CZ301445B6 - Imunogenní prostredek, obsahující alespon jeden polysacharidový a alespon jeden proteinový antigen mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae a adjuvans - Google Patents

Abstract

Imunogenní prostredek, který obsahuje alespon jeden polysacharidový antigen mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae, alespon jeden proteinový antigen mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae nebo jeho imunologicky funkcní ekvivalent a adjuvans, vyvolávající odezvu TH1, pricemž jde o alespon jednu látku ze skupiny monophosporyllipid A nebo jeho derivát, saponinový imunostimulant nebo imunostimulacní oligonukleotid CpG.

Description

Imunogenní prostředek, obsahující alespoň jeden polysacharidový a alespoň jeden proteinový antigen mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae a adjuvans

Oblast techniky

Vynález se týká imunogenního prostředku, tj. vakcíny, která obsahuje polysacharidový antigen mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae, proteinový antigen mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae a pomocný prostředek, adjuvans, vyvolávající odezvu TH1.

io

Imunogenní prostředky podle vynálezu jsou zvláště vhodné pro léčení zápalu plic u starších lidí.

Dosavadní stav techniky

Mikroorganizmus Streptococcus pneumoniae je gram-pozitivní bakterie odpovědná za značnou nemocnost a úmrtnost (zvláště u malých dětí a přestárlých lidí), která způsobuje invazivní onemocnění, jako je zápal plic, bakteriémie a meningitida a onemocnění spojené s kolonizací, jako je akutní zánět středního ucha. Četnost pneumokokového zápalu plic v USA se u lidí ve stáří 60 let odhaduje na 3 až 8 osob ze 100 000. Ve 20 % případů vede k bakteriemi! a kjiným projevům meningitidy s úmrtností 30 %, a to dokonce i v případech léčby antibiotiky.

Mikroorganizmus Pneumococcus obsahuje kapsuli s chemicky vázaným póly sacharidem, který odpovídá za sérotypovou specifitu. Existuje 90 známých sérotypů pneumokoků a kapsule před25 stavuje u pneumokoků hlavní determinantu viru tence, protože kapsule nejenom chrání vnitřní povrch bakterie před komplementem, aleje také sama slabě imunogenní. Polysacharidy jsou antigeny nezávislé na T-buňkách a mohou se zpracovat a prezentovat na molekulách MHC, aby mohly integrovat s T-buňkami. Tyto antigeny mohou stimulovat imunitní systém pomocí alternativního mechanizmu, kteiý zahrnuje zesítění povrchových receptorů na buňkách typu B.

V několika experimentech se ukázalo, že ochrana proti invazivnímu pneumokokovému onemocnění nejsilněji koreluje s protilátkami specifickými pro kapsuli a ochrana je sérotypově specifická.

Vakcíny založené na polysacharidovém antigenu jsou dobře známy v oboru. Čtyři z nich je možné použit při aplikací lidem a zahrnují polysacharid Vi mikroorganizmu Salmonella typhi, polysacharid PRP z mikroorganizmu Haemophilus influenzae, tetravalentní meningokokovou vakcínu složenou ze sérotypů A, C, W135 a Y a 23-valentní pneumokokovou vakcínu složenou z polysacharidů odpovídajícím sérotypů 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9a, 9V, 10A, 1 IA, 12F, 14, 15B, 17F,

18C, 19A, 19F, 20,22F, 23F a 33 (započítává se alespoň 90 % krevních izolátů pneumokoků).

Tři vakcíny jsou schopny zaručit ochranu proti bakteriím, které způsobují respirační infekce, které vedou k vážnému onemocnění a k úmrtí kojenců. Tyto vakcíny však nejsou zatím určeny pro děti mladší dvou let, protože pro děti v tomto věku nejsou adekvátně imunogenní (popisuje se v publikaci Peltota et al., (1984), N. Engl. J. Med. 310: 1561-1566). Mikroorganizmus Streptococcus pneumoniae běžně způsobuje invazivní bakteriální onemocnění a zánět středního ucha kojenců a malých dětí. Podobně staří lidé velmi slabě odpovídají na pneumokokové vakcíny (popisuje se v publikaci Roghmann et al., (1987), J. Gerontoi. 42: 265-270), protože u této populace dochází ke zvýšenému výskytu bakteriálního zánětu plic (Vergese and Berk, (1983)

Medicine (Baltimore) 62: 271-285).

Strategie, které se navrhly, aby se překonala imunitní nedostatečnost u kojenců, zahrnují navázání polysacharídu na velké imunogenní proteiny, které pomáhají T-buňkám a které vyvolávají imunologickou paměť proti polysacharidovému antigenu, na který je vázán. U pneumokokových glykoproteinových konjugačních vakcín se v současné době hodnotí bezpečnost, imunogennost a účinnost u různých věkových skupin.

A) Pneumokokové polysacharidové vakcíny

23-vaIentní nekonjugovaná pneumokoková vakcína ukazuje široké rozmezí klinické účinnosti. Je to od 0 do 81 % (popisuje se v publikaci Fedson et al., (1994) Arch Intem Med. 154: 2531-2535). Ukazuje se, že účinnost se vztahuje na skupinu, která se imunizuje, jako jsou přestárlí lidé, lidé trpící Hodgkinovou nemocí, onemocněním srpkovitých buněk a gammaglobuío linemií a lidí po splenektomii (popisuje se v publikaci Fine et al., (1994), Arch. Intem. Med. 154:

2666-2677), a také je spojena s projevy onemocnění. 23-valentní vakcína nedemonstruje ochranu proti zápalu plic způsobeným pneumokoky (v jistých velmi rizikových skupinách, jako jsou přestárlí) a zánětu středního ucha.

Existuje proto potřeba zlepšit pneumokokové vakcinační kompozice, zvláště ty, které budou účinnější při prevenci nebo zlepšení pneumokokového onemocnění (zvláště při zápalu plic) u přestárlých lidí a malých dětí.

Vynález popisuje takovou optimalizovanou vakcínu,

B) Vybraný pneumokokový polysacharidový konjugát + kompozice 3D-MPL

Obecně se přijímá, že účinnost ochrany běžné nekonjugované pneumokokové vakcíny se více či méně vztahuje ke koncentraci protilátek indukovaných po vakcinaci. Skutečně 23 polysachari25 dům se udělila licence pro aplikaci lidem (popisuje se v publikaci Ed. Williams et al., New York Academy of Sciences 1995 pp. 241-249). Proto další zesílení protilátkové odezvy na pneumokokové polysacharidy by mohlo zvýšit procento kojenců a přestárlých lidí, kteří odpovídají ochrannou hladinou protilátek na první injekci s póly sacharidem nebo póly sacharidovým konjugátem a mohla by se snížit dávka a počet injekcí požadovaných k indukci ochranné imunity na infekci způsobenou mikroorganizmem Streptococcus pneumoniae.

Od začátku dvacátých let tohoto století se provedly experimenty s velkým počtem sloučenin, které se mohou přidat k antigenům, aby zlepšily jejich imunogenitu ve vakcinačních prostředcích (popisuje se v publikaci M. F. Powell and M. J. Newman, Plenům Press, NY, „Vaccine Design

- the Subunit and Adjuvant Approuch“ (1995), Chapter 7, „A Compendium of Vaccine

Adjuvants and Excipients“). Rada z nich je velmi účinná, ale způsobují podstatné lokální a systémové nežádoucí reakce, které brání jejich použití jako lidské vakcinační prostředky. Adjuvans založené na hliníku (jako je alum, hydroxid hlinitý nebo fosforečnan hlinitý), poprvé popsané v roce 1926, zůstávají pouze imunologické adjuvans používané v lidských vakcínách, které získaly licenci v USA.

Adjuvans založené na hliníku jsou příklady třídy nosičových adjuvans, která pracuje na základě depotního účinku. Antigen se absorbuje na jeho povrch a když se kompozice zavede injekcí, adjuvans a antigen se ihned rozptýlí do krevního proudu, místo aby kompozice zůstala v místě zavedení injekce a tak se zesílí imunitní odezva. Takové adjuvans vykazuje další známou výhodu. Je vhodné jako stabilizující činidlo pro látky náchylné k rozkladu, jako jsou například některé polysacharidové antigeny.

3D-MPL je příklad nenosičového adjuvans. Jeho celý název je 3-O-deacylovaný monofosforyl50 lipid A (nebo 3-de-O-acylovaný monofosforyllipid A nebo 3-O-desacyl-4'-monofosforyllipid A). Zkratka 3D-MPL indikuje, že poloha 3 redukčního konce glukosaminu je de-O-acylována. Jeho příprava se popisuje v dokumentu GB 2 220 211 A. Chemicky je to směs 3-deacylo váného monofosforyllipidu A s 4, 5 nebo 6 acylovanými řetězci. Původně se vytvořil začátkem 1990, kdy metoda s 3-O-deacylátem 4'~monofosforylderivátu lipidu A (MPL) vedla ke vzniku mole55 kuly s dále utlumenou toxicitou, aniž došlo ke změnám její imunostimulační aktivity.

Sloučenina 3D-MPL se použije samotná jako adjuvans nebo, což je výhodné, v kombinaci s nosičovým adjuvans depotního typu, jako je hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý nebo emulze olej ve vodě. Antigen a 3D-MPL jsou v takových kompozicích obsazeny ve stejné určité struktuře, která umožňuje zavedení vyšší účinnosti antigenních a imunostimulačních signálů. Studie ukázaly, že 3D-MPL je schopný dále zesílit imunogennost antigenu absorbovaného na alum (popisuje se v publikaci Thoelen et al., Vaccine (1998) 16: 708-14, EP 689454—Β1). Takové kombinace se také preferují v dosavadním stavu techniky v případě antigenů, které jsou náchylné k adsorpcí (například bakteriální polysacharidové konjugáty), kde adsorpce na alum má io tendenci stabilizovat antigen. Většinou se používají precipitovaná adjuvans založená na hliníku. Jsou to jediná adjuvans, která se používají v současné době v USA jako lidské vakcíny. Vakcíny obsahující 3D-MPL v kombinaci s adjuvans založenými na hliníku jsou v oboru nejvýznamnější, protože se jednoduše vyvíjí a rychle se zavádí na trh.

MPL (který nemá acylovanou polohu 3) se vyvinul jako adjuvans s několika monovalentními polysacharidovými konjugačními vakcinačními antigeny. Současná injekce MPL ve fyziologickém roztoku zesiluje odezvu sérových protilátek v případě čtyř monovalentních póly sacharidových konjugátů: pneumokokální PS-6B toxoid tetanu, pneumokokální PS 12-toxoid diftérie a 5. aureus typ 5 a 5. aureus typ 8 konjugovaný s exotoxinem A organizmu Pseudomonas aeruginosa (Schneerson et al., J. Immunology (1991) 147: 2136-2140). Uvažuje se, že zesílené odezvy jsou antigenně specifické. MPL v emulzi olej ve vodě (nosičovy typ adjuvans) konzistentně zesiluje účinek MPL ve fyziologickém roztoku, což je způsobeno přítomností MPL a antigenu ve stejné určité struktuře a považuje se za adjuvanční systém první volby pro optimální zavedení jiných polysacharidových konjugačních vakcín.

V publikaci Devi et ak, Infect. Immun. (1991) 59: 3700-7 hodnotí účinek adjuvans MPL (který nemá acylovanou polohu 3) ve fyziologickém roztoku na myší protilátkovou odezvu na konjugát TT kapsulámího monosacharidu organizmu Cryptococcus neoformans. Když se MPL použil souběžně s konjugátem, objevil se pouze nevýznamný nárůst odezvy specifické pro IgM a IgG ne

PS. MPL však měl daleko větší účinek, když se aplikovat 2 dny po konjugátu. Diskutuje se praktičnost použití imunizačního schématu, které vyžaduje oddálení aplikace MPL relativně k antigenu zvláště u novorozenců. Adjuvanční účinek MPL s polysacharidy a konjugáty polysacharid-protein se jeví být závislý na kompozici. Začlenění MPL do vhodných zaváděcích systémů s pomalým uvolňováním (například použití nosičového adjuvans) poskytuje trvalý adju35 vanční účinek a lze tak obejít problémy načasování a oddálení aplikace.

V obecném případě platí, že v případě určitého polysacharidu nebo konjugátu polysacharidu a antigenu, kde se jako adjuvans používaná MPL nebo 3D-MPL, je výhodné použít spojení s nosičovým adjuvans (například adjuvans založené na hliníku) za účelem maximalizovat jeho imunostimulační účinek.

Překvapivě se zjistilo, že v případě jistých pneumokokových polysacharidových konjugátů, imunogennost vakcinační kompozice je podstatně vyšší, když se antigen spojí se samotným 3D-MPL spíše, než s 3D-MPL ve spojení s nosičovým adjuvans (jako je adjuvans založené na hliníku). Pozorované zlepšení závisí na koncentraci použitého 3D-MPL a zda konjugáty jsou v monovalentní kompozici nebo zda se kombinují za vzniku polyvalentní kompozice.

C) konjugáty bakteriálního polysacharidu - proteinu D

Jak se zmiňuje shora v textu, vakcíny založené na póly sacharidovém antigenu jsou dobře známy v oboru. Polysacharidové vakcíny s udělenou licencí uvedené shora v textu demonstrují odlišnou klinickou účinnost. Účinnost Vi polysacharidové vakcíny se stanovila mezi 55 a 77 % při prevenci břišního tyfu (popisuje se v publikaci Plotkin and Cam, (1995) Arch. Intem. Med. 155: 2293— 99). Ukázalo se, že vakcína obsahující memingokokový polysacharid C vykazuje účinnost 79 % za podmínek epidemie (popisuje se v publikaci De Wals P, et al., (1996) Bull World Health

-3CZ 301445 B6

Organ. 74: 407-^111). 23-valentní pneumokoková vakcína vykazuje široké rozmezí klinické účinnosti od 0 do 81 % (popisuje se v publikaci Fedson et al., (1994) Arch, Intem. Med. 154: 25312535). Jak se uvádí shora v textu, účinnost ochrany u pneumokokové vakcíny více nebo méně souvisí s koncentrací protilátek indukovaných po vakcinaci.

Mezi problémy spojené s vakcinací póly sacharidů patří skutečnost, že polysacharidy jsou slabě imunogenní. Strategie, která se navrhla, aby se obešla tato nedostatečnost imunogennosti zahrnuje navázání polysacharidu na velké vysoce imunogenní proteinové nosiče, které pomáhají Tbuňkám.

io

Příklady těchto uvedených vysoce imunogenních nosičů, které se v současnosti běžně užívají při produkci polysacharidových imunogenů zahrnují toxoid diftérie (DT nebo mutant CRM197), toxoid tetanu (TT), hemocyanin přílipkovitých plžů (K.LH) a čištěný proteinový derivát tuberkulinu (PPD).

Problémy spojené s běžně používanými nosiči

S každým z běžně používaných nosičů je spojena řada problémů, které zahrnují problémy při produkci konjugátů GMP a také imunologické charakteristiky konjugátu.

Navzdory běžnému použití těchto nosičů a jejich úspěch při indukci protilátkové odezvy proti polysacharidu jsou spojeny s několika nedostatky. Například je známo, že antigenní specifické imunitní odezvy se mohou potlačit (potlačení epitopu) přítomností předem existujících protilátek řízených proti nosiči, v tomto případě toxinu tetanu (popisuje se v publikaci Di John et al., (1989)

Lancet, 2: 1415-8). V populaci velmi vysoké procento lidí bude vykazovat předem existující imunitu jak proti DT tak proti TT, protože se lidé rutinně vakcinují těmito antigeny. V Anglii se například 95 % dětí vakcinovalo DTP vakcínou, která obsahuje DT a TT. V publikaci Sad et al., Immunology, 1991, 74: 223-227, Schutze et al., J. Immunol. 135: 4, 1985, 2319-2322 se popisuje problém potlačení epitopu v peptidových vakcínách aplikovaných zvířecím modelům.

Navíc v případě vakcín, které vyžadují pravidelné zesilující dávky, je pravděpodobné, že použití vysoce imunogeních nosičů, jako je DT a TT, potlačuje po několika injekcích protilátkovou odezvu na polysacharid. Tyto vícenásobné vakcinace mohou být doprovázeny nežádoucí reakcí, jako je oddálený typ hyperodezvy (DTH).

KLH je znám jako potentní imunogen a už se používá jako nosič v případě peptidů IgE v lidských klinických studiích. Pozorovaly se však určité nežádoucí reakce (reakce podobné DTH nebo IgE přecitlivělost) stejnějako se pozorovaly protilátkové odezvy proti protilátkám).

Výběr nosičového proteinu v případě vakcíny založené na polysacharidu vyžaduje rovnováhu mezi nezbytností použít nosič fungující u všech pacientů (široké rozeznání molekul MHC), indukcí silné protilátkové odezvy proti póly sacharidům a slabé protilátkové odezvy proti nosiči.

Nosiče, které se drive používaly v případě vakcín založených na polysacharidu, mají řadu nevý45 hod. Toje zvláště v kombinovaných vakcínách, kde potlačení epitopu je zvláště problematické, jestliže se použije stejný nosič pro různé polysacharidové antigeny. V dokumentu WO 98/51339, se použilo v kombinovaných vakcínách více nosičů, aby se obešel tento účinek.

Vynález popisuje nový nosič vhodný pro použití imunogenních konjugátů založených na poly50 sacharidu a póly peptídu, přičemž uvedené konjugáty se nepotýkají se shora uvedenými problémy.

Vynález dále popisuje protein D (EP 0 594 610 Bl) pocházející z organizmu Haemophilus influenzae nebo jeho fragmenty jako nosiče vhodné pro imunogenní kompozice založené na poly-4CZ 301445 B6 sacharidu, které zahrnují vakcíny. Použití tohoto nosiče je zvláště výhodné v kombinačních vakcín ach.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří imunogenní prostředek, který obsahuje alespoň jeden póly sacharidový antigen mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae, alespoň jeden proteinový antigen mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae nebo jeho imunologicky funkční ekvivalent a adjuvans, !0 vyvolávající odezvu TH1, přičemž jde o alespoň jednu látku ze skupiny monophosporyllipid A nebo jeho derivát, saponinový imunostimulant nebo imunostimulační olígonukleotid CpG.

A) Pneumokokové polysacharidové vakcíny

Vynález popisuje vakcinační prostředek obsahující alespoň polysacharidový antigen mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae (výhodný je konjugovaný) a proteinový antigen mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae nebo jeho imunologicky funkční ekvivalent a mimoto obsahuje adjuvans, vyvolávající odezvu TH1. Imunogenní prostředky podle vynálezu jsou zvláště vhodné při léčení zápalu plic u starších lidí.

Pneumokokové polysacharidové vakcíny (konjugované nebo nekonjugované) nejsou schopny chránit přestárlou populaci proti pneumonii. V této populaci výskyt této nemoci je velmi vysoký. Klíčový obranný mechanizmus proti pneumokokům je opsonofagocytóza (humorální B buňka/neutrofily zprostředkovaný jev způsobený produkcí protilátek proti pneumokokovému poly25 sacharidu, přičemž bakterie podléhá fagocytóze), avšak části, které se podílejí na opsonizačních mechanizmech jsou u přestárlých lidí porušeny, to znamená produkce superoxidu pomocí PMN (polymorfní jaderné buňky), produkce jiného druhu reaktivního kyslíku, mobilizace PMN, apoptóza PMN, deformabilita PMN. U přestárlých lidí může být také porušena proti látková odezva.

Na rozdíl od normálně přijatého dogma normální množství antikapsulámích póly sacharidových protilátek nemusí být účinné při kompletním odstranění bakterií. Pneumokoci mohou vstupovat do hostitelských buněk a obcházejí tuto část imunitního systému.

Je překvapivé, že současnou stimulací Části imunitního systému zprostředkovaného buňkami (například imunita zprostředkovaná T buňkou) vedle humorální části imunitního systému (zprostředkovaná B buňkou) vede k lepšímu odstranění pneumokoků z hostitele. To je objev, který povede obecně k prevenci (nebo léčbě) pneumokokové infekce, ale bude zvláště důležitý při prevenci (nebo léčbě) zápalu plic u přestárlých lidí, kde vakcíny založené na póly sacharidech nejsou účinné.

Zjistilo se, že obě části imunitního systému se mohou navzájem tímto způsobem podporovat, jestliže se s pneumokokovým proteinem (upřednostňuje se protein exprimovaný na povrchu pneumokoků nebo vylučovaný nebo uvolňovaný, který se může zpracovat nebo se prezentuje v kontextu třídy II a MHC třídy I na povrchu infikovaných savčích buněk) aplikuje pneumokokový polysacharid (výhodně konjugovaný). Ačkoli pneumokokový protein může samotný způsobit imunitu zprostředkovanou buňkami, také se zjistilo, že přítomnost adjuvans indukující odezvu Thl ve vakcinačním prostředku podporuje tuto část imunitního systému a překvapivě dále zesiluje synergii mezi oběma částmi imunitního systému.

