ES2251124T3 - Vacuna que comprende un antigeno de streptococcus pneumoniae adyuvado por un oligonucleotido cpg. - Google Patents

Vacuna que comprende un antigeno de streptococcus pneumoniae adyuvado por un oligonucleotido cpg.

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ES2251124T3 ES98966705T ES98966705T ES2251124T3 ES 2251124 T3 ES2251124 T3 ES 2251124T3 ES 98966705 T ES98966705 T ES 98966705T ES 98966705 T ES98966705 T ES 98966705T ES 2251124 T3 ES2251124 T3 ES 2251124T3
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Craig A. J. Laferriere
Jean-Paul Prieels
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Abstract

Una composición de vacuna que comprende un oligonucleótido CpG inmunoestimulador y un antígeno polisacárido de Streptococcus pneumoniae. En una realización de la presente invención, es posible aumentar ventajosamente la eficacia de una vacuna neumocócica comercialmente disponible. Esto es particularmente importante en poblaciones de alto riesgo, especialmente en aquéllas que tienen respuestas de anticuerpos contra polisacáridos sub-óptimas. Tales poblaciones pueden incluir, pero no se limitan a, ancianos, pacientes que padecen una de las siguientes enfermedades: esplenectomía, asplenia congénita, hiposplenia, anemia de las células falciformes, neutropenia cíclica, neutropenia inducida por fármacos, anemia aplástica, agammaglobulinemia congénita, hipogammaglobulinemia, deficiencia selectiva de subtipo IgG, mieloma múltiple, leucemia linfocítica crónica, linfoma, infección por VIH, condiciones multifactoriales tales como tratamiento glucocorticoide, malnutrición, cirrosis de hígado, insuficiencia renal, diabetes mellitus, alcoholismo, enfermedad crónica, hospitalización, fatiga, estrés, exposición al frío, infección respiratoria previa, gripe, asma. También se puede incluir a adultos sanos, tales como los profesionales de la salud, reclutas militares, prisioneros u otros, incluyendo asistentes a escuelas o viajantes que deseen garantizarse una cobertura completa de la vacuna.

Description

Vacuna que comprende un antígeno de Streptococcus pneumoniae adyuvado por un oligonucleótido CpG.
La presente invención se refiere a nuevas formulaciones de vacunas, y a procedimientos para su producción y su uso en medicina.
Se conocen los oligonucleótidos inmunomoduladores que contienen dinucleótidos CpG no metilados ("CpG") (WO 96/02555, EP 468520). CpG es la abreviatura para los motivos de dinucleótidos de citosina-guanosina presentes en el ADN. Históricamente, se observó que la fracción de ADN de la vacuna BCG podía ejercer un efecto antitumoral. En otros estudios, los oligonucleótidos sintéticos derivados de secuencias génicas de la BCG demostraron ser capaces de inducir efectos inmunomoduladores (tanto in vitro como in vivo). Los autores de estos estudios concluyeron que determinadas secuencias palindrómicas, incluyendo un motivo central de CG, transportaban esta actividad (Tokunaga, T. et al., Microbial. Immunol. 36: 55 (1992)). El papel central del motivo CG en la inmunoestimulación fue dilucidado más tarde en una publicación de Krieg (Nature, 374 p. 546, 1995). Chu et al.,(J. Exp. Med., 1997, 186: 1623-1631) revelaron que los oligonucleótidos CpG pueden actuar como adyuvantes Th1. El documento EP855184 revela más secuencias CpG para ser usadas en composiciones farmacéuticas. El documento WO 98/37919 revela el uso de secuencias CpG en el tratamiento de trastornos asociados con los LPS. El análisis detallado ha demostrado que el motivo CG tiene secuencias que son comunes en el ADN bacteriano, pero poco comunes en el ADN de los vertebrados.
Actualmente se cree que esta diferencia evolutiva permite al sistema inmune de los vertebrados detectar la presencia de ADN bacteriano (como ocurre durante una infección) conduciendo, por consiguiente, a la estimulación del sistema inmune. Se ha demostrado la actividad inmunoestimuladora para secuencias tan pequeñas como las formadas por 15 bases de nucleótido (Krieg, et al., Nature 374: 546 (1995)), y en las que el motivo CpG tiene que estar sin metilar. Se ha postulado que el oligo debería tener una configuración de hexámero: purina purina CG pirimidina pirimidina, pero esto no es obligatorio.
La Streptococcus pneumoniae es una bacteria gram positiva que es patogénica para los humanos, causando enfermedades invasoras tales como la neumonía, la bacteremia y la meningitis, y enfermedades asociadas con la colonización, tales como la otitis media aguda. Los mecanismos mediante los cuales los neumococos se extienden por los pulmones, el fluido cerebroespinal y la sangre son poco conocidos. El crecimiento de la bacteria que alcanza los alvéolos pulmonares normales es inhibido por su sequedad relativa y por la actividad fagocítica de los macrófagos alveolares. Cualquier trastorno anatómico o fisiológico de estas defensas coordinadas tiende a aumentar la susceptibilidad de los pulmones a ser infectados. La pared celular de la Streptococcus pneumoniae desempeña un papel importante en la generación de una respuesta inflamatoria en los alvéolos pulmonares (Gillespie et al., I&I 65: 3936). La liberación de los componentes de la pared celular tiene lugar al final del ciclo de crecimiento neumocócico mediante autolisis debido a la síntesis de la proteína N-acetil muramoil-L-alanina amidasa (lytA). El ADN también será liberado en la zona infectada al realizarse la autolisis de los neumococos.
Para que el organismo tenga una respuesta inmune eficaz contra las bacterias invasoras, debe tener mecanismos para coordinar el tipo de respuesta inmune que, con mayor probabilidad, detendrá la infección. Para los patógenos intracelulares, la coordinación parece ocurrir entre la célula mediada o las respuestas inmunes humorales, y éstas son controladas por las células T del tipo Th1 y Th2. Sin embargo, las bacterias extracelulares emplean frecuentemente un polisacárido bien en la forma de cápsula o un lipopolisacárido para protegerse ellas mismas de los efectos del complemento de suero que puede lisar las bacterias, o volverlas accesibles a fagocitos tales como macrófagos y neutrófilos.
En este caso, la respuesta inmune sigue otra trayectoria, la respuesta inmune T-independiente. La respuesta inmune T-independiente puede dividirse en la respuesta de tipo 1 y tipo 2. Los antígenos T-independientes de tipo 2 poseen las características expresadas por los antígenos polisacáridos, incluyendo: gran peso molecular, epitopes antigénicos repetidos, capacidad de activar la cascada de complementos, degradabilidad pobre in vivo e incapacidad por estimular la ayuda a células T-dependientes del complejo MHC tipo II (Mond et al., Annu. Rev. Immunol. 13: 655-92). Los antígenos de tipo 1, a diferencia de los polisacáridos, son mitogénicos para las células B, y están comprendidos por lipopolisacáridos (LPS). Los antígenos T-independientes de tipo 2 no pueden estimular las respuestas en ratones neonatales o ratones CBA/N que presentan inmunodeficiencia de las células B ligada a X (ratones xid), mientras que los antígenos de tipo 1 sí pueden.
