ES2275499T3 - Vacuna contra streptococcus pneumoniae. - Google Patents

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Craig A.J. Laferriere
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Abstract

Una composición inmunogénica que comprende al menos un antígeno polisacárido de Streptococcus pneumoniae mezclado con al menos un antígeno proteico de Streptococcus pneumoniae o un equivalente inmunológicamente funcional del mismo, y un adyuvante que es de preferencia un adyuvante inductor de una respuesta TH1 y que comprende al menos uno de los siguientes: Monofosforil lípido A o un derivado del mismo, un inmunoestimulante saponina, o un oligonucleótido CpG inmunoestimulante.

Description

Vacuna contra Streptococcus pneumoniae.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a vacunas antigénicas de polisacáridos bacterianos, su fabricación y el uso de tales polisacáridos en medicamentos.
En particular, la presente invención se refiere a vacunas que comprenden un antígeno polisacárido de Streptococcus pneumoniae mezclado con un antígeno proteico de Streptococcus pneumoniae y un adyuvante inductor de respuesta Th1.
Antecedentes de la invención
Streptococcus pneumoniae es una bacteria Gram-positiva responsable de una morbilidad y mortalidad considerables (particularmente en jóvenes y ancianos), que causa enfermedades invasivas tales como neumonía, bacteriemia y meningitis y enfermedades asociadas con colonización, tal como la otitis media aguda. Se estima que la tasa de neumonía neumocóccica en EEUU para personas con más de 60 años de edad es de 3 a 8 por cada 100.000. En el 20% de los casos lleva a bacteriemia y otras manifestaciones tal como meningitis, con una tasa de mortalidad cercana al 30% incluso con tratamiento antibiótico.
El neumococo está encapsulado con un polisacárido unido químicamente que le confiere especificidad de serotipo. Existen 90 serotipos conocidos de neumococo y la cápsula es el principal determinante de virulencia para los neumococos, ya que la cápsula no sólo protege la superficie interna de la bacteria del complemento, sino que es por sí misma muy poco inmunogénica. Los polisacáridos son antígenos T independientes y no pueden ser procesados o presentados en moléculas del CMH para interactuar con las células T. Pueden sin embargo, estimular el sistema inmune a través de un mecanismo alternativo que incluye el entrecruzamiento de receptores de superficie en células B.
Se ha demostrado en varios experimentos que la protección contra las enfermedades invasivas por neumococos está correlacionada más fuertemente con la especificidad de anticuerpo para la cápsula y la protección es específica de serotipo.
Las vacunas antigénicas basadas en polisacáridos son bien conocidas en la técnica. Cuatro de las que se autorizaron para uso en seres humanos incluyen el polisacárido Vi de Salmonella typhi, el polisacárido PRP de Haemophilus influenzae, la vacuna tetravalente para meningococo compuesta de serotipos A, C, W135 e Y, y la vacuna 23-Valente neumocóccica compuesta de los polisacáridos correspondientes a los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33 (que explican al menos el 90% de los aislamientos de neumococos en sangre).
Las tres últimas vacunas confieren protección contra bacterias que causan infecciones respiratorias que dan como resultado morbilidad y mortalidad graves en infantes, estas vacunas no fueron aún autorizadas para el uso en niños de menos de dos años de edad por que son inadecuadamente inmunogénicas en este grupo etario. [Peltola y col. (1984), N. Engl. J. Med. 310:1561-1566]. Streptococcus pneumoniae es la causa más común de enfermedad bacteriana invasiva y otitis media en infantes y niños de corta edad. Asimismo, los ancianos producen respuestas muy pobres a las vacunas neumocóccicas [Roghmann y col., (1987), J. Gerontol. 42:265-270], de allí la incidencia aumentada de neumonía bacteriana en esta población [Verghese y Berk, (1983) Medicine (Baltimore) 62:271-285].
Las estrategias, que han sido diseñadas para solucionar esta falta de inmunogenicidad en infantes, incluyen la unión del polisacárido a proteínas inmunogénicas grandes, que proveen ayuda a la célula T como espectadoras y que inducen memoria inmunológica contra el antígeno polisacárido con el que está conjugado. Actualmente se están evaluando las vacunas para neumococos de conjugados de glicoproteínas con respecto a la seguridad, inmunogenicidad y eficacia en diversos grupos etarios.
A) Vacunas de Polisacáridos de Neumococos
La vacuna para neumococos no conjugada 23-valente demostró una amplia variación en la eficacia clínica, desde 0% hasta 81% (Fedson y col. (1994) Arch Intern Med. 154: 2531-2535). La eficacia parece estar relacionada con el grupo de riesgo que se está inmunizando, tal como ancianos, enfermedad de Hodgkin, esplenectomía, enfermedad de células falciformes y agammaglobulinémicos (Fine y col. (1994) Arch Intern Med. 154:2666-2677), y también con la manifestación de la enfermedad. La vacuna 23-valente no demuestra protección contra la neumonía neumocóccica (en ciertos grupos de alto riesgo tal como los ancianos) y otitis media.
Existe por lo tanto una necesidad de composiciones de vacunas para neumococos mejoradas, particularmente unas que puedan ser más eficaces en la prevención o alivio de la enfermedad neumocóccica (particularmente neumonía) en los ancianos y niños de corta edad.
La presente invención provee tal vacuna mejorada.
B) Composiciones de Conjugado de Polisacárido Seleccionado de Neumococo + 3D-MPL
Se acepta generalmente que la eficacia protectora de la vacuna para neumococos no conjugada comercializada está más o menos relacionada con la concentración de anticuerpo inducida tras la vacunación; de hecho, los 23 polisacáridos fueron aceptados para aprobación solamente en base a la inmunogenicidad de cada componente polisacárido (Ed. Williams y col. New York Academy of Sciences 1995 págs. 241-249). Por consiguiente otra potenciación de las respuestas de anticuerpos contra los polisacáridos del neumococo podrían aumentar el porcentaje de infantes y ancianos con respuestas con niveles protectores de anticuerpo a la primer inyección de polisacárido o conjugado de polisacárido y podría reducir la dosificación y número de inyecciones necesarias para inducir una inmunidad protectora contra infecciones causadas por Streptococcus pneumoniae.
Desde principios del siglo 20, los investigadores experimentaron con una gran cantidad de compuestos que pueden agregarse a los antígenos para mejorar su inmunogenicidad en composiciones de vacunas [revisión por M. F. Powell & M. J. Newman, Plenum Press, NY, "Vaccine Design - the Subunit and Adjuvant Approach" (1995) Capítulo 7 "A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients"]. Muchos son muy eficaces, pero causan reacciones adversas locales y sistémicas significativas que impiden su uso en composiciones de vacunas para seres humanos. Los adyuvantes basados en aluminio (tales como alum, hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio), descritos por primera vez en 1926, siguen siendo los únicos adyuvantes inmunológicos usados en vacunas autorizadas para uso en seres humanos en los Estados Unidos.
Los adyuvantes basados en aluminio son ejemplos de la clase de adyuvante vehículo que trabaja a través del "efecto depósito" que induce. El antígeno se adsorbe en su superficie y cuando se inyecta la composición el adyuvante y el antígeno no se dispersan inmediatamente en el torrente sanguíneo - por el contrario la composición persiste en el medio local de la inyección y da como resultado una respuesta inmune más pronunciada. Tales adyuvantes vehículo tienen la ventaja adicional conocida de ser adecuados para estabilizar antígenos que son propensos de romperse, por ejemplo algunos antígenos polisacáridos.
3D-MPL es un ejemplo de un adyuvante no vehículo. Su nombre completo es monofosforil lípido A 3-O-desacilado (o monofosforil lípido A 3 De-O-acilado o 3-O-desacil-4' monofosforil lípido A) y se lo nombra como 3D-MPL para indicar que la posición 3 del extremo reductor de glucosamina está de-O-acilado. Para su preparación, ver el documento GB 2220211 A. Químicamente es una mezcla de monofosforil lípido A 3-desacilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas. Se fabricó originalmente a principios de la década de 1990 cuando el procedimiento para 3-O-desacilar el derivado 4'-monofosforil del lípido A (MPL) dio una molécula con toxicidad más atenuada sin cambio en la actividad inmunoestimulante.
Se ha usado el 3D-MPL como un adyuvante ya sea solo o, de preferencia, combinado con un adyuvante vehículo de tipo depósito tal como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio o emulsiones de aceite en agua. En tales composiciones, antígeno y 3D-MPL están contenidos en las mismas estructuras particuladas, permitiendo una administración más eficaz de señales antigénicas e inmunoestimulantes. Los estudios demostraron que 3D-MPL es capaz de potenciar más la inmunogenicidad de un antígeno adsorbido en alum [Thoelen y col. Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454-B1]. Tales combinaciones resultan también de preferencia en la técnica para antígenos propensos a la adsorción (por ejemplo, conjugados de polisacáridos bacterianos), donde la adsorción sobre alum tiende a estabilizar al antígeno. Los adyuvantes basados en aluminio precipitado son muy usados ya que son los únicos adyuvantes actualmente usados en vacunas autorizadas. De acuerdo con esto, las vacunas que contienen 3D-MPL en combinación con adyuvantes basados en aluminio son preferidos en la técnica debido a su facilidad de desarrollo y velocidad de introducción en el mercado.
Se ha evaluado el MPL (no 3-desacilado) como un adyuvante con diversos antígenos de vacuna monovalente de conjugado de polisacáridos. La coinyección de MPL en solución salina potenció la respuesta sérica de anticuerpos para cuatro conjugados de polisacáridos monovalentes: toxoide tetánico-PS 6B de neumococo, PS 12 de neumococo-toxoide diftérico y S. aureus tipo 5 y S. aureus tipo 8 conjugado con exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa [Schneerson y col. J. Immunology (1991) 147:2136-2140]. Las respuestas potenciadas resultaron ser específicas de antígeno. MPL en una emulsión de aceite en agua (un adyuvante de tipo vehículo) potenció consistentemente el efecto de MPL en solución salina debido a la presencia de MPL y antígeno en la misma estructura particulada y fue considerado como un sistema adyuvante de elección para administración óptima de otras vacunas de conjugados de polisacáridos.
Devi y col. [Infect. Immun. (11991) 59:3700-7] evaluaron el efecto adyuvante de MPL (no 3-desacilado) en solución salina en la respuesta de anticuerpos murinos para un conjugado TT de polisacárido capsular de Cryptococcus neoformans. Cuando se usó MPL conjuntamente con el conjugado sólo se produjo un aumento marginal en la respuesta específica de IgM e IgG para el PS; sin embargo MPL tuvo un efecto mucho mayor cuando se administró 2 días tras el conjugado. La practicidad de usar un esquema de inmunización que requiere una demora en la administración de MPL con respecto al antígeno, especialmente en infantes, es cuestionable. El efecto adyuvante de MPL con conjugados de polisacáridos y polisacáridos-proteínas parece ser dependiente de la composición. Una vez más, la incorporación de MPL en sistemas de administración de liberación lenta adecuados (por ejemplo usando un adyuvante vehículo) provee un efecto adyuvante de mayor duración y salva el problema del tiempo y administración demorada.
En resumen, el estado actual de la técnica mostró que, para antígenos polisacáridos particulares o conjugados de polisacáridos, donde se usa MPL o 3D-MPL como un adyuvante, se lo usa ventajosamente en conjunción con un adyuvante vehículo (por ejemplo los adyuvantes basados en aluminio) con el fin de maximizar su efecto inmunoestimulante.
Sorprendentemente, los autores de la presente invención hallaron que para ciertos conjugados de polisacáridos de neumococo, la inmunogenicidad de la composición de vacuna es significativamente mayor cuando el antígeno se formula con 3D-MPL solo más que con 3D-MPL en conjunción con un adyuvante vehículo (tal como un adyuvante basado en aluminio). Además, la mejora observada es independiente de la concentración de 3D-MPL usada y de si los conjugados particulares están en una composición monovalente o si están combinados para formar una composición polivalente.
C) Conjugados de Polisacárido Bacteriano-Proteína D
Como se mencionó anteriormente, las vacunas basadas en antígeno polisacárido son bien conocidas en la técnica. Las vacunas de polisacáridos autorizadas mencionadas anteriormente tienen diferente eficacia clínica demostrada. Se estimó que la vacuna de polisacárido Vi tiene una eficacia de entre 55% y 77% en la prevención de fiebre tifoidea confirmada por cultivo (Plotkin y Cam, (1995) Arch Intern Med 155: 2293-99). La vacuna de polisacáridos de meningococo C demostró tener una eficacia de 79% bajo condiciones epidémicas (De Wals P, y col. (1996) Bull World Health Organ. 74: 407-411). La vacuna de neumococos 23-valente mostró una amplia variación en la eficacia clínica, desde 0% hasta 81% (Fedson y col. (1994) Arch Intern Med. 154: 2531-2535). Como se mencionó anteriormente, se acepta que la eficacia protectora de la vacuna de neumococos está más o menos relacionada con la concentración de anticuerpo inducida tras la vacunación.
Entre los problemas asociados con el enfoque de polisacáridos para vacunación, está el hecho de que los polisacáridos son per se inmunógenos pobres. Las estrategias diseñadas para solucionar esta falta de inmunogenicidad incluyen la unión del polisacárido a vehículos proteicos grandes altamente inmunogénicos que proveen ayuda a las células T como espectadores.
Los ejemplos de estos vehículos altamente inmunogénicos que se usan comúnmente en la actualidad para la producción de inmunógenos polisacáridos incluyen el toxoide de Difteria (DT o el mutante CRM197), toxoide del Tetanos (TT), Hemocianina de lapa (KLH) y la proteína purificada derivada de Tuberculina (PPD).
Proteínas Asociadas con Vehículos Comúnmente Usados
Con cada uno de estos vehículos comúnmente usados están asociados una cantidad de problemas, incluso en la producción de conjugados de GMP y también en las características inmunológicas de los conjugados.
A pesar del uso común de estos vehículos y de su éxito en la inducción de respuestas de anticuerpos anti polisacáridos, están asociados con diversos problemas. Por ejemplo, se sabe que las respuestas inmunes específicas de antígeno pueden suprimirse (supresión de epitope) por la presencia de anticuerpos preexistentes dirigidos contra el vehículo, es el caso de la toxina del Tétanos (Di John y col.; (1989) Lancet, 2:1415-8). En la población en general, un porcentaje muy alto de personas tendrán inmunidad preexistente para DT y TT ya que las personas son vacunadas rutinariamente con estos antígenos. En el RU por ejemplo 95% de los niños reciben la vacuna DPT que comprende DT y TT. Otros autores describieron el problema de la supresión de epitope para vacunas de péptidos en modelos animales (Sad y col., Immunology, 1991; 74:223-227; Schutze y col., J. Immunol. 135: 4, 1985; 2319-2322).
Además, para vacunas que requieren estímulo regular, el uso de vehículos altamente inmunogénicos tales como TT o DT probablemente suprimen la respuesta de anticuerpos para polisacáridos tras varias inyecciones. Estas múltiples vacunaciones pueden también estar acompañadas por reacciones indeseables tal como hiperrespuesta de tipo retardada (HTR).
Se sabe que KLH es un inmunógeno potente y ha sido usado ya como vehículo para péptidos IgE en ensayos clínicos en seres humanos. Sin embargo, se han observado algunas reacciones adversas (reacciones de tipo HTR o sensibilización IgE) así como respuestas de anticuerpos contra anticuerpos.
La selección de una proteína vehículo, por consiguiente, para una vacuna basada en polisacáridos requerirá un equilibrio entre la necesidad de usar un vehículo que sirva en todos los pacientes (reconocimiento amplio del CMH), la inducción de altos niveles de respuesta de anticuerpos anti polisacáridos y baja respuesta de anticuerpos contra el vehículo.
Los vehículos previamente usados para vacunas basadas en polisacáridos, por lo tanto tienen muchas desventajas. Esto es particularmente así en vacunas de combinación, donde la supresión de epitope es especialmente problemática si se usa el mismo vehículo para diversos antígenos polisacáridos. En el documento WO 98/51339, se usaron múltiples vehículos en vacunas de combinación con el fin de intentar evitar este efecto.
La presente invención provee un vehículo nuevo para uso en la preparación de conjugados inmunogénicos basados en polisacáridos/polipéptidos, que no sufre las desventajas mencionadas anteriormente.
La presente invención provee una proteína D (EP 0 594 610 B1) de Haemophilus influenzae, o fragmentos de la misma, como un vehículo para composiciones inmunogénicas basadas en polisacáridos, incluyendo vacunas. El uso de este vehículo es particularmente ventajoso en vacunas de combinación.
