KR101411425B1 - 복합 다가 면역원성 콘쥬게이트의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

복수의 , 또는 면역원성-구분되는 다당류를 하나 이상의 단백질과 동시에 반응시켜, 복합 다가 면역원성 콘쥬게이트를 만드는, 복합 다가 면역원성 콘쥬게이트의 제조 방법. 동시 반응은, 반응물의 하이드라자이드 그룹의, 또 다른 반응물의 cyanate ester 또는 알데하이드 그룹과의 반응을 수반한다.

Description

복합 다가 면역원성 콘쥬게이트의 제조 방법{Methods for preparing complex multivalent immunogenic conjugates}
본 발명은 다가 면역원성 콘쥬게이트의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 콘쥬게이트에 대한 것이다.
우선권의 수반
본 출원은 2006년 3월 17일 출원된 출원번호 60/783,490의 미국 임시출원의 이익을 수반하며 이는 본 출원에 참조로서 그 전체가 포함되어 있다.
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2004년 8월 6일 출원된 WO 2005/014037와 관련되어 있으며, 양자는 그 전체가 참조로서 본 출원에 포함되어 있다.
배경
박테리아 다당류(Bacterial polysaccharides (PSs))는 어린 유아에게는 흔하지 않지만, 나이 많은 어린이들과 어른들에게서는 단기 면역을 일으키는 T-비의존적 항원(T-independent antigen)이다. PSs는 주조직적합체(major histocompatibility complex) 분자들에 결합하지 못하는데, 이는 상기 분자들에의 항원 제시(antigen presentation) 및 T-헬퍼 림프구(T-helper lymphocytes)의 자극에 필요하다. PSs는 T-헬퍼 림파구의 도움 없이 항체 생산을 위하여 B 림파구를 자극할 수 있다. T-비의존적 B-림파구 자극 결과, 이들 항원들에 의한 면역에 따른 기억 유도가 부족해진다.
다당류가 단백질 분자들에 공유 결합(covalent attachment)하는 것에 의하여 T-비의존적 다당류 항원들은 T-비의존적 항원들로 전환될 수 있다. 콘쥬게이트(conjugate) 백신의 다당류 구성요소에 결합하는 B 세포는 콘쥬게이트 담체 단백질의 부분인 펩티드에 특이적인 헬퍼 T 세포( helper T cells)에 의하여 활성화(activate)될 수 있다. 담체 단백질에 대한 T-헬퍼의 반응은 다당류에 대한 항체 생산을 증가시킨다. PS-콘쥬게이트 백신은 PS에 단백질이 공유 부착하여 형성된 다당류-단백질 하이브리드(hybrids)이다. 전형적으로 부착에 우선하여 PS가 화학적으로 변이될 필요가 있는데, 이는 대부분의 본래(native) 박테리아 PS들은 우선 어떤 화학적 변이(“활성화 (activation)")를 거치지 않고는 단백질과 화학적으로 연결(link)될 수 없기 때문이다.
단백질에의 부착은 PS가 그 단백질의 상당 수의 T 세포 에피토프(epitopes)의 면역성(immune property)에 접근할 수 있게 한다. 이러한 T 세포 에피토프들은 CD4 헬퍼 T 세포들과 상호작용하여, 항체가 부착된 다당류와 반응하는 것을 훨씬 쉽게 한다. 콘쥬게이트에 대한 T 헬퍼 세포-의존적 반응은 혈청 IgG 항체와 면역 기억(immune memory) 양자를 , 2세 이하에 유아에서도, 만든다. 또한, 원래의 PS와는 대조적으로, PS-콘쥬게이트의 면역원성은 콘쥬게이트된 PS의 크기에 덜 의존적이다. 또한, PS 또는 올리고당류(oligosaccharides)와 함께 제조된 콘쥬게이트는 유사한 면역원성을 갖는다.
다당류가 단백질에 공유 연결(link)되는데 사용되는 콘쥬게이션 반응은 많이 있다. 좀더 일반적으로 사용되는 세 가지 방법은, 1)반응의 하나의 구성부분에 있는 알데하이드 또는 케톤 그룹이 또다른 구성부분의 아미노 또는 하이드라자이드 그룹과 반응하고, 형성된 C=N 이중 결합이 동시에 환원제(reducing agent)에 의하여 C-N 단일 결합으로 환원되는 환원성 아민화(reductive amination); 2) 다당류가 cyanogens bromide(CNBr)이나 1-cyano-4- dimethylammoniumpyridinium tetrafluoroborate (CDAP)에 의하여 활성화되어, 시안산염(cyanate) 그룹을 하이드록실 그룹에 도입(introduce)함으로써 단백질 구성부분에 추가된 아미노 또는 하이드라자이드 그룹에 공유 결합을 형성하는 시안화 콘쥬게이션(cyanylation conjugation); 및 3) 카보디이미드(carbodiimide)가 콘쥬게이션 반응의 구성부분의 카르복실 그룹을 활성화시켜, 활성화된 카르복실 그룹이 다른 구성부분의 아미노 또는 하이드라자이드 그룹과 반응하는 카보디이미드 반응이다. 이러한 반응들은 또 한 종종 콘쥬게이션 반응에 우선하여, 콘쥬게이트의 구성부분을 활성화시키는데 사용된다.
해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 타입 b(Hib) 콘쥬게이트 백신은 대표적인, 의학적 용도로 생산되는 최초 PS-단백질 콘쥬게이트 백신이다. 로빈스(Robbins)와 그 동료들은 1980년, 50년 전부터 발전해온 개념인, Hib 다당류를 단백질 담체에 화학적으로 부착하는 생물공학적 공정을 이용하였다. Avery et al., J. Exp. Med. 1929; 50:533-SSO; Schneerson et al., J. Exp. Med 1980; 152:361-376 참조. 현재 4개의 서로 다른 Hib 콘쥬게이트 백신이 미국에서 허가돼 있는데, 이들은 표 A에 정리된 것과 같이 각각 고유의 물리적, 화학적, 면역학적 특성을 갖고 있다. 이들 백신에 이용된 콘쥬게이션 화학 및 특성 조절(control)의 상세한 검토는 이미 공개되어 있다. Kniskem et al., "(Conjugation: design, chemistry, and analysis" in Ellis et al., Development and clinical uses of Haemophilus b conjugate vaccines. New York: Marcel Dekker, 1994: 37-69 참조.
백신* 당류(Saccharide )의 크기 담체 단백질 간격자(Spacer (링커linker))
PRP-D
(Connaught)		 다당류 디프테리아 변성 독소(Diphtheria toxoid) 6-carbon spacer
(ADH)
HbOC
(Wyeth-Dederle)		 올리고당류 디프테리아 단백질(Diphtheria protein)
(CRM)		 없음 (amide)
PRP-OMPC
(Merck)		 작은 다당류 수막구균(Meningococcal) 단백질 티오에테르(Thioether
(bigeneric))
PRP-T
(Aventis Pasteur)		 다당류 파상풍 변성 독소(Tetanus toxoid) 6-탄소 간격자
(6-carbon spacer
(ADH))
최초의 상업적 Hib 콘쥬게이트인 polyribosylribitol phosphate diphtheria toxoid conjugate (PRP-D)은 Schneerson 등의 절차(chneerson et al., J. Exp. Med. 1980; 152:361-376)를 이용하여 디프테리아 변성독소(diphtheria toxoid)로 6개 탄소 간격자( toxoid)인 아디픽산 디하이드라자이드(adipic acid dihydrazide (ADH))를 통하여 부착된 부분적으로 크기-줄이는(size- reduced) Hib PS로 구성되어 있다.디프테리아 변성독소의 ADH 유도체는 1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethyl carbodiimide hydrochloride (EDC)의 존재 하, ADH와의 반응을 통하여 이 방법으로 생성된다. 그 후 CNBr을 이용하여 하이드록실 그룹에 시안산염(cyanate) 그룹을 만듦으로써 Hib PS를 활성화시킨다. 활성화된 PS는 ADH-변성독소에 콘쥬게이트되지만(시안화 콘쥬게이션), 이러한 과정은 불안정한 연결(linkage)를 이루게 되고, 콘쥬게이트는 수용성 문제를 갖게 된다.
로빈스(Robbins) 콘쥬게이션 화학은 후에 변형되어 ADH 간격자가 먼저 다당류에 가해지고, 이는 EDC의 존재 하 정제된 단백질에 콘쥬게이트된다(카보디이미드 반응((carbodiimide reaction)). Chu et al., Infect. Immun 1983; 40:245-256; Schneerson et al. Infect.Immun. 1986, 52:519-528 참조. 백신 polyribosylribitol phosphate tetanus protein conjugate (PRP-T)는 개선된 화학을 이용하여 HIb 다당류를 파상풍 변성독소(tetanus toxoid)에 공유 연결(covalently link)시킨다(표 1 참조).
Haemophilus b oligosaccharide conjugate (HbOC)라고도 부르는polyribosylribitol phosphate cross-reacting mutant diphtheria toxoid conjugate (PRP-CRM) 백신은 Hib PS를 포함하고 있지 않다. 대신, 그것은 리비톨 부분(ribitol moiety)에서 글리콜 기능성(glycol functionality)의 과옥소산 산화(periodate oxidation)에 의하여 유도된 약 20 반복 단위의 올리고당류를 이용한다. 그 후 산화된 올리고당류는 소듐 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride)의 존재 하, 디프테리아 독소(toxin)의 비독성 돌연변이 형태인 CRM197에 직접 결합한다. Anderson et al., J. Immunol. 1989; 142:2464-8; and Anderson, Infect. Immun. 1983, 39:233-238 참조. 이 콘쥬게이션 방법에서, 단백질에 대한 올리고당류의 비율이 최적의 항체 반응을 결정한다는 것이 밝혀졌다. Kniskern et al., "Conjugation: design, chemistry, and analysis" in Ellis et al., Development and clinical uses of Haemophilus b conjugate vaccines. New York: Marcel Dekker, 1994: 37- 69; Anderson et al., J. Immunol. 1989; 142:2464-8 참조.
다른 Hib 콘쥬게이트 백신들과 비교하여 볼 때, Hib polysaccharide- Neisseria meningitidis outer membrane protein complex conjugate vaccine (PRP-OMPC)는 고유의 특성을 많이 갖고 있다. 단백질 담체는 디프테리아, 파상풍 및 백일해( diphtheria, tetanus, and pertussis (DTP)) 백신의 구성성분은 아니지만, 티오에테르 연결(thioether linkage)을 통하여 크기-줄이는 Hib PS에 부착하는 지질다당류-제거(lipopolysaccharide- depleted) 수막구균 외막 소포(vesicles)로 구성된다. Marburg et al., J. Amer. Chem. Soc. 1986; 108:5282- 5287; Kniskern et al., "Conjugation: design,chemistry, and analysis" in Ellis et al., Development and clinical uses of Haemophilus b conjugate vaccines. New York: Marcel Dekkcr, 1994: 37-69; Anderson et al., J. Immunol. 1989; 142:2464-8 참조. 이 공정에서, 분리된 링커(linkers)는 단백질과 Hib 다당류에 모두 결합하고, 그 후 링커들은 융합(fusion)하여 티오에스터 연결을 형성한다.
수막염균(Neisseria meningitidis)은 전 세계 패혈증과 박테리아성 수막염의 주 원인이다. 병원성 수막구균은 미생물의 외막(outer membrane) 표면에 부착되는 다당류 피막(capsule)으로 둘러싸여 있다. 피막 다당류의 면역학적 특징에 기초하여 서로 다른 13개 수막구균 혈청군(serogroup)이 확인되었다(Frasch, C. E., et. al. 1985). 이 13개 혈청군들 중 다섯 개가 대부분 수막염의 원인이 되는데; 이들이 혈청군 A, B, C, W135 및 Y이다. 혈청군 A는 대부분 유행성 질병의 원인이다. 혈청균 B, C 및 Y는 대부분의 유행성 질병 및 국지적 발병(localized outbreak)을 일으킨다. 침습성(invasive) 수막구균의 숙주 방어는 보체(complement)-매개 세균용해(bacteriolysis)에 의존적이다. 보체-매개 세균용해의 원인인 혈청 항체는 외막 다당류에 대부분(in large part) 대항하도록 유도된다.
수막구균 다당류에 기초한 종래의 백신들은 외피 다당류에 대항하여 면역 반응을 유도한다. 이러한 항체들은 혈청군 특이적 수막구균의 보체-매개 세균용해를 할 수 있다. 수막구균 다당류 백신은 어린이와 성인에게 효과적인 것으로 나타났다. 그러나 유아와 어린 아동들에게는 그 효과가 제한적이었으며, 그에 따른 어린 아이에의 다당류 투여량은 부스터 대응(booster response)을 약하게 또는 없도록 유도했다.
표 B에 정리된 것과 같이, 수막구균 PS의 활성화 및 콘쥬게이션에 많은 방법들이 사용되어 왔다. 각각의 활성화 방법(mode)은, 상대적으로 PS 분자에서 활성화되는 위치(sites)가 거의 없는 경우에도, 중요한 에피토프들을 변화시킬 잠재성이 있다. 예를 들어, 그룹 C 수막구균 PS의 과옥소산(Periodate) 활성화는 사슬이 끊어지게 하여(chain breakage), 환원성 아미노화(reductive amination)을 통하여 단백질에 연결(link)될 수 있는 말단 알데하이드 그룹과 함께 작은 당류 단위들을 만들어낸다. Richmond et al., J. Infect. Dis. 1999; 179:1569-72.
방법 당류 크기 담체 단백질 간격자(spacer) 공정 인체에의 이용 여부
#1 환원성 아미노화
(Reductive amination)		 감소됨 파상풍 변성 독소(Tetanus toxoid) 없음 sodium cyanoborohydride의 존재 하, 단백질과 화합(combine)한 PS의 알데하이드 형태 이용하지 않음
#2 카보디이미드(Carbodiimide) 원래 크기 파상풍 변성 독소 없음 카보디이미드 존재하, 화합하고, 그 후 ethanolamine에 의하여 차단된 단백질과 PS 이용하지 않음
#3 활성 에스테르a(Active estera) 다당류 CRM 197 아디픽산(Adipic acid) 아디픽산(NHS)2에 의해 단백질에 콘쥬게이트된 다당류의 아민화된 환원 말단 이용함
#4
환원성 아민화(Reductive amination)		 감소 CRM 197 없음 sodium cyanoborohydride 존재 하 단백질과 화합한 알데하이드 형태 이용함
#5
환원성 아민화(Reductive
Amination)		 De-OAc-PSb 파상풍 변성 독소 없음 sodium cyanoborohydride 존재 하 단백질과 결합한 PS의 알데하이드 형태 이용함
a: 아디픽산의 Hydroxysuccinimide diester
b: 수막구균 그룹 C에만 보고된 Deacetylylate PS
수막구균 그룹 C 콘쥬게이트의 생산 및 최적화에 대한 초기의 연구는 Hib 콘쥬게이트가 상업화되기 이전에 잘 보고되었다. Beuvery et al., infect. Immun. 1982; 37:15-22; Beuvery et al., Infect. Immun. 1983; 40:39-45; Beuvery et al., J. Infect. 1983; 6:247-55; Jennings, et al., J. lmmunol. 1981; 127:1011-8 참조.
단백질 담체에 그룹 C PS를 화학적으로 연결하는 두 개의 서로 다른 콘쥬게이션 방법론이 보고되었다. Jennings et al., J. Immunol. 1981; 127:1011-8; Beuvery et al., Infect. Immun. 1983; 40:39-45 참조. 첫 번째 접근은, 과옥소산 산화를 통한 말단 알데하이드 그룹의 생성에 의하여 활성화된, 부분적으로 단량체로 분해된(depolymerized) PS를 이용한 것이다(표 2의 방법 #1). 그리고 나서 알데하이드를, sodium cyanoborohydride 존재 하, 환원성 아미노화를 통하여, 대부분 라이신(lysine)인, 단백질의 자유 아미노 그룹들과 반응시킨다. Jennings et al., J Immunol 1981; 127:1011-8. In this method, activation occurs at one specific site of de-O acetylation on the group C PS 참조.
두 번째 접근은 카보디이미드(carbodiimide) 반응(표 2의 #2)를 이용하여 고분자 질량 PS의 존재 하, 카복실 그룹을 담체 단백질의 ε-amino groups에 공유 연결시켰다. 이 방법의 활성화 부분은 과옥소산 산화보다 좀더 무작위적이다.
이 두 방법에 의하여 제조된 그룹 C 수막구균 콘쥬게이트들은 동물에서 시험되었다. Beuvery et al., Dev. Biol. Stand. 1986; 65:197-204; and Beuvery et al., J. Infect. 1983; 6:247-55 참조. 이 콘쥬게이트는 최초 면역화에서 T 세포 비의존적 반응과 T 세포 의존적 반응 모두를 자극(stimulate)한다. Beuvery et al., J. Infect. 1983; 6:247-55 참조. 그러나, PS는 T 세포 의존적 항체 반응을 유도하기 위하여 담체 단백질에 공유 연결되어야 한다는 것이 연구 결과 밝혀졌다.
임상시험에의 사용을 위한 최초의 그룹 A 및 그룹 C 수막구균 콘쥬게이트는 Chiron Vaccines에 의하여 제조되었고, 1992년 보고되었다(표 2의 방법 #3). Costantino et al., Vaccine 1992; 10:691- 8 참조. 콘쥬게이션 방법은 탄화수소(hydrocarbon) 간격자를 통해 단백질에 커플링한 후 순한(mild) 산 가수분해에 의하여 만들어지는 작은 올리고당류의 선택적인 말단 그룹 활성화에 기초한다. 디프테리아 독소(toxin)인 CRM의 비-독성 돌연변이이 단백질 담체로 사용되었다. 콘쥬게이션을 위하여 올리고당류를 활성화시키기 위하여, 아미노 그룹이 올리고당류의 말단에 추가되고, 그 후, 아디픽산의 N- hydroxysuccinimide diester과 반응하여 활성 에스터(active ester)를 생성한다. 그리고 나서 이 활성 에스터는 CRM197 단백질의 라이신(lysine) ε-아미노 그룹에 공유결합하여, 콘쥬게이트를 형성한다.
PS-단백질 콘쥬게이트 백신 제조를 위한 종래의 방법은, 다당류를 활성화시키는데 ADH 형태의 하이드라자이드(hydrazide)를 이용해 왔음에도 불구하고, 하이드라자이드 화학을 이용하지 않았다. 이러한 선행 기술 방법은 단백질의 라이신 잔기의 ε-아미노 그룹을 이용하여 알데하이드 그룹과 같은, 활성화된 PS의 기능 그룹(functional groups)들과 반응시켰다. 반응의 효율은 보통 대략 20%로 낮다. 콘쥬게이션이 완료되기까지 반응이 끝나는 데는 2일 내지 3일이 걸리며, 반응하지 않은 PS로부터 콘쥬게이트를 분리하기 위하여 정제 단계를 거칠 필요가 있다. Guo et al. "Protein-polysaccharide conjugation" in: Pollard et al., Methods in Molecular Medicine, Vol. 66: Meningococcal Vaccines: methods and Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, 2001, pg 49-54 참조. 낮은 수율이 관찰되는 것에 대하여는 몇 가지 설명이 제시되었다. 첫째로, 콘쥬게이션 조건(pH6.5-7.4) 하, 라이신((pKa = 1 0.5)의 아미노 그룹은 낮은 반응성을 갖고 있다. Inman et al., Biochemistry 1969; 8:4074-4082 참조. 둘째로, 대부분의 콘쥬게이션 방법은 변성독소(toxoid)들을 담체 단백질로 사용하였다. 그 변성독소들은 독소로부터 포름알데하이드로 해독(detoxification)하여 유래된 것으로, 독소의 아미노 그룹과 화합(combine)하여 콘쥬게이션에 사용되는 제한된 수의 아미노 그룹을 남긴 것이다. 셋째로, 생성된 활성화된 단백질의 감소된 용해도(solubility)와 단백질-PS 콘쥬게이트로 침전이 일어난다.
그러므로, 높은 수율의 다당류-단백질 콘쥬게이트 백신의 합성 및 생산을 위한 방법이 요구된다. 또한 바람직한 방법은 반응이 불필요한 부산물은 적게 생성되고, 반응이 끝난 후 남아 있는 다당류 및 반응에 참여하지 않는 단백질의 양도 적으며, 빠른 속도로 진행되는 것이다.
현재, PS에 기초한 백신은 어린 아동들에게만 제한적으로 이용되고, 성인에서는 오래 지속되는(long-lasting) 보호를 제공하지 않는다. 그러므로 예컨대 박테리아성 수막염, 폐렴, 파상풍 및 다른 박테리아 감염과 같은 위험에 대하여, 어린이와 성인의 질환에 대항하여 장기(long-term) 보호를 제공할 수 있는 단백질-PS 콘쥬게이트가 요구된다. 바람직한 단백질-PS 콘쥬게이트는 유아, 어린이 및 성인에게 장기 보호를 제공할 수 있는 백신 공식을 만드는 데에 사용될 수 있어야 한다.
본 출원의 기술분야에서 최근 환자 적응(patient compliance)이 나아진 것은 물론, 경제적, 구조적 이점 때문에, 여러 백신을 포함하는 다가(또는 복합) 백신들의 투약이 널리 행해지고 있다. 유사한 경향이 콘쥬게이트 백신에도 일어나고 있다. 그러한 화합(combination) 콘쥬게이트 백신의 전형적인 예가 7가 폐막구균 콘쥬게이트 백신인 Prevnar (Wyeth Lederle)와 4가 수막구균 콘쥬게이트 백신인 Menactra (Aventis Pasteur)이다.
여기에 기재한 것은 복합(compex) 다가 면역원성, 콘쥬게이트를 포함하는 백신의 제조 방법이다.
하나의 예는,
복수의 면역원적으로 구별되는 다당류를 산화제(oxidizing agent)와 반응시켜 복수의 알데하이드에 의하여 활성화된 면역원적으로 구별되는 다당류를 제조하는 단계;
하나 이상의 단백질을, 하나 이상의 하이드라자이드에 의하여 활성화된 단백질의 용액(solution)을 생성하기에 충분한 조건 하, 하이드라진(hydrazine), 카보하이드라자이드( carbohydrazide), 염화 하이드라진(hydrazine chloride), 디하이드라자이드(dihydrazide) 또는 이것들의 혼합물과 반응시키는 단계;
복수의 알데하이드에 의하여 활성화된 면역원적으로 구별되는 다당류의 혼합물을 약 5 내지 약 8의 pH 조건 하, 하나 이상이 하이드라자이드에 의하여 활성화된 단백질과 접촉(contact)시켜서, 복수의 알데하이드에 의하여 활성화된, 면역원적으로 구별되는 다당류를 하나 이상의 하이드라자이드에 의하여 활성화된 단백질과 동시에 반응시켜, 각각의 부착된 면역원적으로 구별되는 다당류와 단백질 사이에 형성된 하나 이상의 C=N 이중 결합을 포함하는 복합 다가 콘쥬게이트를 형성하는 단계; 및
복합 다가 콘쥬게이트의 모든 C=N 이중 결합을 C-N 결합으로 실질적으로 환원시켜 복합 다가 면역원성 콘쥬게이트 산물을 형성하는 단계
로 구성되는 복합 다가 면역원성 콘쥬게이트의 제조 방법이다.
또다른 예는,
복수의 면역원성-구분되는 다당류를 시안화 제제(cyanylation agent)와 반응시켜 복수의 시안산염(cyanate)에 의하여 활성화된, 면역원적으로 구별되는 다당류를 생성시키는 단계;
하나 이상의 단백질을, 하나 이상의 하이드라자이드에 의하여 활성화된 단백질 용액을 생산할 수 있는 충분한 조건 하, 하이드라진, 카보하이드라자이드, 염화 하이드라진, 디하이드라자이드 또는 그것들의 혼합물과 반응시키는 단계;및
복수의 시안산염-활서오하된 면역원적으로 구별되는 다당류의 혼합물을 약 6 내지 약 8의 pH 조건 하, 하나 이상의 하이드라자이드에 의하여 활성화된 단백질과 접촉시켜, 복수의 시안산염에 의하여 활성화된, 면역원적으로 구별되는 다당류가 하나 이상의 하이드라자이드에 의하여 활성화된 단백질과 동시에 반응하여, 각각의 부착된 면역원적으로 구별되는 다당류와 단백질 사이에 형성된 하나 이상의 C-N 결합을 포함하는 복합 다가 면역원성 콘쥬게이트를 생성하는 단계
로 구성되는 복합 다가 면역원성 콘쥬게이트의 제조 방법이다.
또 다른 예는,
단백질을 1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethyl carbodiimidehydrochloride의 존재 및 약 6 내지 약 7의 pH 조건 하, 1-amino-2,3-propanediol (ADPO)과 반응시키는 단계;
ADPO-변이(modified) 단백질을 산화제와 반응시켜 알데하이드에 의하여 활성화된 단백질 용액(solution)을 생성하는 단계;
복수의 하이드라자이드에 의하여 활성화된, 면역원적으로 구별되는 다당류를 약 5 내지 약 8의 pH 조건 하 알데하이드에 의하여 활성화된 단백질과 반응시켜, 복수의 하이드라자이드에 의하여 활성화된, 면역원적으로 구별되는 다당류가 하나 이상의 알데하이드에 의하여 활성화된 단백질과 동시에 반응하여, 각각의 부착된 면역원성 구별되는 다당류와 단백질 사이에 형성된 하나 이상의 C=N 이중 결합을 포함하는 복합 다가 콘쥬게이트를 생성하는 단계; 및
복합 다가 콘쥬게이트의 모든 C=N 이중 결합을 C-N 결합으로 실질적으로 환원시켜 복합 다가 면역원성 콘쥬게이트 산물을 생성하는 단계
로 구성되는, 복합 다가 면역원성 콘쥬게이트의 제조 방법이다.
또한 여기에 기재된 것은
단백질을, (ⅰ) 카보이미드 및 (ⅱ) 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 펩타이드 또는 하나 이상의 아미노산과 하나 이상의 펩타이드의 혼합물의 존재하, 하이드라진, 카보하이드라자이드, 염화 하이드라진, 디하이드라자이드 또는 이것들의 혼합물과 반응시키는 단계로 구성되는 하이드라자이드에 의하여 활성화된 단백질의 제조 방법이다.
여기에 기재된 또 다른 예는
(a) 하나 이상의 첫 번째 알데하이드에 의하여 활성화된, 면역원적으로 구별되는 다당류를, 첫 번째 콘쥬게이트 중간체(intermediate)를 형성하기에 충분한 조건 하에서, 하나 이상의 하이드라자이드에 의하여 활성화된 단백질과 접촉시켜, 각각의 첫 번째 면역원적으로 구별되는 다당류와 단백질의 사이에 하나 이상의 C=N 이중 결합을 형성시키는 단계;
(b) 하나 이상의 두 번째 알데하이드에 의하여 활성화된, 면역원적으로 구별되는 다당류를 첫 번째 콘쥬게이트 중간체와 접촉시켜, 두 번째 면역원적으로 구별되는 다당류와 단백질 사이에 하나 이상의 c=N 이중 결합을 형성시키는 단계; 및
(c) 모든 C=N 이중결합을 C-N 결합으로 실질적으로 환원시켜, 복합 다가 면역원성 콘쥬게이트 산물을 생성하는 단계(상기 환원은 바람직하게는 하나의 단계로 이루어져, 모든 C=N 이중 결합이 동시에 실질적으로 환원된다);
를 포함하며, 첫 번째 알데하이드에 의하여 활성화된, 면역원적으로 구별되는 다당류과 하이드라자이드에 의하여 활성화된 단백질의 반응성은 두 번째 알데하이드에 의하여 활성화된, 면역원적으로 구별되는 다당계와 하이드라자이드에 의하여 활성화된 단백질 사이의 반응성보다 낮은 것을 특징으로 하는 복합 다가 면역원성 콘쥬게이트의 제조를 위한 것이다.
전술한 그리고 다른 대상, 특징 및 이점은 대응되는 도면을 참조하여 진행되는 하기의 상세한 설명으로부터 더욱 명확하여질 것이다.
여기 이용한 대로, 용어 “하나” “하나의” 및 “그”는 본문에서 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 대상을 포함한다. 유사하게 “또한”이라는 단어는 본문에서 명백하게 달리 지시하지 않는 한, “및”을 포함하는 것으로 의도된다. 또한 여기 이용한대로, 용어 “구성하다”는 “포함하다”를 의미한다. 그러므로 “A 또는 B로 구성하는” 은 A, B 또는 A 및 B를 포함하는 것을 의미한다. 핵산 또는 폴리 펩타이드 또는 다른 화합물의 모든 분자량 또는 분자 크기 정도(molecular mass values), 및 모든 뉴클레오타이드 크기 및 아미노산 크기는 대략적인 값이며, 설명에 사용되는 것이다. 비록 여기에 기재된 것과 유사하거나 등가(equivalent)인 방법 및 물질들이 본 발명의 시험 또는 실시에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재되어 있다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 설명을 위한 것이지, 이들로 제한되는 것은 아니다. 여기에 기재된 방법 및 공정은 다른 별도의 언급이 없는 한, 특정한 서열이나 단계의 수행으로 제한되는 것이 아니다. 예컨대, 다당류의 활성화는 단백질의 활성화 이전 또는 이후에 일어날 수 있으며, 동시에 일어날 수도 있다.
본 발명의 다양한 실시예의 검토를 쉽게 하기 위하여, 특정 용어들이 하기에 설명되어 있다:
“동물” 이란 예컨대, 포유류나 조류 등을 포함하는, 살아 있는 다세포 생물을 포함한다. 포유류라는 용어는 인간과 인간이 아닌 포유류를 포함한다. 유사하게, “대상”이라는 용어는 인간과 가축인 대상, 예컨대 인간, 인간이 아닌 영장류, 개, 고양이, 설치류, 말, 소를 모두 포함한다.
“항원”이란 항체 분자 또는 T-세포 수용체(receptor)로서, 특정 세포성 면역(ellular immunity) 또는 체액성 면역(humoralimmunity)의 산물에 의하여 특이적으로 결합되는 화합물, 조성물 또는 물질이다. 항원은 예컨대, 복잡한 탄수화물(예컨대 다당류), 인지질, 핵산 및 단백질과 같은 거대분자를 비롯하여 단순한 중간산물(intermediary metabolite), 당(예컨대 올리고당류), 지방, 및 호르몬을 포함하는 생물학적 분자라면 어떤 것이나 될 수 있다. 일반적인 항원의 종류는, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 바이러스성 항원, 박테리아성 항원, 균성(fungal) 항원, 원생동물(protozoa) 및 다른 기생체(parasitic) 항원, 종양 항원, 알레르기, 이식편 거부(graft rejection) 및 자가면역 질환과 관련된 항원, 독소(toxin) 및 다른 잡다한 항원들을 포함한다.
“담체”란 다당류와 같은 항원 또는 불완전항원(hapten)이 결합할 수 있는 면역원성(immunogenic) 분자이다. 담체에 결합할 때, 결합된 분자는 더욱 면역원성으로 될 수 있다. 담체는 결합된 분자의 면역원성을 증가시키기 위하여 선택될 수 있고/있거나 진단학적, 분석학적 및/또는 치료적으로 이익이 되는 담체에 대항하는 항체를 제거하기 위하여 선택될 수 있다. 담체에 대한 분자의 공유 연결(linkin)으로 면역원성 및 T-세포 의존성이 강화된다(Pozsgay et al., PNAS 96:5194-97, 1999; Lee et al., J. Immunol. 116:1711-18, 1976; Dintzis et al., PNAS73:3671-75, 1976). 유용한 담체는 중성적인(예컨대, 박테리아 또는 바이러스 유래의 단백질)중합(polymeric) 담체, 반응 부분(reactant moiety)이 결합할 수 있는 하나 또는 그 이상의 기능 그룹을 포함하는 합성(synthetic) 또는 반-합성(semi-synthetic) 물질이다.
담체로 이용될 수 있는 박테리아 산물의 예는 (하나 이상의 항원성 에피토프 및 유사체(analog), 또는 면역 반응을 제거할 수 있는 변이체를 갖는 조각을 포함하는), B. anthracis PA 와 같은, 박테리아성 독소, LF 및 LeTx 및 파상풍(tetanus) 독소(toxin)/변성독소(toxoid), 디프테리아 독소/변성독소, P. aeruginosa 외독소(exotoxin)/변성독소, 백일해(pertussis) 독소/변성독소 및 C. perfringens 외독소/변성독소를 포함한다. hepatitis B 표면 항원 및 핵심 항원(core antigen)과 같은 바이러스성 단백질 또한 담채로 이용될 수 있다.
“공유 결합”은 원자에 의하여 하나 또는 그 이상 쌍의 전자들의 공유(sharing)에 의하여 특징지어지는, 두 원자 사이의 원자간 결합이다. “공유적으로 결합된” 또는 “공유적으로 연결된”은 두 개의 분리된 분자들을 하나의 인접한(contiguous) 분자로 만드는 것을 말한다.
에피토프는 항원 결정기(antigenic determinant)이다. 에피토프는 특별한 면역 반응을 유도하는 항원성 분자의 특정한 화학적 그룹 또는 인접한 또는 인접하지 않은 펩티드 서열이다. 항체는 매칭(matching)(또는 같은 종류의)되는 에피토프 및 항체의 삼차원 구조를 기초로 특정 항원성 에피토프에 결합한다.
“연결된(linked)”, “결합된(joined)", "콘쥬게이트된” 또는 “부착된”은 다당류의 담체 단백질에 대한 공유 결합 연결을 가리킨다. 이 공유 결합 연결은 예컨대 간격자(spacer) 분자를 통하여 연결되는 등 간접적일 수도 있고 직접적일 수도 있다.
“복합 다가 면역원성 콘쥬게이트(complex multivalent immunogenic conjugate)” 또는 “복합 다가 콘쥬게이트 백신”은 하나 이상의 항원성 에피토프로 구성된다. 첫 번째 예에서, 여기에 기재된 복합 다가 면역원성 콘쥬게이트는 각각 다른 면역원적으로 구별되는(immunogenic-distinct) 다당류가 분리된 단백질 담체에 콘쥬게이트되는, 서로 다른 면역원적으로 구별되는 다당류로 구성되는 개개의 서로 다른 분자들의 혼합물을 포함한다. 두 번째 예에서, 여기에 기재된 복합 다가 면역원성 콘쥬게이트는, 복수의 면역원적으로 구별되는 다당류가 하나의 단백질 분자 또는 하나의 단백질 구조체(단백질 구조체 자체는 하나 이상의 서로다른 단백질을 포함한다)에 콘쥬게이트된 분자들을 포함한다. 세 번째 예는 첫 번째 예의 콘쥬게이트 및 두 번째 예의 콘쥬게이트의 혼합물을 포함한다.
첫 번째 예의 실시예는 하기의 식으로 대표되는 서로 다른 구조들의 혼합물로 설명될 수 있다:
P1 - PS1; P1 - PS2;및 P1 - PS3
여기서 P1은 담체 단백질이고; PS1, PS2, 및 PS3는 각각 면역원적으로 구별되는 다당류이다.