Los antígenos de tipo 2 inducen a respuestas más débiles de los anticuerpos en comparación con antígenos T-dependientes tales como las proteínas. Las proteínas pueden activar las células B e inducir a la secreción de anticuerpos mediante su procesamiento en péptidos y su presentación sobre la superficie de la célula B en el contexto del MHC tipo II, permitiendo interactuar a la célula B con las células T y recibir señales adicionales requeridas para la proliferación y maduración máxima de las células B. No obstante, mientras que los oligosacáridos, en algunos casos, pueden asociarse con el complejo MHC tipo II (Ishioka et al., J. Immunol. 148: 2446-2451) y los polisacáridos lipidados parecen asociarse con el CD1 presente en los linfocitos, (Fairhurst, R. M., et al., Immunology Today 19: 257 (1998)), no existe un mecanismo conocido de presentación para los antígenos de tipo 2 contra las células T.
Sin embargo, la naturaleza de repetición múltiple del antígeno polimérico polisacárido puede causar el entrecruzamiento de los receptores sobre la superficie de las células B, conduciendo a la activación de las células B mediante un mecanismo que no requiere células T. Por lo tanto, los polisacáridos son antígenos T-independientes, y se caracterizan en animales y bebés humanos por la producción de anticuerpos IgM y la falta de estimulación y de memoria inmunológica. Sólo los humanos adultos pueden producir cantidades significativas de anticuerpo IgG contra la mayoría (aunque no todos) los antígenos polisacáridos. La capacidad para cambiar el isotipo de anticuerpos a IgG coincide con la aparición del receptor de complemento tipo 2 (CR2) en las células B de bebés y niños entre 1,5 y 2 años de edad, y esto puede proporcionar la señal adicional requerida para la activación y la maduración de las células B.
En un aspecto de la presente invención, se proporciona la formulación de una vacuna que comprende una secuencia de oligonucleótidos CpG y un antígeno polisacárido del Streptococcus pneumoniae que es capaz de aumentar una respuesta inmune contra un antígeno T-independiente neumocócico.
La producción de anticuerpos IgG contra los polisacáridos capsulares de las bacterias es esencial porque los mecanismos principales de protección frente a estas bacterias, la lisis mediada por un complemento y la opsonofagocitosis, son más eficaces con este isotipo de anticuerpo (Maslanka et al., Clin. Diag. Lab. Immunol. 4: 156-67, y Romero-Steiner et al., Clin. Diag. Lab. Immunol. 4: 415-22).
Las vacunas basadas en antígenos polisacáridos son conocidas en la técnica, y cuatro de las que han sido autorizadas para uso humano incluyen el polisacárido Vi de Salmonella typhi, el polisacárido PRP de Haemophilus influenzae, la vacuna tetravalente contra meningococos compuesta por los serotipos A, C, W135 e Y, y la vacuna neumocócica 23-valente compuesta por los polisacáridos correspondientes a los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33.
Las tres últimas vacunas confieren protección frente a las bacterias causantes de infecciones respiratorias que resultan en morbosidad grave y mortalidad en bebés, aunque estas vacunas no han sido autorizadas para su uso en niños menores de dos años, porque son poco inmunogénicas en este grupo de edad. El documento EP497525 revela una vacuna neumocócica conjugada de polisacáridos adyuvada con alumbre.
Las vacunas de polisacáridos autorizadas anteriormente enumeradas han demostrado tener una eficacia clínica variable. Se ha estimado que la vacuna de polisacáridos Vi tiene una eficacia de entre el 55 y el 77% en la prevención de la fiebre tifoidea confirmada mediante cultivos (Plotkin y Cam, Arch. Intern. Med. 155: 2293-99). La vacuna de polisacáridos de meningococos C demostró tener una eficacia del 79% en condiciones epidémicas (De Wals P, et al., Bull World Health Organ. 74: 407-411). La vacuna neumocócica 23-valente ha demostrado una amplia variación en cuanto a su eficacia clínica, del 0 al 81% (Fedson et al., Arch. Intern. Med. 154: 2531-2535). La eficacia parece estar relacionada con el grupo de riesgo que esté siendo inmunizado, tal como el constituido por ancianos, pacientes con la enfermedad de Hodgkin, con esplenectomía, con anemia de células falciformes y con agammaglobulinémicos (Fine et al., Arch. Intern. Med. 154:2666-2677), así como con la manifestación de la enfermedad. La neumonía neumocócica y la otitis media son enfermedades que no han mostrado protección mediante la vacuna 23-valente. Está generalmente admitido que la eficacia protectora de la vacuna neumocócica está más o menos relacionada con la concentración de anticuerpos inducida por la vacunación; de hecho, los 23 polisacáridos sólo fueron autorizados ante la inmunogenicidad de cada componente polisacárido (Ed. Williams et al., New York Academy of Sciences 1995, pp. 241-249).
Para aumentar la respuesta de los anticuerpos contra los polisacáridos neumocócicos que comprenden la vacuna 23-valente, los presentes inventores intentaron mejorar la respuesta inmune añadiendo los inmunoestimuladores QS21 EP 362 279 y dQS21 WO 96/33739; sin embargo no fue posible medir ningún aumento en las respuestas de los anticuerpos contra los polisacáridos en monos Rhesus.
Threadgill et al., han informado recientemente en "Vaccine" 1998 Vol. 16(1) p. 76 que los oligonucleótidos CpG inmunoestimuladores inhiben la respuesta de los anticuerpos específica contra polisacáridos cuando el oligonucleótido es formulado con polisacárido de Pseudomonas aeruginosa.
Los presentes inventores han descubierto que, sorprendentemente, es posible adyuvar la respuesta inmune contra las vacunas neumocócicas de polisacáridos mediante la formulación con un oligonucleótido CpG inmunoestimulador, proporcionando tales formulaciones una respuesta inmune que produce niveles significativos de anticuerpos IgG.
Según la presente invención, se proporciona la composición de una vacuna que comprende un antígeno polisacárido neumocócico adyuvado por un oligonucleótido CpG inmunoestimulador.
El antígeno polisacárido puede estar o no conjugado a un vehículo proteico tal que proporcione epitopes T-ayudantes.
Los oligonucleótidos pueden ser ADN o ARN, pero preferiblemente contienen un motivo hexámero: purina purina CpG pirimidina pirimidina. Más preferiblemente, el enlace internucleotídico es modificado para aumentar la estabilidad del oligonucleótido. Las modificaciones preferidas son los enlaces de fosforotioato. La proteína lytA que participa en la degradación catalítica de la pared celular de los neumococos es producida en el momento de la autolisis, y forma parte del operón inducido por competencia (Mol. Microbiol. 29:1125 (1998)). Por definición, el ARNm que codifica la lytA estará presente en grandes cantidades durante la síntesis de la proteína lytA. Además, la proteína lytA contiene una región de unión a la fosforil colina que contiene secuencias repetidas de ADN (Yother y Briles J., Bacteriol. 174: 601 (1992), y que puede ser encontrada en muchas otras proteínas de unión a la colina presentes en los estreptococos. Las siguientes secuencias CpG fueron identificadas desde las regiones de unión a la fosforil colina de la lytA, y desde la proteína A de unión a la colina (cbpA) (Rosenow et al., Mol. Microbiol. 25: 819-829 (1997)).
