TWI235064B - Lyophilized antigenic composition comprising conjugated streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides - Google Patents

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1235064 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（4) 自2 0世紀初，研究者已試驗了許多種可加至抗原中之化 合物’以改良其在疫苗組合物中之免疫原性[概述於M· F. 包威爾（Powell)與M. J·紐曼（Newman)，紐約普雷門出版社 (Plenum Prees，NY)，”疫苗設計·亞單位與輔劑處理法” (Vaccine Design-the Subunit and Adiuvant Approach)(l995)，第7章，”疫苗輔劑與赋形劑概論”（a Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients)]。有許多 化合物很有效，但令引起顯著之局部與全身不良反應，而 無法用於人類疫苗組合物中。以鋁為主之輔劑（如：礬 土、氫氧化鋁或磷酸鋁）首先發表於1926年，為美國唯一 核准用於人類疫苗之免疫輔劑。 以鋁為主之輔劑為透過其所謗發，，貯積效應”而發揮作用 之載體類辅劑實例。抗原係吸附在其表面上，且當注射組 合物時，輔劑與抗原不會立即散佈在血流中，組合物反而 停留在局邵注射位置，造成更顯著之免疫反應。這種載體 辅劑之另一項已知優點為適合穩定容易分解之抗原，例 如：某些多醣抗原。 3D-MPL為非載體輔劑之實例。其全名為3_〇_去醯基-單 磷醯基脂質A(或3去-0-醯基單磷醯基脂質a或3_〇_去醯基一 4’·單磷醯基脂質A)且稱為SD-MPL，代表還原端葡糖胺之 3 -位置為去0-醯基化。其製法參見GB 222〇211 A。在化 學上，其係具有4、5或6條醯基鏈之3_去醯基化單磷醯基 脂質A之混合物。其最早於1990年代初期製造，當時脂質 A之4，-單磷醯基衍生物（MPL)之3_〇_去醯基化法產生之分 ---------------------.訂·1·!-------線 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁)

1235064 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7 五、發明說明（7 ) 計，V i多醣疫苗在預防培養物確認傷寒上之效力在55%至 77%之間（普洛金（Plotkin)與甘（Can)，1995, Arch Intern Med. 111:2293-99)。腦膜炎C多醣疫苗在流行病條件下之效力為 79%(P.狄瓦（De Wals)等人（1996) Bull World Health Organ· 74:407-411)。23價肺炎球菌疫苗之臨床效力則有很大變 化’由 O/ί)至 81%(費森（Fedson)等人（1994) Arch Intern Med. 111:253 1-2535)。如上已述，已認為肺炎球菌疫苗之保護效 力或多或少與接種時謗發之抗體濃度相關。 在使用多酷進行接種之相關問題中，多酷本身為不良之 免疫原。過去為了克服此免疫原性缺陷而設計之方法包括 由多醋連接大型之高免疫原性蛋白質載體，該載體從旁協 助T -細胞。 目前常用於製造多醣免疫原之此等高免疫原性載體包括 白喉類毒素（DT或CRM197突變株）、破傷風類毒素（ττ)、鑰 孔戚血藍素（KLH)及結核菌素之純化蛋白質衍生物（ppD)。 與目前使用之載體相關之問題 目如使用之載體分別有許多相關問題，包括GMp共軛物 之生產及共輛物之免疫特性。 儘管此等載體為常用載體且已成功謗發抗多醣抗體反 應，但仍有幾項缺點。例如··已知抗原專一性免疫反應可 能因已先存在針對載體之抗體而受到抑制（抗原決定基抑 制作用），如：破傷風毒素（戴強（Di J〇hn)等人〇989)， Lancet，2:1415·8)。在大型族群中，有極高比例之人口已對 DT及ΤΤ二者先具有免疫力，因為這些人曾接受此等抗原 --------------------f訂- If------^線 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) -10- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235064 A7 ______B7 五、發明說明（8) 例行接種。例如：在英國，95%兒童接受含DT與TT二種 之DTP疫苗。其他作者已在動物模式中說明抗原決定基抑 制肽疫苗之問題（薩德（Sad)等人，Immunology，1991; 74:223-227;舒茲（Schutze)等人，J. Immunol. 135:4，1985; 2319-2322)。 此外，對需要定期追加接種之疫苗而言，採用高免疫原 性載體（如：TT與DT)容易在數次注射後抑制多醣抗體反 應。此等多重接種法亦可能出現不要的反應如··延滯型過 度反應（DTH)。 已知KLH為強力免疫原，已在人體臨床試驗中用為IgE肽 I載體。然而，已觀察到某些不良反應（似DTH反應或IgE 敏化）及對抗抗體之抗體反應。 因此為以多醣為主之疫苗選擇載體蛋白質時，需要在採 用適合所有患者之載體（寬廣之MHC辨識性）之必要性與謗 發高度抗多醣抗體反應及對抗載體之低度抗體反應之間取 得平衡。 載缸過去曾用於以多醣為主之疫苗，因此有許多缺點。 尤其田為組合疫苗時，其中若不同多醣抗原使用相同載體 時抗原決疋基抑制作用問題特別嚴重，在w〇 98/5丨3 3 9 中在、'且口疫田中使用多重載體，試圖克服此問題。 、本發明棱供一種新載體用於製備以多醣/多肽為主之免 疫原性共輛物’但沒有上述缺點。 本發月(、#來自流感嗜血桿菌之蛋白質D(Ep 〇 B1)，或其片段’作為以多醣為主之免疫原性組合 括 --------IT·—*-------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1235064

五、 發明說明（9) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 疫田）< 載體。此載體之用法在組合疫苗中特別有 發明概述 A)肺炎球菌多醣疫苗 因此本發明提供一種疫苗組合物，其包含至少一種肺炎 鏈球菌多醣抗原（以共軛較佳）及肺炎鏈球菌蛋白質抗原或 其免疫性功能同等物，視需要使用Thl輔劑（係一種謗發 免疫反應之輔劑）。最好包括肺炎球菌蛋白質與了“輔 劑二者。本發明組合物特別適合治療老年人肺炎。 、肺炎球菌多醣疫苗（共軛或非共軛）可能無法保護老年人 j群對抗肺炎，因為這種疾病之發生率極高。對抗肺炎球 菌之重要防術機轉為調理素細胞呑噬作用（一種由對抗肺 炎球菌多醣而產生之抗體引起之液體B _細胞/嗜中性白血 球所調節過程，細菌最後則被呑噬）然而老年人之涉及調 性機轉之部份過程受損，亦即由PMN(多形核細胞）產生超 氧化物，產生其他反應性氧物質，PMN之固定化，之 細胞调亡，PMN之變形能力。老年人之抗體反應亦可能受 損。 與一般接受之信條相反，抗莢膜多醣抗體之正常含量可 犯無法有效完全清除細菌，因為肺炎球菌可能侵入宿主細 胞來逃避此分支之免疫系統。 本發明者驚人地發現，除了刺激免疫系統之體液分支系 統（受B -細胞調節）外，尚同時刺激免疫系統受細胞調節之 分支系統（例如··受T -細胞調節之免疫力）時，產生之增效 (或k同）結果可以加強宿主清除肺炎球菌。這種發現有助 --------^ii------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 12 A7 1235064 ___B7______ 五、發明說明（10) 於防止（或治療）一般肺炎球菌感染，但對預防（或治療）老 年人肺炎特別重要，因為以多醣為主之疫苗未展現效力。 本發明者已發現，若肺炎球菌多醣（以共軛較佳）與肺炎 球菌蛋白質（以表現在肺炎球菌表面上、或為分泌或㈣ 之蛋白質較佳’其可在受感染之哺乳動物細胞表面上丨^級 及MHC I級環境中處理及呈現）共同投藥時，免疫系統之 二個分支可依此方式増強效用。雖然肺炎球菌蛋白質本身 可啟動細胞調節之免疫力，但本發明者亦發現疫苗調配物 中含有Thl謗發輔劑時，有利於此分支之免疫系統，且驚 人地進一步加強二個免疫系統分支之增效性。 B )選定之肺炎球菌多醣共軛物+3D-]y[PL組合物 因此，本發明亦提供一種抗原性組合物，其包含一種或 多種多醣共軛物，以3D-MPL為輔劑，且實質上不含以鋁 為主之輔劑，其中至少一種肺炎球菌多醣共軛物在包含 3D-MPL之組合物中之免疫原性顯著高於在含3D_MpL且採 用以铭為主之辅劑之組合物中之免疫原性。 較佳具體實施例提供抗原性組合物，其包含一種或多種 下列肺炎球菌莢膜多醣之共軛物：血清型4、6B、i 8C、 19F與23F。此等組合物中，各該多醣在僅含3D_MpL之組合 物中之免疫原性驚人地高於在含3D_MPL及以鋁為主之輔 劑之組合物中。 因此本發明一項具體實施例中，提供一種抗原性組合 物，其包含與免疫原性蛋白質共軛之肺炎鏈球菌莢膜多醣 血清型4、6B、18C、19F或23F及3D-MPL輔劑，其中該組合 -13- 本紙張尺度適財國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱） --------------- (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235064 A7 五、發明說明（13) 炎球菌多醣抗原與Th 1輔劑。 _本發明之肺炎鏈球菌多醣抗原 項 典型地，本發明肺炎鏈球菌疫苗將包含多醣抗原（以业 軛較佳），其中多醣衍生自至少四種肺炎球菌血清型。^ 四種血清型最好包括6B、14、19F與23F。更佳者，組合物 包括至少7種血清型，例如衍生自血清型4、6B、9V、、 18C、19F及2 3F者。更佳者，組合物中包括至少丨丨種血清 型，例如：一項具體實施例中之組合物包括衍生自血清:

tV 1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F及23F之莢膜多醣 (以共軛較佳）。本發明較佳具體實施例中，包括至少1 3種 多醣抗原（以共軛較佳），但本發明亦包括其他 例如價(如：血清型丨小以小…上:、 9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、 20、22F、23F與33F)。 成 包 為老年人接種時（例如：預防肺炎），宜在上述丨丨價抗原 性組合物中添加血清型8與12F(及最佳者15與〗])，形 15價疫苗，而對嬰兒或幼兒（其中較著重於中耳炎= 括血清型6A與19A，形成13價疫苗。 且 多 明 與 為了預防/減輕老年（55歲以上）族群之肺炎及嬰兒 18個月）及幼兒（典型為18個月至5歲）之中耳炎，本發 之較佳具體實施例係由本文說明之多價肺炎鏈球菌多醣 肺炎鏈球菌蛋白質或其免疫性功能同等物組合。 本發明肺炎球茼I白質 為了本發明之目的，”免疫性功能同等物”之定義為八有 16 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格⑵Q χ 297公髮） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235064 A7 ----------------- 五、發明說明（14) 至少一種來自本發明蛋白質之保護性抗原決定基之疋白祈 讀。這種抗原決定基之特徵為曝露在表面上，“ 性’且可在宿主體内謗發殺細菌性抗體反應，或預防毒性 效應。較佳者，功能性同等物具有來自本發明蛋白質之至 少1 5個，且最好3 〇個或更多個鄰接之胺基酸。最佳者， 可使用蛋白質之片段、刪除(如、其穿膜刪除變異體，亦 即使用蛋白質之細胞外區）、融合、化學或遺傳法去毒之 何生物，等等，但其限制條件為應可引起實質上與天然蛋 白質相同之免疫反應。 本發明蛋白質較佳為彼等曝露在肺炎球菌外表面肺炎球 菌蛋白質（在肺炎球菌之至少部份生命循環中，可被宿主 之免疫系統辨識），或為肺炎球菌分泌或釋出蛋白質。最 佳者’蛋白質為肺炎鏈球菌之毒素、黏合素（adhesin)、兩 成份之訊號轉導劑、或脂蛋白，或其免疫性功能同等物。

特別適合包括在這種組合疫苗中之蛋白質包括（但不限 於）：肺炎球菌自溶酶（最好利用化學處理或突變法去除毒 性）（米契爾（Mitchell)等人，Nucleic Acids Res. 1990 Jul 11; 18(13):40 10”來自肺炎鏈球菌1與2型之肺炎球菌自溶酶基 因與蛋白負之比較（Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2);米契 爾等人，Biochim Biophys Acta 1989 Jan 23; 1007(1): 67-72 ” 肺炎球菌自溶酶基因於大腸桿菌中之表現：迅速純化法與 生物性質（Expression of the pneumolysin gene in Escherichia Coli: rapid purification and biological properties); WO -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------tri^-------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1235064 A7 __B7_ 五、發明說明（15) (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 96/05859 (A·赛米德(Cyanamid) ; WO 90/06951(巴頓（Paton)等 人）；WO 99/03884(NAVA)] ; PspA與其穿膜刪除變異體（US 5804193-布里爾（Briles)等人）；PspC與其穿膜刪除變異體 (WO 97/09"4-布里爾等人）；PsaA與其穿膜刪除變異體（貝 里（Berry)與巴頓（Paton)，Infect Immun 1996 年 12 月； 64(12):5255-62，”PsaA之序列異源性，係肺炎鏈球菌之毒 性所必要之37 kD假想之黏合素"（Sequence heterogeneity of PsaA，a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae);肺炎球菌膽驗結合性蛋白質 及其穿膜刪除變異體；CbpA與其穿膜刪除變異體（WO 97/41151 ; WO 99/51266);甘油醛_3·磷酸酯-去氫酶（Infect. Immun. 1996 64:3544) ; HSP70 (WO 96/40928) ; PcpA(山茲-貝特（Sanchez-Beato)等人，FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14);似 M蛋白質，SB 專利申請案No· EP 0837130 ; 及黏合素18627，SB專利申請案No. EP 0834568。 本發明使用之蛋白質最好選自：肺炎球菌自溶酶、 PsaA、PspA、PspC、CbpA或其中二種或多種之組合。本發 明亦包括這種蛋白質之免疫性功能同等物（如上述定義）。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 組合物中，蛋白質可協助謗發T ·細胞調節之反應來對抗 肺炎球菌疾病（此係保護對抗胺炎特別需要者），此反應與 免疫系統之體液分支系統合作抑制肺炎球菌入侵，並刺激 調理素細胞呑嗤作用。 包括蛋白質抗原之另一項優點為對調性素細胞呑噬過程 提供另一種抗原，並抑制細胞黏合（若使用黏合素時）或中 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1235064 A7 -------___ 五、發明說明（16) 和毒素（若使用毒素時）。 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁)

*因此本發明之具體實施例中，提供—種肺炎鏈球菌疫 田，其包含肺炎球菌多醣共輛物疫苗，包含街生自至少四 f血m型（最好至少7種血清型，至少n種血清型更佳）之 :醣說原，及至少一種（但最好二種）肺炎鏈球菌蛋白質。 最好其中一種蛋白質為肺炎球菌自溶酶或PsaA (以去毒性之肺炎球菌自㈣最佳）。較佳組合至^ 含肺炎球菌自溶酶或其衍生物與PspA ^ 、如上已述，與多醣接種法有關之問題為多醣本身即為不 良之免疫原。為了克服此問題，多醣可與蛋白質載體共 軛^作為τ-細胞之助手。因此，本發、明利用之多醣最好連 接這種蛋白質載體。常用於製造多醣免疫原之此等載體實 例包括白喉與破傷風類毒素（分別為DT，dt 及 ττ)，鑰孔戚血藍素（KLH)、來自腦膜炎奈氏球菌（ν· meningitidis)之0MPC及結核菌素之純化蛋白質衍生物 (PPD)。 然而，有許多問題與此等常用之各載體有關（參見上述，， 與常用載體有關之問題”一節）。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明之較佳具體實施例中提供一種新穎載體用於製備 以多醣為主之免疫原構築體，不會出現此等缺點。較適於 以肺炎球菌多醣為主之免疫原性組合物（或疫苗）之載體為 來自流感嗜血桿菌之蛋白質D(EP 594610_B)，或其片段。 適用之片段包括含T -助手抗原決定基之片段。特定言之， 蛋白質D最好包含蛋白質1/3 N•末端。 19· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱） 1235064 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（17) 其他較適於肺炎球菌多醣之載體為肺炎球菌蛋白質本身 (如上述”本發明肺炎球菌蛋白質”一節所定義）。 本發明疫苗最好含有輔劑。合適輔劑包括銘鹽如：氫氧 化鋁凝膠（alum)或磷酸鋁，但亦可為鈣、鐵或鋅之鹽，或 可為醯化酪胺酸、或醯化糖、陽離子性或陰離子性衍化之 多醣或聚磷腈之不可溶懸浮液。 輔劑最好選自TH1型效應之優先謗發劑，以協助免疫反 應之細胞所調節之分支系統。 太發明之TH1輔齋丨 高含量Thl-型細胞素似乎有利於謗發對特定抗原之受細 胞調節之免疫反應，而高含量Th2-型細胞素則有利於謗發 對抗原之體液免疫反應。 應記住，Thl與Th2·型免疫反應沒有絕對區分。事實上， 某個體支持一種免疫反應，稱為主要Thl或主要Th2。然 而，經常宜就莫斯曼（Mosmann)與考夫曼（Coffman)說明之 鼠類CD4+ ve T細胞純系考量細胞素族群（T.R.莫斯曼與R.L. 考夫曼（1989)，TH1與TH2細胞··造成不同功能性質之不同 淋巴素分泌型態（TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology，7，p 145-173) 〇 傳統上，Thl-型反應與T -淋巴球生產INF- r與IL_2細胞素有關。其他經 常與謗發Thl型免疫反應直接相關之細胞素則不由T ·細胞 產生，如：IL-12。反之，Th2·型反應與 IL-4、IL-5、IL-6、 IL-10之分泌有關，促進主要Thl反應之合適輔劑系統包 -20- @張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----------------，訂 ir------線· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 1235064 ____B7_____ 五、發明說明（18) 括：單磷醯基脂質Α或其衍生物，特定言之3-去-〇-醯基化 單磷醯基脂質A，及單磷醯基脂質A，以3-去_〇-醯基化單 璘醯基脂質A(3D-MPL)較佳，與鋁鹽之組合。 一種加強系統涉及單磷醯基脂質A與皂角甞衍生物之組 合，特定言之如WO 94/00153所述之QS21與3D-MPL之組 合，或反應原性較低之組合物，其中如WO 96/33739所揭 示，以膽固醇中止QS21之反應。 一種涉及QS21、3D-MPL及生育驗之水包油性乳液之特 別強效輔劑調配物說明於WO 95/17210，且為較佳調配物。 較佳者，該疫苗另包含皂角甞，以QS21更佳。調配物亦 可包含水包油性乳液及生育酚（WO 95/17210)。 本發明亦提供一種製造疫苗調配物之方法，其包括混合 本發明蛋白質與醫藥上可接受之赋形劑，如：3D-MPL。 含未甲基化CpG之寡核苷酸（WO 96/02555)亦為TH1反應 之優先謗發劑，且適用於本發明。 特別佳之本發明組合物包括一種或多種共軛之肺炎球菌 多醣，一種或多種肺炎球菌蛋白質及Thl輔劑。採用這種 Th-1輔劑可以協助肺炎球菌蛋白質（如上述）謗發受細胞調 節之反應及二種免疫系統分支之間之合作，而形成對抗一 般肺炎球菌疾病特別有效之疫苗，且重要的是，對抗老年 人肺炎球囷胺炎特別有效之疫苗。 本發明另一方面係提供本文說明之免疫原或疫苗用於醫 藥。 本發明另一方面提供一種組合物，其包含肺炎球菌多醣 L___-21 - 本紙張尺度賴中國國家標準（CNS)XJ^ (21G χ 297