두 번째 예의 실시예는 하기의 식으로 대표되는 서로 다른 구조들의 혼합물로 설명될 수 있다:
PS1 - P1 - PS2
│
PS3
여기서 P1은 담체 단백질이고; PS1, PS2, and PS3는 각각 P1에 공유적으로 부착되는 면역원적으로 구별되는 다당류이다.
위의 식에서 단백질 및 다당류는 하나 또는 복수의 구조 단위가 될 수 있으며 단백질과 다당류 사이에 형성되는 하나 이상의 결합이 존재한다.
“면역 반응”은 자극에 대한 B-세포, T-세포, 대식세포(macrophage) 또는 polymorphonucleocyte와 같은 면역시스템 세포의 반응이다. 면역 반응은 예컨대, 인터페론(interferon)이나 사이토카인(cytokine)을 분비하는 상피(epithelial) 세포와 같은 숙주 방어에 관련되는 생체의 모든 세포를 포함한다. 면역 반응은 선천 면역 반응(innate immune response) 또는 염증(inflammation)을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
여기에 사용된 “면역원성 콘쥬게이트 또는 조성물”은 척추동물에 있어서 특정 면역 반응 (또는 면역원성 반응)을 유도하거나 자극하는데 유용한 조성물을 의미하는 용어이다. 어떤 예에서는, 면역반응은, 면역원성 조성물이 목적한대로 생물로부터 질병이 호전되게 하거나 척추 동물이 감염에 더 잘 저항하게 하는 방어 또는 방어 면역(protective immunity)을 제공한다. 면역원성 조성물의 종류의 특별한 예는 백신이다.
“면역원(immunogen)은 적절한 조건에서, 동물의 T-세포 반응 또는 항체 생산을 자극하는, 동물에 흡수되거나 주사되는 조성물을 포함하는, 물질, 조성물, 화합물을 의미한다.
“면역원적으로 구별되는 다당류”는 다른 종류의 다당류에 의하여 유도되는 면역반응과는 다른 면역반응을 유도하는 다당류를 포함한다. 면역원적으로 구별되는 다당류는 서로 다른 피막화된(encapsulated) 박테리아들로터 유래된 둘 또는 그 이상의 다당류일 수 있다. 예를 들어, 수막구균(meningococcal) 다당류와 비교하여 폐렴구균(pneumococcal) 다당류는 면역원적으로 구별되는 다당류이다. 면역원적으로 구별되는 다당류는 또한 서로 다른 혈청군(serogroups) 또는 혈청형(serotypes) 유래의 둘 또는 그 이상의 다당류를 포함한다. 예를 들어, 혈청군 B의 수막구균 다당류와 비교하여 혈청군 A의 수막구균 다당류는 면역원적으로 구별되는 다당류이다.
“질병을 치료 또는 억제하는”은 예컨대 탄저병(anthrax)와 같은 질병의 위험이 있는 개체에 있어서, 상태 또는 질병의 완전한 발병(full development)을 억제하는 것을 포함하는 것이다. “치료”는 발병이 된 이후에, 병리 상태 또는 질병의 증상 또는 예후를 개선(ameliorates)시키는 치료적 개입을 가리킨다. 여기에 사용된대로, “개선시키는(ameliorating)”이라는 용어는, 증상, 병리적 상태 또는 질병과 관련하여, 치료의 관찰 가능한 이로운 효과를 가리킨다. 이러한 이로운 효과는 예컨대 특정 질병에 특이적인 것으로 잘 알려진 다른 지표들, 개체의 무탈함 또는 전체적인 건강에 있어서의 개선, 질병의 재발(relapse) 횟수 감소, 질병의 느린 진행, 질병의 모든 또는 일부 의학적 증상의 심각성의 감소 또는 적용 가능한 개체의 질병의 의학적 증상의 발병(onset) 지연에 의하여 증명될 수 있다.
“펩타이드”란 구조적 단위가 아마이드 결합을 통하여 서로 서로 연결된 둘 이상의 아미노산 잔기로 이루어진 분자를 포함한다. 펩타이드는 디펩타이드(dipeptide), 트리펩타이드(tripeptide) 또는 올리고펩타이드(oligopeptide)를 포함한다. “잔기” 또는 “아미노산 잔기”라는 용어는 펩타이드에 편입(incorporate)되는 아미노산과 관련된 것(reference)들을 포함한다.
“치료적으로 유효한 양”은 제제로 치료받는 개체에 바람직한 효과를 일으키는데 충분한 특정 제제의 용량을 가리킨다. 예컨대, 이는 개체에 박테리아가 감염되어 일으키는 질병 및 감염을 치료 및/또는 개선, 예방, 저항성 증가에 유용한 다가 폴리펩타이드 콘쥬게이트의 용량이 될 수 있다. 이상적으로, 제제의 치료적으로 유효한 양은, 개체에 있어 상당한 세포독성(cytotoxic)효과를 일으키지 않고, 개체에 있어 감염으로 야기되는 질병 및 감염을 치료 및/또는 선, 예방, 저항성 증가에 충분한 양이다. 개체에 있어 감염으로 야기되는 질병 및 감염을 치료 및/또는 선, 예방, 저항성 증가에 유용한 제제의 유효한 양은 약학적 조성물의 투약 종류(manner), 고통(affliction)의 심각성 및 치료받는 개체에 의존적일 수 있다.
백신은 개체에 있어서 예방 또는 치료적 면역 반응을 유도하는 약학적 조성물인다. 어떤 경우, 이 면역 반응은 방어 반응이다. 전형적으로, 백신은 병리학적 상태와 관련하여 세포 성분에 대한, 또는 예컨데 박테리아성 또는 바이러스성 병원균과 같은 병원균의 항원에 대한 항원-특이적 면역 반으을 유도한다. 백신은 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 다당류, 바이러스, 박테리아, 세포 또는 하나 또는 그 이상의 세포 성분을 포함할 수 있다. 어떤 경우, 바이러스, 박테리아 또는 세포는, 백신 성분의 면역원성이 유지되는 한, 감염 가능성을 줄이거나 예방하기 위하여 비활성화(inactivate)되거나 약독화(attenuate)될 수 있다.
여기에 기재된 것은 복합 다가 면역원성 콘쥬게이트와 콘쥬게이트 백신을 제조하는 새로운 방법이다. 하나의 예에서, 다가 콘쥬게이트 및 콘쥬게이트 백신은 하이드라자이드 화학을 이용하는 하나 이상의 담체 단백질에 대한 성분 다당류의 바람직한 비율로, 하나보다 많은 다당류의 혼합물을 콘쥬게이트함으로써 합성된다. 콘쥬게이션에 있어 하이드라자이드 화학의 높은 효율 때문에, 다당류는 효육적으로 담체 단백질(들)에 콘쥬게이트하여, 그 결과 생성되는 복합 합성(synthesized) 백신 콘쥬게이트 산물은, 크로마토그래피 및/또는 황산 암모늄(ammonium sulfate) 침전과 같은 장황하고 복잡한 정제 공정이 없이도, 각각의 성분 다당류에 대항하여 마우스에서 항체를 유도하는 데 효과적이게 된다. 여기에 기재된 특정 예의 방법은, 둘 이상의 면역원적으로 구별되는 다당류를 포함하는 단일 반응 혼합물 또는 뱃치(batch)에서 연속한 콘쥬게이션 반응들을 이용하여, 다가 콘쥬게이트 백신들의 제조를 간단히 하는 것이다. 하나의-뱃치 연속된 반응으로, 더 이상 다가 콘쥬게이트 백신의 종래 제조방법에 있어서 개개의 다당류 백신 콘쥬게이트 성분에 대한 여러 개의 동시 합성(multiple parallel synthesis) 공정이 필요하지 않게 되었다. 즉, 종래 방법에 의하면, 각각의 다당류 콘쥬게이트 성분은 개별적인 공정에 의하여 제조되며, 그 결과 생성된 개개의 다당류 콘쥬게이트 성분은 하나의 투여량(dosage) 제제로 서로 혼합된다(예컨대, US 2005/0002948 A1, [0033] 단락 참조). 본 발명에 기재된 개선된 방법에 따른 다가 콘쥬게이트 및 백신의 합성은 생산 비용을 상당히 절감하고, 예방접종의 적용 분야(field application)를 넓히며, 따라서 공공의 건강을 훨씬 촉진할 것이다
본 발명의 방법에 있어서, 높은 효율 화학은, 검출을 위한 개개의 PS-특이적 항체를 이용한 ELISA와 함께 HPLS에 의하여 검출된 활성화된 단백질과 모든 활성화된 성분 다당류가 콘쥬게이트를 형성할 수 있는, 다가 콘쥬게이트 백신의 화합(combined) 합성에 그 자체로 적용된다.
특정한 예에서, 반응성이 좀 떨어지는 다당류는 활성된 단백질과 초기에 반응한다. 반응성이 높은 다당류는 그 후 덜 반응적인 PS/단백질 중간체(intermediate) 콘쥬게이트와 반응한다. 덜 반응적인 다당류는 처음에 반응성이 높은 다당류와 경쟁하지 않고 긴 반응시간 동안 반응하여, 많은 양의 덜 반응적인 다당류가 콘쥬게이트된다.
활성화된 다당류의 활성화된 단백질과의 상대적인 반응성은 반응 비율 및/또는 콘쥬게이트된 다당류의 양을 가리킨다. 높은 반응 비율 및/도는 콘쥬게이션된 많은 양은 반응성이 높은 다당류의 표시이다. 활성화된 다당류의 반응성은 최소한 몇 가지 요인에 의존한다: 활성화 정도(더 많이 부착된 작용 그룹, 더 높은 반응성); 사슬 길이(활성화 정도가 같은 경우, 더 많은 작용 그룹을 포함하는 긴 사슬이 반응성이 더 높다); 및 다당류 구조(입체 구조적 방해, 구조적 안정성 등).
환원적 아민화(amination) 콘쥬게이션의 특정 예에 있어서, 다당류의 활성화 정도는 활성화 제제(예컨대 NaIO4), 온도, 반응 시간 및 다당류 구조에 의하여 조절된다. 활성화 제제는 Mn C 다당류의 사슬을 절단하지만, Mn A, Mn W 135 및 Mn Y 다당류의 사슬은 절단하지 않는다. 시안화(cyanylation) 콘쥬게이션의 특정 예에서, 다당류의 활성화 정도는 활성화 제제, pH, 반응 시간 및 다당류의 하이드록실기 그룹의 밀도에 의하여 조절된다. Mn A 및 Mn C 다당류는 Mn W135 및 Mn Y 다당류에 비하여 하이드록실기 밀도가 낮다. 일반적으로, 활성화된 Mn C 및 Mn A 다당류의 반응성은 Mn W135 및 Mn Y 다당류의 반응성에 비하여 낮은 것으로 알려졌다.
전술한 바와 같이, 본 발명은, (i) 1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethyl carbodiimide hydrochloride 및 (ii) 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 펩타이드 또는 하나 이상의 아미노산과 하나 이상의 펩타이드의 혼합물의 존재 하, 단백질을, 카보하이드라자이드(carbohydrazide), 하이드라진 디하이드로클로라이드(hydrazine dihydrochloride), 디하이드라자이드( dihydrazide)(예컨대 숙시닐 디하이드라자이드(succinyl dihydrazide) 또는 아디픽산 디하이드라자이드(adipic acid dihydrazide)) 또는 그것들의 혼합물과 반응시키는 것을 포함하는, 담체 단백질의 새로운 활성화 방법이다. 새로운 단백질 활성화 방법은 아래 기재된 대로 다당류에 콘쥬게이트하여 일가(monovalent) 콘쥬게이트 백신을 제조하거나 다당류의 혼합물에 콘쥬게이트하여 다가(또는 복합(complex) 다가) 콘쥬게이트 백신을 제조하는데 이용될 수 있다. 유용한 아미노산들은 알파-L-형태(또는 보통 L-아미노산이라 부르는 isomer)의 단백질 아미노산을 포함한다. 또 다른 아미노산들은 알파-D-형태(D-아미노산), 베타-형태(베타 아미노산), 감마-형태, 델타-형태 및 엡실론-형태 등을 포함한다. 여기에 설명한 아미노산들은 라이신(lysine), 알지닌(arginine), 히스티딘(histidine), 글라이신(glycine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 글루탐산(glutamic acid), 시스테인(cysteine) 및 그것들의 혼합물을 포함한다. 활성화 조성물 내 존재하는 아미노산들의 충분하고(broad), 바람직하며, 더욱 선호되는 농도 범위는 각각 1-500 mM, 20-300 mM 및 36-144 mM 이다.
이론으로 뒷받침되는 것은 아니지만(Although not bound by any theory), 활성화 반응 동안 아미노산은 단백질 분자 내로 하이드라진처럼 편입(get corporate)되는 것으로 믿어진다. 편입된 아미노산 잔기는 단백질 수화(hydration) 환경을 어떻게든지(possibly) 교란하여, 입체구조적 방해를 제공하여, 단백질 응집 및 침전을 예방하게 한다.
하나의 예에서 이 방법은, 1) 반응 시간, 2) EDC 농도 및 3) 반응에 있어 아미노산 또는 아미노산 혼합물의 농도를 포함하는 통제된 조건 하, 과도한 양의 하이드라진, 카보하이드라자이드, 숙시닐 디하이드라자이드 또는 카보디이미드에 의하여 촉매된 ADH와 단백질의 반응을 통하여, 하나 이상의 하이드라진 그룹을 담체 단백질에 도입하는 것을 포함한다. 그 결과 생성된 하이드라자이드에 의하여 활성화된 담체 단백질은 연장된 기간의 시간 동안(예컨대 최소 대략 1년) 중성 pH에서 용해가능한 상태로 유지된다.
다당류-단백질 콘쥬게이트 백신을 합성 및 제조하는 종래 방법은 전형적으로 낮은 효율로 콘쥬게이션 반응을 수행한다(전형적으로는 대략 20%). 이것은 첨가된 활성화된 다당류의 80%까지는 손실되는 것을 의미한다. 게다가, 콘쥬게이트되지 않은 PS로부터 콘쥬게이트를 정제하는 크로마토그래피 공정이 전형적으로 필요하다.
바람직한 예의 합성 방법은 개선된 콘쥬게이트 수율(전형적으로는 약 60%정도로 높음)로 다른 반응물의 cyanate ester 또는 알데하이드 그룹과 반응하는, 반응물의 하이드라자이드 그룹의 특유의 화학적 특징을 이용한다.
콘쥬게이션 반응이 높은 콘쥬게이션 효율로 진행될 때, 반응이 완료된 후 남아 있는 콘쥬게이트되지 않은 단백질 및 다당류의 양은 그것을 제거하는 것이 필요하지 않을 정도로 충분히 낮을 수 있다. 따라서, 콘쥬게이트 산물을 정제하는 공정은 예컨대, 작은 분자 부산물를 제거하는 정용여과(diafiltration) 단계로 간단해질 수 있다. 하이드라자이드-베이스의 콘쥬게이시션 반응은 하루 내지 삼일 동안, 약 1내지 약 50, 바람직하게는 약 1 내지 약 40mg/ml 또는 약 1 내지 약 50mg/ml의 반응물 농도, 특정 예에서는 좀더 높거나 낮은 비율이 선호되기는 하지만, 약 1:5에서 약 5:1, 바람직하게는 약 1:2에서 약 2:1 및 더욱 바람직하게 약 1:1의 PS/단백질 질량 비율로 수행될 수 있다. 콘쥬게이션 반응은 바람직하게는 약 4°C에서 약 40°C, 바람직하게는 약 4, 10, 15 또는 20°C에서 약 25, 30, 또는 35°C의 온도 조건에서 및 약 6에서 약 8.5의 pH에서, 바람직하게는 약 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 또는 6.5에서 약 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7. 6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 또는 8.4의 pH에서 다당류에 따라 다양한 최적 조건으로 수행된다. 그러므로, 하이드라자이드-베이스의 콘쥬게이션 반응을 사용하면 콘쥬게이트 백신을 적은 비용으로 제조할 수 있다.
콘쥬게이트 백신을 합성하는 종래 방법의 결점을 극복하기 위하여, 환원적 아민화 및 시안화(cyanylation) 콘쥬게이션의 하이드라자이드 화학을 이용하여 PSs를 담체 단백질에 콘쥬게이션하는 방법이 제공된다. 하이드라진, ADH, 카보하이드라자이드 또는 숙시닐 디하이드라자이드와의 카보디이미드 반응에 의한 단백질 분자의 아스파르트산(aspartic acid) 및/또는 글루탐산 잔기의 카복실 그룹에 -NH-NH2 구조를 갖는 하이드라자이드 그룹이 도입된다.
한 예에서, 활성화된 단백질은 콘쥬게이션 전, 약 3이상의 또는 10M 이하 또는 그 이상의 완충용액(buffer), 바람직하게는 약 4 또는 5mM에서 약 6, 7, 8 또는 9;mM의 완충용액을 가하여 약 10에서 11.5의 pH, 바람직하게는 약 10.1, 10.2, 10.3, or 10.4에서 약 10.6, 10.7, 10.8, 10.9, 11.0, 11.1, 11.2, 11.3, 또는 11.4의 pH 그리고 더욱더 바람직하게는 약 10.5의 pH에서 용해할 수 있는 상태로 유지된다. 적합한 완충용액은 Na2CO3, 3 (cyclohexylamino)-l-propancsulfonicacid (CAPS) 및 (2-(N-cyclohexylamino)ethane sulfonic acid (CHES)를 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다. 또다른 예에서, 전술한 바와 같이, 하나 이상의 아미노산의 존재 하 단백질을 활성화시킴으로써, 활성화된 단백질은 중성 또는 거의 중성인 pH(예컨대 약 7 내지 약 7.5의 pH)에서 용해가능한 상태로 유지되며 이는 아래에 자세히 설명되어 있다.
활성화된 단백질은, 100 mM 또는 약200 mM 이하, 바람직하게는 약110, 120, 130, 140 또는 150 mM부터 약 160, 170, 180 또는 190 mM까지의 농도를 갖는 완충 용액의 존재 하, 약 6부터 약 8.5, 바람직하게는 약 6.1, 6.2, 6.3, 6.4 또는 6.5부터 약 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7. 2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0까지의 pH에서, 알데하이드(환원적 아민화) 또는 시안산염(시안화 콘쥬게이션)그룹을 포함하는 활성화된 다당류와 반응한다. 적합한 완충 용액은 N-(2-hydroxyethyl) piperazine-N'-(2-ethanesulfonic acid) (HEPES), phosphate buffered saline (PBS), 2 morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) 또는 N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES)이나 여기에 한정되는 것은 아니다.
대체적으로, PS는 하이드라자이드 그룹으로 기능화(functionalize)될 수 있다. 활성화된 PS는 강한 완충용액과 pH 6.5-7.5 조건하, 알데하이드 그룹(환원적 아민화)을 포함하는 활성화된 아미노산과 콘쥬게이트할 수 있다. 단백질은 콘쥬게이션하는 순간까지(until he point of conjugation), 약한 완충용액 및 약 pH10.5 조건 하, 용해될수 있는 상태로 유지된다. 중성/약산성 조건하, 라이신 엡실론(epsilon)-아미노 그룹(pKa = 10.5)과 비교하여 하이드라자이드 그룹(pKa - 2.6)의 높은 반응성 및, 콘쥬게이션 전 약 pH 10.5에서 용해 가능한 상태로 남아있던 활성화된 단백질을 이용한 콘쥬게이트의 증가된 수용성 때문에, 콘쥬게이션 반응의 수율은 확연히 증가한다.
이들 방법으로 제조된 콘쥬게이트들은 마우스에 대한 시험에서 보여진 바와 같이, 시험 동물에서 면역원성이 있었다. 게다가 콘쥬게이션 반응은 sodium cyanoborohydride 없이도 효율적으로 수행될 수 있었는데, 이로써 콘쥬게이트 산물에 시안화물 이온(cyanide in)의 사용을 피할 수 있게 되었다. 이 반응은, 종래 환원적 아민화 콘쥬게이션 방법이 며칠에 걸쳐 수행된 것과 달리, 약산성 또는 중성 pH 조건하, 1-3 일간 4°C 수행되거나 또는 상온에서 밤새 수행될 수 있다. 이는 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 타입 b, Streptococcus pneumonias 타입 19F 및 Neisseria meningitides 그룹 A와 같은 불안정한 다당류의 높은 수율의 콘쥬게이트 백신 생산이 가능함을 다시 한 번 확인시킨다. 바람직한 예의 방법은 덜 비싼 복합 다가 콘쥬게이트 백신의 생산에 사용될 수 있으며, 이로써 공공의 건강이 상당히 촉진된다.
다당류
여기에 사용된 “다당류”라는 용어는 복수의 반복 단위로 구성되나 이로 한정되지는 않는 당류(saccharides), 50 또는 그 이상의 반복 단위를 가지나 이로 한정되지는 않는 다당류(polysaccharides) 및 50 또는 그 이하의 반복 단위를 갖는 올리고당류(oligosaccharide)을 포함하는, 충분하고 통상적으로 사용되는 용어이다. 전형적으로 다당류는 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 95 반복단위부터 약 2000개 또는 그 이상의 반복 단위를 가지며, 바람직하게는 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95개의 반복 단위부터 약 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800 또는 1900개의 반복 단위를 갖는다. 올리고당류는 전형적으로 약 6, 7, 8, 9, 또는 10으로부터 약 15, 20, 25, 30, 또는 35 개의 반복단위, 약 40 또는 45 개의 반복단위를 갖는다.
바람직한 예에서의 사용에 적합한 다당류는 피막화된 박테리아 유래의 다당류 및 올리고당류를 포함한다. 다당류 및 올리고당류는 어떤 소스(source)로부터 유래되어도 괜찮은데, 예컨대, 그것들은 자연적으로-발생한 박테리아, 유전적으로 가공(engineered)된 박테리아로부터 유래될 수 있으며, 또는 합성적으로 생산될 수도 있다. 다당류 및 올리고당류는 활성화에 우선하여, 예컨대 약한 산화 조건(mild oxidative conditions)을 이용하는 해중합(depolymerization), 기능화(functionalization), 정제, 탈아세틸화 등과 같은 하나 또는 그 이상의 공정 과정을 거칠 수 있다. 만약 필요하다면 공정 이후의 단계도 사용될 수 있다. 적절한 다당류 및 올리고당류를 정제 및/또는 제조, 합성하는, 당업계에 이미 알려진 적절한 방법이 사용될 수 있다.
바람직할 실시예에 사용되는 다당류 및 올리고당류는 예컨대, 혈청군 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F,8, ' 9N, 9V, l0A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F의 폐렴구균 다당류; 혈청형 A, B. C, W135, 및 Y의 수막구균 다당류, Haemophilus influenzae 타입 b 다당류 polyribosylribitol phosphate, 혈청형 III 및 V의 그룹 B 연쇄구균(streptococcal) 다당류 및 Salmonella typhiVi 다당류를 포함한다. 폐렴구균 및 그룹 B 연쇄구균 혈청형 및 수막구균 혈청형의 또 다른 다당류 역시, 예컨대 그룹 A 연쇄구균 Staphylococci, Enterococci, Klebsiella pneumoniae, E. coli, Pseudomonas aeruginosa, 및 Bacillus anthracis으로부터 유래된 올리고당류 또는 다당류와 같은 T-비의존성 다당류 또는 올리고당류 항원과 같이 본 발명에서 이용할 수 있다. 박테리아성 올리고당류 및 다당류가 특히 바람직하지만, 그람 (-) 박테리아의 지질다당류(lipopolysaccharides), lipooligosaccharide, 및 이것들의 다당류 및 올리고당류 유도체, 및 바이러스 다당류 및 올리고당류도 역시 사용될 수 있다.
곁사슬 인(phosphorus) 및/또는 백본(backbone) 인을 가진 다당류 역시 바람직한 예의 이용에 적합하다. 바람직한 예의 콘쥬게이션 반응은 특히 백본에 인을 가진 다당류를 이용할 때 아주 적절하다. 이러한 다당류는 단편화(fragmentation) 및 분해(degradation)에 예민하여, 콘쥬게이션 반응의 신속성 및 낮은 온도(4°C) 반응 조건으로 인하여 다당류의 분해가 감소한 질 좋은 콘쥬게이트가 생성된다.
선-공정 단계가 완료된 후, 다당류 또는 올리고당류는 “활성화”단계로 넘어가게 된다. “활성화”라는 용어는 단백질과 반응할 수 있는 화학적 그룹을 제공하기 위하여 다당류에 화학적 처리를 하는 것이다. 특정한 바람직한 예에서, 활성화는 기능화된 단백질의 하이드라자이드 그룹과 반응하는 시안산염 그룹, 케톤 그룹 또는 알데하이드 그룹 및 다당류 또는 올리고당류의 기능화를 수반한다. 또는, 다당류 또는 올리고당류는 기능화된 단백질의 케톤 그룹 도는 알데하이드 그룹과 반응하는 하이드라자이드 그룹과 기능화될 수 있다.
하나의 예에 따르면, 하나 이상의 다당류의 혼합물은 하나의 뱃치 단계에서 하나의 활성화 제제(또는 활성화 제제들의 혼합물)와의 반응으로 동시에 활성화될 수 있다. 예를 들어, Mn A, Mn C, Mn W135 및 Mn Y 다당류는 하나의 뱃치 반응에서 알데하이드-기능화 제제와 반응할 수 있다. 또 다른 예에 따르면, 각각의 다당류는 분리된 공정에서 활성화 제제와의 반응으로 활성화될 수 있다. 분리되어 활성화된 다당류는 그 후 콘쥬게이션 단계에 앞서 서로 혼합되어, 활성화된 다당류는 하나의 공정에서 동시에 콘쥬게이트될 수 있다.
적합한 기능화 반응은 다당류 또는 올리고당류를 시안산염 그룹과 활성화시키는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 다당류 또는 올리고당류는 triethylamine의 존재 하, 1- cyano-4-dimethylammoniumpyridinium tetrafluoroborate과 반응한다.
적절한 기능화 반응은 다당류 또는 올리고당류를 알데하이드 그룹과 활성화시키는데 이용할 수 있다. 특정한 다당류 및 올리고당류는 콘쥬게이션 반응에 참여할 수 있는 말단 알데하이드 그룹을 갖고 있다. 만약 다당류 또는 올리고당류가 알데하이드 그룹과 활성화된다면, 바람직한 반응은 NaIO4과 같은 산화제와의 반응을 수반한다. 산화제는 다당류 또는 올리고당류를 단편화할 잠재력이 있다. 특정 산화제 및 선택된 산화제의 농도를 선택하여 원하지 않은 단편화를 조절하거나 피할 수 있다. 케톤 그룹 또한 하이드라자이드와 반응할 수 있어, 특정 예에서는 다당류 또는 올리고당류의 케톤 그룹과의 활성화를 사용할 수 있다.
적합한 기능화 반응은 다당류 또는 올리고당류를 하이드라자이드 그룹과 활성화시키는데 사용될 수 있다. 바람직한 기능화 반응은 다당류 또는 올리고당류가 과옥소산(periodate) 활성화 반응에서 NaIO4와 반응하여 알데하이드 그룹을 생성하고, 그후 하이드라진 및 아디픽산 디하이드라자이드와 반응하며, 그 후 NaBH4의 환원이 일어나는, 환원성 아민화다. 또는 다당류 또는 올리고당류가 cyanogen bromide 또는 l-cyano-4- dimethylammoniumpyridinium tetrafluoroborate와 반응하여, 시안산염 그룹을 도입하여 하이드라진 및 아디픽산 디하이드라자이드와 반응하는 시안화(cyanylation) 콘쥬게이션 반응을 이용할 수 있다. 다당류 또는 올리고당류가 1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethyl carbodiimide hydrochloride)의 존재 하, 아디픽산 디하이드라자이드와 반응하는, 카보디이미드 반응 또한 이용할 수 있다.
강하게 완충된(약 6.5내지 약 8의 pH, 약 100 mM 내지 약 200 mM의 높은 버퍼 농도) 활성화된 다당류 용액은, 강하게 완충된 용액의 형태로, 콘쥬게이션 반응에 바람직하게 사용될 수 있다. 적합한 완충용액은 바람직하게는 N-(2- Hydroxyethyl) piperazine-N'-(2-ethanesulfonic acid) 또는 phosphate buffered saline과 같은 완충용액이 사용될 수 있다.
단백질
활성화된 다당류 또는 올리고당류는 콘쥬게이트 백신을 만들기 위해 단백질과 연결(couple)된다. 적합한 단백질은 개체에의 투약을 위하여 화학적 또는 유전적 수단으로 안전하다고 만들어진, 면역학적으로 유효한 담체인 박테리아성 독소를 포함한다. 예들은 디프테리아 변성독소, CRM197, 파상풍 변성독소, 백일해 변성독소, E. coli LT, E: coli ST 및 Pseudomonas aeruginosa 유래의 외독소 A를 포함한다. outer membrane complex c (OMPC), 포린(porins), 트랜스페린 결합 단백질(transferrin binding proteins), 뉴모라이시스(pneumolysis), 폐렴구균 표면 단백질 A(pneumococcal surface protein A (PspA)) , 폐렴구균 부착 단백질(pneumococcal adhesin protein (PsaA)) 또는 폐렴구균 표면 단백질(pneumococcal surface proteins) BVH-3 및 BVH-11과 같은 박테리아 외막 단백질들 또한 사용될 수 있다. 다른 단백질들, 예컨대 Bacillus anthracis의 방어 항원(protective antigen (PA)) 및 Bacillus anthracis의 치사 팩터(lethal factor (LF)) 및 해독된 부종 팩터(edema factor(EF)), 오발부민(ovalbumin), keyhole limpet hemocyanin (KLH), 인간혈청 알부민, 소 혈청 알부민(bovine serum albumin (BSA)) 및 튜베큘린의 정제된 단백질 유도체(purified protein derivative of tuberculin (PPD))들도 사용할 수 있다. 단백질들은 바람직하게는 비독성이고 반응성이 없으며, 바람직한 예의 콘쥬게이션 방법에 사용될 수 있는 충분한 양 및 정제 상태로 수득 가능하다. 예를 들어 디프테리아 독소는, 적합한 단백질을 생성하기 위하여 Corynebacterium diphtheriae 배지에서 정제되고, 포름알데하이드를 이용하는 화학 해독이 될 수 있다.
하나 이상의 T-세포 에피토프를 갖는, 본래(native) 독소 또는 변성독소의 조각들 또한 특정 유사체(analogs), 조각 및/또는 상기 다양한 단백질들의 유사한(analog) 조각들과 마찬가지로, 외막 단백질 복합체들이 그러하듯이, 유용하다. 단백질은 자연물(natural sources)로부터 수득할 수 있고, 재조합 기술 또는 당업자에게 알려진 합성 방법에 의하여도 생산될 수 있다. 유사체들은 다양한 수단을 통하여 수득될 수 있는데, 예컨대, 특정 아미노산들은 항체의 항원 결합 영역 또는 기질 분자의 결합 부위 등과 같은 상호작용하는 결합 능력의 손실 없이 단백질에 있어서 다른 아미노산들로 대체(substitute)될 수 있다. 표면에 노출된 글루탐산 또는 아스파르트산 그룹을 포함하는 다른 단백질들 또한 이용될 수 있다.
하이드라자이드 그룹을 갖는 단백질을 활성화 시키기 위하여 적절한 기능화 반응을 이용할 수 있다. 하이드라자이드-변이(modified)된 단백질을 제조하는, 종래 방법은 단백질의 라이신 ε-아미노 그룹을 통한 티올 하이드라자이드(thiol hydrazide) 및 N-succinimidyl iodoacetate을 이용한 두-단계 공정 및 EDC 활성화를 포함하였다. King et al., Biochemistry 1986; 25:5774-5779 참조. 전형적으로, EDC 촉매화에 의하여 제조된 변이 단백질은 콘쥬게이션에 이용하기 위하여 분획(fractionate)될 필요가 있으며, 두-단계 공정은 장황하다. 따라서, 일반적으로 이러한 하이드라자이드-변이 단백질의 제조 방법을 사용하는 것은 일반적으로 바람직하지 않다. 그러나 특별한 경우에는 이러한 방법들이 적합하며, 심지어 바람직하기까지 하다.
바람직하게는, 하이드라자이드 그룹은, 예컨대 하이드라진, 카보하이드라자이드, succinyl dihydrazide, 아디빅산 디하이드라자이드, hydrazine chloride (예컨대, hydrazine dihydrochloride) 또는 EDC 존재 하의 다른 디하이드라자이드와 같은 카보디이미드 반응을 이용하여, 단백질의 아스파르트산(aspartic acid) 및 글루탐산 잔기의 카르복실 그룹를 통하여 단백질 내로 도입된다. EDC는 하이드라진 또는 디하이드라자이드와 단백질 반응물을 활성화시키고 변이시키는데 촉매로 사용된다. EDC-catalyzedproteins generally have a tendency to polymerize and precipitate. EDC-촉매단백질들은 일반적으로 중합(polymerize) 및 침전(precipitate)하는 경향이 있다. Schneerson et al., Infect. Immun. 1986, 52:519-528; Shafer et al., Vaccine 2000; 18(13): 1273-1281; and Inman et al., Biochemistry 1969; 8:4074-4082 참조. 활성화된 단백질들의 응집 및 침전은, 부분적으로는, 그것의 pH 환경에 의존한다. 그러므로 중합화 및 활성화 경향은 그러한 완충용액 내 하이드라자이드-변이 단백질들을 용해될 수 있는 상태(soluble)로 유지시킴으로써 조절될 수 있다. 반응 혼합물 완충용액-교환을 통해, 활성화된 단백질을 약 pH 10.5로 유지시킬 수 있으며, 그 활성화된 단백질들은 가용화 상태로 유지되고 콘쥬게이션에도 안정하다. 적합한 완충용액이 적용될 수 있다. 바람직하게는 약 3mM의 낮은 농도부터 약 10mM까지의 Na2CO3와 같은 약한 완충용액이 사용된다.
완충(buffered) 하이드라자이드-변이 단백질은 그 후 약 pH 6에서 8.5까지, 바람직하게는 약 6.5에서 8까지의 조건 하 활성화된 다당류에 가해질 대 침전 없이 단백질-다당류 콘쥬게이트를 제조하는데 사용될 수 있다. 적합한 기능화 반응이 알데하이드 그룹을 가진 단백질을 활성화시키는데 이용될 수 있다. 바람직하게는, 단백질은 EDC 존재 하, l-amino-2, 3- propanediol와 반응하며, 이어 NaIO4.로 산화가 일어난다. 1-amino-2, 3- propanediol 대신 glucosamine, galactosamine 및 그 유사체와 같은 아미노당(amino sugars)들을 사용할 수 있다. 이 반응에서, EDC 또한 단백질 반응물을 단백질의 아스파르트산 및 글루탐산 잔기의 카복실 그룹을 통하여 아미노디올(aminodiol)과 활성화 및 변이시키는데 있어 촉매로 사용된다.
또한 단백질은 전술한 바와 같이 아미노산 또는 아미노산 혼합물이 존재하는 조건에서도 활성화될 수 있으며 약 7 내지 7.5의 중성 pH에서도 유지될 수 있다.
환원적 아민화에 의한 콘쥬게이트의 제조
콘쥬게이트는 알데하이드 및 하이드라자이드 그룹의 반응을 통하여 제조될 수 있다(환원적 아민화). 환원적 아민화 콘쥬게이션 반응은 하이드라자이드-변이 반으움ㄹ(단백질 또는 다당류)을 알데하이드 그룹을 포함하는 다른 구성요소와 콘쥬게이트시키는데 사용될 수 있다.
종래 환원적 아민화에 있어, 알데하이드와 아미노 그룹간의 반응은 가역적이고 불리(unfavorable)하여, 전체 환원적 아민화 사례(event)가 비가역적으로 만들기 위하여 C=N 이중결합을 C-N 단일 결합으로 전환함으로써 콘쥬게이션을 촉진화기 위하여 sodium cyanoborohydride이 필요하다.
반면에, 바람직한 예의 환원적 아민화 콘쥬게이션 반응은 하이드라자이드-알데하이드 반응의 높은 효율성 때문에 sodium cyanoborohydride의 도움이 필요 없다. 환원적 아민화 콘쥬게이션 반응의 마지막에, sodium borohydride 또는 다른 적적한 환원제가 잔여 알데하이드 그룹을 알콜 그룹으로 환원시키는 목적 뿐 아니라 C=N 이중 결합을 C-N 단일 결합으로 환원시키기 위하여도 사용된다. 바람직한 예의 환원적 아민화 콘쥬게이션 반응은 sodium cyanoborohydride의 부산물인 cyanide에 의하여 산물인 콘쥬게이트가 오염되는 것을 피한다.