OLIGO 1: GCTACTGGTACG TACATTC AGACGGC TCTT (LlytA)
OLIGO 2: ACTATCTAAACGCTAATGGTGCTATGGCGACAGGATGGCT (cbpA)
y pueden ser utilizadas en la presente invención.
Las siguientes secuencias inmunoestimuladoras de oligonucleótidos también pueden ser usadas como ejemplos comparativos:
OLIGO 3: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT
OLIGO 4: TCT CCC AGC GTG CGC CAT
Las secuencias CpG y flanqueadoras han sido subrayadas, y hay motivos ACGT, ACG y GCG conservados. Las secuencias derivadas de las regiones de unión a la colina de las proteínas neumocócicas tienen dos motivos CpG que repitieron 10 ó 15 bases de nucleótidos por separado, y tiene lugar un motivo basado en esta distancia entre bases de nucleótidos entre dos CpG tres veces y cinco veces respectivamente en las proteínas lytA y CbpA. Sin embargo, las secuencias publicadas tienen dos motivos CpG que son siete o dos bases de nucleótidos separadas.
En una realización, al combinarse con la vacuna de polisacáridos 23-valente comercialmente disponible (Pnuemo-
vax®, Pasteur Merieux), la adyuvación con CpG aumentó significativamente la respuesta inmune (anticuerpo IgG) especialmente contra los polisacáridos de tipo 19F y 14 al ser administrada intramuscularmente.
Por lo tanto, en una realización de la presente invención, es posible aumentar ventajosamente la eficacia de una vacuna neumocócica comercialmente disponible. Esto es particularmente importante en poblaciones de alto riesgo, especialmente en aquéllas que tienen respuestas de anticuerpos contra polisacáridos sub-óptimas. Tales poblaciones pueden incluir, pero no se limitan a, ancianos, pacientes que padecen una de las siguientes enfermedades: esplenectomía, asplenia congénita, hiposplenia, anemia de las células falciformes, neutropenia cíclica, neutropenia inducida por fármacos, anemia aplástica, agammaglobulinemia congénita, hipogammaglobulinemia, deficiencia selectiva de subtipo IgG, mieloma múltiple, leucemia linfocítica crónica, linfoma, infección por VIH, condiciones multifactoriales tales como tratamiento glucocorticoide, malnutrición, cirrosis de hígado, insuficiencia renal, diabetes mellitus, alcoholismo, enfermedad crónica, hospitalización, fatiga, estrés, exposición al frío, infección respiratoria previa, gripe, asma. También se puede incluir a adultos sanos, tales como los profesionales de la salud, reclutas militares, prisioneros u otros, incluyendo asistentes a escuelas o viajantes que deseen garantizarse una cobertura completa de
la vacuna.
En una aplicación preferida, se usa el adyuvante CpG para aumentar la respuesta contra la vacuna de polisacáridos cuando se usa como refuerzo en niños entre 6 y 24 meses de edad que han recibido su primera inmunización con un conjugado polisacárido-proteína neumocócico polivalente. Tales vacunas utilizadas para una inmunización primaria también pueden ser ventajosamente adyuvadas con un oligonucleótido CpG. Por consiguiente, en una realización, se proporciona un procedimiento de inmunización de un paciente que comprende administrar una cantidad eficaz de una vacuna según la invención.
En una segunda realización, se proporciona un procedimiento de refuerzo de la respuesta inmune en un sujeto que ha sido previamente cebado contra un antígeno mediante la administración de un antígeno T-independiente neumocócico con un oligonucleótido CpG inmunoestimulador.
Otras vacunas basadas en antígenos T-independientes incluyen, pero no se limitan a, la vacuna de polisacárido Vi contra Salmonella typhi, la vacuna tetravalente de polisacáridos de meningococos (que comprende los tipos A, C, W135 e Y), el polisacárido y los polisacáridos modificados de los meningococos del grupo B, polisacáridos de Staphylococcus aureus, polisacáridos de Streptococcus agalactae, polisacáridos de micobacterias, p.ej., Mycobacterium tuberculosis, tales como mannofosfoinisitidas trehalosas, ácido micólico, arabinomananos cubiertos con manosa, la cápsula de los mismos y arabinogalactanos, polisacárido de Cryptococcus neoformans, los lipopolisacáridos del Haemophilus influenzae no clasificable, los lipopolisacáridos de Moraxella catharralis, los lipopolisacáridos de Shigella sonnei, el lipopeptidofosfoglicano (LPPG) de Trypanosoma cruzi, el cáncer asociado a los gangliósidos GD3, GD2, el tumor asociado a mucinas, especialmente, el antígeno T-F y el antígeno sialil T-F, y el polisacárido asociado al VIH que está estructuralmente relacionado con el antígeno T-F. Otros antígenos T-independientes pueden derivar de: Salmonella, Vibrio cholera, Escherichia, Chlamydia y antígenos T-independientes de Plasmodium.
La preparación de la vacuna se describe de forma general en Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 6 "Vaccine Design - the subunit and adjuvant approach", editado por Powell y Newman, Plenum Press, 1995. La Encapsulación en liposomas es descrita, por ejemplo, por Fullerton, en la patente estadounidense 4.235.877. La conjugación de proteínas a macromoléculas es revelada, por ejemplo, por Likhite, en la patente estadounidense 4.372.945 y por Armor et al., en la patente estadounidense 4.474.757.
La cantidad de proteína de cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induzca a una respuesta inmunoprotectora sin causar efectos secundarios negativos significativos en las vacunas típicas. Tal cantidad variará en función del inmunogen específico que se emplee, y cómo se presente. Generalmente, se espera que cada dosis comprenda 0,1-1.000 \mug de polisacárido o de conjugado de polisacárido-proteína, preferiblemente, 2-100 \mug, y lo más preferible, 4-40 \mug. Se puede determinar la cantidad óptima para una determinada vacuna mediante estudios estándar que impliquen la observación de las respuestas inmunes apropiadas en los sujetos. Tras una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo adecuadamente espaciadas.
Los oligonucleótidos utilizados en la presente invención son normalmente desoxinucleótidos. En una realización preferida, el enlace internucleotídico del oligonucleótido es fosforoditioato, o más preferiblemente, un enlace fosforotioato, aunque los fosfodiésteres también pertenecen al alcance de la presente invención. Se pueden usar otros enlaces internucleotídicos que estabilicen el oligonucleótido.
Los oligonucleótidos CpG utilizados en la presente invención pueden ser sintetizados mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica (p.ej, EP 468 520). Convenientemente, tales oligonucleótidos pueden ser sintetizados utilizando un sintetizador automático. En los documentos US 5.66.153; US 5.278.302 y WO 95/26204, se describen procedimientos para producir oligonucleótidos de fosforotioato o fosforoditioato.
Ejemplo 1 Adyuvación con CpG del polisacárido neumocócico 23-valente en ratones
La protección contra la infección neumocócica es mediada por la acción del anticuerpo IgG contra el polisacárido capsular, junto con la deposición del complemento que vuelve a las bacterias susceptible de ser matadas por neutrófilos mediante opsonofagocitosis. Por lo tanto, la eficacia protectora de la vacuna sólo puede ser estimada en base a la inducción de los anticuerpos IgG. Se inmunizaron una vez varios grupos de 10 ratones con una vacuna comercial 23-valente de polisacáridos neumocócicos a 1/10, 1/50 ó 1/250 de las dosis empleadas en humanos (57,7; 11,5 y 2,3 \mug de polisacárido total respectivamente), que fue adyuvada con CpG (50 \mug de oligo 1), CpG+ alumbre. Tras la inmunización, se midieron las concentraciones de IgG en suero contra polisacáridos de los cuatro serotipos más importantes (6B, 14, 19F y 23F) mediante ensayos ELISA cada 7 días durante 4 semanas.