Aw--------ITi^-------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235064 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（19) 共軛物與Thl輔劑（以3D_MPL較佳），可以在無反應族群中 血清轉化或謗發對抗多醣抗原之體液抗體反應。 已知10-30%族群對多醣免疫接種沒有反應（對疫苗中5〇% 以上血清型沒有反應）[康拉德森（K〇nradsen)等人，Sc⑽d j Immun 40:251 (1994);洛奇格茲（Rodriguez)等人，Jm， 173:1347 (1996)]。這種情形亦出現在共軛疫苗（慕希 (Musher)等人，Clin· Inf· Dis· 27:1487 (1998))。此現象在高 危險群（嬰兒、幼兒及老年人）特別嚴重。 本發明者已發現，由共軛之肺炎球菌多醣（其在特定族 群中之反應低）與Th 1辅劑之組合（見上述”本發明之Th 1輔 劑）可驚人地克服這種無反應性問題。應使用3D-mpl較 佳’且以不含以鋁為主之輔劑之3D_MPL最佳（仍提供更佳 反應）。因此本發明提供這種組合物，並再提供一種對肺 炎球菌多醣無反應之治療法，其係投與這種組合物，且尚 提供一種使用Thl辅劑製造包含共軛之肺炎球菌多醣抗原 (醫藥之用途，供治療對多醣抗原無反應之個體對抗（或 預防）肺炎球菌疾病。 在一項具體實施例中，有一種預防或改善老年人肺炎之 方法’其包括對該老年患者投與安全且有效量之如本文所 述之疫苗’其包含肺炎鏈球菌多醣抗原及抑或Th丨輔劑， 或肺炎球菌蛋白質（以同時使用二者較佳）。 另一具體實施例中，提供一種預防或改善嬰兒或幼兒中 耳炎之方法，其包括對該嬰兒或幼兒投與安全且有效量之 疫苗’其包含肺炎鏈球菌多醣抗原及抑或肺炎鏈球菌蛋白 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐） --------ί ^------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1235064 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（20) 質抗原或Th 1辅劑（以同時使用二者較佳）。 上述本發明方法中，多醣抗原最好呈多醣蛋白質共軛 物。 本發明之疫苗製劑 本發明之疫苗製劑可用於保護或治療容易感染之哺乳動 物，其係經由全身或黏膜途徑投與該疫苗。此等投藥法可 包括經由肌内、腹膜内、皮内或皮下途徑注射；或經由黏 膜投藥至口腔/消化道、呼吸道、生殖泌尿道。以鼻内投 與疫苗治療肺炎或中耳炎較佳（因為可更有效預防肺炎球 菌通過鼻咽道，進而在最早期減輕感染）。 各疫苗劑量中共軛物抗原之用量選擇在可謗發免疫保護 性反應且沒有典型疫苗之顯著不良副作用時之用量。這種 用量將依所採用之專一性免疫原及其呈現方式而定。通 常，各劑量應包含〇·ΐ至100微克多醣，以0丨至別微克較 佳，以0.1至10微克更佳，其中i至5微克為最佳範圍。 疫苗中蛋白質抗原含量典型在1至1〇〇微克範圍内，以5 至50微克較佳，最典型在5至25微克之範圍内。 對特定疫苗之最適當成份用量可由觀察個體之適當免疫 反應之標準實驗來決定。在初次接種後，該個體可在適當 間隔下追加一劑或數劑疫苗。 疫苗製劑一般說明於”疫苗設計學”（Vaccine Design)(，，亞 單位與輔劑處理法 ”（The subunit and adjuvant approach)， M.F·包威爾（Powell)與M.J.紐曼（Newman)編輯，1995，紐約 普雷門出版社（Plenum Press New York)。包括在微脂粒中 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公爱） ---------丨丨丨丨丨丨I-訂--t丨！丨丨線 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) l235〇64

五、發明說明（21) 之方法說明於冨樂頓（Fullert〇n)之美國專利案4,235,877中。 B )特定之肺炎球菌多醣共軛物+3D-MpL組合物 /為了本發明之目的，”本發明肺炎球菌多醣共軛物，，說明 $等肺炎鏈球菌英膜多醣之共軛物，其在含3D_MpL之組 :物中之免疫原性比在含3D_MpL與以鋁為主之輔劑之組 泛物中之免疫原性高（例如：血清型4 ;血清型6 B ;血清 梨18C ;血清型19F或血清型2;317之共軛物）。 為了本發明之目的，”實質上不含以鋁為主之輔劑”一詞 =指該組合物中以鋁為主之輔劑（例如：氫氧化鋁，及特 疋吕 <磷酸鋁）之含量不足以使本發明肺炎球菌多醣共軛 ，之免疫原性比含3D-MPL但未添加以鋁為主之輔劑之同 等組合物有任何程度之下降。較佳者，該抗原性組合物應 匕各基本上由3D-MPL組成之辅劑。每個劑量中以鋁為主 之辅劑添加量最好低於50微克，低於3〇微克更佳，低於 1 〇微克亦更佳，以未添加以鋁為主之輔劑至本發明抗原性 組合物中最佳。 為了本發明之目的，應依實例2所述，判斷肺炎球菌多 醣共軛物在含3D-MPL之組合物中之免疫原性是否顯著高 於在含3D-MPL與以鋁為主之輔劑之組合物中之免疫原 性。當僅含3D-MPL時，判斷組合物之免疫原性是否顯著 較高之指標為僅含3D-MPL之組合物相對於含3D_MpL與磷 酸鋁辅劑之同等組合物之間之GMC IgG濃度比例（依實例2 決足）應大於2，大於5較佳，大於7更佳，大於9亦更佳， 且大於1 4最佳。 -24- 本紙張尺度適时國國家鮮（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) --------ιτί·*-------線泰 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235064 A7 ____Β7 _ 五、發明說明（22) 與多醣接種法有關之問題中，多醣本身即為不良之免疫 原。為了克服此免疫原性缺陷而設計之作法包括由多醣與 大型蛋白質載體連接（共軛），作為τ _細胞之助手。本發明 之肺炎球菌多醣最好連接可作為τ _細胞之助手之蛋白質載 體。可使用之這種載體實例包括白喉、白喉突變株、及百 曰咳類毒素（分別為DT、CRM197及ΤΤ)、鑰孔戚血藍素 (KLH)、結核菌素之純化蛋白質衍生物（ppD)及腦膜炎奈氏 球菌之OMPC。 最佳者’採用來自流感嗜血桿菌之蛋白質D(；EP 0 594 610_ B)或其片段（見C小節）用為本發明肺炎球菌多醣之免疫原 性蛋白質載體。 本發明抗原性組合物之一項具體實施例中，包含與免疫 原性蛋白質共軛之肺炎球菌多醣血清型（ps) 4，並使用3D-MPL輔劑碉配，其中組合物實質上不含以鋁為主之辅劑。 另一項具體實施例中，抗原性組合物分別包含PS 6B，

18C ’ 19F或23F，與免疫原性蛋白質共軛，並使用3D_MPL 輔劑調配，其中組合物實質上不含以鋁為主之輔劑。 本發明另一項具體實施例中，提供一種組合之抗原性組 合物’其包含選自 PS 4，PS 6B，PS 18C，PS 19F及PS 23F 之一種或多種肺炎球菌多醣共軛物，使用3D_mpl輔劑調 配’其中組合物實質上不含以鋁為主之輔劑。 本發明肺炎球菌多醣共軛物之免疫原性不受與其他肺炎 球菌多醣共軛物組合顯著影響（實例3 )。因此，本發明較 佳方面係提供一種組合之抗原性組合物，其包含一種或多 _______25_ 本紙張尺錢时__ii鮮（cns)A4祕（21g -----I訂-------線 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 1235064 A7 五、發明說明（23) 種本發明肺炎球菌多醣共軛物與一種或多種其他肺炎球菌 多酷共輛物之組合，其中組合物使用3D_mpl輔劑調配， 但實質上不含以鋁為主之輔劑。 另項較佳具體實施例中，提供組合之抗原性組合物， 其包含選自PS 4，6B，18C，19F或23F肺炎球菌多醣共軛物 中至少一種，且最好2，3，4或全部5種共軛物，及其他 肺炎球菌多醣共軛物之任何組合，使用3D_mpl輔劑調 配’但實質上不含以鋁為主之辅劑。 〃 i地本發明肺炎鍵球菌組合抗原性組合物將包含多 醋共輛物抗原，其中多醣衍生自至少4、7、1 1、1 3、；! 5 或2 3血⑺型（見上述”本發明肺炎鏈球菌多醣抗原，，一節， 血α型之較佳組合依待治療之疾病而定）。 本發明之抗原性組合物最好呈疫苗組合物使用，供預防 (或治療）肺炎球菌感染，特別對老年人與嬰幼兒。 、本發~明其他具體實施例包括：提供上述抗原性組合物用 於醫藥，一種謗發對肺炎鏈球菌莢膜多醣共軛物之免疫反 應 < 方法，其包括對患者投與安全且有效量之上述一種抗 ，丨、、且6物之步驟，及以上述一種抗原性組合物於製造醫 藥用於預防（或治療）肺炎球菌疾病之醫藥上之用途。 消 竒 ♦ 為了預防/改善老年人（55歲以上）族群肺炎及嬰兒（至Η 個月）及幼兒（典型指18個月至5歲）之中耳炎，本發明另 一㈣佳具體實施例為組合依本文所述調配之多價肺炎鏈 Ϊ固f聽共輛物與一種肺炎鏈球菌蛋白質或其免疫原性功 月b同等物較佳蛋白質/蛋白質組合可參見上述”本發明肺 -26 1235064 五、發明說明（24) 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 炎球菌蛋白質” 一節。 上文說明之抗原性組合物（與疫苗）最好經過冷凍乾燥， 直到臨用前為止，此時使用稀釋劑臨時重新組成。更佳 者，其係於3D-MPL之存在下冷凍乾燥，臨時使用生理食 鹽水溶液重新組成。 =合物冷凍乾燥形成更安定組合物（例如：防止多醣抗 原刀解）、。此方法亦驚人地造成較高之抗體效價，仍可對 抗肺炎球菌多醣。此點對ps 6B共軛物特別重要。因此本 發明另一方面為冷凍乾燥之抗原性組合物，其包含⑼ 共軛物，使用3D-MPL為輔劑，且實質上不含以鋁為主之 輔劑。 疫田之製法參見上述，，本發明疫苗製法，，一節。 C )細菌性多醣·蛋白質〇共軛物 組合—疫苗之趨勢有利於降低接受者之不適感，有助於計 又藥’並確實完成療程；但同時有降低疫苗效力之風險 (見上文有關過度使用載體蛋白質而抑制抗原決定基之討 :)。广’宜製造符合族群需求，且其成份之間沒有免 ::Γ:Γ題，苗組合。這些優點可由本發明之免疫 1' (或疫田）達成，其特別有利於投與組合疫苗給 南危險群，如··嬰兒、幼兒及老年人。 j # t #來自^>感嗜血捍菌之蛋白質D，或其片 :又。：用:醣為主之免疫原性組合物(包括疫苗)之載 :，=:片Γ包括含T-助手抗原決定基之片段。特定言 I虫白質D片段最好包含蛋白質1/3N_末端。 # 計 本紙張尺度翻巾^家鮮（cns)A4 ϋ -27 〇 χ 297 ) A7

1235064 五、發明說明（26) 多醣落於水或生理食鹽水溶液中D CDAP溶於乙腈中， 立即加至多醣溶液中。CDAP與多醣之羥基反應，形成氰 酸酯。活化步騾之後，添加载體蛋白質。離胺酸之胺基與 活化之多醣反應，形成異脲共價鏈結。 偶合反應之後，添加大量過量甘胺酸，中止殘留之活化 官能基之反應。產物隨後通過凝膠滲透法，排除未反應之 載體蛋白質與殘留試劑。因此本發明提供一種製造多醣蛋 白質D共軛物之方法，其包括活化多醣及連接多醣與蛋白 質D之步驟。 本發明較佳具體實施例中，提供一種免疫原性組合物 (或疫苗）調配物，供預防肺炎鏈球菌感染。 肺炎球菌散播至肺部、腦脊髓液及血液中之機轉尚未明 暸。到達正常肺泡之細菌生長會因其中相當乾燥而受抑制 且受到肺泡巨噬細胞之呑噬活性而抑制其生長。這些協調 性防衛機轉有任何組織上或生理上變化時，均會加強肺部 感染之敏感性。肺炎鏈球菌之細胞壁在肺泡中產生免疫反 應上扮演重要角色（基樂斯皮（GiUespie)等人（1997)，1&1 65:3936)。 典型地，本發明肺炎鏈球菌疫苗包含蛋白質D多醣共輛 物’其中多醣衍生自至少4、7、11、13、15或23血清型。 依待治療之疾病選擇較佳血清型組合時，可參見上文，，本 發明之肺炎鏈球菌多醣抗原，，一節。 本發明另一項具體實施例中，提供一種腦膜炎奈氏球菌 疫苗；特定言之選自血清型A、B、C、W-135與Y。腦膜 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公t ) --------tl_-^-------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235064 A7 ________J7_____ 五、發明說明（27) 炎奈氏球菌為細菌性腦膜炎最重要原因之一。此等生物體 之灰水化合物莢膜可作為毒性決定子，且為保護性抗體之 標的。儘管如此，已知碳水化合物在幼童體内為不良之免 疫原’本發明提供一種特別適合此等多醣之蛋白質載體， 蛋白質D，其提供之了_細胞抗原決定基可活化丁_細胞反 應，協助多醣抗原專一性Β -細胞增殖與成熟，並謗發免疫 記憶。 另一項本發明具體實施例中，提供流感嗜血桿菌 b ( PRP)-之莢膜多醣·蛋白質〇共軛物。 本發明亦包括組合疫苗，其提供對抗多種不同病原菌之 保護。蛋白質D載體驚人地適用為組合疫苗中之載體，其 中使多重多醣抗原共軛。如上已述，若各多醣均採^相^ 載體時，抗原決定基抑制作用容易發生。w〇 98/5 1339提 出之組合物試圖將這種干擾降至最低，其作法為將組合物 中一部份多醣與D T共軛，其餘與T τ共軛。 、、本發明者已騖人地發現蛋白質D特別適合使組合疫苗中 這種抗原決定基抑制效應降至最低。組合中一種或多種多 酷宜與蛋白質D共輛，且最好所有抗原均與這種組合疫苗 中蛋白質D共軛。 二較佳組合包括提供保護對抗腦膜炎奈氏球菌〔與¥(以γ 較佳）感染之疫苗，其中由來自血清型γ與C (以Α最之 多醣抗原連接蛋白質D。 以流感嗜血捍菌為主之疫苗（pRp最好與TT、DT或 CRM197共輛，或與蛋白心共輛最佳）可採用上述組 ---------------------訂· — ^-------線 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) -30- A7 1235064 B7 五、發明說明（28) 苗調配。 目前許多小兒科用疫田均為組合疫苗，以減少兒童接受 注射之次數。因此小兒科用疫苗可使用本發明疫苗調配其 他抗原。例如：本發明疫苗可使用習知之”三價，，組合疫苗 調配，或分開但同時投藥，該三價組合疫苗包括白喉類毒 素（DT)、破傷風類毒素（TT)及百曰咳成份[典型為去毒性百 曰咳類毒素（PT)與絲狀血球凝素（FHA)，視需要使用白泰 丁（pertactin; PRN)及/或凝集素1 + 2 ]，例如··疫苗商品 INFANRIX-DTPaTM(史必克占生化公司（SmithKlineBeecham