B) Vybraný pneumokokový polysacharidový konjugát + kompozice 3D-MPL

Vynález dále také popisuje antigenní prostředek obsahující jeden nebo více pneumokokových polysacharidových konjugátů, kde se jako adjuvans použije 3D-MPL a následně neobsahuje adjuvans založené na hliníku, kde alespoň jeden z pneumokokových polysacharidových konjugá-5CZ 301445 B6 tuje podstatně více imunogenní v prostředcích, které obsahují 3D-MPL v porovnání s prostředky, které obsahují 3D-MPL ve spojení s adjuvans založeným na hliníku.

Preferovaná provedení vynálezu popisují antigenní prostředky obsahující konjugáty jednoho nebo více následujících pneumokokových kapsulámích polysacharidu: sérotyp 4, 6B, 18C, 19F a 23F. V takových prostředcích je každý z polysacharidů překvapivě více imunogenní, jestliže prostředek obsahuje samotný 3D-MPL, ve srovnání s prostředky, které obsahují 3D-MPL a adjuvans založené na hliníku.

io Pak jedno provedení vynálezu popisuje antigenní prostředek obsahující kapsulámí polysacharid mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae sérotyp 4, 6B, 18C, 19F nebo 23F konjugovaný s imunogenním proteinem a adjuvans 3D-MPL, kde prostředek v podstatě neobsahuje adjuvans založené na hliníku.

Další provedení vynálezu popisuje kombinaci antigenního prostředku, který v podstatě neobsahuje adjuvans založené na hliníku a obsahuje adjuvans 3D-MPL a dva nebo více pneumokokových polysacharidových konjugátů vybraných ze skupiny zahrnující sérotyp 4,6B, 18C, 19F a23F.

C) Konjugáty bakteriálního polysacharidu a proteinu D

Vynález popisuje polysacharidový konjugační antigen obsahující póly sacharidový antigen získaný z patogenní bakterie konjugovaný z proteinem z mikroorganizmu Haemophilus influenzae nebo jeho fragment. Navíc vynález popisuje polyvalentní vakcinační kompozici, kde jeden nebo více polysacharidových antigenů je konjugováno s proteinem D.

A) Pneumokokové polysacharidové vakcíny

Vynález popisuje zdokonalenou vakcínu zvláště vhodnou při prevenci nebo zlepšení pneumo30 kokové infekce přestárlých lidí (a/nebo kojenců a nemluvňat).

V souladu s vynálezem se pacient považuje za starého člověka, jestliže dosáhne 55 let a více.

V typickém případě je starší 60 let, preferuje se starší 65 let.

V hlavním provedení vynálezu se popisuje vakcinační prostředek vhodný pro aplikaci přestárlým lidem (a/nebo kojencům a nemluvňatům), který obsahuje alespoň jeden polysacharidový antigen mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae a alespoň jeden proteinový antigen mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae.

V tomto provedení vynálezu se popisuje vakcína (vhodná při prevenci zápalu plic u starých lidí), která obsahuje alespoň jeden polysacharidový antigen mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae a alespoň jeden proteinový antigen mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae a adjuvans Thl.

Předpokládá se, že taková vakcína se může také použít při léčbě pneumokokové infekce (například zánětu středního ucha) v jiných vysoce rizikových skupinách populace, jako jsou kojenci nebo nemluvňata.

Polysacharidové antigeny mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae podle vynálezu

V typickém případě vakcína mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae obsahuje polysacharidové antigeny (výhodné jsou konjugované), kde se polysacharidy získaly z alespoň čtyř sérotypů mikroorganizmus Pneumococcus. Výhodné jsou čtyři sérotypy zahrnují 6B, 14, 19F a23F. Výhodnější je, když prostředek zahrnuje alespoň 7 sérotypů. Jsou to například ty získané ze sérotypů 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F a 23F. Více se upřednostňuje, když prostředek zahrnuje alespoň

-6CZ 301445 B6 sérotypů. Například prostředek v jednom provedení vynálezu zahrnuje kapsulámí polysacharidy získané ze sérotypů 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F a 23F (výhodné jsou konjugované).

V preferovaném provedení vynálezu je zahrnuto alespoň 13 polysacharidových antigenů (výhodné jsou konjugované antigeny), ačkoli dále zahrnuje další polysacharidové antigeny, například 23 valentní (takové jako je sérotyp l, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9a, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20,22F, 23F a33F),

Jedenácti valentní antigenní kompozice popsaná shora v textu a vhodná pro vakcinaci přestárlých lidí (například pro prevenci zápalu plic) s výhodou zahrnuje sérotyp 8 a 12F (nejvíce se upředlo nostňuje sérotyp 15 a 22), přičemž tvoří 15-ti valentní vakcínu, zatímco v případě kojenců a nemluvňat (kde připadá v úvahu zánět středního ucha) je výhodné, aby vakcína zahrnovala sérotyp 6A a 19A, přičemž tvoří 13-ti valentní vakcínu.

Při prevenci/zlepšení zápalu plic u populace přestárlých lidí (ve věku nad 55 let) a zánětu středního ucha u kojenců (do 18-tého měsíce) a nemluvňat (v typickém případě odpovídá věku 18 měsíců až 5 let), vynález popisuje kombinaci multivalenčního polysacharidu mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae s proteinem mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae nebo s jeho imunologicky funkčním ekvivalentem.

Pneumokokové proteiny podle vynálezu

Termín „imunologicky funkční ekvivalent“ je peptid proteinu, který obsahuje alespoň jeden ochranný epitop z proteinů podle vynálezu. Takové epitopy jsou v charakteristickém případě povrchově exponované, vysoce konzervativní a mohou v hostiteli vyvolávat baktericidní proti25 látkovou odezvu nebo předcházejí toxickým účinkům. Je výhodné, aby funkční ekvivalent měl alespoň 15 a upřednostňuje se 30 nebo více nepřerušovaných aminokyselin z proteinu podle vynálezu. Nejvíce se upřednostňuje, aby se použily fragmenty, deleční proteiny, jako jsou jejich transmembránové deleční varianty (to znamená použití extrabuněčné oblasti proteinů), fúze, chemicky nebo geneticky detoxifikované deriváty a podobně s podmínkou, že jsou schopny vyvolat v podstatě stejnou imunitní odezvu jako přirozený protein.

Preferované proteiny podle vynálezu jsou takové pneumokokové proteiny, které se exponují na vnějším povrchu pneumokoků (jsou schopny být rozeznány hostitelským imunitním systémem během poslední části životního cyklu pneumokoků) nebo jsou to proteiny, které pneumokocí vylučují nebo uvolňují. Nej výhodnější je, když protein je toxin, adhezin, 2-komponent přenašeče signálu nebo lipoprotein mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae nebo jejich imunologicky funkční ekvivalenty.

Zvláště preferované proteiny, které jsou obsaženy v takové kombinační vakcíně, zahrnují:

pneumolyzín (s výhodou je detoxifikován chemickou cestou nebo mutací) (popisuje se v publikaci Mitchell et al., Nucleic. Acíds Res. 1990 Jul 11, 18(13): 410 „Comparison of pneumolysin genes and proteíns from Streptococcus pneumoniae type 1 and 2“. Mitchell et al., Biochim. Biophys. Acta 1989 Jan. 23, 1007(1): 67-72 „Expression ofthe pneumolysin gene in Escherichia coli\ rapid purification and biological properties“, WO 96/05859 (A. Cyanamíd), WO 90/06951 (Paton et al.,), WO 99/03884 (NAVA)), PspA a jeho transmembránové deleční varianty (US 5 804 193 - Briles et al.), PspC a jeho transmembránové deleční varianty (WO 97/09994 - Briles et al.,), PsaA a jeho transmembránové deleční varianty (popisuje se v publikaci Berry and Paton, Infect. Immun. 1996 Dec., 64(12): 5255-62 „Sequence heterogenity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae“), pneumokokové proteiny vázající cholin a jeho transmembránové deleční varianty, CbpA a jeho transmembránové deleční varianty (WO 97/41151, WO 99/51226), dehydrogenáza gfyceraldehyd-3-fosfátu (popisuje se v publikaci Infect. Immun. 1996 64: 3544), HSP70 (WO 96/40928), PcpA (popisuje se v publikaci Sanchez-Beato et al., FEMS Microbiol. Lett. 1998, 164: 207-14), protein podobný proteinu M (popisuje se v dokumentu EP 0 837 130) a adhezin 18 627 (popisuje se v dokumentu EP 0

834 568.

-7CZ 301445 B6

Proteiny používané podle vynálezu se s výhodou vybraly ze skupiny zahrnující pneumolyzín, PsaA, PspA, PspC, CbpA nebo kombinaci dvou nebo více takových proteinů. Vynález dále popisuje imunologicky funkční ekvivalenty takových proteinů (jak se definuje shora v textu).

V kompozici protein může pomáhat indukovat odezvu proti pneumokokovému onemocnění zprostředkovanou T buňkami, zvláště požadovanou ochranu proti zápalu plic, což spolupracuje s humorální částí imunitního systému, přičemž dochází k ínhibici invaze pneumokoky a ke stimulaci opsonofagocytózy.

Další výhoda použití proteinových antigenů je přítomnost dalších antigenů v procesu opsonofagocytózy a inhibice bakteriální adheze (jestliže se použije adhezín) nebo neutralizace toxinu (jestliže se použije toxin).

Vynález popisuje vakcínu organizmu Streptococcus pneumoniae, která obsahuje pneumokokový polysacharidový konjugát obsahující polysacharidové antigeny získané alespoň ze čtyř sérotypů, přičemž se upřednostňuje alespoň sedm sérotypů, více se upřednostňuje alespoň jedenáct sérotypů, a alespoň jeden, ale s výhodou dva proteiny mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae, S výhodou je jeden z proteinů pneumolyzín nebo PsaA nebo PspA nebo CpbA (nej výhodnější je detoxifikovaný pneumolyzín), Preferovaná kombinace obsahuje alespoň pneumolyzín nebo jeho derivát a PspA.

Jak se uvádí shora v textu, problém spojený s vakcinaci vakcínou obsahující polysacharidy, je skutečnost, že polysacharidy jsou slabé imunogeny. Aby se obešel tento problém, polysacharidy se mohou konjugovat s proteinovými nosiči, které poskytují pomoc T-buňkám. Proto, když vynález používá polysacharidy, jsou spojeny s proteinovým nosičem. Příklady takových nosičů, které se v současné době běžně používají při produkci polysacharidových imunogenů zahrnují toxoidy diftéríe a tetanu (DT, DT CRM197 a TT), hemocyanin plžů Keyhole Limpet (KLH), OMPC, pocházející z mikroorganizmu N. meningitidís a čištěné proteinové deriváty tuberkulinu (PPD).

S každým z těchto běžně používaných nosičů je však spojena rada problémů (popisuje se v sekci „Problems Associated with Commonly-Used carriers“ uvedené shora v textu).

Vynález popisuje nový nosič vhodný pro použití konstrukcí imunogenu založených na póly* sacharidu, které nevykazují tyto nevýhody. Preferovaný nosič v případě imunogenních prostředků (nebo vakcín) založených na pneumokokovém polysacharidu je protein D z mikroorganizmu Haemophilus influenzae (popisuje se v dokumentu EP 594 610-B) nebo jeho fragmenty. Fragmenty vhodné pro použití zahrnují fragmenty obsahující epitopy pomocných buněk T. Zvláště fragment proteinu D bude přednostně obsahovat N-terminální 1/3 proteinu.

Dále preferovaným nosičem pneumokokového polysacharidu je samotný pneumokokový protein (jak se definuje shora v textu v sekci „Pneumokokové proteiny podle vynálezu“).

Vakcíny podle vynálezu přednostně obsahují adjuvans. Vhodné adjuvans zahrnuje hlinité sole, jako je gel hydroxidu hlinitého (alum) nebo fosforečnan hlinitý), ale mohou také zahrnovat sole vápníku, železa nebo zinku nebo mohou zahrnovat nerozpustné suspenze acylovaného tyrozinu nebo acylované cukry, kationicky nebo anionicky derivatizované polysacharidy nebo polyfosfazeny.

Je výhodné adjuvans vybrat tak, aby vytvořilo preferenční indukční Činidlo odezvy typu TH1, což podporuje část imunitního systému zprostředkovaného buňkou.

-8CZ 301445 B6

Adjuvans, vyvolávající odezvu TH1

Velké množství cytokinů typu Thl vyvolává imunitní odezvy zprostředkované buňkou na daný antigen, zatímco velké množství cytokinů typu Th2 má tendenci vyvolat humorální imunitní odezvy na antigen.

Je důležité si pamatovat, že rozdíl imunitní odezvy typu Thl a Th2 není absolutní. Jedinec bude podporovat imunitní odezvu, která se popisuje jako převážně Thl nebo převážně Th2. Často je vhodné zvažovat rodiny cytokinů tak, jak je popsáno pro myší CD4+ v klonech T-buněk (jak se io popisuje v publikaci Mosmann, T. R. and Coffman, R. L. (1989) TH1 and TH2 cells: different pattems of lymphokine secretion lead do different functional properties. Annual Rewiew of

Immunology 7, p!45— 173). Tradičně odezvy typu Thl jsou spojeny s produkcí INF-γ a cytokinů 1L—2 T-Iymfocyty. T buňky neprodukují jiné cytokiny, které jsou spojeny s indukcí imunitní odezvy typu Thl, jako jsou například IL-12. Naopak odezva typu Th2 je spojena se sekrecí 11-4,

11-5, IL-6, IL-10. Vhodné adjuvantní systémy, které podporují převážně odezvu Thl zahrnují monofosfoiylový lipid A nebo jeho deriváty, zvláště 3-de-O-acylovaný monofosforyllipid A a kombinace monofosforyllipidu A, upřednostňuje se 3-de-O-acylovaný monofosforyllipid (3D-MPL) spolu se solí hliníku. Zesilovací systém zahrnuje kombinaci monofosforyllipidu A a derivát saponinu, zvláště v kombinaci QS21 a 3D-MPL, jak se popisuje v dokumentu

WO 94/00153 nebo méně reaktogenní prostředek, kde QS21 je zakalený cholesterolem, jak se popisuje v dokumentu WO 96/33739.

V dokumentu WO 95/17210 se popisuje zvláště silné adjuvans zahrnující QS21, 3D-MPL a tokoferol v emulzi olej ve vodě, což se považuje za preferovanou formulaci.

Vynález také popisuje způsob produkce vakcinační formulace obsahující směs proteinu podle vynálezu spolu s farmaceuticky přijatelným excipientem, jako je 3D-MPL.

Nemethylované oligonukleotidy obsahující CpG (WO 96/02555) jsou také výhodnými indukě30 nimi činidly odezvy TH1 a jsou vhodné pro použití podle vynálezu.

Zvláštní výhodné prostředky obsahují alespoň jeden konjugační pneumokokový polysacharid, alespoň jeden pneumokokový protein a adjuvans, vyvolávající odezvu THL

Indukce odezvy zprostředkované buňkou pneumokokovým proteinem (jak se popisuje shora v textu) a kooperace mezi oběma rameny imunitního systému se mohou podporovat za použití takového adjuvans Th—1, přičemž výsledek je zvláště účinná vakcína proti pneumokokovému onemocnění, zvláště proti pneumokokovému zápalu plic u přestárlých lidí.

Vynález dále popisuje imunogen nebo vakcínu, jak se popisuje v případě použití v medicíně.

Vynález dále popisuje prostředek, obsahující pneumokokový polysacharidový konjugát a adjuvans, vyvolávající odezvu TH1 (výhodně 3D-MPL) a schopný přeměnit sérum nebo indukovat humorální protilátkovou odezvu proti polysacharidovému antigenu v populaci lidí, kteří nereagují odezvou.

Je známo, že 10 až 30 % populace neodpovídá na polysacharidovou imunizaci (neodpovídá na více než 50 % sérotypů ve vakcíně) (popisuje se v publikaci Konradsen et al., Scand. J. ímmun. 40: 251 (1994), Rodriguez et al., JID, 173: 1347 (1996)). To může také být případě konjugačních vakcín (popisuje se v publikaci Musher et al., Clin. Inf. Dis. 27: 1487 (1998)). To může být zvláště vážné pro silně rizikovou oblast populace (kojence, nemluvňata a přestárlé).

Zjistilo se, že kombinace konjugovaného pneumokokového polysacharidu (který je náchylný k malé odezvě v určité populaci) s adjuvans, vyvolávajícím odezvu TH1 (popsaném v příslušné kapitole shora) může neočekávaně překonat skutečnost, že nedochází k odezvě. Upřednostňuje

-9CZ 301445 B6 se, aby se použilo adjuvans 3D-MPL a nejvíce se upřednostňuje 3D-MPL bez adjuvans založeném na hliníku (které stále poskytuje lepší odezvu). Vynález tak popisuje takové prostředky a dále popisuje metodu léčby lidí, kteří neodpovídají na pneumokokové póly sacharidy, aplikací takových prostředků. Dále vynález popisuje použití tohoto adjuvans při výrobě léčiva, které obsa5 huje konjugované pneumokokové polysacharidové antigeny, při léčbě (nebo ochraně proti) pneumokokovému onemocnění jednotlivců, jejichž imunitní systém neodpovídá na polysacharidový antigen.

Vakcínu podle vynálezu je možno využít například k prevenci nebo zlepšení stavu při zápalu plic io u přestárlých lidí. V tomto případě je zvláště výhodná vakcína, obsahující polysacharidový antigen Streptococcus pneumoniae, adjuvans, vyvolávající odezvu TH1 a pneumokokový protein.

Vakcínu podle vynálezu je rovněž možno použít k prevenci nebo zlepšení zánětu středního ucha u kojenců nebo batolat. Kojencům nebo batolatům se v tomto případě aplikuje bezpečné množství vakcíny obsahující polysacharidový antigen Streptococcus pneumoniae, proteinový antigen Streptococcus pneumoniae a adjuvans, vyvolávající odezvu ΤΗ I.

Ve výhodném provedení se polysacharidový antigen použije ve formě polysacharidového proteinového konjugátu.

Vakcinační prostředky podle vynálezu

Vakcinační prostředky podle vynálezu se mohou použít k ochraně nebo k léčbě savců, kteří jsou náchylní k infekci tak, že se aplikuje uvedená vakcína systémovou nebo mukozální cestou. Tyto aplikace mohou zahrnovat intramuskulámí, Íntraperitoneální, intradermální nebo podkožní injekci nebo mukozální aplikaci do orálního/zažívacího, respiračního, močopohlavního traktu. Preferuje se intranasální aplikace vakcín za účelem léčby zápalu plic nebo zánětu středního ucha (nasofaiyngeální zavedení pneumokoků může působit jako velmi účinná prevence nebo může odstranit utlumenou infekci v jejím velmi časném stádiu).

Množství konjugačního antigenu v každé vakcinační dávce se vybralo jako množství, které vyvolává imunoochrannou reakci bez podstatného nežádoucího vedlejšího účinku. Taková množství kolísá v závislosti na použitém imunogenu a jak se prezentuje. V obecném případě se očekává, že každá dávka bude obsahovat 0,1 až 100 pg polysacharidu, upřednostňuje se 0,1 až 50 pg, dále se upřednostňuje 0,1 až 10 pg, z čehož se nejvíce upřednostňuje rozmezí 1 až 5 pg.

Obsah proteinových antigenů ve vakcíně je v typickém případě v rozmezí 1 až lOOpg, upřednostňuje se 5 až 50 pg, nejvíce se upřednostňuje rozmezí 5 až 25 pg.

Optimální množství komponent v určité vakcíně se může zjistit ve standardních studiích, které zahrnují pozorování vhodných imunitních odezev u subjektů. Pak následuje počáteční vakcinace, kdy subjektu se aplikuje jedna nebo několik provokačních dávek v adekvátních časových úsecích.

Vakcinační prostředek se obecně popisuje v publikaci Vacci ne Design („The sub unit and adjuvant approuch“, eds. Powell M. F. and Newman M. J., (1995) Plenům Press New York). Kapsulazice do lipozómů se popisuje v publikaci Fullerton, US 4 235 877.