Materiales y procedimientos
Se inmunizaron los siguientes grupos (10 ratones balb/c por grupo):
23 valente a 2,3; 11,5 y 57,5 \mug/dosis (dosis humana de 1/250, 1/50 y 1/10).
23 valente + CpG (50 \mug) en el mismo intervalo posológico.
23 valente + CpG + Al(OH)_{3} en el mismo intervalo posológico.
Componentes usados
Componente Lote Concentración \mug/ml Tampón
23 valente de Pasteur Mérieux 95K03-HC56630 1.150 Salino
(Pnemovax® 23)
CpG Oligo 3 5.000 H_{2}O
Al(OH)_{3} 96A0089 10.380 H_{2}O
Procedimiento de formulación
Se diluyó la vacuna Pneumovax en H_{2}O, 10 mM de PO_{4} 10 veces concentrado y 150 mM de NaCl a pH 6,8 para obtener 2,3; 11,5 ó 57,7 \mug de antígeno por dosis. Se añadió el CpG durante 30 min, y para los grupos que contenían Al(OH)_{3},las formulaciones fueron adsorbidas durante 30 min sobre Al(OH)_{3} (50 \mug). Se añadió Tiomersal (50 \mug/ml) como conservante.
Ensayo ELISA
Había 10 animales por grupo, pero como las sangrías fueron realizadas todas las semanas, sólo se sangraban
5 animales a la semana. El ensayo ELISA y la opsonofagocitosis fueron realizados en una mezcla de suero.
El ensayo ELISA se realizó para medir el IgG murino usando el protocolo del taller de la OMS sobre el procedimiento ELISA para la cuantificación del anticuerpo IgG contra los polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae en suero humano. En esencia, el polisacárido capsular purificado es cubierto directamente sobre la placa de microvaloración. Se preincuban muestras de suero con polisacárido de pared celular común a todos los neumococos y que está presente en un 0,5% ca. en los polisacáridos neumocócicos purificados según la revelación (EP72513 B1). Se emplearon reactivos de los laboratorios Jackson ImmunoLaboratories Inc. para detectar el IgG murino unido. Las curvas de valoración fueron referenciadas con respecto a estándares internos (anticuerpos monoclonales) modelados por la ecuación logarítmica logística. Los cálculos fueron realizados usando el programa SoftMax Pro®. Se esperaba que el error absoluto máximo de estos resultados estaría en un factor de 2. El error relativo fue
menor del 30%.
Resultados
Se encontraron anticuerpos del isotipo IgG contra los serotipos 14 y 19G, pero no contra los serotipos 6B y 23F, y en la figura 1, se presentan los resultados para el serotipo 14. La respuesta dependió de la dosis, con 1/10 de dosis humana ofreciendo la respuesta más alta, lo que indicó que la respuesta a IgG era específica del polisacárido. Esto es poco habitual, pues los ratones normalmente sólo producen IgM contra los polisacáridos neumocócicos. La respuesta máxima se produjo a los 14 días de haberse realizado la inmunización, lo que no es poco habitual, pues los antígenos T-independientes no inducen a la memoria.
Se llevaron a cabo análisis individuales adicionales para determinar la varianza y la relevancia estadística (no se muestran los datos). La respuesta a 1/10 de dosis humana de la 23-valente sufrió un aumento (estadísticamente) significativo cuando se adyuvó sólo con CpG (para el tipo 19, CMG de 0,8 comparada con 3,7 \mug/ml p = 0,07; para el tipo 14, CMG de 0,19 comparada con 3,4 \mug/ml, p = 0,001). Esto también se cumplió para 1/50 y 1/250 de dosis humana cuando se midieron frente al tipo 14. Además, las respuestas aumentaron significativamente contra el tipo 14 cuando se adyuvó con CpG + alumbre.
La respuesta más elevada fue inducida cuando la vacuna fue adyuvada sólo con CpG.
Ejemplo 2 Efecto de la adyuvación con CpG sobre la inmunogenicidad de los conjugados PS-PD neumocócicos tetravalentes en el modelo de ratas neonatales
Se seleccionó el modelo de ratas neonatales porque los datos publicados mostraron que la inmunogenicidad relativa de 4 conjugados neumocócicos de proteína y polisacárido en bebés humanos fue más similar a la de las ratas que a la de los ratones. Es decir, 6B<23F<14<19F para ratas neonatales. Las ratas neonatales fueron seleccionadas porque su sistema inmune puede tener una inmadurez del desarrollo similar a la encontrada en los bebés humanos.
Las ratas neonatales fueron inmunizadas con lotes de calidad clínica de conjugados neumocócicos tetravalentes de polisacárido-PD^{(a)} en un intervalo posológico de 5 veces y con los adyuvantes CpG y AlPO4+CpG. Se usó oligo 1 a una dosis de 100 \mug. Los animales fueron inmunizados por primera vez a los 7 días de vida, y recibieron inmunizaciones posteriores 14 y 28 días después. Se realizó un serología de las muestras desde el día 42 (14 días después de la III) y 56 (28 días después de la III).
El mejor adyuvante fue el CpG solo: aumentó la media geométrica de las concentraciones de IgG y los valores opsónicos contra 6B, 23F y 19F, mientras que los valores para el serotipo 14 fueron comparables con el resto de las preparaciones adyuvadas. La formulación realizada solo con CpG también fue capaz de aumentar significativamente las velocidades de seroconversión contra el serotipo 6B-PD.
Materiales y procedimientos Grupos de vacunación
El lote de vacuna DSP0401x contiene los lotes de calidad clínica PS-PD tetravalentes D6BPJ208 + D14PDJ202 + D19PJ206 + D23PDJ212 . El ESPL001 contiene los lotes PS-LPD tetravalentes E6BL040P + E14L66P + E19FL033P + E23FL21P.