Biologicals))，其包含 DT、TT、PT、FHA與PRN抗原，或使 用全細胞百日咳成份，例如：史必克占生化公司上市之商 品，如TritanrixTM。組合疫苗亦可包含其他抗原，如：b 型肝炎表面抗原（HBsAg)、灰質炎病毒抗原（例如：去活性 三價灰質炎病毒_IPV)、莫拉氏菌（Moraxella catarrhalis)外 膜蛋白質、非典型流感嗜血桿菌蛋白質、腦膜炎奈氏球菌 外膜蛋白質。 可包括在組合疫苗中之較佳莫拉氏菌蛋白質抗原實例 (尤其用在預防中耳炎）為：OMP 106[W〇 97/4173 1 (Antex) 與 WO 96/34960 (PMC)]; OMP21; LbpA & LbpB [W〇 98/55606 (PMC)]; TbpA & TbpB [WO 97/13785 & \v〇 97/32980 (PMC)]; CopB [ME 赫明（Helminen)等人，1993 Infect· Immun. 61:2003-2010]; UspAl/2 [WO 93/03761(德州 大學）];及OmpCD。可包括在組合疫苗（尤其用於預防中 耳炎）之非典型流感嗜血桿菌抗原實例包括：Fimbrin蛋白 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） in--------MW--------------線# (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235064 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（30) 蛋白質組合可參見上文”本發明之肺炎球菌蛋白質” 一節。 因此本發明提供-種免疫性組合物，其包含肺炎鍵球菌 多醣·蛋白質D共軛物與肺炎鏈球菌蛋白質抗原。 =發明多醣·蛋白質D共軛物抗原在本發明之疫苗調配物 中最好使用輔劑。合適輔劑包括鋁鹽如：氫氧化鋁凝膠 (alum)或磷酸鋁，但亦可為鈣、鐵或鋅之鹽，或可為醯化 酪胺酸、或醯化糖類、陽離子性或陰離子性衍化多醣、或 聚磷腈之不可溶性懸浮液。 — 老年人用疫苗中，輔劑最好選自優先謗發TH1型反應之 謗發劑。 對特定Th 1輔劑，可參見上文，，本發明Th丨辅劑，，。 本發明另一方面提供以本文說明之免疫原或疫苗用於醫 藥。 有關共軛物之疫苗製劑/投藥可參見上文”本發明之疫苗 製劑，丨一節。 又田 蛋白^0亦罝用在對抗中耳炎之疫苗中，因為其本身為 一種免疫原，可產生受B細胞調節之保護作用，來對抗非 典型流感嗜血桿菌（ntHipntHi可侵襲宿主細胞，並逃避由 蛋白質抗原謗發之受B細胞調節之效應。本發明者已驚人 地發現一種提高作為中耳炎疫苗之抗原之蛋白質〇(其本 身或作為多醣之載體）有效性之方法。其作法為辅助蛋白 質D ’在個體中謗發強烈Thl反應，使受細胞調節之免疫 系統分支達到對蛋白質D之最佳狀況。此點可採用含蛋白 夤D與Thl輔劑（以3D-MPL較佳）之冷凍乾燥組合物達成， --------ιτί^— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 線#-

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五、發明說明（31) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 殳藥之前不久方重新組成。因此，本發明亦提供這種組合 物，種製造這種組合物之方法（由含蛋白質D與Th 1辅劑 之此合物冷；東乾燥），及以此等組合物治療中耳炎之用 途〇 廣義而言，本發明者認為在Thl辅劑（較佳為3D_MPL)之 存在下（參見，，本發明之Thi輔劑”），使免疫原冷凍乾燥 時’通常會加強對抗免疫原之Thl免疫反應。因此本發明 適用於需要更強烈Thi免疫反應之任何免疫原。這種免疫 原包括細菌性、病毒性及腫瘤蛋白質抗原，及自身蛋白質 與肽。 實例 實例係說明本發明，但未限制本發明。 實例1 肺炎鏈球菌莢膜多醣 11_價候選疫苗包括莢膜多_血清型1、3、4、5、6B、 7F、9V、14、18C、19F與23F，其基本上依EP 72513所述製 備。各多醣使用CDAP化學法活化及衍化（WO 95/〇8348)並 與蛋白質載體共輛。所有多醣均呈其天然型共轭，但血清 型3除外（其經過縮小，以降低其黏度）。 蛋白質載體： 選用之蛋白質载體為來自非典型流感嗜血桿菌且於大腸 桿菌中表現之重組蛋白質D ( PD)。

蛋白質D之表現 流感嗜血样菌蛋白質D _ -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------tf---------線 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) A7 1235064 ___B7__ 五、發明說明（32) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 供表現蛋白質D之基因構築體 起始材料

編碼蛋白質D之DNA 蛋白質D在流感嗜血桿菌所有血清型及非典型菌株中均 高度保留。含有編碼整個蛋白質D基因之DN A序列之媒介 體pHIC348來自瑞典A、弗葛儉博士（Dr· A. Forsgren， Department of Medical Microbiology，University of Lund， Malmo General Hospital，Malmi，Sweden)。蛋白質 D之DNA 序列已由強森（Janson)等人（199 1)公開於Infect. Immun· 59:119-125 。 表現媒介體pMGl 表現媒介體pMGl為pBR322之衍生物（葛羅斯（Gross)等 人，1985)，其中引進用於轉錄及轉譯外來嵌插基因之衍生 自細菌嗤菌體又之控制元素（蕭茲曼（Shatzman)等人， 1983)。此外，胺苄青黴素抗性基因改成康黴素抗性基因。 大腸桿菌菌株AR58 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 大腸桿菌菌株AR58係由預先於SA500衍生物（galE::TN10, λΚίΓ cI857 △ HI)上生長之P 1噬菌體保存株轉導N99產 生。N99與SA500為大腸桿菌K12菌株，來自國家衛生研究 所馬丁洛森柏格實驗室（Dr. Martin Rosenberg’s laboratory at the National Institute of Health) o 表現蜞介體pMG 1 製造蛋白質D時，編碼蛋白質D之DNA已選殖至表現載 體pMG 1中。此質體利用來自又_噬菌體DNA之訊號指揮嵌 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1235064 A7 B7 五、發明說明（33) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 插之外來基因進行轉錄與轉譯。該媒介體含有發動子 P L，操縱子0 L及二個利用位置（NutL與NutR)，當產生N 蛋白質時，可解除轉錄之極性效應（葛羅斯（Gross)等人， 1985)。在大腸桿菌溶素原宿主中引進含PL發動子之媒介 體，以安定質體DNA。溶素原宿主菌株含有整合至基因組 内之複製缺陷λ-噬菌體DNA(蕭茲曼等人，1983)。染色體 λ-噬菌體DNA指揮c I抑制劑蛋白質合成，該蛋白質與媒介 體之0 L抑制劑結合，且預防RNA聚合酶與P L發動子結 合，藉以轉錄嵌插之基因。表現菌株AR58之cl基因含有對 溫度敏感之突變株，因此P L指揮之轉錄作用可利用溫度 變遷來調節，亦即提高培養溫度可使抑制劑不活化，並開 始合成外來蛋白質。此表現系統控制外來蛋白質之合成，尤 其對細胞有毒性之蛋白質（Shimataka與洛森柏格，198 1)。 大腸桿菌菌株AR58 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 用於製造蛋白質D載體之AR58溶素原大腸桿菌菌株為標 準NIH大腸样菌K12菌株N99之衍生物（F six· galK2，lacZ_ th〇。其包含有缺陷之溶素原λ-噬菌體（galE::TN10，AKir cI857 ΔΗ1)。Kir表型防止宿主大分子停止合成。cI857突 變株使cl抑制劑對溫度敏感性受損。ΔΗ1刪除作用排除λ_ 嗤菌體右邊操縱子及宿主13]1〇、11¥『3與〇111八1〇(^。八1158菌株 係由預先生長在SA500衍生物上之Ρ 1噬菌體保存株轉導 Ν99產生（galE::TN10，AKil· cI857 ΔΗ1)。利用出現在鄰接 之galE基因中編碼四環素抗性之ΤΝ10基因移轉子，使用四 環素選拔引進有缺陷溶素原之N99。 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1235064 A7 B7 五、發明說明（34) 媒介體pMGMDPPrD之構築 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 採用含有編碼流感病毒之非結構性S 1蛋白質（pMGNSI) 之基因之pMG 1錤介體來構築pMGMDPPrD。採用PCR法， 由PHIC348媒介體（強森等人，1991)使用5，及3，端分別含 有Ncol與Xbal限制酶切割位置之PCR引子來擴增蛋白質D 基因。在pMGNSl之Ncol與Xbal之間引進Ncol/Xbal片段， 形成在PD蛋白質後含有NS1蛋白質之N末端81個胺基酸之 融合蛋白質。此媒介體稱為pMGNSIPrD。 根據上述構築體，產生表現蛋白質D之最終構築體。自 pMGNSIPrD排除BamHI/BamHI片段。這種DNA水解作用排 除]NS 1編碼區，但頭三個N _末端殘基除外。當重新黏接 媒介體時，產生具有下列N -末端胺基酸序列之編碼融合 蛋白質之基因。

-MDP SSHSSNMANT-NS1 蛋白質D 蛋白質D不含脂質鏈通常連接之前導肽或N·末端半胱胺 酸。因此蛋白質既未被排泄至胞外質亦未脂基化，而呈可 溶型留在細胞質中。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 利用37°C下之熱震盪，將最終構築體pMG-MDPPrD引進 AR58宿主菌株中。於康黴素之存在下選拔含質體之細 菌。由含特定内核酸酶之單離質體DNA分解，證明含有編 碼DNA嵌段之蛋白質D。重組體大腸桿菌菌株稱為ECD4。 蛋白質D之表現係在Apl發動子/〇1^操縱子之控制下。宿 主菌株AR58在基因組中含有對溫度敏感之cI基因，在低 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） A7 1235064 --—------_____ 五、發明說明（35) 溫度下與〇L結合而阻斷APL表現。一旦溫度提高時，則自 〇L釋出cl，且表現蛋白質D。撥酵結束時，細胞濃縮及冷 康。 依下列方法自所收集之細胞中萃取及純化蛋白質D。冷 凍之細胞培養物集結塊解凍，再懸浮於細胞瓦解溶液^ (檸檬酸鹽緩衝液ρΗ 6·0)，最後〇D65g=6〇。懸浮液在 Ρ=1〇0()巴下通過高壓均質器2次。細胞培養物均質液離心 澄清，過濾排除細胞碎塊。在第一個純化步騾中，添加過 濾必溶胞液至陽離子交換層析管柱（sp Sephdr〇se Fast

Flow)。PD利用離子交互作用與凝膠基質結合，並利用逐 段提高離子強度之溶離緩衝液溶離。 第二個純化步騾中，雜質保留在陰離子交換基質上（q Sepharose Fast Flow) °PD不會結合在凝膠上，而於通過之 流出液中收集。 這二個管柱層析步騾均以〇 D追踪溶離份之收集情形。 通過陰離子交換管柱層析法而含純蛋白質D之流出液經過 超過〉慮法濃縮。 含蛋白質D之超過濾法保留液最後通過〇 2微米膜。 化學： 活化與偶合作用化學·· 各多醣具有特定活化及偶合條件。其示於表1。取天然 多醣（PS3除外）溶於2M NaCl或注射用水中。評估所有血清 型之最適當多醣濃度。 自1〇〇毫克/亳升乙腈之保存溶液中，取cdap(cdap/ps -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐） --------tT· — ·^-------線#_ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235064 A7 ______ B7 五、發明說明（36) 比例為0.75毫克/毫克p S )加至多醣溶液中。1.5分鐘後，添 加0.2M三乙胺，得到專一性活化pH ^多醣之活化作用在此 pH下’ 25 C下進行2分鐘。添加蛋白質d(其用量依初始之 PS/PD比例而定）至活化多醣中，於此專一性ρ η下進行偶 合反應1小時。於25 °C下添加甘胺酸中止反應3 0分鐘，於 4 °C下過夜。 共軛物經凝膠過濾法使用Sephacryl 500HR凝膠過滤管柱 (先經0.2MNaCl平衡）純化。 測定溶離份之碳水化合物與蛋白質含量。收集共輛物， 經0.22微米無菌膜過濾除菌。測定共軛物製劑中p s /蛋白 質比例。 特性： 鑑別各共軛物之特性且符合述於表2之說明。利用間苯 二酚試驗法測定多醣含量（微克/毫升），利用勞瑞試驗法 (Lowry test)測定蛋白質含量（微克/毫升）。由濃度比例測 得最終PS/PD比例（w/w)。 殘留DMAP含量（毫微克/微克P S ): 使用CDAP活化多醣時，在多醣内引進一個氰酸根，釋 出DMAP(4-二甲胺基-外t淀）。利用於S B下展開之專一性分 析法測定DMAP殘留量。 游離多醣含量（％): 保存在4°C下或在37°C下保存7天之共軛物經過與α _pD 抗體及飽和硫酸銨培養後，離心，由得到之上澄液測定_ 離多醣含量。 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----- --------------------計---------線 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235064 A7 B7 五、發明說明（37) 採用6^_?8/“-?8£]^18人定量上澄液中之游離多醣。不含 共軛物之對照組亦進行α-PD/a-PS ELISA。減少游離多酷 含量時，可改善共軛物疫苗。 抗原性： 以夾心型ELISA分析相同共軛物上之抗原性，其中抗體 之捕捉與檢測分別為a-PS與a-PD。 游離蛋白質含量（％): 採用SDS處理樣本，測定”游離”之殘留蛋白質D含量。 共軛物於SDS 0.1%之存在下，於100°C下加熱10分鐘，注 入SEC-HPLC凝膠過濾管柱（TSK 3000-PWXL)。由於蛋白質 D為二聚體，因此有可能因SDS解離結構而過度估計”游離" 蛋白質D之含量。 分子大小（Kav): 分子大小係於SEC-HPLC凝膠過濾管柱上進行（TSK 5000-PWXL)。 安定性： 為保存在4°C下及保存在37°C下7天之共軛物，於HPLC-SEL凝膠過濾法上測定安定性（TSK 6000-PWXL)。 1 1價特性示於表2。 蛋白質共輛物吸附於磷酸銘上，收集形成最終疫苗。 結論 · 已製成之免疫原性共軛物已證明為有成效之疫苗之成 份。已為1 1價分別發現要得到最佳品質之最終共軛肺炎球 菌多醣產品之最適當CDAP條件。依上述改良（最適化） -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------ITi^-------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1235064 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（38) CDAP法（無關載體蛋白質，但以蛋白質D較佳）得到之此等 肺炎球菌多醣共軛物因而成為本發明另一方面。 實例2 -改進輔劑對1丨價肺炎球菌pS-pD共軛物疫苗在嬰兒 期老鼠體内之免疫原性之影響 對嬰兒期老鼠接種1 1價肺炎球菌PS-PD共轭物疫苗，劑 量為各0· 1微克多醣（根據實例1方法製造），且採用下列辅 劑調配：無、A1P04、3D-MPL、3D-MPL吸附在 A1P04上。 1 1種抗原中，有5種僅使用3D-MPL之調配物在統計上 (且窵人地）比使用其他調配物時具有更高免疫原性（最高 GMC IgG)。此現象亦同時出現在高及低溫度3D_MpL時。 調理素細胞呑噬作用證實GMC結果。 材料與方法 免疫接種法 使嬰兒期OFA老鼠隨機分配給不同母親，於7天大時接 受第一劑接種。1 4及2 8天後再接受2劑。第5 6天時，抽 血（第III劑後2 8天）。所有疫苗均經皮下注射，每種疫苗組 有1 〇隻老鼠。 f 為老鼠接種1 1價肺炎球菌共軛物疫苗，其包含下列多醣 血清型共軛在蛋白質D上：1、3、4、5、6Β、7F、9V、14、 18C、19F、32F。 調配物 為了檢視不同改進輔劑之影響，共軛物劑量保持恆定在 含0.1微克各多醣，輔劑Α1Ρ〇4及3D_MPL則依不同劑量與組 合調配，包括完全不使用輔劑。表3中以數字列表以供參 ---------------------*訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -41 -