Resumen de la invención A) Vacunas de Polisacáridos de Neumococos
La presente invención provee una composición de vacuna, que comprende al menos un antígeno polisacárido de Streptococcus pneumoniae (de preferencia conjugado) y un antígeno proteico de Streptococcus pneumoniae o un equivalente inmunológicamente funcional del mismo, opcionalmente con un adyuvante Th1 (un adyuvante que induce una respuesta inmune Th1). De preferencia están incluidos una proteína de neumococo y un adyuvante Th1. Las composiciones de la invención son particularmente adecuadas en el tratamiento de neumonía en ancianos.
Las vacunas de polisacáridos de neumococo (conjugados o no) pueden no ser capaces de proteger contra la neumonía en la población de ancianos para la que la incidencia de esta enfermedad es muy alta. El mecanismo clave de defensa contra el neumococo es la opsonofagocitosis (un acontecimiento humoral mediado por células B/neutrófilos causado por la producción de anticuerpos contra el polisacárido del neumococo, que termina con la fagocitosis de la bacteria), sin embargo parte de los mecanismos opsónicos involucrados están deteriorados en los ancianos, es decir la producción de superóxido por PMN (células polimorfonucleares), otras especies reactivas de oxígeno, movilización de PMN, apoptosis de PMN, deformabilidad de PMN. Las respuestas de anticuerpos pueden también estar deterioradas en los ancianos.
Contrariamente al dogma aceptado normalmente, los niveles normales de anticuerpos anti polisacárido capsular pueden no ser eficaces en la depuración completa de las bacterias, ya que los neumococos pueden invadir células huésped para evadir esta rama del sistema inmune.
Sorprendentemente, los autores de la presente invención hallaron que estimulando simultáneamente la rama mediada por células del sistema inmune (por ejemplo la inmunidad mediada por células T) además de la rama humoral del sistema inmune (mediada por células B), se obtiene como resultado un sinergismo capaz de potenciar la depuración de neumococos del huésped. Éste es un descubrimiento que ayudará a la prevención (o tratamiento) de la infección por neumococos en general, pero será particularmente importante para la prevención (o tratamiento) de neumonía en los ancianos donde las vacunas basadas en polisacáridos no muestran eficacia.
Los autores de la presente invención hallaron que ambos brazos del sistema inmune pueden sinergizar de esta manera si se administra un polisacárido de neumococo (de preferencia conjugado) con una proteína de neumococo (de preferencia una proteína expresada en la superficie del neumococo, o secretada o liberada, que puede procesarse y presentarse en el contexto del CMH clase II y clase I en la superficie de las células del mamífero infectado). Aunque una proteína de neumococo puede por sí misma provocar la inmunidad mediada por células, los autores de la invención hallaron también que la presencia de un adyuvante inductor de Th1 en la formulación de vacuna ayuda a este brazo del sistema inmune y sorprendentemente potencia además el sinergismo entre ambos brazos del sistema inmune.
B) Composiciones de Conjugado de Polisacáridos Seleccionados de Neumococo + 3D-MPL
Por lo tanto la presente invención también provee una composición antigénica que comprende uno o más conjugados de polisacáridos de neumococo con adyuvante 3D-MPL y sustancialmente desprovista de adyuvantes basados en aluminio, en la que al menos uno de los conjugados de polisacáridos de neumococo es significativamente más inmunogénico en composiciones que comprenden 3D-MPL en comparación con las composiciones que comprenden 3D-MPL en conjunción con un adyuvante basado en aluminio.
Las formas de realización de preferencia provistas son composiciones antigénicas que comprenden conjugados de uno o más de los siguientes polisacáridos capsulares de neumococo: serotipo 4, 6B, 18C, 19F y 23F. En tales composiciones, cada polisacárido es sorprendentemente más inmunogénico en composiciones que comprenden 3D-MPL solo en comparación con composiciones que comprenden 3D-MPL y un adyuvante basado en aluminio.
Por ello en una forma de realización de la invención se provee una composición antigénica que comprende el polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 4, 6B, 18C, 19F o 23F conjugado con una proteína inmunogénica y adyuvante 3D-MPL, en la que la composición está sustancialmente desprovista de adyuvantes basados en aluminio.
En una segunda forma de realización, la presente invención provee una combinación antigénica sustancialmente desprovista de adyuvantes basados en aluminio y que comprende adyuvante 3D-MPL y dos o más conjugados de polisacáridos de neumococo elegidos del grupo constituido por: serotipo 4; serotipo 6B; serotipo 18C; serotipo 19F; y serotipo 23F.
C) Conjugados de Polisacárido Bacteriano-Proteína D
Por lo tanto la presente invención provee un antígeno de conjugado de polisacáridos que comprende un antígeno polisacárido derivado de una bacteria patogénica conjugado con proteína D de Haemophilus influenzae o un fragmento de proteína D de la misma. Además, la invención provee composiciones de vacuna polivalentes donde uno o más de los antígenos polisacáridos están conjugados con proteína D.
Descripción de la invención A) Vacunas de Polisacáridos de Neumococo
La presente invención provee una vacuna mejorada particularmente para la prevención o alivio de la infección por neumococos de los ancianos (y/o infantes y niños pequeños).
En el contexto de la invención se considera a un paciente como anciano si tiene 55 años de edad o más, típicamente más de 60 años de edad y más generalmente más de 65 años de edad.
Por ello, en una forma de realización de la invención se provee una composición de vacuna, adecuada para uso en ancianos (y/o infantes y niños pequeños) que comprende al menos un antígeno polisacárido de Streptococcus pneumoniae y al menos un antígeno proteico de Streptococcus pneumoniae.
En una segunda forma de realización, que resulta de preferencia, la presente invención provee una vacuna (adecuada para la prevención de neumonía en ancianos) que comprende al menos un antígeno polisacárido de Streptococcus pneumoniae y al menos un antígeno proteico de Streptococcus pneumoniae y un adyuvante Th1.
Se prevé que tal vacuna también será útil en el tratamiento de la infección por neumococos (por ejemplo en otitis media) en otros grupos de alto riesgo de la población, tales como infantes y niños pequeños.
En una tercera forma de realización se provee una composición de vacuna que comprende un antígeno polisacárido de neumococo y un adyuvante Th1.
Antígenos Polisacáridos de Streptococcus pneumoniae de la Invención
Típicamente la vacuna de Streptococcus pneumoniae de la presente invención comprenderá antígenos polisacáridos (de preferencia conjugados), en la que los polisacáridos derivan de al menos cuatro serotipos de neumococo. De preferencia los cuatro serotipos incluyen 6B, 14, 19F y 23F. De más preferencia, en la composición están incluidos al menos 7 serotipos, por ejemplo aquellos derivados de los serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F. De más preferencia aún, en la composición están incluidos al menos 11 serotipos, por ejemplo la composición en una forma de realización incluye polisacáridos capsulares derivados de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F (de preferencia conjugados). En una forma de realización de preferencia de la invención están incluidos al menos 13 antígenos polisacáridos (de preferencia conjugados), aunque también están contemplados por la invención otros antígenos polisacáridos, por ejemplo 23 valentes (tales como los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F).
Para la vacunación en ancianos (por ejemplo para la prevención de neumonía) resulta ventajoso incluir los serotipos 8 y 12F (y de más preferencia 15 y 22 también) a la composición antigénica 11 valente descrita anteriormente para formar una vacuna 15 valente, mientras que para infantes y niños pequeños (donde la otitis media tiene más importancia) resulta ventajoso incluir los serotipos 6A y 19A para formar una vacuna 13 valente.
Para la prevención/alivio de neumonía en la población de ancianos (+ de 55 años de edad) y otitis media en infantes (hasta 18 meses de edad) y niños pequeños (típicamente de 18 meses a 5 años de edad), resulta una forma de realización de preferencia de la invención combinar un polisacárido multivalente de Streptococcus pneumoniae como se describió en este documento con una proteína de Streptococcus pneumoniae o un equivalente inmunológicamente funcional del mismo.
Proteínas de Neumococo de la Invención
Para los objetivos de esta invención, "equivalente inmunológicamente funcional" se define como un péptido o proteína que comprende al menos un epitope protector de las proteínas de la invención. Tales epitopes están característicamente expuestos en la superficie, altamente conservados y pueden provocar una respuesta bactericida de anticuerpos en un huésped o prevenir efectos tóxicos. De preferencia, el equivalente funcional tiene al menos 15 y de preferencia 30 o más aminoácidos contiguos de la proteína de la invención. De más preferencia, pueden usarse fragmentos, deleciones de la proteína, tales como variantes de deleción transmembrana de la misma (es decir, el uso de un dominio extracelular de las proteínas), fusiones, derivados sin toxicidad por tratamientos químicos o genéticos y similares, con la condición de que sean capaces de provocar sustancialmente la misma respuesta inmune que la proteína nativa.
Las proteínas de preferencia de la invención son aquellas proteínas neumocóccicas que están expuestas en la superficie exterior de los neumococos (capaces de ser reconocidas por el sistema inmune de un huésped durante al menos parte del ciclo de vida del neumococo), o son las proteínas que son secretadas o liberadas por el neumococo. De mayor preferencia, la proteína es una toxina, adhesina, transductor de señales de 2 componentes o lipoproteína de Streptococcus pneumoniae, o equivalentes inmunológicamente funcionales de las mismas.
Las proteínas de particular preferencia que deben incluirse en tal vacuna de combinación incluyen, pero no se limitan a: neumolisina (de preferencia sin toxicidad por tratamiento químico o mutación) [Mitchell y col. Nucleic Acids Res. 1990 Jul. 11; 18(13): 4010 "Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.", Mitchell y col. Biochim Biophys Acta 1989 Jan. 23; 1007(1): 67-72 "Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties.", WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton y col), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA y variantes de deleción transmembrana de la misma (Patente de EEUU Nº 5.804.193 Briles y col.); PspC y variantes de deleción transmembrana de la misma (Documento WO 97/09994 Briles y col); PsaA y variantes de deleción transmembrana de la misma (Berry & Paton, Infect Immun Diciembre 1996; 64(12):5255-62 "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae"); proteínas neumocóccicas de unión a y variantes de deleción transmembrana de la misma, CbpA y variantes de deleción transmembrana de la misma (Documentos WO 97/41151; WO 99/51266); Gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (Infect. Immun. 1996 64:3544); HSP70 (Documento WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato y col. FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14); proteína de tipo M, SB solicitud de Patente Nº EP 0837130; y adhesina 18627, SB Solicitud de Patente Nº EP 0834568.
Las proteínas usadas en la presente invención de preferencia se seleccionan del grupo constituido por neumolisina, PsaA, PspA, PspC, CbpA o una combinación de dos o más de tales proteínas. La presente invención también abarca equivalentes inmunológicamente funcionales de tales proteínas (como se definió anteriormente).
Dentro de la composición, la proteína puede ayudar a inducir una respuesta mediada por células T contra la enfermedad neumocóccica -particularmente necesaria para la protección contra neumonía- que coopera con la rama humoral del sistema inmune para inhibir la invasión por neumococos y estimular la opsonofagocitosis.
Otras ventajas de incluir el antígeno proteico es la presentación de otros antígenos para el proceso de opsonofagocitosis y la inhibición de la adhesión bacteriana (si se usa una adhesina) o la neutralización de toxina (si se usa una toxina).
Por lo tanto en una forma de realización de la invención se provee una vacuna de Streptococcus pneumoniae que comprende una vacuna de conjugados de polisacáridos de neumococo que comprende antígenos polisacáridos derivados de al menos cuatro serotipos, de preferencia al menos siete serotipos, de más preferencia al menos once serotipos, y al menos uno, pero de preferencia dos, proteínas de Streptococcus pneumoniae. De preferencia una de las proteínas es Neumolisina o PsaA o PspA o CbpA (de mayor preferencia neumolisina destoxificada). Una combinación de preferencia contiene al menos neumolisina o un derivado de la misma y PspA.
Como se mencionó anteriormente, un problema asociado con el enfoque de vacunación con polisacáridos es el hecho de que los polisacáridos son per se inmunógenos pobres. Para solucionar esto, los polisacáridos pueden conjugarse a vehículos proteicos, que proveen ayuda de células T como espectador. Resulta de preferencia, por lo tanto, que los polisacáridos usados en la invención estén unidos a tal vehículo proteico. Los ejemplos de tales vehículos que se usan comúnmente en la actualidad para la producción de inmunógenos polisacáridos incluyen los toxoides de Difteria y Tetanos (DT, DT CRM197 y TT respectivamente), Hemopcianina de lapa (KLH), OMPC de N. meningitidis, y el derivado proteico purificado de Tuberculina (PPD).
Un número de problemas están, sin embargo, asociados con cada uno de estos vehículos usados (ver sección "Problemas Asociados con Vehículos Comúnmente Usados" a continuación).
La presente invención provee en una forma de realización de preferencia un vehículo nuevo para uso en la preparación de construcciones de inmunógenos basadas en polisacáridos, que no sufre estas desventajas. El vehículo de preferencia para las composiciones inmunogénicas basadas en polisacáridos de neumococo (o vacunas) es la proteína D de Haemophilus influenzae (Documento EP 594610-B), o fragmentos de la misma. Los fragmentos adecuados para uso incluyen fragmentos que abarcan epitopes T-ayudantes. En particular un fragmento de proteína D de preferencia contendrá el 1/3 N-terminal de la proteína.
Otro vehículo de preferencia para el polisacárido de neumococo es la proteína de neumococo en sí misma (como se definió anteriormente en la sección Proteínas de Neumococo de la Invención'').
Las vacunas de la presente invención de preferencia tienen adyuvantes. Los adyuvantes de preferencia incluyen una sal de aluminio tal como gel de hidróxido de aluminio (alum) o fosfato de aluminio, pero puede también ser una sal de calcio, hierro o zinc, o puede ser una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares acilados, polisacáridos derivatizados catiónicamente o aniónicamente o polifosfacenos.
Resulta de preferencia que el adyuvante se seleccione para que sea un inductor preferencial de una respuesta de tipo Th1 para ayudar la ramo mediada por células de la respuesta inmune.
Adyuvantes TH1 de la Invención
Altos niveles de citoquinas de tipo Th1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células para un antígeno dado, mientras que altos niveles de citoquinas de tipo Th2 tienden a favorecer la inducción de respuestas humorales para el antígeno.
Es importante recordar que la distinción entre respuesta inmune de tipo Th1 y Th2 no es absoluta. En realidad un individuo tendrá una respuesta inmune que se describe como predominantemente Th1 o predominantemente Th2. Sin embargo, con frecuencia es conveniente considerar las familias de citoquinas en términos como los descritos en los clones de células T murinas CD4+ ve por Mosmann y Coffman (Mosmann, T. R. y Coffman, R. L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymfokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, págs. 145-173). Tradicionalmente, las respuestas de tipo Th1 están asociadas con la producción de las citoquinas INF-\gamma e IL-2 por linfocitos T. Otras citoquinas frecuentemente asociadas de manera directa con la inducción de respuestas inmunes de tipo Th1 no son producidas por células T, tales como IL-12. En contraste, las respuestas de tipo Th2 están asociadas con la secreción de Il-4, IL-5, IL-6, IL-10. Los sistemas adecuados de adyuvantes que promueven una respuesta predominantemente de tipo Th1 incluyen, Monofosforil lípido A o un derivado del mismo, particularmente monofosforil lípido A 3-de-O-acilado y una combinación de monofosforil lípido A, de preferencia monofosforil lípido A 3-de-O-acilado (3D-MPL) junto con una sal de
aluminio.
Un sistema mejorado incluye la combinación de un monofosforil lípido A y un derivado de saponina, particularmente la combinación de QS21 y 3D-MPL como se describe en el documento WO 94/00153, o una composición menos reactogénica donde el QS21 está templado con colesterol como se describe en el documento WO 96/33739.
En el documento WO 95/17210 se describe una formulación de adyuvante particularmente potente que incluye QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en, y es una formulación de preferencia.
De preferencia la vacuna además comprende una saponina, de más preferencia QS21. La formulación también comprende una emulsión de aceite en agua y tocoferol (documento WO 95/17210).
La presente invención también provee un procedimiento para producir una formulación de vacuna que comprende mezclar una proteína de la presente invención junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como 3D-MPL.
CpG no metilados conteniendo oligonucleótidos (documento WO 96/02555) son también inductores preferenciales de respuesta Th1 y son adecuados para uso en la presente invención.
Resultan particularmente de preferencia las composiciones de la invención que comprenden uno o más polisacáridos de neumococo conjugados, una o más proteínas de neumococo y un adyuvante Th1. La inducción de una respuesta mediada por células por medio de una proteína de neumococo (como se describió anteriormente) y la cooperación entre ambos brazos del sistema inmune puede alcanzarse usando un adyuvante Th-1, dando como resultado una vacuna particularmente eficaz contra enfermedades por neumococo en general, y de manera importante, contra la neumonía por neumococo en los ancianos.