\vskip1.000000\baselineskip
Grupo Lote de vacuna Adyuvante Dosis (\mug por cada PS)
1 Ninguno CpG —
2 DSP0401x Ninguno 0,1
3 DSP0401x Ninguno 0,5
(Continuación)
Grupo Lote de vacuna Adyuvante Dosis (\mug por cada PS)
4 DSP0401x AlPO_{4} 0,1
5 DSP0401x AlPO_{4} 0,5
6 DSP0401x AlPO_{4} 2,5
7 ESPL001 AlPO_{4} 0,1
8 ESPL001 AlPO_{4} 0,5
9 ESPL001 AlPO_{4} 1,25
10 DSP0401x CpG 0,1
11 DSP0401x CpG 0,5
12 DSP0401x CpG/AlPO_{4} 0,1
13 DSP0401x CpG/AlPO_{4} 0,5 
\vskip1.000000\baselineskip
Componentes usados 
\vskip1.000000\baselineskip
Componente Lote Concentración \mug/ml Tampón
Conjugado PD6B D6BPDJ208 206 NaCl 0,2M pH 6,5
Conjugado PD14 D14PDJ202 186 NaCl 0,2M pH 6,5
Conjugado PD19 D19PDJ206 175 NaCl 0,2M pH 6,5
Conjugado PD23 D23PDJ212 158 NaCl 0,2M pH 6,5
Monovalente PD6B D6BPDD208 100 NaCl 150 mM pH 6,1
Monovalente PD14 D14PDD202 100 NaCl 150 mM pH 6,1
Monovalente PD19 D19PDD206 100 NaCl 150 mM pH 6,1
Monovalente PD23 D23PDD212 96 NaCl 150 mM pH 6,1
Monovalente LPD6B E6BL040P 50 NaCl 150 mM pH 6,1
Monovalente LPD14 E14FL66P 50 NaCl 150 mM p14 6,1
Monovalente LPD19 E19FL033P 50 NaCl 150 mM pH 6,1
Monovalente LPD23 E23FL21P 50 NaCl 150 mM pH 6,1
Tetravalente LPD ESPL001 5/valencia NaCl 150 mM pH 6,1
CpG Oligo 1, WD1001 5.000 H_{2}O
AlPO_{4} 97D0045 5.040 NaCl 150 mM pH 6,1 
\newpage
Procedimiento de formulación Tetravalentes no adsorbidos
Se diluyen los cuatro conjugados en H_{2}O y NaCl 150 mM 10 veces concentrado. Se añade fenoxietanol
(500 \mug/ml) como conservante.
Si se necesita CpG, se añade el oligonucleótido al tetravalente no adsorbido. El NaCl garantiza la isotonicidad y la dilución, en el caso de que sean necesarias.
Tetravalentes adsorbidos
Se diluyen los cuatro monovalentes adsorbidos concentrados en H_{2}O y NaCl 150 mM 10 veces concentrado, antes de la adición de AlPO_{4}. Se añade fenoxietanol (500 \mug/ml) como conservante.
Si se necesitan diluciones, se diluyen los tetravalentes en AlPO_{4} a 1 mg/ml. Estos diluyentes son preparados en NaCl 150 mM.
Si se necesita CpG, se añade el oligonucleótido al tetravalente adsorbido. La adición de NaCl 1.500 mM garantiza la isotonicidad, y si se requieren diluciones, se añaden diluyentes de AlPO_{4} a 1,3 ó 1,8 mg/ml en NaCl.
Todas las formulaciones son preparadas en viales de vidrio no siliconado.
Protocolo de inmunización
Las ratas neonatales fueron seleccionadas al azar de diferentes madres y tenían 7 días de edad cuando recibieron su primera inmunización. Recibieron inmunizaciones posteriores 14 y 28 días después. Se realizaron sangrías en los días 42 (14 días después de la III) y 56 (28 días después de la III). Todas las vacunas fueron inyectadas s.c., y había 10 ratas por grupo de vacunación.
Ensayo ELISA
El ensayo ELISA fue realizado para medir el IgG en ratas usando el protocolo derivado del taller de la OMS sobre "el procedimiento ELISA para la cuantificación de anticuerpos IgG contra los polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae en suero humano". En esencia, el polisacárido capsular purificado es cubierto directamente sobre la placa de microvaloración. Se preincuban muestras de suero con polisacárido de pared celular común a todos los neumococos y que está presente en un 0,5% ca. en los polisacáridos neumocócicos purificados. Se emplearon reactivos de los laboratorios Jackson ImmunoLaboratories Inc. para detectar el IgG unido de las ratas. Las curvas de valoración fueron referenciadas con respecto a la curva de valoración de un modelo referencial de suero mediante la ecuación logarítmica logística. Los cálculos fueron realizados usando el programa SoftMax Pro®. Los sueros estándar fueron calibrados usando un procedimiento de respuesta corolaria, y se demostró que los valores correspondían con las estimaciones de las concentraciones de IgG encontradas mediante inmunoprecipitación (Ref. 21).
Opsonofagocitosis
El análisis opsonofagocítico fue realizado según el protocolo CDC (opsonofagocitosis de Streptococcus pneumoniae usando células HL60 diferenciadas, versión 1.1). La modificación realizada incluyó el uso de cepas neumocócicas internas, y las células HL60 fagocíticas fueron reemplazadas por PMN humanos purificados. Se incluyeron sueros policlonales de rata como control positivo.
Resultados
La figura 2 muestra la media geométrica de las concentraciones de IgG obtenidas contra el serotipo 6B mediante las combinaciones tetravalentes descritas en el apartado de materiales y procedimientos. Por motivos de claridad, los ejes se dividen en adyuvante y dosis. Se obtuvieron resultados similares contra los serotipos 19F y 23F, pero el tipo 14 tuvo una respuesta más uniforme frente a todos los adyuvantes y a todas las dosis.
Se midió mediante opsonofagocitosis la actividad biológica de la mezcla de antisueros de cada grupo adyuvante y de cada dosis. La actividad opsónica relativa a la concentración de IgG ofrecerá una estimación de la actividad funcio-
nal de los antisueros. Los valores, mostrados en la tabla 1, demuestran que todos los adyuvantes inducen al anticuerpo, que tiene aproximadamente la misma capacidad de opsonizar neumococos. Así, el CpG ayuda a la inducción del anticuerpo específico y aumenta en el correlato de concentración de anticuerpo con aumentos en la eficacia protectora.
Conclusiones
\bullet
El AlPO_{4} (en comparación con la ausencia de adyuvante) aumenta significativamente la velocidad de seroconversión, la media geométrica de la concentración de IgG, la actividad opsónica y la memoria inmunológica contra el conjugado PS-PD tetravalente.
\bullet
La dosis de AlPO_{4} de 0,1 \mug es significativamente más inmunogénica que la dosis de 0,5 \mug para los conjugados PS-PD de serotipos 6B, 19F y 23F.
\bullet
Las concentraciones de IgG aumentan significativamente contra los serotipos 6B, 19F y 23F cuando la vacuna conjugada es adyuvada con CpG en comparación con la adyuvación con AlPO4. Esto queda confirmado por el aumento de las velocidades de seroconversión y el aumento de los valores opsonofa- gocíticos.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1 Actividad opsónica relativa (concentración de IgG requerida para matar un 50% de los neumococos) comparada en función del serotipo y del adyuvante
Vacuna Adyuvante Dosis Concentración de IgG requerida para Media por
matar el 50% adyuvante
\mug 6B 14 19F 23F
DSP0401x Ninguno 0,1 0,32 0,30 0,30 0,37 0,26\pm0,14
0,5 Nula 0,015 Nula Nula
DSP0401x AlPO_{4} 0,1 0,02 0,31 0,40 0,09 0,20\pm0,15
0,5 Nula 0,05 0,22 Nula
2,5 Nula 0,32 #VAL Nula
ESPL001 AlPO_{4} 0,1 0,08 0,46 Nula 0,22 0,35\pm0,27
0,5 0,11 0,71 0,75 0,08
1,25 0,10 0,55 0,66 0,20
DSP0401x CpG 0,1 0,42 0,15 Nula 0,20 0,24\pm0,10
0,5 0,21 0,30 Nula 0,17
DSP0401x CpG / AlPO_{4} 0,1 0,27 0,10 Nula 0,21 0,20\pm0,14
0,5 Nula 0,10 0,44 0,09
Media por serotipo 0,19\pm0,14 0,29\pm0,20 0,45\pm0,20 0,18\pm0,09 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3 Efecto de la adyuvación con CpG sobre la inmunogenicidad de los conjugados PS-PD neumocócicos 11-valentes en el modelo de ratas neonatales
El ejemplo 2 mostró que la adyuvación con CpG de las vacunas conjugadas resultó en aumentos del orden de 5 a 10 veces más que con los adyuvantes convencionales (aluminio). Para determinar si estos efectos dependían de la secuencia del oligo, la dosis o la formulación, se llevaron a cabo más experimentos.