1235064 A7 B7 五、發明說明（39) 考。 吸附在Α1Ρ〇4上 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 根據下列方法製備濃縮之吸附單價。由50微克A1P〇4(pH 5.1)與5微克共軛多醣混合2小時。pH調至5·1，混合物再 靜置1 6小時。添加1500 mM NaCl，使鹽濃度達15〇 mM。5 分鐘後，添加5毫克/毫升2 -苯氧乙醇。再過3〇分鐘後， pH調至6.1，再置於4 °C下3天以上。 稀釋液之製法 於NaCl 150 mM/5毫克/毫升苯氧乙醇中製備三種稀釋 液： A : A1P04 1毫克/毫升 B : 3D-MPL吸附在AlP〇4上，分別為250及1〇〇〇微克/毫 升。3D-MPL/A1P04重量比= 5/20 C.3D-MPL吸附在AlP〇4上，分別為561及1〇〇〇微克/亳 升。3D-MPL/A1P04重量比=50/89 吸附之1 1價之製法 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 依正確比例混合1 1種濃縮之吸附PS-PD單價。以稀釋液 A形式添加Α1Ρ〇4之補體。當需要時，以水溶液（未吸附， 見下文方法1)或稀釋液B或C(3D-MPL吸附在A1P04上，2 種劑量，見下文方法2)添加3D-MPL。 方法1 以水性懸浮液形式添加3D-MPL至組合之吸附共輛物上。 於室溫下與11價混合10分鐘，保存在4°C下直到投藥時為止。 方法2 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1235064 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明說明（40)

先使3D-MPL吸附在AiP〇4上，然後加至組合之吸附共軛 物中（稀釋液B與C)。製備i毫升稀釋液時，取3D_MpL水 f生懸浮液（250或561微克）與！毫克Alp〇4於15〇 mM NaC1 pH 6.3中，於皇溫下混合5分鐘。此溶液於"苯氧基 中稀釋，於4 t：下培養一夜。 未吸附之1 1價之製法

混合1 1種PS_PD共軛物，依正確比例於15〇 mM NaC1 pH 6·1，苯氧基中稀釋。當需要時，以溶液形式（未吸附）添加 3D-MPL。 所有注射用調配物均於第一次投藥前丨8天製備。

ELISA 採用WHO工作小組為了定量人體血清中對抗肺炎鏈球菌 莢膜多醣之IgG柷體而採行之Elisa法來測定老鼠IgG。基 本上’直接塗佈純化之莢膜多醣至微滴定板上。血清樣本 先與所有肺炎球菌共有之細胞壁多醣（物質c)培養，根據 文獻指出（EP 725 13 B 1)，其含量佔純化之肺炎球菌多醣約 〇·5%。採用傑克森免疫實驗室（Jackson IminunoLaboratories Inc.)減劑檢測已結合之鼠類IgG。效價曲線係參考内標準 (單株抗m ) ’依對數方程式構成。採用pro軟體進 行计算。此等結果之最大絕對誤差應在因數2以内。相對 誤差小於30%。 調理素細胞呑嗤作用 採用CDC法（採用分化HL60細胞，1 · 1版進行肺炎鏈球菌 調理素細胞呑噬作用），使用純化之人類PMN及幼兔補體 測足血清型3、6B、7F、14、19F與23F之調理素效價。修飾 -43- 本紙張尺度過用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 χ 297公釐） --------tf---------線# (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235064 A7 -------B7____ 五、發明說明（41) 法包括使用内部自有之肺炎球菌菌株，呑噬細胞性^乙60細 胞改為純化之人類嗜中性PMN(其與呑噬性細胞之間有高 度相關性）。此外，添加3毫米玻璃珠至微滴定孔中，提高 混合效果，此作法可使呑噬細胞··細菌比例降至建議之 400 ° 結果

IgG濃度 為每種血清型測定IgG濃度幾何平均值，且p 〇示於表4 至1 0。對血清型6B、14、19F&23F，過去採用四價調配物 得到之結果亦包括在内，以供比較。 表4至1 0中特別加黑標出最高igG濃度。3D-MPL組合物 對3D-MPL/A1PC»4組合物之統計p值示於表丨丨。辅劑調配 物4號（含南劑量3D-MPL之未吸附共軛物）在1 1項中使9項 產生最南GMC。1 1項中有5項使低劑量mpl為第二天免疫 原。此外’對所血清型而言，使用輔劑提供之Gmc高於改 对彳里所传之GMC(未出示數據），此點在血清型4、6B、 7F、18C及23F中具統計顯著性（95% CI p<〇 〇5)。 調理素細胞呑嗟作用 所收集血清於血清型3、6B、7F、14、19F與23F進行之調 理素細胞呑噬作用結果示於表4至8。此等調理素效價確認 了 GMC IgG。的確，血清型6B、19F、23p^Ig(}濃度之相關 性大於85%(未出示數據）。對血清型3而言，應注意只有 3D-MPL組謗發之調理素活性超過閥值。 結論 此實驗中，意外發現僅使用3D_MPL時可謗發最高。⑴農 ___-44· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21G X 297公釐)""""~~ -— --------•訂-— r (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 線#_ 1235064 A7 Β7 五、發明說明（42) 度。 比較改變辅劑所得到之最大GMC IgG與改變P S劑量所得 到最大GMC，且發現3D-MPL在5/11血清型中可謗發顯著較 大反應。 表1 1出示3D-MPL與3D_MPL/A1P04組合物之比較結果 (比較調配過程，及3D_MPL劑量），其中5種多醣共軛物， 當只使用3D_MPL調配時，其免疫原性比使用3D-MPL加 Α1Ρ〇4調配時有顯著改善：PS 4，PS 6B，PS 18C，PS 19F及 PS 23F ° 實例 3 -組合對 ps 4，PS 6B，PS 18C，PS 19F及PS 23F共軛 物在成鼠體内之免疫原性之影響 對成鼠接種肺炎球菌多醣-蛋白質D共軛物疫苗，其係個 別接種或組合成多價組合物接種（四、五、七或十價）。每 組10隻老鼠，均間隔28天，接種2天，於第28天及42天 (弟2劑後1 4天）抽血樣。 利用ELISA測試血清中針對肺炎球菌多醣產生之Ig(J抗 ta。所有共軛物謗發之專一性IgG抗體係以elisa測定。表 12表單價PS 6B、PS 18C、PS 19F及PS 23F蛋白質D共軛 物4組合在成鼠體内對其免疫原性之影響，其係在第二劑 後1 4天時測定IgG濃度。 、若組合時之抗體濃度有顯著差異，則為所有樣本進行統 計分析。多價疫苗中任何血清型ps 6B、ps isc、ps BF與 PS 23F蛋白質D共軛物之組合均不會顯著改變其免疫原 性。 表1 -45 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •訂 ίΓ — 線#· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 火紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規 - * r 3 (厘 < 上 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235064 Δ7 Α7 Β7 五、發明說明（43) P S肺炎鏈球菌-蛋白質D共軛物之專一性活化/偶合/中止 反應條件 血清型 1 3 (//fluid.) 4 5 6B 7F PS濃度 (毫克/毫升） 2.0 3.0 2.0 7.5 5.4 3.0 PS溶解 NaCl 2M NaCl 2M H20 h2o NaCl 2M NaCl 2M PD濃度 (毫克/毫升） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 PS/PD初比例 (w/w) 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1 CDAP濃度 (毫克/毫克PS) 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 pHa=pHe=pHq 9.0/9.0/9.0 9.0/9.0/9.0 9.0/9.0/9.0 9.0/9.0/9.0 9.5/9.5/9.0 9.0/9.0/9.0 血清型 9V 14 18C 19F 23F PS毅 (毫克/毫升） 2.5 2.5 2.0 4.0 3.3 PS溶解 NaCl 2M NaCl 2M h2o NaCl 2M NaCl 2M PD濃度 (毫克/毫升） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 PS/PD初比例 (w/w) 1/0.75 1/0.75 1/1 1/0.5 1/1 CDAP濃度 (毫克/毫克） 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 pHa=pHe=pHq 8.5/8.5/9.0 9.0/9.0/9.0 9.0/9.0/9.0 10/9.5/9.0 9.0/9.0/9.0 表2 : 11價肺炎球菌PS-PD疫苗說明（第一排批號代表血清型） -46- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） *丁 * 泉 ^=0 矣 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 1235064 _B7 五、發明說明（44) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 標準 D01PDJ227 D03PDJ236 D4PDJ228 D5PDJ235 D6PDJ209 PS/蛋白質比例(wAv) 1/0.66 1/1.09 1/0.86 1/0.86 1/0.69 游離多醣含量(％) 1 1 7 9 0 <10% 游離蛋白質含量 8 <1 19 21 9 (%)<15% 0.2 0.6 0.4 1.2 0.3 <0.5毫微韻敫克PS 分子大小 0.18 0.13 0.12 0.11 0.13 安定性 無變遷 無變遷 無變遷 低度變遷 無變遷 D07PDJ225 D09PD222 D14PDJ202 D18PDJ221 D19PDJ206 D23PDJ212 PS/蛋白質比例(w/w) 1/0.58 1/0.80 1/0.068 1/0.62 1/0.45 1/0.74 游離多醣含量(％) 1 <1 <1 4 4 0 <10% 游離蛋白質含量 8 0.3 3 21 10 12 (%)<15% ΙΜΦ賴 0.1 0.6 0.3 0.2 0.1 0.9 <0.5毫微克/微克PS 分子大小(Kav) 0.14 0.14 0.17 0.10 0.12 0.12 安定性 無變遷 無變遷 無變遷 無變遷 有變遷 無變遷 表3 : 1 1價肺炎球菌PS-PD於嬰兒期老鼠體内之輔劑調配 物試驗综合表 組別 AIP04 MPL 方法 說明 1 無 2 100 A1P04 3 5 MPL低 4 50 MPL高 5 100 5 方法1 方法1低 6 100 50 方法1 方法1高 7 100 5 方法2 方法2低 8 100 50 方法2 方法2南 -47- 丁 泉 ϋ ϋ B_^i « > · ammma l I ϋ I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1235064 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（45) 表4 .嬰兒期老鼠接受使用不同輔劑之1 1價PS_PD接種第III 劑後2 8天時血清型6B IgG濃度幾何平均值、血清轉化率、 及平均調理素效價（與四價接種疫苗比較） 組別 AIP04 微克 MPL 微克 方法 6B CMC I沿 (微克/毫升) 6B 血清轉 化率 6B 調理素 效價* 6B GMC (微W毫升) 6B 血清轉 化率 6B 調理素 效價* 四價 十一價 1 0.047 2/10 12.5 0.004 1/10 <6.25 2 100 0.048 4/10 65 0.019 4/10 <6.25 3 5 1.345 10/10 43 4 50 4.927 10/10 192 5 100 5 1 0.042 7/10 <6.25 6 100 50 1 0.255 10/10 <6.25 7 100 5 2 0.033 3/10 <6.25 0.048 8/10 <6.25 8 100 50 2 0.057 8/10 <6.25 表5 .嬰兒期老鼠接受使用不同輔劑之1 1價PS-PD接種第III 劑後2 8天時血清型14 IgG濃度幾何平均值、血清轉化率、 及平均調理素效價（與四價接種疫苗比較） 組別 AIP04 微克 MPL 微克 方法 14 GMC 职 (微克/毫升) 14 血清轉 化率 14 調理素 效價* 14 GMC (微W毫升) 14 血清轉 化率 14 調理素 效價* 四價 十一價 1 0.046 3/10 64 0.022 3/10 <5.25 2 100 0.99 10/10 88 0.237 8/10 27 3 5 0.233 10/10 41 4 50 0.676 10/10 81 5 100 5 1 0.460 9/10 67 6 100 50 1 0.477 10/10 98 7 100 5 2 0.81 10/10 49 0.165 8/10 81 8 100 50 2 1.611 10/10 133 -48- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------，訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1235064 Λ7 Α7 Β7 五、發明說明（46) 表6 .嬰兒期老鼠接受使用不同輔劑之1 1價PS-PD接種第III 劑後2 8天時血清型19F IgG濃度幾何平均值、血清轉化 率、及平均調理素效價（與四價接種疫苗比較） 組別 ADP04 微克 MPL 微克 方法 19F GMC (微克/毫升) 19F 血清轉 化率 19F 調理素 效價* 19F GMC (微W毫升) 19F 血清轉 化率 19F 調理素 效價* 4價 11價 1 0.04 2/10 64 0.021 2/10 <6.25 2 100 1.07 9/10 367 0.222 7/10 79 3 5 4.028 10/10 296 4 50 21.411 10/10 1276 5 100 5 1 1.649 10/10 172 6 100 50 1 2.818 10/10 208 7 100 5 2 1.09 10/10 193 0766 10/10 323 8 100 50 2 3.539 10/10 241 表7 .嬰兒期老鼠接受使用不同輔劑之1 1價PS_PD接種第III 劑後2 8天時血清型2 3 F IgG濃度幾何平均值、血清轉化 率、及平均調理素效價（與四價接種疫苗比較） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 組別 A1P04 微克 MPL 微克 方法 23F CMC 1^3 (微克/毫升) 23F 血清轉 化率 23F 調理素 效價* 23F GMC 1^3 (微W毫升) 23F 血清轉 化率 23F 調理素 效價* 4價 11價 1 0.06 2/10 <6.25 0.152 3/10 <6.25 2 100 0.29 10/10 70 0.56 8/10 <6.25 3 5 2.296 9/10 389 4 50 4.969 10/10 >1600 5 100 5 1 0.462 5/10 17 6 100 50 1 0.635 8/10 54 7 100 5 2 0.38 10/10 <6.25 0.203 3/10 18 8 100 50 2 0.501 7/10 43 -49- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235064 A7 B7 五、發明說明（47) 表8 .嬰兒期老鼠接受使用不同輔劑之1 1價PS-PD接種第III 劑後2 8天時血清型3與7 F IgG濃度幾何平均值、血清轉化 率、及平均調理素效價 組別 AIP04 微克 MPL 微克 方法 3 OMC 职 (微克/毫升) 3 血清轉 化率 3 調理素 效價* 7F GMC (微W亳升) 7F 血清轉 化率 7F 調理素 效價* 1 0.003 1/10 <6.25 0.040 7/10 <6.25 2 100 0.008 6/10 <6.25 0.25 9/10 43 3 5 0.070 10/10 <6.25 2.435 10/10 477 4 50 0.108 10/10 18 2.569 10/10 332 5 100 5 1 0.015 10/10 <6.25 0.579 10/10 54 6 100 50 1 0.027 10/10 <6.25 0.611 9/10 59 7 100 5 2 0.006 10/10 <6.25 0.154 8/10 30 8 100 50 2 0.034 10/10 <^.25 0.638 9/10 140 表9 .婴兒期老鼠接受使用不同輔劑之1 1價PS-PD接種第III 劑後2 8天時血清型3與1，4與5 IgG濃度幾何平均值、血 清轉化率、及平均調理素效價 組別 AIP04 微克 MPL 微克 方法 1 GMC 1^5 (微克/毫升) 1 血清轉 化率 4 GMC IgCr (微克/毫升） 4 血清轉 化率 5 GMC 职 (微克/毫升) 5 血清轉 化率 1 0.026 4/10 0.005 0/10 0.040 3/10 2 100 0.282 8/10 0.052 5/10 0.774 9/10 3 5 1.614 10/10 3.452 10/10 7.927 10/10 4 50 2.261 10/10 7.102 10/10 13.974 10/10 5 100 5 1 0.568 10/10 0.676 10/10 3.015 10/10 6 100 50 1 1.430 10/10 0.419 9/10 5.755 10/10 7 100 5 2 0.478 10/10 0.267 9/10 2.062 10/10 8 100 50 2 1.458 10/10 0.423 10/10 5.009 10/10 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） --------------------~訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235064 A7 B7 五、發明說明（48) 表1 0 .嬰兒期老鼠接受使用不同辅劑之1 1價PS-PD接種第 III劑後28天時血清型9 V、1 8C與PD IgG濃度幾何平均 值、血清轉化率、及平均調理素效價 組別 ΑΙΡ04 微克 MPL 微克 方法 9V CMC I炎 (微克/毫升) 9V 血清轉 化率 18C GMC 职 (微克/毫升) 18C 血清轉 化率 PD GMC 职 (微克/毫升) PD 血清轉 化率 1 0.018 0/10 0.013 1/10 0.003 0/10 2 100 0.489 6/10 0.092 5/10 0.993 10/10 3 5 0.482 7/10 6.560 10/10 3.349 10/10 4 50 11.421 10/10 14.023 10/10 5.446 10/10 5 100 5 1 2.133 9/10 0.690 10/10 11.407 10/10 6 100 50 1 2.558 10/10 1.771 10/10 1.258 10/10 7 100 5 2 1.536 10/10 0.528 10/10 1.665 8/10 8 100 50 2 2.448 9/10 0.980 10/10 5.665 10/10 表1 1 .當單獨使用3D-MPL相對於使用3D-MPL/A1P04來調 配時是否改良某些肺炎球菌多醣共軛物之免疫原性之統計 顯著性（p值）。p值小於0.01則視為高顯著性。方法1與方 法2代表調配方法。 血清型 5011% 3D-MPL v 3D-MPL/A1P04 50 //g 3D-MPL vs 3D_MPL/AlP〇4 方法1 方法2 方法1 方法2 1 0.3 0.05 0.079 0.11 3 0.075 0.01 0.27 0.008 4 0.002 0.0003 0.02 0.003 5 0.04 0.002 0.1 0.12 6B 0.001 0.0001 0.001 0.0006 7F 0.13 0.15 0.01 0.005 9V 0.02 0.02 0.1 0.04 14 0.65 0.21 0.3 0.66 18C 0.0008 0.0002 0.006 0.004 19F 0.0009 0.006 0.21 0.04 23F 0.002 0.0004 0.01 0.004 -51 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） '丁 * i·— ϋ ^^1 tmf ·ϋ ϋ ϋ ^^1 MBBi ϋ I ϋ· ϋ ^^1 1_ ϋ ^^1 ^^1 ^^1 ^1· ϋ i^i I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1235064 A7 B7 五、發明說明（49) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 表:對成鼠單獨接種1·〇微克多醣-蛋白質D共軛物或與 四價、五價、七價或十價疫苗組合接種第2劑後丨4天時 IgG濃度幾何平均值（微克/毫升）。這些數據係來自5次分 開實驗之組合。 血清型 疫苗 4 Η 6Β Τ 18C Η 19F Τ 23F Τ 單獨 9.3 0.11 15 5.2 2.5 組合 4 0.23 3.7 3.7 2.8 T :與四價（T)(PS 6B、14、19F、23F)、五價（T 加 PS 3)、七價 (H)(T加PS 4、9V與18C)及十價（H加PS 1、5與7F)組合之疫苗。 Η :與七價（H)(T加PS 4、9V與18C)及十價（H加PS 1、5與7F)組 合之疫苗。 實例4-添加肺炎球菌自溶酶與3D-MPL對PD-共軛11價多醣 疫苗對抗肺炎球菌於小白鼠肺部群集之保護性效力之效益 免疫解析 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 肺炎球菌自溶酶-專一性血清IgG之ELISA劑量 於37。(3下在Maxisorp Nunc免疫分析板上，以於PBS中稀 釋之2微克/毫升重組體天然肺炎球菌自溶酶（PLY)塗佈2小 時，每孔100微升。以NaCl 0.9% Tween-20 0.05%緩衝液洗 滌板子3次。然後添加一系列2倍稀釋液（含於PBS/Tween-20 0.05%，每孔100微升）之抗PLY血清參考物作為標準曲 線（自670毫微克/毫升IgG開始）及添加血清樣本（自1/10稀 釋度開始），於20X：及攪拌下培養3 0分鐘。依前述方法洗 滌後，取於PBS/Tween-20 0.05%中稀釋5000x之過氧化酶共 軛山羊抗·小白鼠IgG(傑克森（Jackson)公司）於20 QC及攪捽 -52- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235064 Δ7 B7 五、發明說明（50) 下培養3 0分鐘（100微升/孔）。洗滌後，板子於室溫下與 100微升 / 孔展開缓衝液（revelation buffer)(〇PDA 0.4 毫克 / 毫升與11202 0.〇5%含於1〇〇1111^卩114.5檸檬酸緩衝液中）培 養1 5分鐘。添加5 0微升/孔IN HC1中止展開反應。於490及 620 nm下，利用Emax免疫讀數機（分子儀器公司（Molecular Devices))讀取光密度。採用SoftMaxPro軟體進行四參數計 算法計算抗體效價。 溶血抑制作用 進行此分析法，測定血清抗體抑制肺炎球菌自溶酶（PLY) 溶血活性之能力。為了去除膽固醇（容易與PLγ交互作用）， 依下列方法處理血清樣本2次：與1份等體積氯仿混合後， 於攪:掉下培養4 5分鐘。於1〇〇〇 rpm下離心1 0分鐘後收集上 澄液。於9 6孔微滴定板（Nunc公司）中稀釋已清除膽固醇之 血清（於1 mM二硫代異赤蘚糖醇，0.01% BSA，15 mM TRIS，150 mM NaCl，pH 7·5中系列稀釋2倍）。在各孔中添 加50微升含4 HU(溶血單位）PLY之溶液，於37°C下培養15 分鐘。然後添加10 0微升綿羊紅血球細胞（1 %溶液），於3 7 QC下3 0分鐘。於1000 rpm下離心1 0分鐘後，收集上澄液 (150械升）’置入另·一個96孔微滴定板中，於405 nm下讀 取吸光度。結果以中點稀釋效價表示。 肺炎球菌自溶酶化學去毒性法 取重組體天然肺炎球菌自溶酶（PLY)相對於50 mM磷酸 鹽，500 mM NaCl pH 7.6緩衝液透析。下列所有步驟均於 39.5 C下’在偶爾攪;掉下完成。第1天，添加Tween 80 -53- 玉紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公髮Γ _________%________，訂_| (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) A7 1235064 _B7 五、發明說明（51) 10%(1/250 v/v)，N-乙醯基色胺酸 57.4 mM PH 7.6(3/100 v/v)，2·2 Μ甘胺酸之磷酸鹽緩衝液溶液（l/ioo v/v)及ι〇%甲 醛之磷酸鹽緩衝液溶液（3/100 v/v)至PLY溶液中。第2及3 天時，再依3/100與2/100 v/v比例分別添加10%甲醛。續於 39.5°C下及偶爾攪拌下培養至第7天。最後由PLY相對於50 mM磷酸鹽500 mM NaCl pH 7.6緩衝液透析。於溶血分析法 中證明PLY完全不活化。 由OF 1小白鼠經鼻内接受肺炎球菌挑戰 取7週大OF 1雌性小白鼠於麻醉下經鼻内接種5 X 1〇5 CFU 經小白鼠適應之肺炎鏈球菌血清型6 B。接種後6小時，取 出肺部，於妥德·海威特營養液（Todd Hewith Broth) (ΤΗΒ ’奇布可公司（Gibco))培養基中均質化（uitramax， 24000 rpm，4°C )。將一系列稀釋1 〇倍之肺均質液於37°C下 塗佈在補充酵母萃物之THB洋菜之培養皿上一夜。以CFU/ 隻小白鼠數值測定肺炎球菌肺部感染程度，以對數重量平 均值表示。檢測限值為2.14 log CFU/隻。 實例4 A 3D-MPL輔劑對於抗肺炎球菌自溶酶免疫反應之 影響 ‘