En otro aspecto de la presente invención se provee un inmunógeno o vacuna como se describe en este documento para uso en medicina.
En otro aspecto más de la invención, se provee una composición que comprende un conjugado de polisacáridos de neumococo y un adyuvante Th1 (de preferencia 3D-MPL) que es capaz de seroconvertir o inducir una respuesta humoral de anticuerpos contra el antígeno polisacárido dentro de una población no respondedora.
Se sabe que 10-30% de la población es no respondedora a la inmunización con polisacáridos (no responden a más del 50% de los serotipos en una vacuna) (Konradsen y col., Scand. J. Immun 40:251 (1994); Rodriguez y col. JID, 173:1347 (1996)). Éste puede ser también el caso para vacunas de conjugados (Musher y col. Clin. Inf. Dis. 27:1487 (1998)). Esto puede ser particularmente serio para sectores de la población de alto riesgo (infantes, niños pequeños y ancianos).
Los autores de la presente invención hallaron que una combinación de un polisacárido conjugado de neumococo (que es propensa a dar una respuesta baja en una población en particular) con un adyuvante Th1 (ver "adyuvantes Th1 de la invención" a continuación) puede sorprendentemente solucionar esta falta de respuesta. De preferencia debería usarse 3D-MPL, y de más preferencia 3D-MPL desprovisto de adyuvante basado en aluminio (que provee una mejor respuesta aún). La presente invención provee por ello tales composiciones y además provee un procedimiento para tratar a no respondedores para los polisacáridos de neumococo administrando tales composiciones y aún además provee el uso de un adyuvante Th1 en la fabricación de un medicamento que comprende antígenos polisacáridos de neumococo conjugados, en el tratamiento contra (o protección de) la enfermedad por neumococos en individuos que son no respondedores para el antígeno polisacárido.
En una forma de realización se provee un procedimiento para prevenir o aliviar la neumonía en seres humanos ancianos que comprende administrar una cantidad segura y eficaz de una vacuna, como se describe en este documento, que comprende un antígeno polisacárido de Streptoccocus pneumoniae y un adyuvante Th1, o una proteína de neumococo (y de preferencia ambos), a dicho paciente anciano.
En otra forma de realización se provee un procedimiento para prevenir o aliviar la otitis media en infantes o niños pequeños, que comprende administrar una cantidad segura y eficaz de una vacuna que comprende un antígeno polisacárido de Streptoccocus pneumoniae y un antígeno proteico de Streptococcus pneumoniae o un adyuvante Th1 (y de preferencia ambos), a dicho infante o niño pequeño.
De preferencia, en los procedimientos de la invención descritos anteriormente el antígeno polisacárido está presente como un conjugado polisacárido-proteína.
Preparaciones de Vacunas de la Invención
Las preparaciones de vacunas de la presente invención pueden usarse para proteger o tratar a un mamífero susceptible de infección, por medio de la administración de dicha vacuna por vía sistémica o por vía mucosa. Estas administraciones pueden incluir la inyección por vía intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o por administración por vía mucosa a los tractos oral/alimentario, respiratorio, genitourinario. Resulta de preferencia la administración de vacunas por vía intranasal para el tratamiento de neumonía u otitis media (ya que puede prevenirse más eficazmente el transporte de neumococos a través de la nasofaringe, y así atenuar la infección en su etapa temprana).
La cantidad de antígeno conjugado en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin los efectos colaterales adversos significativos de las vacunas típicas. Tal cantidad variará dependiendo de qué inmunógeno específico se usa y cómo se presenta. Generalmente, se espera que cada dosis comprenderá 0,1-100 \mug de polisacárido, de preferencia 0,1-50 \mug, de preferencia 0,1-10 \mug, de los cuales 1 a 5 \mug es el intervalo de mayor preferencia.
El contenido de antígenos proteicos en la vacuna típicamente estará en el intervalo de 1-100 \mug, de preferencia 5-50 \mug, más típicamente en el intervalo de 5-25 \mug.
Pueden averiguarse las cantidades óptimas de componentes para una vacuna en particular por medio de estudios estándar que incluyen la observación de respuestas inmunes adecuadas en sujetos. Tras una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de estímulo adecuadamente espaciadas.
La preparación de vacunas está descrita en general en Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (ed. Powell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenum Press New York). El encapsulado dentro de liposomas está descrito por Fullerton, Patente de EEUU Nº 4,235,877.
B) Composiciones de Conjugado de Polisacárido Seleccionado de Neumococo + 3D-MPL
Para los fines de esta invención, la frase "conjugados de polisacáridos de neumococo de la invención" describe aquellos conjugados de polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae que son más inmunogénicos en composiciones que comprenden 3D-MPL en comparación con las composiciones que comprenden 3D-MPL en conjunción con un adyuvante basado en aluminio (por ejemplo, conjugados de serotipo 4; serotipo 6B; serotipo 18C; serotipo 19F; o serotipo 23F).
Para los fines de esta invención, la frase "sustancialmente desprovisto de adyuvantes basados en aluminio" describe una composición que no contiene suficiente adyuvante basado en aluminio (por ejemplo hidróxido de aluminio y, particularmente, fosfato de aluminio) para causar cualquier disminución en la inmunogenicidad de un conjugado de polisacáridos de neumococo de la invención en comparación con una composición equivalente que comprende 3D-MPL sin agregado de adyuvante basado en aluminio. De preferencia la composición antigénica debería contener un adyuvante constituido esencialmente por 3D-MPL. Las cantidades agregadas de adyuvante basado en aluminio por dosis deberían de preferencia ser menores que 50 \mug, de más preferencia menos que 30 \mug, de más preferencia aún menos que 10 \mug, y de mayor preferencia no hay adyuvante basado en aluminio agregado en las composiciones de la invención.
Para los fines de esta invención, la determinación de si un conjugado de polisacáridos de neumococo es significativamente más inmunogénico en composiciones que comprenden 3D-MPL en comparación con composiciones que comprenden 3D-MPL en conjunción con un adyuvante basado en aluminio, debería establecerse como se describe en el Ejemplo 2. Como una indicación de si una composición es significativamente más inmunogénica cuando comprende 3D-MPL solo, la relación de concentración de MGC (media geométrica de la concentración) de IgG (determinada como en el Ejemplo 2) entre composiciones que comprenden 3D-MPL solo versus una composición equivalente que comprende 3D-MPL en conjunción con un adyuvante de fosfato de aluminio debería ser más de 2, de preferencia más de 5, de más preferencia más de 7, de más preferencia aún más de 9 y de mayor preferencia más de 14.
Entre los problemas asociados con el enfoque de polisacáridos para vacunación, uno es el hecho de que los polisacáridos per se son inmunógenos pobres. Las estrategias, que se diseñaron para solucionar esta falta de inmunogenicidad, incluyen la unión (conjugación) del polisacárido a un vehículo proteico grande, que provee ayuda a células T como espectador. Resulta de preferencia que los polisacáridos de neumococo de la invención estén unidos a un vehículo proteico que provee ayuda a células T como espectador. Los ejemplos de tales vehículos que pueden usarse incluyen los toxoides de Difteria, mutante de Difteria y Tetanos (DT, CRM197 y TT respectivamente), Hemocianina de lapa (KLH), la proteína purificada derivada de Tuberculina (PPD), y OMPC de Neisseria meningitidis.
Con más preferencia se usa proteína D de Haemophilus influenzae (documento EP 0 594 610-B), o fragmentos de la misma (ver sección C), como el vehículo proteico inmunogénico para los polisacáridos de neumococo de la invención.
En una forma de realización la composición antigénica de la invención comprende polisacárido de neumococo de serotipo (PS) 4 conjugado con una proteína inmunogénica y formulada con adyuvante 3D-MPL, donde la composición está sustancialmente desprovista de adyuvante basado en aluminio. En otras formas de realización, la composición antigénica comprende PS 6B, 18C, 19F, o 23F, respectivamente, conjugado con una proteína inmunogénica y formulada con adyuvante 3D-MPL, donde la composición está sustancialmente desprovista de adyuvante basado en
aluminio.
En otra forma más de realización de la invención, se provee una composición antigénica de combinación que comprende dos o más conjugados de polisacáridos de neumococo del grupo PS 4, PS 6B, PS 18C, PS19F, y PS 23F formulada con adyuvante 3D-MPL, donde la composición está sustancialmente desprovista de adyuvante basado en aluminio y en la que la composición contiene también una proteína de neumococo.
La combinación con otros conjugados de polisacáridos de neumococo no provoca significativamente la inmunogenicidad de los conjugados de polisacáridos de neumococo de la invención (Ejemplo 3). En consecuencia, un aspecto de preferencia de la invención provee una composición de combinación antigénica que comprende uno o más conjugados de polisacáridos de neumococo de la invención en combinación con uno o más de otros conjugados de polisacáridos de neumococo, donde la composición está formulada con adyuvante 3D-MPL, pero está sustancialmente desprovista de adyuvante basado en aluminio.
En otras formas de realización de preferencia de la invención, se proveen composiciones de combinaciones antigénicas que contienen al menos uno y de preferencia 2, 3, 4 ó los 5 conjugados de polisacáridos de neumococo PS 4, 6B, 18C, 19F, o 23F y además cualquier combinación de otros conjugados de polisacáridos de neumococo, que están formulados con adyuvante 3D-MPL pero sustancialmente desprovistos de adyuvante basado en aluminio.
Típicamente la composición de combinación antigénica de Streptococcus pneumoniae de la presente invención comprenderá antígenos de conjugados de polisacáridos, en la que los polisacáridos derivan de al menos cuatro, siete, once, trece, quince o veintitrés serotipos (ver "Streptococcus pneumoniae Polysaccharide Antigens of the Invention" anteriormente para combinaciones de serotipos de preferencia dependiendo de la enfermedad a tratar).
Las composiciones antigénicas de la invención se usan de preferencia como composiciones de vacuna para prevenir (o tratar) infecciones por neumococos, particularmente en ancianos y en infantes y niños pequeños.
Otras formas de realización de la presente invención incluyen: la provisión de las composiciones antigénicas anteriores para uso en medicina; un procedimiento para inducir una respuesta inmune para un conjugado de polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae, que comprende las etapas de administrar una cantidad segura y eficaz de una de las composiciones antigénicas anteriores a un paciente; y el uso de una de las composiciones antigénicas anteriores en la fabricación de un medicamento para la prevención (o tratamiento) de la enfermedad por neumococos.
Para la prevención/alivio de neumonía en la población de ancianos (+ 55 años de edad) y otitis media en infantes (hasta 18 meses de edad) y niños pequeños (típicamente 18 meses a 5 años de edad), combinar un conjugado multivalente de polisacáridos de Streptococcus pneumoniae formulado como se describe en este documento con proteína de Streptococcus pneumoniae o un equivalente inmunológicamente funcional de la misma es otra forma de realización de preferencia de la invención. Ver la sección anterior "Proteínas de Neumococo de la Invención" para combinaciones proteínas/proteína de preferencia.
Las composiciones antigénicas de preferencia (y vacunas) descritas anteriormente en este documento se liofilizan hasta el momento de su uso, momento en el que se reconstituyen con diluyente. De más preferencia se liofilizan en presencia de 3D-MPL y se reconstituyen con solución salina.
Liofilizar las composiciones da como resultado una composición más estable (por ejemplo previene la ruptura de los antígenos polisacáridos). El procedimiento es también sorprendentemente responsable de un título de anticuerpos más alto aún contra los polisacáridos de neumococo. Esto demostró ser particularmente significativo para los conjugados PS 6B. Otro aspecto de la invención es una composición antigénica liofilizada que comprende un conjugado PS 6B con adyuvante 3D-MPL y sustancialmente desprovista de adyuvantes basados en aluminio.
Para la preparación de las vacunas, ver la sección anterior "Preparaciones de Vacunas de la Invención".
C) Conjugados de Polisacáridos Bacterianos/Proteína D
La tendencia hacia las vacunas de combinación tiene la ventaja de disminuir la incomodidad para el receptor, facilitando la confección de un calendario y asegurando que el régimen se realice completamente; pero existe también el riesgo concomitante de disminuir la eficacia de la vacuna (ver anteriormente la discusión acerca de la supresión de epitope a través del uso excesivo de proteínas vehículo). Sería, por lo tanto, ventajoso realizar combinaciones de vacunas que cumplen con las necesidades de una población y que, además, no exhiben interferencia inmunogénica entre sus componentes. Estas ventajas pueden obtenerse mediante las composiciones inmunogénicas (o vacunas) de la invención, que son beneficiosas particularmente para administrar vacunas de combinación a grupos de alto riesgo tales como infantes, niños pequeños o ancianos.
La presente invención provee una proteína D de Haemophilus influenzae, o fragmentos de la misma, como un vehículo para composiciones inmunogénicas basadas en polisacáridos, incluyendo vacunas. Los fragmentos adecuados para uso incluyen fragmentos que abarcan epitopes de células T-helper. En particular el fragmento de proteína D de preferencia contendrá el 1/3 N terminal de la proteína.
La proteína D es una proteína de unión de IdD de Haemophilus influenzae (documento EP 0 594 610 B1) y es un potencial inmunógeno.
Los polisacáridos para conjugar con la Proteína D contemplados por la presente invención incluyen, pero no se limitan al antígeno polisacárido Vi contra Salmonella typhi, polisacáridos de neumococos (incluyendo tipo A, C, W135 e Y, y el polisacárido y polisacáridos modificados de meningococo grupo B), polisacáridos de Staphylococcus aureus, polisacáridos de Streptococcus agalactae, polisacáridos de Streptococcus pneumoniae, polisacáridos de Mycobacterium por ej. Mycobacterium tuberculosis (tal como trehalosas manofosfoinisitidas, ácido micólico, arabinomannans bloqueados con manosa, las cápsulas de las mismas y arabinogalactans), polisacáridos de Cryptococcus neoformans, los lipopolisacáridos de Haemophilus influenzae no tipificable, el polisacárido capsular de Haemophilus influenzae b, los lipopolisacáridos de Moraxella catharralis, los lipopolisacáridos de Shigella sonnei, el lipopeptidofosfoglicano (LPPG) de Trypanosoma cruzi, los gangliósidos asociados con el cáncer GD3, GD2, las mucinas asociadas con tumores, especialmente el antígeno T-F y el antígeno sialil T-F y el polisacárido asociado con VIH que está relacionado estructuralmente con el antígeno T-F.
El polisacárido puede unirse a la proteína vehículo por medio de cualquier procedimiento conocido (por ejemplo, la Patente de EEUU Nº 4.372.945 de Likhite y la Patente de EEUU Nº 4.474.757 de Armor y col.). De preferencia, se realiza la conjugación CDAP (documento WO 95/08348).
En CDAP, se usa de preferencia el reactivo de cianilación tetrafluoroborato de 1-ciano-dimetilaminopiridinio (CDAP) para la síntesis de conjugados de polisacárido-proteína. La reacción de cianilación puede realizarse bajo condiciones relativamente suaves, que evitan la hidrólisis de los polisacáridos sensibles a la alcalinidad. La síntesis permite el acoplamiento directo de una proteína vehículo.
Se disuelve el polisacárido en agua o solución salina. Se disuelve CDAP en acetonitrilo y se agrega inmediatamente a la solución de polisacárido. El CDAP reacciona con los grupos hidroxilo del polisacárido para formar un éster de cianato. Tras la etapa de activación, se agrega la proteína vehículo. Los grupo amino de la lisina reaccionan con el polisacárido activado para formar un enlace covalente isourea.
Tras la reacción de acoplamiento, se agrega una gran cantidad de glicina en exceso para templar las funciones activadas residuales. Posteriormente se pasa el producto a través de un gel de permeación para eliminar la proteína vehículo sin reaccionar y los reactivos residuales. En consecuencia, la invención provee un procedimiento para producir conjugados de polisacárido proteína D que comprende las etapas de activar el polisacárido y unir el polisacárido a la proteína D.
En una forma de realización de preferencia de la invención se provee una formulación de composición inmunogénica (o vacuna) para la prevención de infecciones por Streptococcus pneumoniae.
El mecanismo por el que se esparcen los neumococos hacia los pulmones, líquido cefalorraquídeo y sangre se entiende vagamente. El crecimiento de las bacterias que llegan a los alvéolos pulmonares normales se inhibe por su sequedad relativa y por la actividad fagocítica de los macrófagos alveolares. Cualquier cambio anatómico o fisiológico de estas defensas coordinadas tiende a aumentar la susceptibilidad de los pulmones a la infección. La pared celular de Streptococcus pneumoniae tiene un papel importante generando una respuesta inflamatoria en los alvéolos del pulmón. (Gillespie y col. (1997), I&I 65: 3936).