Se seleccionó OLIGO 2 de CpG y se usó en una dosis más baja, que fue de 1 a 10 \mug. También fue adsorbido sobre Al(OH)_{3} y combinado con las vacunas conjugadas.
Además, como las características inmunológicas de cada polisacárido pueden ser diferentes, se analizaron 11 serotipos.
Materiales y procedimientos TABLA 2 Selección de los lotes PS-PD neumocócicos
Serotipo 1 3 4 5 6B 7F 9V 14 18C 19F 23F
Número de lote 017 040 218 024 209 019 222 204 221 207 213
Formulación
Para examinar el efecto de varios adyuvantes avanzados distintos, se mantuvo constante la dosis de conjugado a 0,1 \mug de cada polisacárido, y los adyuvantes AlPO_{4}, Al(OH)_{3} y CpG fueron formulados en diferentes dosis y combinaciones. En total, se analizaron 10 combinaciones distintas, incluyendo la exclusión total de adyuvante. Éstas se encuentran enumeradas numéricamente en la tabla 3 por referencia.
Preparación de los diluyentes
Se prepararon dos diluyentes en NaCl 150 mM/fenoxi
A:
AlPO_{4} a 1 mg/ml.
B:
CpG sobre Al(OH)_{3} a 200 y 1.000 \mug/ml respectivamente. Proporción en peso de CpG / Al(OH)_{3} = 1/5.
Preparación del undecavalente adsorbido
Se mezclaron los once monovalentes PS-PD adsorbidos y concentrados en una proporción correcta. Se añadió el complemento de AlPO_{4}. Cuando fue necesario, se añadió el CpG (CpG adsorbido sobre Al(OH)_{3}) o el diluyente.
Preparación del undecavalente no adsorbido
Se mezclaron los once conjugados PS-PD y se diluyeron en la proporción correcta en NaCl 150 mM pH 6,1, fenoxi. Cuando fue necesario, se añadió CpG bien como solución (no adsorbido) o como CpG adsorbido sobre Al(OH)_{3}.
Las formulaciones de todas las inyecciones fueron preparadas 18 días antes de la primera administración.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3 Tabla resumen de las formulaciones de los adyuvantes analizados con PS-PD neumocócico 11-valente en ratas neonatales
Grupo AlPO_{4} CpG Al(OH)_{3} Descripción
1 Ninguna
2 100 AlPO_{4}
3 1 CpG bajo
4 10 CpG alto
5 1 4,5 CpG ads. bajo
6 10 50 CpG ads. alto
7 100 1 CpG bajo conj. ads.
8 100 10 CpG alto conj. ads.
9 95 1 4,5 CpG y Conj. ads. bajo
10 50 10 50 CpG y Conj. ads. alto
Protocolo de inmunización
Se seleccionaron al azar ratas OFA neonatales de diferentes madres, que tenían 7 días de vida cuando recibieron su primera inmunización. Recibieron 2 inmunizaciones más 14 y 28 días después. Se realizó una sangría el día 56
(28 días después de la III). Todas las vacunas fueron inyectadas s.c., y había 10 ratas por grupo de vacunación.
Ensayo ELISA
El ensayo ELISA fue realizado como se describe en el ejemplo 2.
Opsonofagocitosis
El ensayo opsonofagocítico fue realizado según el protocolo CDC (opsonofagocitosis del Streptococcus pneumoniae usando células HL60 diferenciadas, versión 1.1). La modificación realizada incluyó el uso de cepas neumocócicas internas, y las células HL60 fagocíticas fueron reemplazadas por PMN humanos purificados. Además, se añadieron perlas de vidrio de 3 mm a los pozos de microvaloración para aumentar el mezclado, y esto permitió la reducción de la proporción entre fagocito y bacterias, que era recomendable que fuera de 400.
Resultados
Las tablas 4 a 7 de abajo muestran la media geométrica de la concentración de IgG, la velocidad de seroconversión y la media aritmética del valor opsonofagocítico determinado para los 4 serotipos de neumococos tras la inmunización con una vacuna conjugada de PS-Proteína D neumocócica 11- valente adyuvada con diferentes formulaciones de OLIGO 2 de CpG. En comparación con la vacuna sin adyuvante, los 10 \mug de CpG indujeron a concentraciones de IgG significativamente más elevadas para todos los serotipos. El CpG indujo a concentraciones de IgG significativamente superiores que las inducidas por el AlPO_{4} para los serotipos 1, 6B, 18C y 19F.
A modo de comparación, en las tablas, se incluyen los resultados del ejemplo 2, que usa OLIGO 1. No hay diferencias significativas en las respuestas de IgG inducidas por las dos secuencias OLIGO, cuando se usa OLIGO 2 a 10 \mug. Sin embargo, el OLIGO 2 a 1 \mug no muestra efectos inmunoestimuladores, lo que se demuestra porque las concentraciones de IgG inducido no son significativamente diferentes de las que carecen de CpG.
La adsorción del OLIGO 2 sobre Al(OH)_{3} reduce el efecto inmunoestimulador, y la inducción de los anticuerpos no es significativamente distinta a la obtenida cuando se utiliza AlPO_{4} como adyuvante.
TABLA 4 Concentración media geométrica de IgG, seroconversión y valor opsónico medio del día 28 posterior a la inmunización III de ratas neonatales con PS-PD 11-valente usando distintos adyuvantes (y comparación con la inmunización tetravalente, ejemplo 2) para el serotipo 6B
Grupo AlPO_{4} Oligo 1 Oligo 2 CMG Serocon- Valor* CMG Merocon- Valor*
(\mug) (\mug) (\mug) de IgG versión Opso. de IgG versión Opso.
(\mug/ml) de 6B de 6B (\mug/ml) de 6B de 6B
para 6B para 6B
Ejemplo 2 Ejemplo 3
1 0,047 2/10 12,5 0,004 1/10 <6,25
2 100 0,048 4/10 65 0,019 4/10 <6,25
3 1 0,003 1/10 <6,25
4 10 1,682 10/10 157
100 0,63 8/10 48
5 1 \mug 0,015 6/10 <6,25
sobre
Al(OH)_{3}
6 10 \mug 0,007 3/10 <6,25
sobre
Al(OH)_{3}
TABLA 4 (continuación)
Grupo AlPO_{4} Oligo 1 Oligo 2 CMG Serocon- Valor* CMG Merocon- Valor*
(\mug) (\mug) (\mug) de IgG versión Opso. de IgG versión Opso.
