 | 100 | 1 | 0,243 | 4/10 | <6,25 | ||||
8 | 100 | 10 | 1,545 | 9/10 | 862 | ||||
100 | 100 | 1,1 | 10/10 | 265 | |||||
9 | 95 | 1 \mug | 0,255 | 3/10 | 44 | ||||
sobre | |||||||||
Al(OH)_{3} | |||||||||
10 | 50 | 10 \mug | 0,331 | 6/10 | <6,25 | ||||
sobre | |||||||||
Al(OH)_{3} |
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos anteriores han demostrado la
capacidad del CpG para adyuvar la respuesta inmune contra antígenos
T-independientes y contra antígenos
T-independientes acoplados a un vehículo proteico.
Queda por considerar si el CpG podría adyuvar una respuesta de
memoria provocada por el refuerzo con un antígeno
T-independiente tras el cebado con antígeno
T-dependiente. Resultaba de gran interés determinar
si el CpG podía actuar para inducir al cebado mediante un antígeno
T-independiente.
Para determinar estos efectos, se cebaron los
ratones bien con polisacárido neumocócico, polisacárido neumocócico
adyuvado con CpG o polisacárido neumocócico conjugado con proteína
D.
Se inmunizaron ratones balb/c de seis a ocho
semanas de vida subcutáneamente con las formulaciones de las vacunas
descritas abajo. La dosis fue de 1 \mug por polisacárido tanto
para las formulaciones conjugadas como para las no conjugadas. Se
realizó una sangría de prueba 14 días después para medir la
concentración de CpG. Tras 56 días, se realizó otra sangría de
prueba, y luego se administró una vacunación de refuerzo, para
realizar una sangría de prueba final 14 días después, es decir, 70
días después de la primera inmunización.
\vskip1.000000\baselineskip
Grupo | Preparación | Refuerzo |
1 | Salina | Conjugado |
2 | PS | PS |
3 | PS/Cp | PS |
4 | PS | Conjugado |
5 | PS/Cp | Conjugado |
6 | Conjug | PS |
7 | Conjug | PS/CpG |
8 | Conjug | Conjugado |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Componente | Lote | Conc. | Tampón | Adsorción | Conc. PS tras | Tampón tras |
\mug/ml | adsorción \mug/ml | adsorción | ||||
PS6b | 6b/24 | 2.000 | NaCl | |||
150 mM | ||||||
PS14 | 14/19 | 2.000 | NaCl | |||
150 mM | ||||||
PS19 | 19f/26b | 2.000 | NaCl | |||
150 mM | ||||||
PS23 | 23f/29 | 2.000 | NaCl | |||
150 mM | ||||||
Conjugado | D6BPDJ209 | MBSP9801 | 100 | NaCl 150 mM | ||
PDPS6B | pH 6,1/fenoxi | |||||
Conjugado | D14PDJ204 | MBSP9801 | 100 | NaCl 150 mM | ||
PDPS14 | pH 6,1/fenoxi | |||||
Conjugado | D19PDJ207 | MBSP9801 | 100 | NaCl 150 mM | ||
PDPS19 | pH 6,1/fenoxi | |||||
Conjugado | D23PDJ213 | MBSP9801 | 100 | NaCl 150 mM | ||
PDPS23 | pH 6,1/fenoxi | |||||
CpG | Oligo 1 | 5.000 | H_{2}O | |||
Diluyente St | 97D0045 | 1.000 | NaCl 150 mM | |||
Pn AlPO_{4} | pH 6,1/fenoxi |
\vskip1.000000\baselineskip
Preparación de los 4 monovalentes adsorbidos
concentrados (conjugados PS-PD).
Los monovalentes adsorbidos concentrados fueron
preparados según el procedimiento descrito anteriormente en el
ejemplo 2.
Los cuatro monovalentes adsorbidos concentrados
fueron mezclados en una proporción correcta (1 \mug de cada
valencia/dosis) y diluidos en NaCl pH 6,1. Se añadió el complemento
de AlPO4 (10 \mug/dosis) como diluyente a
1 mg/ml en NaCl 150 mM pH 6,1 que contenía 5 mg/ml de fenoxietanol.
1 mg/ml en NaCl 150 mM pH 6,1 que contenía 5 mg/ml de fenoxietanol.
Preparación del tetravalente no adsorbido no
conjugado con o sin CpG (PS libre).
Se mezclaron los cuatro PS libres en una
proporción correcta (1 \mug de cada valencia / dosis) y se
diluyeron en NaCl pH 6,1. Cuando fue necesario, se añadió el CpG
(100 \mug/dosis). Se añadieron cinco mg/ml de fenoxietanol como
conservante.
Las formulaciones para ambas inyecciones fueron
preparadas 6 días antes de la primera administración en viales de
vidrio no siliconados.
Preparación de los 4 monovalentes adsorbidos
concentrados (conjugados PS-PD).
Los monovalentes adsorbidos concentrados fueron
preparados según el procedimiento anteriormente descrito.
Los cuatro monovalentes adsorbidos concentrados
fueron mezclados en una proporción correcta (1 \mug de cada
valencia / dosis). Se añadió el complemento de AlPO_{4} (10
\mug/dosis) como diluyente a 1 mg/ml en NaCl 150 mM pH 6,1 que
contenía 5 mg/ml de fenoxietanol.