B) Prostředek obsahující vybraný pneumokokový polysacharidový konjugát + 3D-MPL

Termín „pneumokokové polysacharidové konjugáty podle vynálezu“ popisují ty konjugáty kapsulámích polysacharidu mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae, které jsou více imunogenní v kompozicích obsahujících 3D-MPL v porovnání s prostředky, které obsahují 3D-MPL ve spojení s adjuvans založeném na hliníku (například konjugáty sérotypu 4, 6B, 18C,

19Fnebo23F).

- lil.

Termín „v podstatě neobsahuje adjuvans založené na hliníku“ popisuje prostředek, který v podstatě neobsahuje adjuvans založené na hliníku (například hydroxid hlinitý a zvláště pak fosforečnan hlinitý) a způsobuje libovolné snížení imunogennosti pneumokokového polysacharidového konjugátu podle vynálezu ve srovnání s ekvivalentní kompozicí, která obsahuje 3D-MPL, aniž se přidá adjuvans založené na hliníku. Upřednostňuje se, aby antigenní prostředek obsahoval adjuvans, které obsahuje podstatné množství 3D-MPL. Množství adjuvans přidaného do dávky by mělo přednostně obsahovat méně než 50 pg, více se upřednostňuje méně než 30 pg, stále výhodnější je méně než 10 pg a nejvíce se preferuje, když se do antigenního prostředku podle vynálezu io nepřidá žádné adjuvans založené na hliníku.

Stanovení, zda pneumokokový polysacharidový konjugát je podstatně více imunogenní ve srovnání s prostředkem, který obsahuje 3D-MPL, ve srovnání s prostředkem, který obsahuje 3D-MPL ve spojení s adjuvans založeným na hliníku, se může provést způsobem popsaným v příkladu 2. Jako indikace, zda prostředek je podstatně více imunogenní, když obsahuje samotný 3D-MPL, poměr koncentrace GMC IgG (jak ^se stanovila v příkladu 2) mezi prostředky, které obsahují samotný 3D-MPL versus ekvivalentní prostředek obsahující 3D-MPL ve spojení s fosforečnanem hlinitým by mělo být víc jak 2, upřednostňuje se více jak 5, více se upřednostňuje víc než 7, stále více se upřednostňuje více jak 9 a nejvíce se upřednostňuje více než 14.

Mezí problémy spojenými s polysacharidovou vakcínou patří skutečnost, že polysacharidy jsou málo imunogenní. Strategie, která se navrhla, aby se obešla nedostatečnost imunogennosti, zahrnuje vazbu (spojení) póly sacharidu s velkými proteinovými nosiči, které pomáhají T buňkám, Preferuje se, aby pneumokokové polysacharidy podle vynálezu se vázaly na proteinový nosič, který pomáhá T-buňkám. Příklady takových nosičů, které se mohou použít zahrnují diftérie, mutant diftérie a toxoidy tetanu (DT, CRM197 a TT), hemocyanin přílipkovitých plžů (KLH), čištěný proteinový derivát tuberkulinu (PPD) a OMPC mikroorganizmu Neisseria meningitidis.

Protein D z mikroorganizmu Haemophihts influenzae (EP 0 594 610-B) nebo jeho fragmenty (sekce C) se používá jako imunogenní proteinový nosič pro pneumokokové polysacharidy podle vynálezu.

V jednom provedení antigenního prostředku podle vynálezu se popisuje pneumokokový poly35 sacharid sérotyp (PS)4 konjugovaný s imunogenním proteinem a spojený s adjuvans 3D-MPL, kde prostředek v podstatě neobsahuje adjuvans založené na hliníku. V dalších provedeních vynálezu antigenní prostředek obsahuje PS 6B, 18C, 19F nebo 23F konjugované s imunogenním proteinem a je formulován s adjuvans 3D-MPL, kde prostředek v podstatě neobsahuje adjuvans založené na hliníku.

V dalším provedení vynálezu se popisuje kombinace antigenního prostředku obsahující dva nebo více pneumokokových polysacharidových konjugátů ze skupiny PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F a PS 23F formulované s adjuvans 3D-MPL, kde prostředek v podstatě neobsahuje adjuvans založené na hliníku.

Imunogennost pneumokokových polysacharidových konjugátů podle vynálezu není v podstatě ovlivněna kombinací sjinými pneumokokovými polysacharidovými konjugáty (příklad 3). Vynález popisuje kombinaci antigenního prostředku, který obsahuje jeden nebo více pneumokokových polysacharidových konjugátů podle vynálezu v kombinaci s jedním nebo více pneumo50 kokovými polysacharidovými konjugáty, kde prostředek obsahuje adjuvans 3D-MPL, ale v podstatě neobsahuje adjuvans založené na hliníku.

V dalších provedeních vynálezu se popisuje kombinace antigenních prostředků, které obsahují alespoň jeden a přednostně 2, 3, 4 nebo všech pět pneumokokových polysacharidových konjugátů PS 4, 6B, 18C, 19F nebo 23F a navíc libovolnou kombinaci jiných pneumokokových

- 11 CZ 301445 B6 polysacharidových konjugátů, které jsou tvořeny s adjuvans 3D-MPL, ale v podstatě neobsahují adjuvans založené na hliníku.

V typickém případě kombinace antigenního prostředku mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae podle vynálezu obsahuje polysacharidové konjugační antigeny, kde polysacharidy se získaly z alespoň čtyř, sedmi, dvanácti, třinácti, patnácti nebo dvacetitří sérotypů (preferované kombinace sérotypů závisí na léčeném onemocnění a popisují se v sekci „Streptococcus pneumoniae Polysacharide Antigens of the Invention“).

1tí Antigenní prostředky podle vynálezu se s výhodou používají jako vakcinační prostředky pro prevenci (nebo léčbu) pneumokokových infekcí zvláště u přestárlých lidí a kojenců a nemluvňat.

Další provedení vynálezu zahrnuje zajištění shora popsaných antigenních kompozic vhodných pro použití v medicíně, způsob zahrnující imunitní odezvu na kapsulámí polysacharidový konju15 gát mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae, který zahrnuje kroky aplikace bezpečného a účinného množství jednoho ze shora uvedených antigenních prostředků, a použití jednoho ze shora uvedených antigenních prostředků při výrobě léčiva vhodného pro prevenci (nebo léčbu) pneumokokového onemocnění.

Při prevenci/zlepšení zápalu plic u populace přestárlých lidí (nad 55 let) a zánětu středního ucha u kojenců (až do 18 měsíců) a nemluvňat (v typickém případě 18 měsíců až 5 let) se v dalším preferovaném provedení podle vynálezu popisuje kombinace multivalentního polysacharidového konjugátu formulovaného stejným způsobem jako se popisuje v případě proteinu mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae nebo jeho imunologicky funkčního ekvivalentu. Preferovaný protein nebo proteinové kombinace se popisují ve shora v textu uvedené sekci „Pneumokokové proteiny podle vynálezu“.

Upřednostňuje se, aby popsané antigenní prostředky (a vakcíny) se lyofilizovaly a tak se udržovaly do toho okamžiku, kdy se mají použít, což znamená, že se rekonstituují rozpouštědlem.

Více se upřednostňuje, aby se prostředky lyofilizovaly v přítomnosti 3D-MPL a rekonstituovaly se fyziologickým roztokem.

Lyofilizované prostředky jsou stabilnější (například se předchází rozkladu polysacharidových antigenů). Způsob je také překvapivě odpovědný za vyšší titr protilátek proti pneumokokovým polysacharidům. To se ukazuje zvláště podstatné v případě konjugátů PS 6B. V jiném ohledu podle vynálezu se tak lyofllizovaný antigenní prostředek obsahující konjugát PS 6B adjuvoval s 3D-MPL a v podstatě neobsahuje adjuvans založené na hliníku.

Příprava vakcín se popisuje shora v textu v sekci „Příprava vakcín podle vynálezu“.

C) Konjugáty bakteriální polysacharid - protein D

Kombinační vakcíny jsou výhodné v tom, že redukují potíže recipienta, umožňují plánování a dokončení režimu, vykazují také průvodní jev, kterým je snížení účinnosti vakcíny (shora v textu se popisuje potlačení epitopu pomoci použití nosičových proteinů). Je proto výhodné vytvořit vakcinační kombinaci, která spojuje potřeby populace a která navíc vykazuje imunogenní interferenci mezi jejími komponenty. Tyto výhody zahrnují imunogenní prostředky (nebo vakcíny) podle vynálezu, které jsou zvláště výhodné pro aplikaci kombinačních vakcín vysoce rizikovým skupinám, jako jsou kojenci, nemluvňata nebo přestárlí lidé.

Vynález popisuje protein D pocházející z mikroorganizmu Haemophilus influenzae nebo jeho fragmenty, jako nosič imunogenního prostředku založeného na polysacharidu, které jsou obsaženy ve vakcínách. Fragmenty vhodné pro použití zahrnují fragmenty obsahující epitopy pomocných buněk T. Zvláště fragment proteinu D bude s výhodou obsahovat N-terminální 1/3 proteinu.

- 12 CZ 301445 B6

Protein D je protein vázající IgD pocházející z mikroorganizmu Haemophilus influenzae (EP 0 594 610 Bl) a je potencionálním imunogenem.

Polysacharidy, aby se konjugovaly s proteinem D podle vynálezu zahrnují, ale nejsou omezeny na Vi polysacharidový antigen proti mikroorganizmu Salmonella typhi, meningokokální sacharidy (zahrnující typ A, C, W135 a Y a polysacharid a upravený polysacharid a upravené polysacharidy meningokoků skupiny B), polysacharidy z mikroorganizmu Staphylococcus aureus, polysacharidy z mikroorganizmu Streptococcus agalactae, polysacharidy zmikro!0 organizmu Streptococcus pnewnoniae, polysacharidy z mikroorganizmu mykobacterium, například Nfycobacterium tuberculosis (mannofosfoinisitidy trehalóz, kyselina mykoliová, kapsule vytvořené z těchto látek a arabinogalaktany), polysacharid z mikroorganizmu Cryptococcus neoformans, lípopolysacharidy netypovatelného Haemophilus influenzae, kapsulámí polysacharid z mikroorganizmu Haemophilus influenzae b, lípopolysacharidy mikroorganizmu Moraxella catharralis, lípopolysacharidy mikroorganizmu Shigella sonnei, lipopeptidofosfoglykan (LPPG) mikroorganizmu Trypanosoma cruzi, gangliosidy spojené se zhoubným bujením, GD3, GD2, mucíny spojené nádorovým onemocněním, zvláště T-F antigen a sialyl T-F antigen a polysacharid spojený s IV, který je strukturálně spojený s antigenem T-F.

Polysacharid může být spojen s nosičovým proteinem libovolnou známou metodou (popisuje se například v publikaci Likhite, US 4 372 945 a Armor et al, US 4 474 757). Přednostně se provedlo spojení s CDAP (WO 95/08348).

V CDAP kyanylaění činidlo 1-kyanodimethylaminopyridin-tetrafluorborát (CDAP) se před25 nostně použil pri syntéze konjugátů polysacharid-protein. Kyaniiaění reakce se může uskutečnit za relativně mírných podmínek, které brání hydrolýze polysacharidů citlivých na alkalické činidlo. Tato syntéza umožňuje přímé spojování s nosičovým proteinem.

Polysacharid se rozpustil ve vodě nebo ve fyziologickém roztoku. CDAP se rozpustil v aceto30 nitrilu a přidal se okamžitě k póly sacharidovému roztoku. CDAP reaguje s hydroxylovými skupinami polysacharidů ve formě esteru kyanátu. Po aktivaci se přidal nosičový protein. Aminoskupiny lyzinu reagují s aktivovaným polysacharidem za vzniku izomočovinové kovalentní vazby.

Po reakci se přidá velký nadbytek glycinu a potlačí se zbytkové aktivované funkce. Produkt pak prochází gelem, aby se odstranil nezreagovaný nosičový protein a zbytková činidla. Vynález popisuje způsob produkce konjugátů polysacharidů a proteinu D, který zahrnuje kroky aktivace polysacharidů a spojení polysacharidů s proteinem D.

V preferovaném provedení vynálezu se popisuje imunogenní prostředek (nebo vakcína) vhodná pro prevenci infekcí Streptococcus pnewnoniae.

Mechanizmy rozšíření pneumokoků do plic, cerebrospinální tekutiny a krve nejsou zcela jasné. Růst bakterií v normálních plicních sklípcích se inhibuje jejich relativní suchosti a fagocytámí aktivitou alveolámích makrofágů. Libovolné anatomické nebo fyziologické změny této koordino45 váné obrany má tendenci zvyšovat citlivost plic k infekci. Buněčná stěna mikroorganizmu Streptococcus pnewnoniae má důležitou úlohu pri vytvoření zánětlivé odezvy ve sklípcích plic (popisuje se v publikaci Gillespie et al., (1997), I and I 65: 3936).

V typickém případě vakcína proti mikroorganizmu Streptococcus pnewnoniae podle vynálezu bude obsahovat konjugáty polysacharidů a proteinu D, kde polysacharid se získal z alespoň čtyř, sedmi, jedenácti, třinácti, patnácti nebo 23 sérotypů. V sekci „Polysacharidové antigeny mikroorganizmu Streptococcus pnewnoniae“ se podle vynálezu popisují preferované kombinace sérotypů závisející na léčeném onemocnění.

- 13CZ 301445 B6

V dalším provedení vynálezu se popisuje vakcína proti mikroorganizmu Neisseria meningitidis, zvláště sérotypy A, B, C W-135 a Y. Mikroorganizmus Neisseria meningitidis je jeden z nejdůležitějších případů bakteriální meningitidy. Sacharidová kapsule těchto organizmů může působit jako determinanta virulence a cíl ochranných protilátek. V oboru je známo, že polysacharidy jsou u malých dětí slabými imunogeny. Vynález popisuje zvláště vhodný proteinový nosič vhodný pro tyto polysacharidy, protein D, který popisuje epitopy buňky T, které se mohou aktivovat odezvou buňky-T, přičemž dochází k proliferaci, protože polysacharidový antigen specifický pro buňku B napomáhá jejich pomnožení a zrání, stejně jako indukci imunologické odpovědi.

ίο V jiném provedení podle vynálezu se popisuje konjugát kapsulámího polysacharidu mikroorganizmu Haemophilus influenzae b (PRP) - protein D.

Vynález dále popisuje kombinační vakcíny, které poskytují ochranu proti řadě rozdílných patogenů. Nosič proteinu D je překvapivě použitelný jako nosič v kombinačních vakcínách, kde je konjugováno více póly sacharidových antigenu. Jak se popisuje shora v textu potlačení epitopu se pravděpodobně objevuje, jestliže se pro každý polysacharid může použít stejný nosič. Dokument WO 98/51339 popisuje prostředky, které minimalizují svůj vliv konjugací části polysacharidů v prostředku s DT a zbytek s TT.

Překvapivě se zjistilo, že protein D je zvláště vhodný pro minimalizaci takových účinků potlačení epitopu v kombinačních vakcínách. Jeden nebo více polysacharidů v kombinaci může s výhodou konjugovat s proteinem D a přednostně v takových kombinačních vakcínách všechny antigeny konjugují s proteinem D.

Preferované kombinace zahrnují vakcínu, která umožňuje ochranu proti infekcí mikroorganizmu Neisseria meningitidis C a Γ (a s výhodou A), kde polysacharidový antigen z jednoho nebo více sérotypů Y a C (a nej výhodnější je A) je spojen s proteinem D.

Vakcína založená na polysacharidu mikroorganizmu Haemophilus influenzae (PRP konjugovaný přednostně s TT, DT nebo CRM197 nebo výhodně s proteinem D) se může vytvořit stejně jako shora v textu popsané kombinační vakcíny.

Řada vakcín použitelných v pediatrii se vyskytuje jako kombinační vakcína, aby se snížil počet injekcí, které se musí dítěti aplikovat. Tak pediatrické vakcíny podle vynálezu obsahují více anti35 genů. Vakcíny podle vynálezu se mohou spojovat nebo se mohou aplikovat jednotlivě, ale je známa trivalentní kombinační vakcína obsahující toxoid diftérie (DT), toxoid tetanu (TT) a komponenty černého kašle (v typickém případě jde o detox i fi kovaný toxoid černého kašle (PT) a fílamentózní hemaglutinin (FHA) s pertaktinem (PRN) a/nebo aglutinin 1+2), která se označuje jako INFANRIX-DTPa (od firmy SmithKlineBeecham, Bio logica ls), která obsahuje antigeny

DT, TT, PT, FHA a PRN. Dále je známa vakcína obsahující celé buňky černého kašle, kteráje od firmy SmithKlineBeecham Biologicals s.a. a je označena jako Tritanrix™. Kombinovaná vakcína může také obsahovat jiný antigen, jako je povrchový antigen hepatitidy B (HbsAg), antigeny Polioviru (například deaktivovaný trivalentní poliovirus-IPV), proteiny vnější membrány mikroorganizmu Moraxella catarhalis, proteiny netypovatelného Haemophilus influenzae, proteiny vněj ší mem brány m ikroorgan izm u N. men ingitidis B.

Příklady preferovaných proteinových antigenů mikroorganizmu Moraxella catarrhalis zahrnuté v kombinační vakcíně (zvláště pro prevenci zánětu středního ucha) jsou: OMP106 [WO97/41731] (Antex) a WO 96/34960 (PMC)], OMP 21, LbpA a LpbB [WO98/55606 (PMC)], TbpA a TbpB [WO 97/13785 a WO 97/32980 (PMC)], CopB [Helminen ME, et al., (1993) Infect. Immun. 61: 2003-2010], UspAl/2 [WO 93/03761 (University of Texas)] aOmpCD. Příklady netypovatelných antigenů mikroorganizmu Haemophilus influenzae, které jsou zahrnuty v kombinační vakcíně (zvláště vhodné pro prevenci zánětu středního ucha) zahrnují: protein fíbrin [US 5766608 - Ohio State research Foundation] a fúze obsahující jeho peptidy [například fúze peptidů LBl(f), US 5 843 464 (OSU) nebo WO 99/64067], OMP26

- 14CZ 301445 B6 [WO 97/01638 (Cortercs)], P6 [EP 281 673 (State University of New York], TbpA a TbpB, Hia,

Hmwl,2, HapaDIS.

Preferované pediatrické vakcíny podle vynálezu jsou:

a) Konjugát polysacharidu C mikroorganizmu N. meningitidis a konjugát polysacharidu Haemophilus influenzae b, které mohou být spojeny s konjugátem polysacharidu A a/nebo Y M.meningitidis, přičemž se poskytuje alespoň jeden polysacharidový antigen a upřednostňuje se, aby všechny polysacharidy byly spojené s proteinem D.

to

b) Vakcína a) doplněná DT, TT, komponenty černého kašle (upřednostňuje se PT, HFA a PRN), povrchový antigen hepatítidy B a 1PV (deaktivovaná trivalentní vakcína polioviru).

c) Polysacharidové antigeny mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae spojené s proteinem

D.

d) Vakcína c) s jedním nebo více antigeny, které pocházejí z mikroorganizmu Moroxella catarrhalis a/nebo z netypovatelného Haemophilus influenzae.

Pro všechny shora uvedené kombinované vakcíny je výhodné použití proteinu D, jako nosiče. Je zřejmé, že čím více nosičů, které se zahrnou do kombinační vakcíny (například, aby se překonalo potlačení epítopu), tím je dražší a komplexnější konečná vakcína. Podstatně výhodné je, když všechny nebo většina polysacharidových antigenu v kombinační vakcíně se konjuguje s proteinem D.

Při prevenci zápalu plic u populace přestárlých lidí (nad 55 let) a zánětu středního ucha u kojenců nebo nemluvňat se preferuje provedení vynálezu, kdy se kombinuje multivalentní polysacharid mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae a protein D, což se zde nazývá protein mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae nebo jeho imunologicky funkční ekvivalent. Ve shora uvedené sekci „Pneumokokové proteiny podle vynálezu“ se popisují preferované proteiny (proteinové kombinace, které mohou být obsaženy v takových kombinacích.

Vynález dále popisuje imunogení prostředek obsahující konjugát polysacharid Streptococcus pneumoniae - protein D a proteinový antigen mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae.

Antigeny polysacharid - protein D podle vynálezu jsou ve vakcinaěním prostředku podle vynálezu s výhodou konjugované. Vhodná adjuvans zahrnují hlinité sole, jako je gel hydroxidu hlinitého (alum) nebo fosforečnan hlinitý, ale mohou to také být sole vápníku, železa nebo zinku nebo to mohou být nerozpustné suspenze acylovaného tyrozinu nebo acylované cukry, kationicky nebo anionicky derivatizované polysacharidy nebo polyfosfazeny.

U vakcín pro starší lidi je výhodné vybrat adjuvans tak, aby vyvolávalo odezvu TH1.