(\mug/ml) de 6B de 6B (\mug/ml) de 6B de 6B
para 6B para 6B
Ejemplo 2 Ejemplo 3
7 100 1 0,029 7710 <6,25
8 100 10 0,469 9/10 77
100 100 0,46 7/10 75
9 95 1 \mug 0,040 5/10 38
sobre
Al(OH)_{3}
10 50 10 \mug 0,022 7/10 <6,25
sobre
Al(OH)_{3}
TABLA 5 Concentración media geométrica de IgG, seroconversión y valor opsónico medio del día 28 posterior a la inmunización III de ratas neonatales con PS-PD 11-valente usando distintos adyuvantes (y comparación con la inmunización tetravalente, ejemplo 2) para el serotipo 14
Grupo AlPO_{4} Oligo 1 Oligo 2 CMG Serocon- Valor* CMG Merocon- Valor*
(\mug) (\mug) (\mug) de IgG versión Opso. de IgG versión Opso.
(\mug/ml) de 14 de 14 (\mug/ml) de 14 de 14
para 14 para 14
Ejemplo 2 Ejemplo 3
1 0,046 3/10 64 0,022 3/10 <6,25
2 100 0,99 10/10 88 0,237 8/10 27
3 1 0,035 4/10 <6,25
4 10 0,361 10/10 88
100 0,66 9/10 295
5 1 \mug 0,093 9/10 <6,25
sobre
Al(OH)_{3}
6 10 \mug 0,155 9/10 27
sobre
Al(OH)_{3}
7 100 1 0,134 7/10 <6,25
8 100 10 2,028 10/10 188
100 100 2,3 10/10 888
TABLA 5 (continuación)
Grupo AlPO_{4} Oligo 1 Oligo 2 CMG Serocon- Valor* CMG Merocon- Valor*
(\mug) (\mug) (\mug) de IgG versión Opso. de IgG versión Opso.
(\mug/ml) de 14 de 14 (\mug/ml) de 14 de 14
para 14 para 14
Ejemplo 2 Ejemplo 3
9 95 1 \mug 0,140 6/10 138
sobre
Al(OH)_{3}
10 50 10 \mug 0,196 10/10 <6,25
sobre
Al(OH)_{3}
TABLA 6 Concentración media geométrica de IgG, seroconversión y valor opsónico medio del día 28 posterior a la inmunización III de ratas neonatales con PS-PD 11-valente usando distintos adyuvantes (y comparación con la inmunización tetravalente, ejemplo 2) para el serotipo 19F
Grupo AlPO_{4} Oligo 1 Oligo 2 CMG Serocon- Valor* CMG Merocon- Valor*
(\mug) (\mug) (\mug) de IgG versión Opso. de IgG versión Opso.
(\mug/ml) de 19F de 19F (\mug/ml) de 19F de 19F
para 19F para 19F
Ejemplo 2 Ejemplo 3
1 0,04 2/10 64 0,021 2/10 <6,25
2 100 1,07 9/10 367 0,222 7/10 79
3 1 0,015 3/10 <6,25
4 10 4,287 10/10 415
100 12,0 10/10 >1.600
5 1 \mug 0,417 9/10 32
sobre
Al(OH)_{3}
6 10 \mug 1,612 9/10 94
sobre
Al(OH)_{3}
7 100 1 0,441 10/10 135
8 100 10 9,475 10/10 >1.600
100 100 11,0 10/10 >1.600
9 95 1 \mug 0,438 9/10 377
sobre
Al(OH)_{3}
10 50 10 \mug 0,258 7/10 165
sobre
Al(OH)_{3}
TABLA 7 Concentración media geométrica de IgG, seroconversión y valor opsónico medio del día 28 posterior a la inmunización III de ratas neonatales con PS-PD 11-valente usando distintos adyuvantes (y comparación con la inmunización tetravalente, ejemplo 2) para el serotipo 23F
Grupo AlPO_{4} Oligo 1 Oligo 2 CMG Serocon- Valor* CMG Merocon- Valor*
(\mug) (\mug) (\mug) de IgG versión Opso. de IgG versión Opso.
(\mug/ml) de 23F de 23F (\mug/ml) de 23F de 23F
para 23F para 23F
Ejemplo 2 Ejemplo 3
1 0,06 2/10 <6,25 0,152 3/10 <6,25
2 100 0,29 10/10 70 0,56 8/10 <6,25
3 1 0,114 4/10 <6,25
4 10 1,305 9/10 192
100 2,0 10/10 454
5 1 \mug 0,28 7/10 <6,25
sobre
Al(OH)_{3}
6 10 \mug 0,107 2/10 <6,25
sobre
Al(OH)_{3}
7 100 1 0,243 4/10 <6,25
8 100 10 1,545 9/10 862
100 100 1,1 10/10 265
9 95 1 \mug 0,255 3/10 44
sobre
Al(OH)_{3}
10 50 10 \mug 0,331 6/10 <6,25
sobre
Al(OH)_{3} 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5 Influencia del CpG sobre el refuerzo con polisacárido tras un cebado con vacunas de polisacárido-conjugado, y sobre un cebado con polisacárido
Los ejemplos anteriores han demostrado la capacidad del CpG para adyuvar la respuesta inmune contra antígenos T-independientes y contra antígenos T-independientes acoplados a un vehículo proteico. Queda por considerar si el CpG podría adyuvar una respuesta de memoria provocada por el refuerzo con un antígeno T-independiente tras el cebado con antígeno T-dependiente. Resultaba de gran interés determinar si el CpG podía actuar para inducir al cebado mediante un antígeno T-independiente.
Para determinar estos efectos, se cebaron los ratones bien con polisacárido neumocócico, polisacárido neumocócico adyuvado con CpG o polisacárido neumocócico conjugado con proteína D.
Protocolo de inmunización
Se inmunizaron ratones balb/c de seis a ocho semanas de vida subcutáneamente con las formulaciones de las vacunas descritas abajo. La dosis fue de 1 \mug por polisacárido tanto para las formulaciones conjugadas como para las no conjugadas. Se realizó una sangría de prueba 14 días después para medir la concentración de CpG. Tras 56 días, se realizó otra sangría de prueba, y luego se administró una vacunación de refuerzo, para realizar una sangría de prueba final 14 días después, es decir, 70 días después de la primera inmunización.
\vskip1.000000\baselineskip
Grupo Preparación Refuerzo
1 Salina Conjugado
2 PS PS
3 PS/Cp PS
4 PS Conjugado
5 PS/Cp Conjugado
6 Conjug PS
7 Conjug PS/CpG
8 Conjug Conjugado 
\vskip1.000000\baselineskip
Componentes usados 
\vskip1.000000\baselineskip
Componente Lote Conc. Tampón Adsorción Conc. PS tras Tampón tras
\mug/ml adsorción \mug/ml adsorción
PS6b 6b/24 2.000 NaCl
150 mM
PS14 14/19 2.000 NaCl
150 mM
PS19 19f/26b 2.000 NaCl
150 mM
PS23 23f/29 2.000 NaCl
150 mM
Conjugado D6BPDJ209 MBSP9801 100 NaCl 150 mM
PDPS6B pH 6,1/fenoxi
Conjugado D14PDJ204 MBSP9801 100 NaCl 150 mM
PDPS14 pH 6,1/fenoxi
Conjugado D19PDJ207 MBSP9801 100 NaCl 150 mM
PDPS19 pH 6,1/fenoxi
Conjugado D23PDJ213 MBSP9801 100 NaCl 150 mM
PDPS23 pH 6,1/fenoxi
CpG Oligo 1 5.000 H_{2}O
Diluyente St 97D0045 1.000 NaCl 150 mM
Pn AlPO_{4} pH 6,1/fenoxi 
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento de formulación
Preparación de los 4 monovalentes adsorbidos concentrados (conjugados PS-PD).