콘쥬게이션 반응 중 활성화된 단백질의 침전을 줄이기 위하여, 활성화된 단백질은 강하게 완충(약 100mM부터 약 200mM까지의 높은 완충농도, 약 6.5에서 약 7.5까지의 pH)활성화된 다당류 용액에 가해진, 약 3mM 내지 약 10mM의 낮은 완충 농도의, 약한 완충 용액의 형태가 바람직하다. 바람직하게는, 활성화된 단백질 용액의 pH는 약 pH 10에서 약 pH 11.5까지 완충되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 약 pH 10.5까지이다. 활성화된 다당류 용액은 바람직하게는 약 pH 5에서 약 pH 8까지, 더욱 바람직하게는 약 pH 6.5에서 약 pH 7.5까지 강하게 완충된다. 하이드라자이드-알데하이드 환원적 아민화 반응은 빠른 속도로 진행되며, 활성화된 단백질에 대한 10.5보다 낮은 pH(예컨대, 약 8.5에서 약 9.5가지 정도로 약한 pH)의 침전 효과는 반응하는 활성화된 다당류의 분자 특성에 의하여 극복된다.
시안화(cyanylation) 콘쥬게이션에 의한 콘쥬게이트의 제조
콘쥬게이트는, 하이드라자이드와 시안산염(cyanate) 그룹의 반응(시안화 콘쥬게이션)에 의하여 제조될 수 있다. 시안화 콘쥬게이션 반응은 효율적이며 가역적이며 산물 형성에 유리하다. 특정 예에서, 방해제(blocking agents)가 잔여 시안산염 그룹을 제거하는데 사용된다. 그러나, 반응 혼합물에 방해제를 가하는 것은 콘쥬게이션 반응을 역으로 유도하며(driving backward) 콘쥬게이션 수율을 5-12%로 감소시킨다. 수율에 대한 다양한 방해제의 효과가 연구되었다. 폐렴구균 다당류 Pn 18C PS는 CDAP로 활성화되었으며, 하이드라자이드 활성화된 파상풍 변성독소(tetanus toxoid (TTH))와 밤새 콘쥬게이트되었다. 부분표본(aliquot) 5개가 물 또는 방해제와 0.2M 가해졌다. 4 시간의 배양 후, 샘플들이 280nm monitor를 가진 Waters Ultrahydrogel 2000 column을 이용한 HPSEC에 의하여 분석되었다. 표 3에 나타난 대로, 각 샘플의 콘쥬게이션 수율은, 콘쥬게이션 피크에 자유 TTH 피크(22분)에 더한 것과 같이, 전체 단백질에 대하여 15.5분의 콘쥬게이트 피크의 %영역으로 확인되었다. 특정 예에서, 남은 잔여 시안산염 그룹을 제거하기 위하여 방해제를 사용하는 것이 바람직할 수 있는데 반하여, 일반적으로는, 콘쥬게이션 수율이 낮아지는 것을 피하기 위하여, 방해제 사용을 피하는 것이 바람직하다.
방해제 (0.2 M) 콘쥬게이션 수율 %대조군(control) % 환원
없음 (대조) 75 100 0
ADH 63 84 16
Hydrazine 70 93 7
Glycine 66 89 11
Ethanolamine 65 87 13
방해제를 사용하지 않고, 콘쥬게이션 산물 내의 잔여 시안산염 그룹을 제거하기 위하여, 콘쥬게이션 시간을 연장할 수 있다. 바람직하게는, 콘쥬게이션은 약 0℃에서 약 5℃의 온도에서, 약 36시간에서 약 48시간동안, 가장 바람직하게는 약 4℃에서 약 36시간 동안 수행되며, 그 후 약 20℃ 에서 약 25℃의 온도로 추가적으로 18 내지 24시간을 더 수행하며, 가장 바람직하게는 약 20 내지 24℃에서 약 18시간동안 수행하여, 잔여 시안산염 그룹이 물과 반응하고 분해(decompose)되게 한다. 더 길거나 더 짧은 콘쥬게이션 시간 및/또는 더 높거나 더 낮은 콘쥬게이션 온도가 사용될 수 있으며, 원하는 대로 다양한 시간 및 온도에서 다른 서열으로 수행될 수 있다. 그러나, 콘쥬게이션 반응이, 적어도 처음에는 낮은 온도에서, 바람직하게는 약 0℃부터 약 5℃까지, 더욱더 바람직하게는 약 4℃에서 수행되어, 콘쥬게이트의 침전 정도를 감소시키는 것이 바람직하다.
콘쥬게이션 산물의 높은 면역원성 및 높은 콘쥬게이션 수율과 아울러,콘쥬게이트되지 않은 다당류로부터 콘쥬게이트의 황산암모늄(ammonium sulfate) 및/또는 칼럼 크로마토그래피과 같은 정제 공정이 필요하지 않을 수 있다. 그러나 특정 예에서, 하나 또는 그 이상의 정제 단계를 거치는 것이 바람직하다.
콘쥬게이트
양 반응물 모두 분자당 여러개의 반응성 있는 그룹들을 포함하고 있다. 활성화된 다당류 분자는 반응하여 하나 이상의 활성화된 단백질 분자들과 하나 이상의 연결(linkage)을 형성한다. 마찬가지로, 활성화된 단백질 분자는 반응하여 하나 이상의 활성화된 다당류 분자와 하나 이상의 연결을 형성한다.
그러므로, 콘쥬게이트 산물은 다양한, 교차연결된 매트릭스-타입(matrix-type)의 격자 구조들의 혼합물이다. 예컨대, 하나의 연결이 존재할 수 있고, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 그 이상의 연결이 존재할 수 있다. 다당류와 단백질 사이의 연결의 평균적인 개수는 원하는 대로 조정할 수 있다. 연결의 바람직한 평균 개수는 다당류의 종류, 단백질의 종류, 콘쥬게이션 방법, 반응 조건 등에 의하여 결정된다. 일반적으로, 1개의 연결에서 약 2,3,4 또는 5개의 연결이 평균적이어서, 과도하게 콘쥬게이션되어 단백질이 면역 시스템을 자극하는 기능을 방해하는 것을 피하고, 다당류 구조에 변화를 일으키지 않도록 한다. 그러나, 특정한 예에서 5개 이상의 연결도 감수할 만하고, 심지어 바람직하기도 하다.
전술한 바와 같이, 복합 다가 콘쥬게이트는 여기에 기재된 방법에 의하여 생산된다. 복합 다가 콘쥬게이트에 포함되는, 면역원적으로 구별되는 다당류의 숫자는 제한되지 않고, 특정 예에서는, 2에서 28, 바람직하게는 5에서 25, 그리고 더욱 바람직하게는 15개의 범위에 이른다. 복합 다가 콘쥬게이트에 포함되는, 다른 담체 단백질의 숫자는 제한되지 않고, 특정 예에서는, 1에서 10, 바람직하게는 4에서 6, 그리고 더욱 바람직하게는 5개의 범위에 이른다. 예컨대, 담체 단백질 분자는 2, 3, 4, 5, 6 개 등의 면역원적으로 구별되는 다당류와 콘쥬게이트할 수 있다. 구조 콘쥬게이트(construct conjugate)는 서로 서로 또는 2, 3, 4, 5, 6개 등의 면역원적으로 구별되는 다당류들과 콘쥬게이트되는 둘 이상의 서로 다른 단백질 분자들을 포함하는 격자 구조를 포함한다.
콘쥬게이션 후, 콘쥬게이트는 적절한 방법에 의하여 정제될 수 있다. 정제는 반응하지 않은 다당류, 단백질 또는 작은 분자 반응 분산물을 제거하기 위해서 사용된다. 정제 방법은 당업계에 알려진 초미세여과법(ultrafiltration), 크기배제크로마토그래피(size exclusion chromatography), 밀도구배원심분리(density gradient centrifugation), 소수성상호작용크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography), 황산암모늄분획(ammonium sulfate fractionation) 등을 포함한다. 전술한 바와 같이 바람직한 예의 콘쥬게이션 반응은 높은 수율로 진행되며, 바람직하지 않은 작은 분자 반응 부산물을 더 적게 만들어낸다. 그러므로, 정제가 필요하지 않거나, 정용여과(diafiltration)와 같은 약한 정도의 정제가 바람직하다. 콘쥬게이트는 원하는 대로, 농축(diafiltration)되거나 희석될 수 있으며, 약학적 조성물에의 이용을 위하여 적절한 형태로 가공될 수도 있다.
치료 방법
바람직한 예에 따라 제조된 콘쥬게이트는 감염성 질환의 치료 및/또는 예방을 위하여 적절한 형태의 약학적으로 유효한 양(dose)으로 개체에 투약된다. 여기에서 사용하는“개체”란 용어는, 포유류와 같은 동물을 말한다. 예컨대, 예상되는 포유류는 인간, 영장류, 개, 고양이, 양, 소, 염소, 돼지, 말, 마우스, 래트(rat), 토끼, 기니어피그 등을 포함한다. “개체”,“환자”, “숙주”란 용어들은 혼용하여 사용된다. 여기에서 사용된, 콘쥬게이트 백신의“면역학적으로 유효한”양은 면역 반응을 유도하는데 적절한 양이다. 특정 양은 연령, 몸무게 및: 투약 방법과 같이, 치료받을 개체의 의학적 조건에 의존한다. 적절한 양은 당업자에 의하여 쉽게(readily) 결정될 수 있다.
바람직한 예의 콘쥬게이트 백신으로 구성된 약학적 조성물은 약한 면역원성 항원의 강화된 면역원성, 사용된 항원에의 잠재된 감소(reduction), 추가예방접종의 빈도 감소, 효능 개선, 면역의 우선적(preferential)자극, 면역반응의 잠재된 타겟팅(targetin)을 포함하는, 종래 백신을 능가하는 다양한 이점이 있다. 백신은 하기와 같이, 다양한 방법을 통하여 개체에 투약될 수 있는데, 이는 비경구(예컨대 뇌기저조내 주사 및 주입 (intracisternal injection and infusion) 기술), 진피내(intradermal), 막관통(transmembranal), (국소를 포함하는) 피부통과(transdermal), 근육내, 복막내(intraperitoneal), 정맥내(intravenous), 동맥내( intra-arterial), 병변내(intralesional), 피하(subcutaneous), 구강(oral) 및 예컨대 흡입과 같은 비강내(intranasal)투약방법들을 포함하나 이것들에 제한되는 것은 아니다. 콘쥬게이트 백신은 예컨대 질병 또는 상처 부위에의 국소투약에 의하는 것과 마찬가지로, 연속 주입(continuous infusion) 또는 일시주사(bolus injection)에 의하여 투약될 수 있다.
여기서 사용된 “백신”이라는 용어는 광범위한 용어로, 통상적으로 사용되는 의미로 사용되며, 선호되는 예의 콘쥬게이트 또는 아쥬반트(adjuvants), 희석제,부형제, 담체 및 다른 약학적으로 적합한 물질과 함께 제조되는 다른 항원들이 이에 포함되나, 이것들로 제한되는 것은 아니다.“약학적으로 적합한”이라는 용어는, 세포, 세포배양, 조직 또는 유기체와 같은 생물학적 조직과 양립될 수 있는 비독성 물질을 가리킨다.
바람직한 예의 콘쥬게이트의 이용을 위한 면역화 프로토콜(protocols)은 질병: 장애 및/또는 개체에의 감염의 예방 또는 치료를 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 여기서 사용된“치료”라는 용어는 광범위한 용어로, 통상적으로 사용되는 의미로 사용되었는데, 치유(curative), 예방(preventative), 예방(prophylactic), 완화 및/또는 개선 치료를 포함하나, 이로써 제한되는 것은 아니다.
백신 조성물은 바람직하게는 멸균되며 개체에의 투약을 위한 중량 또는 부피 단위의 콘쥬게이트의 치료학적으로 또는 예방적으로 효과적인 양을 포함한다. 여기서 사용된“약학적으로-적합한 담체”라는 용어는 개체레의 투약에 적절한 하나 또는 그 이상의 양립가능한 고체 또는 액체 부형제(filler), 희석제 또는 피막 형성 물질을 의미한다.“담체”라는 용어는 활성 성분이 적용 촉진을 위하여 복합(combine)된, 유기적 또는 무기적 성분, 천연 또는 합성 성분을 가리킨다. 담체의 특징은 투약방법에 의존한다. 물리적으로 및 약학적으로-적합한 담체는 희석제, 부형제, 염, 완충제, 안정제, 용해제 및 당업계에 잘 알려진 다른 물질들을 포함한다.
약학적 조성물의 성분은 또한 바람직한 예의 바람직학 약학적 효능을 상당히 감소시키는 상호작용이 없는 등의 방식으로 콘쥬게이트와, 및 서로서로 섞일 수 있다.
약학적 조성물로의 바람직한 예의 콘쥬게이트 백신의 제조는 당업계에 알려진 방법을 통하여 수행될 수 있다. 백신 조성물은 또한 하나 또는 그 이상의 아쥬반트를 포함할 수 있다. 적절한 아쥬반트는, 예컨대, aluminum hydroxide 또는 aluminum phosphate과 같은 알루미늄 아쥬반트, Freund's 아쥬반트, BAY, DC-chol, pcpp, monophoshoryl lipid A, CpG, QS-21, 콜레라 독소 및 formyl methionyl peptide를 포함한다. 예컨대 Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach, 1995 (M. F. Powell and M. J. Newman, eds., Plenum Press, N.Y.) 참조.
개체에 투약되는 콘쥬게이트 백신의 양 및 투약 요법은, 의도된 용도, 특정 항원, (만약 존재한다면) 아쥬반트, 연령, 성별, 몸무게, 종, 일반적인 상태, 병력 및/또는 치료, 투약 방법과 같은 요소들을 고려하여, 약학적 및 수의학적(veterinary) 분야의 당업자에게 잘 알려진 표준적인 기술로 결정될 수 있다. 예비(Preliminary)량은 동물 시험을 통하여 결정될 수 있으며, 인간 투약을 위한 양은 표준 투약량 시험(standard dosing trials)과 같은 업계에-수용된 방법으로 가늠(scaling)할 수 있다. 예컨대, 약학적으로 유효한 양은 처음에 혈청 항원 수준 검사로부터 추정될 수 있다. 용량은 콘쥬게이트의 특정 활성에 의존하며, 정형적인 시험에 의하여 쉽게 결정될 수 있다.
특정 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 면역화 프로토콜을 실시하는데 있어, 치료적으로 유효한 양의 콘쥬게이트가 개체에 투약된다.“유효한 양”이란 개체에게, 상대적인 의학적 상태(질병, 감염 등)의 개선(amelioration), 예방, 강화된 면역 반응, 치료, 치유 또는 그러한 상태의 개선, 예방, 치유, 치료의 속도가 증가와 같은 유의한 이익을 일으키기에 충분한, 치료적 제제(예컨대 콘쥬게이트) 또는 다른 활성 성분의 전체 양을 의미한다.“유효한 양”이 단독 투약된 개개의 치료적 제제에 대하여 쓰일 때는, 이 용어는 치료적 제제만을 가리킨다. 여기에 사용된 대로, 치료적 제제의 “유효한 양을 투여하는”이라는 구절은 질병, 감염 또는 장애의 심각성을 반영하는 최소 하나의 지표(indicator)에 있어서, 개선, 좀더 바람직하게는 개선이 유지되는 것을 유도하기에 충분한 시간 및 양의 상기 치료적 제제로 개체를 치료하는 것을 의미한다.
환자가 일정 기간의 시간에 의하여 구분되는 최소 두 때(occasions)에 있어서 개선을 보일 때, 개선이 “유지”된 것으로 생각된다. 치료 시간 및 용량이 어느 정도가 충분한지 결정하기 위하여 환자의 병의 정도를 반영하는 다양한 지표가 평가된다. 선택된 지표 또는 지표들을 위한 기저선 평가(baseline value)는 치료적 제제의 첫 번째 양의 투약에 우선하여 환자를 시험한데 기초하거나 건강한 환자들의 표본으로부터 산출된 통계적 평가에 기초하여 확정될 수 있다. 치료적 제제가 급성 통증을 치료하기 위하여 투약될 때, 첫 번째 양은 가능한한 실질적으로 투약된다. 선택된 지표 또는 지표들의 기저선을 넘는 개선을 개체가 보일 때까지 치료적 제제를 투약하여 개선을 유도한다. 만성 상태를 치료하는데 있어, 개선 정도는 한달, 두달 또는 세달 또는 그 이상 또는 무기한 등의 시간 동안 반복적으로 치료적 제제를 투약함으로써 이러한 정도의 개선을 얻을 수 있다. 한 번의 용량은 특정 상태를 예방하거나 치료하는데 충분하다. 치료는 만약 원한다면, 환자의 상태에 관계 없이, 종종 감소된 용량으로, 또는 동일한 수준으로 무기한 계속될 수 있다. 일단 치료가 감소되거나 중단되면, 만약 통증이 재발하였을 때, 후에 치료를 원래 수준으로 다시 시작할 수 있다.
일반적으로 박테리아 감염에 대항하는 백신을 위한 치료적으로 유효한 양 또는 효능적 용량을 제공하는 콘쥬게이트의 총량은 몸무게 kg 당 약 1 또는 약 100 또는 그 이상보다 적으며, 바람직하게는, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1 0, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50부터 약 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95㎍ 까지이다. 감염 후 시간 경과한 시간이 적은 경우, 박테리아가 증식하는데 시간이 덜 있었으므로, 유효한 용량은 항체를 덜 필요로 할 수 있다. 유효한 용량은 또한 진단 당시의 박테리아 적재(load)에 의존한다. 하루 중 일정 기간 동안 여러 번 주사(multiple injections)하는 것이 치료 목적으로 고려될 수 있다.
콘쥬게이트 백신은 하나의 용량 또는 하나 또는 그 이상의 추가를 포함하는 시리즈로 투약될 수 있다. 예를 들어, 유아 또는 아동은 생애의 초기에 하나의 용량을 받을 수 있으며, 나중에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 년(year) 이 지난 후, 추가 용량을 투약받을 수 있다. 추가 용량은 예컨대 이차면역반응으로, 초회감작(primed) B-세포로부터 항체를 만들 수 있다. 즉, 콘쥬게이트 백신은 유아 또는 아동에 있어서 높은 1차 기능적 항체 반응을 유도하며, 추가투약에 따른 이차면역반응을 유도할 수 있고, 콘쥬게이트 백신에 의하여 유도된 보호면역반응이 장기로 효과가 있다는 것을 보여준다.
콘쥬게이트 백신은 구강(oral), 비강, 항문, 볼, 질, 경구(peroral), 위내(intragastric), 점막, 설하(perlinqual), 치조(alveolar), 잇몸( gingival), 후각(olfactory) 또는 호흡점막 투약을 위하여 액체 제제로 제조될 수 있다. 그러한 투약을 위한 적절한 형태는 현탁물, 시럽 및 dfpfl서(elixir)를 포함한다. 콘쥬게이트 백신은 또한 비경구, 피하, 진피내, 근육내, 복막내 또는 정맥 투약, 주사적 투약, 이식물로부터 계속하여 흘러나오거나 눈에 떨어뜨려 투약하는 형식의 투약들을 위하여 제조될 수 있다. 그러한 투약을 위한 적절한 형태는 멸균 현탁액 및 에멀젼(emulsion)을 포함한다. 그러한 콘쥬게이트 백신은 적절한 담체, 희석제, 멸균수와 같은 부형제, 물리학적 식염수, 글루코스 등과 함께 혼합물로 될 수 있다. 콘쥬게이트 백신은 또한 동결건조될 수 있다. 콘쥬게이트 백신은 바람직한 투약 방법 및 제조에 의존하여, 풍미제, 색소, 보존제, 젤화 또는 점성 강화 첨가제, pH 완충제, 습윤제 또는 유화제와 같은 보조물질을 포함할 수 있다. 여기에 전체로서 참조로 포함된, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Lippincott Williams & Wilkins; 20th edition (June 1, 2003) and "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Pub. Co.; 18th and 19th editions (December 1985, and June 1990, respectively)와 같은 표준 텍스트는 과도한 실험이 없이도, 적절한 제제의 제조를 위하여 참고될 수 있다. 그러한 제조는 복합 제제, 금속 이온, dextran, hydrogels, polyglycolic acid, polyacetic acid과 같은 중합(polymeric) 화합물 등, 리포좀(liposomes), microemulsions, 미포(micelles), 단층소포, 다층소포, 적혈구 허깨비(erythrocyte ghosts) 또는 spheroblast를 포함한다. 리포좀 제조를 위한 적절한 액체는 monoglycerides, diglycerides, sulfatides, lysoleeithin, phospholipids, saponin, bile acids 등을 포함하나, 이로써 제한되는 것은 아니다. 이러한 추가적 성분의 존재는 물리적 상태, 용해도, 안정성, in vivo에서의 방출 속도 및 in vivo에서 제거되는 속도에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서 의도된 적용에 따라 선택되어, 담체의 특성이 선택된 투약방법에 부가된다.
콘쥬게이트 백신은 바람직하게는 액체 현탁액 또는 동결건조된 산물로 제공된다. 적절한 액체 제제는 예컨대, 선택된 pH로 완충된 점성있는 조성물,에멀젼, 등장성 방수 용액(isotonic aqueous solutions) 또는 현탁액을 포함한다. 경피제제는 로션, 젤, 스프레이, 연고 또는 다른 적절한 기술을 포함한다.비강 또는 호흡(점막)이 바람직한(예컨대 에어로졸,흡입(inhalation) 또는 통기(insufflation) 경우, 조성물은 형태로 되어, 에어로졸 투약기(dispenser), 펌프 투약기, 압축 스프레이 투약기에 의하여 분배된다. 에어로졸은 보통 탄화수소를 수단으로 한 압력 하에서 있다. 펌프 투약기는 바람직하게는 하기와 같이, 특정 입자를 갖는 용양 또는 측정된 양을 분배한다.
용액, 현탁액 및 젤의 형태일 때는, 콘쥬게이트의 제조는 활성 성분에 추가로, 상당한 양의 물(바람직하게는 정제수)를 포함하는 것이 전형적이다. pH 조정제, 유화제, 분산제, 완충제, 보존제, 습윤제, 젤리화제(jelling agent), 색소 등과 같은 다른 성분도 소량 존재할 수 있다.
조성물은 바람직하게는 환자의 혈액 또는 다른 체액과 등장(isotonic)이다. 조성물의 등장성은 sodium tartrate, propylene glycol 또는 다른 무기 또는 유기 용매를 이용하여 얻을 수 있다. Sodium chloride가 특히 바람직하다. 아세트산 및 염, 시트르산 및 염, 붕산 및 염, 인산 및 염과 같은 완충제를 사용할 수 있다. 비경구 매개체(vehicle)는 염화 나트륨 수용액, Ringer's 포도당, 포도당과 염화나트륨, lactated Ringer's 또는 향유(fixed oil)을 포함한다. 정맥내 매개체는 액체 및 영양소 보충물, (Ringer's 포도당에 기초한 것과 같은) 전해질 보충물 등을 포함한다.
조성물의 점성은 약학적으로 적합한 비후제(thickening agent)를 이용한, 선택된 수준으로 유지될 수 있다. 쉽고 경제적으로 이용가능하며, 작업하기 쉽기 때문에 methylcellulose는 바람직하다. 다른 적절한 비후제는, 예컨대, xanthan gum, carboxymethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, carbomer 등을 포함한다. 비후제의 바람직한 농도는 선택된 제제에 의하여 결정된다. 중요한 점은 선택된 점성을 만들 수 있는 양을 사용하여야 한다는 것이다. 점성 조성물은 일반적으로 그러한 그러한 비후제를 용액에 첨가함으로써 제조된다.
약학적으로 적절한 보존제는 조성물의 저장기간을 증가시키기 위하여 사용한다. 예컨대 parabens, thimerosal, chlorobutanol 또는 benzalkonium chloride와 같은 다양한 보존제들도 사용될 수 있지만, benzyl alcohol이 적당할 수 있다. 보존제의 적절한 농도는 선택된 제제에 따라 다양하게 적용될 수 있기는 하지만, 전체 질량의 0.2%부터 2%까지이다.
콘쥬게이트를 폐로 전달(pulmonary delivery)할 수도 있다. 혈관을 따라 위치한 폐 상피를 가로질러 숨을 들이 마쉬고 내쉬는 동안(inhaling and traverses), 콘쥬게이트는 포유류의 폐로 전달된다. 폐로의 전달을 위하여 당업자에게 친숙한, 분무기, 측정된 양의 호흡기 및 분말 호흡기를 포함하는 치료적 제품인 다양한 기계적 장치가 사용될 수 있는데, 이들에 제한되는 것은 아니다. 이러한 장치들은 콘쥬게이트의 분배를 위한, 적합한 제조에 사용된다. 전형적으로 각각의 제조는 사용되는 장치의 종류에 특이적이고, 치료에 유용한 희석제, 아쥬반트 및/또는 담체에 추가로, 적절한 추진(propellant) 물질의 이용을 수반한다.
콘쥬게이트는 폐로의 전달을 위하여 0.1에서 또는 10 또는 그 이상 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 또는 0.9 에서 약 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0 또는 9.5 ㎛의 평균 입자 크기를 갖는 특정 형태로, 폐로의 전달을 위하여 유리하게 제조된다. 콘쥬게이트의 폐로의 전달을 위한, 약학적으로 적합한 담체는 trehalose, mannitol, xylitol, sucrose, lactose 및 sorbitol과 같은 탄수화물을 포함한다. 제조에 이용되는 또다른 성분은 DPPC, DOPE, DSPC 및 DOPC를 포함한다. cyclodextran와 같은 dextran, polyethylene glycol을 포함하는, 천연 또는 합성 계면활성제가 사용될 수 있다. 담즙산염(Bile salt) 및 셀룰로스, 셀룰로스 유도체 및 아미노산뿐 아니라 다른 관련 강화제들도 사용될 수 있다. 리포좀, 미세협막(microcapsule), 미세구(microsphere), 봉입체 복합체(inclusion complex) 및 다른 종류의 담체들도 또한 사용될 수 있다.
분무기,분사기나 초음파와 함께 사용되는데 적합한 제조는 용액의 mL 당 약 0.01 또는 100mg 또는 그 이상 미만의 콘쥬게이트, 바람직하게는 용액의 mL 당 약 0.1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mg에서 약 5, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 또는 90 mg의 콘쥬게이트 농도의 물에 용해되거나 현탁된 콘쥬게이트로 구성되는 것이 정형적이다. 제조는 또한 완충제 및 (예컨대 단백질 안정화 및 삼투압 조절을 위하여) 단순한 당을 포함할 수도 있다 .분무기 제조는 또한 에어로졸을 형성하는데 있어 용액의 원자화(atomization)에 의하여, 표면에 콘쥬게이트가 응집되도록 유도되는 것을 예방하거나 감소시키기 위하여, 계면활성제를 포함할 수도 있다.
측정된 양의 흡입 장치의 이용을 위한 제조는 계면활성제의 도움으로 분사제에서 현탁된 개선된 화합물(inventive compound)을 포함하는, 잘 분쇄된 분말로 구성되는 것이 일반적이다. 분사제는 trichlorofluoromethane, dichlorodifluoronethane, dichlorotetrafluoroethanol 및 1,1,1,2-tetrafluoroethane 및 그것들의 조합과 같은, 탄화수소, chlorofluorocarbon, a hydrochlorofluorocarbons, 및 hydrofluorocarbons과 같은 종래의 분사제를 포함할 수 있다.
적절한 계면활성제는 sorbitan trioleate, 대두 레시틴(soya lecithin) 및 올레산(oleic acid)을 포함한다.
분말 흡입 장치로부터의 투약을 위한 제조는, 장치로부터 정형적으로 제조의 약 1 wt. % 또는 99 wt. % 또는 그 이상의 미만, 바람직하게는 제조의 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 wt.%부터 약 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, or 90 wt.%까지의 분말의 투약을 촉진하는 양의 자이리톨(xylitol), 만니톨, 수크로스, 솔비톨, 락토스와 같은 충전제를 선택적으로 포함하며, 콘쥬게이트를 포함하는 미세하게 분쇄된 건조 분말로 구성되는 것이 전형적이다.
콘쥬게이트가 정맥내,피부, 피하 또는 다른 주입에 의하여 투입될 때, 콘쥬게이트 백신은 바람직하게는 발열원이 없는(pyrogen-free), 비경구에 적절한 수용액의 형태이다. 적합한 pH, 등장, 안정성 등을 갖춘, 비경구적으로 적절한 용액의 제조는 당업계 내의 기술범위 안에 있다. 주입을 위하여 선호되는 약학적 조성물은 바람직하게는 Sodium Chloride Injection, Ringer's Injection, Dextrose injection, Dextrose and Sodium Chloride Injection, Lactated Ringer's Injection 또는 당업계에 알려진 다른 매개체와 같은 등장 매개체를 포함한다. 약학적 조성물은 또한 안정제, 보존제, 완충제, 항산화제 또는 당업계에 알려진 다른 첨가제를 포함할 수 있다.
주입 기간은 다양한 요소에 의존하여 다양하며, 몇 초 또는 그 이하에서의 한 번의 투약된 주입 또는 1,2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19,20,21,22,23 또는 24시간 또는 그 이상 연속된 정맥 투약으로 구성된다.
콘쥬게이트는 국소적으로(topically), 액체 또는 젤을 걸쳐 또는 이식체 또는 장치로, 구조적 또는 국부적(locally)으로 투약될 수 있다.
바람직한 예의 콘쥬게이트 또는 바람직한 예의 콘쥬게이션 방법은, Helicobacterpyloris,Boreliaburgdorferi,Legionellapneumophilia,Mycobacteriasps.(e.g.M.tuberculosis,M.avium,At.intracellulare,M.kansaii,M.gordonae),Staphylococcusaureus,Neisseriagonorrhoeae,Neisseriameningitidis,Listeriamonocytogenes,Streptococcuspyogenes(GroupAStreptococcus),Streptococcusagalaciae(GroupBStreptococcus),Streptococcus(viridansgroup),Streptococcusfaecalis,Streptococcusbovis,Streptococcus(anaerobicsps.),Streptococcuspneumoniae,pathogenicCampylobactersp.,Enterococcussp.,Haemophilusinfluenzae,Bacillusanthracis,Corynebacteriumdiphtheriae,Corynebacteriumsp.,Erysipelothrixrhusiopathiae,Clostridiumperfringers,Clostridiumtetani,Enterobacteraerogenes,Klebsiellapneumoiae,Pasturellamultocida,BacteroidesAt.,Fusobacteriumnucleatum,Streptobacillusmoniliformis,Treponemapallidium,Treponemapertenue,Leptospira 및 Actinomycesisraelli에 의한 감염을 포함하는 다양한 박테리아 감염의 치료용 백신 제조에 유용할 수 있다.
바람직한 예의 특정 방법들은 섬유육종(fibrosarcoma), 점액육종(myxosarcoma), 지방육종(liposarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), osteogenic sarcoma, chordoma, angiosarcoma, endotheliosarcoma, 림프관육종(lymphangiosarcoma), lymphangioendotheliosarcoma, 활막종(synovioma), 중피종(mesothelioma), Ewing's tumor, 평활근육종(leiomyosarcoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 막장암(colon carcinoma), 췌장암(pancreatic cancer), 유방암(breast cancer), 난소암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer), 편평세포암종(squamous cell carcinoma), 기저세포암종(basal cell carcinoma), 샘암종(adenocarcinoma), 한선암(sweat gland carcinoma), sebaceous gland carcinoma, 유두암종(papillary carcinoma), 유두모양샘암(papillary adenocarcinomas), 낭샘암종(cystadenocarcinoma), 수질암종(medullary carcinoma), 기관지원성암종(bronchogenic carcinoma), 콩팥세포암종(renal cell carcinoma), 간암(hepatoma), 쓸개관암(bile duct carcinoma), 융모막암종(choriocarcinoma), serminoma, 배아암종(embryonal carcinoma), Wilms' tumor, 자궁경부암, 고환암(testicular tumor), 폐암(lung carcinoma), small cell lung carcinoma, 방광암종(bladder carcinoma), epithelial carcinoma, 신경아교종(glioma), 별아교세포종(astrocytoma), 속질모세포종(medulloblastoma), 머리인두종(craniopharyngioma), 뇌실막세포종(ependymoma), 송과체종(pinealoma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), acoustic neuron, 희소돌기아교세포종(oligodendroglioma), 수막종(meningioma), 흑색종(melanoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 망막모세포종(retinoblastoma); 급성 림프구성 백혈병 및 급성 골수구성 백혈병(골수모구(myeloblastic), 전골수구(promyelocytic), 골수단핵구(myelomonocytic), 단구성(monocytic) 백혈병 및 적백혈병(erythroleukemia))과 같은 백혈병; 만성백혈병 (만성 골수성(chronic myelocytic (골수(granulocytic)))백혈병 및 chronic Iymphocytic leukemia); 및 polycythemia Vera, 림프종(lymphoma) (Hodgkin's disease 및 non-Hodgkin's disease), 다발골수종(multiple myeloma), Waldenstrom's macroglobulinemia, 및 중고리병(heavy chain disease), autoimmune lymphoproliferative syndrome (ALPS)을 포함하는 림프세포증식질환(lymphoproliferative disorders), 만성 림프모구백혈병(chronic lymphoblastic leukemia), 털세포 백혈병(hairy cell leukemia), 만성 림프모구 백혈병(chronic lymphatic leukemia), peripheral T-cell Iymphoma, 소림프구 림프종(small lymphocytic lymphoma), mantle cell lymphoma, 소포림프종(follicular lymphoma), Burkitt's lymphoma, Epstein-Barr virus-positive T cell lymphoma, 조직구 림프종(histiocytic lymphoma), Hodgkin's disease, diffuse aggressive lymphoma, acute lymphatic leukemias, T gamma lyrnphoproliferative disease, 피부 B 세포 림프종(cutaneous B cell lymphoma), 피부 T 세포 림프종(cutaneous T cell Iymphoma (예컨대 균상식육종(mycosis fungoides))) 및 Szary syndrome과 같은 암 및 포유류 육종과 같은 암에 대하여 개체를 면역화하거나 치료하는 백신 제조에 유용할 수 있다..