Típicamente la vacuna de la presente invención comprenderá conjugados de proteína D y polisacáridos, en la que el polisacárido deriva de al menos cuatro, siete, once, trece, quince o 23 serotipos. Ver la sección anterior "Antígenos Polisacáridos de Streptococcus pneumoniae de la Invención" para combinaciones de preferencia de serotipos dependiendo de la enfermedad a tratar.
En otra forma de realización de la invención se provee una vacuna para Neisseria meningitidis; en particular de serotipos A, B, C W-135 e Y. Neisseria meningitidis es una de las causas más importantes de meningitis bacteriana. La cápsula de carbohidratos de estos organismos puede actuar como determinante de virulencia y como blanco para anticuerpos protectores. De cualquier manera se sabe que los carbohidratos son inmunógenos pobres en niños pequeños. La presente invención provee un vehículo proteico particularmente adecuado para estos polisacáridos, proteína D, que provee epitopes de células T que pueden activar una respuesta de células T para ayudar a una proliferación y maduración de células B específicas de antígeno polisacárido, así como la inducción de una memoria inmunológica.
En una forma de realización alternativa de la invención se provee un conjugado de polisacárido capsular de Haemophilus influenzae b (PRP)-proteína D.
La presente invención también contempla vacunas de combinación que proveen protección contra una variedad de patógenos diferentes. Una proteína D resulta sorprendentemente útil como un vehículo en vacunas de combinación donde están conjugados antígenos polisacáridos múltiples. Como se mencionó anteriormente, es probable que ocurra supresión de epitopes si se usa el mismo vehículo para cada polisacárido. El documento WO 98/51339 describe composiciones para tratar de minimizar esta interferencia conjugando una proporción de los polisacáridos en la composición a DT y el resto a TT.
Sorprendentemente, los autores de la presente invención hallaron que la proteína D es particularmente adecuada para minimizar tales efectos de supresión de epitopes en las vacunas de combinación. En una combinación, uno o más polisacáridos pueden estar conjugados ventajosamente a proteína D y de preferencia todos los antígenos están conjugados dentro de tales vacunas de combinación.
Una combinación de preferencia incluye una vacuna que brinda protección contra infección por Neisseria meningitidis C e Y (y de preferencia A) en la que el antígeno polisacárido de uno o más de los serotipos Y y C (y de mayor preferencia A) están unidos a proteína D.
La vacuna para Haemophilus influenzae basada en polisacáridos (PRP conjugado de preferencia con TT, DT o CRM197, o de mayor preferencia con proteína D) puede estar formulada con las vacunas de combinación anteriores.
Muchas vacunas pediátricas están siendo actualmente administradas como vacunas de combinación para reducir el número de inyecciones que tiene que recibir un niño. Por ello, para vacunas pediátricas pueden formularse otros antígenos con las vacunas de la invención. Por ejemplo las vacunas de la invención pueden formularse con, o administrarse separadamente, pero al mismo tiempo con la bien conocida vacuna de combinación "trivalente" que comprende toxoide de Difteria (DT), toxoide de tétanos (CT) y componentes de pertussis [típicamente toxoide destoxificado de Pertussis (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) con pertactina (PRN) y/o aglutinina 1+2 opcional], por ejemplo la vacuna comercializada INFANRIX-DTPa™ (SmithKlineBeecham Biologicals) que contiene antígenos DT, TT, PT, FHA y PRN , o con un componente de células de pertussis completa por ejemplo como comercializa SmithKlineBeecham Biologicals s.a., como Tritanrix™. La vacuna de combinación puede también comprender otro antígeno, tal como antígeno de superficie de Hepatitis B (HBsAg), antígenos de virus de Polio (por ejemplo virus de polio trivalente inactivado-IPV), proteínas de membrana externa de Moraxella catarrhalis, proteínas de Haemophilus influenzae no tipificable, proteínas de membrana externa de N. meningitidis B.
Los ejemplos de antígenos proteicos de preferencia de Moraxella catarrhalis que pueden incluirse en una vacuna de combinación (especialmente para la prevención de otitis media) son: OMP106 [documento WO 97/41731 (Antex) & WO 96/34960 (PMC)]; OMP21; LbpA & LbpB [documento WO 98/55606 (PMC)]; ThpA & TbpB [documentos WO 97/13785 & WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen M E, y col. (1993) Infect. Immun. 61:2003-2010]; UspA1/2 [documento WO 93/03761 (Universidad de Texas)]; y OmpCD. Los ejemplos de antígenos de Haemophilus influenzae no tipificable que pueden incluirse en una vacuna de combinación (especialmente para la prevención de otitis media) incluyen: proteína Fimbrina [(Patente de EEUU Nº 5.766.608-Ohio State Research Foundation)] y fusiones que comprenden péptidos de la misma [por ej. fusiones de péptidos LB 1(f); Patente de EEUU Nº 5.843.464 (OSU) o documento WO 99/64067]; OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [Documento EP 281673 (Universidad Estatal de New York)]; TbpA y TbpB; Hia; Hmw1,2; Hap; y D15.
Las vacunas pediátricas de preferencia contempladas por la presente invención son:
a) conjugado de polisacáridos de N. meningitidis C y conjugado de polisacáridos de Haemophilus influenzae b, opcionalmente con conjugado de polisacáridos de N. meningitidis A y/o Y, a condición de que al menos un antígeno polisacárido, y de preferencia todos están conjugados a proteína D.
b) Vacuna a) con, DT, TT, componentes de pertussis (de preferencia PT, FHA y PRN), antígeno de superficie de Hepatitis B y IPV (vacuna antipoliomielítica trivalente inactivada).
c) Antígenos polisacáridos de Streptococcus pneumoniae conjugados con proteína D.
d) Vacuna c) con uno o más antígenos de Moraxella catarrhalis y/o Haemophilus influenzae no tipificable.
Todas las vacunas de combinación anteriores pueden beneficiarse de la inclusión de proteína D como vehículo. Claramente, cuantos más vehículos están involucrados en una vacuna de combinación (por ejemplo para solucionar la supresión de epitopes), más cara y compleja resulta la vacuna final. Tener todos, o la mayoría, de los antígenos polisacáridos de una vacuna de combinación conjugados a proteína D, provee una ventaja considerable.
Para la prevención de neumonía en la población de ancianos (+ de 55 años de edad) y otitis media en infantes y niños pequeños, resulta una forma de realización preferencia de la invención combinar antígenos de polisacáridos de Streptococcus pneumoniae multivalentes y proteína D como se describió en este documento con una proteína de Streptococcus pneumoniae o un equivalente inmunológicamente funcional de la misma. Ver la sección anterior "Proteínas de Neumococo de la Invención" para combinaciones proteínas/proteína de preferencia que pueden incluirse en tal combinación.
En consecuencia la presente invención provee una composición inmunogénica que comprende un conjugado de polisacárido de Streptococcus pneumoniae-proteína D y un antígeno proteico de Streptococcus pneumoniae.
Los antígenos de conjugado de polisacárido-proteína D de la presente invención de preferencia tienen adyuvantes en la formulación de vacuna de la invención. Los adyuvantes adecuados incluyen sal de aluminio tal como gel de hidróxido de aluminio (alum) o fosfato de aluminio, pero también puede ser una sal de calcio, hierro o zinc, o puede ser una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares acilados, polisacáridos derivatizados catiónica o aniónicamente, o polifisfacenos.
Para las vacunas para ancianos resulta de preferencia que el adyuvante se seleccione para que sea un potencial inductor de una respuesta de tipo Th1.
Para adyuvantes Th1 particulares ver la sección anterior "Adyuvantes Th1 de la Invención".
En otro aspecto de la presente invención se provee un inmunógeno o una vacuna como se describió en este documento para uso en medicina.
Para la preparación de la vacuna/administración del conjugado, ver la sección anterior "Preparación de Vacunas de la Invención".
La proteína D también se usa ventajosamente en una vacuna contra la otitis media, ya que es por sí misma un inmunógeno capaz de producir protección mediada por células B contra H. influenzae no tipificable (ntHi). ntHi puede invadir células del huésped y evadir los efectos mediados por células B inducidos por el antígeno proteico. Los autores de la presente invención hallaron sorprendentemente una manera de aumentar la eficacia de la proteína D (por sí misma o como un vehículo para un polisacárido) como un antígeno para una vacuna contra la otitis media. Esto se realiza agregando adyuvantes a la proteína D de manera tal que se induce una potente respuesta Th1 en el sujeto de tal que se optimiza el brazo del sistema inmune contra la proteína D mediado por células. Esto se logra sorprendentemente usando una composición liofilizada que comprende proteína D y un adyuvante Th1 (de preferencia 3D-MPL) que se reconstituye poco antes de la administración. La invención también provee tales composiciones, un procedimiento para fabricar tales composiciones (liofilizando un a mezcla que comprende proteína D y un adyuvante Th1) y un uso de tal composición en el tratamiento de la otitis media.
En un sentido más amplio, los autores de la invención prevén que liofilizando un inmunógeno en presencia de un adyuvante Th1 (ver "Adyuvantes Th1 de la Invención"), de preferencia 3D-MPL, aumentará generalmente la respuesta inmune Th1 contra el inmunógeno. La presente invención es por lo tanto aplicable a cualquier inmunógeno para el que se necesita una respuesta inmune Th1 más potente. Tales inmunógenos comprenden antígenos proteicos bacterianos, virales y tumorales, así como proteínas y péptidos mismos.
Ejemplos Ejemplo 1 Polisacárido Capsular de S. pneumoniae
La vacuna candidata 11 valente incluye los serotipos de polisacáridos capsulares 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F que se realizaron esencialmente como se describe en el documento EP 72513. Se activa y derivatiza cada polisacárido usando química de CDAP (documento WO 95/08348) y se conjuga al vehículo proteico. Todos los polisacáridos
se conjugan en su forma nativa, excepto para el serotipo 3 (al que se le redujo el tamaño para disminuir su viscosidad).
Vehículo Proteico
El vehículo proteico seleccionado es la proteína D recombinante (PD) de Haemophilus influenzae no tipificable, expresada en E coli.
Expresión de proteína D
Proteína D de Haemophilus influenzae
Construcción Genética para Expresión de Proteína D
Materiales de Inicio ADN que Codifica la Proteína D
La proteína D está altamente conservada entre todos los serotipos de H. influenzae y cepas no tipificables. El Dr. A. Forsgren, Departamento de Microbiología Médica, Universidad de Lund, Malmo General Hospital, Malmo, Suecia obtuvo el vector pHIC348 que contiene el gen con la secuencia de ADN que codifica la proteína D completa. La secuencia de ADN de proteína D fue publicada por Janson y col. (1991) Infect. Immun. 59: 119-125.
El Vector de Expresión pMG1
El vector de expresión pMG1 es un derivado de pBR322 (Gross y col., 1985) en el que se introdujeron elementos de control para transcripción y traducción de genes extraños insertados derivados de bacteriofago \lambda (Shatzman y col., 1983). Además, se cambió el gen de resistencia a la Ampicilina con el gen de resistencia a Kanamicina.
La Cepa AR58 de E. coli
Se generó la cepa AR58 de E. coli por transducción de N99 con un stock de fago P1 cultivado previamente en un derivado SA500 (galE::TN10, lambdaKil^{-} cI857 \DeltaH1). N99 y SA500 son cepas K12 de E. coli derivadas del laboratorio del Dr. Martin Rosenberg laboratory en el National Institute of Health.
El Vector de Expresión pMG1
Para la producción de proteína D, se clonó el ADN que codifica la proteína en el vector de expresión pMG1. Este plásmido usa señales de ADN de fago lambda para dirigir la transcripción y traducción de genes extraños insertados. El vector contiene el promotor PL, operador OL y dos sitios de utilización (NutL y NutR) para aliviar los efectos de polaridad transcripcional cuanto se provee proteína N (Gross y col., 1985). Los vectores que contienen el promotor PL se introducen en un huésped lisogénico de E. coli para estabilizar el ADN del plásmido. Las cepas lisogénicas del huésped contienen ADN de fago lambda con defectos de replicación integrado en el genoma (Shatzman y col., 1983). El ADN cromosómico del fago lambda dirige la síntesis de la proteína represora cI que se une al represor OL del vector y previene la unión de polimerasa de ARN al promotor PL y por lo tanto la transcripción del gen insertado. El gen cI de la cepa AR58 de expresión contiene un mutante sensible a la temperatura de manera que la transcripción dirigida por PL puede regularse por medio de cambios de temperatura, es decir, un aumento en la temperatura de cultivo inactiva el represor y se inicia la síntesis de la proteína extraña. Este sistema de expresión permite la síntesis controlada de proteínas extrañas especialmente de aquellas que pueden ser tóxicas para la célula (Shimataka & Rosenberg,
1981).
La Cepa AR58 de E. coli
La cepa lisogénica de E. coli AR58 usada para la producción del vehículo de proteína D es un derivado de la cepa de E. coli K12 N99 estándar según NIH (F^{-} su^{-} galK2, lacZ^{-} thr^{-}). Contiene un fago lambda lisogénico defectuoso (galE::TN10, lambdaKil^{-} cI857 \DeltaH1). El fenotipo Kil^{-} previene la desconexión de la síntesis macromolecular del huésped. La mutación cI857 confiere una lesión sensible a la temperatura al represor cI. La deleción \DeltaH1 elimina el operón derecho del fago lambda y los loci bio, uvr3, y chlA del huésped. La cepa AR58 se generó por transducción de N99 con un stock de fago P1 cultivado previamente en un derivado SA500 (galE::TN10, lambdaKil^{-} cI857 \DeltaH1). La introducción del lisógeno defectuoso en N99 se seleccionó con tetraciclina gracias a la presencia de un transposón TN10 que codifica resistencia a la tetraciclina en el gen galE adyacente.
Construcción del Vector pMGMDPPrD
Se usó el vector pMG 1 que contiene el gen que codifica la proteína no estructural S1 del virus de Influenza (pMGNSI) para construir pMGMDPPrD. Se amplificó el gen de proteína D por PCR a partir del vector pHIC348 (Janson y col. 1991) con cebadores de PCR conteniendo sitios de restricción NcoI y XbaI en los extremos 5' y 3', respectivamente. Posteriormente se introdujo el fragmento NcoI/XbaI en pMGNS1 entre NcoI y XbaI creando así una proteína de fusión conteniendo los 81 aminoácidos N-terminal de la proteína NS1 seguidos por la proteína D. Se marcó este vector pMGNS1 PrD.
En base a la construcción descrita anteriormente se generó la construcción final para la expresión de proteína D. Se eliminó una región del fragmento BamHI/BamHI de pMGNS1PrD. Esta hidrólisis de ADN elimina la región que codifica NS1, excepto por los primeros tres residuos N-terminal. Tras la nueva unión del vector se generó un gen que codifica una proteína de fusión con la siguiente secuencia de aminoácidos N-terminal:
- - - - -MDP SSHSSNMANT- - - - -
\hskip5.5cm
NS1 
\hskip3.5cm
Proteína D
La proteína D no contiene un péptido líder o la cisteína N-terminal a los que normalmente están unidas cadenas de lípidos. Por lo tanto la proteína ni es extretada dentro del periplasma ni se le agregan lípidos y permanece en el citoplasma en una forma soluble.
Se introdujo la construcción final pMG-MDPPrD en la cepa huésped AR58 por medio de choque de calor a 37ºC. Se seleccionaron las bacterias conteniendo plásmido en presencia de Kanamicina. La presencia de ADN que codifica proteína D se demostró por digestión de ADN aislado de plásmidos con endonucleasas seleccionadas. Se nombra a la cepa recombinante de E. coli como ECD4.
La expresión de proteína D está bajo el control del promotor lambda P_{L}/operador O_{L}. La cepa huésped AR58 contiene un gen cI sensible a la temperatura en el genoma que bloquea la expresión a partir de lambda P_{L} a bajas temperaturas uniéndose a O_{L}. Una vez que se eleva la temperatura cI se libera de O_{L} y se expresa la proteína D. Al final de la fermentación las células se concentran y se congelan.
La extracción a partir de las células cultivadas y la purificación de proteína D se realizó de la siguiente manera. Se descongela el sedimento del cultivo celular congelado y se resuspende en una solución de disrupción celular (tampón citrato pH 6,0) hasta una DO_{650}=60. Se pasa la suspensión dos veces a través de un homogeneizador de alta presión a P=1000 bar. Se clarifica el homogenado del cultivo celular por centrifugación y se eliminan los restos celulares por filtración. En la primera etapa de purificación se aplica el lisado filtrado a una columna de cromatografía de intercambio catiónico (SP Sepharose de Flujo Rápido). PD se une a la matriz de gel por interacción iónica y se eluye mediante una etapa en la que se aumenta la fuerza iónica del tampón de elución.