Vhodné adjuvans, vyvolávající odezvu TH1 bylo popsáno svrchu v příslušné kapitole.

Vynález dále popisuje imunogen nebo vakcína, kterou je možné použít v medicíně.

Příprava/aplikace konjugátu se popisuje v sekci „Příprava vakcíny podle vynálezu“ shora v textu.

Protein D se také s výhodou použije ve vakcíně proti zánětu středního ucha. Sám působí jako imunogen schopný produkovat ochranu zprostředkovanou B-buňkou proti netypovatelnému H. influenze (ntHi). ntHi může vstoupit do hostitele a umožní pomocí proteinového antigenu indukcí účinků zprostředkovaných buňkou B. Překvapivě se zjistil způsob zvýšení účinnosti působení proteinu D (buď se samotného, nebo jako nosiče pro polysacharid) jako antigenu ve vakcíně proti zánětu středního ucha. To je možné provést adjuvancí proteinu D tak, že se

-15CZ 301445 B6 v subjektu indukuje silná odezva Thl proti proteinu D tak, že část imunitního systému zprostředkovaná buňkou se optimalizuje. Toho se překvapivě dosáhne použitím lyofilizo váného prostředku, který obsahuje protein D a adjuvans, vyvolávající odezvu TH1 (výhodně 3D-MPL), které se rekonstituoval krátce před aplikací. Vynález tak popisuje takové prostředky, způsob pro přípravu takových kompozic (lyofilizací směsi, která obsahuje protein D a adjuvans Thl) a použití takového prostředku při léčbě zánětu středního ucha.

Ukázalo se, že lyofilizace imunogenu v přítomnosti adjuvans, vyvolávajícího odezvu TH1 (popsaného v příslušném odstavci popisu), výhodně 3D-MPL v obecném případě vyvolá imu10 nitní odezvu Thl proti imunogenu. Vynález je možné aplikovat na libovolný imunogen, v případě, že je nutné, aby imunitní systém reagovat silnější imunitní odezvou Thl, Takové imunogeny obsahují bakteriální, virové a nádorové proteinové antigeny, stejně jako samotné proteiny a peptidy.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1; Kapsulámí polysacharid mikroorganizmu S.pneumoniae

11-valentní vakcína zahrnuje kapsulámí polysacharidy sérotypu 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F a 23F se připravily v podstatě stejným způsobem, jak se popisuje v dokumentu EP 72 513. Každý polysacharid se aktivuje a derivatizuje za použití chemie CDAP (popisuje se v dokumentu WO 95/08348) a konjugoval se s proteinovým nosičem. Všechny polysacharidy se konjugovaly ve své přirozené formě s výjimkou sérotypu 3 (jehož velikost se redukovala, aby se snížila viskozita).

Proteinový nosič:

ao Vybraný proteinový nosič je rekombinantní protein D (PD) z netypovatelného Haemophilus influenzae, který se exprimuje v £. coli.

Exprese proteinu D

Protein D mikroorganizmu Haemophilus influenzae Genetická konstrukce vhodná pro expresi proteinu D

Počáteční materiál

DNA kódující protein D

Protein D je mezi H. influenzae všech typů a netypovatelnými kmeny vysoce konzervativní. Vektor pHÍC348 obsahující sekvenci DNA kódující celý gen proteinu D se získal od Dr. A.

Forsgrena, z instituce Department of Medical Microbiology, University of Lund, Malmo General Hospital, Malmo, Sweden. Sekvence DNA proteinu D se popisuje v publikaci Janson et al., (1991) Infect. Immun. 59: 119-125.

Exprese vektoru pMGl

Expresívní vektor pMGl je derivát pBR322 (popisuje se v publikaci Gross et al., 1985), kde bakteriofág λ nese řídicí elementy pro transkripci a translaci cizorodých začleněných genů (popisuje se v publikaci Shatzmanet et al., 1983). Navíc gen nesoucí rezistenci na ampicilin se zaměnil za gen nesoucí rezistenci na kanamycin.

- 16CZ 301445 B6

Kmen AR58 mikroorganizmu E.coli

Kmen AR58 mikroorganizmu E. coli se vytvořil transdukcí N99 se zásobním roztokem fágu Pl, který se kultivoval na derivátu SA500 (galE::TN10, lambdaKil'cl857 ΔΗ1).

Kmeny N99 a SA500 jsou kmeny K12 mikroorganizmu E.coli získané od Dr. Martina Rosenberga z instituce National Institute of Health.

Expresívní vektor pMGl

Při produkci proteinu D DNA kódující protein se klonovala do expresívního vektoru pMGl. Tento plazmid využívá signály z DNA fágu lambda, aby řídil transkripci a translaci začleněných cizorodých genů. Vektor obsahuje promotor PL, operátor OL a dvě utilizační místa (NutL aNutR), aby se uvolnily transkripční polarizační účinky, když se připravuje protein A (popisuje se v publikací Gross et al., 1985). Vektory obsahující promotor PL se zavedou do mikroorganizmu lysogenního kmene E. coli, aby se stabilizovala ptazmidová DNA. Lisogenní hostitelské kmeny obsahují DNA fágu lambda, který se nereplikuje, integrovanou do genomu (popisuje se v publikaci Shatzman et al., 1983). Chromozomální DNA fága lambda řídí syntézu proteinu represoru cl, který se váže na represor OL vektoru a předchází navázání RNA polymerázy na promotor PL a tím předchází transkripci začleněného genu. Kmen AR58 exprimující gen cl obsahuje mutant citlivý na teplotu tak, že transkripce řízená PL může regulovat posunem teploty. To znamená, že zvýšením teploty kultivace se deaktivuje represor a iniciuje se syntéza cizorodého proteinu. Tento expresívní systém umožňuje řízenou syntézu cizorodých proteinů zvláště těch, které mohou být pro buňku toxické (popisuje se v publikaci Shimataka and Rosenberg,

1981).

Kmen AR58 mikroorganizmu E. coli

Lysogenní kmen mikroorganizmu £. coli AR58 používaný při produkci nosiče proteinu D je derivát standardního kmene N1H E. coli K12 kmen N99 (Fsu“galK2, LacZ“ thr ). Tento kmen obsahuje defektivní lysogenní fág lambda (galE::TN10, íambdaKird857AHl). Fenotyp ΚίΓ brání vypnutí syntézy makromolekul v hostiteli. Mutace cI857 udílí lézi citlivou na teplotu represoru cl. Delece ΔΗ1 odstraňuje pravý operon fágu lambda a hostitelská loci bio, uvr3 achlA. Kmen AR58 se vytvořil transdukcí N99 se zásobním roztokem fága Pl, který se dříve kultivoval na derivátu SA500 (galE::TN10, lambdaKil cI857AHl). Zavedení defektního lyzogenu do N99 se zjistilo na základě selekce s tetracyklinem a základě přítomnosti transpozonu TN10, který kóduje rezistenci na tetracyklin v přilehlém genu galE.

Konstrukce vektoru pMGMDPPrD

Vektor pMG, který obsahuje gen kódující nestrukturový protein SI viru Influenzae (pMGNSI), se použil při konstrukci pMGMDPPrD. Gen proteinu D se amplifikoval pomocí PCR z vektoru pHIC (popisuje se v publikaci Janson et al., 1991) s primery PCR, které obsahují restrikční místa Ncol a Xbal na 5' a 3'konci. Fragment Ncol/Xbal se pak zavedl do pMGNSI mezí restrikční místa Ncol a Xbal a tak vznikl fúzní protein obsahující 81 N-terminálních aminokyselin proteinu NS1, po nichž následuje protein PD. Tento vektor se označil jako pMGNSI PrD.

Na základě konstrukce popsané shora v textu se vytvořila konečná konstrukce pro expresi proteinu D. Z pMGNSI PrD se odstranil fragment Baml/BamHI. Hydrolýza této DNA odstranila oblast kódující NS1, mimo prvních tří zbytků N-konce. Po opětné ligaci vektoru se vytvořil gen kódující fúzní protein s následující N-terminální aminokyselinovou sekvencí.

-MDP SSHSSNMANTNS1 protein D

- 17CZ 301445 B6

Protein D neobsahuje vedoucí peptid ani N-terminální cystein, na který se v normálním případě připojí lípidový řetězec. Protein se proto nevylučuje do periplazmy a zůstává v cytoplazmě v nerozpustné formě,

Konečná konstrukce pMG-MDPPrD se zavedla do hostitelského kmene AR58 teplotním šokem při teplotě 37 °C. Bakterie obsahující plazmid se vybraly v přítomnosti kanamycinu. Přítomnost proteinu D obsahující inzert DNA se demonstrovala štěpením izolované plazmidové DNA s vybranými endonukíeázami. Rekombinantní kmen E. coli se označil jako ECD4.

io Exprese proteinu D je řízena promotorem lambda P_L/operátorem O_L. Hostitelský kmen AR58 obsahuje v genomu gen cl citlivý na teplotu, přičemž tento gen blokuje expresi lambda P_L při nízké teplotě pomocí navázání O_L. Když se zvýší teplota zO_L se uvolní cl a exprimuje se protein D. Nakonec fermentace se zvýší koncentrace buněk a buňky se zamrazí.

Extrakce ze sebraných buněk a čištění proteinu D se provedla následujícím způsobem. Pelet kultury zamražených buněk se rozpustil a resuspendoval se v roztoku, který porušuje buňky (citrátový pufr pH 6,0) na konečnou hodnotu OD₆₅₀ = 60. Suspenze dvakrát prošla homogenizérem za vysokého tlaku pri P = 1000 barů, Homogenát buněčné kultury se vyčeřil centrifugací a buněčný odpad se odstranil filtrací. V prvním čisticím kroku se filtrovaný lyzát aplikovat na chromatografickou kolonu s výměnou kationtů (SP sefaróza s malým průtokem). PD se váže na gelovou matrici iontovou interakcí a vymyl se postupným zvyšováním iontové síly elučního pufru.

Při druhém kroku čištění se nečistoty odstranily na matrici s výměnou aniontů (Q sefaróza s rychlým průtokem). PD se neváže na gel a může se hromadit ve výtokové fázi.

Oba kroky hromadění frakcí na chromatografické koloně se monitorují pomocí hodnoty OD. Frakce vytékající z kolony s výměnnou aniontů obsahující čištěný protein D se koncentrovaly ultrafiltraci.

Protein D obsažený ve frakci po ultrafiltraci nakonec prošel membránou o velikosti pórů 0,2 pm.

Chemie:

Aktivace a konjugace

Podmínky aktivace a párování jsou specifické pro každý polysacharid. Tyto podmínky jsou popsány v tabulce č. 1. Přirozený polysacharid (s výjimkou PS3) se rozpustil v 2M roztoku NaCl nebo ve vodě a roztok je vhodný pro zavedení injekcí. Optimální koncentrace polysacharidu se stanovila v případě všech typů polysacharidu.

Do polysacharidového roztoku se přidal CDAP (CDAP/PS = 0,75 mg/mg PS) ze zásobního roztoku v nitrilu o koncentraci 100 mg/ml. Po 1,5 minutě se přidal 0,2M triethylamin, aby došlo ke specifické aktivaci pH. Aktivace polysacharidu se provedla pri uvedeném pH během 2 minut při teplotě 25 °C. Protein D (množství závisí na počátečním poměru PS/PD) se přidal do aktivovaného polysacharidu a provedla se konjugace při specifickém pH po dobu 1 hodiny. Reakce se zastavila glycinem po dobu 30 minut při teplotě 25 °C a nechala se stát přes noc při teplotě 4 °C.

Konjugáty se Čistily gelovou filtrací na gelové filtrační koloně Sephaciyl 500HR, která se uvedla do rovnováhy 0,2M roztokem NaCl.

Stanovil se obsah sacharidů a proteinů eluovaných frakcích. Konjugáty se slily a sterilně se filtrovaly na sterilizační membráně o velikosti pórů 0,22 pm. V konjugátu se stanovil poměr PS/protein.

- 18CZ 301445 B6

Charakterizace:

Každý konjugát se charakterizoval a specifikace se uvedly v tabulce 2. Obsah polysacharidu (pg/ml) se měřil Resorcinolovým testem a obsah proteinu (vyjádřený v pg/ml) se stanovil

Lowryho testem. Konečný poměr PS/PD (hmotn./hmotn.) se stanovil poměrem koncentrací. Zbytkový obsah DMAP (ng/pg PS):

Aktivace polysacharidu sCDAP zavádí do polysacharidu kyanátovou skupinu a uvolňuje se i o DMAP (4 dÍmethylaminopyridin). Zbytkový obsah DMAP se stanovil specifickým testem vyvinutým při SB.

Obsah volných polysacharidů (vyjádřeno v %):

Obsah konjugátů volných polysacharidů pri teplotě 4 °C nebo skladovaných 7 dní pri teplotě 37 °C se stanovil na supematantu získaném po inkubaci s protilátkami α-PD a saturovaným sulfátem amonným, pak následuje centrifugace.

Test ELISA α-PS/a-PS se použila pri kvantifikaci volného polysacharidu v supematantu.

Absence konjugátu se také kontrolovala testem ELISA α-PD/a-PS. Snížení množství polysacharidu vede ke zlepšení konjugační vakcíny.

Antigenicita:

Antigenicita stejných konjugátů se analyzovala testem ELISA sendvičového typu, kde zachycení a detekce protilátek byly α-PS a a-PD,

Obsah volného proteinu (vyjádřeno v %)

Množství volného zbytkového proteinu D se stanovilo použitím způsobu, kdy se vzorek ošetřil SDS. Konjugát se zahříval pri teplotě 100 °C po dobu 10 minut v přítomnosti 0,1 % a nanesl se injekcí na gelovou filtrační kolonu SEC-HPLC (TSK 3000-PWXL). V případě, že protein D je dimér, existuje nebezpečí nadhodnocení množství volného proteinu D disociací struktury s SDS.

Molekulová velikost (K_av):

Molekulová velikost se stanovila použitím gelové filtrační kolony SEC-HPLC (TSK 5000PWXL).

Stabilita:

Stabilita se měřila na gelové filtrační HPLC-SEC (TSK 6000-PWXL) v případě konjugátů udržovaných pri teplotě 4 °C a skladovaných po dobu 7 dní při teplotě 37 °C.

11-valentní charakterizace je dána v tabulce č. 2.

Proteinové konjugáty se mohou adsorbovat na fosforečnan hlinitý a spojit se za vzniku konečné vakcíny.

Závěr

Připravily se imunogenní konjugáty, které jsou komponenty slibné vakcíny. V případě každé z jedenácti valencí se zjišťovaly optimální podmínky CDAP, aby vznikl konečný konjugovaný pneumokokový polysacharidový produkt. Konjugáty těchto pneumokokových polysacharidů,

-19CZ 301445 B6 které je možné získat shora uvedeným způsobem (optimalizovaným) CDAP (s ohledem na nosičový protein, ale přednostně protein D) je tak dalším aspektem vynálezu.

Příklad 2: Studie účinku výhodného adjuvans na imunogennost 11-valentní pneumokokové konjugační vakcíny PS-PD u krys.

Právě narozené krysy se imunizovaly 11 valentní pneumokokovou konjugační vakcínou PS-PD, která obsahuje 0,1 pg každého polysacharidu (vyrobeno způsobem popsaným v příkladu 1) io a použití následující adjuvančního činidla: žádný, AIPO4, 3D-MPL, 3D-MPL na AIPO4.

Prostředek obsahující pouze 3D-MPL je statisticky (a překvapivě více imunogenní) (nejvíce GMC IgG) ve srovnání s jinými prostředky v případě pěti z 11-ti antigenů. To platí, jak pro vysoké, tak nízké koncentrace 3D-MPL.

Opsonofagocytóza potvrdila výsledky GMC.

Materiály a metody

Imunizaění protokol

Právě narozené krysy se vybraly od různých náhodných matek a při první imunizaci byly 7dní staré. Pak se provedly 2 další imunizace o 14 dní a 28 dní později. Vykrvácení se provedlo v den 56 (to je 28 dní po III. imunizaci). Všechny vakcíny se zavedly podkožní injekcí a ve skupině pro jednu vakcínu bylo 10 krys.

Krysy se imunizovaly 11-valentní pneumokokovou konjugační vakcínou, která obsahuje následující polysacharidové sérotypy konjugované s proteinem D: 1,3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 23F.

Příprava

Za účelem testování účinku různých výhodných adjuvans, dávka konjugátu se udržovala konstantní 0,1 pg každého polysacharidu a připravilo se adjuvans AIPO4 a 3D-MPL v různých dáv35 kách a kombinacích, které nezahrnují žádné adjuvans. Ty jsou uvedeny podle čísel v tabulce č. 3. Adsorpce na AIPO4

Koncentrované, adsorbované monovalenty se připravily podle následujícího postupu. 50 μg 40 AIPO4 (pH 5,1) se míchalo s 5 pg konjugovaných polysacharidů po dobu 2 hodin. pH se upravilo na hodnotu pH 5,1 a směs se nechala stát dalších 16 hodin. Přidal se 1 500mM roztok NaCl, koncentrace sole je 150mM. Po 5 minutách se přidal 2-fenoxy ethanol v koncentraci 5 mg/ml. Po dalších 30 minutách se pH upravilo na hodnotu 6,1 a směs se nechala stát po dobu 3 dní při teplotě 4 °C.

Příprava ředidla

Tri ředidla se připravila v roztoku NaCl při koncentraci 150 mM/5 mg/ml fenoxyethanolu 50 A: AIPO4 při koncentraci 1 mg/ml.

B: 3D MPL na A1PO₄ při koncentraci 250 a 1000pg/ml, poměr hmotností 3D-MPL/AIPO4 - 5/20

->0CZ 301445 B6

C: 3D-MPL na A1PO₄ při koncentraci 561 a 10OOpg/mi, poměr hmotností 3D-MPL/A1PO₄ = 50/89

Příprava adsorbovaného undekavalentu

Dvanáct koncentrovaných adsorbovaných PS-PD monovalentů se smíchalo při správném poměru. Jako ředidlo A se přidal doplněk AIPO4. Když je to nutné, přidal se 3D-MPL buď ve formě vodného roztoku (neadsorbovaného, způsob 1 popsaný dále v textu) nebo jako ředidlo B nebo C (3D-MPL adsorbovaný na A1PO₄ ve dvou dávkách, způsob 2 popsaný dále v textu).

Způsob 1:

3D-MPL se přidal ke kombinovaným adsorbovaným konjugátům ve formě vodné suspenze. Směs se míchala s undekavalentem po dobu 10 minut při teplotě místnosti a před aplikací se uchovával při teplotě 4 °C.

Způsob 2:

Před přidáním k adsorbovanému konjugátu se 3D-MP předem adsorboval na AIPO4 (ředidlo B aC). Aby se připravil 1 ml ředidla, vodná suspenze 3D-MPL (250 nebo 561 pg) se míchala s 1 mg AIPO4 ve l50mM NaCl s hodnotou pH 5,6 po dobu 5 minut při teplotě místnosti. Roztok se ředil v NaCl s hodnotou pH 6,1/fenoxy a inkuboval se přes noc při teplotě 4 °C.

Příprava neadsorbovaného undekavalentu

Smíchalo se jedenáct konjugátu PS-PD a ve správném poměru se přidal 150mM roztok NaCl pH 6,1, fenoxy. Když je to nutné přidal se 3D-MPL ve formě roztoku (neadsorbovaný).

Přípravky pro všechny injekce se připravily 18 dní před první aplikací.

Test ELISA

Test ELISA se uskutečnil za účelem měření krysího IgG za použití protokolu získaného z WHO workshopu zabývajícím se postupy testů ELISA při kvantifikaci protilátek IgG proti kapsulámím polysacharidům v lidském séru. V podstatě čištěný kapsulámí polysacharid se potáhl přímo na mikrotitrační destičku. Vzorky sér se předem inkubovaly s polysacharidem z buněčné stěny, který je běžný pro všechny pneumokoky (substance C) a který je přítomen v pneumokokových póly sacharidech čištěných podle popisu v dokumentu EP 72 513 Bl) v přibližné koncentraci 0,5 %. Aby se detekovaly vázané myší IgG, použila se činidla získaná v instituci. Jackson

ImmunoLaboratories lne. Titrační křivky odpovídaly vnitřním standardům (monoklonální protilátky) modelovaným logickou logaritmickou rovnicí. Výpočet se provedl za použití SoftMax Pro softwaru. Očekávalo se, že maximální absolutní chyba u těchto výsledků bude faktor dvou. Relativní chyba je menší než 30 %.