本實例中，評估3D-MPL輔劑對針對天然重組肺炎球菌 菌自溶酶（PLY，由澳洲北亞大萊德兒童醫院之j .培頓（J

Paton, Children’s Hospital，North Adelaide，Australia)提供） 及其化學性去毒性相對物質之免疫反應之影響（Dpj^Y)。化 學去毒性法如上述。 每組1 0隻6週大Balb/c小白鼠於第〇、1 4及2 1天時，經 -54- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公t ) -----I---I----------- * 訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235064 A7 B7 五、發明說明（52)

肌内接種1微克PLY或DPLY，其含在A ·· A1P04 100微克； 或B : A1P04 100微克+5微克3D-MPL(3-去-0-醯基單磷醯 基脂質A，由里必免疫化學公司（Ribi Immunochem)供應） 中。圖1A與1B出示第III劑之後血清中測得之ELISA IgG 與溶血抑制作用。 無論何種抗原，接受補充3D-MPL之調配物接種之動物 可謗發最佳免疫反應。值得注意的是，當投與A1P04十3D-MPL時，DPLY與PLY同樣具免疫原性，而在A1P04調配物 中，DPLY則為較弱之免疫原。此點表示3D-MPL有能力改 善對去毒性之肺炎球菌自溶酶之抗體反應。 在含肺炎球菌自溶酶之組合物中，可能最好使用經化學 方法去毒性之肺炎球菌自溶酶，而不使用經突變法去毒性 之肺炎球菌自溶酶。此乃因目前可得到之去毒性突變株仍 有殘留毒素活性，而經化學方法去毒性之肺炎球菌自溶酶 則沒有。因此本發明另一方面一般而言為包含經化學方法 去毒性之肺炎球菌自溶酶（或肺炎球菌自溶酶突變株）之組 合物於疫苗中之用途，應以Thl輔劑（以3D-MPL較佳）為輔 劑。這種組合物由本發明提供。亦涵括一種在免疫原性組 合物中，提高經化學方法去毒性之肺炎球菌自溶酶之免疫 反應之方法，其包括添加Thl輔劑（以3D-MPL較佳）至組合 物中之步騾。 實例4 B添加肺炎球菌自溶酶之減毒突變株與3D-MPL輔 劑對PD-共軛1 1價多醣疫苗對抗肺炎球菌在經鼻内接種血 清型6 B挑戰之OF1小白鼠肺内群集之保護效力之影響 -55- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -Γ ϋ βϋ Βϋ ϋ ϋ· ·-、· 1_ ϋ ϋ ^1 ϋ emmf I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1235064 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（53> 本實例中’吾等評估含1 1價多醣-蛋白質D共軛物、減 毒突變株肺炎球菌自溶酶抗原（PdB，WO 90/06951)與 A1P04+3D-MPL辅劑之疫苗之預防效力，與傳統之吸附 A1P04 11價多醣蛋白質D共軛物調配物之預防效力比較。 於第0及1 4天，對每組1 2隻4週大OF 1雌性小白鼠經皮下 接種調配物，其含A : 50微克A1P04 ;及B ·· 0.1微克PS/PD 之血清型-共輛11價多醣疫苗+ 50微克A1P04 ;或C : 0.1微 克PS/PD之血清型-共軛1 1價多醣疫苗+ 1 〇微克P(jB(由澳洲 北亞大萊德兒童醫院J ·培頓提供）+ 5 0微克A1P04+5微克3D-MPL (由里必免疫化學公司供應）。依上述，於第2 1天時接 受挑戰。 如圖1 C所示，由補充PdB且以A1P04+MPL為輔劑之1 1價 多醣共軛物疫苗提供極顯著保護作用（ρ<〇·〇〇7)(黑長條代 表算術平均值）。反之，接受1 1價多醣共軛物/ A1P04調配 物接種之動物未觀察到顯著保護作用。此結果證明添加肺 炎球菌自溶酶抗原（甚至經過減毒）及3D-MPL輔劑可加強 1 1價多醣共軛物疫苗對抗肺炎之效力。 實例4 C實例4 B所示保護作用與免疫性之相關性 為了建立實例4 B，由減毒突變株肺炎球菌自溶酶（PdB) 與3D-MPL補充1 1價多醣共軛物疫苗所提供保護作用與免 疫性之相關性，依上述說明測定預先經過挑戰之血清對多 醣6B與PdB之抗體反應。 然後在挑戰後6小時，在所收集之相應動物肺部所測定 抗體效價與細菌群落數比較。於對數/對數線性迴歸上計 算R2。 -56- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---------^--------訂 ---------線# (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1235064 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（54) 由抗PdD與抗_6B抗體反應計算得到之R2分別等於〇 18與 0·02。此結果顯示體液免疫反應與二種抗原之保護作用之 間/又有相關性。接受1 1價共軛物疫苗（GMT=0.3 1 8毫微克/ 晕升）接種或接受此相同疫苗並補充pdD與3d_MPL ( GMT = 〇.458毫微克/亳升）接種之試驗組中，抗_6B抗體效價並沒 有顯著不同。因此，出現在調配物C之改良之保護作用並 不只因為其對多醣6 B具有較高抗體反應所致。 總言之’其結果顯示該保護作用不只受到體液免疫反應 單獨調節，亦受到3D·MPL存在下pdB抗原所謗發之細胞調 即 < 免疫性調節。此點進一步支持添加蛋白質抗原與強力 辅劑至肺炎球菌多醣共輛物疫苗中之作法，使二個免疫系 統分支互相協碉達最適當保護作用。 見例5 -經肺炎球菌自溶酶主動免疫及經對抗肺炎球菌p $ 之抗體被動免疫之小白鼠之免疫系統二種分支之協同性 實例5 A -探討被動接種抗6 B -多醣（抗-PS)抗體提供保護對 抗肺炎之濃度 方法 疫苗組：取4組各1 6隻小白鼠於第-1天，根據下列分組 (共6 4隻）’接受1 〇〇微升未稀釋之老鼠抗多_抗血清被動 免疫（i.p.)。 組別 專一性 抗血清中IgG濃度 G1 a -PS-6B 5微克/毫升 G2 a -PS-6B 2微克/毫升 G3 a -PS-6B 0.75微克/毫升 G4 對照組 0微克/毫升 -57 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公f ) --------訂 i (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 線# 1235064

五、發明說明（55) 、動物：來自加拿大查理士李佛公司（Charles River)i64 隻雄性CD- 1小白鼠，重約3 5克（約1 〇週大）。 麻醉：以異氟烷（3%)加02(1升/分鐘）麻醉小白鼠。 生物體：自補充5 %馬血之胰蛋白酶大豆洋菜板（TSA)中 收集肺炎鏈球菌川387(血清型6)，懸浮於6毫升pBS中。在 即將感染之前，取丨毫升細菌懸浮液稀釋至9毫升冷卻融化 之營養培養基（BBL)中，保存在4ir。小白鼠接受含在5〇 微升體積中之約6.0 l〇gl〇 Cfu/小白鼠。 感染：第0天時’依上述麻醉小白鼠，經由非手術性之氣 管内插管’在支氣管内滴入肺炎鏈球菌N13 87(5〇微升冷卻之 細菌懸浮液）進行感染。此方法說明於伍納德（冒⑽乜叫與 貝里(Berry)(Antimicrob· Ag. Chemotherap. 43:29 (1999))。 樣本：感染後第3天時，以過度劑量C02殺死8隻小白鼠 /組，切下肺部1於1毫升PBS中均質化。於PBS中製備1 〇倍 之系列稀釋液，來計算存活之細菌數目。樣本依三重覆接 種（2 0微升）至補充5%馬血之TsA板上，於37°C下培養一 夜後才分析。其他組小白鼠則於第7天殺死，並如上述取 樣。 !·--------#--------f -------線# (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 結果： 老鼠血清IgG濃度 (微克/毫升） 細菌數（感染後天數之log 10 cfuM固肺） 3 8 5 6·7±0·7(1/7) 7·2±0·7(5/8) 2 6.5±0·7(1/7) 6.9± 1.8(4/7) 0.75 7·7±0·5(5/8) 4·8土 1.4(2/8) 0 6.7土 1.5(3/6) 6.3± 1.5(3/9) 括號中之數據為在取樣時間之前死亡之動物數目。 β.Ά-:一般而言，任何處理組之間之細菌單離株數目沒有 -58- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱） A7 1235064 _B7__ 五、發明說明（56) 顯著差異。此顯示抗多醣在至高（含）5微克/毫升之濃度下 仍無可測得之保護作用。 此點同樣出現在有些人體臨床試驗中，亦即抗多醣抗體 不足以在某些族群中保護對抗肺炎球菌肺炎。 實例5 B -測定使用或不使用輔劑主動接種Ply(肺炎球菌自 溶酶）時，及使用次佳之抗P S抗體作為增效劑時，對抗肺 炎之保護作用 方法 動物：128隻雄性CD-1小白鼠（接種時6週大，感染時10 週大）來自加拿大查理士李佛公司（Charles River，St Constant，Quebec，Canada)。動物在6週大時重約2 0克，10週 大時重3 8克。 免疫接種：6組各1 6隻小白鼠於第· 2 2天及-1 4天時，經 皮下注射100微升下說明之疫苗（共128隻小白鼠）。PdB (WO 90/06951)得自澳洲J.培頓博士之贈與。3D-MPL則來 自里必/柯利沙公司（Ribi/Corixa)。 第-1天時，以濃度4.26微克/毫升（4毫升5微克/毫升+1.3 毫升2微克/毫升）小白鼠抗多醣抗體為特定處理組（見下表） 被動免疫接種（i.p· 100微升）。 組別 主動免疫 注射體積 於第-22天及-14天投與疫 苗(劑量微克） 被動免疫 注射體積 被動免疫IgG (第·1天） 1-1 100 微升 S.C. PdB/AlP04(10/50) 無 1-2 100 微升 s.c. PdB/MPL/AlP04(10/5/50) 無 1-3 100 微升 s.c. PdB/AlP04( 10/50) 100 微升 i.p. a-PS 1-4 100 微升 s.c. PdB/MPL/AlP04( 10/5/50) 100 微升 i.p. a-PS 1-5 100 微升 s.c. PdB/AlPO4(5/50) 100 微升 i.p· α-PS 1-6 100 微升 s.c. PdB/AlPO4(5/50) 無 -59- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------If---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235064