콘쥬게이트는 인간 또는 인간이 아닌 개체에 대하여, 현재 사용되거나 개발중이 다양한 백신과 복합하여 투약될 수 있다. 인간 개체를 위한, 감염성 질병에 대한 백신들의 예는 복합된 디프테리아 및 파상풍 변성독소 백신; 백일해 whole cell 백신; 불활성화된 인플루엔자 백신; the 23-valent pneumococcal 백신; 생(live) 풍진(measles) 백신; 생 볼거리 백신; 생 풍진(rubella) 백신; Bacille Calmette- Guerin I (BCG) 풍진(rubella) 백신; 간염(hepatitis) A 백신; 간염 B 백신; 간염 C 백신; 광견병(rabies) 백신 (예를 들어 human diploid cell 백신);불활성화된 polio 백신; 수막구균 다당류(meningococcal polysaccharide) 백신; 사가(quadrivalent) 수막구균 콘쥬게이트 백신; 황열병 생바이러스백신; typhoid killed whole cell 백신; 콜레라 백신; Japanese B encephalitis killed virus 백신; adenovirus 백신; cytomegalovirus 백신; rotavirus 백신; 수두(varicella) 백신; 탄저병(anthrax) 백신; 천연두(small pox) 백신;및 다른 상업적으로 이용가능하고 시험적인 백신을 포함한다.
콘쥬게이트는 키트의 형태로, 투약하는(administering) 내과의사 또는 다른 건강 관리 전문가에게 제공된다. 키트는 콘쥬게이트 백신을 포함하는 용기(container) 및 콘쥬게이트 백신의 개체로의 투약을 위한 지시서가 들어있는 패키지이다. 또한 키트는 선택적으로 하나 또는 그 이상의 다른 치료적 제제를 포함할 수 있다. 키트는 선택적으로 하나 또는 그 이상의 진단용 도구(tool) 및 그 사용 지시서를 포함할 수 있다.예컨대, 둘 또는 그 이상의 백신을 포함하는 백신 칵테일이 포함될 수 있고, 또는 다른 백신을 포함하는 분리된 약학적 조성물 또는 치료적 제제. 키트는 또한 연속적(serial) 또는 순차적(sequential)인 투약을 위하여 용량이 분리된 콘쥬게이트 백신을 포함할 수도 있다. 키트는 치료적 제제의 투약을 위한 지시서와 함께 적절한 운반 장치, 예컨대 주사기(syringe), 흡입 장치 등을 포함할 수 있다. 키트는 포함된 모든 치료적 제제의 모두 또는 일부의 투약, 보관 및 (만약 적용될 수 있다면) 재구성(reconstitution)을 위한 지시서를 선택적으로 포함할 수 있다. 키트는 개체에 주어진 투약량을 반영하는 복수의 용기를 포함할 수 있다. 만약 키트가 첫 번째 및 두 번째 용기를 포함하는 경우, 이것들은 충분한 양이 존재할 수 있다.
도 1. 다양한 EDC 농도와 반응 시간으로 촉매된 아디픽산 디하이드라진(adipic acid dihydrazide (ADH)) 또는 하이드라진을 가한 파상풍 변성독소 활성화 산물(tetanus toxoid activation product (TTH))의 HPLC 프로파일(profiles)(수크로스 6 칼럼(column)에 의한 280nm). 반응 조건은: (A) 4시간 동안 하이드라진, 24 mM EDC; (B) 밤새 하이드라진, 12 mM EDC; (C) 4시간 동안 ADH, 36 mM EDC; (D) 2시간 동안 ADH, 48 mM EDC이다. 프로파일 (A)에서는 산물이 칼럼을 통과하기에 분자량이 너무 많아 TTH 신호가 나타나지 않았다. 프로파일 (B)에서는, 산물의 작운 조각만이 칼럼을 통과하였으며 34분에 TTH의 섀도우 피크(shadow peak)가 관찰되었다. 프로파일 (C) 및 (D)에서, 반응 산물은 칼럼을 통과하였으며 34분에 TTH 피크가 관찰되었다.
도 2 서로 다른 라이신 농도 및 반응 시간의 조건 하, 다양한 EDC 농도로 촉매된 아디픽산 디하이드라자이드(ADH) 및 하이드라진을 가한 파상풍 변성 독소 활성화 산물(TTH)의 HPLC 프로파일(수크로스 6 칼럼에 의한 280 nm). 반응 조건은 (A) 2 시간 동안 하이드라진, 24 mM EDC, 36 mM 라이신; (B) 2 시간 동안 하이드라진, 12 mM EDC, 144 mM 라이신; (C) 1 시간 동안 ADH, 12 mM EDC, 36 mM 라이신; and (D) 4 시간 동안 ADH, 12 mM EDC, 72 mM 라이신이다. 프로파일 (A)에서는 산물의 작은 조각 만이 칼럼을 통과하여 34 분에 섀도우 피크가 관찰되었다. 프로파일 (B), (C) 및 (D)에서는 산물이 럼을 통과하여 34 분에 모노머(monomer)의 주요 피크(major peak)가 관찰되고 31분에 다이머(dimmer)의 비(非)주요(minor) 피크가 관찰되었다.
도 3. 다양한 반응 시간 동안 72mM 글루탐산의 존재 하 다양한 EDC 농도로 촉매화된, 아디픽산 디하이드라자이드 (ADH) 또는 하이드라진이 가해진 파상풍 변성독소 활성화 산물 (TTH)의 HPLC 프로파일 (수크로스 6 칼럼에 의한 280 nm). 다른 반응 조건은 (A) 1시간 동안의 하이드라진, 24 mM EDC; (B) 1시간 동안 하이드라진, 48 mM EDC; (C) 1 시간 동안 ADH, 24 mM EDC; 및 (D) 2 시간 동안 ADH, 48 mM EDC이다. 그 산물은 칼럼을 통과하고 34분에 모노머의 주요 피크가 관찰되며 31분에 다이머의 비주요 피크가 관찰된다.
도 4. (A) 활성화된 파상풍 변성독소 (TTH) 및 (B) 콘쥬게이션 방법 A에 의하여 제조된, 화합된 합성된 다가 다당류-파상풍 변성 독소 콘쥬게이트(Conj)의 HPLC 프로파일 (Waters Ultrahydrogel Linear 칼럼에 의한 280 nm). 단백질 신호가, 활성화된 다당류 혼합물에 콘쥬게이션되어, 저분자량(17.5분)에서 고분자 량(13.5분)으로 이동(shift)하였다.
도 5. 도 4.의 (B)의 화합된 합성 다가 콘쥬게이트 백신에 포함된 콘쥬게이트된 구성성분 다당류의 ELISA 분석. HPLC 조각들 중 단백질-포함한 종류(예컨대 콘쥬게이트와 자유 TTH)만이 코팅 동안 ELISA 플레이트(plate)에 붙었다. 그 후, 파상풍 변성 독소와 교차-반응하지 않고 각각의 PS에 특이적인 항혈청(antisera)로 콘쥬게이트된 다당류를 검출한다.
12-15분 모든 다당류에 대하여 도 4의 (B)의 중첩된 단백질 신호(superimposing the protein signal)인 주요 피크가 검출되었다.
도 6. (A) 활성화된 파상풍 변성독소 (TTH) 및
(B)콘쥬게이션 방법 B에 의하여 제조된 화합 합성 다가 다당류-파상풍 변성 독소 콘쥬게이트(Conj)의 HPLC 프로파일 (Waters Ultrahydrogel Linear 칼럼에 의한 280 nm). 단백질 신호가, 활성화된 다당류 혼합물에 콘쥬게이션되어, 저분자량(17.5분)에서 고분자량(13.5분)으로 이동(shift)하였다. 산물 혼합물에는 콘쥬게이트되지 않은 자유 TTH가 어느 정도 남겨져 있었다.
도 7. 도 6.의 (B)의 화합된 합성 다가 콘쥬게이트 백신의 콘쥬게이트된 구성성분 다당류의 ELISA 분석. HPLC 조각들 중 단백질-포함한 종류(예컨대 콘쥬게이트와 자유 TTH)만이 코팅 동안 ELISA 플레이트(plate)에 붙었으며, 그 후, 파상 풍 변성 독소와 교차-반응하지 않고 각각의 PS에 특이적인 항혈청(antisera)로 콘쥬게이트된 다당류를 검출한다. 12-15분 모든 4개 다당류에 대하여 도 6의 (B)의 중첩된 단백질 신호(superimposing the protein signal)인 주요 피크가 검출되었다.
도 8. (A) 활성화된 파상풍 변성독소 (TTH) 및 (C)콘쥬게이션 방법 B에 의하여 제조된 화합 합성 다가 다당류-파상풍 변성 독소 콘쥬게이트(Conj)의 HPLC 프로파일 (Waters Ultrahydrogel Linear 칼럼에 의한 280 nm). 단백질 신호가, 활성화된 다당류 혼합물에 콘쥬게이션되어, 저분자량(17.5분)에서 고분자량(13.5분)으로 이동(shift)하였다. 산물 혼합물에는 콘쥬게이트되지 않은 자유 TTH가 어느 정도 남겨져 있었다.
도 9. 도 8.의 (B)의 화합된 합성 다가 콘쥬게이트 백신의 콘쥬게이트된 구성성분 다당류의 ELISA 분석. HPLC 조각들 중 단백질-포함한 종류(예컨대 콘쥬게이트와 자유 TTH)만이 코팅 동안 ELISA 플레이트(plate)에 붙었으며, 그 후, 파상풍 변성 독소와 교차-반응하지 않고 각각의 PS에 특이적인 항혈청(antisera)로 콘쥬게이트된 다당류를 검출한다. 12-15분 모든 4개 다당류에 대하여 도 8의 (B)의 중첩된 단백질 신호(superimposing the protein signal)인 주요 피크가 검출되었다.
도 10. (A) 활성화된 파상풍 변성독소 (TTH) 및 (B)콘쥬게이션 방법 A에 의하여 제조된 화합 합성 다가 다당류-파상풍 변성 독소 콘쥬게이트(Conj)의 HPLC 프로파일 (Waters Ultrahydrogel Linear 칼럼에 의한 280 nm). 단백질 신호가, 활성화된 다당류 혼합물에 콘쥬게이션되어, 저분자량(17.5분)에서 고분자량(13.5분)으로 이동(shift)하였다.
도 11. 도 10.의 (B)의 화합된 합성 다가 콘쥬게이트 백신의 콘쥬게이트된 구성성분 다당류의 ELISA 분석. HPLC 조각들 중 단백질-포함한 종류(예컨대 콘쥬게이트와 자유 TTH)만이 코팅 동안 ELISA 플레이트(plate)에 붙었으며, 그 후, 파상풍 변성 독소와 교차-반응하지 않고 각각의 PS에 특이적인 항혈청(antisera)로 콘쥬게이트된 다당류를 검출한다. 12-19분 모든 4개 다당류에 대하여 높은 ELISA 신호가 검출되었다. 15-19분의 높은 ELSA 신호가 작은 분자량의 잔여 콘쥬게이트때문인 것에 반하여 12-15분에 높은 ELISA 신호가 도 10의 (B)의 단백질 신호에 중첩되었다.
도 12. (A) 활성화된 파상풍 변성독소 (TTH) 및 (B)콘쥬게이션 방법 B에 의하여 제조된 화합 합성 다가 다당류-파상풍 변성 독소 콘쥬게이트(Conj)의 HPLC 프로파일 (Waters Ultrahydrogel Linear 칼럼에 의한 280 nm). 단백질 신호가, 활성화된 다당류 혼합물에 콘쥬게이션되어, 저분자량(17.5분)에서 고분자량(13.5분)으로 이동(shift)하였다. 산물 혼합물에는 콘쥬게이트되지 않은 자유 TTH가 상당 량(substantial) 남아 있었다.
도 13. 도 12.의 (B)의 화합된 합성 다가 콘쥬게이트 백신의 콘쥬게이트된 구성성분 다당류의 ELISA 분석. HPLC 조각들 중 단백질-포함한 종류(예컨대 콘쥬게이트와 자유 TTH)만이 코팅 동안 ELISA 플레이트(plate)에 붙었으며, 그 후, 파상풍 변성 독소와 교차-반응하지 않고 각각의 PS에 특이적인 항혈청(antisera)로 콘쥬게이트된 다당류를 검출했다. 12-18분 모든 4개 다당류에 대하여 높은 ELISA 신호가 검출되었다. 15-18분의 높은 ELSA 신호가 작은 분자량의 잔여 콘쥬게이트 때문인 것에 반하여 12-15분에 높은 ELISA 신호가 도 12의 (B)의 단백질 신호에 중첩되었다.
도 14 롯(lot) TTHACWY061126의 화합 합성 다가 콘쥬게이트 백신의 콘쥬게이트된 구성성분 다당류의 ELSA 검출. 단백질(파상풍 변성독소)0.05 mg/mL를 포함하는 25 uL 콘쥬게이트 샘플 및 각각 0.0125 mg/mL의 Mn A, C, W135 및 Y PS 를 HPLC로 분석하였다. HPLC 조각들 중 단백질-포함한 종류(예컨대 콘쥬게이트와 자유 TTH)만이 코팅 동안 ELISA 플레이트(plate)에 붙었으며, 그 후, 파상풍 변성 독소와 교차-반응하지 않고(solid symbols)각각의 PS에 특이적인 항혈청(antisera)로 콘쥬게이트된 다당류를 검출했다. Mn A, W135 및 Y PS가 콘쥬게이트로 상당부분 편입(incorporation)된 것이, 각각의 ELISA 신호를 약한 ELISA 신호의 Mn C PS와 비교하여 확인되었다. 이는 활성화된 Mn A, W135 및 Y PS와 비교하여 TTH에 콘쥬게이 트된, 활성화된 Mn C PS의 약한 반응성 때문이다. 이 관찰은 Mn C에 있어 낮은 효능(efficacy)을 보인, 콘쥬게이트의 면역원성 데이터와 일치하는 것이다. 원래 다당류 혼합물의 샘플 또한 동시에 분석하였다(open symbols). 이 ELISA 검출에서 원래 Mn A PS만이 콘쥬게이트와 비교하여 약한 신호를 보였다.
도 15. 롯(lot) TTH2C/A/WY070209의 화합 합성 다가 콘쥬게이트 백신의 콘쥬게이트된 구성성분 다당류의 ELSA 검출. 단백질(파상풍 변성독소)0.05 mg/mL를 포함하는 25 uL 콘쥬게이트 샘플 및 각각 0.0125 mg/mL의 Mn A, C, W135 및 Y PS 를 HPLC로 분석하였다. HPLC 조각들 중 단백질-포함한 종류(예컨대 콘쥬게이트와 자유 TTH)만이 코팅 동안 ELISA 플레이트(plate)에 붙었으며, 그 후, 파상풍 변성 독소와 교차-반응하지 않고(solid symbols)각각의 PS에 특이적인 항혈청(antisera)로 콘쥬게이트된 다당류를 검출했다. 원래 다당류 혼합물 샘플 또한 동시에 분석하였다(open symbls). 모든 4개 PS 상당량이 콘쥬게이트로 편입(incorporation)되는 것이 원래 PS와 비교한 각각의 ELISA 신호에 의하여 확인되었다. 도 14에 나타난 TTH에 콘쥬게이트된 활성화된 Mn C PS의 약한 반응성은, 활성화된 Mn A, W 135 및 Y PS와의 반응에 우선하여, TTH에의 초기 노출 및 높은 투약량으로 보상된다(이 경우 두 배).
실시예-물질 및 방법
물질- 파상풍 변성독소(Tetanus toxoid) (TT) 는 Lederle Vaccines, Pearl River, NY and Serum Institute of India, Pune, India에서 수득하였다. 수막구균 그룹 A 및 C 다당류 (각각 Mn A PS 및 Mn C PS)는 Bio-Manguinhos, Rio de Janeiro, Brazil에서 수득하였다. Mn A PS SynCo Bio Partners, Amsterdam, The Netherlands로부터 수득하였다. Mn W135 및 Y PS’s는 Aventis Pasteur and Chiron로부터 수득하였다. Hydrazine, carbohydrazide, adipic acid dihydrazide (ADH), acetic hydrazide, 1-[3-(dimethylamino) propyl]-3-ethyl carbodiimide hydrochloride (EDC), N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N’-(2-ethanesulfonic acid) (HEPES), sodium periodate, sodium borohydride, sodium cynoborohydride, 4-cyno-dimethylamino pyridium tetrafluoroborate (CDAP), 및 1-amino-2, 3-propanediol 및 다양한 아미노산들은 Sigma/Aldrich Chemical Company에서 구입하였다. TNBSA (2, 4, 6-trinitrobenzenesulfonic acid) 및 BCA (bicinchoninic acid) assay kits는 Pierce로부터 구입하였다.
방법- 전술한 바와 같이 여기에는 아미노산, 아미노산 혼합물, 펩타이드 및 펩타이드 혼합물의 존재 하, 카보디이미드에 의하여 촉매된 단백질의 하이드라자이드 그룹과의 활성화 방법 및 다당류 또는 다당류 혼합물을 단백질에 콘쥬게이트 하는 일반적인 세 가지 방법이 기재되어 있다. 이러한 방법에 의하여 단백질에의 콘쥬게이션 에 사용되는 박테리아 다당류는 수막구균 혈청군 A, C, W135 및 Y 다당류를 포함한다.
아미노산, 아미노산 혼합물, 펩타이드 및 펩타이드 혼합물의 존재 하, 카보디이미드에 의하여 촉매된 단백질의 하이드라자이드 그룹과의 활성화
1. 단백질 (Lowry assay [26] or BCA assay [35]에 의하여 측정된, 파상풍 변성 독소 TT, 4 mg/mL, )이 0.36 M 하이드라진 또는 adipic acid dihydrazide (ADH)과, 12-72 mM EDC, 0.2 M MES 존재 하, pH 5-6.5 및 0-144 mM 아미노산 또는 아미노산 혼합물 존재 하 1-24 시간동안 반응 한다. .
2. 반응 혼합물은 1 N NaOH로 중성화되고 30 mM NaCl, 10 mM HEPES에 대하여, pH 7.5, 4oC에서 투석된다.
3. 투석 후, 샘플은 침전물 형성을 위하여 기록(record)된다.
4. 샘플은 4oC에서 1-8주 동안 저장되며, 침전물 형성이 시험되고 기록된다.
5. 침전물이 없거나 거의 없는 샘플은 Superose 6 칼럼을 가한 HPLC로 분석된다.
6. 단백질 농도는 BCA assay [35]로 확인되고, 하이드라자이드 농도는 TNBS assay [34]로 확인된다. TT 분자 당 하이드라자이드 그룹의 수, 예컨대 활성 화 정도(degree of activation (DA))가 계산된다.
하이드라자이드에 의하여 활성화된 단백질과 반응하는, 알데하이드에 의하여 활성화된 PS 또는 PS 혼합물의 콘쥬게이션을 위한 일반적인 방법 A (환원적 아민화 콘쥬게이션)
1. 파상풍 변성독소를 활성화하는데 두 가지 방법이 사용되었다. 파상풍 변성독소는 하이드라진 또는 아디픽산 디하이드라자이드와, EDC의 조건 하 pH 5.5-6.5에서 활성화되었고, 그 후 pH 약 10.5에서 30 mM NaCl, 3 mM Na2CO3,와 완충용액이 교환되었다. 대체하여 파상풍 변성독소는 하이드라진 또는 아디픽산 디하이드라자이드와, EDC 및 0-155mM 아미노산 또는 아미노산 혼합물의 조건 하 pH 5.5에 활성화되었고, 그 후 pH 약 7.5, 4o C에서 30 mM NaCl, 10 mM HEPES와 완충용액이 교환되었다.
2.다당류 또는 (구성요소 다당류의 바람직한 질량 비율의) 다당류의 혼합물이 NaIO4와 활성화되었으며, pH 7.5, 4o C에서 10 mM HEPES와 완충용액 교환되었다.
3. 하이드라자이드에 의하여 활성화된 TT 는 알데하이드에 의하여 활성화된 다당류 또는 다당류 혼합물과 2:1부터 1:2까지의 비율로, 그리고 pH 6.5-7.5, 4-40oC 조건 하, 1-40 mg/mL 의 농도 범위에서 밤새 반응하였다.
4. 그 후 NaBH4 (최초 반응물의 알데하이드 그룹의 10-배(ten-fold) 몰(moles)) 이 C=N 이중결합을 C-N 단일결합으로 환원시키고, 또한 반응하지 않은 알데하이드 그룹을 알콜로 환원시키기 위하여 6시간에서 밤새 가해졌다.
5. 수용액은 12-14 KDa 분자량의 얇게 썬(cut-off) 막을 이용한 1mM EDTA, 10mM HEPES, pH 7.5에서 식염수와 완충용액이 교환되었다.
6. The volume of the sample was determined.
7. Lowry assay [26] or BCA assay [35]에 의하여 측정된 최초 시작 양에 기초하여 단백질 농도가 계산되었다.
8. 혼합 전, 예컨대 Mn A and C PS’s를 위한 resorcinol assay [27], Mn W135 and Y PS’s를 위한 anthrone assay [32], Mn A PS를 위한 phosphorus assay [33], 및 Mn W135 및 Y PS’을 위한 purpald assay [31] s와 같은, 각각의 구성요소 다당류의 적절한 분석방법에 의한 최초 시작량에 기초하여 다당류 농도가 계산되었다.
하이드라자이드에 의하여 활성화된 단백질과 반응하는, 시안산염에 의하여 활성화된 PS 또는 PS 혼합물의 콘쥬게이션을 위한 일반적인 방법 B (시안화 콘쥬게이션)
1. 파상풍 변성독소를 활성화하는데 두 가지 방법이 사용되었다. 변성독 소는 pH5.5-6.5에서 EDC 조건하, 하이드라진 또는 아디픽산 디하이드라자이드와 활성화되고, pH 약 10.5에서 30 mM NaCl, 3 mM Na2CO3과 완충용액 교환되었다.
대체적으로 파상풍 변성독소는 pH 5.5 및 0-144 mM 아미노산 또는 아미노산 혼합물 조건 하, EDC의 존재 하, 하이드라진 또는 아디픽산 디하이드라자이드와 활성화되어, pH 7.5, 4o C에서 30 mM NaCl, 10 mM HEPES로 완충용액 교환된다.
2. 다당류 또는 (구성요소 다당류의 바람직한 질량 비율의) 다당류의 혼합물이 triethylamine의 존재 하 20-24oC에서, 2-2.5 분 동안 CDAP와 활성화되었다.
3. 4oC에서, 하이드라자이드에 의하여 활성화된 TT은 pH 6.5-7.5, 0.2-1 mg/mL 농도 범위의, 2:1에서 1:2까지의 비율의 시안산염에 의하여 활성화된 다당류 또는 다당류 혼합물과 반응하였다.
4. 4oC에서 3일 밤새 반응한 후, (잔여의 남은 반응하지 않은 시안산염 그룹의 분해를 확실히 하기 위하여 배양을 연장한다), 12-14 KDa 분자량의 얇게 잘린(cut-off) 막을 이용한 1mM EDTA, pH 7.5, 10mM HEPES, 식염수로 용액은 완충용액이 교환된다.
5. 샘플의 부피를 확인하였다.
6. Lowry assay [26] or BCA assay [35]에 의하여 측정된 최초 시작량에 기초하여 단백질 농도가 계산되었다.
7. 혼합 전, 예컨대 Mn W135 및 Y PS’s를 위한 purpald assay [31], Mn A PS를 위한 phosphorus assay [33], Mn W135 및 Y PS’s를 위한 anthrone assay [32], Mn A and C PS’s를 위한 resorcinol assay [27]과 같은, 각각의 성분요소 다당류의 적절한 분석방법에 의하여 측정된 최초 시작량에 기초하여 다당류 농도가 계산되었다.
방해제의 이용 없이, 화합된 합성 다가 콘쥬게이트 백신을 제조하기 위한, 제조방법 B의 콘쥬게이션 반응시간은 4oC에서 3일 밤이다. 콘쥬게이션 산물의 높은 면역원성 및 높은 콘쥬게이션 수율 때문에, 콘쥬게이트되지 않은 다당류로터 콘쥬게이트의 칼럼 크로마토그래피 및/또는 ammonium sulfate 침전과 같은 정제 공정이 필요하다.
알데하이드에 의하여 활성화된 단백질과 반응하는, 하이드라자이드에 의하여 활성화된 PS 또는 PS 혼합물의 콘쥬게이션을 위한 일반적인 방법 C (환원적 아민화 콘쥬게이션)
1. 파상풍 변성독소를 활성화하는데 두 가지 방법이 사용되었다. 파상풍 변성독소는 pH 5.5-6.5에서 EDC 존재하, 1-amino-2, 3-propanediol (APDO)과 반응하여, pH 약 10.5, 4oC에서 30 mM NaCl, 3 mM Na2CO3과 완충용액 교환되었다. TT- APDO는 NaIO4 과 반응하여 알데하이드 그룹을 만들고, pH 약 10.5, 4oC에서 30 mM NaCl, 3 mM Na2CO3와 완충용액 교환되었다. 대체적으로, 파상풍 변성 독소는 pH 5.5-6.5 및 0-144 아미노산 또는 아미노산 혼합물에서 EDC 존재 하, 1-amino-2,3-propanediol (APDO) in the presence of EDC과 반응하고, pH 7.5, 4o C에서 30 mM NaCl, 10 mM HEPES과 완충용액 교환된다. TT-APDO는 NaIO4 과 반응하여 알데하이드 그룹을 만들고, pH 7.5, 4o C에서 30 mM NaCl, 10 mM HEPES와 완충용액 교환된다. 2. 하이드라자이드에 의하여 활성화된 다당류 또는 (구성성분인 다당류가 바람직한 질량비인) 다당류 혼합물을 제조하는데 세 가지 방법이 사용되었다 : a) PS 또는 PS 혼합물이 NaIO4와 반응하고, 그후 하이드라진 또는 아디픽산 디하이드라자이드와 NaBH4와 환원하는 반응하였다(환원적 아민화);
b) PS 또는 PS는 CDAP와 반응하고, 그후 하이드라진 또는 아디픽산 디하이드라자이드와 반응하였다 (시안화 콘쥬게이션 반응);및
c) EDC 존재 하, PS 또는 PS 혼합물이 하이드라진 또는 아디픽산 디하이드라자이드와 반응하였다(카보디이미드 반응).
3. 알데하이드에 의하여 활성화된 TT는 pH 6.5-7.5, 4-40oC에서 2:1에서 1:2의 비율 및 1-5 mg/mLwas 농도 범위의 하이드라자이드에 의하여 활성화된 PS 또는 PS 혼합물과 반응하였다.
4. 그 후 NaBH4 (최초 반응물의 알데하이드 그룹의 10-배(ten-fold) 몰(moles)) 이 C=N 이중결합을 C-N 단일결합으로 환원시키고, 또한 반응하지 않은 알데하이드 그룹을 알콜로 환원시키기 위하여 6시간에서 밤새 가해졌다.
5. 12-14 KDa 분자량의 얇게 잘린(cut-off) 막을 이용한 1mM EDTA, pH 7.5, 10mM HEPES, 식염수로 용액은 완충용액이 교환된다.
6. 샘플의 부피를 확인하였다.
7. Lowry assay [26] 또는 BCA assay [35]에 의하여 측정된 최초 시작량에 기초하여 단백질 농도가 계산되었다.
8. 혼합 전, 예컨대 Mn W135 및 Y PS’s를 위한 purpald assay [31], Mn A PS를 위한 phosphorus assay [33], Mn W135 및 Y PS’s를 위한 anthrone assay [32], Mn A and C PS’s를 위한 resorcinol assay [27]과 같은, 각각의 성분요소 다당류의 적절한 분석방법에 의하여 측정된 최초 시작량에 기초하여 다당류 농도가 계산되었다.
활성화된 단백질 및 콘쥬게이트 산물들의 물리-화학적 분석
High performance liquid size-exclusion chromatography (HPSEC)
단백질, 다당류 및 콘쥬게이트 산물 샘플(25 uL, 0.05-1 mg/mL)을, 280 nm의 UV 검출기(detector) 및 Chromelean 소프트웨어를 이용하는 Dionex HPLC 시스템에서 0.5 mL/minute의 EDTA 1mM, 10 mM의 Tris 및 식염수와 수크로스 6 칼럼 또는 Ultrahydrogel Linear 칼럼 또는 Waters Ultrahydrogel 2000을 통과시켰다. 280 nm에서 UV 검출기는 방향족 모이에티(aromatic moieties)를 포함하는 화합물을 비롯하여 단백질-포함 종류들의 신호를 모니터한다. RI 검출기는 단백질, 다당류, 콘쥬게이트 및 염의 신호를 측정한다. 복합 합성된 다가 콘쥬게이트 백신이 HPLC로 분석될 때, ELISA에 의하여 다당류-단백질 콘쥬게이트 검출을 위하여 매 분마다 분획(fractions)이 수집된다.
PS-단백질 콘쥬게이트 검출을 위한 ELISA 방법
80 uL 1x PBS이 가해진, 각각의 HPLC 분획 20 uL으로(코팅 용액의 전체 부피는 100 임), Immunolon 1 플레이트(plates) (Dynatech)를 3시간 동안 코팅하였다. 오직 단백질-포함 분자 종류만이(예컨대 콘쥬게이트 및 콘쥬게이트되지 않은 자유 단백질) 다당류 플레이트에 부착한다. 150 uL 와싱 버퍼(washing buffer (0.05% Tween 20, 0.02% NaN3를 포함하는 PB ))로 3회 세척한 후, 100 uL 각각의 PS-특이적인(그러나 담체 단백질에 교차-반응성이 있지는 않은) 항-혈청(PBS, 5% new born calf serum, 0.02% NaN3, PBS를 포함하는 완충용액으로 희석됨 1/100 -1/250) 이 각각의 웰(well)에 가해졌다. 밤새 배양한 후, 플레이트는 3회 세척되고, 알칼리성 인산염(희석 완충용액에서 1/10,000로 희석)과 콘쥬게이트된, 염소 항-마우스 IgG Fc 100 uL와 함께 3시간 동안 배양되었다. 세척(3 x 150 uL)) 후, 플레이트는 p-nitrophenyl phosphate (1 mg/mL in 1 M Tris, pH 9.8, 0.3 mM MgCl2) 100 uL과 30-180분간 배양되고, 405 nm에서 판독하는(reading) ELISA가 플레이트 판독기(reader)로 측정되었다. 바탕(background)을 제거한 후, 콘쥬게이트되지 않은 자유 PS는 플레이트 코팅 동안 플레이트에 부착(stick)하거나 붙지(adhere) 않기 때문에, 각각의 분획에서 콘쥬게이트된 분획을 나타내는 리딩(reading). 이로써 복합 합성 다가 콘쥬게이트 백신 내 모든 다당류 종류 구성요소의 존재가 증명된다.
마우스에서 다당류 단백질-콘쥬게이트의 면역원성
마우스의 면역화(Immunization)
일일이 열거하지 않은, 마우스 (NIH-Swiss; 5 또는 10 그룹)가, 42일에 수집된 항혈청(antisera)과 0, 14 및 28일에, (콘쥬게이션 방법 A, B 및 C로 제조된 콘쥬게이션 또는 PS 혼합물 내의) 각각의 다당류 1 ug/dose로 면역화되었다. 각각의 원래 다당류에 대항한 항체 수준을 확인하기 위하여 ELISA를 수행하였다.
항체가(antibody titer)의 확인을 위한 ELISA 방법
(Mn A, C, W135 또는 Y를 위한 5 ug/mL의) 다당류를 포함하는 코팅 용액 100 uL로, Immunolon 1 플레이트 (Dynatech)가 18시간동안 코팅되었다. 와싱 버퍼(0.05% Tween 20, 0.02% NaN3를 가한 PBS) 150uL로 세 번 세척한 후, 1/200에서 시작하여, 2-배 희석을 연속한 (diluted with dilution buffer containing PBS, 4% new born calf serum, 0.02% NaN3 with 2 ug/mL cell wall polysaccharide in pneumococcal cases) 참고혈청(reference serum)(부작위적으로 할당한(rbitrarily assigned) 항-다당류 항체:duplicate 3200 units/mL) 및 특이적인 항-혈청 샘플 100 uL를 각각의 웰에 가하였다. 밤새 배양한 후, 플레이트는 3회 세척되고, 알칼리성 인산염(희석 완충용액에서 1/10,000로 희석)과 콘쥬게이트된, 염소 항-마우스 IgG Fc 100 uL와 함께 2시간 동안 배양되었다. 세척(3 x 150 uL) 후, 플레이트는 p-nitrophenyl phosphate (1 mg/mL in 1 M Tris, pH 9, 0.3 mM MgCl2) 100 uL과 30-45분간 배양되고, 반응은 1 N NaOH 50 uL에서 정지되었다. ELISA 판독은 450nm에서 플레이트 판독기로 측정되며, 동일한 플레이트에서 함께 분석된(채-assayed) 참고 혈청의 표준 곡선 및 그것들의 ELISA 판독으로부터 항혈청 샘플의 항-다당류 항체 수준이 계산되었다. 각각의 마우스 그룹의 항체 수준의 기하학적 평균이 계산되었다.
항체(살균가((Bactericidal titer))의 생물학적 기능성의 확인을 위한 살균 분석
[ Maslanka SE, Gheesling LL, Libutti DE, Donaldson KB, Harakeh HS, Dykes JK et al. Standardization and a multilaboratory comparison of Neisseria meningitidisserogroup A and C serum bactericidal assays. The Multilaboratory Study Group. Clin Diagn Lab Immunol 1997; 4(2):156-167.]을 약간 변형한 방법에 따른, 상동적인 박테리아 균주에 대항하는 유도된 항체의 생물학적 활성은, 유도된 항혈청의 살균 분석에 의하여 확인된다. 요약하면, 박테리아는 먼저 뇌심장침출배지(brain heart infusion (BHI))/정상 말 혈청(normal horse serum (NHS)) 5% 플레이트에서 밤새 배양되었으며, 그후, 신선한 플레이트로 옮겨져, 4-5 시간동안 배양되었다. 신선한 4-5 시간 배지로부터, DPBS 530nm에서 80% 투과율인 박테리아 현탁액을 제조하고, 그것을 50-80 colony-forming unit (CFU)/25 uL로, DPBS로(대략 1:50,000 희석) 희석한다. 박테리아 희석을 준비하는 동안, 보체(complement)를 실온으로 녹인(thaw) 후, 사용할 때까지 얼음에서 보관한다. 96-웰 조직 배양 플레이트에서, 시험용 2-배 희석 시리즈 및 대조군 샘플이 0.5 mM MgCl2 및 0.9 mM CaCl2을 포함하는 DPBS로 수행되었다. 각각의 웰에 25 uL 박테리아 현탁액을 가한 후, 25 uL 보체를 가하였다(Lot # 34426-A, Pel-Freez, Rogers, Aakansas). CO2 없이, 37oC에서 30분간, 배양한 후, 각각의 웰에서 박테리아 현탁액 10 uL가 플레이트로 옮겨졌다. 37oC with 5% CO2 조건에서 밤새 배양한 후, 콜로니의 수를 세었다. 항혈청이 없는 보체를 포함하는 대조군 웰과 비교하여, 살균가는 CFU에서 50% 감소를 산출한 시험 샘플의, 가장 높은 희석도였다.
특정한 시험예
반응 시간, EDC의 농도 및 아미노산 및 아미노산 혼합물의 농도를 포함하는 통제된 조건하, 단백질과, 카보디이미드에 의하여 촉매된 하이드라자이드 또는 하이드라진과의 활성화
EDC에 의하여 촉매된 디-하이드라자이드 또는 하이드라진과 단백질의 반응은 산물이 응집되고 침전되는 결과를 가져오는 경향이 있다는 것이 보고되었다. 0.36 M의 하이드라진 또는 ADH와 TT 4 mg/mL의 반응을 위한, 몇몇의 반응 조건들이 침전 없이 반응 산물을 얻기 위하여 연구되었다.
아미노산 부존재 하, 활성화 반응
아미노산의 부존재 하, 반응은 12-48 mM의 EDC 존재 하, 1-24시간 동안 수행되었다. 반응 혼합물은 pH 7.5, 30 mM NaCl, 10 mM HEPES와 완충용액-교환되고, 4oC에서 저장되었다. 이 반응들의 산물들 중 일부는 4oC에서 1-8 주간 투석한 산물을 보관한 이후 또는 반응 도중, 침전을 형성하였다. 남아 있는 샘플들의 활성화 정도(DA; TT 분자 당 하이드라자이드 그룹의 수)가 확인되었으며, 표 3에 정리되었다. 이러한 산물들 일부의 HPLC 프로파일가 도 1.에 나타나 있다.
표 3. 아미노산 부존재 하, 다양한 활성화 조건으로부터 얻어진, 활성화된 파상풍 변성독소에서 활성화 정도(DA; TT 분자 당 하이드라자이드 그룹의 수)
[EDC]