Se mezclaron los cuatro PS libres en una
proporción correcta (1 \mug de cada valencia / dosis) y se
diluyeron en NaCl pH 6,1. Cuando fue necesario, se añadió el CpG. Se
añadieron cinco mg/ml de fenoxietanol como conservante.
Las formulaciones para ambas inyecciones fueron
preparadas 6 días antes de la primera administración en viales de
vidrio no siliconados.
El ensayo ELISA fue realizado como se describe en
el ejemplo 1.
Los resultados de este experimento son el cebado
y el refuerzo. Los resultados del cebado concordaron con las
observaciones previas (ejemplo 1) en cuanto al descubrimiento de un
aumento en la seroconversión y de concentraciones más altas de IgG
en ratones que fueron inmunizados con polisacárido adyuvado con CpG
en comparación con el polisacárido simple. Según lo descubierto en
el ejemplo 1, los aumentos en la concentración de IgG tipo 14 con
adyuvación de CpG son estadísticamente significativos en comparación
con el PS solo, y los aumentos relativos al tipo 19F se aproximan a
ser significativos. Sin embargo, las concentraciones de IgG con
adyuvación de CpG no fueron tan elevados como las observadas en el
ejemplo 1. Para explicar esta diferencia, sólo se aplicaron dos
diferencias en los experimentos, en la valencia de la vacuna
(valencia 23 frente a valencia 4) y en la vía de inmunización
(intramuscular frente a subcutánea). Ya que no se espera que la
reducción de la valencia disminuya la inmunogenicidad, las pruebas
indican que la vía de inmunización es importante para conseguir una
adyuvación óptima con CpG de antígenos
T-independientes. Esto concuerda con una publicación
reciente que revela un intento fallido por usar una adyuvación con
CpG de una vacuna de polisacáridos simples. La vía de inmunización
empleada fue la interperitoneal (Threadgill et al.,
"Vaccine", 1998 Vol. 16(1) p. 76).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Seroconversión | CMG | |
PS 14 | 2/20* | 0,07 |
PS14/CpG | 12/20*\delta | 0,15 |
Conjugado | 24/30\delta | 1,04 |
PS19F | 1/20\xi | 0,08 |
PS19F CpG | 4/20\xi\omega | 0,10 |
Conjugado | 22/30\omega | 0,35 |
* p = 0,001 según la prueba de probabilidad exacta de Fisher | ||
\delta p = 0,11 según la prueba de probabilidad exacta de Fisher | ||
\xi p = 0,17 según la prueba de probabilidad exacta de Fisher | ||
\omega p < 0,001 según la prueba de probabilidad exacta de Fisher |
En la segunda parte de este experimento, los
animales cebados bien con PS, PS/CpG o vacuna conjugada, recibieron
un refuerzo de PS o PS/CpG o conjugado. Para normalizar los datos
por motivos comparativos, se determinó el aumento de IgG 14 días
después de haber administrado el refuerzo, contando el número de
animales que mostraron un aumento de la concentración de anticuerpos
como respondedores.
Cebado | Refuerzo | Aumento geométrico | Respondedores positivos |
PS | PS | 1,7* | 5/10 |
PS/CpG | PS | 2,8* | 6/10 |
Conjugado | PS | 0,78 \xi | 1/10 \delta |
Conjugado | PS/CpG | 1,7 \xi | 6/10 \delta |
Conjugado | Conjugado | 4,2 | 7/10 |
* p = 0,09 según el test t de Student | |||
\xi p = 0,12 según el test t de Student | |||
\delta p = 0,03 según la prueba de probabilidad exacta de Fisher |
Este ejemplo confirma los resultados presentados
en el ejemplo 1, pero ha revelado que el modo de inmunización puede
ser importante para una inmunización óptima. En una ampliación del
experimento de refuerzo y memoria, se demuestran dos características
importantes de la adyuvación con CpG. La primera es que el cebado
con PS adyuvado con CpG conduce a un aumento más elevado al reforzar
con polisacárido, y que existe una tendencia hacia la relevancia
estadística. Esto indicaría que el CpG fue capaz de inducir a una
mejora en la memoria. La segunda característica es que el CpG puede
adyuvar una respuesta de memoria inducida por polisacáridos en
animales cebados con una vacuna conjugada.
El CpG puede inducir a un cambio de isotipo en
los anticuerpos de ratones contra polisacáridos no conjugados. La
magnitud de la respuesta a IgG es mayor con CpG.
Claims (6)
1. Una composición de vacuna que comprende un
oligonucleótido CpG inmunoestimulador y un antígeno polisacárido de
Streptococcus pneumoniae.
2. Una composición de vacuna como la reivindicada
en la reivindicación 1, en la que el polisacárido está conjugado con
un vehículo proteico.
3. Una composición de vacuna como la reivindicada
en la reivindicación 1 ó 2, en la que el oligonucleótido CpG
inmunoestimulador tiene al menos un enlace internucleotídico,
seleccionado entre fosfodiésteres, fosforoditioato y
fosforotioato.
4. Una composición de vacuna como la reivindicada
en cualquier reivindicación anterior, en la que el oligonucleótido
CpG es:
- TCT CCC AGC GTG CGC CAT
5. Una composición de vacuna como la reivindicada
en cualquier reivindicación anterior para su uso en medicina.
6. Uso de la composición de vacuna como la
reivindicada en cualquier reivindicación anterior en la elaboración
de un medicamento para inducir una respuesta inmune contra un
antígeno polisacárido de Streptococcus pneumoniae.
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