五、發明說明（57) 感染·弟0天時’麻醉小白田 叮』曰叭（3 /〇井亂烷加1升/分鐘 Ο 2 )。細菌接種菌之製法A 刀趣 一、、，分 I，奢為自補无5 %馬血之胰蛋白酶大 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 且年古米板（TSA)中收集肺炎鏈球菌m387 (血清型幻，懸浮 在6笔升PBS中。#將感染之前，於冷卻之融化營養素洋 菜中（保持4rc)製備10倍稀釋液（1毫升加9毫升）。小白鼠 經由氣管内插管’在支氣管内滴注，接受含於5G微升體積 中約6.0 log 10 Cfu/隻小白鼠感染。此方法說明於伍納祆 (Woodnut)^I^(Berry)(Antlmicrob. Ag. Chemotherap. 43 29 (1999))。 ' 樣本·感染後7 2小時，以過度劑量c〇2殺死8隻小白鼠/ 組，切下肺邵1於1毫升PBS中均質化。於pBS中製備〖〇倍 <系列稀釋液，來計算存活之細菌數目。樣本依三重覆接 種（20微升）至補充5%馬血之μ a板上，於37 °C下培養~ 夜後才分析。其他組小白鼠則於感染後第8天殺死，並如 上述取樣。 數據分析 以感染後3天及7天時肺部中細菌數目來比較處理結果。 結果以組平均值與標準偏差表示。採用史都登氏t _試驗 (Students t-test)進行統計分析，其中ρ<〇·〇5則視為顯著。 結果： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 感染後7 2小時 1_4組之細菌數顯著低於1-3組（ρ<0.05)。 1_4組之細菌數顯著低於1-5組（ρ<0.05)。 感染後168小時 第8天時，各組之細菌數比第3天時低約2 logs，此表示 -60- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1235064 A7 B7 五、發明說明（58) 已消除感染。 I - 2組之細菌數顯著低於丨_ 5組（ϋ<0 〇5、 組別 第3天 第8天 Log CFU/個肺 標準偏差 Log CFU/個肺 標準偏差 1-1 6.93 0.61 5.23 1.28 1-2 6.59 1.25 4.08 1.34 1-3 7.09 0.8 5.32 1.26 1-4 6.09 1.43 4.46 2.32 1-5 7.19 0.89 5.42 1.05 1-6 6.68 1.14 5.01 1.48 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 如上所示，單獨抗多醣抗體一者（〗_ 5組）無法提供對抗 肺中肺炎球菌生長之保護。以A1P04為輔劑之PdB亦未產 生保護作用，但當PbB與3D-MPL組合時，於第8天時則有 保護傾向（I - 2組）。 第3天時’保護作用最顯著之卜4組含有所有三種元素 PdB、3D-MPL及被動接種之抗多醣抗體。死亡率即可支持 此結論。1-4組有2/8死亡，而1-5與1-3組則為5/10。 結論： 由於本實驗採用被動免疫之動物進行，因此亦經肺炎球 菌自溶酶與MPL主動免疫之增效效應之原因可能不是對抗 多醣抗原之抗體含量增加所致。 當動物僅接受對抗肺炎球菌多醣被動免疫時，這種抗體 在第8天時之含量已自宿主體内大部份消除。 儘管如此，接受肺炎球菌自溶酶加3D-MPL免疫接種之 試驗組仍可能有對抗肺炎球菌肺之顯著保護作用，尤其在 -61 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) # '訂-------線< 1235064

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（59) 接種肺炎球菌自溶酶加3D-MPL加被動免疫接種多醣抗體 之試驗組，此表示此組合有增效作用。 若柷多醣免疫接種為主動免疫接種（最妤使用共軛多 酷），該效應可能會顯著，如同B細胞記憶效應，且恆定之 抗P S抗體含量將會造成免疫反應協同效果（見例如：圖 1 C ’其中許多接受多醣與蛋白質之動物在接受細菌挑戰 後，肺部並未出現細菌）。

實例6 · 1 1價肺炎球菌_多醣蛋白質〇共軛物疫苗以3D_MpL 為輔劑時，在1歲大BalB/C小白鼠體内之免疫原性 緒言輿目的 對抗肺炎球菌感染之保護作用係利用血清型專一性抗體 透過調理素細胞呑噬作用調節。據推測，抗體濃度增加將 產生更大保護效果，因此更積極尋求可提高體液反應之方 法。其中一種在臨床前試驗中已成功用於共軛物疫苗之方 法為使用免疫刺激性輔劑（其概論可參見普曼（p〇〇lman)等 人，1998，”以碳水化合物為主之細菌性疫苗”（Carb〇hydrate_ Based Bacterial Vaccines)，述於”實驗醫藥學手冊 ’’（Handbook of Experimental Pharmacology)，p 普爾曼 (Perlmann)與Η ·威希爾（Wigsell)編輯，德國海德堡史普林 格出版社（Springer-Verlag))。 此小節出示之數據顯示在模擬臨床試驗而設計之方法中 採用臨床套組得到之最近實驗結果。 方法： 以1/10人類劑量之肺炎球菌-多醣蛋白質D共軛物疫苗或 23價單純多醣疫苗為i歲大baib/o】、白鼠免疫接種。採用 -62- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---------鮝--------tf_ —------線· (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) A7 1235064 B7 五、發明說明（6〇) 之疫苗為臨床套組DSP009、DSP013或DSP014，分別相當於 1微克劑量血清型6 B與23 F及5微克1 1 -價共軛物疫苗中其 餘血清型，0. 1微克劑量1 1 _價共轭物疫苗，或〇. 1微克劑量 1 1 -價共軛物疫苗使用5微克3D_MPL為輔劑。所有1 1 -價 共軛物疫苗亦以5 0微克AlP〇4為輔劑。 每組2 0隻小白鼠經肌内免疫接種。於第0及2 1天時，依 下表所示為各組注射接種。第3 5天（第11劑之後1 4天）時 得到試驗血樣。 表：接受肺炎球菌-多醣蛋白質D共輛物疫苗之臨床套組 免疫接種之1歲大Balb/c小白鼠之接種計劃 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 組別 第0天 疫苗 第1劑 第21天 疫苗 第2劑 小白氣 數目 1 Pneumovax-23 2.5微克 緩衝液 20 2a 11 價 Pn-PD 0.1微克 緩衝液 20 2b 11 價 Pn-PD 0.1微克 11-價 Pn-PD 0.1微克 20 3a 11價Pn-PD+MPL 0.1微克+ 5微克 缓衝液 20 3b 11 價 Pn-PD+MPL 0.1微克+5微克 11-價 Pn-PD+MPL 0.1微克+ 5微克 20 4a 11 價 Pn-PD 1/0.5微克 緩衝液 20 4b 11 價 Pn-PD 1/0.5微克 ll，Pn-PD 1/0.5微克 20 對照組 緩衝液 緩衝液 20 依CDC/WHO—致同意之方法，亦即以細胞壁多醣中和血 63- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1235064 A7 B7 五、發明說明（61) 清後，由血清進行ELISA測定針對肺炎球菌多醣之1§(}抗 體。採用血清型專一性IgGl單株抗體校正ElisA，產生之 抗體濃度以微克/愛升表示。 採用UNISTAT 5.0 B版進行統計分析比較。依Tukey-HSD 法進行ANOVA分析換算成對數值之IgG濃度。採用費雪準 確試驗法（Fisher’s exact test)成對比較血清轉化率。 結果 · 第2次接種（第11劑）後1 4天針對1 1種血清型及蛋白質d 謗發之GMC IgG與95%可信區間示於下表。所示出血清轉 化率之95%可信區間無法計算。 第1組出示接受單純多醣免疫接種後之效果，其通常在 動物體内只謗發IgM。大多數IgG含量在檢測閥值以下；儘 管如此，balb/c小白鼠仍可針對少數幾種肺炎球菌多醣製 造IgG，尤指血清型3、19F與14。 接種共軛物疫苗時，可針對除了 23F以外之所有血清型 謗發IgG抗體，且具高度血清轉化率。 僅在血清型7 F與19F觀察到隨劑量變化之反應（第4組對 笫2組）’但這些結果均無統計顯著性。血清型3、6B、7F 與19F、及PD在接種兩劑（b組對a組）後，觀察到更大反 應，使用所有三種調配物之許多情形下之結果均具統計顯 者性。 最值得注意的是3D-MPL之效應。兩劑使用3D-MPL調配 之疫苗（3 b組）謗發專一性IgG之最高GMC，且除了血清型 23F外’對所有血清型均具統計顯著性，此時之血清轉化 率顯著較鬲（3b組對2b組p = 0.02，費雪準確試驗）。 -64- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) IAW--------•訂 -------線< 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235064 五、發明說明（62) 表：1歲大Balb/c小白鼠接受1 1 -價PS-PD共軛物疫苗免疫 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 接種第11劑後1 4天時，對特定肺炎球菌血清型與蛋白質D 產生之[IgG]幾何平均值與95%可信區間 組別 1 2a 2b 3a 3b 4a 4b 血清型 CM[Ig(j] GM[TgCj] GM|IgG] GM_ OvlpgG] GMP^jr] 微克/毫升 微克/毫升 微克/毫升 微克/毫升 微克/毫升 微克/毫升 微克/毫升 (95% CI) (95% C1) (95% C1) (95% Cl) (95% CT) (95% Ο) (95% Ο) 3 0.24 0.18 0.84 0.72 4.84 0.22 0.95 (0.16-0.6) (0.11-0.27) (0.47-1.5) (0.51-1.0) (3.0-7.9) (0.14-035) (0.19-1.8) 6B 0.02 0.04 0.19 0.14 074 0.09 0.11 0/20# 8/19 (0.09-Ό.41) (0.07-0.27) (0.29-1.9) (0.05-0.16) (0.05-0.23) 7F 0.04 0.07 0.19 0.15 0.97 0.09 0.45 0/20# (0.0Φ0.12) (0.100.39) (0.10Ό.22) (0.49-2.0) (0.06-0.14) (0.20-1.Q2) 14 0.15 4.5 6.2 12.9 13.6 4.0 6.9 3/20# (2.5-8.1) (3.6-10.5) (7.8-21.2) (9.4-19.7) (2.0-8.0) (4.^10.6) 19F 1.2 6.7 12.1 10.1 58.5 5.9 22.0 (0.56-26) (3.6-12.5) (7.&19.3) (5.5-18.5) (42-81) (3.5-9.9) (16.0-30.2) 23F 0.07 0.08 0.08 0.07 0.17 0.06 0.10 1/20# 3/20# υ\Φ 2/10# 9/2〇U 1/18# 4/20# PD* 0.25 5.2 11.9 13.5 98.0 10.9 38.7 1/20# (3.3-8.3) (6.9-20.7) (9.5-19.0) (49.1-195.) (6.4-18.4) (21.3-70.3) *EU/毫升；#血清轉化率，其定義為超過陰性對照組平均 值二個標準偏差。 組別之定義請參照前述各表。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 結論 · 本文出示之數據證明添加3D-MPL至1卜價肺炎球菌-多 醣蛋白質D共軛物疫苗時，可使年老balb/c小白鼠對所有 試驗血清型之免疫反應提高。 大多數情況下，兩劑疫苗謗發之IgG濃度幾何平均值高 1-65- ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱） 1235064

五、發明說明（63) 、一劑疫苗時。由於此現象未出現在使用單純多醣疫苗時 (即使在人體内），因此認為此係依賴T -細胞之免疫反應， 且謗發免疫記憶。 這些數據支持使用以Thl輔劑（以3D-MPL較佳）為輔劑之 共輛肺炎球菌多醣之疫苗接種計劃，其係投與至少兩劑有 辅劑之疫苗，最好間隔1至1 2週，以間隔3週最佳。這種 接種計劃為本發明另一方面。 實驗中採用之小白鼠對PS 23(單純或共軛）無反應。值得 /主思的是’雖然不論使用何種疫苗組合物，對抗多醣產生 <抗體量仍舊低，當使用3D_MPL作為輔劑時，更多小白 私則對PS 23有反應（血清轉化率顯著較高）。本發明另一 方面為在含共輛之肺炎球菌多醣之疫苗組合物中使用丁卜^ 輔劑，特足言之3D-MPL，以解除對疫苗中肺炎球菌多醣 之無反應性問題。本發明又另一方面為採用上述之兩劑投 藥計劃，使用上述組合物解除無反應性之方法。 實例7 -腦膜炎奈氏球菌c多醣-蛋白質d共轭物（psc-PD) A :蛋白質D之表現 如實例1。 B ··多醣C之製造 C族多醣之來源為腦膜炎奈氏球菌之菌株c 11。其係使用 傳統醱酵技術醱酵（EP 72513)進行醱酵。共軛法中使用之 乾粉多醣與Mencevax (SB生化公司）相同。 取一份C11菌株解凍，取ο.〗毫升懸浮液在補充酵母萃物 透析液（10%，v/ν)之慕勒亨頓（Mudler Hinton)培養基培養 -66- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） Γ睛先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) #

tT---------線 I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製， 1235064

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（64) 皿上依條狀塗佈，於飽含水之通風培養箱中，在36t:下培 養2 3至2 5小時。 表面生長物再懸浮於無菌醱酵培養基中，取此懸浮液接 種至含有補充酵母萃物透析液（1〇%，之慕勒亨頓培養 基與無菌玻璃珠之洛克斯瓶（R〇ux b〇ttle)上。洛克斯瓶在 飽含水之通風培養物中，於36t：下培養23至25小時後， 表面生長物再懸浮於10毫升無菌醱酵培養基中，取〇.2至 〇·3晕升此懸浮液接種至另丨2支慕勒亨頓培養基洛克斯瓶 中。 於飽含水之通風培養箱中，於36它下培養23至25小時 後，表面生長物再懸浮於1〇毫升無菌醱酵培養基中。於圓 錐瓶中收集細菌懸浮液。 此懸浮液再於無菌下使用無菌針筒移至醱酵槽中。 腦膜炎球菌之醱酵係於位於負壓下之無菌室之醱酵槽中 進行。醱酵過程通常在1〇至12小時後完成，相當於約ι〇1〇 個細菌/耄升（亦即前穩定期），且由p H提高程度來檢測。 在此階段，整個營養液先加熱去活性（56t：下12分鐘）， 然後離心。去活性之前與之後，自營養液中取樣，依條狀 塗在慕勒亨頓培養基培養皿上。 C : PS純化法 遠純化法為一種多段式法，於整個醱酵營養液上進行。 第一個純化階段中，去活性之培養物經離心澄清化，回收 上澄液。 多醋純化法係以利用四級銨鹽進行之沈澱法為主（鯨虫鼠 ___ -67- 本紙張尺度適中國國規格⑽χ挪 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) it tfi —------線‘ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235064 ^ A/ B7 五、發明說明（65) 基三甲基銨4匕溴/CTAB，CETAVLON R)。CTAB與聚陰離子 (如：多醣、核酸與蛋白質，依其pi而定）形成不可溶複合 物。依離子控制條件，可採用此方法使雜質（低導電性）或 多醣（高導電性）沈澱。 含在澄清之上澄液中之多醣使用矽藻土（ CELITER 545)作 為母質進行沈澱，以避免在不同沈澱/純化期間形成不可 溶之惰性物質。 腦膜炎奈氏球菌多醣C之純化法： 步騾1 :使PSC-CTAB複合物固定在CELITER 545上，以 CTAB 0.05%洗滌，排除細胞碎塊、核酸及蛋白質。 步騾2 :以EtOH 50%溶離P S。第一個溶離份混濁且包含 雜質與LPS，棄置不要。利用凝絮試驗法證明下一個溶離 份中含有P S。 步騾3 :使PS-CTAB複合物再固定於CELITE R 545上， 以0.05% CTAB洗滌排除較小型核酸及蛋白質。 步騾4 :以50% EtOH溶離P S。第一個混濁溶離份棄置不 要。以凝絮試驗法證明下一個溶離份中含有P S。 溶出液過濾，收集含粗多醣之濾液。添加乙醇至終濃度 80%，使多醣自濾液中沈澱。回收多醣之白色粉末，真空 乾燥，保存在-20°C下。 D . CDAP共軛法 PSC與PD之共軛法 使PSC與PD共軛時，以CDAP共軛技術較適於傳統CNBr 活化法，並利用間隔基與載體蛋白質偶合。首先活化多 -68- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ——1--------0--------Ifi-------線# (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1235064 A7 B7 五、發明說明（66) 二係與1 β氰基_4·二甲胺基吡啶鑕四氟硼酸鹽（CDAP) 進行氰酸化作用。CDAP為水溶性氨酸化試劑，其中氨基 之親弘子性同過CNBr之親電子性，使得氰酸化反應得以 在相當溫和條件下進行。活化後，多醣可利用其胺基與直 接與載體蛋白質偶合，不需要引進任何間隔基分子。未反 應义酯氰酸酯基團則利用與甘胺酸積極反應而中止其反 應。製備共軛物疫苗之步騾總數減少，最重要的是可能具 免疫原性之間隔基分子不出現在終產物中。 以CDAP活化多醣可在多醣中引進一個氰酸酯基團，釋 出二甲胺基吡啶（DMAP)。氰酸酯基於下一個偶合過程中與 蛋白g中之NH2·基團反應，轉化成胺甲酸酯。 PSC活化作用與PSC-PD偶合法 活化作用與偶合法均在+25 °C下進行。 取120毫克PS於WFI中至少溶離4小時。 添加CDAP溶液（於乙腈中新鮮製備1〇〇毫克/亳升），使 CDAP/PS(w/w)比例達 0.75。 1分鐘3 0秒後，添加三乙胺提高pH至活化pH (pH 1〇)， 並且保持安定至添加p D時。 3分鐘3 0秒後，添加NaCl至終濃度2 Μ。 4分鐘後，添加純化之PD至PD/PS比例為1.5/1 ;立即調 整pH至偶合pH (pH 10)。在調整pH下靜置溶液1小時。 中止反應 添加6毫升2 Μ甘胺酸溶液至PS/PD/CD AP混合物中。調 整pH至中止反應pH (pH 8·8)。於操作溫度下攪拌溶液3 〇 -69- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------•訂---------線* 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235064 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（67) 分鐘，然後在持續緩缓攪拌下，於+2-8°C下一夜。 PS-PD純化法 過濾後（5微米），PS-PD共軛物在低溫室中，於S400HR Sephacryl凝膠上進行凝膠滲透層析法純化，以排除小型分 子（包括DMAP)與未共軛之PD ··溶離-NaCl 150 mM pH 6.5 ;追踪-UV 280 nm，pH與導電性。 根據反應成份之不同分子大小，首先溶離出PS-PD，接 著為游離PD及最後DMAP。收集含有由DMAB (PS)及//BCA (蛋白質）檢測到之共輛物之溶離份。收集之溶離份無菌過 濾（0,2微米）。 E . PSC-PD吸附之共軛物疫苗之調配物 以aipo4洗滌 為了使PSC-PD共軛物在AlP〇4上有最佳吸附作用，洗滌 A1P04以降低P043·濃度： 以 150 mM NaCl洗滌 AlP〇4並離心（4x); -離心塊再懸浮於150nMNaCl中後，過濾（100微米）；及 -遽液加熱除菌。 此洗滌後之A1P04稱為WAP(經洗滌及高壓釜殺菌之磷酸 鹽）。 調配法 最後調配終產物之前，使鬆散之PSC-PD共軛物吸附在 AlP〇4 WAP上。AlP〇4 WAP於室溫下與PSC-PD攪拌5分 鐘。調整p Η至5.1，混合物於室溫下攪拌1 8小時。添加 NaCl溶液至150 mM，混合物於室溫下攪拌5分鐘。添加2- -70- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -1--------* 訂---------線- 1235064 A7 B7 五、發明說明（68> — 苯氧乙醇至5毫克/毫升，混合物於室溫 你 ^ ^ ττ 卜柷拌1 5分鐘 後，调至pH 6.1。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 最終組成/劑 • PSC-PD : -aipo4 WAP ： • NaCl : -2-苯氧基乙醇 -注射用水 -pH F :臨床前資料 多醣共軛物於小白鼠體内之免疫原性 以6至8週大Balb/C小白鼠分析PSC-PD共軛物之免疫原 性。以單價疫苗形式注射單純（未吸附）共軛物或吸附在 AIPO4上之共輛物。利用ELIS A測定謗發之抗psc抗體，利 用細菌試驗分析功能性抗體，這二種方法均以C d C (美國 亞特蘭大疾病防治中心（Centers for Disease Control and Prevention，Atlanta，USA)方法為依據。由進行二種不同實 驗所得結果來評估劑量與輔劑（A1P04)對反應之影響。 劑量範圍實驗 本實驗中，為Balb/C小白鼠注射二次PSC-PD(間隔2 週）。採用於Α1Ρ〇4上調配之四種不同共軛物劑量：〇. 1 ; 0.5 ; 2.5 ;及9.6微克/隻動物。於第14天（第I劑後14天）， 2 8天（第11劑後1 4天）及4 2天（第11劑後2 8天）為小白鼠（每 組1 0隻）抽血。採用ELIS A測定多醣C專一性抗體之濃度幾 10微克PS 0.25毫克Af 150 mM 2.5毫克 至0.5毫升 6.1 -71 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) IAW--------訂---------線- 1235064 A7 B7 五、發明說明（69) (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 何平均值（GMCs)，以微克igG/毫升表示，以純IgG為參考 物。於收集之血清上，於幼兔補體之存在下使用腦膜炎奈 氏球菌C 11菌珠測定殺細菌性抗體，以可以殺死5〇%細菌 之稀釋度倒數為效價表示。 所得到劑量-反應自2·5微克劑量起形成一個平頂期。結 果顯示’在第I劑後1 4天至第11劑後1 4天之間有良好之追 加反應。在第11劑後2 8天時之抗體含量至少與第11劑後 1 4天時之含量相同。殺細菌性抗體效價與ELIS a濃度一 致，且證實PSOPD共軛物之免疫原性。 輔劑之影響 本實驗中，分析一批於A1P04上調配之PSC-PD共軛物， 注射單純（無輔劑）共軛物供比較。每組1 0隻小白鼠，間隔 2週經皮下途徑共注射2次，各2微克共軛物。於第1 4天 (第I劑後1 4天）、2 8天（第11劑後1 4天）、及4 2天（第11劑 後2 8天）為小白鼠抽血，測定ElisA與功能性抗體效價（僅 於第11劑後1 4天及第11劑後2 8天時進行殺細菌試驗）。 A1P04調配物謗發之抗體效價比無輔劑之調配物高達10倍。 結論 由上述實驗之結果得到下列一般結論： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -PSC-PD共軛物謗發之記憶反應證明當PSC共軛時，即 成為依賴T細胞之抗原。 -由ELISA測定之抗PSC抗體濃度與殺細菌性抗體效價有 良好相關性，此表示由PSC-PD共軛物謗發之抗體具有對抗 腦膜炎奈氏球菌血清型C之功能。 -72- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1235064