(mM) 		하이드라진의 경우 반응시간
(hours) 		ADH의 경우 반응시간
(hours)
1 2 4 24 1 2 4 24
12 - a - - (92) b 49 - - -
18 - (110) (81) (99)
24 - (83) (90) (107) - - - -
36 (77) (96) (102) (112) - - 75 66
48 - - - - - 76 77 (103)
a. 침전을 보인 샘플에서 DA는 확인되지 않는다.
b. 괄호 내 숫자는 침전을 보이지는 않았지만, HPLC 프로파일에서 단백질 신호의 상당한 감소를 보인 (도 1, 프로필 A 및 B) 샘플의 DA 값이다.
lysine, arginine, histidine, glycine, serine 또는 threonine 또는, lysine, arginine, histidine, glycine, serine, threonine, glutamic acid 또는 cysteine의 아미노산 혼합물 존재 하의, 활성화 반응
36, 72 또는 144mM의 아미노산 lysine, arginine, threonine, serine, glycine, histidine 또는 lysine, arginine, threonine, serine, glycine, histidine, glutamic acid 또는 cysteine의 같은 몰농도(molarity)로 구성된 아미노산 혼합물의 존재 하, 12 또는 24 mM의 EDC에 의하여 촉매되는 0.36M 하이드라진 및 ADH와 파상풍 변성독소(4 mg/mL)의 반응이 1,2,4 및 24시간 동안 수행되었다. 침전 없는 반응 산물의 활성화정도(DA)가 확인되었으며 표 4에 정리되었다. 이들 산물들 중 일부의 HPLC 프로파일이 도 2에 나타나 있다.
표 4. 아미노산 lysine, arginine, threonine, serine, glycine, histidine 또는 아미노산 혼합물의 존재 하, 다양한 활성화 조건으로부터 얻어진, 활성화된 파상풍 변성독소에서 활성화 정도(DA; TT 분자 당 하이드라자이드 그룹의 수)
[EDC]