Opsonofagocytóza

Opsonizační titry se stanovily pro sérotypy 3, 6B, 7F, 14, 19F a 23F za použiti protokolu CDC (Streptococcus pneumoniae Opsonophagocytosis using Differentiated HL60 cells, version LI) s čištěnými lidskými PMN a s králičím komplementem. Úprava zahrnovala použití pneumo50 kokových kmenů a fágocytické buňky HL60 se nahradily čištěnými lidskými neutrofily PMN (kde existuje vysoký stupeň korelace mezi uvedenými fagocytickými buňkami). Navíc se do mikrotitračních prohlubní přidaly skleněné kuličky o velikosti 3 mm za účelem intenzivnějšího míchání, a to umožňuje redukovat poměr fagocyty : bakterie, jehož doporučená hodnota je 400.

-91 CZ 301445 B6

Výsledky:

Koncentrace IgG

Geometrický průměr koncentrací IgG se stanovil pro každý sérotyp a PD se zobrazilo v tabulkách č. 4 až 10. V případě sérotypů 6B, 14, 19F a 23F jsou zahrnuty pro porovnání předchozí výsledky získané za použití tetravalentní formulace.

Porovnání statistických hodnot p v případě kompozic 3D-MPL versus 3D-MPL/A1PO₄ je io v tabulce ě. 11. Adjuvantní formulace č. 4 (neadsorbované konjugáty s vysokou dávkou

3D-MPL), které umožňují nejvyšší GMC pro 9 z jedenácti případů. V pěti z jedenácti případů je MPL v nízké dávce druhým nejvíce imunogenním adjuvans. Přísady umožní vyšší GMC ve srovnání s dávkou pro všechny sérotypy (data nejsou uvedena) a to je statisticky podstatné v případě sérotypů 4, 6B, 7F, 18C a 23F (pje menší než 0,05 od 95 % Cl),

Opsonofagocytóza

Výsledky opsonofagocytózy na shromážděném séru jsou zobrazeny pro sérotyp 3, 6B, 7F, 14, 19F a 23F v tabulce 4 až 8. Ve většině případů tyto opsonizační titry potvrdily přítomnost GMC

IgG. Korelace s koncentrací IgG je vyšší než 85 % v případě sérotypů 6B, 19F, 23F (data nejsou uvedena). V případě sérotypů 3, je důležité poznamenat, že pouze skupina 3D-MPL vyvolala opsonizační aktivitu nad hodnotu pozadí.

Závěr

V tomto experimentu se neočekávalo, že použití samotného 3D-MPL bude indukovat nejvyšší koncentrace IgG.

Maximální GMC IgG získané modifikací pomocí adjuvans se porovnávalo s maximální získanou

GMC modifikací dávky PS a zjistilo se, že 3D-MPL by mohlo vyvolat vyšší odezvy u 5-ti z jedenácti sérotypů.

Tabulka č. 11 ukazuje, že když se porovnávají kompozice 3D-MPL a 3D-MPL/AIPO4 (porovnání způsobu formulace a dávka 3D-MPL), podstatně se zlepšila imunogennost 5-ti poly35 sacharidových konjugátů, když se přidá jen 3D-MPL než 3D-MPL plus A1PO₄, PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19FaPS 23F.

Příklad 3: Studium účinku kombinací na imunogennost konjugátů PS4, PS 6B, PS 18C,

PS 19F a PS 23F dospělých krys

Dospělé krysy se imunizovaly konjugační vakcínou obsahující pneumokokový póly sacharid a protein D, buď jednotlivě, nebo kombinovaně multivalentní kompozicí (buď tetra-, pentahepta- nebo dekavalent). Skupiny deseti krys se imunizovaly dvakrát v časovém intervalu 28 dní a testovací krev se získala v den 28 a v den 42 (14 dní po druhé dávce).

V sérech se testem ELISA testovala přítomnost protilátek IgG proti pneumokokovým polysacharidům. Testem ELISA se zjistilo, že všechny konjugáty vyvolaly specifické protilátky IgG. Tabulka č. 12 ukazuje účinek konjugátů proteinu D v kombinaci monovalentu PS 6B, PS 18C, PS 19F a PS 23F na jejich imunogenost u dospělých krys, jak se měřila koncentrace IgG po 14-ti dnech po druhé dávce.

U všech vzorků se provedla statistická analýza, aby se stanovilo, zda rozdíly v koncentraci protilátek po kombinaci byly podstatné. Kombinace libovolných sérotypů PS6B, PS 18C, PS 19F a PS 23 F konjugátů proteinu D v multivalenční vakcíně podstatně nemění jejich imunogennost.

. 77 _

Tabulka č, 1: Specifická aktivace/konjugace/podmínky ukončení PS konjugátů S. pneumoniae

- protein D

serotyp	1	3 (mikroka palina)	4	5	6B	7F
PS konc. (mg/ml)	2,0	3,0	2,0	7,5	5,4	3,0
PS rozpust.	NaCl 2M	NaCl 2M	h2o	H2O	2M NaCl	2M NaCl
PD konc.(mg /ml)	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
počáteč. poměr PS/PD (hmotn.i hmotn.)	1/1	1/1	1/1	1/1	1/1	1/1
CDAP konc. (mg/mg PS)	0,75	0,75	Q,75	0,75	0,75	0,75
pHa=pHc=	9,0/9,0/	9,0/9,0/	9,0/9,0/	9,0/9,0/	9,0/9,0/	9,0/9,0/
PHq	9,0	9,0	9,0	9,0	9,0	9,0

serotyp	9V	14	18C	19F	23F
PS konc. (mg/ml)	2,5	2,5	2,0	4,0	3,3
PS rozpust.	2M NaCl	2M NaCl	h2o	2M NaCl	2M NaCl
PD konc.(mg/ ml)	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
počáteč. poměr PS/PD (hmotn. /h motn.)	1/0,75	1/0,75	1/1	1/0,5	1/1
CDAP konc. (mg/mg PS)	0,75	0,75	0,75	0,75	0,75
pHa=pHc=pH	8,5/8,5/9	9,0/9,0/9	9,0/9,0/9	10/9,5/9,	9,0/9,0/9
q	,0	,0	,0	0	,0

-23CZ 301445 B6

Tabulka č. 2: Specifikace 11-valentní pneumokokové vakcíny PS-PD (první čísla kódu dávky indikují sérotyp)

(T> O ÍM •o Q CC CO Q	1/0,69	O	co	co s O	co i—I o	c P w 0 Oj Ή c CD fl
						£ (O
1.0						.U CQ
PO						0
CM	co					CL
	co
Q					tH	Ή
Cm	o			CM	r4	C
ιΌ			rH	*1		CD
Q	i—1	<50	CM	i-4	O	£
						C
						□
00						CQ
CM						0
CM	ID					CL
£>	00
Q					CM	Ή
04	o			<r	r4	c
			CTi		v	υ
Q	rH	r-	r-ř	O	O	£
						£
CO						3
co						ÍQ
CM						O
+)	σ>					Pj
Q	o
cl					co	^<—1
co	rH			Ό		c
o	\		rH	x	X	4J
Q	rd	1—1	v	O	o	£
						C
r						£
CM						cQ
cm						O
b	ό					CL
Ci	LO
Oj	-				CO	vH
r-l	O			CM	r-4	c
O	X			s	W	CD
□	1-1	r-1	co	o	O	£
	JJ	0 □	0	tn
	o	χζ Ό	xz ~	Cl	Ϊ* <u
	Ij	0) -H	4D cw>
	cu	c n	C	CL	'Π)
g		r—| f0	i—t	< W i	>	flj
	tn —	o _d	0 3	Σ O-· M	0 JJ	+J
-H	Oj -	> υ	> £	Q CO	—1 CQ	-rJ
M	C	qj	H	Cn £	3 0	i—1
	M +J	Λ B) dP	33 4> oV>	x: i	42 44	•H
JJ	><1) O	cfl >	f0 jj	m 'x m	0 Ή	33
Ή	£ £	tn h - o	cq O m	m (ji u	f-1 i—í	(O
M	o x;	31 0 tfř h	Λ H	Λ £ o	0 0	JJ
	Oj —	o o.- v	o a v	O '- V	2 >	tQ

D23PDJ212	M r~- O v. T-l	O
LD
O
CM
£)	m
Q	sr
o.	*.
co	o
rH
Q	c4	sr
i—1
CM
CM
£>	CM
Q	L0
Oj	x
03	o
rJ
a	í-l	vr
CM
O
CM
Ό	00
a	Ό
Oj	h
M*	O
t—1	'-s	I—t
Q	r“J	V
CM
CM
CM
£)	O
Q	co
Oj	x
m	o
o	\	1-4
a	r—J	V
uo
CM
CM
£»	00
Q	uo
Oj	X
Γ'	o
O
O	t—1
	£1 £	0 3
	0 -J	33 Ό
	P 0	'CD -H
	Pj £	C M
	x:	<—1 <0
	ω	0 33
	0j	> □
	c	CO
	ÍJ JJ	XZ CQ jp
	><D 0	(0 >
	g g	CQ Ή —· o
	0 33 —	.Q 0 oP H
	Oj — -	0 CL— V

- ?4 CZ 301445 B6

C\J r—I	j 6 '0	CM H ·» O	není posun
							1	posun
10			ϊ—4 O			CM i—1 O		není
								posun
21			CM % o			O H O		není
								c 0 OT 0 fl.
n			m o			Γ- r-1 O		není
								unsod
m o			y? o			r—1 O		není
								posun
co			O			TT r-1 o		není
obsah volného	V c Ή Φ P 0 a	□F lD i—1 V	Oj s a x (0 ot X 0	cn cl cn X ΪΤ q	cn CL* cn i cn q ď> o v	velikost	molekul (KavJ 1	stabilita

-25CZ 301445 B6

Tabulka č. 3: Shrnutí adjuvančních formulací testovaných 11—valentní pneumokokové PS-PD u novorozených krys

skupina	AlPO4	MPL	způsob	popis
1				žádný
2	100			A1PO4
3		5		nízká konc. MPL
4		50		vysoká konc. MPL
5	100	5	způsob 1	způsob 1 nízká konc.
6	100	50	způsob 1	způsob 1 vysoká konc.
7	100	5	způsob 2	způsob 2 nízk. konc.
8	100	50	způsob 2	způsob 2 vysok. konc.

Tabulka ě. 4: Geometrický průměr koncentrace IgG sérotyp 6B, serokon verze a průměr opsonizačního titru 28 dní po III, imunizaci novorozených krys s 11-valentní PS-PD za použití různých adjuvans (a porovnání s tetravalentní imunizací)

skupí na	AIPO4	MPL gg	způso b	6B GMC IgG (pg/ml)	6B serok onver ze	6B opson titr*	6B GMC IgG (μ^/ιηΐΐ	6B serok onver ze	6B opson titr*
				tetravalent	undekavalent
1				0,047	2/10	12, 5	0,004	1/10	<6,25
2	100			0,048	4/10	65	0,019	4/10	<6,25
3		5					1,345	10/10	43
4		50					4,927	10/10	192
5	100	5	1				0,042	7/10	<6,25
5	100	50	1				0,255	10/10	<6,25
7	100	5	2	0,033	3/10	<6,25	0,048	8/10	<6,25
8	100	50	2				0,057	8/10	<6,25

Tabulka č. 5: Geometrický průměr koncentrace IgG sérotyp 14, serokonverze a průměr opson izačního titru 28 dní po III. imunizaci novorozených krys s 11-valentni PS-PD za použití různých adjuvans (a porovnání s tetravalentní imunizací)

skupí	A1PO4	MPL	způso	14	14	14	14	14	14
na		μο	b	CMC	serok	opson	GMC	serok	opson
				IgG	onver	titr*	IgG	onver	titr*
				(pg/ml)	ze		(μς/ηύ.)	ze
				tetravalent	undekavalent
1				0,046	3/10	64	0,022	3/10	<6,25
2	100			0,99	10/10	88	0,237	8/10	27
3		5					0,233	10/10	41
4		50					0,676	10/10	81
5	100	5	1				0,460	9/10	67
6	100	50	1				0,477	10/10	98
7	100	5	2	0,81	10/10	49	0,165	8/10Π	81
8	100	50	2				1,611	10/10	133

Tabulka č. 6: Geometrický průměr koncentrace IgG sérotyp 19F, serokonverze a průměr opsonizačního titru 28 dní po III. imunizaci novorozených krys s 11-valentní PS-PD za použití různých adjuvans (a porovnání s tetravalentní imunizací)

skupí	AIPO4	MPL	zpuso	19F	19F	Í9F	19F	19F	19F
na	μο	pg	b	GMC IgG (μς/πύ.) J	serok onver ze	opson titr*	GMC IgG (μ^/πιΐ)	serok onver ze	opson titr*
				tetravalent	undekavalent
1				0,04	2/10	64	0,021	2/10	<6,25
2	100			1,07	9/10	367	0,222	7/10	79
3		5					4,028	10/10	296
4		50					21,41 1	íoVio	1276
5	100	5	1				1,649	10/10	172
6	100	50	1				2,818	10/10	208
7	100	5	2	1,09	10/10	193	0,766	10/10	323
8	100	50	2				3,539	10/10	241

-27CZ 301445 B6

Tabulka č. 7: Geometrický průměr koncentrace IgG sérotyp 23F, serokonverze a průměr opsonizačního titru 28 dní po III. imunizaci novorozených krys s 11-valentní PS-PD za použití různých adjuvans (a porovnání s tetravalentní imunizací)

skupí	ΑΙΡΟή	MPL	zpúso	23F	23F	23F	23F	23F	23F
na	pg		b	CMC	serok	opson	GMC	serok	opson
				IgG	onver	titr*	IgG	onver	titr*
				(gg/rnl)	ze		(pg/ml)	ze
				tetravalent	undekavalent
1				0,06	2/10	<6,25	0,152	3/10	<6,25
2	100			0,29	10/10	70	0,56	8/10	<6,25
3		5					2,296	9/10	389
4		50					4,969	10/10	>1600
5	100	5	1				0,462	5/10	17
6	100	50	1				0,635	8/10	54
7	ICO	5	2	0,38	10/10	<6,25	0,203	3/10	18
8	100	50	2				0,501	7/10	43

Tabulka č, 8: Geometrický průměr koncentrace IgG sérotyp 3 a 7F, serokonverze a průměr opsonizaěního titru 28 dní po III. imunizaci novorozených krys s 11-valentní PS-PD za použití různých adjuvans (a porovnání s tetravalentní imunizací)

skupí na	A1PO4 μς	MPL P9	zpúso b	3 GMC IgG	3 serok onver ze	3 opson titr*	7F GMC IgG ^g/ml)	7F serok onver ze	7F opson titr*
1				0,003	1/10	<6,25	07040	7/10	<6, 25
2	100		t	0,008	6/10	<6,25	0,25	9/10	43
3		5		0,070	10/10	<6,25	2,435	10/10	477
4		50		0,108	10/10	18	2,569	10/10	332
5	100	5	1	0,015	10/10	<6,25	0,579	10/10	54
6	100	50	1	0,027	10/10	<6, 25	0,611	9/10	59
7	100	5	2	0, 006	10/10	<6,25	0,154	8/10	30
8 I	100	50	2	0,034	10/10	<6,25	0,638	9/10	140

- 28 CZ 301445 B6

Tabulka č. 9: Geometrický průměr koncentrace IgG sérotyp 1, 4 a 5, serokonverze 28 dní po III.

imunizaci novorozených krys s 11-valentní PS-PD za použití různých adjuvans

skupí na	AIPO4 μα	MPL μα	způso b	1 GMC IgG (pg/ml)	1 serok onver ze	4 GMC IgG (pg/ml)	4 serok onver ze	5 GMC IgG (pg/ml	5 serok onver ze
1				0,026	4/10	0,005	1/10	0,040	3/10
2	100			0,282	8/10	0,052	5/10	0,774	9/10
3		5		1,614	10/10	3,452	10/10	7,927	10/10
4		50		2,261	10/10	7,102	10/10	13,97 4	10/10
5	100	5	1	0,569	10/10	0, 676	10/10	3,015	10/10
6	100	50	1	1,430	10/10	0,419	9/10	5,755	10/10
7	100	5	2	0,478	10/10	0,267	9/10	2,062	10/10
8	100	50	2	1,458	10/10	0,423	10/10	5,009	10/10

Tabulka č. 10: Geometrický průměr koncentrace IgG sérotyp 9V, 18C a PD, serokonverze 28 dní 5 po III. imunizaci novorozených krys s 11-valentní PS-PD za použití různých adjuvans

skupí na	AIPO4 μα	MPL μα	způso b	9V GMC IgG (pg/ml)	9V serok onver ze	18C GMC IgG (pg/ml)	18C serok onver ze	PD GMC IgG (pg/ml	PD serok onver ze
1				0,018	0/10	0,013	1/10	0,003	Ó/10
2	100			0,489	6/10	0,092	5/10	0,993	10/10
3		5		0,482	7/10	6,560	10/10	3,349	10/10
4		50		11,42 1	10/Ϊ0	14,02 3	10/10	5,446	10/10
5	100	5	1	2,133	9/10	0,690	10/10	11,40 7	10/10
6	100	50	1	2,558	10/10	1,771	10/10	1,258	10/10
7	100	5	2	1,536	10/10	0,528	10/10	1,665	8/10
8	100	50	2	2,448	9/10	0,980	10/10	5,665	10/10

-29CZ 301445 B6

Tabulkač. II: Statistická významnost (hodnota p), zda jisté pneumokokové polysacharidové konjugáty zlepšily imunogennost, když se spojily se samotným 3D-MPL ve srovnání s 3D-MPL/AIPO4. Hodnota p nižší než 0,01 se považuje za vysoce podstatnou. Způsob 1 a 2 indikuje způsob formulace.

serotyp	50 μς 3D-MPL •MPL/AIPO4	vs 3D-	5 μς 3D-MPL vs 3D- MPL/AXPO,
1	Způsob 1	Způsob 2	Způsob 1	Způsob 2
3	k 3	0,05	0,079	0,11
4	0,075	0,01	0,27	0,008
5	0,002	0,0003	0,02	0,003
6B	0,001	0,0001	0,001	0,0006
7F	0,13	0,15	0,01	0,005
9V	0,02	0,02	0,1	0,04
14	0,65	0,21	0,3	0,66
18C	0,0008	0,0002	0,006	0,004
19F	0,0009	0,006	0,21	0,04
23F	0,002	0,0004	0,01	0,0004

Tabulka č. 12: Geometrický průměr koncentrace IgG (gg/ml) v den 14 po druhé dávce po imunizaci dospělých krys 1,0 pg samotného konjugátu polysacharid-protein nebo kombinovaného do tetravalentní, pentavalentní, heptavalentní nebo dekavalentní vakcíny. Tato data se pg kombinují z pěti nezávislých experimentů.

Serotypy	4	6B	18C	19F	23F
vakcíny	H	T	H	T	T
samotný	9,3	0,11	15	5,2	2,5
kombinova ný	4	0,23	3,7	3,7	2,8
T: kombinovaný v tetravalentní (TJ {PS 6B, 14, 19F, 23FJ , pentavalentní (T plus PS3) , heptavalentní (Η) (T plus ΡΞ4, 9V a T8C) a dekavalentní (H plus PS 1, 5 a 7F) kombinační vakcíny. H: kombinovaný do heptavalentní (Η) (T plus 4, 9V a 180 a dekavelentní {H plus PS 1, 5 a 7 F) kombinovanou vakcínu.

Příklad 4: Výhody přidání pneumolyzinu a 3D-PML na účinnost ochrany PD-konjugované

11-valentní polysacharidové vakcíny proti pneumokokové kolonizaci plic u myší

Odečítání imunologických hodnot

Dávka sérového IgG specifických pro pneumolyzín určených testem ELISA

Imunodestičky Maxisorp Nunc se potáhly po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C 100 μί/prohlubeň rekombinantního nativního pneumolyzinu (PLY) v koncentraci 2 μg/ml ředěného PBS. Destičky io se promyly 3krát NaCl 0,9 % v 0,05% pufru Tween-20. Standardní křivka se vytvořila za použití dvojnásobného ředění (v PBS/Tween-20 0,05%, 100 μί v jedné prohlubni) anti-PLY séra (počáteční koncentrace je 670 ng/mmol IgG) a vzorky séra (počáteční ředění je 1/10) se inkubovaly po dobu 30 minut při teplotě 20 °C za stálého míchání. Po promytí, jak se popisuje shora v textu, se kozí anti-myší IgG konjugované s peroxidázou (Jackson) ředěné 5000 x v PBS/Tween-20 0,05% inkubovaly (100 μί na jednu prohlubeň) po dobu 30 minut při teplotě 20 °C za stálého míchání. Po promytí se destičky inkubovaly po dobu 15 minut při teplotě místnosti se 100 μί vyvíjejícího pufru na jednu prohlubeň (OPDA 0,4 mg/ml a H₂O₂ 0,05 % ve 100 mM pH 4,5 citrátového pufru). Vyvíjení se zastavilo přidáním 50 μί roztoku 1M HCl na jednu prohlubeň. Optická hustota se odečítala při 490 a 620 nm za použití zařízení Emax (od firmy Molecular Device), Titr protilátek se vypočítal matematickou metodou pro čtyři parametry za použití software SoftMaxPro.

Inhibice hemolýzy

Tento test se provedl za účelem měření schopnosti sérových protilátek inhibovat hemolytickou aktivitu pneumolyzinu (PLY). Za účelem eliminovat cholesterol (který je náchylný k reakci s PLY), vzorky séra se ošetřily 2X následujícím způsobem: vzorky se smíchaly s jedním ekvivalentním objemem chloroformu a pak se inkubovaly po dobu 45 minut za stálého míchání. Supernatanty se sebraly po centrifugací po dobu 10 minut při 1000 ot./min.. Séra zbavená cholesterolu se ředila (provedlo se dvojnásobné sériové ředění v lmM dithiothreitolu, 0,01% BSA, 15mM Tris, l50mM NaCl, pH 7,5) na mikrodestičkách s 96 prohlubněmi (Nunc). Do každé prohlubně se přidalo 50 μί roztoku, který obsahuje 4 HU (jednotek hemolyzinu) PLY a destičky se inkubovaly po dobu 15 minut při teplotě 37 °C. Pak se přidalo 100 μί ovčí červené krevní destičky (1% roztok) a vše se inkubovalo po dobu 30 minut při teplotě 37 °C. Po centrifugací po dobu 10 minut při 1000 ot./min, se shromáždil supematant (150 μί) a přenesl se do další mikrotitrační destičky s 96 prohlubněmi, přičemž je možné číst optickou hustotu při vlnové délce 405 nm. Výsledky se exprimovaly jako střední bod ředění titrů.

Chemická detoxifikace pneumolyzinu

Rekombinantní přirozený pneumolyzín (PLY) se dialyzoval proti 50mM fosfátovému pufru s NaCl o koncentraci 500mM pH 7,6. Všechny následující kroky se provedly při teplotě 39,5 °C za epísodického míchání. V den 1 se přidal k roztoku PLY roztok obsahující 10% Tween-80 (1/25 objem/objem), 57,4mM N-acetyl-tryptofan pH 7,6 (3/100 objem/objem), 2,2M glycin ve fosfátovém pufru (1/100 objem/objem) a 10% formaldehyd ve fosfátovém pufru (3/100 objem/objem). V den 2 a 3 se opět přidal 10% formaldehyd v poměru 3/100 a 2/100 (objem/objem). Kultivace proběhla při teplotě 39,5 °C do sedmého dne za stálého míchání. Nakonec se roztok PLY dialyzoval proti 50mM fosfátovému pufru s 500mM NaCl pH 7,6. V hemolytickém testu se demonstrovala úplná deaktivace PLY.

Pneumokokové intranasální Čelendž u myší OF1

Sedm týdnů staré samice myší se intranasálně inokulovaly při anestezi s 5 x 10⁵ jednotek tvořící kolonie mikroorganizmem S.pneumoniae adaptovaným pro myší sérotyp 6B. Plíce byly odstraně-31 CZ 301445 B6 ny 6 hodin po čelendži a homogenizovaly se (zařízením Ultramax, při 24 000 ot./min a teplotě °C) v kultivačním médiu Todd Hewth Broth (THB, Gibco). Sériové desetinásobné ředění plicního homogenátu se naneslo na Petriho misky, které obsahují THB doplněný kvasinkovým extraktem, a ty se inkubovaly přes noc pri teplotě 37 °C. Pneumokoková plicní infekce se stanovila jako počet jednotek tvořící kolonie/myš a vyjádřila se jako logaritmicky vážený průměr. Limit detekce je 2,14 log jednotek tvořící kolonie/myš.

Příklad 4A: Adjuvanční účinek 3D-MPL na imunitní odezvu na pneumolyzin io

V tomto příkladu se hodnotí vliv adjuvace s 3D-MPL na imunitní odezvu na přirozený rekombinantní pneumolyzin (PLY, poskytl J. Panton, Children's Hospital, North Adelaide, Australia) a na jeho chemicky detoxifikovanou část (DPLY). Chemická detoxifikace se provedla, jak se popisuje shora v textu.

Skupina deseti šesti týdnů starých samic myší Balb/c se intramuskulámě imunizovaly v den 0, 14 a 21 s 1 pg PLY nebo DPLY, který je obsažen buď v A: A1PO₄ 100 pg, nebo B: A1PO₄100 pg + pg 3D-MPL (3-de-O-acylovaný monofosforyllipid A od firmy Ribi Immunochem). Obrázky č. 1A a 1B zobrazují hodnoty IgG získané testem ELISA a hemolyzinové inhibiční titry (HLI) měřené v séru po 111 imunizaci.

V případě kteréhokoli antigenu se nejsilnější imunitní odezva vyvolala u zvířat vakcinovaných formulacemi doplněnými 3D-MPL. Je zajímavé, že DPLY je stejně imunogenní jako PLY v případě, že se aplikoval s A1PO₄ + 3D-MPL, zatímco je slabší imunogen ve formulaci s AIPO4.

To ukazuje výhodnou schopnost 3D-MPL zlepšit protilátkovou odezvu na detoxifikovaný pneumolyzin,

V prostředku, který obsahuje pneumolyzin, se může s výhodou použít chemicky detoxifikovaný pneumolyzin spíše než mutačně detoxifikovaný pneumolyzin. To proto, že detoxifikování mutan30 ti získáni od této doby stále obsahují zbytkovou aktivitu toxinu, přičemž chemicky detoxifikovaný pneumolyzin tuto aktivitu nemá. Uvažuje se proto další aspekt vynálezu, prostředek obsahující pneumolyzin (nebo pneumolyzinové mutanty), které se chemicky detoxifi kovaly, aby se mohly použít ve vakcíně. Mohou se smíchat s Thl adjuvans, přičemž se upřednostňuje 3D-MPL. Tyto prostředky jsou obsahem vynálezu. Také se předpokládá způsob zvyšující imunitní odezvu chemicky detoxifikovaného pneumolyzinu v imunogenním prostředku obsahující kroky přidání Thl adjuvans (upřednostňuje se 3D-MPL) k prostředku.

Příklad 4B: Výhody přidání utlumeného mutantu pneumolyzinu a adjuvans 3D-MPL na 1140 valentní polysacharidové vakcíny proti pneumokokové plicní kolonizaci u myší

OF 1, kteiým se provedla intranasální čelendž se sérotypem 6B.

V tomto příkladu se hodnotila účinnost profylaxe vakcíny obsahující 11-valentní konjugát polysacharid-protein D, utlumený mutantní pneumolyzinový antigen (PdB, popisuje se v dokumentu

WO 90/06951) a adjuvans AIPO4 + 3D-MPL ve srovnání s klasickým 11-ti valentním konjugačním prostředkem obsahující konjugát polysacharid-protein D s adsorbovaným AIPO4.

Skupiny 12-ti samic čtyři týdny starých myší OF1 se podkožně imunizovaly v den 0 a 14 prostředkem obsahujícím A: 50 pg A1PO₄, B: 0,1 pg PS/sérotyp PD-konjugované 11-valentní poly50 sacharidové vakcíny + 50 pg AIPO4 nebo C: 0,1 pg PS/sérotyp PD-konjugované 11-valentní polysacharidové vakcíny + ÍOpg PdB (poskytl Dr. J. Palton, Childreďs Hospital, North Adelaide, Australia) + 50 pg A1PO₄ + 5 pg 3D-MPL (od firmy Ribi Immunochem). Čelendž se provedla v den 21, jak se popisuje shora v textu.

-32CZ 301445 B6

Jakje zobrazeno na obrázku č. IC, 11-valentní polysacharidová konjugační vakcína doplněná

PdB a adjuvans A1PO₄ + MPL (černé sloupce reprezentují aritmetický průměr) vykazuje velmi podstatnou ochranu (hodnota p je menší než 0,007). Naopak nepodstatná ochrana se pozorovala u zvířat imunizovaných 11-valentním polysacharidovým konjugátem a A1PO₄. Tento výsledek ukazuje, že přidání antigenů pneumolyzinu (dokonce utlumeného) a adjuvans 3D-MPL zesiluje účinnost 11-valentní polysacharidové konjugační vakcíny proti zápalu plic.

Příklad 4C: Imunní koreláty ochrany popsané v příkladu 4B

Za účelem zavést imunitní koreláty ochrany popsané v příkladu 4B pomocí 11-valentní polysacharidové konjugační vakcíny doplněné atenuovaným mutantním pneumolyzinem (PdB) a 3D-MPL, se měřila serologická protilátková odezva na polysacharid 6B a PdB před Čelendží, jak se popisuje shora v textu.

Titry protilátek se pak porovnaly s počtem bakteriálních kolonií určených v plicích odpovídajících zvířat odebraných 6 hodin po čelendží. Hodnota R² se vypočítala log/log lineární regrese.

Vypočtená hodnota R² se rovná 0,18 a 0,02 jako v případě anti-PdD a anti-6B protilátkové 20 odezvy. To ukazuje na nepřítomnost korelace mezi humorální imunitní odezvou a ochrannou proti oběma antigenům. Titry protilátek proti 6B se ve skupinách imunizovaných 11 valentní konjugační vakcínou podstatně neliší (GMT je 0,318 ng/ml), a to také v případě stejné vakcíny doplněné PdD a 3D-MPL (GMT = 0,458 ng/ml). Proto zdokonalení ochrany pomocí prostředku

C není zřejmě způsobené silnější protilátkovou ochranou proti polysacharidu 6B.

Výsledky naznačují, že ochrana není zprostředkována samotnou humorální imunitní odezvou, ale spíše imunitou zprostředkovanou buňkou, která se vyvolala antigenem PdB v přítomnosti 3DMPL. To podporuje myšlenku aplikace proteinového antigenu(ů) a potentních adjuvans v pneumokokové polysacharidové konjugační vakcíně tak, že dochází ke koordinaci obou částí imunit30 ního systému pro optimální ochranu.

Příklad 5: Spolupráce obou částí imunitního systému u myší aktivně imunizovaných pneumolyzinem a pasivně imunizovaných protilátkami proti pneumokokovému PS

Příklad 5A: Zjištění koncentrace pasivně aplikovaných anti-6B-polysacharidových protilátek, které chrání před zápalem plic

Metoda:

Vakcinační skupiny: Čtyři skupiny 16-ti myší se pasivně imunizovaly (ip.) v den -1 se 100 μΐ naředěného krysího antipolysacharidového antiséra v souladu se skupinami popsanými dále v textu (celkem 64 myší).

skupina	specifita	koncentrace IgG v antiséru
Gl	a-PS-6B	5 pg/ml
G2	(X-PS-6B	2 pg/ml
G3	a-P$-6B	0,75 pg/ml
G4	kontrola	0 pg/ml

-33CZ 301445 B6

Zvířata: 64 samic myší CD-I z Charles River, Canada, které váží přibližně 35 g (jsou přibližně týdnů staré).

Anesteze: K anestezi myší se použil isofluran (3 %) plus O₂ (1 l/min).

Organizmus: S.pneumoniae NI387 (sérotyp 6) se sklidily tryptíkázových sojových agarových ploten (TSA) doplněných 5% koňskou krví a suspendovaných v 6 ml PBS. Bezprostředně před infekcí 1 ml bakteriální suspenze se ředil na 9 ml tekutého nutričního agaru (BRL) a vše se uchovávalo při teplotě 41 °C. Myším se aplikovalo 6,0 log₎₀ jednotek tvořící kolonie/myš v objemu io 50 pl.

Infekce. V den 0 se provedla anestezie u myší, jak se popisuje shora v textu, a infikovaly se mikroorganizmem S.pneumoniae N1387 (50 pl chlazené bakteriální suspenze) intrabronchiální instilací pomocí intratracheální inkubací. Tato metoda se popisuje v publikaci Woodnut and

Berry, Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43: 29( 1999).

Vzorky: 3 dni po infekci se usmrtilo 8 myší ve skupině nadměrnou dávkou CO₃, odebraly se plíce a homogenizovaly se v 1 ml PBS. Aby se určil živý počet bakterií, připravilo se desetinásobné ředění v PBS. Vzorky se inokulovaly (objem 20 μΙ) ve třech provedeních na plotny TSA doplně20 né 5% koňskou krví pg/ml a vše se inkubovalo přes noc při teplotě 37 °C a pak se provedlo hodnocení. Další sady myší se usmrtily v den 7 a připravily se vzorky způsobem popsaným shora v textu.

Výsledky:

koncentrace	IgG	počet bakterií	(logio cfu/plíce) v dny po
v krysím	seru	infekci
(pg/ml)		3	8
5	6,7 ± 0,7 (1/7)	7,2 ± 0,7 (5/8)
2	6,5 + 0,7 (1/7)	6,9 ± 1,8 (4/7)
0,75	7,7 ± 0,5 (5/8)	4,3 ± 1,4 (2/8)
0	6,7 ± 1,5 (3/6)	6,3 ± 1,5 (3/9)

čísla v závorce jsou zvířata, která zemřela před přípravou vzorků

Závěr: Obecně nedošlo k podstatnému rozdílu v počtu izolovaných bakterií z libovolných ošetřovaných skupin. To ukazuje, že nedošlo k žádné měřitelné ochraně antipolysacharidem v koncen30 tracích až 5 pg/ml.

To je podobné tomu, co se pozorovalo v některých klinických studiích na lidech, to znamená, že antipolysacharidová část není schopna některé populace chránit proti pneumokokovému zápalu plic.

-34CZ 301445 B6

Příklad 5B: Stanovení ochrany před zápalem plic dosažené aktivní aplikací Ply (pneumolyzín) s adjuvans nebo bez a synergie s suboptimálními protilátkami proti PS.

skupina	objem injekce aktivní	vakcína aplikovaná v den -22, -14 (dávka μς)	injekční objem pasivní	pasivní IgG (den -1)
1-1	100 μΐ podkožně	PdB/AlP04 (10/50)		žádné
1-2	100 μΐ podkožně	PdB/MPL/AlP O4 ¢10/5/50)		žádné
1-3	100 μΐ podkožně	PdB/AlPO, (10/50)	100 μΐ i.p.	a-PS
1-4	100 μΐ podkožně	PdB/MPL/AlP O4 (10/5/50)	100 μΐ i.p.	a-PS
1-5	100 μΐ podkožně	PdB/AlPO, (5/50)	100 μΐ i.p.	a-PS
1-6	100 μΐ podkožně	PdB/AlPO, (5/50)		žádné

Infekce: V den 0 se provedla u myší anestezie (3% isofluran plus 11/min O₂). Bakteriální inokulum se připravilo sklizením kultury mikroorganizmu 5.pneumoniae Ní387 (sérotyp 6) z ploten s tryptikázovým sojovým agarem (TSA) doplněným 5% koňskou krví a buňky se suspendovaly v 6 ml PBS. Těsně před infekcí se v chlazeném kapalném nutričním agaru (udržovaném při teplotě 41 °C) připravilo desetinásobné ředění (1 ml plus 9 ml). Myši se infikovaly intrabronchiální instilací prostřednictvím intratracheální inkubace a aplikovalo se jim přibližně 6,0 io logio jednotek tvořící kolonie na jednu myš v objemu 50 μΐ. Tato metoda se popisuje v publikaci

Woodnut and Beny (Antimicrob. Ag. chemotherap. 43: 29 (1999)).

Vzorky: 72 dní po infekci se usmrtilo 8 myší ve skupině nadměrnou dávkou CO₂, odebraly se plíce a homogenizovaly se v l ml PBS. Aby se určil živý počet bakterií, připravilo se deseti15 násobné ředění v PBS. Vzorky se inokulovaly (objem 20 μΐ) ve třech provedeních na plotny TSA doplněné 5% koňskou krví μg/mI a vše se inkubovalo přes noc při teplotě 37 °C a pak se provedlo hodnocení. Další sady myší se usmrtily v den 8 a připravily se vzorky způsobem popsaným shora v textu.

Analýza dat

Výstupní hodnota vhodná pro porovnání aplikace je počet bakterií v plicích v den 3 a 7 po infekci. Výsledky se prezentovaly jako skupinový průměr se standardní odchylkou. Statistická analýza se uskutečnila za použití Studentova t-testu, kde se považuje za podstatnou hodnotu hodnota P, když je menší než 0,05.

-35CZ 301445 B6

Výsledky hodin po infekci

Počet bakterií ze skupiny 1—4 je podstatně nižší (p<0,05) než ve skupině 1-3.

Počet bakterií ze skupiny 1-4 je podstatně nižší (p<0,05) než ve skupině 1-5.

168 hodin po infekci

Počet bakterií ve všech skupinách je přibližně o 2 log nižší v den 8 než v den 3, což indikuje, že infekce se lepší.

Počet bakterií ze skupiny t—2 je podstatně nižší (p<0,05) než ve skupině 1-5.

skupina	den 3	den 8
	log cfu/plíce	stand. odchylka	log cfu/plíce	stand. odchylka
1-1	6,93	0,61	5,23	1,28 ..
1-2	6,59	1,25	4,08	1,34
1-3	7,09	0,8	5,32	1,26
1-4	6,09	1,43	4,46	2,32
1-5	7,19	0,89	5,42	1,05
1-6	6,68	1,14	5,01	1,48

Jak se ukázalo shora v textu samotné anti-polysacharidové protilátky (skupina 1-5) nevykazují ochranu proti pneumokokům v plicích. PdB s adjuvans A1PO₄ také nezaručuje ochranu, ale v den 8 je zde zjevný trend ochrany, když se PdB kombinuje s 3D-MPL (skupina 1-2).

V den 3 skupina, která vyjadřuje nejvíce podstatnou ochranu, což je skupina 1-4, vykazuje všechny tři elementy, PdB, 3D-MPL a pasivně aplikované anti-polysacharidové protilátky. Tento závěr je podpořen četností úmrtí. Skupina 1-4 vykazuje pouze 2 úmrtí z 8 samic ve srovnání se skupinou 1-5 a 1-3, kde je 5 úmrtí z 10 myší.

Závěr:

V případě, že se provedl experiment s pasivně imunizovanými zvířaty, synergický účinek aktivní imunizace pneumolyzinem a MPL nemůže být způsoben zvýšením množství protilátek proti polysacharidovému antigenů.

V případě, že zvířata byla imunizována proti pneumokokovému polysacharidu pouze pasivně, v den 8 se množství takových protilátek v hostiteli rychle ztrácí.

Podstatnou ochranu proti pneumokokovému zápalu plic je možné spatřit ve skupinách imunizo35 váných pneumolyzinem plus 3D-MPL a zvláště ve skupinách imunizovaných pneumolyzinem plus 3D-MPL, kde se pasivně přidávají anti-polysacharidové protilátky, což indikuje synergii této kombinace.

Jestliže se anti-polysacharidová imunizace provede aktivně (upřednostňuje se s konjugovaným polysacharidem), účinek bude více znatelný jako účinek paměti B-buněk a konstantní množství

-36CZ 301445 B6 protilátek proti PS se bude podílet na kooperaci imunitní odpovědi (popisuje se například na obrázku č. 1C, kde řada zvířat aktivně imunizovaných polysacharidem a proteinem nevykazuje v plících po čelendži žádné bakterie).

Příklad 6: Imunogennost u jednoletých myší Balb/c 11-valentní konjugační vakcíny obsahující pneumokokový polysacharid a protein D a adjuvans 3D-MPL

Úvod a cíle

Ochrana proti pneumokokové infekci je zprostředkována protilátkami specifickými pro sérotyp prostřednictvím opsonofagocytózy. Je možné se domnívat, že zvýšení koncentrace protilátek povede k silnější ochraně a proto se velké úsilí věnuje nalezení způsobu jak zesílit humorální odezvu. Jedna strategie, která se s úspěchem aplikuje, je použití konjugační vakcíny v preklínické studii spolu s imunostimulačním adjuvans (popisuje se v publikaci Poolman et al., 1998, Carbohydrate-Based Bacterial Vaccines, In: Handbook of Experimental Pharmacology eds. P. Perlmann and H. Wigsell, Springer-Verlag, Heidelberg, D).

Data uvedená v této sekci ukazují výsledky posledního experimentu za použití klinických sérií v protokolu navrženém tak, aby napodobit klinickou studii.

Protokol:

Jednoleté myši Balb/c se imunizovaly jednou desetinou lidské dávky konjugační vakcíny zahrnující pneumokokový polysacharid a protein D nebo 23-valentní vakcíny obsahující pouze polysacharid. Používané vakcíny byly klinické série DSP009, DSP013 nebo DSP014 odpovídající 1 pg dávky sérotypu 6B a 23F a 5 pg zbývajících sérotypů 11-valentní konjugační vakcíny, 0,1 pg dávky 11-valentní konjugační vakcíny nebo 0,1 pg dávky 11-valentní konjugační vakcíny s 5 pg adjuvans 3D-MPL. Všechny 11-valentní konjugované vakcíny obsahují také 50 pg

AIPO4.

Skupiny 20 myší se imunizovaly do svalu. Injekce skupin uvedených v následující tabulce se zavedly v den 0 a 21. Testovaná krev se získala v den 35 (14 dní po druhé dávce).

-37CZ 301445 B6

Tabulka: Imunizační rozvrh v případě jednoletých myší Balb/c imunizovaných klinickou sérií konjugační vakcíny obsahující pneumokokový polysacharid a protein D

Skupina	den 0 vakcína dávka	den 21 vakcína dávka	počet myší
1	pneumovax-23 2,5 pg	pufr	20
2a	11-valent. Pn-PD 0,1 pg	pufr	20
2b	11-valent. Pn-PD 0,1 pg	11-valent. Pn-PD 0,1 pg	20
3a	11-valent. Pn-PD +MPL 0,1 pg + 5 pg	pufr	20
3b	11-valent. Pn-PD +MPL 0,1 pg 1 5 pg	11-valent. Pn-PD +MPL 0,1 pg + 5 pg	20
4a	11-valent. Pn-PD 1 pg + 0,5 pg	pufr	20
4b	11-valent. Pn-PD 1 pg + 0,5 pg	11-valent. Pn-PD 1 pg + 0,5 pg	20
kontrola	pufr	pufr	20

V séru se testem ELISA testovala přítomnost protilátek IgG proti pneumokokovému polysacharidu podle protokolu CDC/WHO, což znamená, že po neutralizaci séra se použije polysacharid z buněčné stěny. Test ELISA se kalibroval tak, že koncentrace protilátek se vyjadřuje v pg/ml za použití sérotypově specifických monoklonálních protilátek IgGl.

io Statistické analýzy porovnání se provedly za použití programu UNISTAT verze 5,0 beta. Test ANOVA pomocí metody Tukey-HSD se provedl na logaritmicky transformovaných koncentracích IgG. Porovnání rychlosti přeměny séra se uskutečnilo použitím Fisherova exaktního testu.

Výsledky:

V následující tabulce jsou zobrazeny GMC IgG a 95% interval spolehlivosti proti 11 sérotypům a protein D indukovaný 14 dní po druhé imunizaci (dávka 2). Rychlosti sérokonverze jsou zobrazeny tam, kde není možné vypočítat 95% interval spolehlivosti.

Skupina jedna vykazuje účinek imunizace se samotným polysacharidem, který normálně indukuje u zvířat pouze IgM. Většina množství IgG se drží pod mezí detekce, nicméně myši Balb/c jsou schopny vytvořit IgG na několik pneumokokových polysacharidů, přičemž je možné zmínit sérotypy 3, 19F a 14.

Imunizace s konjugačními vakcínami vyvolala protilátky IgG s vysokou rychlostí sérokonverze proti všem sérotypům s výjimkou 23F.

-38CZ 301445 B6

Pouze v případě sérotypů 7F a 19F se pozorovala odezva závislá na dávce (skupina 4 vs skupina 2), ale tyto pozorování nebyli statisticky podstatná. Silnější odezva se pozorovala po dvou dávkách (skupiny b vs skupiny a) v případě sérotypů 3, 6B, 7F a 19F a PD a tato pozorování jsou v mnoha případech se všemi třemi prostředky statisticky podstatná.

Nejvíce zajímavý je účinek 3D-MPL. Dvě dávky 3D-MPL vytvořené vakcíny (skupina 3b) indukovala nejvyšší GMC specifického IgG a to je statisticky podstatné pro všechny sérotypy s výjimkou 23F. V tomto případě je podstatně vyšší rychlost sérokonverze (p - 0,02 skupina 3b vs 2b, Fisherův extrakt).

Tabulka: Geometrický průměr (IgG) a 95% intervaly spolehlivosti pro vybrané pneumokokové sérotypy a protein D u jednoletých myší Balb/c 14 dní po II imunizaci s 11-valentní konjugační vakcínou PS-PD

skupina	1	2a	2b	3a	3b	4a |	4b
Šero typ	GM [IgGJ gg/ml (95% Cl)	GM [IgGl gg/ml (95% Cl)	GM [IgGJ gg/ml (95% Ct)	GM [IgG] ug/ml (95% Cl)	GM [IgG] Ug/mi (95% Cl)	GM [IgG 1 gg/ml (95% Cl)	GM (IgG] μ»· ml (95% Cl)
3	0.24 (0.16-0.6)	0.18 (0.11-027)	0.84 (0.47-1.5)	0.72 (0.51-1.0)	4.84 (3.0-7.9)	0.22 (0.14-0.35)	0,95 (0.19-1.8)
6B	0.02 0/203	0.04 8/19	0.19 (0.09-041)	0.14 (0.07-0.27)	0.74 (0.29-1.9)	0.09 (0.05-0.161	0.11 (0.05-0.23)
7F	0.04 0/20*	0.07 (0.04-0.12)	0.19 (0.10-0.39)	0.15 (0.10-0.22)	0.97 (0.49-2.0)	0.09 (0.06-0.14)	045 ¢0.204.02)
14	0.15 3/20*	4.5 (2.5-8.1)	6.2 (3.6-10.5)	12.9 (7.8-21.2)	13.6 (9.449.7)	4.0 (2.0-8.0)	6.9 (4.6-10.61
19F	1.2 (0.56-2.6)	6.7 (3.6-12.5)	12.1 (7.6-19.3)	10.1 (5.5-18.5)	58.5 (42-81)	5.9 (3.5-9.9)	22.0 (16.0-30.2)
23 F	0.07 1/20*	0.08 3/20*	0.08 2/19*	0.07 2/10*	0.17 9/20’	0.06 1/18*	0.10 4/20*
PD*	0.25 1/20*	5.2 (3.3-8.3)	11.9 (6.9-20.7)	13.5 (9.5-19.0)	98.0 (49.1-195.)	10.9 (6.4-18.4)	38.7 (21.3-70.3)

vyjádřeno v EU/ml, # rychlost sérokonverze se definuje jako 2 standardní odchylky nad průměr negativní kontroly.

V předchozí tabulce jsou definovány skupiny.

Závěr:

Zde uvedená data demonstrují, že přidání 3D-MPL k 11-valentní konjugační vakcíně obsahující pneumokokový polysacharid a protein D zvýší imunitní odpověď u starých myší Balb/c v případě všech testovaných sérotypů.

U většiny případů dvě dávky vakcíny indukovaly vyšší geometrický průměr koncentrací IgG ve srovnání s jednou dávkou. To se nepozorovalo za použití samotné polysacharídové vakcíny. Tato skutečnost se považuje za indikaci imunitní odezvy závislé na T-buňkách a imunitní paměti.

Tato data podporují vakcinační aplikační schéma za použití konjugovaných pneumokokových polysacharidů, kde se jako adjuvans používá Thl (upřednostňuje se 3D-MPL), přičemž se aplikují alespoň dvě dávky vakcíny obsahující adjuvans, přičemž se preferuje časový interval

-39CZ 301445 B6 mezi dávkami 1 až 12 týdnů a nejvýhodnější je interval tří týdnů. Takové aplikační schéma je obsahem vynálezu.

Myši používané v experimentu nevykazují odezvu na PS 23 (samotný nebo konjugovaný). Je s zajímavé, že ačkoli množství protilátek proti polysacharídu zůstává nízké s ohledem na použitý vakcinační prostředek, o mnoho více myší odpovídá na PS 23, v případě, že se jako adjuvans použije 3D-MPL (sérokonverze je podstatně vyšší). Použití adjuvans Thl, zvláště pak 3D-MPL ve vakcinačních prostředcích obsahujících konjugované pneumokokové polysacharidy za účelem odstranit neschopnost odezvy na pneumokokový polysacharid ve vakcíně je také dalším io aspektem vynálezu. Dalším způsobem jak odstranit neschopnost odpovídat na dříve uvedený prostředek je použití dvou dávkového aplikačního schématu popsaného shora v textu.

Příklad 7: Konjugát polysacharídu C mikroorganizmu Neisseria meningitidis - protein D

A: Exprese proteinu D

Probíhá jako v příkladu 1.

B: Výroba polysacharídu C

Zdroj polysacharídu Skupiny C je mikroorganizmus N. meningitidis kmen Cil. Tento kmen se fermentuje za použití klasické fermentaění techniky (popisuje se v dokumentu EP 72 513). Suché práškové polysacharidy užívané v konjugační procesu jsou shodné s Mencevax (SB

Biologicals s.a.).

Alikvot kmene Cl 1 se roztavil a 0,1 ml suspenze se naneslo na petriho misku s médiem Mueller

Hinton doplněném dialyzátem kvasinkového extraktu (10 % objem/objem) a kultura se inkubovala po dobu 23 až 25 hodin při teplotě 36 °C v inkubátoru v atmosféře vzduchu saturovaného vodou.

Povrchová kultura se nesuspendovala ve sterilním fermentačním médiu a s touto suspenzí se inokulovala Rouxova láhev obsahující médium Mueller Hinton doplněné dialyzátem kvasinkového extraktu (10 % objem/objem) a sterilní skleněné kuličky. Po inkubaci Rouxovy nádoby po dobu 23 až 25 hodin při teplotě 36 °C v inkubátoru v atmosféře vzduchu saturovaného vodou se povrchová kultura nesuspendovala v 10 ml sterilního fermentačního média a 0,2 až 0,3 ml této suspenze se inokulovalo do 12 jiných Rouxových lahví s médiem Mueller Hinton.

Po inkubaci během 23 až 25 hodin při teplotě 36 °C v inkubátoru v atmosféře vzduchu saturova40 ného vodou se povrchová kultura nesuspendovala v 10 ml sterilního fermentačního média. Bakteriální suspenze se slila do konické lahve.

Tato suspenze se pak sterilně přenesla do fermentoru za použití sterilní stříkačky.

Fermentace meningokoků se provedla ve fermentoru, které se nacházejí v čisté místnosti při negativním tlaku. Fermentace se v obecném případě ukončila po 10 až 12 hodinách. Koncentrace bakterií je 10¹⁰ bakterií v jednom mililitru (to je časná stacionární fáze) a ukončení fermentace se detekuje zvýšením pH.

V tomto stádiu se celá půda před centrifugací deaktivovala zahřátím (12 min. při teplotě 56 °C). Před aktivací a po ní se odebral vzorek půdy a rozetřel se na Pepiho misky na médium Mueller Hinton.

-40CZ 301445 B6

C. Čištění PS

Proces čištění je postup zahrnující více kroků a provedl se s celým obsahem fermentace.

V prvním stádiu čištění se deaktivovaná kultura čiřila centrifugací a získal se supernatant.

Čištění póly sacharidů je založeno na srážení s kvartémí amonnou solí (bromid cetyltrimethylamonný/CTAB, Cetavlon R). CTAB tvoří nerozpustné komplexy s polyantionty, jako jsou polysacharidy, nukleové kyseliny a proteiny závisející na jejich pl. Tato metoda se může použít při srážení nečistot (nízká konduktivita) nebo polysacharidů (vysoká konduktivita).

!0

Polysacharidy obsažené v čistém supematantu se srážely za použití diatomitu (CELÍTE® 545) jako matrice, aby se zabránilo tvorbě nerozpustné inertní hmoty během srážení/čištění.

Schéma čištění polysacharidu C mikroorganizmu N.meningitidis

Krok 1: Fixace komplexu PSC-CTAB na CELÍTE® 545 a odstranění buněčného odpadu, nukleových kyselin a proteinů promytím 0,05 % CTAB.

Krok 2: Eluce PS 50 % EtOH. První frakce, která je turbidní a obsahuje nečistoty a LPS se vylila. Přítomnost PS v dalších frakcích se ověřila flokulaěním testem.

Krok 3: Opětná fixace komplexu PS-CTAB na CELÍTE® 545 a odstranění menších nukleových kyselin a proteinů promytím 0,05 % CTAB.

Krok 4: Eluce PS 50 % EtOH. První turbidní frakce se vylije. Přítomnost PS v následujících frakcích se ověří flokulaěním testem

Eluát se filtroval a sbíral se filtrát obsahující surový extrakt. Polysacharid se srážel z filtrátu přidáním etanolu na konečnou koncentraci 80 %. Polysacharid se pak odstranil jako bílý prášek, sušil se ve vakuu a skladoval se při teplotě -20 °C.

D. Konjugace CDAP

Konjugace PSC a PD

V případě konjugace PSC a PD se preferuje technologie CDAP konjugace oproti klasické aktivaci CNBr a provedlo se párování přes mezemík na nosičový protein, Polysacharid se nejdříve aktivoval kyanilací s l-kyano-4-dimethylaminopyridinÍumtetrafluoroborátem (CDAP). CDAP je ve vodě rozpustné kyanylační činidlo, ve kterém se elektrofilita kyanoskupiny zvyšuje nad hodnotu pro CNBr, což umožňuje, aby kyanylační reakce se provedla za poměrně jemných podmínek. Po aktivaci se může polysacharid přímo spojit s nosičovým proteinem přes jeho aminoskupiny, aniž je nutné zavést distanční molekuly. Nezreagované esterkyanátové skupiny se uhasí extenzivní reakcí s glycinem. Celkový počet kroků zahrnutých v přípravě konjugačních vakcín se omezil a v konečném produktu nejsou přítomny nej důležitější potencionálně imuno45 genní distanční molekuly.

Aktivace polysacharidu s CDAP zavádí kyanoskupinu do polysacharidů a uvolňuje se dímethylaminopyridin (DMAP). Během následujícího postupu párování kyanátová skupina reaguje se skupinami NH₂ v proteinu a je přetvořena na karbamát.

Aktivace PSC a párování PSC-PD

Aktivace a párování se provedlo při teplotě 25 °C. 120 mg PS se rozpouštělo alespoň po dobu 4 hodin v WFI.

-41 CZ 301445 B6

Roztok CDAP (100 mg/ml čerstvě připraveného acetonitrilu) se přidalo v množství, aby se dosáhlo poměru CDAP/PS (hmotn./hmotn.) 0,75.

Po 1 minutě a 30 vteřinách se zvýšila hodnota pH až na hodnotu aktivace (pH 10) přidáním triethylaminu a pak se tato hodnota stabilizuje až do přidání PD.

V čase 3 minuty 30 vteřin se přidalo NaCl tak,aby konečná koncentrace byla 2M.

V čase 4 minuty se přidal PD tak, aby poměr PD/PS byl 1,5/1. Hodnota pH je bezprostředně i o upravena na hodnotu při párování (pH 10). Roztok se nechal stát po dobu jedné hodiny při regulované hodnotě pH.

Zastavení reakce

Ke směsi PS/PD/CDAP se přidalo 6 ml 2M glycinu. Hodnota pH se upravila na pH, při kterém dochází k zastavení reakce (pH 8,8). Roztok se míchal po dobu 30 minut při pracovní teplotě a pak se pomalu míchal přes noc při teplotě 2 až 8 °C.

Čištění PS-PD

Po filtraci (velikost pórů membrány je 5pm) se konjugát PS-PD čistil v lednici gelovou permeační chromatografií na gelu Sephacryl S400HR, aby se odstranily malé molekuly (zahrnující DMAP) a konjugovány PD: Eluce se provedla pomocí NaCl 150mM při hodnotě pH 6,5 a monitorování se provedlo při UV 200 nm a dále se sledovalo pH a konduktivita.

Na základě různých molekulových velikostí reakčních komponentů, konjugáty se nejdříve eluovaly konjugáty PS-PD a pak následují volný PD a nakonec DMAP. Frakce obsahující konjugát, jak se detekovalo pomocí DMAB (PS) a pBCA (protein) se slily. Slité frakce se sterilizovaly filtrací (velikost póruje 0,2 pm),

E. Tvorba adsorbované konjugační vakcíny PSC-PD Promytí AIPO₄

Za účelem optimalizovat adsorpci konjugátu PSC-PD na AIPO₄ se A1PO₄ promylo, aby se redukovala koncentrace PO₄ ³':

AIPO4 se promylo 150mM NaCl a centrifugoválo se (4x), pelet se pak nesuspendoval ve 150mM NaCl a pak se filtroval (velikost pórů je 100 pm) a filtrát se sterilizoval zahřátím,

Takto promytý AIPO₄ se nazývá WAP (promytý autoklávovaný fosforečnan).

Postup přípravy:

Před vytvoření konečného produktu se konjugát PSC-PD adsorboval na A1PO₄ WAP. A1PO₄ WAP se míchal s PSC-PD po dobu 5 minut při teplotě místnosti. pH se upravilo na hodnotu 5,1 a směs se míchala po dalších 18 hodin při teplotě místnosti. Pak se přidal roztok NaCl, aby koncentrace byla 150mM a směs se míchala po dobu 5 minut při teplotě místností. Ke směsi se přidal 2-fenoxyethanol, aby koncentrace byla 5 mg/ml a směs se míchala po dobu 15 minut při teplotě místnosti, pak se pH upravilo na hodnotu 6,1.

-42CZ 301445 B6

Konečné složení/dávka:

PSC-PD

A1PO₄ WAP:

NaCl

2-fenoxyethanol:

voda vhodná pro injekci:

pH:

lOpgPS

O,25mgAI^3t l50mM 2,5 mg až 0,5 ml 6,1

F. Preklinické informace

Imonogenicita polysacharidového konjugátu u myší

Imunogennost konjugátu PC-PD se stanovila v případě 6 až 8 týdnů starých myší Balb/C. Samotný konjugát (neadsorbovaný) nebo konjugát adsorbovaný na A1PO₄ se zavedl injekcí jako monovalentní vakcína. Vyvolané protilátky proti PSC se stanovily testem ELIS A, zatímco funkční protilátky se analyzovaly za použití bakterieidního tastu. Obě metody jsou založeny na protokolech CDC (Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, USA). Na základě výsledků ze dvou různých provedených experimentů se odhaduje odezva versus dávka a účinek adjuvans (AIPO4).

Rozsah dávky vhodný pro experiment

V tomto experimentu se myším Balb/c dvakrát (v intervalu jednoho týdne) injekcí zavedla vakcína PSC-PD. Použily se čtyři různé dávky konjugátu vytvořené na A1PO₄: 0,1, 0,5, 2,5 a

9,6 pg najedno zvíře. Myši (10 myší v jedné skupině) se nechaly vykrvácet v den 14(14 post I), (14 post II) a 42 (28 post II). Geometrický průměr koncentrací (GMC) protilátek specifických pro polysacharid stanovený testem ELISA se vyjádřil v pg IgG v jednom mililitru za použití čištěného IgG, V séru se měřily bakterícidní protilátky a titry se vyjádřily jako převrácená hodnota ředění, které je schopné usmrtit 50 % bakterií, přičemž se používá mikroorganizmus N.

meningitidis kmen Cl 1 v přítomnosti komplementu mláďat králíků.

Získaná odezva na dávku je znázorněna rovinou už od dávky 2,5 pg. Výsledky indikují, že existuje dobrá odezva na zesilovací dávku mezi 14 post I a 14 post II, Množství protilátek v 28 post lije alespoň stejný jako v době 14 post II. Titry bakterie idních protilátek souhlasí s koncen35 tracemi určenými v testu ELISA a potvrzují imunogennost konjugátu PSC-PD.

Účinek adjuvans

V tomto experimentu se vytvořila jedna sada konjugátu PSC-PD vytvořená na AIPO4, pro případ porovnání se zavedl injekcí samotný konjugát (bez adjuvans). 10-ti myším ve skupině se dvakrát injekcí zavedlo ve dvou týdenních intervalech podkožní cestou 2 pg konjugátu. Myši se nechaly vykrvácet v den 14 (14 post I), 28 (14 post II) a 42 (28 post II). Stanovily se testy ELISA a titry funkčních protilátek (v případě baktericidního testu pouze 14 post II a 28 post II). Formulace AIPO4 vyvolává až lOkřát vyšší titry protilátek ve srovnání s formulacemi, které nezahrnují adjuvans.

Závěry:

Následující obecné závěry se vytvořily na základě výsledků shora popsaného experimentu:

- konjugát PSC-PD vyvolává anamnestickou odezvu demonstrující, že PSC, když je konjugován, se stává antigenem závislým na T buňce, koncentrace protilátek proti PSC měřené testem ELISA dobře korelují s titry baktericidních protilátek, což ukazuje, že protilátky vyvolané konjugátem PSC-PD jsou funkční proti mikroorganizmu N. meningitidis séroskupina C,

-43CZ 301445 B6 přibližně 2,5 pg konjugátu adsorbovaného na A1PO₄ se jeví, že vyvolává u myší optimální protilátkovou odezvu, chemie CDAP je vhodnou metodou pro přípravu imunogenních konjugátu PSC-PD.

Příklad 8: Příprava konjugátu polysacharidu z mikroorganizmu N. meningitidis séroskupina

A - PD

Suchý prášek polysacharidu A (PSA) se rozpustil po dobu jedné hodiny v 0,2M roztoku NaCl, aby konečná koncentrace byla 8 mg/ml. pH se pak fixovalo na hodnotě 6 pomocí HCI nebo NaOH a roztok se temperoval při teplotě 25 °C. K roztoku PSA se přidalo 0,75 mg CDAP/mg PSA. Po 1,5 min. bez regulace pH se přidal 0,2M NaOH a získala se hodnota pH 10. Po 2,5 minutách se přidal v souladu s poměrem PD/PSA přibližně 1 protein D (jeho koncentrace je 5 mg/ml). Během párování po dobu jedné hodiny se udržuje pH na hodnotě 10. Pak se přidalo

10 mg glycinu (2M, pH 9) na jeden miligram PSA (hodnota pH je 9, čas 30 minut a teplota °C). Před čištěním na kolonové chromatografii s exkluzí (Sephacryl S400HR od firmy Pharmacia) se směs konzervovala přes noc při teplotě 4 °C, Jako první eluuje konjugát, pak následuje PD a vedlejší produkty (DMAP, glycin, sole). Konjugát se shromáždil a sterilizoval se filtrací na membráně Saptopore (od firmy Sartorius) s velikostí pórů 0,2 μιη.

Příklad 9: Charakterizace produktů popsaných v přibližně 7 a 8 in vitro

Hlavní charakteristiky se uvádějí v tabulce dále v textu:

č.	popis konjugátu	protein a obsah PS (μςτ/πιΐ)	poměr PS/protein (hmotn.)	volný protein (%>	volný PS (%)
1	PS C-PD pH se reguluje NaOH	PD : 210 PS : 308	1/0,68	< 2	8-9
2	PS C -PD pH se reguluje TEA	PD : 230 PS : 351	1/0,65	< 2	5-6
3	PS A - PD pH se reguluje NaOH	PD : 159 PS ; 149	1/1,07	5	5-9

Výsledky in vivo

Jako zvířecí model pro testování imunogennosti konjugátu se použily naší Balb/c. Konjugáty se adsorbovaly buď na A1PO₄, nebo A1(OH)₃ (10 pg PS na 500 μg Al³⁺) nebo se neadsorbovaly,

Myším se zavedly následující injekce: 2 injekce ve dvoutýdenních intervalech (2 pg PS/injekci).

Na základě těchto výsledků vyplývá, že volný PS velmi ovlivňuje imunitní odezvu. Lepší výsledky jsou možné získat s konjugátem, který obsahuje méně než 10 % volného PS. Vynález tedy popisuje optimalizací postupu CDAP.

-44CZ 301445 B6

Příprava je také důležitá. V tomto modelu se AIPO4 jeví jako nejvhodnější adjuvans. Konjugáty vyvolávají zesilovací účinek, ke kterému nedochází, když se injekcí zavádějí samotné polysacharidy.

Závěry:

Konjugáty mikroorganizmu N. meningitidis A a C se získaly z konečných poměrech PS/protein 1 a 0,6 až 0,7 (hmotn.). Volný PS a volný nosičový protein byl pod 10% respektive 15%. Výtěžek polysacharidu je vyšší než 70 %. Konjugáty PSA a PSC získatelné shora popsaným ío optimalizovaným postupem CDAP (bez ohledu na nosičový protein, ale přednostně s proteinem

D) je pak dalším aspektem vynálezu.

Příklad 10: Příprava konjugátu polysacharidu z mikroorganizmu H. influenzae b-PD 15

Mikroorganizmus H. influenzae b je jeden z hlavních agens, které způsobuje meningitidu u dětí mladších dvou let. V oboru je dobře znám kapsulámí polysacharid mikroorganizmu H. influenzae (PRP) tvoří konjugát s toxoidem tetanu (konjugace probíhá metodou vyvinutou J. Robbins). CDAP je zdokonalená chemická metoda. Následuje výčet optimálních podmínek pro CDAP zjiš20 těných pro případ konjugace PRP přednostně PD.

Parametry ovlivňující reakci konjugace jsou následující:

počáteční koncentrace polysacharidu (může mít vliv na konečné množství volného polysacharidu a krok sterilizace filtrací),

- počáteční koncentrace nosičového proteinu, počáteční poměr polysacharidu a proteinu (může mít vliv na konečné množství volného polysacharidu a sterilizaci filtrací),

- používané množství CDAP (obvykle se používá velký nadbytek), teplota reakce (která může ovlivnit rozpad polysacharidu, kinetiku reakce a rozpad reaktivních skupin), hodnota pH aktivace a konjugace, hodnota pH ukončení reakce (ovlivňuje množství zbytkového DMAP), doba aktivace, konjugace a ukončení reakce.

Zjistilo se, že 3 nejvíce kritické parametry pro optimalizaci kvality konečného produktu jsou počáteční poměr polysacharidu a proteinu, počáteční koncentrace polysacharidu a hodnota pH konjugace.

Reakční kostka se tak znázornila se třemi shora uvedenými podmínkami, jako tři osy. Centrální body (a rozmezí experimentálních hodnot) v případě těchto os jsou: poměr PS/protein =1/1 (±0,3/1), [PS] = 5 mg/ml (± 2 mg/ml) a Ph při párování je 8,0 (± 1,0 jednotek pH).

Méně podstatné parametry se zafixovaly následovně: použilo se 30 mg polysacharidu, teplota je 25 ^QC, (CDAP) = 0,75 mg/mg PS, pH se títruje 0,2M NaOH, pH aktivace je 9,5, teplota aktivace se udržuje po dobu 1,5 minut, teplota konjugace se udržuje po dobu jedné hodiny, koncentrace proteinu je 10 mg/ml, pH pro ukončení reakce je 9,0 teplota pro ukončení reakce se udržuje po dobu jedné hodiny, teplota pro rozpuštění PS v rozpouštědle se udržuje po dobu jedné hodiny a rozpouštědlo je 2M NaCl, Sephacryl S-400HR se eluuje 150 mM NaCl při rychlosti 12 cm/hodinu a sterilizace filtrací se provádí na SARTOLAB P20 při rychlosti 5 ml/min.

Vyhledávaná data při optimalizaci podmínek jsou: data zpracování - maximální výtěžek po filtraci, maximální množství začleněného proteinu a kvalita produktu - konečný poměr PS/pro-45CZ 301445 B6 tein, množství volného PS, množství volného proteinu, minimální množství zbytkového DMAP (rozklad produkce CDAP).

Výstup z filtrace

Faktor, který ovlivňuje výstup po filtraci je interakce mezi počáteční hodnotou pH (PS) a hodnotou pH (PS) a hodnotou pH při spojování a počáteční poměr PS/protein. Při nízké koncentraci PS dochází k malé interakci s pozdějšími dvěma faktory a rozhoduje dobrá schopnost se filtrovat (přibližně 95 % v případě všech produktů). Pri vysoké koncentraci se však filtrovatelnost snižuje, io jestliže hodnota pH a počáteční poměr roste (vysoká koncentrace PS, nejnižší poměr, nejnižší pH = 99 % filtrace, ale vysoká koncentrace PS, nejvyšší poměr a pH = 19 % filtrace).

Množství začleněného proteinu

Poměr konečného poměru PS/protein s ohledem na počáteční poměr je mírou účinnosti spojování. Pri vysoké koncentraci PS, hodnota pH neovlivňuje poměr poměrů. Avšak počáteční poměr ovlivňuje hodnotu poměrů (1,75 při nízkém počátečním poměru, 1,26 pri vysokém počátečním poměru). Při nízké koncentraci PS je poměr poměrů ve většině případů nižší, avšak pH vykazuje více účinků (nízké pH, nízký poměr = 0,96, nízké pH, vysoký poměr - 0,8, vysoké pH, nízký poměr = 1,4 a vysoké pH, vysoký poměr = 0,92).

Konečný poměr PS/protein

Konečný poměr závisí na počátečním poměru a koncentraci PS. Konečný poměr, který je nejlépe rozdělitelný podle velikosti, se získal kombinací vysokých počátečních poměrů a vysoké koncentrace PS. Účinek pH na konečný poměr není podstatný pokud je nízká koncentrace PS. Množství volného proteinu D

Nej menší množství volného proteinu D se pozorovalo při vysoké koncentraci PS (množství dosahuje hodnoty 0,0). Účinek vysoké koncentrace PS se stává zvláště znatelný pri nízkém pH. Zvýšení počátečního poměru trochu přispívá ke zvýšení množství volného proteinu D.

Zbytkový DMAP

Počáteční poměr nemá podstatný účinek. Naopak množství DMAP roste s koncentrací PS a klesá s rostoucím pH.

Závěry

Nejvýhodnější konjugační podmínky jsou následující: pH konjugace je 9,0, koncentrace PS je 3 mg/ml a počáteční poměr je 1/1. Při takových podmínkách charakteristiky konečného produktu jsou následující:

konečný poměr PS/protein	výstup PS z filtrace (%)	poměr poměrů	volný protein D (%)	množství DMAP (ng/10 pg PS)
hodnota	rozmezí	hodnota	rozmezí	hodnota	rozmezí	hodnota	rozmezí	hodnota	rozmezí
1, io	0,91- 1,30	92,6	50- 138	1,16 J	1,03- 1,29 1	0,71	0- 10,40	4.95	2,60- 7,80

Vynález dále popisuje konjugáty PRP, které je možné získat shora v textu popsaným (optimalizovaným) způsobem CDAP (bez ohledu na nosičový protein, ale přednostně se použije protein D).

Příklad 11: Protein D jako antigen - jak je možné zvýšit jeho účinnost ochrany proti netypovatelnému H. influenzae připojením 3D-MPL

Samice myši Balb/c (10 myší ve skupině) se imunizovaly poprvé ve stáří 20-ti týdnů (DO) (do to svalu) 11-valentní konjugační vakcínou obsahující pneumokokový polysacharid a protein D.

Druhá imunizace se provedla o dva týdny později (D14). 7 dní po druhé imunizaci se shromáždila krev. Titry protilátek proti proteinu D se měřily jako množství protilátek typu IgGl, IgG2 aIgG2b.

Připravily se za mrazu sušené undekavalentní vakcíny (bez A1PO₄) kombinací konjugátů s 15,57 % laktózou, míchaly se po dobu 15 minut při teplotě místnosti a pH se upravilo na hodnotu 6,1 ± 0,1 a lyofilizovaly se (cyklus obvykle začíná při teplotě -69 °C, postupně během 3 hodin se teplota zvyšuje na -24 °C a pak se tato teplota udržuje po dobu 18 hodin. Teplota se dále zvedá na -16 °C po dobu jedné hodiny a udržuje se po dobu 6 hodin a pak dosáhne během

3 hodin 34 °C a tato teplota se udržuje po dobu 9 hodin).

Složení kompozic vhodných pro lyofílizaci se uvádí v tabulce č. 13.

Je známo, že nejvýhodnější charakteristika, zde se objeví imunitní odezva zprostředkovaná buň25 kami typu Thl, koreluje s množstvím protilátek lgG2a. Jakje možné vidět na základě dat, dojde k překvapivě velkému zvýšení množství protilátek IgG2, jestliže protein D se lyofílizoval v adjuvans Thl (v tomto případě 3D-MPL).

-47CZ 301445 B6

Tabulkač. 13:Složení prostředků (pro aplikaci lidem) a titry protilátek proti proteinu D u myší (s dávkou 1/10)

d (M O tn w		rt rt rt l o	tt tt fN O	tt <N tt O	tt tt Γ' o	rt tt GD O	ř* r- ti rt	O tt rt *> O	O OJ tt O	tt ti <D tt	tt 00 O rt
ti Cd s M	vP	ti tt tt o	r· Γ4 ti O	ÍM O rt	ΓΜ rt rt	rt T* Γ4	c* λο tt o	tt tt rt	rt a ti o	tt O iA	rt urt rt
rt O M	n βϊ o	rt tt tt	ti tt tt	rN N? σ>	ti ,tt tt	tt h*' tt	cn tt tt	σ tt tt	rt 00 00	O) rt oo
cú fM U σ» M		-c CN O	tt r- i—t O	Ό l*5 O O	rt ti o σ	tt ti D O	ťD tt rt O	in ť- o o	tt rt rt o”	in rt	rt tn
CN O H	tt <N ti O	ti OD <N O	Γ' o fN o	<n tt rt O	r v rt O	rt rt O	tt 00 rt	Γ* p- o o	tt CJ	tn PJ
rt . u σ* H	s 's. σ X	tt r	tt tt	tt tt	<N tt	OJ tt	i—1 rt	tt ti	tt rt	v> ti	lA rt rt
44 H U ω £ 0 -P c: (U <U c. 3	1 'ti	ti *N	3 40	«4) § -fl »N	o tt rt rt l §	O tt rt rt u ti X z e	- tn O SL Ol o d ° <ť m	d 2 a. o H o Λ m	V iJ d. CU O 33 úl	kA EL £
4 > 0 Μ H OJ fl N H d C 0 .rl rl χ c u	fl. 1 CN	ω 0. 1 CN	w til 1 CN	f«3 IX 1 CM	ΌΪ £ 40 <N	-v I M0 rt	,(U c fl •fl rN	-ti c Ό MQ	-fl c fl fl •N	kflj -ti WJ
υ o rl rl τ*ι Ή a -u >d r > -H Φ U Q. W rl	c v fl fl	s fl 10 <4	·> a fl •a >N	c fl fl fl	ti « dP Ό 4J tt Λ! rt ti rt rt	« N <· Ό jj in X n fl H O	ti N * O M tt 44 rt ti H rt rt	fl n a* Ό jj irt X rl fl Η (Ώ	ti n ar O U M> rt rt ti -fl rt rt	fl N * -O JJ in X n fl ·. Η n
E Ή 44 W 0 44 č c 3 * rt 3	·> c fl fl fl	'5n § 10 >N	c fl fl fl	σ o io fl	>. c fl fl fl	>. C fl fl fl	>1 a fl A IN	> g 'ti	c fl fl fl	-!>. c fl fl fl
α ď) O ~ Cb rt rt i. < o	cn □. α o tt	tn a. o o m	cn d. o	5 o	σ zL o	fll i O	2 O	cn X o	ty 3. O	tt zt o
rt a. o o n cn cu ~	o> 1 x	9 a. ď>	s rt	b> =L tt	5 rt	σ> tt	2 rt	2 m	2 rt	tn zt in
fyzikální stav	l-t α « x	H fl a. a x	H fl 0. fl X	cl fl a. •o X	*J 0 >. rt	M4 0 >, rt	0 >1 rt	<u 0 >1 rl	M-l 0 ?h H	<j O >, rt

- 4Χ CZ 301445 B6

1 1	ZN < O CO	o 01 [Ji	» r/l CN ů
				m
	i—4		ιΛ	u?
	κ		lD
	C-í
	Γ7		i—t	o
	<O		m	<N
	O		10	σι
	<O		σ»	cn
				o
				σι
	Γ*		r-l	CO
	»n		cn	O
	(N			·
	OJ		r-	iH
			cH	CT
	m			CT
	vr			OJ
r-J			'>	>t
ct	H		c	fl
	iM		0	Ό
o	3		fl	fl
JI	a,		>N	*«
	-v			(4
	c		íd
	o		04	Ol
	•fl		I	1
	Ή		ÍN	ni
	(0
	!4	&
	Ό		fl)	fl)
	4->	&	tí	e
	Jí	r-t	Ό	fl
	fl		fl	Ά
		m	wJ
	O		O	Ů
	in		in
			rl —	rl
	CU	0*	Qi CT	Oj	ct
	X	i	s a.	E
			CT X	3
	ct
	_L		o	o
			o	o
	O		ďl	i/l
	ct		O*
	r4		H	lO
			1-4	*-4
	<u		fl	fl
	o		(X	a
			id	a
				jí

před injkecí, ² ± 2 hod-před injekci, 2-fenoxyethanol

Claims (13)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Imunogenní prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden polysacharidový antigen mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae, alespoň jeden proteinový antigen mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae nebo jeho imunologicky funkční ekvivalent a adjuvans, vyvolávající odezvu THl, přičemž jde o alespoň jednu látku ze skupiny monoio phosporyllipid A nebo jeho derivát, imunostimulační látka typu saponinu nebo imunostimulační oligonukleotid CpG.
2. 2. Imunogenní prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že proteinový antigen je vnější povrchový protein nebo vylučovaný protein mikroorganizmu Streptococcus

   15 pneumoniae nebo jeho imunologicky funkční ekvivalenty.
3. 3. Imunogenní prostředek podle nároku 1 nebo 2, vy z n aČ u j í cí se t í m , že proteinový antigen je toxin, adhesin nebo lipoprotein mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae nebo jeho imunologicky funkční ekvivalenty.
4. 4. Imunogenní prostředek podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že proteinový antigen nebo jeho imunologicky funkční ekvivalent je vybrán ze skupiny, tvořené pneumolyzinem, proteinem A, schopným vázat cholin, CbpA nebo jeho transmembránovou deleční variantou, proteinem A povrchu pneumokoků, PspA nebo jeho transmembránovou deleční variantou,

   25 proteinem C povrchu pneumokoků PspC nebo jeho transmembránovou deleční variantou nebo adhesinem A povrchem pneumokoků, PsaA nebo jeho transmembránovou deleční variantou nebo glyceraldehyd-3-fosfátovou dehydrogenázou.
5. 5. Imunogenní prostředek podle nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že polysacha30 ridový antigen je přítomen ve formě konjugátu polysacharidproteinový nosič.
6. 6. Imunogenní prostředek podle nároku 5, vyznačující se tím, že proteinový nosič je vybrán ze skupiny tvořené toxinem diftérie, toxinem tetanu, CRM197, hemocyaninem plžů Keyhole Limpet (KLH), proteinovým derivátem tuberkulin (PPD) a proteinem D zmikro35 organizmu H. influenzae.
7. 7. Imunogenní prostředek podle libovolného z nároků lažó, vyznačující se tím, že zahrnuje alespoň čtyři pneumokokové polysacharidové antigeny z různých sérotypů.

   40
8. 8. Imunogenní prostředek podle libovolného z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že adjuvans obsahuje alespoň jedno činidlo ze skupiny tvořené 3D-MPL, saponinovým imunostimulantem nebo imunostimulačním oligonukleotidem GpG.
9. 9. Imunogenní prostředek podle nároku 8, vyznačující se tím, že adjuvans obsa45 huje nosič vybraný ze skupiny tvořené emulzí olej ve vodě, lipozomy a solemi hliníku.
10. 10. Imunogenní prostředek podle libovolného z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, zeje vhodný pro použitíjako léčivo.

    50
11. 11. Vakcinační prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje imunogenní prostředek podle nároků 1 až 9.
12. 12. Použití pneumokokového polysacharidového antigenů Streptococcus pneumoniae v kombinaci s proteinovým antigenem mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae a adjuvans vyvoláva55 jícího odezvu TH1, obsahujícího alespoň jednu látku ze skupiny monophosporyllipid A nebo . sn CZ 301445 B6 jeho derivát, imunostimulační látka typu saponinu nebo imunostimulační oligonukleotid CpG při výrobě léčiva vhodného pro prevenci zápalu plic u pacientů starších 55 let.
13. 13. Způsob přípravy imunogenního prostředku podle nároku 1 až 10, vyznačující se 5 tím, že zahrnuje:

    výběr jednoho nebo více pneumokokových, polysacharidových antigenů, výběr jednoho nebo více pneumokokových proteinových antigenů,

    - výběr adjuvans vyvolávajícího TH1, obsahujícího alespoň jednu látku ze skupiny monophosporyllipid A nebo jeho derivát, imunostimulační látka typu saponinu nebo imunoio stimulační oligonukleotid CpG, a smíchání polysacharidových a proteinových antigenů a adjuvans s vhodným excipientem.