En una segunda etapa de purificación se retienen impurezas en una matriz de intercambio aniónico (Q Sepharose de Flujo Rápido). PD no se une al gel y puede recogerse en el fluido obtenido.
En ambas etapas de cromatografía se controla la recolección de fracciones mediante la DO. Se concentra y purifica por ultrafiltración el fluido obtenido de la columna de intercambio aniónico que contiene la proteína D purificada.
El retenido de la ultrafiltración que contiene proteína D se pasa finalmente a través de una membrana de 0,2 \mum.
Química Química de Activación y Acoplamiento
Las condiciones de activación y acoplamiento son específicas para cada polisacárido. Éstas se presentan en la Tabla 1. Se disolvió el polisacárido nativo (excepto para PS3) en NaCl 2M o en agua para inyección. La concentración óptima de polisacáridos se evaluó para todos los serotipos.
De una solución stock de 100 mg/ml en acetonitrilo, se agregó CDAP (relación CDAP/PS 0,75 mg/mg PS) a la solución de polisacárido. Tras 1,5 minutos se agregó trietilamina 0,2M para obtener el pH específico de activación. La activación del polisacárido se realizó a este pH durante 2 minutos a 25ºC. Se agregó proteína D (la cantidad depende de la relación inicial PS/PD) al polisacárido activado y se realizó la reacción de acoplamiento al pH específico durante 1 hora. Posteriormente se templó la reacción con glicina durante 30 minutos a 25ºC y durante la noche a 4ºC.
Se purificaron los conjugados por medio de filtración en gel usando una columna de filtración con gel Sephacryl 500HR equilibrada con NaCl 0,2M.
Se determinó el contenido de carbohidrato y proteína de las fracciones eluidas. Se combinaron los conjugados y se filtraron de manera estéril en una membrana de esterilización de 0,22 \mum. Se determinaron las relaciones PS/Proteína en las preparaciones de conjugados.
Caracterización
Se caracterizó cada conjugado y cumplió con las especificaciones descritas en la Tabla 2. Se midió el contenido de polisacárido (\mug/ml) por la prueba del Resorcinol y el contenido de proteína (\mug/ml) mediante la prueba de Lowry. Se determina la relación final PS/PD mediante la relación de las concentraciones.
Contenido Residual de DMAP (ng/\mug PS)
La activación del polisacárido con CDAP introduce un grupo cianato en el polisacárido y se libera DMAP (4-dimetilaminoipiridina). Se determinó el contenido residual de DMAP por medio de un ensayo específico desarrollado en SB.
Contenido de Polisacárido Libre (%)
Se determinó el contenido de polisacárido libre en conjugados mantenidos a 4ºC o almacenados durante 7 días a 37ºC en el sobrenadante obtenido tras la incubación con anticuerpos \alpha-PD y sulfato de amonio saturado, seguida por una centrifugación.
Se usó un ELISA de \alpha-PS/\alpha-PS para la cuantificación de polisacárido libre en el sobrenadante. También se controló la ausencia de conjugado por medio de un ELISA \alpha-PD/\alpha-PS. La reducción de la cantidad de polisacárido libre da como resultado una vacuna de conjugado mejorada.
Antigenicidad
Se analizó la antigenicidad en los mismos conjugados en el ELISA tipo sandwich en el que la captura y detección de anticuerpos fue \alpha-PS y \alpha-PD respectivamente.
Contenido de Proteína Libre (%)
Se determinó el nivel de proteína D residual libre usando un procedimiento con tratamiento de SDS de la muestra. Se calentó el conjugado 10 min a 100ºC en presencia de SDS 0,1% y se inyectó en una columna de filtración con gel SEC-HPLC (TSK 3000-PWXL). Como la proteína D es un dímero, existe el riesgo de sobreestimar el nivel de proteína D "libre" por disociación de la estructura con SDS.
Tamaño Molecular (K_{av})
Se determinó el tamaño molecular en una columna de filtración de gel SEC-HPLC (TSK 5000-PWXL).
Estabilidad
Se midió la estabilidad en un gel de filtración HPLC-SEC (TSK 6000-PWXL) para conjugados mantenido a 4ºC y almacenado durante 7 días a 37ºC.
En la Tabla 2 se presenta la caracterización 11-valente.
Los conjugados proteicos pueden adsorberse en fosfato de aluminio y combinarse para formar la vacuna final.
Conclusión
Se produjeron conjugados inmunogénicos que demostraron ser componentes de una vacuna prometedora. Las condiciones de CDAP optimizadas para la mejor calidad final del producto de polisacáridos conjugados de neumococo se descubrieron para cada una de las 11 valencias. Por ello los conjugados de estos polisacáridos de neumococo obtenibles por el procedimiento anterior de CDAP mejorado (optimizado) es otro aspecto de la invención.
Ejemplo 2 Estudio del Efecto de Adyuvantes Avanzados en la Inmunogenicidad de la Vacuna de Conjugado PS-PD 11 Valente de Neumococo en Ratas Infantes
Se inmunizaron ratas infantes con vacuna de conjugado PS-PD 11 valente de neumococo a una dosificación de 0,1 \mug de cada polisacárido (realizada de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 1), y usando las formulaciones de adyuvantes siguientes: ninguno, AlPO_{4}, 3D-MPL, 3D-MPL en AlPO_{4}.
La formulación con 3D-MPL solo fue estadísticamente (y sorprendentemente) más inmunogénica (MGC de IgG más elevada) que las otras formulaciones para 5 de 11 antígenos. Esto fue así tanto para concentraciones altas como bajas de 3D-MPL.
La opsonofagocitosis confirmó los resultados de MGC.
Materiales y Procedimientos Protocolo de Inmunización
Se aleatorizaron ratas de corta edad OFA a diferentes madres y tenían 7 días de vida cuando recibieron la primera inmunización. Recibieron 2 inmunizaciones adicionales tras 14 y 28 días. Se obtuvieron muestras de sangre en el día 56 (28 días post III). Todas las vacunas se inyectaron por vía s.c., y se realizó en grupos de 10 ratas por vacuna.
Se inmunizó a las ratas con una vacuna de conjugado de neumococo 11 valente comprendiendo los siguientes serotipos de polisacáridos conjugados con proteína D: 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 23F.
Formulación
Para examinar el efecto de diferentes adyuvantes avanzados, se mantuvo constante la dosificación de conjugado en 0,1 \mug de cada polisacárido y se formularon los adyuvantes AlPO_{4} y 3D-MPL en diferentes dosificaciones y combinaciones, incluyendo sin ningún adyuvante. En la Tabla 3 se presente una lista de éstos para referencia.
Adsorción sobre AlPO_{4}
Los monovalentes concentrados, adsorbidos se prepararon de acuerdo con el siguiente procedimiento. Se mezclaron 50 \mug de AlPO_{4} (pH 5,1) con 5 \mug de polisacáridos conjugados durante 2 horas. Se ajustó el pH hasta 5,1 y se dejó la mezcla durante otras 16 horas. Se agregaron 1500 mM de NaCl para alcanzar la concentración salina de 150 mM. Tras 5 minutos se agregaron 5 mg/ml de 2-fenoxietanol. Tras otros 30 minutos se ajustó el pH hasta 6,1 y se dejó durante más de 3 días a 4ºC.
Preparación de Diluyentes
Se prepararon tres diluyentes en NaCl 150 mM/5 mg/ml fenoxietanol.
A: AlPO_{4,} 1 mg/ml.
B: 3D-MPL en AlPO_{4}, 250 y 1000 \mug/ml respectivamente. Relación de pesos 3D-MPL/AlPO_{4} = 5/20
C: 3D-MPL en AlPO_{4,} 561 y 1000 \mug/ml respectivamente. Relación de pesos 3D-MPL/AlPO_{4} = 50/89
Preparación de Undecavalente Adsorbido
Se mezclaron los once monovalentes PS-PD concentrados, adsorbidos en las relaciones correctas. Se agregó el complemento de AlPO_{4} como el diluyente A. Cuando fue necesario, se agregó 3D-MPL como solución acuosa (no adsorbida, Forma 1, ver a continuación) o como el diluyente B o C (3D-MPL adsorbido en AlPO_{4} en 2 dosis, Forma 2, ver a continuación).
Forma 1
Se agregó 3D-MPL a los conjugados combinados adsorbidos como una suspensión acuosa. Se mezcló con el undecavalente durante 10 minutos a temperatura ambiente y se almacenó a 4ºC hasta la administración.
Forma 2
Se preadsorbió 3D-MPL en AlPO_{4} previo al agregado a los conjugados combinados adsorbidos (diluyentes B y C). Para preparar 1 ml de diluyente, se mezcló una suspensión acuosa de 3D-MPL (250 ó 561 \mug) con 1 mg de AlPO_{4} en NaCl 150 mM pH 6,3 durante 5 min a temperatura ambiente. Se diluyó esta solución en NaCl pH 6,1/fenoxi y se incubó durante la noche a 4ºC.
Preparación de Undecavalente No Adsorbido
Se mezclaron los once conjugados PS-PD y diluidos en las relaciones correctas en NaCl 150 mM pH 6,1, fenoxi. Cuando fue necesario, se agregó 3D-MPL como una solución (no adsorbido).
Se prepararon las formulaciones de todas las inyecciones 18 días previo a la primera administración.
ELISA
Se realizó el ELISA para medir IgG de rata usando el protocolo derivado del Workshop de WOH en procedimiento de ELISA para la cuantificación de anticuerpos IgI contra polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae en suero humano. En esencia, se recubre la placa de microtitulación directamente con polisacárido capsular purificado. Se incuban muestras de suero previamente con el polisacárido de pared celular común a todos los neumococos (sustancia C) y que está presente aproximadamente en un 0,5% en polisacáridos de neumococos purificados de acuerdo con la descripción (documento EP 72513 B1). Se usaron reactivos de Jackson ImmunoLaboratories Inc. para detectar IgG murina unida. Se referenciaron las curvas de titulación con patrones internos (anticuerpos monoclonales) modeladas mediante ecuación Logistic log. Se realizaron los cálculos usando el programa informático SoftMax Pro. Se esperó que
el error máximo absoluto en estos resultados estuviera dentro de un factor de 2. El error relativo es menor que 30%.
Opsonofagocitosis
Se determinaron los títulos opsónicos para los serotipos 3, 6B, 7F, 14, 19F y 23F usando el protocolo del CDC (Opsonofagocitosis de Streptococcus pneumoniae usando células Diferenciadas HL60, versión 1.1) con PMN humanos purificados y complemento de crías de conejo. La modificación incluyó el uso de cepas internas de neumococo y se reemplazaron las células fagocíticas HL60 por PMN neutrófilos humanos purificados (existe un alto grado de correlación entre estas células fagocíticas). Además, se agregaron perlas de vidrio de 3 mm a los pocillos de microtitulación para incrementar el mezclado lo que permitió la reducción de la relación fagocito:bacteria, siendo la relación recomendada de 400.
Resultados Concentraciones de IgG
Se determinó la media geométrica de las concentraciones de IgG para cada serotipo y PD, y se muestran en las Tablas 4 a 10. Para los serotipos 6B, 14, 19F y 23F, se incluyen para comparación resultados previos obtenidos usando una formulación tetravalente.
En las Tablas 4 a 10 se resaltaron las concentraciones de IgG más elevadas. El valor estadístico de p para composiciones con 3D-MPL vs. composiciones con 3D-MPL/AlPO_{4} está en la Tabla 11. La formulación de adyuvante número 4 (conjugados no adsorbidos con dosis alta de 3D-MPL) da la MGC más alta para 9 de 11 casos. En 5/11 casos, MPL en baja dosis es el segundo más inmunogénico. Además, el agregado de adyuvantes da MGC más alta que la modificación de dosis para todos los serotipos (no mostrado), y esto es estadísticamente significativo para los serotipos 4, 6B, 7F, 18C y 23F (p<0,05 para IC 95%).
Opsonofagocitosis
Los resultados de opsonofagocitosis en sueros combinados se muestra para los serotipos 3, 6B, 7F, 14, 19F y 23F en las Tablas 4 a 8. Para la mayor parte, estos títulos opsónicos confirman la MGC de IgG. Por cierto, la correlación con la concentración de IgG es mayor que 85% para los serotipos 6B, 19F, 23F (datos no mostrados). Para el serotipo 3, es importante notar que sólo el grupo con 3D-MPL indujo la actividad opsónica por encima del umbral.
Conclusiones
En este experimento, se esperaba que el uso de 3D-MPL solo induciría las concentraciones más elevadas de IgG.
La MGC de IgG máxima obtenida modificando el adyuvante se comparó con la MGC máxima obtenida modificando la dosificación de PS y se halló que 3D-MPL podía inducir respuestas significativamente más altas en 5/11 serotipos.
La Tabla 11 muestra que cuando se comparan las composiciones con 3D-MPL y 3D-MPL/AlPO_{4} (comparando el procedimiento de formulación, y la dosis de 3D-MPL), 5 de los conjugados de polisacáridos mejoran significativamente, en términos de inmunogenicidad, cuando se formulan sólo con 3D-MPL más que con 3D-MPL más AlPO_{4}: PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F, y PS 23F.
Ejemplo 3 Estudio del Efecto de Combinación en la Inmunogenicidad de Conjugados PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F, y PS 23F en Ratas Adultas
Se inmunizaron ratas adultas con vacunas de conjugado de polisacárido de neumococo-proteína D individualmente, o combinada en una composición multivalente (tetra-, penta-, hepta-, o decavalente). Se inmunizaron grupos de 10 ratas dos veces con diferencia de 28 días y se obtuvieron muestras de sangre en el día 28 y 42 (14 días tras la 2º dosis).
Se probaron los sueros por medio de ELISA para anticuerpos IgG para los polisacáridos de neumococos. Todos los conjugados indujeron anticuerpos IgG específicos como se midió por ELISA. La Tabla 12 muestra el efecto de la combinación de conjugados monovalentes de PS 6B, PS 18C, PS 19F, y PS 23F proteína D en la inmunogenicidad en ratas adultas, como se midió por medio de la concentración de IgG en el día 14 posterior a la 2º dosis.
Se realizó el análisis estadístico en todas las muestras para determinar si las diferencias en la concentración de anticuerpos con la combinación eran significativas. La combinación de cualquiera de los conjugados de serotipos PS 6B, PS 18C, PS 19F, y PS 23F proteína D en una vacuna multivalente no cambió significativamente su inmunogenicidad.
TABLA 1 Condiciones específicas de activación/acoplamiento/templado de conjugados de PS. S. pneumoniae-Proteína D
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TABLA 2 Especificaciones de la vacuna PS-PD de neumococo 11 valente (los primeros números del código de lote indican el serotipo)
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TABLA 3 Tabla Resumen de Formulaciones Probadas con PS-PD de Neumococo 11 Valente en Ratas de Corta Edad
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TABLA 11 Significancia estadística (valor de p) de si ciertos conjugados de polisacáridos de neumococos mejoraron la inmunogenicidad cuando se formularon con 3D-MPL solo versus los formulados con 3D-MPL/AlPO_{4}. Se considera altamente significativo un valor de p por debajo de 0,01. Forma 1 y Forma 2 indica el procedimiento de formulación
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TABLA 12 Media Geométrica de la concentración de IgG (\mug/ml) en el día 14 post 2º dosis tras la inmunización de ratas adultas con 1,0 \mug de conjugado de polisacárido-proteína D solo o combinado en vacuna tetravalente, pentavalente, heptavalente o decavalente. Estos datos están combinados a partir de 5 experimentos separados
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Ejemplo 4 Impacto Beneficioso del Agregado de Neumolisima y 3D-MPL en la Eficacia Protectora de la Vacuna de Polisacárido 11 Valente Conjugada con PD Contra la Colonización Pulmonar de Neumococos en Ratones Lecturas Inmunológicas Dosificación de Neumolisina-IgG Sérica Específica por ELISA
Se recubrieron inmunoplacas Maxisorp Nunc durante 2 horas a 37ºC con 100 \mul/pocillo de neumolisina nativa recombinante (PLY) diluida en PBS. Se lavaron las placas 3 veces con tampón NaCl 0.9% Tween-20 0,05%. Posteriormente se agregaron diluciones seriales al doble (en PBS/Tween-20 0,05%, 100 \mul por pocillo) de un suero anti-PLY de referencia como curva patrón (comenzando con 670 ng/ml IgG) y se incubaron muestras de suero (comenzando con una dilución 1/10) durante 30 minutos a 20ºC bajo agitación. Tras el lavado descrito anteriormente, se incubaron IgG de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa (Jackson) diluida 5.000 veces en PBS/Tween-20 0,05% (100 \mul/pocillo) durante 30 minutos a 20ºC bajo agitación. Tras lavar, se incubaron las placas durante 15 min a temperatura ambiente con 100 \mul/pocillo de tampón de revelado (OPDA 0,4 mg/ml y H_{2}O_{2} 0,05% en 100 mM de tampón citrato pH 4,5). Se detuvo el revelado agregando 50 \mul/pocillo de HCl 1N. Se realizaron las lecturas de densidad óptica a 490 y 620 nm usando un inmunolector Emax (Molecular Devices). Se calcularon los títulos de anticuerpo por el procedimiento matemático de 4 parámetros usando el programa informático SoftMaxPro.
Inhibición de Hemólisis
Se realizó este ensayo para medir la capacidad de los anticuerpos séricos de inhibir la actividad hemolítica de la neumolisina (PLY). Con el fin de eliminar el colesterol (susceptible de interactuar con PLY), se trataron las muestras de suero 2 veces de la siguiente manera: se mezclaron con 1 volumen igual de cloroforma y posteriormente se incubaron durante 45 minutos bajo agitación. Se recogieron los sobrenadantes tras centrifugar durante 10 minutos a 1.000 rpm. Se diluyeron los sueros libres de colesterol (diluciones seriales al doble en ditiotreitol 1 mM, 0,01% SAB, 15 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 7,5) en microplacas de 96 pocillos (Nunc). Se agregaron cincuenta \mul de una solución conteniendo 4 UH (Unidades Hemolíticas) de PLY en cada pocillo y se incubaron durante 15 minutos a 37ºC. Posteriormente, se agregaron 100 \mul de glóbulos rojos de oveja (solución al 1%) durante 30 minutos a 37ºC. Tras centrifugar durante 10 minutos a 1000 rpm, se recogieron los sobrenadantes (150 \mul) y se colocaron en otra microplaca de 96 pocillos para leer la densidad óptica a 405 nm. Los resultados se expresaron como el punto medio de los títulos de dilución.
Destoxificación Química de Neumolisina
Se dializó neumolisina nativa recombinante (PLY) contra tampón Fosfato 50 mM NaCl 500 mM pH 7,6 buffer. Todas las demás etapas se realizaron a 39,5ºC. bajo agitación esporádica. En el día 1, se agregaron Tween-80 10% (1/250 v/v), N-acetil triptofano 57,4 mM pH 7,6 (3/100 v/v), glicina 2,2 M en tampón Fosfato (1/100 v/v) y formaldehído 10% en tampón Fosfato (3/100 v/v) en la solución de PLY. En los días 2 y 3, se agregó formaldehído 10%, en proporciones 3/100 y 2/100 v/v, respectivamente. Se mantuvo la incubación a 39,5ºC hasta el día 7 bajo agitación esporádica. Finalmente, se dializó PLY contra tampón Fosfato 50 mM NaCl 500 mM pH 7,6. Se demostró la inactivación completa de PLY en el ensayo de hemólisis.
Desafío Intranasal con Neumococo en Ratones OF1
Se inocularon ratones hembra OF1 de siete semanas de vida por vía intranasal bajo anestesia con 5 x 105 UFC de S. pneumoniae serotipo 6B adaptadas para ratón. Se extrajeron los pulmones a las 6 horas del desafío y se homogeneizaron (Ultramax, 24000 rpm, 4ºC) en medio Todd Hewith Broth (THB, Gibco). Se plaquearon diluciones seriales al décimo de homogenados de pulmón durante la noche a 37ºC en placas de Petri conteniendo agar THB suplementado con extracto de levadura. Se determinó la infección pulmonar por neumococo como el número de UFC/ratón, expresado como el promedio logarítmico. El límite de detección fue de 2,14 log UFC/ratón.
Ejemplo 4A
Efecto del Adyuvante 3D-MPL en la Respuesta Inmune Anti Neumolisina
En el presente ejemplo, evaluamos el impacto del agregado de adyuvante 3D-MPL en la respuesta inmune a la neumolisina nativa recombinante (PLY, provista por J. Paton, Children's Hospital, North Adelaide, Australia) y su contrapartida químicamente destoxificada (DPLY). La destoxificación química se realizó como se describió anteriormente.
Se inmunizaron grupos de 10 ratones hembra Balb/c de 6 semanas de edad por vía intramuscular en los días 0, 14 y 21 con 1 \mug de PLY o DPLY contenido en A: AlPO_{4} 100 \mug; o B: AlPO_{4} 100 \mug + 5 \mug 3D-MPL (monofosforil lípido A 3 de-O-acilado, suministrado por Ribi Immunochem). Las Figuras 1A y 1B muestran los títulos de IgG por ELISA y de Inhibición de Hemólisis (HLI) medidos en suero post III.
Con cualquier antígeno, las mejores respuestas inmunes se indujeron en animales vacunados con formulaciones suplementadas con 3D-MPL. Es interesante destacar que DPLY fue tan inmunogénico como PLY cuando se administró con AlPO_{4} + 3D-MPL, mientras que resultó un inmunógeno más débil en la formulación con AlPO_{4}. Esto mostró la ventajosa capacidad de 3D-MPL para mejorar la respuesta de anticuerpos para neumolisina destoxificada.
En composiciones conteniendo neumolisina, resultaría de preferencia usar neumolisina químicamente destoxificada en vez de neumolisina destoxificada por mutación. Esto es porque los mutantes destoxificados obtenidos hasta el momento todavía tienen actividad de toxina residual - la neumolisina destoxificada químicamente no la tiene. Por lo tanto se considera otro aspecto de la invención que, en general, las composiciones que comprenden neumolisina (o mutantes de neumolisina) que se destoxificó químicamente para uso en una vacuna, deberían contar con el agregado de un adyuvante Th1, de preferencia 3D-MPL. La invención provee tales composiciones. También se prevé un procedimiento para aumentar la respuesta inmune de neumolisina químicamente destoxificada dentro de una composición inmunogénica que comprende las etapas de agregar un adyuvante Th1 (de preferencia 3D-MPL) a la
composición.
Ejemplo 4B
Impacto Beneficioso del Agregado de un Mutante Atenuado de Neumolisina y Adyuvante 3D-MPL en la Eficacia Protectora de la Vacuna de Polisacáridos 11 Valente Conjugada con PD Contra la Colonización Pulmonar en Ratones OF1 Desafiados Intranasalmente con Serotipo 6B
En el presente ejemplo, evaluamos la eficacia terapéutica de una vacuna conteniendo un conjugado de polisacárido 11 valente y proteína D, antígeno neumolisina mutante atenuado (PdB, documento WO 90/06951) y adyuvantes AlPO_{4} + 3D-MPL, en comparación con la formulación clásica de conjugado adsorbido en AlPO_{4} de polisacárido 11 valente y proteína D.
Se inmunizaron grupos de 12 ratones hembra OF1 de 4 semanas de vida por vía subcutánea en los días 0 y 14 con formulaciones conteniendo A: 50 \mug AlPO_{4}; B: 0,1 \mug PS/serotipo de vacuna de polisacárido 11 valente conjugada con PD + 50 \mug AlPO_{4}; o C: 0,1 \mug PS/serotipo de vacuna de polisacárido 11 valente conjugada con PD + 10 \mug PdB (provisto por J. Paton, Children's Hospital, North Adelaide, Australia) + 50 \mug AlPO_{4} + 5 \mug 3D-MPL (suministrado por Ribi Immunochem). El desafío se realizó en el día 21 como se describió anteriormente.
Como se muestra en la Figura 1C, la vacuna de conjugado de polisacárido 11 valente suplementada con PdB y con adyuvante AlPO_{4} + MPL confirió una protección muy significativa (p<0.007) (las barras negras representan la media aritmética). Por el contrario, no se observó protección significativa en animales inmunizados con la formulación de conjugado de polisacárido 11 valente/AlPO_{4}. Este resultado probó que el agregado de antígeno neumolisina (incluso atenuado) y adyuvante 3D-MPL mejora la eficacia de la vacuna de conjugado de polisacárido 11 valente contra la neumonía.
Ejemplo 4C
Correlatos Inmunes de la Protección Mostrada en el Ejemplo 4B
Con el fin de establecer los correlatos inmunes de protección conferida en el ejemplo 4B, por la vacuna de conjugado de polisacárido 11 valente suplementada con neumolisina mutante atenuada (PdB) y 3D-MPL, se midieron las respuestas de anticuerpo sérico a polisacárido 6B y PdB previo al desafío como se describió anteriormente.
Posteriormente se compararon los títulos de anticuerpos con los números de colonias de bacterias medidos en pulmones de los correspondientes animales recogidos 6 horas post desafío. Se calculó R^{2} en regresiones lineales Log/Log.
Las R^{2} fueron iguales a 0,18 y 0,02 para las respuestas de anticuerpo anti-PdB y anti-6B, respectivamente. Esto mostró la ausencia de correlación entre las respuestas inmunes humorales y la protección para ambos antígenos. Los títulos de anticuerpo anti-6B no fueron significativamente diferentes en los grupos inmunizados con la vacuna de conjugado 11 valente (GMT=0,318 ng/ml) o con la misma vacuna suplementada con PdD y 3D-MPL (GMT=0,458 ng/ml). Por lo tanto, la mejor protección observada con la formulación C no se debió solamente a la respuesta de anticuerpos para polisacárido 6B más elevada.
Tomados conjuntamente, los resultados sugieren que la protección no está mediada sólo por las respuestas inmunes humorales, sino también por una inmunidad mediada por células inducida por el antígeno PdB en presencia de 3D-MPL. Esto respaldó aún más el agregado de antígeno(s) proteico(s) y adyuvante(s) potente(s) en la vacuna de conjugado de polisacáridos de neumococo, de manera tal de coordinar ambos brazos del sistema inmune para una protección óptima.
Ejemplo 5 Cooperación de Ambos Brazos del Sistema Inmune en Ratones Activamente Inmunizados con Neumolisina y Pasivamente Inmunizados con Anticuerpos Contra PS de Neumococo
Ejemplo 5A
Hallazgo de la Concentración Protectora Contra Neumonía del Anticuerpo Anti Polisacárido-6B (Anti-PS) Administrado Pasivamente Procedimiento
Grupos de Vacunas: Se inmunizaron pasivamente (i.p.) cuatro grupos de 16 ratones en el día -1 con 100 \mul de antisuero anti-polisacárido de rata sin diluir de acuerdo con los grupos detallados a continuación. (total 64 ratones)
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Animales: 64 ratones macho CD-1 de Charles River. Canada, con un peso aproximado de 35 g (aproximadamente 10 semanas de vida).
Anestesia: Los ratones se anestesiaron con isoflurano (3%) más O_{2} (1 l/min).
Organismo: Se cultivó S. pneumoniae N1387 (serotipo 6) a partir de placas de agar soya tripticasa (TSA) suplementado con 5% de sangre de caballo y suspendido en 6 ml de PBS. Inmediatamente previo a la infección, se diluyó 1 ml de suspensión bacteriana en 9 ml de agar nutritivo fundido frío (BBL) y se mantuvo a 41ºC. Los ratones recibieron aproximadamente 6,0 log 10 ufc/ratón en un volumen de 50 \mul.
Infección: se anestesiaron los ratones en el día 0 como se describió anteriormente y se infectaron con S. pneumoniae N1387 (50 \mul de suspensión bacteriana enfriada) por instilación intrabronquial vía intubación intratraqueal no quirúrgica. Este procedimiento fue descrito por Woodnut y Berry (Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43: 29 (1999)).
Muestras: En el día 3 post infección, se sacrificaron 8 ratones/grupo por sobredosis de CO_{2} y se excindieron los pulmones y se homogeneizaron en 1 ml de PBS. Se prepararon diluciones al décimo en PBS para enumerar las bacterias viables. Se inocularon muestras (20 \mul) por triplicado en placas de TSA suplementadas con 5% de sangre de caballo y se incubaron durante la noche a 37ºC previo a la evaluación. Las otras series de ratones se sacrificaron en el día 7 y se tomaron muestras como se explicó anteriormente.
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Resultados
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Conclusión: En general, no hubo diferencias significativas en el número de bacterias aisladas de cualquier grupo de tratamiento. Esto indica que no se alcanzó protección medible por los anti-polisacáridos a concentraciones de hasta e incluyendo 5 \mug/ml.
Esto es similar a lo observado en algunos ensayos clínicos con seres humanos, esto es, el anticuerpo anti-polisacárido es insuficiente para proteger a algunas poblaciones contra la neumonía por neumococo.
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Ejemplo 5B
Determinar la protección para neumonía alcanzada por administración activa de PLY (neumolisina) con o sin adyuvante, y sinergia con anticuerpo anti-PS subóptimo Procedimiento
Animales: 128 ratones CD-1 macho (6 semanas de vida en el momento de la inmunización, 10 semanas de vida en el momento de la infección) de Charles River, St. Constant, Quebec, Canada. Los animales pesaron aproximadamente 20 g a las 6 semanas y 38 g a las 10 semanas.
Inmunizaciones: Se inmunizaron seis grupos de 16 ratones por inyección subcutánea en los días -22 y -14 con 100 \mul de vacuna como se detalla a continuación. (Total 128 ratones). Se obtuvo PdB (documento WO 90/06951) por cortesía de Dr. James Paton, Australia. Se obtuvo 3D-MPL de Ribi/Corixa.
En el día -1 se inmunizaron (i.p. 100 \mul) grupos específicos (ver Tabla a continuación) pasivamente con una concentración de 4,26 \mug/ml (4 ml de 5 \mug/ml + 1,3 ml de 2 \mug/ml) de anticuerpo anti-polisacárido de ratón.
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Infección: Se anestesiaron los ratones en el día 0 (3% isoflurano más O_{2} 1 l/min). Se prepararon inóculos bacterianos a partir de un cultivo de S. pneumoniae N1387 (serotipo 6) a partir de placas de agar tripticasa soya (TSA) suplementado con 5% de sangre de caballo y suspendido en 6 ml de PBS. Se preparó una dilución al décimo (1 ml más 9 ml) en agar nutritivo fundido enfriado (mantenido a 41ºC) inmediatamente previo a la infección. Se infectaron los ratones por instilación intrabronquial vía intubación intratraqueal y recibieron aproximadamente 6,0 log 10 ufc/ratón en un volumen de 50 \mul. Este procedimiento fue descrito por Woodnut y Berry (Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43: 29 (1999)).
Muestras: A las 72 horas post infección, se sacrificaron se sacrificaron 8 ratones/grupo por sobredosis de CO_{2} y se excindieron los pulmones y se homogeneizaron en 1 ml de PBS. Se prepararon diluciones al décimo en PBS para enumerar las bacterias viables. Se inocularon muestras (20 \mul) por triplicado en placas de TSA suplementadas con 5% de sangre de caballo y se incubaron durante la noche a 37ºC previo a la evaluación. Las otras series de ratones se sacrificaron en el día 8 y se tomaron muestras como se explicó anteriormente.
Análisis de los Datos
La medida de resultados para comparación del tratamiento fue el número de bacterias en los pulmones en los días 3 y 7 post infección. Los resultados se presentan como medias de grupos con desviaciones estándar. El análisis estadístico se realizó usando la prueba-t de Student donde un valor de P <0,05 se considera significativo.
Resultados
72 horas Post Infección
Los recuentos bacterianos de los grupos 1-4 fueron significativamente inferiores (p<0,05) que aquellos de los grupos 1-3.
Los recuentos bacterianos de los grupos 1-4 fueron significativamente inferiores (p<0,05) que aquellos de los grupos 1-5.
168 horas Post Infección
El número de bacterias en todos los grupos fue aproximadamente 2 log inferior a los 8 días que a los 3 días, indicando que la infección se estaba resolviendo.
Los recuentos bacterianos de los grupos 1-2 fueron significativamente inferiores (p<0,05) a aquellos de los grupos 1-5.
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Como se demostró anteriormente, el anticuerpo anti polisacárido solo (grupo 1-5) no brinda protección contra el crecimiento de neumococos en el pulmón. PdB con adyuvante AlPO_{4} tampoco confiere protección, pero en el día 8 existe una tendencia hacia una protección cuando PdB se combina con 3D-MPL (grupo 1-2).
En el día 3, el grupo más significativamente protegido, grupo 1-4, tenía los tres elementos, PdB, 3D-MPL y anticuerpos anti polisacáridos administrado pasivamente. Esta conclusión está respaldada por la tasa de mortalidad. El grupo 1-4 tuvo sólo 2/8 muertes comparado con 5/10 para los grupos 1-5 y 1-3.
Conclusión
Como el experimento se realizó con animales inmunizados pasivamente, tampoco el efecto sinérgico de la inmunización activa con neumolisina y MPL puede deberse a un aumento en el nivel de anticuerpos contre el antígeno polisacárido.
Como los animales se inmunizaron sólo pasivamente contra polisacárido de neumococo, para el día 8 los niveles de tal anticuerpo deberían haber desaparecido del huésped.
Aún así, pudo observarse protección significativa contra la neumonía por neumococo en grupos inmunizados con neumolisina más 3D-MPL y especialmente en grupos inmunizados con neumolisina más 3D-MPL más anticuerpo anti polisacárido administrado pasivamente, indicando la sinergia de esta combinación.
Si la inmunización anti polisacárido se hubiera realizado activamente (de preferencia con polisacárido conjugado), el efecto podría haber sido aún más marcado, ya que el efecto de memoria de células B, y los niveles constantes de anticuerpos anti-PS deberían contribuir con la cooperación de la respuesta inmune (ver por ejemplo la Figura 1C donde muchos animales inmunizados activamente con polisacárido y proteína demostraron no tener bacterias en los pulmones tras el desafío).
Ejemplo 6 Inmunogenicidad en ratones Balb/C de 1 año de edad de la vacuna de conjugado de polisacárido de neumococo 11 valente y Proteína D con adyuvante 3D-MPL Introducción y Objetivo(s)
La protección contra la infección por neumococos está mediada por anticuerpos específicos de serotipo a través de opsonofagocitosis. Se puede suponer que aumentos en la concentración de anticuerpos darían como resultado una protección mayor, y por lo tanto se ha invertido mucho esfuerzo en hallar formas para aumentar la respuesta humoral. Una estrategia que se aplicó con éxito para vacunas conjugadas en estudios preclínicos es el uso de adyuvantes inmunoestimulantes (revisión por Poolman y col. 1998, Carbohydrate-Based Bacterial Vaccines. En: Handbook of Experimental Pharmacology eds. P. Perlmann y H. Wigsell. Springer-Verlag, Heidelberg, D).
Los datos presentados en esta sección muestran los resultados del último experimento usando lotes clínicos en un protocolo diseñado para imitar un ensayo clínico.
Protocolo
Se inmunizaron ratones Balb/C de un año de edad con un décimo de la dosis para seres humanos de vacuna de conjugado de polisacárido de neumococo y proteína D, o vacuna de polisacárido pleno 23 valente. Las vacunas usadas fueron lotes clínicos DSP009, DSP013 o DSP014 correspondientes a la dosificación de 1 \mug de serotipos 6B y 23F y 5 \mug de los restantes serotipos de la vacuna conjugada 11 valente, la dosificación de 0,1 \mug de la vacuna conjugada 11 valente, o la dosificación de 0,1 \mug de la vacuna conjugada 11 valente con 5 \mug de adyuvante 3D-MPL, respectivamente. A todas las vacunas conjugadas 11 valentes se les agregó como adyuvante 50 \mug de AlPO_{4}.
Se inmunizaron grupos de 20 ratones por vía intramuscular. Las inyecciones de los grupos que se presentan en la siguiente tabla se realizaron en los días 0 y 21. Se obtuvieron muestras de sangre en el día 35, (14 días tras la segunda dosis).
TABLA Calendario de Inmunización para ratones Balb/C de 1 año de edad inmunizados con lotes clínicos de vacuna conjugada de polisacárido de neumococo y Proteína D.
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Se probaron los sueros mediante ELISA para anticuerpos IgG para polisacáridos de neumococo siguiendo el protocolo de consenso de CDC/WHO, esto es, tras la neutralización del suero con polisacárido de pared celular. Se calibró el ELISA para dar concentraciones de anticuerpos en \mug/ml usando anticuerpos monoclonales IgG1 específicos de serotipo.
Los análisis estadísticos de comparaciones se calcularon usando UNISTAT versión 5.0 beta. Se realizó el método ANOVA por el Tukey-HSD en concentraciones de IgG transformadas a log. Se realizó la comparación de a pares de las tasas de seroconversión usando la prueba exacta de Fisher.
Resultados
En la siguiente tabla se muestran la MGC de IgG y un intervalo de confianza de 95% contra los 11 serotipos y proteína D inducida 14 días tras la segunda inmunización (dosis 2). Las tasas de seroconversión se muestran donde no se pudo calcular un intervalo de confianza de 95%.
El grupo 1 muestra el efecto de la inmunización con polisacáridos plenos, que normalmente inducen sólo la producción de IgM en animales. La mayoría de los niveles de IgG están por debajo del umbral de detección; sin embargo los
ratones Balb/C fueron capaces de generar IgG contra unos pocos polisacáridos, principalmente serotipos 3, 19F y 14.
La inmunización con vacunas de conjugado indujo la producción de anticuerpos IgG con altas tasas de seroconversión contra todos los serotipos excepto 23F.
Se observó una respuesta dependiente de la dosis (grupo 4 vs grupo 2) sólo para los serotipos 7F y 19F, pero estas observaciones no fueron estadísticamente significativas. Se observó una mayor respuesta tras dos dosis (grupos b vs grupos a) para los serotipos 3, 6B, 7F y 19F, y PD, y estas observaciones fueron estadísticamente significativas en muchos casos con las 3 formulaciones.
Más interesante es el efecto de 3D-MPL. Dos dosis de la vacuna formulada con 3D-MPL (grupo 3b) indujeron la MGC más alta de IgG específica, y esto fue estadísticamente significativo para todos los serotipos excepto 23F, en cuyo caso tuvo una tasa de seroconversión significativamente más alta (p=0,02 grupo 3b vs 2b, prueba exacta de Fisher).
TABLA Media Geométrica [IgG] e Intervalos de Confianza de 95% para Serotipos Seleccionados de Neumococo y Proteína D en Ratones Balb/C de 1 año de edad 14 Días Post II Inmunización con Vacuna de Conjugado PS 11 valente-PD
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Conclusión
Los datos presentados aquí demuestran que el agregado de 3D-MPL a la vacuna de conjugado de polisacárido 11 valente de neumococo y Proteína D aumentó la respuesta inmune en ratones Babl/C ancianos para todos los serotipos probados.
En la mayoría de los casos, dos dosis de vacuna indujeron una media geométrica de concentración de IgG más alta que una sola dosis. Ya que esto no se observa usando vacuna de polisacáridos plenos, incluso en seres humanos, se considera una indicación de una respuesta inmune dependiente de células T y la inducción de memoria inmune.
Estos datos respaldan un esquema de administración de vacuna usando polisacáridos de neumococo conjugados con adyuvantes Th1 (de preferencia 3D-MPL), con el que se administran al menos dos dosis de vacuna con adyuvante, de preferencia separadas por 1-12 semanas y de más preferencia separadas por 3 semanas. Se considera a tal esquema de administración otro aspecto de la invención.
Los ratones usados en el experimento eran no respondedores a PS 23 (pleno o conjugado). Resulta interesante que aunque los niveles de anticuerpos contra el polisacárido se mantuvieron bajos sin importar la composición de vacuna usada, muchos más ratones respondieron a PS 23 cuando se usó como adyuvante 3D-MPL (la seroconversión fue significativamente más elevada). El uso de adyuvantes Th1, particularmente 3D-MPL, en composiciones de vacunas que comprenden polisacáridos de neumococos conjugados con el fin de solucionar la falta de respuesta frente al polisacárido de neumococo en una vacuna es aún otro aspecto de la invención. Un procedimiento para solucionar la falta de respuesta con la composición anteriormente mencionada usando el esquema de administración de dos dosis es aún otro aspecto.
Ejemplo 7 Conjugado de Polisacárido de Neisseria Meningitidis C-Proteína D (PSC-PD) A: Expresión de la Proteína D
Como para el Ejemplo 1.
B: Fabricación del Polisacárido C
La fuente de polisacáridos del grupo C es la cepa C11 de N. meningitidis. Ésta fermenta usando técnicas clásicas de fermentación (documento EP 72513). Los polisacáridos en polvo seco usados en el procedimiento de conjugación son idénticos a Mencevax (SB Biologicals s.a.).
Se descongela una alícuota de la cepa C11 y se siembra en una placa de petri con medio Mueller Hinton suplementado con dializado de extracto de levadura (10%, v/v) y se incuba durante 23 a 25 horas a 36ºC en un incubador con aire saturado de agua.
Posteriormente se resuspende el crecimiento en superficie en medio de fermentación esterilizado y se inocula con esta suspensión en una botella Roux conteniendo medio Mueller Hinton suplementado con dializado de extracto de levaduras (10%, v/v) en perlas de vidrio estériles. Tras la incubación de la botella Roux durante 25 horas a 36ºC en un incubador con aire saturado de agua, se resuspende el crecimiento de superficie en 10 ml de medio de fermentación estéril y 0,2 a 0,3 ml de esta suspensión se inoculan en otras 12 botellas de Roux de medio Mueller Hinton.
Tras incubar durante 23 a 25 horas a 36ºC en un incubador con aire saturado de agua, se resuspendió el crecimiento de superficie en 10 ml de medio de fermentación estéril. Se combinó la suspensión bacteriana en un matraz cónico.
Posteriormente se transfirió esta solución asépticamente al fermentador usando jeringas estériles.
La fermentación del meningococo se realiza en fermentadores dentro de una habitación limpia bajo presión negativa. Generalmente la fermentación se completa tras 10-12 horas correspondiendo a aproximadamente 10^{10} bacterias/ml (es decir la fase estacionaria temprana) y se detecta por el aumento de pH.
En esta etapa, se inactiva el cultivo completo por medio de calor (12 min a 56ºC) previo a la centrifugación. Previamente y tras la inactivación, se toma una muestra y se siembra en placas de petri con medio Mueller Hinton.
C: Purificación de PS
El procedimiento de purificación es un procedimiento de múltiples etapas que se realiza en todo el cultivo de fermentación. En una primera etapa de purificación se clarifica el cultivo inactivado por centrifugación y se recupera el sobrenadante.
La purificación de polisacáridos se basa en la precipitación con una sal de amonio cuaternario (Bromuro de Cetiltrimetilamonio/CTAB, CETAVLON R). CTAB forma complejos insolubles con polianiones tales como polisacáridos, ácido nucleico y proteínas dependiendo de su pI. Siguiendo condiciones iónicas controladas, este procedimiento puede usarse para precipitar impurezas (conductividad baja) o polisacáridos (conductividad alta).
Los polisacáridos incluidos en el sobrenadante clarificado precipitan usando tierra de diatomeas (CELITE^{R} 545) como matriz para evitar la formación de masa inerte insoluble durante las diferentes precipitaciones/purificaciones.
Esquema de purificación para polisacárido C de N. meningitidis:
Etapa 1: fijación de complejo PSC-CTAB en CELITE^{R} 545 y eliminación de restos celulares, ácidos nucleicos y proteínas lavando con CTAB 0,05%.
Etapa 2: Elución de PS con EtOH 50%. Se descartan las primeras fracciones que son turbias y contienen impurezas y LPS. Se verifica la presencia de PS en las siguientes fracciones mediante prueba de floculación.
Etapa 3: refijación de complejo PS-CTAB en CELITE^{R} 545 y eliminación de ácidos nucleicos más pequeños y proteínas mediante lavado con CTAB 0,05%.
Etapa 4: Elución de PS con EtOH 50%. Se descartan las primeras fracciones turbias. Se verifica la presencia de PS en las siguientes fracciones mediante prueba de floculación.
Se filtra el eluato y se recoge el filtrado conteniendo polisacárido bruto.
Se precipita el polisacárido del filtrado agregando etanol hasta una concentración final de 80%. Posteriormente se recupera el polisacárido como un polvo blanco, se seca bajo vacío y se almacena a -20ºC.
D: Conjugación de CDAP Conjugación de PSC y PD
Para la conjugación de PSC y PD se prefirió la tecnología de conjugación con CDAP a la activación clásica con CNBr y acoplamiento por medio de un espaciador a la proteína vehículo. Primero se activa el polisacárido por cianilación con tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino-piridinio (CDAP). CDAP es un reactivo de cianilación soluble en agua en el que la electrofilicidad del grupo ciano está aumentada sobre la de CNBr, permitiendo la reacción de cianilación bajo condiciones relativamente suaves. Tras la activación, el polisacárido puede acoplarse directamente a la proteína vehículo a través de sus grupos amino sin introducir ninguna molécula espaciadora. Los grupos estercianato sin reaccionar se templan por medio de una reacción extensiva con glicina. Se reduce el número total de etapas involucradas en la preparación de vacunas de conjugado y lo más importante es que en el producto final no están presentes moléculas espaciadoras potencialmente inmunogénicas.
La activación de polisacáridos con CDAP introduce un grupo cianato en los polisacáridos y se libera dimetilaminopiridina (DMAP). El grupo cianato reacciona con grupos NH_{2} en la proteína durante el subsiguiente proceso de acoplamiento y se convierte en un carbamato.
Activación de PSC y acoplamiento de PSC-PD
La activación y el acoplamiento se realizan a 25ºC.
Se disuelven 120 mg de PS durante al menos 4 horas en WFI.
Se agrega solución de CDAP (100 mg/ml de acetonitrilo recién preparado) para alcanzar una relación CDAP/PS (p/p) de 0,75.
Tras 1 minuto 30, se eleva el pH hasta el pH de activación (pH 10) por el agregado de trietilamina y se estabiliza hasta el agregado de PD.
A los 3 minutos 30, se agrega NaCl hasta una concentración final de 2M.
A los 4 minutos, se agrega PD purificada hasta alcanzar una relación PD/PS de 1,5/1; se ajusta inmediatamente el pH hasta el pH de acoplamiento (pH 10). Se deja la solución durante 1 hora bajo regulación del pH.
Templado
Se agregan 6 ml de una solución de glicina 2M a la mezcla de PS/PD/CDAP. Se ajusta el pH hasta el pH de templado (pH 8,8). Se agita la solución durante 30 min a la temperatura de trabajo, posteriormente se deja durante la noche a +2 -8ºC con agitación lenta continua.
\global\parskip0.980000\baselineskip
Purificación de PS-PD
Tras la filtración (5 \mum), se purifica el conjugado PS-PD en un ambiente frío por cromatografía de permeación con gel en un gel S400HR Sephacryl para eliminar moléculas pequeñas (incluyendo DMAP) y PD no conjugada: Elución-NaCl 150 mM-pH 6,5; Control-UV 280 nm, pH y conductividad.
En base a los diferentes tamaños moleculares de los componentes de la reacción, los conjugados PS-PD se eluyen primero seguidos por PD libre y finalmente DMAP. Se combinan las fracciones conteniendo conjugado detectado por DMAB (PS) y \muBCA (proteína). Las fracciones combinadas se esterilizan por filtración (0,2 \mum).
E: Formulación de vacuna de conjugado PSC-PD adsorbida Lavado de AlPO_{4}
Con el fin de optimizar la adsorción del conjugado PSC-PD sobre AlPO_{4}, se lava el AlPO_{4} para disminuir la concentración de PO_{4}^{3-}:
- Se lava el AlPO_{4} con NaCl 150 mM y se centrifuga (4 veces);
- Posteriormente se resuspenden las pellas en NaCl 150 mM y se filtra (100 \mum); y
- Se esteriliza el filtrado por calor.
A este AlPO_{4} lavado se lo llama WAP (fosfato lavado autoclavado).
Procedimiento de formulación
El grueso del conjugado PSC-PD se adsorbió sobre AlPO_{4} WAP previo a la formulación final del producto terminado. Se agitó el AlPO_{4} WAP con PSC-PD durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se ajustó el pH hasta 5,1 y se agitó la mezcla durante otras 18 horas a temperatura ambiente. Se agregó solución de NaCl hasta 150 nM y se agitó la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se agregó 2-fenoxietanol hasta 5 mg/ml y se agitó la mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente, posteriormente se ajustó el pH hasta 6,1.
Composición final/dosis
- PSC-PD: 10 \mug PS
- AlPO_{4} WAP: 0,25 mg Al^{3+}
- NaCl: 150 mM
- 2-fenoxietanol: 2,5 mg
- Agua para inyección: hasta 0,5 ml
- pH: 6,1
F: Información preclínica Inmunogenicidad del conjugado de polisacáridos en ratones
La inmunogenicidad del conjugado PSC-PD se evaluó en ratones Balb/C de 6- a 8- semanas de vida. Se inyectó el conjugado (no adsorbido) o el conjugado adsorbido sobre AlPO_{4} como una vacuna monovalente. Se midieron los anticuerpos anti-PSC por ELISA mientras que se analizaron los anticuerpos funcionales usando la prueba bactericida, ambos procedimientos basados en los protocolos del CDC (Centros para el Control y Prevención de Enfermedades, Atlanta, EEUU). Se presentan los resultados de dos experimentos diferentes realizados para evaluar la respuesta versus la dosis y el efecto del adyuvante (AlPO_{4}).