(mM) 		[Lys]

(mM) 		Reaction time for hydrazine (hours) Reaction time for ADH
(hours)
1 2 4 24 1 2 4 24
12 36 -a - - - 47 - - -
72 - - - - 39 40 57 -
144 32 - - - 34 43 43 58
24 36 - (95)b (88) (93) - - (92) (90)
72 - - (103) (106) - - - -
144 - - - - - - - -
[EDC]

(mM) 		[Arg]

(mM) 		Reaction time for hydrazine (hours) Reaction time for ADH
(hours)
1 2 4 24 1 2 4 24
12 36 - - - - 48 - - -
72 - - - - 40 46 56 -
144 36 - - - 36 42 48 57
24 36 - (86) (83) (92) - - (87) (93)
72 - - (105) (101) - - - -
144 - - - - - - - -
[EDC]

(mM) 		[Thr]

(mM) 		Reaction time for hydrazine (hours) Reaction time for ADH
(hours)
1 2 4 24 1 2 4 24
12 36 - - - - 47 - - -
72 - - - - 38 46 52 -
144 35 - - - 32 42 46 48
24 36 - (112) (88) (96) - - (87) (88)
72 - - - - - - - -
144 - - - - - - - -
[EDC]

(mM) 		[Ser]

(mM) 		Reaction time for hydrazine (hours) Reaction time for ADH
(hours)
1 2 4 24 1 2 4 24
12 36 - - - - 47 - - -
72 32 - - - 39 43 51 57
144 35 - - - 41 40 44 47
24 36 - (114) (82) (91) - - (91) (93)
72 - - - - - - - -
144 - - - - - - - -
[EDC]

(mM) 		[Gly]

(mM) 		Reaction time for hydrazine (hours) Reaction time for ADH
(hours)
1 2 4 24 1 2 4 24
12 36 - - - - 49 - - -
72 35 - - - 37 45 47 54
144 32 32 32 33 35 40 39 47
24 36 - - - - - - - (82)
72 - - - - - - - -
144 - - - - - - - -
[EDC]

(mM) 		[His]

(mM) 		Reaction time for hydrazine (hours) Reaction time for ADH
(hours)
1 2 4 24 1 2 4 24
12 36 41 - - - 44 46 58 -
72 28 36 46 - 27 35 41 46
144 21 27 30 39 24 30 33 40
24 36 - (85) - - - - - -
72 - - - - 22 - - -
144 65 - 48 - 40 44 58 -
[EDC]

(mM) 		[Mix]

(mM) 		Reaction time for hydrazine (hours) Reaction time for ADH
(hours)
1 2 4 24 1 2 4 24
12 36 40 - - - 45 51 62 -
72 12 12 13 17 19 17 18 22
144 10 8 9 13 13 13 14 17
24 36 - - - - 48 - - -
72 - - - - - - - -
144 26 29 27 - 50 58 64 80
a. 침전을 보인 샘플에서 DA는 확인되지 않는다.
b. 괄호 내 숫자는 침전을 보이지는 않았지만, HPLC 프로파일에서 단백질 신호의 상당한 감소를 보인 (도 2, 프로필 A) 샘플의 DA 값이다.
glutamic acid (및 aspartic acid)의 존재 하, 활성화 반응
36, 72 및 144 mM의 글루탐산의 존재 하, 12, 24, 48 및 72 mM의 EDC에 의하여 촉매된 0.36M 하이드라진 및 ADH와 파상풍 변성 독소(4mg/mL)의 반응이 1, 2, 4 및 24시간 동안 수행되었다. 침전 없는 반응 산물의 활성화 정도(DA)가 확인되었으 며, 표 5에 정리되었다. 이들 산물 중 일부의 HPLC 프로파일이 도 3.에 기재되어 있다.
표 5. 글루탐산의 존재 하, 다양한 활성화 조건으로부터 얻어진, 활성화된 파상풍 변성독소에서 활성화 정도(DA; TT 분자 당 하이드라자이드 그룹의 수)
[EDC]

(mM) 		[Glu]

(mM) 		Reaction time for hydrazine (hours) Reaction time for ADH
(hours)
1 2 4 24 1 2 4 24
12 36 19 21 26 27 35 35 35 39
72 16 7 6 8 21 21 20 25
144 5 5 12 15 16 17 18 21
24 36 33 35 - a - 41 37 39 41
72 23 23 25 30 36 37 36 41
144 17 20 16 23 30 29 33 34
48 36 - - - - - - - -
72 49 - - - - 54 49 59
144 25 26 27 33 38 39 40 44
72 36 - (98) b (80) (92) - - - -
72 - - - - - - - -
144 34 35 37 - 46 46 46 53
a. 침전을 보인 샘플에서 DA는 확인되지 않는다.
b. 괄호 내 숫자는 침전을 보이지는 않았지만, HPLC 프로파일에서 단백질 신호의 상당한 감소를 보인 샘플의 DA 값이다.
다당류 혼합물의 단백질과의 콘쥬게이션
방법 A-화합 합성된 다가 수막구균 그룹 A, C, W135 및 Y 다당류-파상풍 변성독소 콘쥬게이트 롯(lot) ACWY040228a1
하이드라자이드 그룹을 포함하게 되는 TT의 활성화
1. 20-24oC, pH 6.5, 0.1 M의 MES, 20 mM의 EDC 존재 하, 파상풍 변성독소(.2 mg/mL)가 0.42 M의 하이드라진으로 활성화되었다.
2. 4시간 동안 반응한 후, 1 N의 NaOH로 반응이 끝나기까지, 반응 혼합물의 pH는 7.5-10까지 증가하였다.
3. 반응 혼합물은 12-14 KDa의 투석막(dialysis membrane)을 이용하는, 4oC, pH 약 10.5, 3 mM의 Na2CO3, 30 mM의 NaCl로 완충용액-교환되었다.
알데하이드 그룹을 포함하게 되는, Mn A, C, W135 및 Y PS 혼합물의 활성화
1. Mn A, C, W135 및 Y PS 혼합물(개개의 구성요소 PS, 전체 PS; 2.5mg/mL, 10 mg/mL)이 20-24oC에서, 4 시간 동안, 6mM의 NaIO4과 반응하였다.
2. 샘플은 12-14 KDa의 투석막(dialysis membrane)을 이용하는, 4oC, pH 약 7.5, 10 mM HEPES에서 투석되었다.
활성화된 TT에 대한, 활성화된 Mn A, C, W135 및 Y PS 혼합물의 콘쥬게이션
1. 하이드라자이드-포함하는 TT(0.4 mg) 부분표본(aliquot)이, 0.04 mL의 물에서의 용해 및 동결건조를 통하여 10mg/mL로 조정되었다.
2. 알데하이드-포함하는 Mn A, C, W135 및 Y PS의 혼합물의 부분표본이 0.04 mL, 0.2 M의 HEPES, pH 7.5, 30 mM EDTA에서 용해 및 동결건조되어, 10mg/mL로 조정되었다.
3. 활성화된 TT 용액을, 같은 부피의, 활성화된 Mn PS 혼합물에 가하고 교반(vortex)하였다.
4. 20-24oC에서 밤새, 반응 혼합물을 배양하였다.
5. 반응 혼합물은 6 uL 1 M의 NaBH4(활성화된 PS에서 최초 알데하이드 농도와 등가인 10-배 몰(molar))로 6시간 동안 처리되었다.
6. 12-14 KDa 분자량의 얇게 잘린(cut-off) 막을 이용한 1mM EDTA, 4oC, pH 7.5, 10mM HEPES, 식염수로 용액은 완충용액-교환된다.
7. 투석된 콘쥬게이트의 부피가 확인되었으며, 단백질(TT) 및 각각의 다당류(Mn A, C, W135 및 Y)의 농도가 투입질량(input massess)로부터 계산되었다.
화합 합성된 다가 콘쥬게이트 롯(lot) ACWY040228a1의 특징
도 4는 콘쥬게이트 롯(lot) ACWY040228a1의 HPSEC 용출(elution) 프로파일(280nm에서 검출됨)을 보여준다. 콘쥬게이션에서 단백질 신호가 17.5 분으로부 터 13 분으로 이동하는 것이 관찰되었으며, 콘쥬게이션 후, 콘쥬게이트되지 않은 자유 단백질은 거의 남지 않았다. HPLC 프로파일의 각각의 분획의, 각각의 수막구균 혈청군 A, C, W135 또는 Y의 콘쥬게이트된 다당류가, 각각의 다당류에 특이적인 항체로 ELLISA에 의하여 검출되었다(도 5).
화합 합성된 다가 콘쥬게이트 롯(lot) ACWY040228a1의 면역원성
콘쥬게이트는 0, 14 및 28일에 1 ug 다당류/1회 용량으로 다당류를 대조군으로 하여 10 개 마우스의 그룹을 면역시키는데 사용되었다. ELISA에 의하여 확인된 3번째 주입 후 2주 후 유도된 항체 수준의 기하학적 평균은, 각각의 혈청군 PS의 참고혈청이 3200 units/mL 로 추정되며, 콘쥬게이트 뱃치(batches)는 Mn A, 9291 (3535, 24421), Mn C, 4080 (1694, 9824); Mn W135, 17450 (9502, 32050); 및 Mn Y, 114429 (60462, 216566)이고, 대조군은 Mn A, 11 (1, 195; 1 SD 신뢰구간(confidence interval)), MnC, 672 (328, 1379); Mn W135, 72 (32, 162); 및 Mn Y, 298 (105, 844)이다 (표 6). 콘쥬게이트는 원래 Mn PS 대조군과 비교하여, 마우스에서 6-845배 이상의 항-Mn PS 특이적 항체를 유도하였다. 살균 분석에 의하여 확인된, 3번째 주입 후, 2주 후 유도된 살균가(bactericidal titer)의 기하학적 평균은, 대조군의 경우 Mn A, 329 (113, 598; 1 SD 신뢰구간), MnC, 329 (163, 668); Mn W135, 2743 (1851, 4066); 및 Mn Y, 12958 (10197, 16559)이며, 콘쥬게이트 뱃치의 경우 Mn A, 9699 (3373, 27895), Mn C, 1657 (854, 3214); Mn W135, 6625 (2076, 21143); 및 Mn Y, 77262 (32824, 181863)이다(표 6b). 콘쥬게이트는 원래 Mn PS 대조군과 비교하여, 마우스에서 2.4-29배 이상의 살균가를 유도하였다.
표 6a. 다가 콘쥬게이트 롯(lot) ACWY040228a1에서 Mn PS 각각 1 ug/용량으로 3번째 면역화한 후, 2 주 후 마우스 그룹(그룹 당 10마리 마우스)의 a1 SD 신뢰구간으로 한, 기하학적 평균 항-Mn-PS 항체 수준.
다당류 원래 PS 혼합물 롯 ACWY040228a1 증가된 배수
(Fold increase)
A 11 (1, 195) 9291 (3535, 24421) 845
C 672 (328, 1379) 4080 (1694, 9824) 6
W135 72 (32, 162) 17450 (9502, 32050) 242
Y 298 (105, 844) 114429 (60462, 216566) 384
a. 3200 units/mL의, 지정된 항-Mn PS 항체 수준으로 각각의 PS의 참고 혈청과의 비교.
표 6b. 다가 콘쥬게이트 롯(lot) ACWY040228a1에서 Mn PS 각각 1 ug/용량으로 3번째 면역화한 후, 2 주 후 마우스 그룹(그룹 당 10마리 마우스)의 1 SD 신뢰구간으로 한, 기하학적 평균 살균가.
Polysaccharide Native PS mixture Lot ACWY040228a1 Fold increase
A 329 (113, 958) 9699 (3373, 27895) 29
C 329 (163, 668) 1657 (854, 3214) 5
W135 2743 (1851, 4066) 6625 (2076, 21143) 2.4
Y 12995 (10197, 16559) 77262 (32824, 181863) 6
방법 B 화합 합성된 다가 수막구균 그룹 A, C, W135 및 Y 다당류-파상풍 변성독소 콘쥬게이트 롯(lot) ACWY040723B5
하이드라자이드 그룹을 갖게 되는, TT의 활성화
1. 20-24oC, pH 6.5, 0.1 M의 MES 및 20 mM의 EDC의 존재 하, 파상풍 변성독소 (4.2 mg/mL)가 0.42 M의 하이드라진으로 활성화되었다.
2. 4시간 동안 반응한 후, 반응을 끝내기 위한 1N의 NaOH로, 반응 혼합물의 pH는 7.5-10까지 올라갔다.
3. 12-14 KDa 투석막을 이용한 1mM EDTA, 4oC, pH 약 10.5, 30 mM의 NaCl, 3 mM의 Na2CO3로 반응 혼합물은 완충용액-교환된다.
시안산염 그룹을 포함하게 되는, Mn A, C, W135 및 Y PS 혼합물의 활성화
1. Mn A, C, W135 및 Y PS 혼합물(0.04 mL, 10 mg/mL, 전체 PS; 2.5 mg/mL, 각각의 구성성분 PS)이 0.2 M의 triethylamine 5 uL 존재 하, 2-2.5분간, 5 uL의 CDAP (아세토나이트릴(acetonitrile) 내 100 mg/mL)로 활성화되었다.
2. 활성화된 다당류는 0.625 mL ice-cold 0.2 M의 HEPES, pH 7.5, 30 mM 의 EDTA와 혼합되었고, 즉시 콘쥬게이션에 사용되었다.
활성화된 Mn A, C, W135 및 Y PS 혼합물의 활성화된 TT와의 콘쥬게이션
1. 활성화된 다당류를 0.25 mg의 활성화된 TT(ice-cold, 0.0.065 mL, 3.84 mg/mL)에 가했다; 교반(vortex)
2. 3일 밤 동안 부르럽게 흔들어 주면서(with gentle shaking) 4oC에서 반응 혼합물을 배양하였다.(배양을 연장한 것은 남은 잔여 반응하지 않은 시안산염 그룹의 분해를 확실히 하기 위한 것이다)
3. 용액은 12-14 KDa 분자량의 얇게 자른(cut-off) 막을 이용한 1mM의 EDTA, pH 7.5, 10 mM의 HEPES 및 식염수로 완충용액-교환되었다.
4. 투석된 콘쥬게이트의 부피가 확인되었으며, 각각의 다당류(Mn A, C, W135 및 Y) 및 단백질(TT)의 농도가 투입 질량으로부터 계산되었다.
화합 합성된 다가 콘쥬게이트 롯(lot) ACWY040723B5의 특징
도 6은 콘쥬게이트 롯 ACWY040723B5의 HPSEC 용출(elution) 프로파일(280nm에서 검출)을 보여준다. 콘쥬게이션에서 단백질 신호가 17.5에서 14.5로 이동한 것이 관찰되었으며, 콘쥬게이션 후 상당한 양의 콘쥬게이트되지 않은 자유 단백질이 남았다. HPLC 프로파일의 각각의 분획의 각각의 수막구균 혈청군 A, C, W135 또는 Y의 콘쥬게이트된 다당류가, 각각의 다당류에 특이적인 항체로, ELISA에 의하여 검출되었다(도 7).
화합 합성된 다가 콘쥬게이트 롯(lot) ACWY040423B5의 면역원성
0, 14 및 28일에, 1 ug 다당류/용량의 원래의 다당류를 대조군으로 하여 10 마우스 그룹을 면역화하는데 콘쥬게이트를 사용하였다. ELISA에 의하여 확인된 3번째 주입 후 2주 후 유도된 항체 수준의 기하학적 평균은, 각각의 혈청군 PS의 참고혈청이 3200 units/mL 로 추정되며(표 7), 대조군의 경우 Mn A, 11 (1, 195; 1 SD 신뢰구간), MnC, 672 (328, 1379); Mn W135, 72 (32, 162); 및 Mn Y, 298 (105, 844)이며, 콘쥬게이트 뱃치의 경우 Mn A, 5214 (2532, 10739), Mn C, 6430 (1797, 23008) Mn W135, 8211 (490, 137609) 및 Mn Y, 81833 (26489, 252808)이다. 콘쥬게이트는 마우스에서 원래 Mn PS 대조군에 비하여 10-474 배 이상의 항-Mn PS 특이적 항체를 유도하였다. 살균 분석에 의하여 확인된 3번째 주입 후 2주 후 유도된 살균가의 기하학적 평균은, 대조군의 경우 Mn A, 329 (113, 598; 1 SD confidence interval), MnC, 329 (163, 668); Mn W135, 2743 (1851, 4066); 및 Mn Y, 12958 (10197, 16559)이고, 콘쥬게이트 뱃치의 경우 Mn A, 1255 (696, 2263), Mn C, 3203 (1536, 6679); Mn W135, 33774 (9346, 122041); and Mn Y, 171471 (93450, 314632)이다(표 7b). 콘쥬게이트는 마우스에서 원래 Mn PS 대조군에 비하여 4-13 배 이상의 살균가를 유도하였다.
표 7a. 다가 콘쥬게이트 롯(lot) ACWY040723B5에서 Mn PS 각각 1 ug/용량으로 3번 째 면역화한 후, 2 주 후 마우스 그룹(그룹 당 10마리 마우스)의 a1 SD 신뢰구간으로 한, 기하학적 평균 항-Mn-PS 항체 수준.
다당류 원래 PS 혼합물 롯 ACWY040723B5 증가된 배수
(Fold increase)
A 11 (1, 195) 5214 (2532, 10739) 474
C 672 (328, 1379) 6430 (1797, 23008) 10
W135 72 (32, 162) 8211 (490, 137609) 114
Y 298 (105, 844) 81833 (26489, 252808) 275
a. 3200 units/mL의, 지정된 항-Mn PS 항체 수준으로 각각의 PS의 참고 혈청과의 비교.
표 7b. 다가 콘쥬게이트 롯(lot) ACWY040723B5에서 Mn PS 각각 1 ug/용량으로 3번째 면역화한 후, 2 주 후 마우스 그룹(그룹 당 10마리 마우스)의 1 SD 신뢰구간으로 한, 기하학적 평균 살균가.
다당류 원래 PS 혼합물 롯 ACWY040723B5 증가된 배수
(Fold increase)
A 329 (113, 958) 1255 (696, 2263) 4
C 329 (163, 668) 3203 (1536, 6679) 10
W135 2743 (1851, 4066) 33774 (9346, 122041) 12
Y 12995 (10197, 16559) 171471 (93450, 314632) 13
방법 C 화합 합성된 다가 수막구균 그룹 A, C, W135 및 Y 다당류-파상풍 변성독소 콘쥬게이트 롯(lot) ACWY040723C5
특정 알데하이드 그룹을 갖게 되는, TT의 활성화
1. 20-24oC, pH 6.5, 0.1 M의 MES 및 20 mM의 EDC의 존재 하, 파상풍 변성독소 (4.2 mg/mL)가 0.42 M의 1-amino-2, 3-propanediol (APDO)으로 활성화되었다.
2. 4시간 동안 반응한 후, 반응을 끝내기 위한 1N의 NaOH로, 반응 혼합물의 pH는 7.5-10까지 올라갔다.
3. 12-14 KDa 투석막을 이용한 4oC, pH 약 10.5, 30 mM의 NaCl, 3 mM의 Na2CO3로 반응 혼합물은 완충용액-교환된다.
4. APDO에 의한 TT의 변이 정도는 purpald assay [31] and Lowry assay [26]에 의하여 확인되었다.
5. TT-APDO 부분표본이 3시간 동안 6 mM의 NaIO4과 반응하고, 그후 pH 약 10.5, 30 mM NaCl, 3 mM Na2CO3,로 완충용액-교환되었다.
하이드라자이드 그룹을 포함하게 되는, Mn A, C, W135 및 Y PS 혼합물의 활성화
1. Mn A, C, W135 및 Y PS 혼합물(0.04 mL, 10 mg/mL, 전체 PS; 2.5 mg/mL, 각각의 구성성분 PS)이 0.2 M의 triethylamine 5 uL 존재 하, 2-2.5분간, 5 uL의 CDAP (아세토나이트릴(acetonitrile) 내 100 mg/mL)로 활성화되었다.
2. 활성화의 마지막에, 5 M의 hydrazine 0.01 mL 및 pH 7이 가해지고, 혼합되었다.
3. 반응 혼합물은 20-24oC에서 4시간 동안 배양되었다.
4. 샘플은 12-14 KDa 투석막을 이용한 4oC, pH 7.5, 10 mM의 HEPES에 대항하여 투석되었다.
5. 활성화된 PS 혼합물의 부피가 확인되었다(0.12 mL).
활성화된 Mn A, C, W135 및 Y PS 혼합물의 활성화된 TT와의 콘쥬게이션
1. 하이드라자이드-포함하는 Mn A, C, W135 및 Y PS 혼합물(0.12 mL 내 0.5mg)이 pH 7.5에서 1 M의 HEPES 0.03 mL과 혼합되었다.
2. 알데하이드-포함하는 TT(0.5 mg; 0.148 mL 3.38mg/mL)의 부분표본을 활성화된 Mn A, C, W135 및 Y PS 혼합물에 가하였다(전체 부피, 0.298 mL)
3. 반응 혼합물을 20-24oC에서 18시간동안 배양하였다.
4. 반응 혼합물은 6시간동안 1M의 NaBH4 5 uL로 처리되었다.
5. 12-14 KDa 분자량 얇게 잘린 막을 이용하는 1mM EDTA, pH 7.5, 10 mM HEPES, 식염수로 완충용액-교환되었다.
6. 투석된 콘쥬게이트의 부피가 확인되었으며, 각각의 다당류(Mn A, C, W135 및 Y) 및 단백질(TT)의 농도가 투입 질량으로부터 계산되었다.
화합 합성된 다가 콘쥬게이트 롯(lot) ACWY040723C5의 특징
도 8은 콘쥬게이트 롯 ACWY040723C5의 HPSEC 용출(elution) 프로파일(280nm에서 검출)을 보여준다. 콘쥬게이션에서 단백질 신호가 17.5에서 14분로 이동한 것이 관찰되었으며, 콘쥬게이션 후 잔여 콘쥬게이트되지 않은 자유 단백질이 남았다. HPLC 프로파일의 각각의 분획의 각각의 수막구균 혈청군 A, C, W135 또는 Y의 콘쥬게이트된 다당류가, 각각의 다당류에 특이적인 각각의 항체로, ELISA에 의하여 검출되었다(도 9).
화합 합성된 다가 콘쥬게이트 롯(lot) ACWY040423C5의 면역원성
0, 14 및 28일에, 1 ug 다당류/용량의 원래의 다당류를 대조군으로 하여 10 마우스의 그룹을 면역화하는데 콘쥬게이트를 사용하였다. ELISA에 의하여 확인된 3번째 주입 후 2주 후 유도된 항체 수준 (units/mL)의 기하학적 평균은, 각각의 혈청군 PS의 참고혈청이 3200 units/mL 로 추정되며(표 8), 대조군의 경우 Mn A, 11 (1, 195; 1 SD confidence interval), MnC, 672 (328, 1379); Mn W135, 72 (32, 162); 및 Mn Y, 298 (105, 844)이고, 콘쥬게이트 뱃치의 경우 Mn A, 17250 (6786, 43847), Mn C, 11035 (5996, 20309) Mn W135, 8321 (3505, 19755) 및 Mn Y, 84643 (46669, 153517)이다. 콘쥬게이트는 마우스에서 원래 Mn PS 대조군에 비하여 16-1568 배 이상의 항-Mn PS 특이적 항체를 유도하였다. 살균 분석에 의하여 확인된 3번째 주입 후 2주 후 유도된 살균가의 기하학적 평균은, 대조군의 경우 Mn A, 329 (113, 598; 1 SD confidence interval), MnC, 329 (163, 668); Mn W135, 2743 (1851, 4066); 및 Mn Y, 12958 (10197, 16559)이고, 콘쥬게이트 뱃치의 경우 Mn A, 3941 (921, 16862), Mn C, 6860 (2812, 16733); Mn W135, 72403 (39288, 133431); 및 Mn Y, 82832 (43591, 157400)이다(표 8b). 콘쥬게이트는 마우스에서 원래 Mn PS 대조군에 비하여 6-26 배 이상의 살균가를 유도하였다.
표 8a. 다가 콘쥬게이트 롯(lot) ACWY040723C5에서 Mn PS 각각 1 ug/용량으로 3번째 면역화한 후, 2 주 후 마우스 그룹(그룹 당 10마리 마우스)의 1 SD 신뢰구간으로 한, 기하학적 평균 항-Mn-PS 항체 수준a
다당류 원래 PS 혼합물 롯 ACWY040723C5 증가된 배수
(Fold increase)
A 11 (1, 195) 17250 (6786, 43847) 1568
C 672 (328, 1379) 11035 (5996, 20309) 16
W135 72 (32, 162) 8321 (3505, 19755) 116
Y 298 (105, 844) 84643 (46669, 153517) 284
a. 3200 units/mL의, 지정된 항-Mn PS 항체 수준으로 각각의 PS의 참고 혈청과의 비교.
표 8b. 다가 콘쥬게이트 롯(lot) ACWY040723C5에서 Mn PS 각각 1 ug/용량으로 3번째 면역화한 후, 2 주 후 마우스 그룹(그룹 당 10마리 마우스)의 1 SD 신뢰 구간으로 한, 기하학적 평균 살균가.
다당류 원래 PS 혼합물 롯 ACWY040723C5 증가된 배수
(Fold increase)
A 329 (113, 958) 3941 (921, 16862) 12
C 329 (163, 668) 6860 (2812, 16733) 21
W135 2743 (1851, 4066) 72403 (39288, 133431) 26
Y 12995 (10197, 16559) 82832 (43591, 157400) 6
방법 A 화합 합성된 다가 수막구균 그룹 A, C, W135 및 Y 다당류-파상풍 변성독소 콘쥬게이트 롯(lot) MnACWYTTD(K72)050131A6
하이드라자이드 그룹을 갖게 되는, TT의 활성화
1. 20-24oC, pH 5.5, 0.1 M의 MES, 20 mM의 EDC 및 72 mM의 lysine의 존재 하, 파상풍 변성독소 (4.2 mg/mL)가 0.36 M의 아디픽산 디하이드라자이드(adipic acid dihydrazide)로 활성화되었다.
2. 2 시간 동안 반응시킨 후, 12-14 KDa 투석막을 이용한 4oC, pH 약 7.5, 10 mM의 HEPES, 30 mM의 NaCl로 반응 혼합물을 완충용액-교환하였다.
3. 샘플의 부피가 확인되었으며, 활성화된 TT의 농도가 계산되었다(3.48 mg/mL).
알데하이드 그룹을 포함하게 되는, Mn A, C, W135 및 Y PS 혼합물의 활성화
1. Mn A, C, W135 및 Y PS 혼합물(10 mg/mL, 전체 PS; 2.5 mg/mL, 각각의 구성성분 PS)이 4oC에서 밤새 6 mM의 NaIO4와 반응하였다.
2. 샘플은 12-14 KDa 투석막을 이용한 4oC, pH 7.5 및 10 mM의 HEPES로 투석되었다.
3. 샘플의 부피가 확인되었으며, 활성화된 PS 혼합물의 농도가 계산되었다(7.25 mg/mL 전체 PS).
활성화된 Mn A, C, W135 및 Y PS 혼합물의 활성화된 TT와의 콘쥬게이션
1. 알데하이드-포함하는 Mn A, C, W135 및 Y PS 혼합물(1 mg; 0.138 mL 7.25 mg/mL)의 부분표본을 pH7.5, 1 M의 HEPES 0.0284 mL 및 0.5 M의 EDTA 0.0189 mL과 합쳐졌다.
2. 혼합물은 얼음에 보관되었다.
3. 하이드라자이드-포함하는 TT(1 mg; 0.288 mL, 3.475 mg/mL)의 부분표본이 활성화된 얼음 위의(on ice) PS 혼합물에 가해지고 혼합되었다.
4. 4oC에서 밤새 반응 혼합물이 배양되었다.
5. 반응 혼합물은 6시간동안 1M의 NaBH4 10 uL로 처리되었다.
6. 용액은, 12-14 KDa 분자량 얇게 잘린 막을 이용하는 4oC, 1mM EDTA, pH 7.5, 10 mM HEPES, 식염수로 완충용액-교환되었다.
7. 투석된 콘쥬게이트의 부피가 확인되었으며, 각각의 다당류(Mn A, C, W135 및 Y) 및 단백질(TT)의 농도가 투입 질량으로부터 계산되었다.
화합 합성된 다가 콘쥬게이트 롯(lot) MnACWYTTD(K72)050131A6의 특징
도 10은 콘쥬게이트 롯 MnACWYTTD(K72)050131A6의 HPSEC 용출(elution) 프로파일(280nm에서 검출)을 보여준다. 콘쥬게이션에서 단백질 신호가 17.5에서 13분로 이동한 것이 관찰되었으며, 콘쥬게이션 후 콘쥬게이트되지 않은 자유 단백질이 거의 남지 않았다. HPLC 프로파일의 각각의 분획의 각각의 수막구균 혈청군 A, C, W135 또는 Y의 콘쥬게이트된 다당류가, 각각의 다당류에 특이적인 개개의 항체로, ELISA에 의하여 검출되었다(도 11).
화합 합성된 다가 콘쥬게이트 롯(lot) MnACWYTTD(K72)050131A6의 면역원성
0, 14 및 28일에, 1 ug 다당류/용량의 원래의 다당류 혼합물(10마리 쥐)을 대조군으로 하여 5 마우스 그룹을 면역화하는데 콘쥬게이트를 사용하였다. ELISA에 의하여 확인된 3번째 주입 후 2주 후 유도된 항체 수준(units/mL)의 기하학적 평균은, 각각의 혈청군 PS의 참고혈청이 3200 units/mL 로 추정되며(표 9), 대조군의 경우 Mn A, 11 (1, 195; 1 SD confidence interval); MnC, 672 (328, 1379); Mn W135, 72 (32, 162); 및 Mn Y, 298 (105, 844)이며, 콘쥬게이트의 경우 Mn A, 8308 (5282, 13071) Mn C, 4090 (1424, 11746) Mn W135, 11314 (5981, 21403) 및 Mn Y, 90779 (63135, 130528)이다. 콘쥬게이트는 마우스에서 원래 Mn PS 대조군에 비하여 6-305 배 이상의 항-Mn PS 특이적 항체를 유도하였다.
표 9. 다가 콘쥬게이트 롯(lot) MnACWYTTD(K72)050131A6에서 Mn PS 각각 1 ug/용량으로 3번째 면역화한 후, 2 주 후 마우스 그룹(원래 PS 혼합물 대조군의 경우 10마리의 마우스이고 시험되는 경우는 5마리 마우스)의 1 SD 신뢰구간으로 한, 기하학적 평균 항-Mn-PS 항체 수준a
Polysaccharide Native PS mixture Lot MnACWYTTD(K72)050131A6 Fold increase
A 11 (1, 195) 8308 (5282, 13071) 755
C 672 (328, 1379) 4090 (1424, 11746) 6
W135 72 (32, 162) 11314 (5981, 21403) 157
Y 298 (105, 844) 90779 (63135, 130528) 305
a. 3200 units/mL의, 지정된 항-Mn PS 항체 수준으로 각각의 PS의 참고 혈청과의 비교.
방법 B 화합 합성된 다가 수막구균 그룹 A, C, W135 및 Y 다당류-파상풍 변성독소 콘쥬게이트 롯(lot) MnACWYTTD(K72)050201B6
하이드라자이드 그룹을 갖게 되는, TT의 활성화
1. 20-24oC, pH 5.5, 0.1 M의 MES, 12 mM의 EDC 및 72 mM의 lysine의 존재 하, 파상풍 변성독소 (4.2 mg/mL)가 0.36 M의 아디픽산 디하이드라자이드로 활성화되었다.
2. 2 시간 동안 반응시킨 후, 12-14 KDa 투석막을 이용한 4oC, pH 약 7.5, 10 mM의 HEPES, 30 mM의 NaCl로 반응 혼합물을 완충용액-교환하였다.
3. 샘플의 부피가 확인되었으며, 활성화된 TT의 농도가 계산되었다(3.48 mg/mL).
시안산염 그룹을 포함하게 되는, Mn A, C, W135 및 Y PS 혼합물의 활성화
1. Mn A, C, W135 및 Y PS 혼합물(0.1 mL, 10 mg/mL, 전체 PS; 2.5 mg/mL, 각각의 구성성분 PS)이 0.2 M의 triethylamine 6 uL 존재 하, 20-24oC에서 2-2.5분 동안 6 uL의 CDAP(아세토나이트릴(acetonitrile) 내 100 mg/mL))로 활성화되었다.
2. 활성화된 다당류는 30 mM EDTA, pH 7.5, 얼음같이 찬(ice-cold) 0.2 M의 HEPES 1.25 mL과 혼합되었다.
활성화된 Mn A, C, W135 및 Y PS 혼합물의 활성화된 TT와의 콘쥬게이션
1. 활성화된 다당류를 0.5 mg의 활성화된 TT(얼음처럼 차가우며, 0.144 mL, 3.48 mg/mL)에 가했다; 교반(vortex)
2. 3일 밤 동안 부르럽게 흔들어 주면서(with gentle shaking) 4oC에서 반응 혼합물을 배양하였다.(배양을 연장한 것은 남은 잔여 반응하지 않은 시안산염 그룹의 분해를 확실히 하기 위한 것이다)
3. 용액은 12-14 KDa 분자량의 얇게 자른(cut-off) 막을 이용한 1mM의 EDTA, pH 7.5, 10 mM의 HEPES 및 식염수로 완충용액-교환되었다.
4. 투석된 콘쥬게이트의 부피가 확인되었으며, 각각의 다당류(Mn A, C, W135 및 Y) 및 단백질(TT)의 농도가 투입 질량으로부터 계산되었다.
화합 합성된 다가 콘쥬게이트 롯(lot) MnACWYTTD(K72)050201B6의 특징
도 12은 콘쥬게이트 롯 MnACWYTTD(K72)050201B6의 HPSEC 용출(elution) 프로파일(280nm에서 검출)을 보여준다. 콘쥬게이션에서 단백질 신호가 17.5에서 14 및 16분으로 이동한 것이 관찰되었으며, 콘쥬게이션 후 콘쥬게이트되지 않은 자유 단백질이 상당량 남았다. HPLC 프로파일의 각각의 분획의 각각의 수막구균 혈청군 A, C, W135 또는 Y의 콘쥬게이트된 다당류가, 각각의 다당류에 특이적인 개개의 항체로, ELISA에 의하여 검출되었다(도 13).
화합 합성된 다가 콘쥬게이트 롯(lot) MnACWYTTD(K72)050201B6의 면역원성
0, 14 및 28일에, 1 ug 다당류/용량의 원래의 다당류를 대조군(10마리 쥐)으로 하여 5 마우스 그룹을 면역화하는데 콘쥬게이트를 사용하였다. ELISA에 의하여 확인된 3번째 주입 후 2주 후 유도된 항체 수준(units/mL)의 기하학적 평균은, 각각의 PS의 참고혈청이 3200 units/mL 로 추정되며(표 10), 대조군의 경우 Mn A, 11 (1, 195; 1 SD confidence interval); MnC, 672 (328, 1379); Mn W135, 72 (32, 162); 및 Mn Y, 298 (105, 844)이고, 콘쥬게이트 그룹의 경우 Mn A, 2752 (1355, 5589); Mn C, 2930 (1190, 7212) Mn W135, 4755 (1455, 15542) 및 Mn Y, 22494 (10466, 48347)이다.콘쥬게이트는 마우스에서 원래 Mn PS 대조군에 비하여 4-250 배 이상의 항-Mn PS 특이적 항체를 유도하였다.
표 10. 다가 콘쥬게이트 롯(lot) MnACWYTTD(K72)050201B6에서 Mn PS 각각 1 ug/용량으로 3번째 면역화한 후, 2 주 후 마우스 그룹(원래 PS 혼합물 대조군의 경우 10마리의 마우스이고 시험되는 경우는 5마리 마우스)의 1 SD 신뢰구간으로 한, 기하학적 평균 항-Mn-PS 항체 수준a
다당류 원래 PS 혼합물 롯 MnACWYTTD(K72)050201B6 증가된 배수
(Fold increase)
A 11 (1, 195) 2752 (1355, 5589) 250
C 672 (328, 1379) 2930 (1190, 7212) 4
W135 72 (32, 162) 4755 (1455, 15542) 66
Y 298 (105, 844) 22494 (10466, 48347) 75
a. 3200 units/mL의, 지정된 항-Mn PS 항체 수준으로 각각의 PS의 참고 혈청과의 비교.
방법 A 화합 합성된 다가 수막구균 그룹 A, C, W135 및 Y 다당류-파상풍 변성독소 콘쥬게이트 롯(lot) TTHACWY061126
하이드라자이드 그룹을 갖게 되는, TT의 활성화
1. 20-24oC, pH 5.5, 0.1 M의 MES 및 20 mM의 EDC의 존재 하, 파상풍 변성독소 (4.2 mg/mL)가 0.42 M의 하이드라진으로 활성화되었다.
2. 4시간 동안 반응한 후, 반응을 끝내기 위한 1N의 NaOH로, 반응 혼합물의 pH는 7.5-10까지 올라갔다.
3. 12-14 KDa 투석막을 이용한 4oC, pH 약 10.5, 30 mM의 NaCl, 3 mM의 Na2CO3로 반응 혼합물은 완충용액-교환되었다.
알데하이드 그룹을 포함하게 되는, NaIO 4 에 의한 개개의 Mn A, C, W135 및 Y PS의 활성화
1. Mn A PS (10 mg/mL)가 4oC에서 72시간 동안 15 mM의 NaIO4로 활성화되 고, 25 mM의 글리세롤로 냉각되었으며(quenched), 4oC에서 물로 투석되었다.
2. Mn C PS (10 mg/mL)가 상온에서 4시간 동안 6 mM의 NaIO4로 활성화되고, 25 mM의 글리세롤로 냉각되었으며(quenched), 4oC에서 물로 투석되었다.
3. Mn W135 PS (10 mg/mL)가 4oC에서 밤새 3 mM의 NaIO4로 활성화되고, 25 mM의 글리세롤로 냉각되었으며(quenched), 4oC에서 물로 투석되었다.
4. Mn Y PS (10 mg/mL)가 4oC에서 밤새 3 mM의 NaIO4로 활성화되고, 25 mM의 글리세롤로 냉각되었으며(quenched), 4oC에서 물로 투석되었다.
활성화된 Mn A, C, W135 및 Y PS 혼합물의 활성화된 TT와의 콘쥬게이션
1. 활성화된 알데하이드-포함하는 Mn A, C, W135 및 Y PS의 부분표본이 1:1:1:1의 비율로 혼합되었다(W/W; 전체 PS = 0.1 mg).
2. PS혼합물은 얼음에 보관되고, pH 6, 1M의 MES 1 uL과 혼합되었다.