Los monovalentes adsorbidos concentrados fueron preparados según el procedimiento descrito anteriormente en el ejemplo 2.
Preparación del tetravalente (conjugados PS-PD)
Los cuatro monovalentes adsorbidos concentrados fueron mezclados en una proporción correcta (1 \mug de cada valencia/dosis) y diluidos en NaCl pH 6,1. Se añadió el complemento de AlPO4 (10 \mug/dosis) como diluyente a
1 mg/ml en NaCl 150 mM pH 6,1 que contenía 5 mg/ml de fenoxietanol.
Preparación del tetravalente no adsorbido no conjugado con o sin CpG (PS libre).
Se mezclaron los cuatro PS libres en una proporción correcta (1 \mug de cada valencia / dosis) y se diluyeron en NaCl pH 6,1. Cuando fue necesario, se añadió el CpG (100 \mug/dosis). Se añadieron cinco mg/ml de fenoxietanol como conservante.
Las formulaciones para ambas inyecciones fueron preparadas 6 días antes de la primera administración en viales de vidrio no siliconados.
Procedimiento de formulación
Preparación de los 4 monovalentes adsorbidos concentrados (conjugados PS-PD).
Los monovalentes adsorbidos concentrados fueron preparados según el procedimiento anteriormente descrito.
Preparación del tetravalente (conjugados PS-PD)
Los cuatro monovalentes adsorbidos concentrados fueron mezclados en una proporción correcta (1 \mug de cada valencia / dosis). Se añadió el complemento de AlPO_{4} (10 \mug/dosis) como diluyente a 1 mg/ml en NaCl 150 mM pH 6,1 que contenía 5 mg/ml de fenoxietanol.
Preparación del tetravalente no adsorbido no conjugado con o sin CpG (PS libre)
Se mezclaron los cuatro PS libres en una proporción correcta (1 \mug de cada valencia / dosis) y se diluyeron en NaCl pH 6,1. Cuando fue necesario, se añadió el CpG. Se añadieron cinco mg/ml de fenoxietanol como conservante.
Las formulaciones para ambas inyecciones fueron preparadas 6 días antes de la primera administración en viales de vidrio no siliconados.
Ensayo ELISA
El ensayo ELISA fue realizado como se describe en el ejemplo 1.
Resultados
Los resultados de este experimento son el cebado y el refuerzo. Los resultados del cebado concordaron con las observaciones previas (ejemplo 1) en cuanto al descubrimiento de un aumento en la seroconversión y de concentraciones más altas de IgG en ratones que fueron inmunizados con polisacárido adyuvado con CpG en comparación con el polisacárido simple. Según lo descubierto en el ejemplo 1, los aumentos en la concentración de IgG tipo 14 con adyuvación de CpG son estadísticamente significativos en comparación con el PS solo, y los aumentos relativos al tipo 19F se aproximan a ser significativos. Sin embargo, las concentraciones de IgG con adyuvación de CpG no fueron tan elevados como las observadas en el ejemplo 1. Para explicar esta diferencia, sólo se aplicaron dos diferencias en los experimentos, en la valencia de la vacuna (valencia 23 frente a valencia 4) y en la vía de inmunización (intramuscular frente a subcutánea). Ya que no se espera que la reducción de la valencia disminuya la inmunogenicidad, las pruebas indican que la vía de inmunización es importante para conseguir una adyuvación óptima con CpG de antígenos T-independientes. Esto concuerda con una publicación reciente que revela un intento fallido por usar una adyuvación con CpG de una vacuna de polisacáridos simples. La vía de inmunización empleada fue la interperitoneal (Threadgill et al., "Vaccine", 1998 Vol. 16(1) p. 76).
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(Tabla pasa a página siguiente)
\newpage
Seroconversión CMG
PS 14 2/20* 0,07
PS14/CpG 12/20*\delta 0,15
Conjugado 24/30\delta 1,04
PS19F 1/20\xi 0,08
PS19F CpG 4/20\xi\omega 0,10
Conjugado 22/30\omega 0,35
* p = 0,001 según la prueba de probabilidad exacta de Fisher
\delta p = 0,11 según la prueba de probabilidad exacta de Fisher
\xi p = 0,17 según la prueba de probabilidad exacta de Fisher
\omega p < 0,001 según la prueba de probabilidad exacta de Fisher
En la segunda parte de este experimento, los animales cebados bien con PS, PS/CpG o vacuna conjugada, recibieron un refuerzo de PS o PS/CpG o conjugado. Para normalizar los datos por motivos comparativos, se determinó el aumento de IgG 14 días después de haber administrado el refuerzo, contando el número de animales que mostraron un aumento de la concentración de anticuerpos como respondedores.
Cebado Refuerzo Aumento geométrico Respondedores positivos
PS PS 1,7* 5/10
PS/CpG PS 2,8* 6/10
Conjugado PS 0,78 \xi 1/10 \delta
Conjugado PS/CpG 1,7 \xi 6/10 \delta
Conjugado Conjugado 4,2 7/10
* p = 0,09 según el test t de Student
\xi p = 0,12 según el test t de Student
\delta p = 0,03 según la prueba de probabilidad exacta de Fisher
Explicación de los resultados
Este ejemplo confirma los resultados presentados en el ejemplo 1, pero ha revelado que el modo de inmunización puede ser importante para una inmunización óptima. En una ampliación del experimento de refuerzo y memoria, se demuestran dos características importantes de la adyuvación con CpG. La primera es que el cebado con PS adyuvado con CpG conduce a un aumento más elevado al reforzar con polisacárido, y que existe una tendencia hacia la relevancia estadística. Esto indicaría que el CpG fue capaz de inducir a una mejora en la memoria. La segunda característica es que el CpG puede adyuvar una respuesta de memoria inducida por polisacáridos en animales cebados con una vacuna conjugada.
Conclusiones
El CpG puede inducir a un cambio de isotipo en los anticuerpos de ratones contra polisacáridos no conjugados. La magnitud de la respuesta a IgG es mayor con CpG.

Claims (6)

1. Una composición de vacuna que comprende un oligonucleótido CpG inmunoestimulador y un antígeno polisacárido de Streptococcus pneumoniae.
2. Una composición de vacuna como la reivindicada en la reivindicación 1, en la que el polisacárido está conjugado con un vehículo proteico.
3. Una composición de vacuna como la reivindicada en la reivindicación 1 ó 2, en la que el oligonucleótido CpG inmunoestimulador tiene al menos un enlace internucleotídico, seleccionado entre fosfodiésteres, fosforoditioato y fosforotioato.
4. Una composición de vacuna como la reivindicada en cualquier reivindicación anterior, en la que el oligonucleótido CpG es:
TCT CCC AGC GTG CGC CAT
5. Una composición de vacuna como la reivindicada en cualquier reivindicación anterior para su uso en medicina.
6. Uso de la composición de vacuna como la reivindicada en cualquier reivindicación anterior en la elaboración de un medicamento para inducir una respuesta inmune contra un antígeno polisacárido de Streptococcus pneumoniae.
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