Experimento dosis-intervalo
En este experimento, se inyectaron ratones Balb/C dos veces (separadas por dos semanas) con PSC-PD. Se usaron cuatro dosis diferentes de conjugado formulado con AlPO_{4}: 0,1; 0,5; 2,5; y 9,6 \mug/animal. Se obtuvieron muestras de sangre de los ratones (10/grupo) en los días 14 (14 Post I), 28 (14 Post II) y 42 (28 Post II). Las medias geométricas de las concentraciones (MGCs) de anticuerpos específicos para polisacárido C medidos por ELISA se expresaron en \mug IgG/ml usando IgG purificada como referencia. Se midieron los anticuerpos bactericidad en sueros combinados y los títulos se expresaron como la inversa de la dilución capaz de matar el 50% de las bacterias, usando la cepa C11 de N. meningitidis en presencia de complemento de cría de conejo.
La dosis-respuesta obtenida muestra un plateau a partir de la dosis de 2,5 \mug. Los resultados indican que hay una buena respuesta al estímulo entre los días 14 Post I y 14 Post II. Los niveles de anticuerpos en el día 28 Post II son al menos equivalentes a aquellos en el día 14 Post II. Los títulos bactericidas de anticuerpos concuerdan con las concentraciones por ELISA y confirman la inmunogenicidad del conjugado PSC-PD.
\global\parskip0.990000\baselineskip
Efecto del adyuvante
En este experimento, se evaluó un lote de conjugado PSC-PD formulado con AlPO_{4}, se inyectó el conjugado pleno (sin adyuvante) para comparación. Se inyectaron 10 ratones/grupo dos veces, separadas por dos semanas, por vía subcutánea, con 2 \mug de conjugado. Se obtuvieron muestras de sangre en los días 14 (14 Post I), 28 (14 Post II) y 42 (28 Post II), y se midieron los títulos de anticuerpos funcionales por ELISA (sólo en los días 14 Post II y 28 Post II para la prueba bactericida). La formulación con AlPO_{4} induce títulos hasta 10 veces más elevados en comparación con las formulaciones sin adyuvantes.
Conclusiones
A partir de los resultados de los experimentos descritos anteriormente se pueden sacar las siguientes conclusiones:
- El conjugado PSC-PD induces una respuesta anamnésica demostrando que PSC, cuando está conjugado, se convierte en un antígeno dependiente de células T.
- Las concentraciones de anticuerpos anti-PSC medidas por ELISA correlacionan bien con los títulos de anticuerpos bactericidas mostrando que los anticuerpos inducidos por el conjugado PSC-PD son funcionales contra el serogrupo C de N. meningitidis
- Aproximadamente 2,5 \mug de conjugado adsorbido sobre AlPO_{4} parecen provocar una respuesta óptima de anticuerpos en ratones. La química de CDAP parece ser un procedimiento adecuado para fabricar conjugados PSC-PD inmunogénicos.
Ejemplo 8 Preparación de un Conjugado de Polisacárido de N. meningitidis Serogrupo A-PD
Se disuelve un polvo seco de polisacárido A (PSA) durante una hora en solución NaCl 0,2 M hasta una concentración final de 8 mg/ml. Posteriormente se fija el pH hasta un valor de 6 con HCl o NaOH y se termorregula la solución a 25ºC. Se agrega 0,75 mg CDAP/mg PSA (una preparación hasta 100 mg/ml de acetonitrilo) a una solución de PSA. Tras 1,5 minutos sin regulación de pH, se agrega NaOH 0,2 M para obtener un pH de 10. 2,5 minutos más tarde, se agrega proteína D (concentrada hasta 5 mg/ml) de acuerdo con una relación PD/PSA de aproximadamente 1. Se mantiene un pH de 10 durante el periodo de reacción de acoplamiento de 1 hora. Posteriormente, se agregan 10 mg de glicina (2 M pH 9,0)/mg PSA y se regula el pH en un valor de 9,0 durante 30 minutos a 25ºC. Posteriormente se conserva la mezcla durante la noche a 4ºC previo a la purificación por cromatografía de exclusión en columna (Sephacryl S400HR de Pharmacia). Primero eluye el conjugado, seguido por PD sin reaccionar y subproductos (DMAP, glicina, sales). Se recoge el conjugado y se esteriliza por filtración en una membrana de 0,2 \mum Sartopore de Sartorius.
Ejemplo 9 Caracterizaciones in vitro de los productos de los Ejemplos 7 y 8
Las características principales se resumen en la tabla a continuación:
21
Resultados in vivo
Como modelo animal se usaron ratones Balb/C para probar la inmunogenicidad de los conjugados. Los conjugados se adsorbieron sobre AlPO_{4} o Al(OH)_{3} (10 \mug de PS sobre 500 \mug de Al) o no se adsorbieron. Se inyectó a los ratones de la siguiente manera: 2 inyecciones con intervalos de dos semanas (2 \mug PS/inyección).
De estos resultados podemos concluir en primer lugar que PS libre tiene gran influencia en la respuesta inmune. Se obtuvieron mejores resultados con conjugados con menos de 10% PS libre. Las mejoras anteriores al procedimiento CDAP es otro aspecto de la invención.
La formulación es también importante. AlPO_{4} parece ser el adyuvante más adecuado en este modelo. Los conjugados inducen un efecto estimulante que no se observa cuando se inyectan sólo polisacáridos.
Conclusiones
Se obtuvieron conjugados de N. meningitidis A y C con una relación final PS/proteína de 1 y 0,6-0,7 (p/p) respectivamente. PS libre y vehículo libre estaban por debajo del 10% y 15% respectivamente. La recuperación de polisacáridos es mayor del 70%. Los conjugados de PSA y PSC obtenibles por medio del procedimiento anterior mejorado (optimizado) CDAP (sin tener en cuenta la proteína vehículo, pero de preferencia es proteína D) es otro aspecto de la invención.
Ejemplo 10 Preparación de un Conjugado de Polisacárido de H. influenzae b-PD
H. influenzae b es una de las causas principales de meningitis en niños con menos de 2 años de edad. Es bien conocido el polisacárido de H. influenzae (PRP) como un conjugado con el toxoide del tétanos (conjugado por reacción química desarrollada por J. Robbins). CDAP es un procedimiento químico mejorado. La siguiente es una descripción de las condiciones óptimas halladas de CDAP para conjugar PRP, de preferencia con PD.
Los parámetros que tienen influencia sobre la conjugación son los siguientes:
- La concentración inicial de polisacárido (que puede tener un doble impacto en los niveles finales de polisacárido libre y en la etapa de esterilización por filtración).
- La concentración inicial de la proteína vehículo.
- La relación inicial de polisacárido a proteína (que también puede tener el doble impacto en los niveles finales de polisacárido libre y en la etapa de esterilización por filtración).
- La cantidad de CDAP usada (por lo general en gran exceso).
- La temperatura de la reacción (que puede influenciar la descomposición del polisacárido, la cinética de la reacción y descomposición de los grupos reactivos).
- El pH de activación y acoplamiento.
- El pH de templado (que influencia el nivel de DMAP residual).
- El tiempo de activación, acoplamiento y templado.
Los autores de la presente invención hallaron que los 3 parámetros más críticos para optimizar la calidad del producto final son: la relación inicial de polisacárido/proteína; la concentración de polisacárido; y el pH de acoplamiento.
De esta manera se diseñó un cubo de reacción con las 3 condiciones anteriores como los tres ejes. Los puntos centrales (e intervalo de valores experimentados) para estos ejes fueron: relación PS/proteína - 1/1 (\pm0,3/1); [PS]=5 mg/ml (\pm2 mg/ml); y pH de acoplamiento = 8,0 (\pm 1,0 unidad de pH).
Los parámetros menos esenciales se fijaron como los siguientes: se usaron 30 mg de polisacárido; temperatura 25ºC.; [CDAP] = 0,75 mg/mg PS; pH titulado con NaOH 0,2M; pH de activación = 9,5; temperatura para activación = 1,5 minutos; temperatura de acoplamiento -1 hora; [proteína] = 10 mg/ml; pH de templado = 9,0; temperatura de templado = 1 hora; temperatura de disolución de PS en solvente = 1 hora en NaCl 2M; purificación en Sephacryl S-400HR eluido con NaCl 150 mM a 12 cm/hora; y esterilización por filtración con un SARTOLAB P20 a 5 ml/min.
Los datos considerados para establecer condiciones óptimas al fabricar productos dentro del cubo de reacción mencionado anteriormente fueron: datos de proceso - rendimiento máximo tras filtración, máximo nivel de proteína incorporada; y calidad de datos del producto - relación final PS/proteína, nivel de PS libre, nivel de proteína libre, niveles mínimos de DMAP residual (un producto de descomposición de CDAP).
Producto final de la filtración
El factor que afecta el producto tras la filtración es la interacción entre [PS] inicial y el pH de acoplamiento y la relación PS/proteína inicial. A bajas [PS] existe poca interacción con los últimos 2 factores y el resultado siempre es una buena filtrabilidad (aproximadamente 95% para todos los productos). Sin embargo, a concentraciones altas la filtrabilidad disminuye si el pH y la relación inicial aumenta ([PS] alta, relación más baja, pH más bajo = 99% filtración; pero [PS] alta, relación y pH más altos = 19% filtración).
Nivel de incorporación de la proteína
La proporción de la relación PS/proteína final con respecto a la relación inicial es una medida de la eficacia del acoplamiento. a [PS] alta, el pH no afecta la proporción de las relaciones. Sin embargo, la relación inicial sí lo hace (1,75 a relación inicial baja, 1,26 a relaciones iniciales altas). A [PS] baja, la proporción de relaciones es para la mayor parte más baja, sin embargo ahora el pH afecta más (pH bajo, relación baja = 0,96; pH bajo, relación alta = 0,8; pH alto, relación baja = 1,4; y pH alto, relación alta = 0,92).
Relación final PS/Proteína
La relación final depende de la relación inicial y de la [PS]. Las relaciones finales más amplias se obtienen con una combinación de relaciones iniciales altas y [PS] altas. El efecto del pH en la relación final no es tan significativo como una [PS] baja.
Nivel de proteína D libre
Las cantidades menores de proteína D se observan a pH alto y [PS] alta (niveles cercanos a 0,0). El efecto de la [PS] alta se hace especialmente marcado cuando el pH es bajo. La elevación de la relación inicial contribuye un poco al incremento de proteína D libre.
DMAP residual
La relación inicial no tiene un efecto significativo. En contraste, el nivel de DMAP aumenta con la [PS], y disminuye cuando se eleva el pH.
Conclusiones
Las condiciones de conjugación de mayor preferencia son por lo tanto las siguientes: pH de acoplamiento = 9,0; [PS] = 3 mg/ml; y relación inicial = 1/1. Con tales condiciones las características del producto final son las siguientes:
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Por lo tanto los conjugados de PRP obtenibles por el proceso mejorado (optimizado) CDAP anterior (sin tener en cuenta la proteína vehículo, pero de preferencia es proteína D) es otro aspecto de la invención.
Ejemplo 11 Proteína D como un antígeno - cómo puede mejorarse su eficacia protectora contra H. influenzae no tipificable por medio de la formulación con 3D-MPL
Se inmunizaron ratones Balb/C hembra (10 por grupo) (por vía intramuscular) con la vacuna de conjugado de polisacárido 11 valente de neumococo-proteína D por primera vez a las 20 semanas de vida (D0) y recibieron una segunda inmunización dos semanas más tarde (D14). Se tomaron muestras de sangre 7 días tras la segunda inmunización. Se midieron los títulos de anticuerpos contra proteína D en términos de cantidad de anticuerpos de tipo IgG1, IgG2a e IgG2b.
Se prepararon vacunas undecavalentes liofilizadas (sin AlPO_{4}) combinando los conjugados con 15,75% de lactosa, agitando durante 15 minutos a temperatura ambiente, ajustando el pH hasta 6,1 \pm 0,1, y liofilizando (el ciclo comenzando usualmente a -69ºC, ajustando gradualmente hasta -24ºC en 3 horas, posteriormente manteniendo esta temperatura durante 18 horas, ajustando posteriormente de forma gradual hasta -16ºC en 1 hora, manteniendo posteriormente esta temperatura durante 6 horas, ajustando posteriormente de forma gradual hasta +34ºC en 3 horas, y finalmente manteniendo esta temperatura durante 9 horas).
Las composiciones de las formulaciones y reconstituyentes para liofilizados se presentan en la Tabla 13.
Se sabe que la medida más característica de si se ha producido una respuesta inmune mediada por células de tipo Th1 está correlacionada con el nivel de anticuerpo IgG2a. Como puede verse a partir de los datos, el resultado es un gran incremento de IgG2a si se liofiliza proteína D con un adyuvante Th1 (en este caso 3D-MPL).
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(Tabla pasa a página siguiente)
23

Claims (14)

1. Una composición inmunogénica que comprende al menos un antígeno polisacárido de Streptococcus pneumoniae mezclado con al menos un antígeno proteico de Streptococcus pneumoniae o un equivalente inmunológicamente funcional del mismo, y un adyuvante que es de preferencia un adyuvante inductor de una respuesta TH1 y que comprende al menos uno de los siguientes: Monofosforil lípido A o un derivado del mismo, un inmunoestimulante saponina, o un oligonucleótido CpG inmunoestimulante.
2. La composición inmunogénica de la reivindicación 1, en la que el antígeno proteico es una proteína de superficie externa o una proteína secretada de Streptococcus pneumoniae o equivalentes inmunológicamente funcionales de las mismas.
3. La composición inmunogénica de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que el antígeno proteico es una toxina, adhesina o lipoproteína de Streptococcus pneumoniae o equivalentes inmunológicamente funcionales de las mismas.
4. La composición inmunogénica de las reivindicaciones 1-3, en la que el antígeno proteico o el equivalente inmunológicamente funcional del mismo se selecciona del grupo: neumolisina, PspA o variantes de deleción transmembrana de la misma, PspC o variantes de deleción transmembrana de la misma, PsaA o variantes de deleción transmembrana de la misma, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y CbpA o variantes de deleción transmembrana de la misma.
5. La composición inmunogénica de las reivindicaciones 1-4, en la que el antígeno polisacárido se presenta en la forma de un conjugado polisacárido-vehículo proteico.
6. La composición inmunogénica de la reivindicación 5, en la que la proteína vehículo se selecciona del grupo constituido por: toxoide de Difteria, toxoide del Tetanos, CRM197, Hemocianina de lapa (KLH), proteína derivada de Tuberculina (PPD) y proteína D de H. influenzae.
7. La composición inmunogénica como la reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la vacuna comprende al menos cuatro antígenos polisacáridos de neumococo de diferentes serotipos.
8. La composición inmunogénica como la reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el adyuvante comprende un adyuvante vehículo seleccionado del grupo constituido por: una emulsión de aceite en agua, liposomas y una sal de aluminio.
9. La composición inmunogénica como la reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para uso como un medicamento.
10. Una vacuna que comprende la composición inmunogénica de las reivindicaciones 1-8.
11. El uso de un antígeno polisacárido de neumococo mezclado con un antígeno proteico de Streptococcus pneumoniae, y un adyuvante inductor de TH1 que comprende al menos uno de los siguientes: Monofosforil lípido A o un derivado del mismo, un inmunoestimulante saponina, o un oligonucleótido CpGI inmunoestimulante, en la fabricación de un medicamento para la prevención de neumonía en pacientes con más de 55 años de edad.
12. El uso de un antígeno polisacárido de neumococo mezclado con un antígeno proteico de Streptococcus pneumoniae, y un adyuvante inductor de TH1 que comprende al menos uno de los siguientes: Monofosforil lípido A o un derivado del mismo, un inmunoestimulante saponina, o un oligonucleótido CpG inmunoestimulante, en la fabricación de un medicamento para la prevención o alivio de la otitis media en infantes.
13. Un procedimiento para fabricar la composición inmunogénica de las reivindicaciones 1-9, que comprende las etapas de:
Seleccionar uno o más antígeno(s) polisacárido(s) de neumococo;
Seleccionar uno o más antígeno(s) proteico(s) de neumococo;
Seleccionar un adyuvante inductor de TH1 que comprende al menos uno de los siguientes: Monofosforil lípido A o un derivado del mismo, un inmunoestimulante saponina, o un oligonucleótido CpG inmunoestimulante; y mezclar dichos antígenos polisacárido y proteico y adyuvante con un excipiente adecuado.
14. La composición inmunogénica como la reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, la vacuna de la reivindicación 10, el uso de las reivindicaciones 11 ó 12, o el procedimiento de la reivindicación 13, en la que el adyuvante inductor de TH1 comprende 3D-MPL.
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