3. PS의 전체 부피는 얼음과 같이 찬 물(ice-cold water)에서 36.8 uL에 달하였다.
4. Aliquot of hydrazide-containing TT (0.1 mg; 29.9 uL, 3.41 mg/mL) was added to the activated PS mixture on ice and mixed.
하이드라자이드-포함하는 TT(0.1 mg; 29.9 uL, 3.41 mg/mL)의 부분표본을 얼음 위의 활성화된 PS 혼합물에 가하고, 혼합하였다.
5. 이틀밤 동안 4oC에서 반응 혼합물을 배양하였다.
6. pH 6.5에서 1 M의 MES 1 uL을 가하였다.
7. 반응 혼합물은 4oC에서 밤새 1 M의 NaBH4 2 uL로 처리되었다.
8. 용액은, 12-14 KDa 분자량 얇게 잘린 막을 이용하는 4oC, 1mM EDTA, pH 7.5, 10 mM HEPES, 식염수로 완충용액-교환되었다.
9. 투석된 콘쥬게이트의 부피가 확인되었으며, 각각의 다당류(Mn A, C, W135 및 Y) 및 단백질(TT)의 농도가 투입 질량으로부터 계산되었다.
화합 합성된 다가 콘쥬게이트 롯(lot) TTHACWY061126의 특징
콘쥬게이트 롯 TTHACWY061126이 HPSEC 용출(elution) 프로파일(280nm에서 검출)로 분석되었다. 콘쥬게이션에서 단백질 신호가 17.5에서 14분로 이동한 것이 관찰되었으며, 콘쥬게이션 후 콘쥬게이트되지 않은 자유 단백질이 거의 남지 않았다. HPLC 프로파일의 각각의 분획의 각각의 수막구균 혈청군 A, C, W135 또는 Y의 콘쥬게이트된 다당류가, 각각의 다당류에 특이적인 개개의 항체로, ELISA에 의하여 검출되었다(도 14).
화합 합성된 다가 콘쥬게이트 롯(lot) TTHACWY061126의 면역원성
0, 14 및 28일에, 1 ug 다당류/용량의 원래의 다당류 혼합물(5마리 쥐)을 대조군으로 하여 15 마우스 그룹을 면역화하는데 콘쥬게이트를 사용하였다. ELISA에 의하여 확인된 3번째 주입 후 2주 후 유도된 항체 수준(units/mL)의 기하학적 평균은, 각각의 혈청군 PS의 참고혈청이 3200 units/mL 로 추정되며(표 11a), 대조군 그룹의 경우 Mn A, 108 (39, 296; 1 SD confidence interval); Mn C, 416 (221, 784); Mn W135, 52 (29, 96); 및 Mn Y, 386 (232, 644)이고, 콘쥬게이트의 경우 Mn A, 29819 (18049, 49266) Mn C, 1319 (372, 4674) Mn W135, 11075 (4610, 26607)및 Mn Y, 39901 (24295, 65530)이다. 콘쥬게이트는 마우스에서 원래 Mn PS 대조군에 비하여 3-268 배 이상의 항-Mn PS 특이적 항체를 유도하였다. 살균 분석에 의하여 확인된 3번째 주입 후 2주 후 유도된 살균가의 기하학적 평균은, 대조군 그룹의 경우 Mn A, 394 (114, 1358; 1 SD confidence interval), MnC, 226 (97, 529); Mn W135, 10396 (6146, 17585); 및 Mn Y, 9050 (9050, 9050)이고, 콘쥬게이트 뱃치의 경우 Mn A, 12125 (3800, 38689),Mn C, 1811 (621, 5282); Mn W135, 89595 (28643, 280251); 및 Mn Y, 128062 (25097, 653452)이다(표 11b). 콘쥬게이트는 마우스에서 원래 Mn PS 대조군에 비하여 8-31배 이상의 살균가를 유도하였다.
표 11a. 다가 콘쥬게이트 롯(lot) TTHACWY061126에서 Mn PS 각각 1 ug/용량 으로 3번째 면역화한 후, 2 주 후 마우스 그룹(원래 PS 혼합물 대조군의 경우 5마리의 마우스이고 시험되는 경우는 15마리 마우스)의 1 SD 신뢰구간으로 한, 기하ㅍ학적 평균 항-Mn-PS 항체 수준a
다당류 원래 PS 혼합물 롯 TTHACWY061126 증가된 배수
(Fold increase)
A 108 (39, 296) 29819 (18049, 49266) 268
C 416 (221, 784) 1319 (372, 4674) 3
W135 52 (29, 96) 11075 (4610, 26607) 213
Y 386 (232, 644) 39901 (24295, 65530) 103
a. 3200 units/mL의, 지정된 항-Mn PS 항체 수준으로 각각의 PS의 참고 혈청과의 비교.
표 11b. 다가 콘쥬게이트 롯(lot) TTHACWY061126에서 Mn PS 각각 1 ug/용량으로 3번째 면역화한 후, 2 주 후 마우스 그룹(원래 PS 혼합물 대조군의 경우 5마리의 마우스이고 시험되는 경우는 15마리 마우스)의 1 SD 신뢰구간으로 한, 기하학적 평균 살균가.
다당류 원래 PS 혼합물 롯 TTHACWY061126 증가된 배수
(Fold increase)
A 394 (114, 1358) 12125 (3800, 38689) 31
C 226 (97, 529) 1811 (621, 5282) 8
W135 10396 (6146, 17585) 89595 (28643, 280251) 9
Y 9050 (9050, 9050) 128062 (25097, 653452) 14
방법 B 화합 합성된 다가 수막구균 그룹 A, C, W135 및 Y 다당류-파상풍 변성독소 콘쥬게이트 롯(lot) TTHVIIACWYa060922B(2:2)
하이드라자이드 그룹을 갖게 되는, TT의 활성화
1. 20-24oC, pH 5.5, 0.1 M의 MES 및 30 mM의 EDC의 존재 하, 파상풍 변성독소 (4.2 mg/mL)가 0.42 M의 하이드라진으로 활성화되었다.
2. 1 시간 동안 반응시킨 후, 1 N의 NaOH로 반응이 끝나기까지, 반응 혼합물의 pH는 7.5-10까지 증가하였다.
3. 반응 혼합물은 12-14 KDa의 투석막(dialysis membrane)을 이용하는, 4oC, pH 약 10.5, 3 mM의 Na2CO3, 30 mM의 NaCl로 완충용액-교환되었다.
시안산염 그룹을 포함하게 되는, Mn A, C, W135 및 Y PS 혼합물의 활성화
Mn A, C, W135 및 Y PS 혼합물 ( 1:1:1:1, W/W; 0.0125 mL, 10 mg/mL)이 0.2 M의 triethylamine 0.5 uL의 존재 하, 20-24oC에서 2-2.5분 동안 0.75 uL의 CDAP (아세토나이트릴(acetonitrile) 내 100 mg/mL)로 활성화되었다.
활성화된 Mn A, C, W135 및 Y PS 혼합물의, 활성화된 TT에 대한 콘쥬게이션
1. 활성화된 다당류가 pH7.4, 얼음처럼 차가운 2x PBS 50 uL과 혼합되고, 0.125 mg의 TTH가 가해진다((32.3 uL, 3.87 mg/mL,얼음처럼 차가움).
2. 3일 밤 동안 부드럽게 흔들어 주면서(with gentle shaking) 4oC에서 반응 혼합물을 배양하였다.(배양을 연장한 것은 남은 잔여 반응하지 않은 시안산염 그룹의 분해를 확실히 하기 위한 것이다)
3. 용액은 12-14 KDa 분자량의 얇게 자른(cut-off) 막을 이용한 1mM의 EDTA, pH 7.5, 10 mM의 HEPES 및 식염수로 4oC 에서 완충용액-교환되었다.
4. 투석된 콘쥬게이트의 부피가 확인되었으며, 각각의 다당류(Mn A, C, W135 및 Y) 및 단백질(TT)의 농도가 투입 질량으로부터 계산되었다.
화합 합성된 다가 콘쥬게이트 롯(lot) TTHVIIACWYa060922B(2:2)의 특징
콘쥬게이트 롯 TTHVIIACWYa060922B(2:2)이 HPSEC 용출(elution) 프로파일(280nm에서 검출)의하여 분석되었다. 콘쥬게이션에서 단백질 신호가 17.5에서 14분으로 이동한 것이 관찰되었으며, 콘쥬게이션 후 콘쥬게이트되지 않은 자유 단백질이 거의 남지 않았다. HPLC 프로파일의 각각의 분획의 각각의 수막구균 혈청군 A, C, W135 또는 Y의 콘쥬게이트된 다당류가, 각각의 다당류에 특이적인 항체로, ELISA에 의하여 검출되었다.
화합 합성된 다가 콘쥬게이트 롯(lot) TTHVIIACWYa060922B(2:2)의 면역원성
0, 14 및 28일에, 1 ug 다당류/용량의 원래의 다당류를 대조군으로 하여 5마리 마우스 그룹을 면역화하는데 콘쥬게이트를 사용하였다. ELISA에 의하여 확인된 3번째 주입 후 2주 후 유도된 항체 수준(units/mL) 의 기하학적 평균은, 각각의 혈청군 PS의 참고혈청이 3200 units/mL 로 추정되며(표 12a), 대조군의 경우 Mn A, 108 (39, 296; 1 SD 신뢰구간); MnC, 416 (221, 784); Mn W135, 52 (29, 96); and Mn Y, 386 (232, 644)이고, 콘쥬게이트 그룹의 경우 Mn A, 24828 (16738, 36829); Mn C, 10641 (6118, 18506); Mn W135, 15068 (7374, 30788); and Mn Y, 99827 (56810, 175416)이다. 콘쥬게이트는 원래 Mn PS 대조군과 비교하여, 마우스에서 26-290배 이상의 항-ㅡMn PS 특이적 항체를 유도하였다. 살균분석에 의하여 확인된 3번째 주입 후 2주 후 유도된 살균가(bactericidal titer)의 기하학적 평균은, 대조군의 경우 Mn A, 394 (114, 1358; 1 SD 신뢰구간), MnC, 226 (97, 529); Mn W135, 10396 (6146, 17585); and Mn Y, 9050 (9050, 9050)이고, 콘쥬게이트 뱃치(batch)의 경우 Mn A, 5970 (3212, 11099), Mn C, 19400 (8185, 45985); Mn W135, 68593 (19473, 241620); and Mn Y, 111431 (45134, 275106)이다(표 12b). 콘쥬게이트는 원래 Mn PS 대조군과 비교하여, 마우스에서 7-86배 이상의 살균가를 유 도하였다
표 12a. 다가 콘쥬게이트 롯(lot) TTHVIIACWYa060922B(2:2)에서 Mn PS 각각 1 ug/용량으로 3번째 면역화한 후, 2 주 후 마우스 그룹(원래 PS 혼합물 대조군의 경우 5마리의 마우스이고 시험되는 경우 5마리 마우스)의 1 SD 신뢰구간으로 한, 기하학적 평균 항-Mn-PS 항체 수준a.
다당류 원래 PS 혼합물 롯 TTHVIIACWYa060922B(2:2) 증가된 배수
(Fold increase)
A 108 (39, 296) 24828 (16738, 36829) 230
C 416 (221, 784) 10641 (6118, 18506) 26
W135 52 (29, 96) 15068 (7374, 30788) 290
Y 386 (232, 644) 99827 (56810, 175416) 259
a. 3200 units/mL의, 지정된 항-Mn PS 항체 수준으로 각각의 PS의 참고 혈청과의 비교.
표 12b. 다가 콘쥬게이트 롯(lot) TTHVIIACWYa060922B(2:2)에서 Mn PS 각각 1 ug/용량으로 3번째 면역화한 후, 2 주 후 마우스 그룹(그룹 당 5마리 마우스)의 1 SD 신뢰구간으로 한, 기하학적 평균 살균가.
다당류 원래 PS 혼합물 롯TTHVIIACWYa060922B(2:2) 증가된 배수
(Fold increase)
A 394 (114, 1358) 5971 (3212, 11099) 15
C 226 (97, 529) 19499 (8185, 45985) 86
W135 10396 (6146, 17585) 68593 (19473, 241620) 7
Y 9050 (9050, 9050) 111431 (45134, 275106) 12
방법 A 화합 합성된 다가 수막구균 그룹 A, C, W135 및 Y 다당류-파상풍 변성독소 콘쥬게이트 롯(lot) TTH2C/A/WY070209
하이드라자이드 그룹을 갖게 되는, TT의 활성화
1. 20-24oC, pH 5.5, 0.1 M의 MES 및 20 mM의 EDC의 존재 하, 파상풍 변성독소 (4.2 mg/mL)가 0.42 M의 하이드라진으로 활성화되었다.
2. 4 시간 동안 반응시킨 후, 1 N의 NaOH로 반응이 끝나기까지, 반응 혼합물의 pH는 7.5-10까지 증가하였다.
3. 반응 혼합물은 12-14 KDa의 투석막(dialysis membrane)을 이용하는, 4oC, pH 약 10.5, 3 mM의 Na2CO3, 30 mM의 NaCl로 완충용액-교환되었다.
알데하이드 그룹을 포함하게 되는, Mn A, C, W135 및 Y PS 혼합물의 NaIO 4 에 의한 활성화
1. Mn A PS (10 mg/mL)가, 4oC에서 72시간 동안, 15 mM의 NaIO4로 활성화되고, 25 mM의 글리세롤로 냉각되었으며(quenched), 4oC에서 물로 투석되었다.
2. Mn C PS (10 mg/mL)가, 상온에서 4시간 동안, 6 mM의 NaIO4로 활성화되 고, 25 mM의 글리세롤로 냉각되었으며(quenched), 4oC에서 물로 투석되었다.
3. Mn W135 PS (10 mg/mL)가, 4oC에서 밤새, 3 mM의 NaIO4로 활성화되고, 25 mM의 글리세롤로 냉각되었으며(quenched), 4oC에서 물로 투석되었다.
4. Mn Y PS (10 mg/mL)가, 4oC에서 밤새, 3 mM의 NaIO4로 활성화되고, 25 mM의 글리세롤로 냉각되었으며(quenched), 4oC에서 물로 투석되었다.
활성화된 Mn A, C, W135 및 Y PS 혼합물의 활성화된 TT와의 콘쥬게이션
1. 활성화된 Mn C PS의 부분표본(0.1 mg)이 동결건조(lyophilize)되고, pH 6, 1M의 MES 1 uL에서 재-용해되었다.
2. 하이드라자이드-포함하는 TT의 부분표본(0.2 mg)이 동결건조되고, 물 2 uL에서 재-용해되었다.
3. 첫째 날(on day 1), 4oC, 활성화된 Mn C PS 용액에 단백질 용액을 가하고; 혼합하며;밤새 4oC에서 배양한다.
4. 둘째날(on day 2), 4oC에서, 2-7 uL의 활성화된 Mn A PS 0.05 mg을 하이드라자이드-포함하는 TT/활성화된 Mn C PS 반응 혼합물에 가하고; 혼합하며; 4oC 에서 밤새 배양한다.
5. 셋째날(on day 3), 전체 부피가 200 uL가 되도록 각각 0.05 mg의 활성화된 Mn W135 및 Y PS's를 얼음처럼 차가운 식염수와 함께 단계 (4)의 반응 혼합물에 가하고; 혼합하며; 4oC에서 밤새 배양한다.
6. pH 6.5, 1 M의 MES를 2 uL 가하였다.
7. 4oC 에서 밤새, 반응 혼합물에 1 M의 NaBH4 를 3 uL 처리하였다.
8. 12-14 KDa 분자량의 얇게 잘린(cut-off) 막을 이용한 1mM EDTA, 4oC, pH 7.5, 10mM HEPES, 식염수로 용액을 완충용액-교환하였다.
9. 투석된 콘쥬게이트의 부피가 확인되었으며, 단백질(TT) 및 각각의 다당류(Mn A, C, W135 및 Y)의 농도가 투입질량(input massess)로부터 계산되었다.
화합 합성된 다가 콘쥬게이트 롯(lot) TTH2C/A/WY070209의 특징
콘쥬게이트 롯 TTH2C/A/WY070209이 HPSEC 용출(elution) 프로파일(280nm에서 검출)에 의하여 분석되었다. 콘쥬게이션에서 단백질 신호가 17.5에서 14분으로 이동한 것이 관찰되었으며, 콘쥬게이션 후 콘쥬게이트되지 않은 자유 단백질이 거의 남지 않았다. HPLC 프로파일의 각각의 분획의 각각의 수막구균 혈청군 A, C, W135 또는 Y의 콘쥬게이트된 다당류가, 각각의 다당류에 특이적인 항체로, ELISA에 의하 여 검출되었다(도 15).
화합 합성된 다가 콘쥬게이트 롯(lot) TTH2C/A/WY070209의 면역원성
0, 7 및 14일에, Mn C의 경우 0.2 ug/용량 및 Mn A, W135 및 Y의 경우 각각 0.1 ug의 PS/용량 에서 원래의 다당류 혼합물(5마리의 마우스)을 대조군으로 하여, 15마리 마우스의 그룹을 면역화하는데 콘쥬게이트를 사용하였다. ELISA에 의하여 확인된 3번째 주입 후 1주 후 유도된 항체 수준(units/mL)의 기하학적 평균은, 각각의 PS의 참고혈청이 3200 units/mL 로 추정되며(표 13a), 대조군 그룹의 경우 Mn A, 1 (1, 1; 1 SD confidence interval); Mn C, 34 (10, 109); Mn W135, 1 (1, 1); and Mn Y, 28 (5, 166)이고, 콘쥬게이트의 경우 Mn A, 10303 (5480, 19371); Mn C, 12815 (7350, 22343); Mn W135, 3111 (1490, 6494); and Mn Y, 9457 (4280, 20894) 이다. 콘쥬게이트는 원래 Mn PS 대조군과 비교하여, 마우스에서 338-10303배 이상의 항-Mn PS 특이적 항체를 유도하였다. 살균분석(bactericidal assay)에 의하여 확인된 3번째 주입 후 1주 후 유도된 살균가(bactericidal titer)의 기하학적 평균은, 대조군 그룹의 경우 Mn A, 260 (127, 533; 1 SD confidence interval), MnC, 92 (76, 111); Mn W135, 858 (587, 1254); 및 Mn Y, 462 (53, 3998)이고, 콘쥬게이트 뱃치(batch)의 경우 Mn A, 4321 (2192, 8521), Mn C, 1755 (931, 3310); Mn W135, 20030 (4288, 93566); 및 Mn Y, 7728 (2811, 21244)이다(표 13b). 콘쥬게이트는 원래 Mn PS 대조군과 비교하여, 마우스에서 17-23배 이상의 살 균가를 유도하였다.
표 13a. 다가 콘쥬게이트 롯(lot) TTH2C/A/WY070209에서, Mn C의 경우 0.2 ug/용량 및 Mn A, W135 및 Y의 경우 각각 0.1 ug/용량의 PS로 3번째 면역화한 후, 1 주 후 마우스 그룹(원래 PS 혼합물 대조군의 경우 5마리의 마우스이고 시험되는 경우 15마리 마우스)의 1 SD 신뢰구간으로 한, 기하학적 평균 항-Mn-PS 항체 수준a.
다당류 원래 PS 혼합물 롯 TTH2C/A/WY070209 증가된 배수
(Fold increase)
A 1 (1, 1) 10303 (5480, 19371) 10303
C 34 (10, 109) 12815 (7350, 22343) 377
W135 1 (1, 1) 3111 (1490, 6494) 3111
Y 28 (5, 166) 9457 (4280, 20894) 338
a. 3200 units/mL의 지정된 항-Mn PS 항체 수준으로 각각의 PS의 참고 혈청과의 비교.
표 13b. 다가 콘쥬게이트 롯(lot) TTH2C/A/WY070209에서, Mn C의 경우 0.2 ug/용량 및 Mn A, W135 및 Y의 경우 각각 0.1 ug/용량의 PS로 3번째 면역화한 후, 1 주 후 마우스 그룹(원래 PS 혼합물 대조군의 경우 5마리의 마우스이고 시험되는 경우 15마리 마우스)의 1 SD 신뢰구간으로 한, 기하학적 평균 살균가.
다당류 원래 PS 혼합물 롯 TTH2C/A/WY070209 증가된 배수
(Fold increase)
A 260 (127, 533) 4321 (2192, 8521) 17
C 92 (76, 111) 1755 (931, 3310) 19
W135 858 (587, 1254) 20030 (4288, 93566) 23
Y 462 (53, 3998) 7728 (2811, 21244) 17
방법 B 화합 합성된 다가 수막구균 그룹 A, C, W135 및 Y 다당류-파상풍 변 성독소 콘쥬게이트 롯(lot) TTHIAC/WY070210B(2:2)
하이드라자이드 그룹을 갖게 되는, TT의 활성화
1. 20-24oC, pH 5.5, 0.1 M의 MES 및 30 mM의 EDC의 존재 하, 파상풍 변성독소(4.2 mg/mL)가 0.42 M의 하이드라진으로 활성화되었다.
2. 3시간 동안 반응한 후, 1 N의 NaOH로 반응이 끝나기까지, 반응 혼합물의 pH는 7.5-10까지 증가하였다.
3. 반응 혼합물은 12-14 KDa의 투석막(dialysis membrane)을 이용하는, 4oC, pH 약 10.5, 3 mM의 Na2CO3, 30 mM의 NaCl로 완충용액-교환되었다.
시안산염 그룹을 포함하게 되는, Mn A 및 C PS 혼합물의 활성화
Mn A 및 C PS 혼합물 ( 1:1, W/W; 0.025 mL, 10 mg/mL)이 0.2 M의 triethylamine 1 uL의 존재 하, 20-24oC에서 2-2.5분 동안 1.5 uL의 CDAP (아세토 나이트릴(acetonitrile) 내 100 mg/mL)로 활성화되었다.
활성화된 Mn A 및 C PS 혼합물의, 활성화된 TT에 대한 콘쥬게이션
1. 활성화된 다당류가 pH7.4, 얼음처럼 차가운 2x PBS 200 uL과 혼합되고, 0.5 mg의 얼음처럼 차가운 TTH가 가해진다.
2. 밤새 부드럽게 흔들어 주면서(with gentle shaking) 4oC에서 반응 혼합물을 배양하였다.
시안산염 그룹을 포함하게 되는, Mn W135 및 Y PS 혼합물의 활성화
Mn W135 및 Y PS 혼합물 (1:1, W/W; 0.025 mL, 10 mg/mL)이 0.2 M의 triethylamine 1 uL의 존재 하, 20-24oC에서 2-2.5분 동안 1.5 uL의 CDAP (아세토나이트릴(acetonitrile) 내 100 mg/mL)로 활성화되었다.
TTH + 활성화된 Mn A 및 C 반응 혼합물 내에서, 활성화된 Mn W135 및 Y PS 혼합물의 활성화된 TT와의 콘쥬게이션
1. 얼음 위의(on ice) TTH + 활성화된 Mn A 및 C 반응 혼합물과 활성화된 Mn W135 및Y 혼합물이 혼합되었다.
2. 3일 밤 동안 부드럽게 흔들어 주면서(with gentle shaking) 4oC에서 반응 혼합물을 배양하였다.(배양을 연장한 것은 남은 잔여 반응하지 않은 시안산염 그룹의 분해를 확실히 하기 위한 것이다).
3. 용액은 12-14 KDa 분자량의 얇게 자른(cut-off) 막을 이용한 1mM의 EDTA, pH 7.5, 10 mM의 HEPES 및 식염수로 4oC 에서 완충용액-교환되었다.
4. 투석된 콘쥬게이트의 부피가 확인되었으며, 각각의 다당류(Mn A, C, W135 및 Y) 및 단백질(TT)의 농도가 투입 질량으로부터 계산되었다.
화합 합성된 다가 콘쥬게이트 롯(lot) TTHIAC/WY070210B(2:2)의 특징
콘쥬게이트 롯 TTHIAC/WY070210B(2:2)이 HPSEC 용출(elution) 프로파일(280nm에서 검출)의하여 분석되었다. 콘쥬게이션에서 단백질 신호가 17.5에서 14분으로 이동한 것이 관찰되었으며, 콘쥬게이션 후 콘쥬게이트되지 않은 자유 단백질이 거의 남지 않았다. HPLC 프로파일의 각각의 분획의 각각의 수막구균 혈청군 A, C, W135 또는 Y의 콘쥬게이트된 다당류가, 각각의 다당류에 각각 특이적인 항체들로, ELISA에 의하여 검출되었다.
화합 합성된 다가 콘쥬게이트 롯(lot) TTHIAC/WY070210B(2:2)의 면역원성
0, 7 및 14일에, 0.1 ug 각각의 다당류/용량의 원래의 다당류를 대조군으로 하여 5마리 마우스 그룹을 면역화하는데 콘쥬게이트를 사용하였다. ELISA에 의하여 확인된 3번째 주입 후 1주 후 유도된 항체 수준(units/mL)의 기하학적 평균은, 각각의 혈청군 PS의 참고혈청이 3200 units/mL 로 추정되며(표 14a), 대조군의 경우 Mn A, 1 (1, 1; 1 SD confidence interval); MnC, 34 (10, 109); Mn W135, 1 (1, 1); and Mn Y, 28 (5, 166)이고, 콘쥬게이트 그룹의 경우 Mn A, 5873 (3966, 8699); Mn C, 3465 (2109, 5695); Mn W135, 3798 (2090, 6900); and Mn Y, 22423 (11933, 42133)이다. 콘쥬게이트는 원래 Mn PS 대조군과 비교하여, 마우스에서 102-5873배 이상의 항-Mn PS 특이적 항체를 유도하였다. 살균 분석에 의하여 확인된 3번째 주입 후 1주 후 유도된 살균가(bactericidal titer)의 기하학적 평균은, 대조군 그룹의 경우 Mn A, 260 (127, 533; 1 SD confidence interval), MnC, 92 (76, 111); Mn W135, 858 (587, 1254); and Mn Y, 462 (53, 3998) 이고, 콘쥬게이트 뱃치(batch)의 경우 Mn A, 4127 (2196, 7756), Mn C, 1331 (588, 3010); Mn W135, 38508 (17971, 82515); and Mn Y, 11506 (7700, 17194)이다(표 14b). 콘쥬게이트는 원래 Mn PS 대조군과 비교하여, 마우스에서 14-45배 이상의 살균가(bactericidal titer)를 유도하였다.
표 14a. 다가 콘쥬게이트 롯(lot) TTHIAC/WY070210B(2:2)에서 Mn PS 각각 0.1 ug/용량으로 3번째 면역화한 후, 1 주 후 마우스 그룹(원래 PS 혼합물 대조군의 경우 5마리의 마우스이고 시험되는 경우 5마리 마우스)의 1 SD 신뢰구간으로 한, 기하학적 평균 항-Mn-PS 항체 수준a.
다당류 원래 PS 혼합물 롯TTHIAC/WY070210B(2:2) 증가된 배수
(Fold increase)
A 1 (1, 1) 5873 (3966, 8699) 5873
C 34 (10, 109) 3465 (2109, 5695) 102
W135 1 (1, 1) 3798 (2090, 6900) 3798
Y 28 (5, 166) 22423 (11933, 42133) 801
a. 3200 units/mL의, 지정된 항-Mn PS 항체 수준으로 각각의 PS의 참고 혈청과의 비교
표 14b. 다가 콘쥬게이트 롯(lot) TTHIAC/WY070210B(2:2)에서 Mn PS 각각 0.1 ug/용량으로 3번째 면역화한 후, 1 주 후 마우스 그룹(그룹 당 마우스 5 마리)의 1 SD 신뢰구간으로 한, 기하학적 평균 살균가(bactericidal titer).
Polysaccharide Native PS mixture LotTTHIAC/WY070210B(2:2) Fold increase
A 260 (127, 533) 4127 (2196, 7756) 16
C 92 (76, 111) 1331 (588, 3010) 14
W135 858 (587, 1254) 38508 (17971, 82515) 45
Y 462 (53, 3998) 11506 (7700, 17194) 25
본 발명의 사상이 적용될 수 있는 많은 가능한 예들의 관점에서, 제시된 예들은 본 발명의 바람직한 예시들일 뿐이지, 발명의 범위가 이로써 제한되는 것은 아니라는 점을 알아야 할 것이다. 오히려, 본 발명의 범위는 하기의 특허청구범위에 의하여 정의된다. 그러므로 본 발명은 이들 청구항들의 범위 및 사상에 포함되는 모든 것이라고 할 것이다.
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  18. 복수의 면역원적으로 구별되는 다당류를 시안화 제제(cyanylation agent)와 반응시켜 복수의 시안산염(cyanate)에 의하여 활성화된, 면역원적으로 구별되는 다당류의 혼합물을 형성하는 단계로서,
    여기에서, 복수의 면역원적으로 구별되는 다당류는 서로 다른 피막화된(encapsulated) 박테리아들로터 유래된 둘 또는 그 이상의 다당류이거나, 또는 서로 다른 혈청군(serogroups) 또는 혈청형(serotypes) 유래의 둘 또는 그 이상의 다당류인 것을 특징으로 하는 단계;
    하나 이상의 단백질을, 하나 이상의 하이드라자이드에 의하여 활성화된 단백질 용액을 생산하기에 충분한 조건 하에서, 하이드라진, 카보하이드라자이드, 이염화 하이드라진(hydrazine dichloride), 디하이드라자이드(dihydrazide) 또는 그것들의 혼합물과 반응시키는 단계; 및
    복수의 시안산염에 의하여 활성화된, 면역원적으로 구별되는 다당류를 하나 이상의 하이드라자이드에 의하여 활성화된 단백질과 pH6 내지 pH8에서 접촉시켜, 복수의 시안산염에 의하여 활성화된, 면역원적으로 구별되는 다당류가 동시에 하나 이상의 하이드라자이드에 의하여 활성화된 단백질과 반응하여, 각각의 부착된 면역원적으로 구별되는 다당류와 단백질 사이에 형성된 하나 이상의 C-N 결합을 포함하는 복합 다가 면역원성 콘쥬게이트를 형성하는 단계
    를 포함하는 복합 다가 면역성 콘쥬게이트의 제조 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 시안화 제제는 1-시아노-4-디메틸암모쥼피리디늄 테트라플루오로보레이트(1-cyano-4-dimethylammoniumpyridinium tetrafluorborate), (cyanogen bromide) 및 N-시아노-N,N,N-트리에틸암모튬 테트라플루오로보레이트(N-cyano-N,N,N-triethylammonium tetrafluoroborate)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  20. 제 18항에 있어서, 상기 복수의 시안산염에 의하여 활성화된, 면역원적으로 구별되는 다당류와 하나 이상의 하이드라자이드에 의하여 활성화된 단백질의 동시 반응은 복수의 시안산염에 의하여 활성화된, 면역원적으로 구별되는 다당류와 하나 이상의 하이드라자이드에 의하여 활성화된 단백질의 혼합물을 포함하는 조성물을 생성하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  21. 제 18항에 있어서, 복수의 시안산염에 의하여 활성화된, 면역원적으로 구별되는 다당류와 하나 이상의 하이드라자이드에 의하여 활성화된 단백질의 혼합물을 포함하는 반응 조성물의 제조는, 상기 복수의 시안산염에 의하여 활성화된, 면역원적으로 구별되는 다당류 혼합물과 하나 이상의 하이드라자이드에 의하여 활성화된 단백질의 접촉을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  22. 제 18항에 있어서, 두번째 복수의, 두 번째 면역원적으로 구별되는 다당류를 시안화 제제와 반응시켜 복수의 두 번째 시안산염에 의하여 활성화된, 면역원적으로 구별되는 다당류의 두 번째 혼합물을 생성하는 단계;및
    복수의 시안산염에 의하여 활성화된, 면역원적으로 구별되는 다당류의 두 번째 혼합물을 복합 다가 면역원성 콘쥬게이트와 접촉시켜 각각의 두 번째 시안산염 에 의하여 활성화된, 면역원적으로 구별되는 다당류와 단백질 사이에 하나 이상의 C-N 결합을 형성시키는 단계
    를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 두 번째 면역원적으로 구별되는 다당류와 시안화 제제의 반응성은 첫 번째 면역원적으로 구별되는 다당류와 시안화 제제의 반응성보다 큰 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 첫 번째 면역원적으로 구별되는 다당류는 수막구균 그룹 A 및 수막구균 그룹 C로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  25. 제 23항에 있어서, 상기 두 번째 면역원적으로 구별되는 다당류는 수막구균 그룹 W135 및 수막구균 그룹 Y로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  26. 제 18항에 있어서, 상기 복수의 면역원적으로 구별되는 다당류는 적어도 하나의 폐렴구균(pneumococcal) 다당류, 적어도 하나의 수막구균(meningococcal) 다당류, 및 적어도 하나의 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 타입 b 다당류인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  27. 제 18항에 있어서, 상기 복합 다가 면역성 콘쥬게이트는 하나의 단백질 구조체(single protein construct)에 콘쥬게이트된 복수의 면역원적으로 구별되는 다당류를 갖는 구조(structure)를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  28. 제 18항에 있어서, 상기 복합 다가 면역성 콘쥬게이트는 하기의 구조(structure)를 갖는 것을 특징으로 하는 제조 방법:
    PS1 - P1 - PS2
    │
    PS3
    여기서 P1은 담체 단백질이고; PS1, PS2, 및 PS3는 각각 P1에 공유적으로 부착되는 면역원적으로 구별되는 다당류임.
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