五、發明說明（7〇) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -吸附在A1P04之約2.5微克共軛物似乎可在小白鼠體内, 發取佳抗體反應。 -CDAP化學似乎為製造免疫原性PSC_PD共軛物之適當方 法。 實例8 -由腦膜炎奈氏球菌血清型a - p D共軛物製備多膽之 方法 取多醣A(PSA)乾粉於〇·2 M NaCl溶液中溶解1小時，至 終濃度8毫克/毫升。以HC1或NaOH固定pH值在6，溶液於 25C加溫調節。添加0.75毫克CDAP/毫克PSA(製成1〇〇毫克 /毫升乙腈）至PSA溶液中。在未調節pH下1.5分鐘，添加 0.2 M NaOH至pH 10。2.5分鐘後，根據pD/pSA比例約 下，添加蛋白質D (濃縮至5毫克/毫升）。在1小時之偶合 反應期間保持pH 10。然後添加1 〇毫克甘胺酸（2 M pH 9·〇)/耄克PSA ’調節pH至9.0，於25下3 0分鐘。混合物先 於4 C下保留一夜後，利用排斥管柱層析法純化（Sephacryl S400HR ’法馬藥廠（pharmacia))。首先溶離出共軛物，隨 後為未反應之P D與副產物（DMAP，甘胺酸，鹽）。收集共 輛物’經0.2微米Sartopore膜過濾（薩特里斯公司（Sartorius)) 除菌。 實例9 -實例7與8產物之試管内特性： 主要特性综合說明於下表： -73- 本紙張尺度過用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) I I I I--—訂------丨丨 _ { A7 1235064 一 —__B7 五、發明說明（71)

No 共軛物 說明 蛋白質與PS含 量(微克/毫升） PS/蛋白質 比例(w/w) 游離蛋白質 (%) 游離PS (%) 1 PSC-PD 以NaOH調節pH PS:210 PS:308 1/0.68 <2 8_9 2 PSC-PD 以TEA調節pH PS:230 PS:351 1/0.65 <2 5_6 3 PSA-PD 以NaOH調節pH PS.159 PS.149 1/1.07 __i 5 5-9 試管内結果 以Balb/c小白鼠為動物模式測試共輛物之免疫原性。共 車厄物係吸附在Α1Ρ〇4或Al(OH)3上（10微克PS吸附在5〇〇微 克Al3 +上）或未吸附。依下列方式注射小白鼠：間隔2週， 注射2次（2微克P S /次注射）。 由此等結果得到之第一個結論為游離p s對免疫反應有極 大影響。游離P S含量小於1〇%之共軛物可得到較佳結果。 上述CD AP方法之改良法亦為本發明另一方面。 調配物亦重要。A1P〇4似乎為此模式中最適當輔劑。共 軛物可誘發之追加效應則未出現在僅注射多醣時。 結論 ^ 所得到腦膜炎奈氏球菌之共輛物中最_ps/蛋白質 比例分別為1與〇.6_〇.7(w/w)。游離p s與游離載體蛋白 別曰在10%及15%以下。多醣回收率高於7〇%。由上述改： (最週化）CDAP法（不論何種載體蛋白質，但以蛋白 佳）得到之PSA與PSC之共軛物為本發明另一方面。 义 實例1 〇 -由流感嗜血捍菌b_PD*軛物製備多醣之方法 流感嗜血桿菌b為2歲以下幼兒腦膜炎之主因之一’。流感 _________ - 74 · 本紙張尺度適用家標準格⑽x 297公璧） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂----I----一 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235064 A7 ___B7__ 五、發明說明（72) 嗜血样菌（PRP)之莢膜多醣與破傷風類毒素之共輕物係習 知者（依J,洛賓斯（Robbms)發展之化學進行共軛）。CDAp 為一種改良之化學法。下文說明使PRp共軛，最好與pD# 軛之最佳CDAP條件。 影響共軛反應之參數如下： 多醣初濃度（對游離多醣終濃度及無菌過濾步騾有雙重 影響）。 載體蛋白質初濃度。 多醣對蛋白質之初比例（其亦對游離多醣終含量及無菌 過濾步騾有雙重影響）。 CDAP之用量（通常大量過量）。 反應溫度（其會影響多醣降解，反應動力學，及反應性 基團之降解）。 活化及偶合之p Η。 中止反應之ρ Η (影響殘留DMAP之含量）。 活化、偶合及中止反應之時間。 本發明者已發現使終產物達最佳品質之三種最重要參數 為··多醣/蛋白質之初比例；多醣之初濃度；及供合作用 pH。 反應空間之設計以上述三條件為三個軸。這三個轴 < 中 心點（及實驗值範圍）為：PS/蛋白質比例-^(土0·3/1); [PS] = 5毫克/毫升（土 2毫克/毫升）；及偶合PH 單位）。 次要參數固定如下：採用30毫克多醣；溫虞25 C ; -75- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 0--------訂——------赛 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235064 A7 B7 五、發明說明（73) [CDAP]=0.75毫克/毫克PS ;以〇 2 μ NaOH滴定PH ;活化 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) pH=9.5 ;活化時間=ι·5分鐘；偶合時間=丨小時；[蛋白 質]=10毫克/毫升；中止反應ρΗ=9·0 ;中止反應時間=!小 時；P S於溶劑中溶解時間=1小時，於2M NaC1中，·於

Sephacry S=400HR上純化，以 150 NaCl溶離，1 2 公分 / 小時；及依5毫升/分鐘，經SART〇lab P2〇過濾除菌。 當在上述反應空間中製造產物時，建立最佳條件之數據 為：加工數據-過濾後之最大收量，蛋白質之最大添加 量；及產物品質數據-P S /蛋白質之終比例，游離p S含 量，游離蛋白質含量，殘留DMAP之最低含量（係CDAp之 降解產物）。 過遽產量 影響過濾產量之因素為初[PS]與偶合pH及初PS/蛋白質比 例之間之交互作用。[PS]低時，與後2個因素之交互作用 不大，經常得到良好之可過濾性（所有產物均可達約 95%)。然而，在高濃度下，若ρ η及初比例提高時，可過 濾性即下降（高[PS]，最低比例，最低ρΗ=99%過濾性；但 高[PS]，最高比例與ρΗ=19%過濾性]。 蛋白質添加量 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 P S /蛋白質最終比例對初比例之比值為偶合效力之測定 值。高[PS]下，ρ Η不影響比例之比值。然而，初比例則會 影響比例之比值（初比例低時為1 ·75，初比例高時為丨26)。 [PS]低時，比例之比值大多較低，但此時ρ η之影響較大 [低pH，低比值=0,96 ;低pH，高比值=0.8 ;高pH，低比值 -76- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1235064 A7

7 R 五、發明說明（74) —1.4 ,及南pH，南比值=〇92)。 PS/蛋白質終比例 終比例依初比例與[PS]而定。當組合高初比例與高[ps] 時，可得到最大終比例。P H對終比例之影響不如在弱[ps] 下之影響。 游離蛋白質D之含量 在高pH及高[PS]下可見到最少量游離蛋白質D(達〇 〇)。 當p Η低時，咼[PS]之影響特別顯著。提高初比例對提高游 離蛋白質D之影響不大。 殘留DMAP 初比例並沒有顯著影響。反之，DMAP含量隨[PS]提 同’當ρ Η }疋南時則下降。 結論 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Li 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 最佳偶合條件如下：偶合pH=9.0 ; [PS] = 3毫克/毫升；且 初比例=1/1。在此等條件下得到終產物之特性如下： PS/蛋 終 白質 匕例 過濾後PS 產量C%) 比例之 比值 游離蛋白質D (%) DMAP含量 (毫微克/10微克 PS) 值 範圍 值 範圍 值 範圍 值 範圍 值 範園 1.10 0.91- 92.6 50_ 1.16 1.03- 0.71 0- 4.95 2.60- 1.30 138 1.29 10.40 7.80 由上述改良（最適化）CDAP法（無關何種載體蛋白質，但 以蛋白質D較佳）得到之prp共軛物為本發明另一方面。 實例1 1 :以蛋白質D為抗原-使用3D-MPL調配時，如何改 -77- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Ifi^-------線 < 1235064 A7 B7 五、發明說明（75) 善其對抗非典型流感嗜血捍菌之保護效力 取雌性Balb/c小白鼠（每組1〇隻），於2〇週大時（do)第一 次接種（經肌内）1 1價肺炎球菌多醣-蛋白質D共軛物疫 苗，2週後（D14)接種第2劑。第2劑接種後7天抽血。以 IgGl、IgG2a與IgG2b型抗體測定對抗蛋白質d之抗體效價。 冷束乾燥之11價疫苗（不含A1P〇4)之製法為組合共軛物 與15.75%乳糖，於室溫下攪拌15分鐘，調至1)116.1±〇.1， 冷涞乾燥（該循環通常在_69ac下開始，在3小時内逐漸調 至-24 C ’然後保持此溫度1 8小時，然後在1小時内逐漸調 至_ 16 °C，然後保持此溫度6小時，再於3小時内逐漸調至 +34°C，最後保持此溫度9小時）。 調配物組成及冷凍乾燥物之再組成法示於表1 3。 判斷Th 1型細胞調節之免疫反應是否發生之最具特色之 測定值已知與IgG2a抗體相關。由數據可見，若蛋白質d與 Thl輔劑（此時為3D-MPL )冷〉東乾燥時，igG2a驚人地大量 增加。 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁} --------tfi-------線< 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -78- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1235064 A7 B7 五、發明說明（76) * ii念騎二许耸4之-2二> 岑二2-舛梦6®> 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 气 m η 痛 痛 笳 笳 痛 痳 雜 趄 雜 铱 斧蓉 添婶 η , η S Lh 褰 C^ LT\ η U\ n c^ η c^ ί-Λ 赛 C^ 赛 C^· h 十 鱗 U\ 揉 S S s s S S S S c^ S i 燁 c^ I 燁 c^ h 1 1 1 P »> P ρ '¥ > *^3v gs ^ ARV gs gs 袭s ^ ί P ，外 ovv- 查 § s P Ρ %γ § s ig s 1 查 Ss |p || 1 § ii i_1 P 多Γ 聋釔 to Η—* δ a； d; Ltx Kj Lh Kj 褰 ►τ—* to OS 〇 s Ρ Ρ .〇 s f i 1 I § >〇 y\ U) U P 〇 Ρ S i ·〇 § o s On P § § 子 1 « ho u S bo 00 bo 8§ i VO ΟΝ g s g u> H-* S p •念 B: U) p; δ 1 ►—a u> 1 N u> U) s I g 1 o oo § OO g U) .! PN s 0 1 P δ P § ·〇 KJ\ δ 1 s c 1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .· tfir------線< -79- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1235064 年月曰 —一—— 修正. 申請曰期 89. 03. 17 案 號 089104976 類 別 說明書替換頁(93年9月） A4 C4 中 文 含共軛的肺炎鏈球菌莢膜多醣之冷凍乾燥抗原性組合物 英 文 "LYOPHILIZEDAmiGENIC COMPOSITION COMPRISING CONJUGATED STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE CAPSULAR POLYSACCHARIDES ” 姓 名 國 發明 創作> 住、居所 1. 卡林卡皮歐 2. 瑪格麗特迪絲崔沛絲 3·皮爾麥克迪斯蒙斯 4·克里格安東尼約瑟夫拉菲利爾5. 貞普爾曼 6. 貞-保羅皮利爾斯 1·2·3·6·均比利時4.加拿大5.荷蘭 1 -6.均比利時利克森沙特市第一學院路89號 姓 名 (名稱） 國 籍 申請人 住、居所 (事務所) 代表人 姓 名 比利時商史密斯克萊美占生物公司 比利時 比利時利克森沙特市第一學院路89號 詹恩史帝芬 V63\63292-930929doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 12350猶 五、發明説明（彳 ） 第089104976號專利申請案 中文說i明書替換頁(92年6月） *η·【骤一 一·1· 一《»，一-—一〜、 92 π f .，，雄…:τ: | 4 ,， 厂多—l-i—”· A7 千月日 B7 *— .. „__ 發明範圍 本發明係有關細菌性多醣抗原疫苗，其製法及此等多醣 於醫學上之用途。 特定言之，本發明係有關三個相關方面入_包含肺炎球菌 多醣抗原之疫苗，典型指肺炎球菌多醣共輛物抗原，採用 來自肺炎鏈球菌〇S7rej^OCOCCM5⑽⑼所州,·此）之蛋白質抗原 及視需要使用TM謗發輔劑調配；B_wTM輔劑為輔劑之 專一性且有利 < 肺炎球菌多醣共軛物；及c _通常與來自流 感嗜血桿菌（H. influenzae)之蛋白質D共軛之細菌性多醣共 輛物。 發明背景 肺炎鏈球菌為格蘭陽性細菌，為相當高罹病率與死亡率 (尤其對#年幼及年長者）之肇因，會引起侵入性疾病如：肺 炎、細菌血症及腦膜炎，及與菌落移生有關之疾病如··急 性中耳炎。美國6 0歲以上罹患肺炎球菌胺炎之比例約每 100,000人有3至8人。其中20%病例導致細菌血症，其他病 症如：腦膜炎，即使使用抗生素治療仍使死亡率逼近 30%。 肺炎球菌係利用化學連接之多醣包埋，賦與血清型專一 性。已知之肺炎球菌血清型有9 〇種，莢膜為肺炎球菌之主 要毒力決定子，因為莢膜不僅保護細菌内表面與補體分 隔，而且其本身之免疫原性低。多醣為不依賴丁_細胞之抗 丨 原，且不會被處理或出現在MHC分子上與τ-細胞交互作 用。然而，其會透過另一種涉及與B細胞上表面受體交鏈 I O:\63\63292-920618.doc - 4 - 本紙張尺度適财顯緖準(CNS) Μ規格(⑽χ2974、#) Α7 Β7 丨彳12择(^^1|〇4976號專利申請案 I “，書替換頁(92年6月) 五、發明説明（2 ) 之機轉刺激免疫系統。 有數項實驗顯示，對抗侵入性肺炎球菌疾病之防護作用 與莢膜之專一性抗體有最強烈相關性，且此防護作用為血 清型專一性。 以多醣抗原為主之疫苗係相關技藝習知者。已核准人體 使用之四種多醣抗原包括：傷寒沙門氏菌（Sa/mo/7e//a 〇^/2/) 之Vi多醣，流感嗜血样菌之PRP多 醣，由血清型A，C，W135及Y組成之四價腦膜炎球菌疫 苗，及由相當於血清型1、2、3、4、5、68、7尸、8、91^、 9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、 20、22F、23F及33之多醣組成之23價肺炎球菌疫苗（佔肺 炎球菌血液單離株至少90%)。 後三者疫苗為嬰幼兒提供保護對抗造成嚴重罹患率及死 亡率之呼吸性感染之細菌，但此等疫苗仍未核准用於二歲 以下之幼兒，因為其免疫原性不適合這個年齡層（皮特拉 (Peltola)等人（1984)，N. Engl. J. Med. 3 10:1561-1566)。肺炎 鏈球菌為嬰幼兒之侵入性細菌性疾病與中耳炎最常見原 因。同樣地，較年長患者對肺炎球菌疫苗之反應較差[洛 曼（Roghmann)等人，（1987)，J. Gerontol. 42:265-270]，因此 這個族群之細菌性肺炎發生率亦提高[維格希（Verghese)與 柏克（Berk)，（1983) Medicine (Baltimore) 62:271-285]。 過去曾設計克服此嬰兒免疫原性缺陷之方法包括連接多 醣與大型免疫原性蛋白質，以作為T -細胞之助手，並謗發 對抗與其共軛之多醣抗原之免疫記憶。肺炎球菌醣蛋白共 O:\63\63292-920618.doc _ Ο _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 5(^^^4976號專利申請案 中文說相書替換頁(92年6月)

A7 B7 五、發明説明（3 ) 轭疫苗目前仍在評估其在不同年齡層之安全性、免疫原性 及效力。 A) 肺炎球菌多醣疫苗 2 3價未共軛肺炎球菌疫苗之臨床效力有很大差異，由 0 % 至 8 1%(費森（Fedson)等人，（1994) Arch Intern Med. 154: 253 1-2535)。該效力似乎與已有免疫力之危險族群有關， 如：老年人、霍金氏症（Hodgkin’s disease)、脾切除、鐮刀 狀細胞疾病及缺丙型球蛋白血症（費恩（Fine)等人，I"4, Arch Intern Med. 154:2666-2677)，亦與疾病症狀有關。該 2 3價疫苗並未對肺炎球菌肺炎（對某些高危險群如：老年 人）及中耳炎疾病展現保護作用。 因此需要改良之肺炎球菌疫苗組合物，特定言之，可對 老年人及幼兒更有效預防或改善肺炎球菌疾病（特定言之 肺炎）之組合物。 本發明提供這種改良之疫苗。 B) 選定之肺炎球菌多醣共軛物+3D-MPL組合物 一般認為商業化未共軛之肺炎球菌疫苗之保護效力多少 與接種時謗發之抗體濃度有關；的確，各成份多醣之免疫 原性只有2 3種多醣核准使用（威廉斯（Williams)等人編輯， New York Academy of Sciences 1995 pp. 241-249)。因此進 一步提昇對肺炎球菌多醣之抗體反應可增加嬰兒與老年人 對第一次接受多醣或多醣共軛物注射後產生之抗體保護程 度百分比，且可減少為了謗發對肺炎鏈球菌引起之感染之 保護性免疫力所需之劑量與注射次數。 -6 - O:\63\63292-920618.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 阪飞:. 104976號專利申請案 也文Μ明書替換頁(92年6月） 五、發明説明（5 子進一步減弱毒性，但未改變免疫刺激活性。 3D-MPL本身即已用為輔劑，或最好與貯積型載體輔劑 組合如··氫氧化鋁、磷酸鋁或水包油性乳液··這種組合物 中，抗原與3D-MPL含在相同粒狀結構中，可更有效傳送 抗原性與免疫刺激性訊號。已有實驗顯示，3EuMpL可以 進一步加強吸附在鋁上之抗原之免疫原性[特倫（Th〇elen) 等人，Vacine (1998) 16:708_14; EP 689454-B1]。這種組合 亦較適於容易吸附之抗原（例如：細菌性多醣共軛物），其 中吸附在礬土上之作法可以穩定抗原。主要使用沈澱之以 鋁為王之輔劑，因為其係目前人體疫苗唯一核准使用之輔 劑。因此，含3D-MPL與以鋁為主之辅劑組合之疫苗由於 發展之簡便及導入市場之速度，因此係相關技藝上有利之 疫苗。 MPL(非3·去醯基化）已評估為具有多種單價多醣_共軛物 疫苗抗原之輔劑。於生理食鹽水中共同注射MpL可加強血 清抗體對四種單價多醣共軛物之反應：肺炎球菌ps 66_破 傷風類毒素、肺炎球菌PS 12-白喉類毒素、及與銅綠假單 胞菌（Ρπ W謂⑽似•⑽μ)外毒素A共軛之金黃色葡萄 球菌型及金黃色葡萄球菌8型（史尼森 (Schneerson)等人，j. Immunol〇gy (1991) 147:2136_214〇]。 所加強之反應據稱為抗原專一性。含在水包油性乳液中之 MPL(—種載體型輔劑）與含在生理食鹽水中之MpL所加= 之效應一致，因為MPL與抗原含在相同粒狀結構中，且被 視為傳送其他多醣共軛物疫苗之輔劑系統之最佳選擇。子 O:\63\63292-920618.doc - 8 · 本紙張尺度適用巾酬家標準(CNS) A4規格(21Q χ哪公右

1〇4976號專利申請案 仴書替換頁(92年6月） Λ23Α 〆，一-一‘，〜1 口 r爻說 五、發明説明（6 ) 大衛（Devi)等人[Iufect· Immun. (1991) 59:3700-7]分析含 在生理食鹽水中之MPL(非3 -去醯基化）對鼠類抗體針對新 型隱球菌荚膜多醣之TT共輛物 之反應產生之輔劑效應。當MPL與共軛物同時使用時，對 P S之IgM-及IgG-專一性反應均只有很有限地增加；然而， 當投與共軛物2天後，MPL之效應即大幅提高。採用這種 免疫接種計劃需要比抗原延後投與MPL，尤其對嬰兒接種 時，使得其實用性令人存疑。MPL使用多醣及多醣-蛋白 質共軛物之輔劑效應似乎與組成有關。此外，在合適之緩 釋傳送系統中增加MPL (例如：使用載體輔劑）可提供更持 久之輔劑效應，且解決投藥時間及延遲投藥之問題。 總言之，相關技藝已說明對於特定多醣或多醣-共軛物 抗原而言，當使用MPL或3D-MPL作為輔劑時，宜與載體輔 劑（例如：以鋁為主之輔劑）組合使用，以加強其免疫刺激 效應至最大程度。 本發明者已驚人地發現，對某些肺炎球菌多醣共軛物而 言，當抗原只使用3D-MPL調配而不使用3D-MPL配合載體 輔劑（如：以鋁為主之輔劑）調配時，疫苗組合物之免疫原 性顯著較高。此外，所觀察到之改善效果與3D-MPL之使 用濃度無關，且不論該特定共輛物含在單價組合物或組合 形成多價組合物均然。 C )細菌性多醣-蛋白質D共軛物 如上已述，以多醣抗原為主之疫苗係相關技藝習知者。 上述核准使用之多醣疫苗已證實有不同臨床效力。據估 O:\63\63292-920618.doc ~ 9 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

二A 口

〇4976號專利申請案 明書替換頁(92年6月） A7 B7 五、發明説明（12 圖1 C : 0 F 1小白鼠經鼻内接種血清型6 B挑戰後6小時肺 部肺炎球菌群集情形，12組0F1小白鼠於第0及14天經皮 下接種後肺炎球菌於肺之群集。該小白鼠接種含有A : 5 0 微克Α1Ρ〇4，B ·· 0.1微克多醣/蛋白質〇之血清型·共軛 Η價肺炎球菌多醣共軛疫苗+ 50微克AlP〇4，或C : 0.1 微克多醣/蛋白質D之血清型-共軛11價肺炎球菌多醣共 轭疫苗+10微克PdB(滅毒突變株自溶酶）+ 5〇微克 A 1 P 〇 4 + 5微克3 D - Μ P L之調配物。該小白鼠於2 1天後接 受血清型6 Β肺炎球菌之挑戰，並於挑戰6小時後測量群集 之情況。粗線表示等差中項。 發明說明 Α)肺炎球菌多醣疫苗 本發明提供一種改良疫苗，特別用於預防或改善老年人 (及/或嬰兒與幼兒）肺炎球菌感染。 本發明中，若患者為55歲或以上時，典型指超過6〇歲 以上，更常指6 5歲以上，則視之為老年人。 因此，本發明一項具體實施例中，提供一種適用於老年 人（及/或嬰兒與幼兒）之疫苗組合物，其包含至少一種肺炎 鏈球菌多醣抗原及至少一種肺炎鏈球菌蛋白質抗原。 第二項較佳具體實施例，本發明提供一種疫苗（其適合 預防老年人肺炎），其包含至少一種肺炎鏈球菌多醣抗原 及至少一種肺炎鏈球菌蛋白質抗原與Thl辅劑。 這種疫苗亦適用於為其他高危險群（如：嬰兒或幼兒 肺炎球菌感染。 第三項具體實施例中，提供一種疫苗組合物，其包含肺

訂

O:\63\63292-920618.doc 15- 本紙張尺度適财顯^W(CNS) A4%¥(21〇7i^57 ............ I I ------_ 123 50#^|9丨i4976號專利申請案 ，：中文說_書替換頁(92年6月） |五、發明説明（25~Γ~ 蛋白質D為來自流感嗜血样菌之I g D -結合性蛋白質 (EP 0 594 610 B1)且為一種潛在免疫原。 包括在本發明内之蛋白質D共軛之多醣包括（但不限 於）：對抗傷寒沙門氏菌之Vi多醣抗原，腦膜炎球菌多醣 (包括A、C、W135與Y型，及B群腦膜炎球菌之多醣與改 質多醣），來自金黃色葡萄球菌之多醣，來自無乳鏈球菌 之多醣，來自肺炎鏈球菌之多醣，來自分支捍菌之多醣， 例如：結核分枝桿菌（如：甘露糖磷酸肌醇海藻糖、黴菌 酸，甘露糖封端之阿拉伯甘露聚糖，其莢膜與阿拉伯半乳 聚糖），來自新型隱球菌之多醣，非典型流感嗜血桿菌之 脂多醣，來自流感嗜血桿菌b之莢膜多醣，莫拉氏菌 之脂多醣，索氏志贺氏菌（从/如//0 5〇/7狀/·)之脂多醋，克魯士氏錐蟲（7>少/?⑽crwz/·)之脂 肽磷酸糖甞（LPPG)，與癌症有關之神經節醣脂GD3， GD2，與腫瘤有關之黏蛋白，尤指T - F抗原、及唾液T - F 抗原，及結構上與T · F抗原相關之HIV結合多醣。 該多醣可依任何已知方法與載體蛋白質連接（例如：萊 克哈特（Likhite)，美國專利案4,372,945及阿莫（Armor)等 人，美國專禾『案4,474,757)。最好進行CDAP共軛法（WO 95/08348) ° CDAP法中，最好使用氰酸化劑1 -氰基-二甲胺基吡啶鑕 四氟硼酸鹽（CD AP)來合成多醣-蛋白質共軛物。氰酸化反 應可於相當溫和條件下進行，其中避免水解對驗敏感之多 醣。此合成法可直接偶合載體蛋白質。 -28-

t O:\63\63292-920618.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) •\：：r

l〇4976號專利申請案 文說^書替換頁(92年6月）

五、發明説明（29 質[(US 5766608-俄亥俄州研究基金會）]及含其肽之融合物 [例如：LB 1(f)肽融合物；US 5843464 (OSU)或WO 99/64067]; OMP26 [WO 97/01638(寇狄斯（Cortecs)]; P6 [EP 281673 (紐 約州 ϋ 大學）];TbpA與TbpB; Hia; Hmwl，2; Hap;及D15。 本發明涵括之較佳小兒科用疫苗為： a) 腦膜炎奈氏球菌多醣共軛物與流感嗜血捍菌b多醣共軛 物’視需要使用腦膜炎奈氏球菌A及/或γ多醣共軛 物，但其限制條件為至少一種多醣抗原，最好所有多 醣抗原均與蛋白質D共軛。 b) 疫苗a)含DT、TT、百日咳成份（以PT、FHA及PRN較 佳）、B型肝炎表面抗原及ΙΡγ(去活性三價灰質炎病毒 疫苗）。 〇與蛋白質D共軛之肺炎鏈球菌多醣抗原。 d)疫田c)含一種或多種來自莫拉氏菌 camrr/m/b)及/或非典型流感嗜血桿菌之抗原。 所有上述組合疫苗均宜包含蛋白質D作為載體。顯然 地’組合疫苗中涉及愈多載體（例如為了克服抗原決定基 抑制作用時），最終疫苗產品愈昂費且愈複雜。若使組合 疫苗之所有或—大多數多醣抗原與蛋白質D共軛，即可提供 相當大功效。 為了預防老年人（55歲以上）族群之肺炎及嬰兒或幼兒之 中耳炎’本發明較佳具體實施例為組合如本文說明之多價 肺炎鏈球菌多醣-蛋白質D抗原與肺炎鏈球菌蛋白質或其 免疫性功能同等物。有關這種組合可包括之較佳蛋白質/ O:\63\63292-920618.doc - 32 -

本紙張尺度適用中國國家檩準(CNS) A4規格(210X297公袭T

Claims (1)

1. ------—........................ ·_·_·>·-Λ 1104976號專利申請案 請專利範圍替換本(93年9月） Α8 Β8 C8 D8 1 丨 々、申請專利範圍 1. 一種冷;東乾燥之抗原性組合物，其包含一種共輛的肺炎 鏈球菌（荚膜多醣血清型6B及 3D-MPL，且不含以鋁為主之辅劑。 2 .根據申請專利範圍第1項之冷凍乾燥之抗原性組合物，其 進一步包括一或多種選自下列所組成之群之肺炎球菌多 醣共軛物： 血清型4 ; 血清型18C ; 血清型19F ;與 血清型23。 3. 根據申請專利範圍第1或2項之冷凍乾燥之抗原性組合 物，其中肺炎鏈球菌莢膜多醣與選自下列所組成之群之 蛋白質共軛： 破傷風類毒素； 腦膜炎奈氏球菌（Neisseria meningitidis)之OMPC ; 白喉類毒素； 肺炎鏈球菌之肺炎球菌自溶酶；或 CRM197 ° 4. 根據申請專利範圍第1或2項之冷凍乾燥之抗原性組合 物，其中肺炎鏈球菌莢膜多醣係與流感嗜血桿菌 (Haemophilus influenzae)之蛋白質 D 共輛。 5. 根據申請專利範圍第1或2項之冷凍乾燥之抗原性組合 物，其進一步含有肺炎鏈球菌莢膜多醣血清型6B、14、 19F與23F之共軛物。 O:\63\63292-930929.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1235064 as B8 C8 D8 六、申請專利範圍 6. 根據申請專利範圍第1或2項之抗原性組合物，其進一步 含有肺炎鏈球菌莢膜多醣血清型4、6Β、9V、14、18C、 19F與23F之共軛物。 7. 根據申請專利範圍第1或2項之冷凍乾燥之抗原性組合 物，其進一步含有肺炎鏈球菌莢膜多醣血清型1、3、 4、5、6Β、7F、9V、14、18C、19F與23F之共軛物。 8. 根據申請專利範圍第1或2項之冷凍乾燥之抗原性組合 物，其進一步含有肺炎鏈球菌莢膜多醣血清型1、3、 4、5、6Β、7F、8、9V、12F、14、18C、19F與23F之共軛 物。 O:\63\63292-930929.doc - 2 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐)