CN101405028B - 制备复合的多价免疫原性结合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了制备复合的多价免疫原性结合物的方法，包括将多种免疫原性不同的多糖与至少一种蛋白同时进行反应，以制备复合的多价免疫原性结合物。该同时进行的反应包括一种反应物上的酰肼基团与另一种反应物上的醛或氰酸酯基团的反应。

Description

制备复合的多价免疫原性结合物的方法
发明领域
本公开涉及制造多价免疫原性结合物的方法，以及按照这样的方法制造的结合物。
优先权声明
本申请要求2006年3月17日提交的美国临时申请No.60/783,490的权益，该临时申请在此以其全文引为参考。
与相关申请的交叉参考
本申请涉及2004年8月6日提交的WO 2005/014037和2004年8月6日提交的WO 2005/037320，这两份专利在此以其全文引为参考。
发明背景
细菌多糖(PS)是T细胞非依赖性抗原，在较大的儿童以及成年人中诱导短期的免疫，但在年龄小的婴幼儿中通常没有。PS不能与主要组织相容性复合物分子结合，而这是抗原呈递到辅助性T淋巴细胞并刺激它所必需的。PS能够在没有辅助性T淋巴细胞的帮助下刺激B淋巴细胞产生抗体。B淋巴细胞的T细胞非依赖性刺激的结果是，在被这些抗原免疫后，没有记忆性诱导。
T细胞非依赖性多糖抗原可以通过多糖与蛋白分子的共价结合而转变成T细胞依赖性抗原。与结合物疫苗的多糖成分结合的B细胞，可以被特异性针对作为结合的载体蛋白的一部分的肽的辅助性T细胞所激活。辅助性T细胞对载体蛋白的反应可以用于增加针对多糖的抗体的产生。PS-结合物疫苗是通过蛋白与PS共价结合而形成的多糖-蛋白杂合体。在结合前一般需要对PS进行化学修饰，因为大多数天然细菌PS不首先经过一些化学修饰(“活化”)，就不能与蛋白化学连接。
与蛋白结合使得PS具有了蛋白的许多T细胞表位的免疫性质。这些T细胞表位与CD4辅助性T细胞相互作用，极大地促进了针对被结合的多糖的抗体反应。针对结合物的辅助性T细胞依赖性反应产生血清IgG抗体和免疫记忆，即使是在婴儿、例如不到两岁的婴儿中。此外，PS-结合物的免疫原性，与天然PS相比，对于被结合的PS的大小的依赖性较小。因此，使用PS或寡糖制备的结合物可以具有相似的免疫原性。
已经有许多结合反应被用于共价连接多糖与蛋白。三种比较常用的方法包括：1)还原胺化，其中在一种反应成分上的醛基或酮基与另一种成分上的氨基或酰肼基进行反应，然后使用还原剂将形成的C＝N双键还原成C-N单键；2)氰基化结合，其中用溴化氰(CNBr)或1-氰基-4-二甲基铵吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化多糖，以便向羟基基团导入氰酸酯基团，该基团在加入蛋白成分后与氨基或酰肼基形成共价键；以及3)碳二亚胺反应，其中碳二亚胺活化了结合反应的一种成分上的羧基基团，被活化的羰基基团与另一种成分上的氨基或酰肼基反应。这些反应通常也被用于在结合反应之前活化结合物的成分。
b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(Hib)结合物疫苗代表了第一种被生产用于临床应用的PS-蛋白结合物疫苗。Robbins及其同事在1980年利用生物技术工艺将Hib糖类化学结合到蛋白载体上，这种理念在50年前就已经建立了。参见Avery等，J.Exp.Med.1929；50：533-SSO；Schneerson等，J.Exp.Med1980；152：361-376。现在，在美国已经注册了四种不同的Hib结合物疫苗，每种都不相同，每种都具有它们自己的物理、化学和免疫学性质，正如在表A中总结的那样。在这些疫苗中使用的结合化学和质量控制的详细综述已经出版。参见Kniskern等的“结合：设计、化学与分析”(“Conjugation：design，chemistry，and analysis”)，在Ellis等的《b型嗜血杆菌结合物疫苗的开发与临床应用》一书中(Development and clinical uses of Haemophilusb conjugate vaccines.New York：Marcel Dekker，1994：37-69)。
表A
 
疫苗＊ 糖类大小 载体蛋白 分隔物(接头)
PRP-D(Connaught) 多糖 白喉类毒素 6碳分隔物(ADH)
HbOC(Wyeth-Dederle) 寡糖 白喉蛋白(CRM) 无(酰胺)
PRO-OMPC(Merck) 小的多糖 脑膜炎球菌蛋白 硫醚(属间杂交)
PRP-T(AventisPasteur) 多糖 破伤风类毒素 6碳分隔物(ADH)
第一个商业化的Hib结合物，多聚磷酸核糖基核糖醇白喉类毒素结合物(PRP-D)，由使用Schneerson等J.Exp.Med.1980；152：361-376中的程序通过6碳分隔物己二酸二酰肼(ADH)与白喉类毒素连接的、大小被部分减小了的Hib PS组成。在该方法中白喉类毒素的ADH衍生物是通过在存在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的情况下，与ADH反应而获得的。然后通过使用CNBr在羟基基团上产生氰酸酯基团来活化Hib PS。活化的PS被结合到ADH-类毒素上(氰基化(cyanylation)结合)，但是该过程产生的键合不稳定，结合物具有溶解度的问题。
后来对Robbins结合化学进行了修改，使得ADH分隔物被首先加到多糖上，然后再在存在EDC的情况下结合到纯化的蛋白上(碳二亚胺反应)。参见Chu等，Infect.Immun1983；40：245-256；Schneerson等，Infect.Immun.1986，52：519-528。这种修改改善了结合效率和产物的溶解性。疫苗多聚磷酸核糖基核糖醇破伤风蛋白结合物(PRP-T)利用了改进的化学来将Hib多糖共价连接到破伤风类毒素上(参见表1)。
多聚磷酸核糖基核糖醇交叉反应突变型白喉类毒素结合物(PRP-CRM)疫苗，也被称为嗜血杆菌b寡糖结合物(HbOC)，不含有Hib PS。它利用了大约20个重复单位的寡糖来代替，这些寡糖是通过核糖醇部分中二醇官能团的高碘酸氧化得到的。然后将被氧化的寡糖在氰基硼氢化钠存在下直接连接到白喉类毒素的无毒性突变体形式CRM197上(还原胺化)。参见Anderson等，J.Immunol.1989；142：2464-8和Anderson，Infect.Immun.1983，39：233-238。在这种结合方法中，发现寡糖与蛋白的比率对于最适的抗体反应来说是关键的。参见Kniskern等的“结合：设计、化学与分析”(“Conjugation：design，chemistry，andanalysis”)，在Ellis等的《b型嗜血杆菌结合物疫苗的开发与临床应用》一书中(Development and clinical uses of Haemophilus b conjugatevaccines.New York：Marcel Dekker，1994：37-69)；Anderson等，J.Immunol.1989；142：2464-8。
与其它的Hib结合物疫苗相比，Hib多糖-脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白复合物结合疫苗(PRP-OMPC)有许多独特的性质。蛋白载体不是白喉、破伤风和百日咳(DTP)疫苗的成分，而是由除去了脂多糖的脑膜炎球菌外膜囊泡构成，所述囊泡通过硫醚键与大小被减小了的Hib PS连接。参见Marburg等，J.Amer.Chem.Soc.1986；108：5282-5287；Kniskern等的“结合：设计、化学与分析”(“Conjugation：design，chemistry，andanalysis”)，在Ellis等的《b型流感嗜血杆菌结合疫苗的开发与临床应用》一书中(Development and clinical uses of Haemophilus b conjugatevaccines.New York：Marcel Dekker，1994：37-69)；Anderson等，J.Immunol.1989；142：2464-8。在该方法中，各个接头与蛋白和Hib多糖连接，然后将接头融合以形成硫醚键。
脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)是世界上细菌性脑膜炎和败血症的主要病因。病原性脑膜炎球菌被连接到生物体的外膜表面上的多糖荚膜所包裹。在荚膜多糖的免疫特异性的基础上已经鉴定了13种不同血清型的脑膜炎球菌(Frasch，C.E.等，1985)。在这13种血清型中，5种引起了大多数脑膜炎球菌疾病；它们包括血清型A、B、C、W135和Y。血清型A是造成大部分流行性疾病的原因。血清型B、C和Y引起大部分地方性疾病和局部爆发。宿主对侵染性脑膜炎球菌的防御依赖于补体介导的溶菌作用。负责补体介导的溶菌作用的血清抗体大部分针对外荚膜多糖。
基于脑膜炎球菌多糖的常规疫苗引发针对荚膜多糖的免疫应答。这些抗体能够对血清型特异的脑膜炎球菌进行补体介导的溶菌作用。脑膜炎球菌多糖疫苗在儿童和成年人中被显示是有效的。但是，在婴儿和幼儿中效果有限，在较年轻的人群中后续剂量的多糖引起弱的加强反应或不能引起加强反应。
已经有许多方法被用于活化脑膜炎球菌PS和用于结合，正如在表B中所总结的那样。每种活化模式都具有改变重要表位的潜力，即使是PS分子上只活化了相对少的位点的情况下。例如，C群脑膜炎球菌PS的高碘酸活化导致了链断裂，产生了具有末端醛基基团的较小糖类单元，所述醛基可以通过还原胺化与蛋白相连。Richmond等，J.Infect.Dis.1999；179：1569-72。
表B
 
方法 糖类大小 载体蛋白 分隔物 程序 用于人类
#1还原胺化 减小了的 破伤风类毒素 无 PS的醛形式在存在氰基硼氢化钠的情况下与蛋白结合 否
#2碳二亚胺 天然 破伤风类毒素 无 PS和蛋白在存在碳二亚胺的情况下结合，然后用乙醇胺阻断 否
#3活性酯a 寡糖 CRM197 己二酸 寡糖的胺化还原末端通过己二酸与蛋白结合(NHS)2 是
#4还原胺化 减小了的 CRM197 无 PS的醛形式在存在氰基硼氢化钠的情况下与蛋白结合 是
#5还原胺化 De-Oac-PSb 破伤风类毒素 无 PS的醛形式在存在氰基硼氢化钠的情况下与蛋白结合 是
a.己二酸的羟基琥珀酰亚胺二酯
b.脱乙酰化的PS仅在C群脑膜炎球菌中有报道
关于C群脑膜炎球菌结合物的生产和优化的最初研究在Hib结合物的商业化以前就有充分报道了。参见Beuvery等，infect.Immun.1982；37：15-22；Beuvery等，Infect.Immun.1983；40：39-45；Beuvery等，J.Infect.1983；6：247-55；Jennings等，J.Immunol.1981；127：1011-8。
已经报道了两种不同的将C群PS与蛋白载体进行化学连接的结合方法。参见Jennings等，J.Immunol.1981；127：1011-8；Beuvery等，Infect.Immun.1983；40：39-45。第一种方法使用了部分解聚的PS，它通过高碘酸氧化产生末端醛基基团而被活化(表2中的方法#1)。然后醛在氰基硼氢化钠的存在下通过还原胺化与蛋白、主要是赖氨酸上的游离氨基基团反应。参见Jennings等，J Immunol 1981；127：1011-8。在该方法中，活化发生在C群PS的一个特定的脱氧乙酰化位点上。
第二种方法利用了碳二亚胺反应(表2中的方法#2)，将高分子量PS中的羧基基团与载体蛋白上的赖氨酸∈-氨基基团共价连接。在该方法中活化位点与高碘酸活化相比更加随机。
通过这两种方法制备的C群脑膜炎球菌结合物已经在动物中进行了评估。参见Beuvery等，Dev.Biol.Stand.1986；65：197-204；和Beuvery等，J.Infect.1983；6：247-55。结合物在最初的免疫后同时刺激T细胞不依赖性和T细胞依赖性反应。参见Beuvery等，J.Infect.1983；6：247-55。但是，研究显示，PS必须与载体蛋白共价连接以诱导T细胞依赖性抗体反应。
在临床试验中使用的第一种A群和C群脑膜炎球菌结合物由Chiron Vaccines制备，报道于1992年(表2中的方法#3)。参见Costantino等，Vaccine 1992；10：691-8。结合方法基于通过温和的酸水解产生的小的寡糖的选择性末端基团活化，然后通过碳氢分隔物与蛋白相连。白喉毒素的无毒性突变体CRM被用作蛋白载体。为了活化寡糖进行结合，在寡糖的末端加上了氨基基团，然后与己二酸的N-羟基琥珀酰亚胺二酯反应产生活化的酯。然后将该活化的酯共价结合到CRM197蛋白中赖氨酸的∈-氨基基团上，产生结合物。
用于制备PS-蛋白结合疫苗的常规方法在还原胺化结合反应中不使用酰肼化学，尽管ADH形式的酰肼已经被用于活化多糖。这些现有技术的方法利用蛋白上赖氨酸残基的∈-氨基基团与被活化的PS上的功能性基团例如醛基基团(还原胺化)和羧基基团进行反应。反应的效率低，一般仅仅为大约20％。为了完成结合，反应还需要进行2到3天，必需使用纯化步骤将结合物从未反应的PS中分离出来。参见Guo等的“蛋白-多糖结合”(＂Protein-polysaccharide conjugation＂)，在Pollard等的《分子医学方法》第66卷的《脑膜炎球菌疫苗：方法与规程》中(Methods in Molecular Medicine，Vol.66：Meningococcal Vaccines：methods and Protocols，Humana Press，Totowa，NJ，2001，pg49-54)。对于观察到的低产率已经提出了许多解释。首先，赖氨酸的∈-氨基基团(pKa＝10.5)在结合条件下(pH6.5-7.4)具有低反应性。参见Inman等，Biochemistry 1969；8：4074-4082。第二，大多数结合方法使用类毒素作为载体蛋白。类毒素源自于用甲醛脱毒的毒素，甲醛与毒素的氨基基团结合，只剩下有限数量的氨基基团可用于结合。第三，得到的活化蛋白和蛋白-PS结合物的溶解性降低能够导致沉淀。
因此，以高产率合成和生产多糖-蛋白结合疫苗的方法是符合需要的。此外，其中快速进行反应、减少不需要的副产物产生、和减少反应结束时剩余的未反应的蛋白和多糖的量的方法也是符合需要的。
现有的基于PS的疫苗在年龄小的儿童中的用途有限，并且在成年人中不能提供长期持续的保护。因此，对于能够在处于例如细菌性脑膜炎、肺炎、破伤风和其它细菌性感染的风险下的儿童和成年人中提供针对疾病的长期保护作用的蛋白-PS结合疫苗，存在着需求。优选实施方案中的蛋白-PS结合物可以用于制备能够为婴儿、儿童和成年人提供长期保护作用的疫苗制剂。
最近，由于经济和物流的优点以及在野外应用中更好的患者顺从性，施用含有多种疫苗的多价(或联合)疫苗变得更加流行。对于结合疫苗来说也发生了同样的趋势。这样的联合的结合疫苗的典型例子是七价肺炎球菌结合疫苗Prevnar(Wyeth Lederle)和四价的脑膜炎球菌结合疫苗Menactra(Aventis Pasteur)。
发明简述
本文描述了用于制造复合的多价免疫原性结合物、包括结合疫苗的方法。
在一种实施方案中，描述了用于制造复合的多价免疫原性结合物的方法，包括：
将多种免疫原性不同的多糖与氧化剂进行反应，产生了多种醛活化的免疫原性不同的多糖的混合物；
将至少一种蛋白与肼、碳酰肼、盐酸肼、二酰肼或其混合物在足以产生至少一种酰肼活化的蛋白的溶液的条件下进行反应；
将多种醛活化的免疫原性不同的多糖的混合物与至少一种酰肼活化的蛋白在pH大约5到大约8下相接触，以便多种醛活化的免疫原性不同的多糖同时与至少一种酰肼活化的蛋白发生反应，产生复合的多价结合物，该结合物包含在每个结合的免疫原性不同的多糖和蛋白之间形成的至少一个C＝N双键；以及
将复合的多价结合物中基本上所有的C＝N双键还原成C-N键，产生复合的多价免疫原性结合产物。
在另一种实施方案中，描述了用于制造复合的多价免疫原性结合物的方法，包括：
将多种免疫原性不同的多糖与氰基化剂进行反应，产生多种氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖的混合物；
将至少一种蛋白与肼、碳酰肼、盐酸肼、二酰肼或其混合物在足以产生至少一种酰肼活化的蛋白的溶液的条件下进行反应；以及
将多种氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖的混合物与至少一种酰肼活化的蛋白在pH大约6到大约8下相接触，以便多种氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖能够同时与至少一种酰肼活化的蛋白发生反应，产生复合的多价结合物，该结合物包含在每个结合的免疫原性不同的多糖和蛋白之间形成的至少一个C-N键。
在另一种实施方案中，描述了用于制造复合的多价免疫原性结合物的方法，包括：
将蛋白与1-氨基-2，3-丙二醇(ADPO)在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基盐酸碳二亚胺存在下在pH大约6到大约7下进行反应，产生ADPO修饰的蛋白的溶液；
将ADPO修饰的蛋白与氧化剂进行反应，产生醛活化的蛋白的溶液；
将多种酰肼活化的免疫原性不同的多糖的混合物与醛活化的蛋白在pH大约5到大约8下相接触，以便多种酰肼活化的免疫原性不同的多糖能够同时与至少一种醛活化的蛋白发生反应，产生复合的多价结合物，该结合物包含在每个结合的免疫原性不同的多糖和蛋白之间形成的至少一个C＝N双键；以及
将复合的多价结合物中基本上所有的C＝N双键还原成C-N键，产生复合的多价免疫原性结合产物。
本文还公开了用于制备酰肼活化的蛋白的方法，包括：
将蛋白与肼、碳酰肼、盐酸肼、二酰肼或其混合物在存在下述物质的情况下进行反应：(i)碳二亚胺以及(ii)至少一种氨基酸、至少一种肽、或至少一种氨基酸和至少一种肽的混合物。
本文公开的另一种用于制造复合的多价免疫原性结合物的实施方案包括：
(a)将至少一种第一种醛活化的免疫原性不同的多糖与至少一种酰肼活化的蛋白在足以形成第一种结合物中间体的条件下相接触，以便在第一种免疫原性不同的多糖与蛋白之间形成至少一个C＝N双键；
(b)将至少一种第二种醛活化的免疫原性不同的多糖与第一种结合物中间体相接触，以便在第二种免疫原性不同的多糖与蛋白之间形成至少一个C＝N双键；以及
(c)将基本上所有的C＝N双键还原成C-N键，产生复合的多价免疫原性结合物产物(优选还原是单一步骤，以便所有的C＝N双键基本上同时被还原)；
其中第一种醛活化的免疫原性不同的多糖与酰肼活化的蛋白的反应性比第二种醛活化的免疫原性不同的多糖与酰肼活化的蛋白的反应性低。
根据参考随附的图进行的下面的详细描述，上述的以及其它的目的、特点和优点将变得更加明显。
附图简述
图1、不同的EDC浓度和反应时间下催化的、破伤风类毒素与肼或己二酸二酰肼(ADH)的活化产物(TTH)的HPLC图谱(280nm，使用Superose6柱)。反应条件是：(A)肼，24mM EDC反应4小时；(B)肼，12mM EDC，反应过夜；(C)ADH，36mM EDC反应4小时；(D)ADH，48mM EDC反应2小时。在图谱(A)中产物的分子量太高而不能通过柱子，因此没有显示出TTH信号。在图谱(B)中，只有少量的产物通过了柱子，在34分钟处显示出少许TTH峰。在图谱(C)和(D)中，产物通过了柱子，在34分钟处显示出TTH峰。
图2、在不同的赖氨酸浓度存在下的不同EDC浓度和反应时间所催化的、破伤风类毒素与肼或己二酸二酰肼(ADH)的活化产物(TTH)的HPLC图谱(280nm，使用Superose6柱)。反应条件是：(A)肼，24mM EDC，36mM赖氨酸，反应2小时；(B)肼，12mM EDC，144mM赖氨酸，反应2小时；(C)ADH，12mM EDC，36mM赖氨酸，反应1小时；以及(D)ADH，12mM EDC，72mM赖氨酸，反应4小时。在图谱(A)中，只有少量的产物通过柱子，并在34分钟处显示出少许峰。在图谱(B)、(C)和(D)中，产物通过了柱子，在34分钟处显示出单体的主峰，在31分钟处显示出二体的次峰。
图3、在72mM谷氨酸存在下的不同EDC浓度催化不同的反应时间下，破伤风类毒素与肼或己二酸二酰肼(ADH)的活化产物(TTH)的HPLC图谱(280nm，使用Superose6柱)。其它的反应条件是：(A)肼，24mM EDC，反应1小时；(B)肼，48mM EDC，反应1小时；(C)ADH，24mM EDC，反应1小时；以及(D)ADH，48mM EDC，反应2小时。产物通过了柱子，在34分钟处显示出单体的主峰，在31分钟处显示出二体的次峰。
图4、(A)活化的破伤风类毒素(TTH)、以及(B)通过结合方法A制备的联合的合成多价多糖-破伤风类毒素结合物(Conj.)的HPLC图谱(280nm，使用Waters Ultrahydrogel线性柱)。一旦与活化的多糖混合物结合，蛋白的信号从低分子量(17.5分钟)迁移到了高分子量(13.5分钟)。
图5、图4中联合的合成多价结合疫苗(B)中包含的结合成分多糖的ELISA检测。在HPLC级份中只有含有蛋白的物质(即结合物和游离TTH)在包被过程中附着到ELISA板上。然后用特异性针对每种相应的PS但是不与破伤风类毒素发生交叉反应的抗血清来检测结合的多糖。对于所有4种多糖来说，主峰在12-15分钟处被检测到，与图4中(B)的蛋白信号重叠。
图6、(A)活化的破伤风类毒素(TTH)、以及(B)通过结合方法B制备的联合的合成多价多糖-破伤风类毒素结合物(Conj.)的HPLC图谱(280nm，使用Waters Ultrahydrogel线性柱)。一旦与活化的多糖混合物结合，蛋白的信号从低分子量(17.5分钟)迁移到了高分子量(13.5分钟)。在产物混合物中还剩余一些游离的未结合的TTH。
图7、图6中联合的合成多价结合疫苗(B)中结合成分多糖的ELISA检测。在HPLC级份中只有含有蛋白的物质(即结合物和游离TTH)在包被过程中附着到ELISA板上，然后用特异性针对每种相应的PS但是不与破伤风类毒素发生交叉反应的抗血清来检测结合的多糖。对于所有4种多糖来说，主峰在12-15分钟处被检测到，与图6中(B)的蛋白信号重叠。
图8、(A)活化的破伤风类毒素(TTH)、以及(B)通过结合方法C制备的联合的合成多价多糖-破伤风类毒素结合物(Conj.)的HPLC图谱(280nm，使用Waters Ultrahydrogel线性柱)。一旦与活化的多糖混合物结合，蛋白的信号从低分子量(17.5分钟)迁移到了高分子量(13.5分钟)。在产物混合物中还剩余一些游离的未结合的TTH。
图9、图8中联合的合成多价结合疫苗(B)中结合成分多糖的ELISA检测。HPLC级份中只有含有蛋白的物质(即结合物和游离的TTH)在包被过程中附着到ELISA板上，然后用特异性针对每种相应的PS但是不与破伤风类毒素发生交叉反应的抗血清来检测结合多糖。对于所有4种多糖来说，主峰在12-15分钟处被检测到，与图8中(B)的蛋白信号重叠。
图10、(A)活化的破伤风类毒素(TTH)、以及(B)通过结合方法A制备的联合的合成多价多糖-破伤风类毒素结合物(Conj.)的HPLC图谱(280nm，使用Waters Ultrahydrogel线性柱)。一旦与活化的多糖混合物结合，蛋白信号从低分子量(17.5分钟)迁移到了高分子量(13.5分钟)。
图11、图10中联合的合成多价结合疫苗(B)中结合成分多糖的ELISA检测。HPLC级份中只有含有蛋白的物质(即结合物和游离TTH)在包被过程中附着到ELISA板上，然后用特异性针对每种相应的PS但是不与破伤风类毒素发生交叉反应的抗血清来检测结合多糖。对于所有4种多糖来说，高的ELISA信号在12-19分钟处被检测到。在12-15分钟处的高ELISA信号与图10中(B)的蛋白信号重叠，而15-19分钟处的高ELISA信号是由残留的小分子量结合物所引起。
图12、(A)活化的破伤风类毒素(TTH)、以及(B)通过结合方法B制备的联合的合成多价多糖-破伤风类毒素结合物(Conj.)的HPLC图谱(280nm，使用Waters Ultrahydrogel线性柱)。一旦与活化的多糖混合物结合，蛋白的信号从低分子量(17.5分钟)迁移到了高分子量(13.5分钟)。在产物混合物中剩有大量游离的未结合的TTH。
图13、图12中联合的合成多价结合疫苗(B)中结合成分多糖的ELISA检测。HPLC级份中只有含有蛋白的物质(即结合物和游离TTH)在包被过程中附着到ELISA板上，然后用特异性针对每种相应的PS但是不与破伤风类毒素发生交叉反应的抗血清来检测结合的多糖。对于所有4种多糖来说，高的ELISA信号在12-18分钟处被检测到。在12-15分钟处的高的ELISA信号与图12中(B)的蛋白信号重叠，而15-18分钟处的高ELISA信号是由残留的小分子量结合物所引起。
图14、在批次TTHACWY061126的联合的合成多价结合疫苗中结合成分多糖的ELISA检测。通过HPLC分析了含有0.05mg/mL蛋白(破伤风类毒素)和Mn A、C、W135和Y PS各0.0125mg/mL的25μL结合物样品。HPLC级份中只有含有蛋白的物质(即结合物和游离TTH)在包被过程中附着到ELISA板上，然后用特异性针对每种相应的PS但是不与破伤风类毒素发生交叉反应的抗血清来检测结合的多糖(实心符号)。Mn A、W135和Y PS显著掺入到结合物中则由它们对应的ELISA信号与Mn C PS的弱ELISA信号相比较来说明。这是由于与活化的Mn A、W135和Y PS相比，与TTH结合的活化Mn C PS的反应性较弱。该观察与显示了Mn C的效率较低的结合物的免疫原性数据相符合。天然的多糖混合物样品也平行地进行了分析(空心符号)。与该ELISA检测中的结合物相比，只有天然的Mn A PS显示出弱信号。
图15、在批次TTH2C/A/WY070209的联合的合成多价结合疫苗中结合成分多糖的ELISA检测。通过HPLC分析了含有0.05mg/mL蛋白(破伤风类毒素)和Mn A、C、W135和Y PS各0.0125mg/mL的25μL结合物样品。HPLC级份中只有含有蛋白的物质(即结合物和游离TTH)在包被过程中附着到ELISA板上，然后用特异性针对每个相应的PS但是不与破伤风类毒素发生交叉反应的抗血清来检测结合的多糖(实心符号)。天然的多糖混合物样品也平行地进行了分析(空心符号)。所有4种PS显著掺入到结合物中则由它们对应的ELISA信号与它们的天然PS的ELISA信号相比来说明。在图14中显示出的与TTH结合的活化Mn C PS的反应性较弱则用较高的剂量(在该情况下是加倍)和与活化的Mn A、W135和Y PS反应之前较早暴露于TTH来进行补偿。
发明详述
本文中使用的单数形式术语＂a＂、＂an＂和＂the＂包括了复数形式的所指物，除非在上下文中明确表示不是这样。同样，单词“或”旨在包括“和”，除非在上下文中明确表示不是这样。此外，本文使用的术语“包含”意味着“包括”。因此，“包含A或B”意味着包括A、B或A和B。此外，还应该理解，对于核酸或多肽或其它化合物给出的所有的核苷酸大小或氨基酸大小、以及所有的分子量或分子质量数值都是大约的，仅供说明。尽管与本文中描述的相似或等价的方法和材料也可用于本公开的实践或试验中，但合适的方法和材料将在下面描述。此外，材料、方法和例子仅仅是说明性的，并非意在限制。除非特别指明，本文所述的方法和过程不限于任何具体的序列或步骤中的实施。例如，多糖的活化可以在蛋白的活化之前、之后或平行地进行。
为了便于对本公开中的各种不同的实施例进行综述，提供了下列对特定的术语的解释：
“动物”包括活的多细胞脊椎动物生物体，该门类包括例如哺乳动物和鸟类。术语哺乳动物包括人类和非人类哺乳动物。同样地，术语“对象”包括人类和兽医对象，例如人类、非人类灵长动物、狗、猫、啮齿动物、马和牛。
“抗原”是可以被特定的体液或细胞免疫的产物、例如抗体分子或T细胞受体特异性结合的化合物、组合物或物质。抗原可以是任何类型的生物分子，包括，例如，简单的中间代谢物、糖类(例如寡糖)、脂类和激素以及大分子例如复合糖(例如多糖)、磷脂、核酸和蛋白。抗原的常见类别包括但不限于病毒抗原，细菌抗原，真菌抗原，原生动物和其它寄生虫抗原，肿瘤抗原，参与自身免疫性疾病、过敏和移植排斥的抗原，毒素以及其它的各种抗原。
“载体”是免疫原性分子，其可以结合半抗原或抗原例如多糖。当与载体结合时，结合的分子可变得更具有免疫原性。载体可以被选择，以增加结合的分子的免疫原性，和/或引发在诊断、分析和/或治疗上有益的针对载体的抗体。将分子共价连接到载体上提供了增强的免疫原性和T细胞依赖性(Pozsgay等，PNAS 96：5194-97，1999；Lee等，J.Immunol 1 16：1711-18，1976；Dintzis等，PNAS 73：3671-75，1976)。有用的载体包括聚合物载体，它们可以是天然的(例如来自细菌或病毒的蛋白)、半合成的或合成的物质，含有一个或多个可以结合反应剂部分的功能性基团。
用作载体的细菌产物的例子包括细菌毒素，例如炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)PA(包括能够引发免疫应答的含有至少一个抗原性表位的片段和类似物或衍生物)、LF和LeTx，以及其它的细菌毒素和类毒素，例如破伤风毒素/类毒素、白喉毒素/类毒素、绿脓杆菌(P.aeruginosa)外毒素/类毒素、百日咳毒素/类毒素以及产气荚膜梭菌(C.perfringens)外毒素/类毒素。病毒蛋白例如乙肝表面抗原和核心抗原也可以用作载体。
“共价键”是两个原子之间的原子间键，其特征为原子共享一对或多对电子。术语“共价结合的”或“共价连接的”是指使两个分离的分子成为一个相接的分子。
“表位”是抗原性决定簇。它们是分子上的特定化学基团或毗连的或非毗连的肽序列，具有抗原性，即引发特定免疫应答。抗体在抗体和匹配(或识别)表位的三维结构的基础上结合特定的抗原性表位。
“连接”、“接合”、“结合”或“联结”是指多糖与载体蛋白的共价键连接。共价键连接可以是直接的或间接的，例如通过分隔物分子连接。
“复合的多价免疫原性结合物”或“复合的多价结合疫苗”包含一个以上的抗原性表位。在第一种实施方案中，本文公开的复合的多价免疫原性结合物包括不同分子的混合物，每个分子含有不同的免疫原性不同的多糖，其中每个不同的免疫原性不同的多糖被结合到分离的蛋白载体上。在第二个实施方案中，本文公开的复合的多价免疫原性结合物包括的分子中多种免疫原性不同的多糖被结合到单个蛋白分子或单个蛋白构建物(该蛋白构建物本身包含一种以上的不同蛋白)上。第三个实施方案包括第一种实施方案的结合物和第二个实施方案的结合物的混合物。第一种实施方案的例子可以描述为下式表示的不同结构的混合物：
P1-PS1；P1-PS2；以及P1-PS3
其中P1是载体蛋白；PS1、PS2和PS3各是免疫原性不同的多糖。
第二个实施方案的例子可以被描述为下式表示的结构：
其中P1是载体蛋白；PS1、PS2和PS3各是共价连接到P1上的免疫原性不同的多糖。
上式中的蛋白和多糖可以是单个或多个结构单元，在蛋白和多糖之间形成至少一个键。
“免疫应答”是免疫系统的细胞例如B细胞、T细胞、巨噬细胞或多形核细胞对刺激的反应。免疫应答可以包括身体中参与宿主防御反应的任何细胞，例如分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫应答包括但不限于先天性免疫应答或炎症。
本文中使用的术语“免疫原性结合物或组合物”是指用于在脊椎动物中刺激或引发特定的免疫应答(或免疫原性反应)的组合物。在某些实施方案中，免疫原性反应是保护性的或提供了保护性免疫，因为它使脊椎动物能够更好地抵抗由免疫原性组合物所对抗的生物体造成的感染或疾病进程。一类免疫原性组合物的一个具体例子是疫苗。
“免疫原”是指在适当条件下能够在动物中刺激抗体的产生或T细胞反应的化合物、组合物或物质，包括被注射或吸收到动物中的组合物。
“免疫原性不同的多糖”包括了引发的免疫应答与另一种类型的多糖引发的免疫应答不同的多糖。免疫原性不同的多糖可以是来自不同的有荚膜的细菌的两种或多种多糖。例如，与脑膜炎球菌多糖相比，肺炎球菌多糖是免疫原性不同的多糖。免疫原性不同的多糖也包括来自不同的血清组或血清型的两种或多种多糖。例如，与血清组B的脑膜炎球菌多糖相比，血清组A的脑膜炎球菌多糖是免疫原性不同的多糖。
“抑制或治疗疾病”包括在处于疾病例如炭疽病风险的对象中，抑制疾病或病状的全面发展。“治疗”是指在疾病或病理性状况开始发展之后缓解疾病或病状的征象或症状的治疗性干预。本文中使用的术语“缓解”对于疾病、病理性状况或症状来说，是指治疗的任何可以观察到的有益效果。有益的效果可以被例如在易感对象中疾病临床症状的延迟发作、疾病的某些或所有临床症状的严重性降低、疾病的进程减慢、疾病的复发次数减少、对象的整体健康或舒适改善、以及本技术领域中熟知的对于具体疾病来说是特异性的其它参数所证明。
“肽”包括其中结构单元是至少两个通过酰胺键连接到一起的氨基酸残基的分子。肽包括二肽、三肽或寡肽。术语“残基”或“氨基酸残基”包括对掺入到肽中的氨基酸的指代。
“治疗有效量”是指特定药剂在用该药剂治疗的对象中足以产生所需效果的量。例如，它可以是在对象中用于对感染和细菌感染引起的疾病增加抵抗、预防、缓解和/或治疗的多价多糖结合物的量。理想情况下，药剂的治疗有效量是足以在对象中对感染和感染引起的疾病增加抵抗、预防、缓解和/或治疗而在对象中不引起显著的细胞毒性效果的量。用于在对象中对感染和感染引起的疾病增加抵抗力、预防、缓解和/或治疗的有效药剂量将依赖于被治疗的对象、疾病的严重性、以及治疗性组合物的给药方式。
疫苗是在对象中引发预防性或治疗性免疫应答的药物组合物。在某些情况下，免疫应答是保护性反应。典型情况下，疫苗引发针对病原体例如细菌或病毒病原体的抗原、或针对与病理状况相关的细胞组分的抗原特异性免疫应答。疫苗可以包括多核苷酸、肽或多肽、多糖、病毒、细菌、细胞或一种或多种细胞组分。在某些情况下，病毒、细菌或细胞可以被失活或减毒，以防止或降低感染的可能性，同时维持疫苗组分的免疫原性。
本发明公开了制备复合的多价免疫原性结合物和结合疫苗的新方法。在一种实施方案中，多价结合物和结合疫苗是通过使用酰肼化学方法，将一种以上的多糖的混合物以所需的多糖成分比率与至少一种载体蛋白相结合来合成的。由于酰肼化学在结合中的高效率，多糖被有效结合到载体蛋白上，使得获得的复合的合成疫苗结合产物不需要繁琐和复杂的纯化步骤例如色谱和/或硫酸铵沉淀，就能够在小鼠中有效诱导针对每种多糖成分的抗体。本文公开的某些实施方案中的方法，通过在包含至少两种免疫原性不同的多糖的单个反应混合物或批次中使用同时的结合反应，简化了多价结合疫苗的制备。这种单批同时反应消除了制造多价结合疫苗的常规方法中使用的对每种多肽疫苗结合物组分的多种平行合成工艺的需要。换句话说，按照常规的方法，每个单独的多糖结合物组分通过单独的过程来制备，然后将获得的单个多糖结合物组分混合在一起成为单剂制剂(参见例如US2005/0002948Al的段落[0033])。按照这里公开的本发明方法合成多价结合物和疫苗将显著降低生产成本并便于接种免疫的野外应用，因此极大地促进了公众健康。
在本公开的方法中，高效率的化学被用于多价结合疫苗的组合合成，这样的话，所有活化的多糖成分都能够与活化的蛋白形成结合物，这通过HPLC结合ELISA检测，使用相应的PS特异性的抗体进行检测。
在某些实施方案中，首先将反应性较低的多糖与活化的蛋白进行反应。然后将反应性较高的多糖与反应性较低的PS/蛋白中间体结合物进行反应。首先用反应性较低的多糖进行反应以提供较长的没有反应性较高的多糖进行竞争的反应时间，以便有较大量的反应性较低的多糖被结合。
活化的多糖与活化的蛋白的相对反应性是指结合的多糖的反应速度和/或量。达到较高反应速度和/或较大量的结合表明多糖反应性较高。活化的多糖的反应性依赖于至少几个因素：活化的程度(结合的功能性基团越多，反应性越高)；链的长度(在同样的活化程度下，含有较多功能性基团的较长链具有较高的反应性)；以及多糖的结构(空间位阻、结构稳定性等)。
在还原胺化结合的具体情况下，多糖的活化程度由活化剂(例如NaIO4)、温度、反应时间和多糖的结构来控制。活化剂断裂Mn C多糖链，但是不断裂Mn A、Mn W135和Mn Y多糖的链。在氰基化结合的具体情况下，多糖的活化程度由活化剂、pH、反应时间和多糖的羟基基团密度来控制。相对于Mn W135和Mn Y多糖来说，Mn A和Mn C多糖具有较低的羟基密度。已经发现，一般来说，相对于Mn W135和Mn Y多糖的反应性来说，活化的Mn C和Mn A多糖的反应性较低。
如上所述，本文中还公开了活化载体蛋白的新方法，包括将蛋白与肼、碳酰肼、二盐酸肼、二酰肼(例如琥珀酰二酰肼或己二酸二酰肼)或其混合物在(i)1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和(ii)至少一种氨基酸、至少一种肽、或至少一种氨基酸和至少一种肽的混合物存在下进行反应。正如下面描述的那样，新的蛋白活化方法对于可用于结合单价结合疫苗的多糖或多价(或复合的多价)结合疫苗的多糖混合物。有用的氨基酸包括α-L形式(或异构体，通常称为L-氨基酸)的蛋白氨基酸。其它氨基酸包括α-D形式(D-氨基酸)、β-形式(β-氨基酸)、γ-形式、δ-形式和∈-形式等。示例性的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、半胱氨酸及其混合物。在活性组合物中存在的氨基酸的宽的、优选的和更优选的浓度范围分别为1-500mM、20-300mM和36-144mM。
尽管不受任何理论的束缚，但相信在活化反应过程中氨基酸也可以象肼一样掺入到蛋白分子中。被掺入的氨基酸残基可能扰乱蛋白的水合环境并提供空间位阻，导致阻止了蛋白的聚集和沉淀。
在一个例子中，该方法包括在受控条件下，通过用碳二亚胺催化将蛋白与过量的肼、碳酰肼、琥珀酰二酰肼或ADH进行反应，在载体蛋白上引入至少一个酰肼基团，受控条件包括1)反应时间、2)EDC的浓度和3)反应中的氨基酸或氨基酸混合物的浓度。获得的酰肼活化的载体蛋白可以在延长的时期中(例如至少大约1年)在中性pH下保持可溶。
合成和生产多糖-蛋白结合疫苗的常规方法一般使用的结合反应效率较低(典型为大约20％)。这意味着多达80％的添加的活化多糖损失了。此外，通常需要从未结合的PS中纯化结合物的色谱过程。优选实施方案的合成方法利用了一种反应剂上的酰肼基团的特征性的化学性质与另一种反应剂上的醛基或氰酸酯进行反应，结合物产率提高(通常高达大约60％)。
当结合反应以较高的结合效率进行时，反应后残留的未结合的蛋白和多糖的量可能会足够低，使得不需要移除它们。因此，纯化结合产物的过程可以被简化成例如除去小分子副产物的透滤步骤。基于酰肼的结合反应可以在1到3天内进行到完成，反应剂的浓度为从大约1到大约50、特别是大约1到大约40mg/mL，或大约1到大约50mg/mL，PS/蛋白的重量比从大约1:5到大约5:1，优选从大约1:2到大约2:1，最优选大约1:1，尽管在某些实施方案中更高或更低的比率可能是优选的。结合反应优选在从大约4℃到大约40℃的温度下进行，优选从大约4、10、15或20℃到大约25、30或35℃，pH为大约6到大约8.5，优选从大约6.1、6.2、6.3、6.4或6.5到大约6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3或8.4，最适的条件根据多糖而变化。因此，当使用基于酰肼的结合反应时，可以以较低的成本生产结合疫苗。
为了克服合成结合疫苗的常规方法的某些缺点，提供了在还原胺化和氰基化结合反应中使用酰肼化学将PS与载体蛋白结合的方法。具有-NH-NH2结构的酰肼基团通过与肼、ADH、碳酰肼或琥珀酰二酰肼的碳二亚胺反应被引入到蛋白分子的天冬氨酸和/或谷氨酸残基的羧基基团上。在一种实施方案中，活化的蛋白在结合前，与浓度为大约3以下到大约10mM以上、优选从大约4或5mM到大约6、7、8或9mM的缓冲液在pH从大约10到大约11.5下维持可溶，优选pH从大约10.1、10.2、10.3、或10.4到大约10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3或11.4，最优选为大约10.5。适合的缓冲液包括但不限于Na2CO3、3-(环己胺)-1-丙磺酸(CAPS)和2-(N-环己胺)乙磺酸(CHES)。在另一种实施方案中，通过在至少一种上述的氨基酸存在下活化蛋白，活化的蛋白在中性或近似中性的pH(例如pH大约7到大约7.5)下维持可溶，下文将更详细地举例。
然后将活化的蛋白与含有醛(还原胺化)或氰酸酯(氰基化结合)基团的活化多糖在缓冲液存在下进行反应，pH为大约6到大约8.5，优选从大约6.1、6.2、6.3、6.4或6.5到大约6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0，缓冲液的浓度为大约100mM以下到大约200mM，优选从大约110、120、130、140或150mM到大约160、170、180或190mM。适合的缓冲液包括但不限于N-(2-羟基乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、2-吗啉基丙磺酸(MOPS)和N，N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)。
或者，PS可以用酰肼基团功能化。活化的PS可以在使用强缓冲液获得的pH6.5-7.5下与含有醛基(还原胺化)的活化蛋白结合。蛋白在用弱缓冲液的pH大约10.5下维持可溶直到结合点。由于在中性/弱酸性条件下与赖氨酸的∈-氨基基团(pKa＝10.5)相比，酰肼基团(pKa-2.6)具有较高的反应性，并且使用结合之前在大约pH10.5下维持可溶的活化蛋白增加结合物的溶解性，极大地提高了结合反应的产率。
通过这些方法制备的结合物在实验动物中具有免疫原性，这被对小鼠进行的实验所证实。此外，结合反应可以无需氰基硼氢化钠而有效地进行，因此避免了在结合物产物中引入氰化物离子。反应可以在弱酸性或中性pH条件下在4℃进行1-3天或在室温进行过夜，与此相比常规的还原胺化结合方法要进行几天。这再次确保了对于不稳定的多糖、例如来自b型流感嗜血杆菌、19F型肺炎链球菌(Streptocuccuspneumonias)和A类脑膜炎奈瑟菌的多糖的高产率结合疫苗的生产。优选的实施方案的方法可以用于生产较廉价的复合多价结合疫苗，因此极大地促进了公众健康。
多糖
术语“多糖”用于本文中时是一个广义的术语并以其通常的意义使用，包括但不限于含有多个重复单元的糖类，包括但不限于具有50个以上重复单元的多糖以及具有50个以下的重复单元的寡糖。通常，多糖具有从大约50、55、60、65、70、75、80、85、90或95个重复单元到大约2000个以上的重复单元，优选从大约100、150、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900或1000个重复单元到大约1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800或1900个重复单元。寡糖通常大约从大约6、7、8、9或10个重复单元到大约15、20、25、30或35到大约40或45个重复单元。
适合用于优选实施方案的多糖包括来自有荚膜的细菌的多糖或寡糖。多糖和寡糖可以来自任何来源，例如它们可以来自于天然存在的细菌、遗传工程的细菌，或者可以是合成生产的。多糖和寡糖在活化前可以进行一个或多个处理步骤，例如纯化、功能化、使用温和的氧化条件解聚化、脱乙酰化等。如果需要，也可以使用后处理步骤。本技术领域中已知的用于合成、制备和/或纯化适合的多糖和寡糖的任何适合的方法都可以使用。
用于优选实施方案的多糖和寡糖包括例如血清组1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的肺炎球菌多糖，血清型A、B、C、W135和Y的脑膜炎球菌多糖，b型流感嗜血杆菌多糖多聚磷酸核糖基核糖醇，血清型III和V的B类链球菌多糖以及伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)Vi多糖。其它肺炎球菌和B类链球菌血清型以及脑膜炎球菌血清组的多糖也适合用于本发明，其它的T细胞不依赖性多糖和寡糖抗原也是同样，例如来自A类链球菌、葡萄球菌(Staphylococci)、肠球菌(Enterococci)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、大肠杆菌(E.coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)的多糖和寡糖。尽管特别优选细菌多糖和寡糖，但革兰氏阴性细菌的脂多糖和脂寡糖以及它们的多糖和寡糖衍生物、以及病毒的多糖和寡糖也可以使用。
具有侧链磷和/或骨架磷的多糖适合用于优选的实施方案中。优选实施方案的结合反应特别适合于使用在骨架中具有磷的多糖。这样的多糖对于片段化和降解敏感，因此低温(4℃)反应条件和快速的结合反应由于减少了多糖的降解而产生了较高质量的结合物。
在完成了任何前加工步骤之后，将多糖或寡糖进行“活化”步骤。术语“活化”是指对多糖进行化学处理以提供能够与蛋白反应的化学基团。在特别优选的实施方案中，活化包括用与功能化的蛋白上的酰肼基团反应的醛基、酮基或氰酸酯基使多糖或寡糖功能化。或者，多糖和寡糖也可以用与功能化的蛋白上的醛基或酮基反应的酰肼基团来功能化。
按照一种实施方案，一种以上的多糖的混合物可以通过与单一的活化剂(或活化剂的混合物)在单一批式步骤中反应而同时被活化。例如，Mn A、Mn C、Mn W135和Mn Y多糖的混合物可以与醛功能化剂在单一批式反应中进行反应。按照另一种实施方案，每个个体多糖可以通过在单独的步骤中与活化剂反应来活化。然后可以在结合步骤之前将单独活化的多糖混合在一起，以便活化的多糖可以在单一过程中同时进行结合。
任何适合的功能化反应都可以用于用氰酸酯基团活化多糖或寡糖。优选多糖或寡糖与1-氰基-4-二甲基铵吡啶四氟硼酸盐在三乙醇胺存在下进行反应。
任何适合的功能化反应都可以用于用醛基活化多糖或寡糖。某些多糖或寡糖具有能够参与结合反应的末端醛基。如果用醛基活化多糖或寡糖，优选的反应包括与氧化剂例如NaIO4反应。氧化剂具有使多糖或寡糖断裂的潜力。不利的断裂可以通过选择具体的氧化剂和使用的氧化剂的浓度来避免或控制。酮基也能够与酰肼反应，因此在某些实施方案中可以采用以酮基来活化多糖或寡糖。
任何适合的功能化反应都可以用于用酰肼基团活化多糖或寡糖。优选的功能化反应是还原胺化，其中多糖或寡糖在高碘酸活化反应中与NaIO4进行反应以产生醛基，然后醛基与肼和己二酸二酰肼反应，接着用NaBH4后续还原。或者，也可以使用氰基化结合反应，其中多糖或寡糖与溴化氰或1-氰基，4-二甲基铵吡啶四氟硼酸盐进行反应以导入氰酸酯基团，氰酸酯基团然后与肼和己二酸二酰肼反应。也可以使用碳二亚胺反应，其中多糖或寡糖与己二酸二酰肼在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐存在下进行反应。
强缓冲的(在pH从大约6.5到大约8下，使用从大约100mM到大约200mM的高缓冲液浓度)活化多糖的溶液优选以强缓冲的溶液形式用于结合反应中。可以使用任何适合的缓冲液，优选的缓冲液例如N-(2-羟基乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)或磷酸盐缓冲盐水。
蛋白
活化的多糖或寡糖与蛋白结合以产生结合疫苗。适合的蛋白包括细菌毒素，它们是免疫有效的载体，并已经通过化学或遗传的手段使其在用于对象时是安全的。例子包括失活的细菌毒素例如白喉类毒素、CRM197、破伤风类毒素、百日咳类毒素、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST以及来自铜绿假单胞菌的外毒素A。细菌的外膜蛋白例如外膜复合物c(OMPC)、膜孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素(pneumolysis)、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附素蛋白(PsaA)或肺炎球菌表面蛋白BVH-3和BVH-11也可以使用。其它的蛋白，例如炭疽芽胞杆菌的保护性抗原(PA)和炭疽芽胞杆菌的脱毒的水肿因子(EF)和致死因子(LF)、卵清蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)也可以使用。优选蛋白是无毒性和无反应原性的蛋白，并且可以依照优选实施方案的结合方法以足够的量和纯度获得。例如，白喉毒素可以从白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)的培养物中纯化，并使用甲醛进行化学脱毒以产生适合的蛋白。
含有至少一个T细胞表位的天然毒素或类毒素的片段也可以使用，外膜蛋白复合物以及上面列出的各种不同蛋白的某些类似物、片段和/或类似物片段也可以使用。蛋白可以从天然来源获得，可以通过重组技术生产，或者通过本技术领域中已知的合成方法来生产。类似物可以通过各种手段获得，例如蛋白中的某些氨基酸可以用其它的氨基酸取代，而不会引起可察觉的与结构例如抗体的抗原结合区域或底物分子上的结合位点的相互结合能力的丧失。其它的蛋白也可以使用，例如含有表面暴露的谷氨酸或天冬氨酸基团的蛋白。
任何适合的功能化反应都可以用于用酰肼基团活化蛋白。制备酰肼修饰的蛋白的常规方法包括EDC催化和使用N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯和巯基酰肼通过蛋白的赖氨酸∈-氨基基团的两步工艺。参见King等，Biochemistry1986；25：5774-5779。通过EDC催化制备的修饰蛋白通常需要被分级以便使它适合用于结合，并且两步工艺是繁琐的。因此，一般来说不优选使用这样的方法制备酰肼修饰的蛋白。但是，在某些实施方案中这样的方法是可以接受的或甚至是理想的。
优选酰肼基团通过蛋白上天冬氨酸和谷氨酸残基的羧基基团使用碳二亚胺反应导入到蛋白中，例如，通过在EDC存在下与肼、碳酰肼、琥珀酰基二酰肼、己二酸二酰肼、盐酸肼(例如二盐酸肼)或任何其它的二酰肼进行反应。EDC被用作催化剂，用肼或二酰肼活化和修饰蛋白反应剂。任何水溶性的碳二亚胺包括EDC都可以用作催化剂。EDC催化的蛋白一般具有聚合和沉淀的趋势。参见Schneerson等，Infect.Immun.1986，52：519-528；Shafer等，Vaccine2000；18(13)：1273-1281；和Inman等，Biochemistry 1969；58：4074-4082。活化蛋白的聚集和沉淀部分依赖于其pH环境。因此，聚合和沉淀的趋势可以通过使这些酰肼修饰的蛋白在缓冲溶液中保持溶解来进行控制。通过对反应混合物进行缓冲液交换以维持活化蛋白在大约10.5的pH下，活化的蛋白保持溶解和稳定以用于结合。任何适合的缓冲液都可以使用。优选使用弱缓冲液，例如从大约3mM到大约10mM的低浓度的Na2CO3。
然后可以将缓冲的酰肼修饰的蛋白用于制备蛋白-多糖结合物，这样的蛋白当在pH从大约6到8.5、优选从大约6.5到大约8下加入到活化的多糖中时，不会沉淀。任何适合的功能化反应都可以用于用醛基活化蛋白。优选蛋白在EDC存在下与1-氨基-2，3-丙二醇进行反应，然后用NaIO4进行氧化。氨基糖例如葡萄糖胺、半乳糖胺等可用于代替1-氨基-2，3-丙二醇。在该反应中也是用EDC作为催化剂，用氨基二醇通过蛋白的天冬氨酸和谷氨酸残基的羧基基团活化和修饰蛋白。
蛋白也可以在上述氨基酸或氨基酸混合物存在下进行活化，并在大约7到大约7.5的中性pH下维持可溶。
通过还原胺化制备结合物
结合物可以通过醛和酰肼基团的反应(还原胺化)来制备。还原胺化结合反应可以用于将酰肼修饰的反应剂(蛋白或多糖)与另一个含有醛基基团的成分进行结合。
在常规的还原胺化中，醛基和氨基之间的反应是可逆的和不利的，以至于需要氰基硼氢化钠通过将C＝N双键转化为C-N单键使得整个还原胺化事件不可逆，来促进结合。相比之下，优选实施方案的还原胺化结合反应不需要氰基硼氢化钠的帮助就能够进行，这是由于酰肼-醛反应的高效率。在还原胺化结合反应结束时，硼氢化钠或另一种适合的还原剂被用于将C＝N双键还原成C-N单键，同时将任何残留的醛基还原成醇基。优选实施方案的还原胺化结合反应避免了获得的结合物被氰基硼氢化钠的副产物氰化物污染。
为了在结合反应过程中减少活化蛋白的沉淀，活化蛋白优选是具有从大约3mM到大约10mM的低缓冲液浓度的弱缓冲溶液的形式，加入到强缓冲的(pH从大约6.5到大约7.5，具有从大约100mM到大约200mM的高缓冲液浓度)活化多糖溶液中。优选活化蛋白溶液的pH被缓冲到大约pH10到大约pH11.5，最优选到大约pH10.5。活化的多糖溶液优选被强缓冲到从大约pH6到大约pH8，最优选从大约pH6.5到大约pH7.5。酰肼-醛还原胺化反应快速进行，pH低于10.5(例如pH低至从大约8.5到大约9.5)对活化蛋白的沉淀效应被反应性活化多糖的分子性质所克服。
通过氰基化结合制备结合物
结合物可以通过酰肼和氰酸酯基团的反应(氰基化结合)来制备。氰基化结合反应是有效和可逆的，有利于产物的形成。在某些实施方案中，使用了阻断剂以除去残留的氰酸酯基团。但是，在反应混合物中加入阻断剂驱使结合反应向反向进行，使结合产率降低了5-12％。研究了各种不同阻断剂对产率的影响。将肺炎球菌多糖Pn 18C PS用CDAP活化，然后与酰肼活化的破伤风类毒素(TTH)结合过夜。5份等份试样加入水或阻断剂到0.2M。孵育4小时后，通过HPSEC使用Waters Ultrahydrogel 2000柱子用280nm监测器分析样品。表C中提供的每个样品的结合产率被测定为15.5分钟处结合物峰占总蛋白、即结合物峰加上游离TTH峰(在22分钟处)中的面积％。尽管在某些实施方案中可能希望使用阻断剂淬灭剩余的残留氰酸酯基团，但是通常优选避免使用它们以避免降低结合物产率。
表C
 
阻断剂(0.2M) 结合产率 ％对照 ％降低
无(对照) 75 100 0
ADH 63 84 16
肼 70 93 7
甘氨酸 66 89 11
乙醇胺 65 87 13
为了不使用阻断剂移除结合产物中残留的氰酸酯基团，可以延长结合时间。优选结合在温度从大约0℃到大约5℃下进行大约36到大约48小时，最优选在大约4℃进行大约36小时，然后在从大约20℃到大约25℃的温度下再进行大约18到24小时，最优选在大约20到24℃下进行大约18小时，使得残留的氰酸酯基团与水反应并分解。如果需要，可以使用更长或更短的结合时间和/或更高或更低的结合温度，并可以进行各种不同的时间和温度下不同的步骤顺序。但是，希望至少在开始时在低温下进行结合反应，优选从大约0℃到大约5℃，更优选在大约4℃，以便减少结合物沉淀的程度。
由于结合产物具有高结合产率和高免疫原性，可以不需要纯化步骤，例如柱层析和/或将结合物从未结合的多糖中进行硫酸铵沉淀。但是，在某些实施方案中可能希望进行一个或多个纯化步骤。
结合物
两种反应剂每个分子都含有多个反应性基团。活化的多糖分子可以与一个以上的活化蛋白分子反应并与其形成一个以上的键。同样地，活化的蛋白分子可以与一个以上的活化多糖分子反应并与其形成一个以上的键。
因此，结合物产物是各种交联的基质类型的晶格结构的混合物。例如可以存在单一的键，或者可以存在2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多的键。优选情况下，在多糖和蛋白之间的平均键数可以被调节。优选的平均键数可以依赖于多糖的类型、蛋白的类型、结合方法、反应条件等。一般来说，存在平均1个键到大约2、3、4或5个键，以便避免由于过度结合而干扰蛋白刺激免疫系统的能力，同时不引起多糖结构的变化。但是，在某些实施方案中，5个以上的键是可以接受的或甚至是希望的。
如上所述，复合的多价结合物通过本文公开的方法生产。复合的多价结合物中包含的免疫原性不同的多糖的数量没有限制，在某些实施方案中可以在从2到28个的范围内，优选5到25个，最优选15个。复合的多价结合物中包含的不同载体蛋白的数量也没有限制，在某些实施方案中可以在从1到10个的范围内，优选4到6个，最优选5个。例如，一个载体蛋白分子可以与2、3、4、5、6个等免疫原性不同的多糖结合。构建的结合物可以包含晶格结构，其中包含了两个以上彼此结合的不同蛋白分子和2、3、4、5、6个等免疫原性不同的多糖。
结合后，可以通过任何适合的方法纯化结合物。纯化被用于除去未反应的多糖、蛋白或小分子反应副产物。纯化方法包括超滤、体积排阻色谱、密度梯度离心、疏水相互作用色谱、硫酸铵沉淀等，这些在本技术领域中是已知的。正如上面讨论的那样，优选实施方案的结合反应以高产率进行，并产生较少的不需要的小分子反应副产物。因此，纯化可能不是必需的，或者可能只需要很小程度的纯化例如透滤。按照需要，结合物可以被浓缩或稀释或加工成任何适合的形式用于药物组合物中。
治疗方法
按照优选实施方案制备的结合物以适合的形式、以免疫有效的剂量施用于对象以预防和/或治疗感染性疾病。本文中使用的术语“对象”是指动物，例如哺乳动物。例如，被考虑到的哺乳动物包括人类、灵长类、狗、猫、绵羊、牛、山羊、猪、马、小鼠、大鼠、兔、豚鼠等。术语“对象”、“患者”和“宿主”可以互换使用。本文中使用的结合疫苗的“免疫有效的”剂量是适合引发免疫应答的剂量。具体的剂量依赖于被治疗的对象的年龄、体重和医疗状况，并依赖于给药的方法。适合的剂量可以被本技术领域的专业人员容易地确定。
含有优选实施方案的结合疫苗的药物组合物可以提供超过传统疫苗的各种优点，包括增强免疫原性弱的抗原的免疫原性、可能减少抗原的使用量、降低加强接种免疫的频率、改进功效、对免疫的优先刺激、或可能定向免疫应答。疫苗可以通过各种途径给药于对象，正如下面讨论的那样，包括但不限于肠胃外(例如通过脑池内注射和输注技术)、真皮内、跨膜、经皮(包括局部外用)、肌内、腹膜内、静脉内、动脉内、病变内、皮下、口服和鼻内(例如吸入)给药途径。结合疫苗可以通过推注或通过连续输注进行给药，以及通过局部给药，例如在疾病或损伤的位点。结合疫苗也可以任选在药物或生理可接受的介质中给药。
本文使用的术语“疫苗”是广义术语，以其平常的意义来使用，包括但不限于优选实施方案的结合物或用佐剂、稀释剂、赋形剂、载体和其它可药用的物质配制的其它抗原。术语“可药用的”被用于指称与生物系统例如细胞、细胞培养物、组织或生物体相容的无毒性的物质。
使用优选实施方案的结合物的免疫方案为预防或治疗对象中的疾病、病症和/或感染提供了组合物和方法。本文中使用的术语“治疗”是广义术语，以其平常的意义来使用，包括但不限于治愈性、防止性、预防性、姑息性和/或缓解性治疗。
优选疫苗组合物是无菌的，并且在适合给对象施用的重量或体积单位中含有治疗或预防有效量的结合物。本文使用的术语“可药用的载体”是指适合于在对象中施用的一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包囊物质。术语“载体”表示天然的或合成的有机或无机成分，活性成分与其组合以方便应用。载体的特性依赖于给药途径。生理可接受或可药用的载体包括稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和其它本技术领域中熟知的物质。
药物组合物的成分也能够与优选实施方案的结合物以及彼此之间共混，使得没有明显损害所需的药物功效的相互作用。
将优选实施方案的结合疫苗配制成药物组合物可以使用本技术领域已知的方法来完成。疫苗组合物也可以含有一种或多种佐剂。适合的佐剂包括，例如，铝佐剂如氢氧化铝或磷酸铝、弗氏佐剂、BAY、DC-chol、pcpp、单磷酰脂A、CpG、QS-21、霍乱毒素和甲酰甲硫氨酰肽。参见例如《疫苗设计，亚基和佐剂方法》(Vaccine Design，theSubunit and Adjuvant Approach，1995(M.F.Powell和M.J.Newman主编，Plenum Press，N.Y.))。
给对象施用的结合疫苗的剂量和用药方案，可以依照药物和兽医技术领域的专业人员熟知的标准技术，在考虑各种因素例如所打算的应用、具体的抗原、佐剂(如果存在的话)、年龄、性别、体重、物种、大体状况、之前的疾病和/或治疗、以及给药途径后，进行确定。初步的剂量可以根据动物实验来确定，对于人类用药的剂量的缩放按照本技术领域接受的实践方法例如标准的剂量试验来进行。例如，治疗有效剂量最初可以从血清抗体水平测试来估计。剂量依赖于结合物的比活性，并可以通过常规的实验容易地测定。
在实施免疫方案治疗和/或预防具体疾病中，给对象施用治疗有效量的结合物。“有效量”是指足以显示出对对象有意义的益处的的治疗剂(例如结合物)和其它活性成分的总量，其中有意义的益处例如增强的免疫应答、相关医学病况(疾病、感染等)的治疗、治愈、防止或缓解、或增加了这些病况的治疗、治愈、防止或缓解的速度。当“有效量”被用于单独给药的个体治疗药剂时，该术语只是指该治疗剂。当用于组合时，该术语是指产生治疗效果的成分的组合量，不论是组合、连续还是同时给药。本文中使用的词组“施用有效量”的治疗剂，是指用所述治疗剂治疗对象的量和时间足以诱导反映疾病、感染或病症的严重性的至少一种指标的改善、优选为持续的改善。
如果患者在相隔一段时间的至少两个时机表现出了改善，这种改善可以被认为是“持续的”。改善的程度可以根据例如免疫学数据或疾病、感染或病症的征象或症状来确定。可以对各种不同的反映患者的疾病程度的指标进行评估以确定治疗的量和时间是否充分。可以根据对患者在第一剂治疗剂用药之前进行的检查、或根据从健康的患者群体中产生的统计学值来建立选择性指标的基线值。如果施用治疗剂治疗急性症状，第一剂用药应该尽可能快。通过施用治疗药剂诱导改善，直到对象对于所选的指标显示出超过了基线的改善。在治疗慢性病症中，这种程度的改善通过在一段时期内、例如1、2或3个月或以上或无限期地重复施用治疗药剂来获得。单剂药剂可能就足以治疗或预防某些疾病。如果需要的话，不论患者的病症如何，治疗可以以同样的水平或以减少的剂量或频率无限期地持续。一旦治疗被减少或中止，以后如果症状重新出现，治疗可以恢复。
一般来说，为针对细菌感染的预防接种提供有效剂量或治疗有效剂量的结合物的量为每公斤体重从大约1μg以下到大约100μg以上，优选从大约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50μg到大约55、60、65、70、75、80、85、90或95μg。如果感染后经过的时间短，有效剂量可能需要较少的抗体，因为细菌增殖的时间较少。有效剂量也可以依赖于诊断时的细菌载量。对于治疗性应用来说，可以考虑在几天的时期内进行多次注射给药。
结合疫苗可以作为单剂或者系列施用，包括一次或多次加强。例如，婴儿或儿童可以在幼时接受单剂，然后使用加强剂直到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年后。加强剂从接触过抗原的B细胞产生抗体，即记忆应答。也就是说，结合疫苗在婴儿或儿童中引发了高的初级功能性抗体反应，并在加强剂给药后能够引发记忆应答，这证实了结合疫苗引发的保护性免疫应答是持久的。
结合疫苗可以配制成液体制剂用于例如口、鼻、肛门、直肠、颊、阴道、经口、胃内、粘膜、经舌、肺泡、牙龈、嗅觉道或呼吸道粘膜给药。适合这样给药的形式包括悬浮液、糖浆和酏剂。结合疫苗也可以配制成用于肠胃外、皮下、真皮内、肌内、腹膜内或静脉内给药、可注射给药、从植入物持续释放、或通过滴眼液给药。适合用于这样的给药形式包括无菌悬浮液和乳液。这样的结合疫苗可以与适合的载体、稀释剂或赋形剂例如无菌水、生理盐水、葡萄糖等混合。结合疫苗也可以被冷冻干燥。结合疫苗可以含有辅助性物质、例如增湿剂或乳化剂、Ph缓冲剂、增加胶凝或粘度的添加剂、防腐剂、调味剂、色素等，这依赖于给药途径和所需的制剂。可以参考标准的教科书不需过度的实验来制备适合的制剂，例如《雷氏药物科学与实践》(＂Remington：The Science and Practice of Pharmacy＂)，LippincottWilliams & Wilkins，第20版，2003年6月1日)和《雷氏药物学》(＂Remington′s Pharmaceutical Sciences＂)，Mack Pub.Co.，第18和19版(分别为1985年12月和1990年6月)，在此以其全文引为参考。这样的制剂可以包含络合剂、金属离子、聚合化合物例如聚乙酸、聚羟基乙酸、水凝胶、葡聚糖等、脂质体、微乳液、微团、单层或多层介质、红细胞血影或球芽。适合用于脂质体制剂的脂类包括但不限于甘油单酯、甘油二酯、硫苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸等。这些附加成分的存在可以影响物理状态、溶解性、稳定性、体内释放速度以及体内清除速度，因此可以根据所需的应用进行选择，以便载体的特性适合于所选的给药途径。
结合疫苗优选被提供成液体悬浮液或冷冻干燥的产品。适合的液体制剂包括例如被缓冲到选定pH的等渗水性溶液、悬浮液、乳液或粘性组合物。经皮制剂包括洗剂、凝胶、喷雾剂、膏剂或其它适合的技术。如果希望进行鼻或呼吸道(粘膜)给药(例如气溶胶吸入或吹入)，组合物可以采用通过挤压喷雾分配器、泵式分配器或气溶胶分配器分配的形式。气溶胶通常在通过碳氢化合物形成的压力下。泵式分配器优选分配定量的剂量或具有特定颗度的剂量，正如下面讨论的那样。
当采取溶液、悬浮液和凝胶形式时，结合物的制剂除了活性成分之外通常可以含有大量的水(优选为纯水)。少量的其它成分例如pH调节剂、乳化剂、分散剂、缓冲剂、防腐剂、增湿剂、胶凝剂、色素等也可以存在。
组合物优选与受者的血液或其它体液等渗。组合物的等渗性可以使用酒石酸钠、丙二醇或其它无机或有机溶质来获得。氯化钠是特别优选的。可以使用缓冲剂，例如乙酸及其盐、柠檬酸及其盐、硼酸及其盐以及磷酸及其盐。肠胃外介质包括氯化钠溶液、林格氏(Ringer′s)葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化的林格液或不挥发性油。静脉内介质包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的那些)等。
组合物的粘度可以使用可药用的增稠剂维持在选定的水平。甲基纤维素是优选的，因为它可以容易并且廉价地获得且易于操作。其它适合的增稠剂包括例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的优选浓度可以依赖于所选的试剂。要点是使用量可以获得选定的粘度。粘性组合物通常通过在溶液中加入这些增稠剂来制备。
可药用的防腐剂可以用来增加组合物的保存期限。苯甲醇是适合的，尽管各种不同的防腐剂包括例如对羟苯甲酸酯、乙基汞硫代水杨酸钠、氯代丁醇或苯扎氯铵也可以使用。适合的防腐剂的浓度可以为总重量的0.02％到2％，尽管根据所选的试剂可以有相当大的改变。
也可以采用结合物的肺部投送。结合物在吸入时被投送到哺乳动物的肺部，并透过肺的上皮层进入血流。有广泛的被设计用于肺部投送治疗产品的机械装置可以使用，包括但不限于喷雾器、定量吸入器和粉末吸入器，所有这些对于本技术领域的专业人员来说都是熟悉的。这些装置使用适合于分配结合物的制剂。通常，每种制剂都特异性对应于所使用的装置类型，并且除了在治疗中有用的稀释剂、佐剂和/或载体之外，可以包括适合的推进物质的使用。
为了肺部投送，结合物可以被有利地制备成颗粒的形式，对于肺部投送来说平均的粒度从0.1μm以下到10μm以上，更优选从大约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9μm到大约1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0或9.5μm。用于肺部投送结合物的可药用载体包括碳水化合物例如海藻糖、甘露糖醇、木糖醇、蔗糖、乳糖和山梨糖醇。其它在制剂中使用的成分可以包括DPPC、DOPE、DSPC和DOPC。可以使用天然的或合成的表面活性剂，包括聚乙二醇和葡聚糖，例如环状糊精。胆盐和其它相关的增强剂以及纤维素和纤维素衍生物和氨基酸也可以使用。脂质体、微囊、微球、包合物和其它类型的载体也可以使用。
适合用于喷射或超声的喷雾器的制剂通常包含溶解或悬浮在水中的结合物，结合物浓度为每毫升溶液大约0.01以下到100mg以上，优选为每毫升溶液大约0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg到大约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90mg结合物。制剂也可以包含缓冲液和简单的糖(例如用于蛋白稳定化和调节渗透压)。喷雾器制剂也可以含有表面活性剂，以减少或防止结合物在形成气溶胶时由于溶液的原子化所引起表面诱导的聚集。
用于定量吸入装置的制剂一般来说含有分得很细的粉末，其中含有在表面活性剂的帮助下悬浮在推进剂中的本发明的化合物。推进剂可以包含常规的推进剂，例如氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃和烃类，例如三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷以及它们的组合。
适合的表面活性剂包括失水山梨醇三油酸酯、大豆卵磷脂和油酸。
从粉末吸入装置分配的制剂通常含有包含了结合物的分得很细的干燥粉末，任选包含增量剂例如乳糖、山梨糖醇、蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或木糖醇，其量能够促进粉末从装置中分散，通常为制剂的大约1重量％以下到99重量％以上，优选为制剂的大约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50重量％到大约55、60、65、70、75、80、85或90重量％。
当结合物通过静脉内、皮肤、皮下或其它注射方式给药时，结合疫苗优选无热原的肠胃外可接受的水性溶液的形式。具有适合的pH、等渗性、稳定性等的肠胃外可用溶液的制备属于本技术领域中的技术。优选的用于注射的药物组合物优选含有等渗的介质例如氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、乳酸林格氏注射液以及其它在本技术领域中已知的介质。药物组合物还可以含有稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂或本技术领域专业人员熟知的其它添加剂。
注射的时程可以依赖于各种因素而变化，并包括在几秒钟以下的过程中单次注射给药，到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时以上的连续静脉内用药。
结合物可以通过液体或凝胶、或作为植入物或装置局部外用、全身地或局部给药。
优选实施方案的结合物或优选实施方案的结合方法可以用于制备治疗各种细菌性感染的疫苗，所述感染包括由幽门螺旋杆菌(Helicobacter pyloris)、博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、分枝杆菌菌种(例如结核分枝杆菌(M.tubercidosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、At.Intracellulare、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、戈登分枝杆菌(M.gordonae))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、单核细胞增多性李氏杆菌(Listeria monocytogenes)、化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)(A类链球菌)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B类链球菌)、链球菌(草绿色类，viridans group)、粪链球菌(Streptococcusfaecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、链球菌(厌氧种类，anaerobicsps.)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、病原性弯曲杆菌(pathogenic Campylobacter sp.)、肠球菌(Enterococcus sp.)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、棒杆菌(Corynebacteriumsp.)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoiae)、多杀巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、类杆菌(BacteroidesAt.)、具核梭杆菌(Fusobacterhim nucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、细弱螺旋体(Treponema pertenue)、钩端螺旋体(Leptospira)和伊氏放线菌(Actinomyces israelii)引起的感染。
优选实施方案的某些方法也可以用于制备针对癌症对对象进行治疗或免疫的疫苗，所述癌症例如哺乳动物肉瘤或癌，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏(Ewing′s)肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威尔姆氏(Wilms’s)肿瘤、宫颈癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听觉神经元、少突神经胶质细胞瘤、脑脊膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、白血病例如急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞白血病(成髓细胞、前髓细胞、骨髓单核细胞、单核细胞和红细胞白血病)、慢性白血病(慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病)、以及真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金氏病和非霍奇金氏病、多发性骨髓瘤、华氏(Waldenstrom′s)巨球蛋白血症、以及重链病、淋巴组织增生性病症包括自身免疫性淋巴组织增生综合症(ALPS)、慢性淋巴母细胞白血病、多毛细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病、外周T细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、伯奇氏(Burkitt′s)淋巴瘤、EB病毒阳性T细胞淋巴瘤、组织细胞性淋巴瘤、霍奇金氏病、弥散性进展性淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、Tγ淋巴组织增生病、皮肤性B细胞淋巴瘤、皮肤性T细胞淋巴瘤(即蕈样肉芽肿)和塞扎里氏(Szary)综合征。
结合物可以与各种不同的目前使用的或正在开发的、用于人类或非人类对象的疫苗组合使用。用于人类对象并针对感染性疾病的疫苗的例子包括组合的白喉和破伤风类毒素疫苗、百日咳全细胞疫苗、失活的流感疫苗、23价肺炎球菌疫苗、麻疹活疫苗、腮腺炎活疫苗、风疹活疫苗、卡介苗(BCG)I肺结核疫苗、甲肝疫苗、乙肝疫苗、丙肝疫苗、狂犬病疫苗(例如人类二倍体细胞疫苗)、失活的脊髓灰质炎疫苗、脑膜炎球菌多糖疫苗、四价脑膜炎球菌结合疫苗、黄热病活病毒疫苗、伤寒杀全细胞疫苗、霍乱疫苗、日本B型脑炎杀病毒疫苗、腺病毒疫苗细胞、肥大病毒疫苗、轮状病毒疫苗、水痘疫苗、炭疽热疫苗、天花疫苗以及其它的可商购的和实验的疫苗。
结合物可以以试剂盒的形式提供给用药的医生或其它的卫生护理专业人员。试剂盒是容纳着容器的包装，容器中含有结合疫苗和对象施用结合疫苗的说明书。试剂盒也可以任选含有一种或多种其它的治疗剂。试剂盒可任选含有一种或多种诊断工具和使用说明书。例如，可以包括含有两种或多种疫苗的疫苗混合物，或含有不同的疫苗或治疗剂的分离的药物组合物。试剂盒也可以含有分开剂量的结合疫苗，用于连续或顺序地给药。试剂盒可以含有适合的投送装置，例如注射器、吸入装置等，以及治疗剂给药的说明书。试剂盒可以任选含有用于储存、复溶(如果可行的话)和所包含的任何或所有治疗剂给药的说明书。试剂盒可以含有多个容器，这反映了给对象用药的次数。如果试剂盒含有第一个和第二个容器，则可以存在多个。
实施例——材料和方法
材料——破伤风类毒素(TT)来自Lederle Vaccines，Pearl River，NY和Serum Institute of India，Pune，India。脑膜炎球菌A群和C群多糖(分别为Mn A PS和Mn C PS)来自Bio-Manguinhos，Rio de Janeiro，Brazil。Mn A PS也从SynCo Bio Partners，Amsterdam，The Netherlands获得。Mn W135和Y PS从Aventis Pasteur and Chiron获得。肼、碳酰肼、己二酸二酰肼(ADH)、乙酰肼、1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-(2-羟基乙基)哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)、高碘酸钠、硼氢化钠、氰基硼氢化钠、4-氰基-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)和1-氨基-2，3-丙二醇以及各种氨基酸从Sigma/AldrichChemical Company购买。TNBSA(2，4，6-三硝基苯磺酸)和BCA(二辛可宁酸)分析试剂盒从Pierce购买。
方法——如上所述，本文公开了由碳二亚胺在氨基酸、氨基酸混合物、肽和肽混合物存在下催化的用酰肼基团活化蛋白的方法，以及将多糖和多糖混合物与蛋白结合的三种通用方法。用于通过这些方法与蛋白结合的细菌多糖包括脑膜炎球菌血清组A、C、W135和Y的多糖。
由碳二亚胺在氨基酸、氨基酸混合物、肽和肽混合物存在下催化的用酰肼基团活化蛋白
1.将蛋白(破伤风类毒素或TT，4mg/mL，通过Lowry分析[26]或BCA分析[35]测定)与0.36M肼或己二酸二酰肼(ADH)在12-72mM EDC、0.2M MES、pH5-6.5和0-144mM氨基酸或氨基酸混合物存在下反应1-24小时。
2.用1N NaOH中和反应混合物，对30mM NaCl、10mMHEPES、pH7.5在4℃透析。
3.透析后，记录样品的沉淀形成。
4.将样品在4℃储存1-8周，检查并记录沉淀的形成。
5.显示出很少或没有沉淀的样品用Superose6柱进行HPLC分析。
6.通过BCA分析[35]测定蛋白浓度，酰肼的浓度通过TNBS分析[34]测定。计算每个TT分子的酰肼基团的数量，即活化程度(DA)。
通用结合方法A——醛活化的PS或PS混合物与酰肼活化的蛋白反应(还原胺化结合)
1.两种方法被用于活化破伤风类毒素。将破伤风类毒素用肼或己二酸二酰肼在EDC存在下在pH5.5-6.5下进行活化，然后缓冲液用30mM NaCl、3mM Na2CO3、pH大约10.5进行交换。或者，将破伤风类毒素用肼或己二酸二酰肼在pH5.5、EDC和0-144mM氨基酸或氨基酸混合物的存在下进行活化，然后缓冲液用30mM NaCl、10mM HEPES、pH7.5在4℃进行交换。
2.将多糖或多糖混合物(以成分多糖的所需重量比率)用NaIO4进行活化，然后缓冲液用pH7.5的10mM HEPES缓冲液在4℃进行交换。
3.将酰肼活化的TT与醛活化的多糖或多糖混合物以2:1到1:2的比例和1-40mg/mL的浓度范围在pH6.5-7.5、4-40℃下反应过夜。
4.然后加入NaBH4(起始反应剂中醛基的10倍摩尔量)6小时到过夜，以便将C＝N双键还原成C-N单键并将未反应的醛基还原成醇。
5.使用截留分子量为12-14KDa的膜，用盐水、10mM HEPES、pH7.5、1mM EDTA对溶液进行缓冲液交换。
6.测定样品的体积。
7.根据用Lowry分析[26]或BCA分析[35]测量的最初的起始量，计算蛋白的浓度。
8.根据通过适合的分析方法在混合前对每种成分多糖测量的最初的起始量，计算多糖的浓度，例如用于Mn A和C PS的间苯二酚分析[27]、用于Mn W135和Y PS的蒽酮分析[32]、用于Mn A PS的磷分析[33]和用于Mn W135和Y PS的purpald分析[31]。
通用结合方法B——氰酸酯活化的PS或PS混合物与酰肼活化的蛋白反应(氰基化结合)
1.两种方法被用于活化破伤风类毒素。将破伤风类毒素用肼或己二酸二酰肼在EDC存在下在pH5.5-6.5下进行活化，然后用30mMNaCl、3mM Na2CO3、pH大约10.5进行缓冲液交换。或者，将破伤风类毒素用肼或己二酸二酰肼在pH5.5、EDC和0-144mM氨基酸或氨基酸混合物存在下进行活化，然后用30mM NaCl、10mM HEPES、pH7.5在4℃进行缓冲液交换。
2.将多糖或多糖混合物(以成分多糖的所需重量比率)用CDAP在三乙胺存在下在20-24℃活化2-2.5分钟。
3.4℃下，将酰肼活化的TT与氰酸酯活化的多糖或多糖混合物以2:1到1:2的比例和0.2-1mg/mL的浓度范围在pH6.5-7.5进行反应。
4.在4℃反应3个通宵后(延长的孵育是为了确保剩下的残留未反应的氰酸酯基团分解)，使用截留分子量为12-14KDa的膜，用盐水、10mM HEPES、pH7.5、1mM EDTA对溶液进行缓冲液交换。
5.测定样品的体积。
6.根据用Lowry分析[26]或BCA分析[35]测量的最初的起始量，计算蛋白的浓度。
7.根据在混合前通过适合的分析方法对每种成分多糖测量的最初的起始量，计算多糖的浓度，例如用于Mn A和C PS的间苯二酚分析[27]、用于Mn W135和Y PS的蒽酮分析[32]、用于Mn A PS的磷分析[33]和用于Mn W135和Y PS的purpald分析[31]。
不使用阻断剂制备联合的合成多价结合疫苗的方法B的结合反应时间在4℃下是3个通宵。由于结合产物的高结合产率和高免疫原性，需要纯化步骤，例如柱色谱和/或结合物从未结合的多糖中的硫酸铵沉淀。
通用结合方法C——酰肼活化的PS或PS混合物与醛活化的蛋白反应(还原胺化结合)
1.两种方法被用于活化破伤风类毒素。将破伤风类毒素与1-氨基-2，3-丙二醇(APDO)在EDC存在下在pH5.5-6.5下进行反应，然后用30mM NaCl、3mM Na2CO3、pH大约10.5在4℃进行缓冲液交换。TT-APDO与NaIO4反应产生醛基，然后用30mM NaCl、3mM Na2CO3、pH大约10.5在4℃进行缓冲液交换。或者，将破伤风类毒素与1-氨基-2，3-丙二醇(APDO)在pH5.5-6.5、EDC和0-144mM氨基酸或氨基酸混合物存在下进行反应，然后用30mM NaCl、10mM HEPES、pH7.5在4℃进行缓冲液交换。TT-APDO与NaIO4反应产生醛基，然后用30mM NaCl、10mM HEPES、pH7.5在4℃进行缓冲液交换。
2.三种方法被用于制备酰肼活化的多糖或多糖混合物(以成分多糖的所需的重量比率)：a)PS或PS混合物与NaIO4反应，然后与肼或己二酸二酰肼反应，然后用NaBH4还原(还原胺化)；b)PS或PS混合物用CDAP活化，然后与肼或己二酸二酰肼反应(氰基化结合反应)；以及c)PS或PS混合物与肼或己二酸二酰肼在EDC存在下反应(碳二亚胺反应)。
3.醛活化的TT与酰肼活化的PS或PS混合物以2:1到1:2的比率和1-5mg/mL的浓度范围在pH6.5-7.5和4-40℃下反应18小时。
4.然后加入NaBH4(起始反应剂中醛的10倍摩尔量)6小时到过夜，以便将C＝N双键还原成C-N单键并将未反应的醛基还原成醇。
5.使用截留分子量为12-14Kda的膜，用盐水、10mM HEPES、pH7.5、1mM EDTA对溶液进行缓冲液交换。
6.测定样品的体积。
7.根据用Lowry分析[26]或BCA分析[35]测量的最初起始量，计算蛋白的浓度。
8.根据在混合前通过适合的分析方法对每种成分多糖测量的最初的起始量，计算多糖的浓度，例如用于Mn A和C PS的间苯二酚分析[27]、用于Mn W135和Y PS的蒽酮分析[32]、用于Mn A PS的磷分析[33]和用于Mn W135和Y PS的purpald分析[31]。
活化的蛋白和结合产物的物理化学分析
高效液相体积排阻色谱(HPSEO)
用盐水、10mM Tris、pH7.5、1mM EDTA溶液，以0.5mL/分钟在使用Chromelean软件和280nm UV检测器的Dionex HPLC系统中将蛋白、多糖和结合产物的样品(25μL，0.05-1mg/mL)在WatersUltrahydrogel 2000或Ultrahydrogel线性柱或Superose 6柱中跑柱。UV检测器在280nm处监测含有蛋白的物质以及含有芳香部分的化合物的信号。RI检测器测量蛋白、多糖、结合物和盐的信号。当用HPLC分析联合的合成多价结合疫苗时，每分钟收集级份，用于通过ELISA检测多糖-蛋白结合物。
检测PS-蛋白结合物的ELISA方法
将Immunolon I板(Dynatech)用20μL各HPLC级份加上80μL1xPBS(总体积为100μL包被溶液)包被3小时。只有含有蛋白的分子种类(即结合物和未结合的游离蛋白)附着于聚苯乙烯板上。在用150μL清洗缓冲液(含有0.05％Tween 20、0.02％NaN3的PBS)清洗3次后，在每个孔中加入100μL相应的PS特异性(但是不与载体蛋白交叉反应)抗血清(用含有PBS、5％新生牛血清、0.02％NaN3的缓冲液1/100-1/250稀释)。孵育过夜后，将板洗3次，与100μL结合了碱性磷酸酶的山羊抗小鼠IgG Fc(在稀释缓冲液中1/10,000稀释)孵育3小时。清洗后(3x150μL)，将板与100μL对硝基苯磷酸(1mg/mL，在1M Tris，pH9.8，0.3mM MgCl2中)孵育30-180分钟，使用读板器在405nm测量ELISA读数。减去背景之后，读数代表了每个级份中被结合的PS，因为未结合的游离PS在板包被过程中不能粘附或附着到板上。因此证实了在联合的合成多价结合疫苗中所有的成分多糖种类的存在。
多糖-蛋白结合物在小鼠中的免疫原性
小鼠的免疫
除非指明，小鼠(NIH-Swiss；每组5或10只)在第0、14和28天用每种多糖(在PS混合物中或在通过结合方法A、B和C制备的结合物中)1μg/剂进行免疫，并在第42天收集抗血清。进行ELISA以测定针对相应的天然多糖的抗体的水平。
测定抗体滴度的ELISA方法
将Immunolon I板(Dynatech)用100μL含有多糖(5μg/mL的Mn A、C、W135或Y)的包被溶液包被18小时。在用150μL清洗缓冲液(含有0.05％Tween20、0.02％NaN3的PBS)清洗3次后，在每个孔中加入100μL特异的抗血清样品和参比血清(任意指定为3200单位/mL的抗多糖抗体；双份)，从1/200开始进行连续的两倍稀释(在肺炎球菌的情况下用含有PBS、4％新生牛血清、0.02％NaN3和2μg/mL细胞壁多糖的稀释缓冲液稀释)。孵育过夜后，将板洗3次，与100μL结合了碱性磷酸酶的山羊抗小鼠IgG Fc(在稀释缓冲液中1/10,000稀释)孵育2小时。清洗后(3x150μL)，将板与100μL对硝基苯磷酸(1mg/mL，在1M Tris，pH9.8，0.3mM MgCl2中)孵育30-45分钟，用50μL 1N NaOH终止反应。使用读板器在405nm测量ELISA读数，抗血清样品的抗多糖抗体水平根据它们的ELISA读数和在同样的板中共同分析的参比血清的标准曲线来计算。计算每个小鼠组的抗体水平的几何平均值。
测定抗体的生物功能性(杀菌滴度)的杀菌分析
通过诱导的抗血清对同源的细菌菌株的杀菌分析测定诱导的抗体的生物功能，根据的方法为[Maslanka SE，Gheesling LL，Libutti DE，Donaldson KB，Harakeh HS，Dykes JK等“脑膜炎奈瑟菌血清组A和C血清杀菌分析的标准化和多实验室比较”(Standardization and amultilaboratory comparison of Neisseria meningitidis serogroup A and Cserum bactericidal assays.)The Multilaboratory Study Group.Clin DiagnLab Immunol1997；4(2)：156-167]，做了少量的修改。简单来说，首先将细菌在脑心浸液(BHI)/5％正常马血清(NHS)平板上培养过夜，然后转移到新板上培养4-5小时。在来自新鲜的4-5小时培养物的DPBS中制备在530nm处透光率为80％的细菌悬浮液，将它用DPBS稀释到50-80个菌落形成单位(CFU)/25μL(稀释度为大约1:50,000)。在制备细菌稀释液的同时将补体在室温融化，并保存在冰上直到使用。在96孔组织培养板中，用含有0.5mM MgCl2和0.9mM CaCl2的DPBS对测试和对照样品进行系列的2倍稀释。在每个孔中加入25μL细菌悬浮液，然后加入25μL补体(Lot # 34426-A，Pel-Freez，Rogers，Aakansas)。在没有CO2下在37℃孵育30分钟后，每个孔中的10μL细菌悬浮液被铺板。在5％CO2和37℃下孵育过夜后，对菌落计数。杀菌滴度是与含有补体但没有抗血清的对照孔相比导致CFU减少50％的测试样品的最高稀释度。
具体实施例
在包括反应时间、EDC浓度和氨基酸与氨基酸混合物的浓度的受 控的条件下由碳二亚胺催化的用肼或酰肼进行的蛋白活化
已经报道了通过EDC催化的蛋白与肼或二酰肼的反应倾向于导致产物的聚集和沉淀。调查了几种将4mg/mL TT与0.36M肼或ADH进行反应的反应条件，以获得没有沉淀的反应产物。
不存在氨基酸的情况下的活化反应
在不存在氨基酸的情况下，反应在存在12-48mM EDC下进行1-24小时。用30mM NaCl、10mM HEPES、pH7.5对反应混合物进行缓冲液交换，并储存在4℃。这些反应的某些产物在反应过程中或透析过的产物在4℃储存1-8周之后形成了沉淀。测定了剩余的样品的活化程度(DA；每个TT分子的酰肼基团数量)，并列于表3中。某些这些产物的HPLC图谱显示在图1中。
表3、不存在氨基酸的情况下从各种不同的活化条件下获得的活化的破伤风类毒素的活化程度(DA；每个TT分子的酰肼基团数量)。
[EDC]　与肼的反应时间(小时)　      　与ADH的反应时间(小时)
(mM)　   1     2     4     24        1      2      4      24
12       -a    -     -     (92)b     49     -      -      -
18       -     (110) (81)  (99)
24       -     (83)  (90)  (107)     -      -      -      -
36       (77)  (96)  (102) (112)     -      -      75     66
48       -     -     -     -         -      76     77     (103)
a.对于显示沉淀的样品没有测定DA。
b.括号中的数字是没有沉淀但是在HPLC图谱(图1，A和B图谱)中显示出蛋白信号明显降低的样品的DA值。
在赖氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及赖氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸和半胱氨酸的混合物的存在下的活化反应
破伤风类毒素(4mg/mL)与0.36M肼或ADH的反应由12和24mM EDC催化，在36、72和144mM氨基酸赖氨酸、精氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸或由等摩尔量的赖氨酸、精氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、谷氨酸和半胱氨酸组成的氨基酸混合物的存在下进行1、2、4和24小时的反应。测定了没有沉淀的反应产物的活化程度(DA)，并列于表4中。某些这些产物的HPLC图谱显示在图2中。
表4、在氨基酸赖氨酸、精氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸或氨基酸混合物的存在下从各种不同的活化条件获得的活化的破伤风类毒素的活化程度(DA；每个TT分子的酰肼基团数量)。
[EDC]  赖氨酸  与肼的反应时间(小时)  与ADH的反应时间(小时)
(mM)    (mM)   1      2     4    24    1     2     4      24
12      36     -a     -     -    -     47    -     -      -
        72     -      -     -    -     39    40    57     -
        144    32     -     -    -     34    43    43     58
24      36     -      (95)b (88) (93)  -     -     (92)   (90)
        72     -      -     (103)(106) -     -     -      -
        144           -     -    -     -     -     -      -
[EDC]  精氨酸   与肼的反应时间(小时)   与ADH的反应时间(小时)
(mM)    (mM)    1      2     4    24    1    2     4      24
12      36      -      -     -    -     48   -     -      -
        72      -      -     -    -     40   46    56     -
        144     36     -     -    -     36   42    48     57
24      36      -      (86)  (83) (92)  -    -     (87)   (93)
        72      -      -     (105)(101) -    -     -      -
        144-           -     -    -     -    -     -      -
[EDC]  苏氨酸  与肼的反应时间(小时)  与ADH的反应时间(小时)
(mM)  (mM)   1    2    4    24    1    2    4    24
12    36     -    -    -    -     47   -    -    -
      72     -    -    -    -     38   46   52   -
      144    35   -    -    -     32   42   46   48
24    36     -    (112)(88) (96)  -    -    (87) (88)
      72     -    -    -    -     -    -    -    -
      144    -    -    -    -     -    -    -    -
[EDC] 丝氨酸  与肼的反应时间(小时)  与ADH的反应时间(小时)
(mM)   (mM)    1     2     4     24   1    2    4    24
12     36      -     -     -     -    47   -    -    -
       72      32    -     -     -    39   43   51   57
       144     35    -     -     -    41   40   44   47
24     36      -     (114) (82)  (91) -    -    (91) (93)
       72      -     -     -     -    -    -    -    -
       144     -     -     -     -    -    -    -    -
[EDC] 甘氨酸  与肼的反应时间(小时)  与ADH的反应时间(小时)
(mM)   (mM)    1    2    4    24    1    2    4    24
12     36      -    -    -    -     49   -    -    -
       72      35   -    -    -     37   45   47   54
       144     32   32   32   33    35   40   39   47
24     36      -    -    -    -     -    -    -    (82)
       72      -    -    -    -     -    -    -    -
       144     -    -         -     -    -         -
[EDC]  组氨酸  与肼的反应时间(小时)与ADH的反应时间(小时)
(mM)   (mM)    1    2    4    24    1    2    4    24
12     36      41   -    -    -     44   46   58   -
       72      28   36   46   -     27   35   41   46
     144    21    27    30    39    24    30    33    40
24   36     -     (85)    -    -    -     -     -     -
     72     -     -     -     -     22    -     -     -
     144    65    -     48    -     40    44    58    -
[EDC]  混合物  与肼的反应时间(小时)  与ADH的反应时间(小时)
(mM)    (mM)    1    2    4    24     1    2    4    24
12      36      40   -    -    -      45   51   62   -
        72      12   12   13   17     19   17   18   22
        144     10   8    9    13     13   13   14   17
24      36      -    -    -    -      48   -    -    -
        72      -    -    -    -      -    -    -    -
        144     26   29   27   -      50   58   64   80
a.对于显示沉淀的样品没有测定DA。
b.括号中的数字是没有沉淀但是在HPLC图谱(图2，图谱A)中显示出蛋白信号明显降低的样品的DA值。
谷氨酸(和天冬氨酸)存在下的活化反应
破伤风类毒素(4mg/mL)与0.36M肼或ADH的反应由12、24、48和72mM EDC催化，在36、72和144mM谷氨酸存在下反应进行1、2、4和24小时。测定了没有沉淀的反应产物的活化程度(DA)，并列于表5中。某些这些产物的HPLC图谱显示在图3中。
表5、谷氨酸存在下从各种不同的活化条件获得的活化的破伤风类毒素的活化程度(DA；每个TT分子的酰肼基团数量)。
[EDC]  谷氨酸  与肼的反应时间(小时)  与ADH的反应时间(小时)
(mM)    (mM)    1    2    4    24     1    2    4    24
12      36      19   21   26   27     35   35   35   39
        72      16   7    6    8      21   21   20   25
        144     5    5    12   15     16   17   18   21
24    36    33    35      -a    -    41    37    39    41
      72    23    23      25    30   36    37    36    41
      144   17    20      16    23   30    29    33    34
48    36    -     -       -     -    -     -     -     -
      72    49    -       -     -    -     54    49    59
      144   25    26      27    33   38    39    40    44
72    36    -     (98)b   (80)  (92) -     -     -     -
      72    -     -       -     -    -     -     -     -
      144   34    35      37    -    4646        46    53
a.对于显示沉淀的样品没有测定DA。
b.括号中的数字是没有沉淀但是在HPLC图谱中显示出蛋白信号明显降低的样品的DA值。
多糖混合物与蛋白的结合
方法A——联合的合成多价脑膜炎球菌A、C、W135和Y群多糖-破伤风类毒素结合物批次ACWY040228a1
活化TT以含有酰肼基团
1.破伤风类毒素(4.2mg/mL)用0.42M肼在存在20mM EDC、0.1M MES、pH6.5的情况下在20-24℃下活化。
2.反应4小时后，用1N NaOH将反应混合物的pH升高到7.5-10以终止反应。
3.使用12-14KDa的透析膜在4℃下用30mM NaCl、3mMNa2CO3、pH大约10.5对反应混合物进行缓冲液交换。
活化Mn A、C、W135和Y PS混合物以含有醛基
1.将Mn A、C、W135和Y PS混合物(10mg/mL总PS；2.5mg/mL每种成分PS)与6mM NaIO4在20-24℃下反应4小时。
2.使用12-14KDa的透析膜在4℃下用pH7.5的10mM HEPES对样品进行透析。
活化的Mn A、C、W135和Y PS混合物与活化的TT结合
1.通过冷冻干燥和溶解在0.04mL水中，将含有酰肼的TT的等份试样(0.4mg)调整到10mg/mL。
2.通过冷冻干燥和溶解在0.04mL0.2M HEPES、pH7.5、30mMEDTA中，将含有醛的Mn A、C、W135和Y PS混合物的等份试样调整到10mg/mL。
3.将活化的TT加入到等体积的活化的Mn PS混合物中并涡旋振荡。
4.将反应混合物在20-24℃下孵育过夜。
5.用6μL 1M NaBH4(相当于活化的PS中起始醛浓度的10倍摩尔量)将反应混合物处理6小时。
6.使用截留分子量为12-14KDa的膜，用盐水、10mM HEPES、pH7.5、1mM EDTA的缓冲液对溶液进行缓冲液交换。
7.测定透析的结合物的体积，根据投入的质量计算蛋白(TT)和每种多糖(Mn A、C、W135和Y)的浓度。
联合的合成多价结合物批次ACWY040228a1的性质
图4显示了结合物批次ACWY040228a1的HPSEC洗脱图谱谱(在280nm处监测)。在结合后，观察到蛋白信号从17.5分钟移向13分钟，在结合后几乎没有留下未结合的游离蛋白。在HPLC图谱中每个级份中每种脑膜炎球菌血清组A、C、W135或Y的结合多糖都通过使用相应的特异性针对每种多糖的抗体进行了ELISA检测(图5)。
联合的合成多价结合物批次ACWY040228a1的免疫原性
结合物以1μg多糖/剂在第0、14和28天被用于免疫每组10只小鼠的组，天然多糖作为对照。通过ELISA测定的第三次注射后2周时诱导的抗体水平的几何平均值(单位/mL)，对于对照组来说是Mn A为11(1，195；1SD置信区间)、Mn C为672(328，1379)、Mn W135为72(32，162)、Mn Y为298(105，844)，对于结合物组来说是Mn A为9291(3535，24421)、Mn C为4080(1694，9824)、Mn W135为17450(9502，32050)、Mn Y为114429(60462，216566)，假定每种血清组PS的参比血清为3200单位/mL(表6)。与天然的Mn PS对照相比，结合物在小鼠中诱导的抗Mn PS特异性抗体高6-845倍。通过杀菌分析测定的在第三次注射后2周时诱导的杀菌滴度的几何平均值，对于对照组来说是Mn A为329(113，598；1SD置信区间)、Mn C为329(163，668)、Mn W135为2743(1851，4066)、Mn Y为12958(10197，16559)，对于结合物组来说是Mn A为9699(3373，27895)、Mn C为1657(854，3214)、Mn W135为6625(2076，21143)、Mn Y为77262(32824，181863)(表6b)。与天然的Mn PS对照相比，结合物在小鼠中诱导的杀菌滴度高2.4-29倍。
表6a、使用多价结合物批次ACWY040228a1中的每种Mn PS以1μg/剂对小鼠组(每组10只小鼠)进行第三次免疫后2周时，在1个SD置信区间内的抗Mn PS抗体水平的几何平均值a
多糖   天然PS混合物    批次ACWY040228a1    增加的倍数
 A      11(1，195)      9291(3535，24421)      845
 C      672(328，1379)  4080(1694，9824)       6
W135    72(32，162)     17450(9502，32050)     242
 Y      298(105，844)   114429(60462，216566)  384
a.与指定的抗Mn PS抗体水平为3200单位/mL的每种PS参比血清相比。
表6b、使用多价结合物批次ACWY040228a1中每种Mn PS1μg/剂对小鼠组(每组10只小鼠)进行第三次免疫后2周时，在1个SD置信区间内杀菌滴度的几何平均值。
多糖   天然PS混合物          批次ACWY040228a1      增加的倍数
A      329(113，598)         9699(3373，27895)     29
C      329(163，668)         1657(854，3214)       5
W135   2743(1851，4066)      6625(2076，21143)     2.4
Y      12958(10197，16559)   77262(32824，181863)  6
方法B——联合的合成多价脑膜炎球菌A、C、W135和Y群多糖-破伤风类毒素结合物批次ACWY040723B5
活化TT以含有酰肼基团
1.破伤风类毒素(4.2mg/mL)用0.42M肼在存在20mM EDC、0.1M MES、pH6.5的情况下在20-24℃下活化。
2.反应4小时后，用1N NaOH将反应混合物的pH升高到7.5-10以终止反应。
3.使用12-14KDa的透析膜在4℃下用30mM NaCl、3mMNa2CO3、pH大约10.5对反应混合物进行缓冲液交换。
活化Mn A、C、W135和Y PS混合物以含有氰酸酯基团
1.将Mn A、C、W135和Y PS混合物(0.04mL，10mg/mL总PS；2.5mg/mL每种成分PS)以5μL CDAP(100mg/mL，在乙腈中)在5μL0.2M三乙胺存在下在20-24℃下活化2-2.5分钟。
2.将活化的多糖与0.625mL冰冷的0.2M HEPES、pH7.5、30mMEDTA混合，并马上用于结合。
活化的Mn A、C、W135和Y PS混合物与活化的TT结合
1.将活化的多糖加入到0.25mg活化的TT(冰冷，0.0.065mL，3.84mg/mL)中；涡旋振荡。
2.将反应混合物在4℃下轻轻摇动孵育3个通宵。(延长孵育是为了确保剩余的残留未反应的氰酸酯基团分解)
3.使用截留分子量为12-14KDa的膜，用盐水、10mM HEPES、pH7.5、1mM EDTA对溶液进行缓冲液交换。
4.测定透析过的结合物的体积，根据投入的质量计算蛋白(TT)和每种多糖(Mn A、C、W135和Y)的浓度。
联合的合成多价结合物批次ACWY040723B5的性质
图6显示了结合物批次ACWY040723B5的HPSEC洗脱图谱(在280nm处监测)。在结合后，观察到了蛋白信号从17.5分钟移向14.5分钟，在结合后留下了大量的未结合的游离蛋白。在HPLC图谱的每个级份中每种脑膜炎球菌血清组A、C、W135或Y的结合多糖都通过使用相应的特异性针对每种多糖的抗体进行了ELISA检测(图7)。
联合的合成多价结合物批次ACWY040723B5的免疫原性
结合物以1μg多糖/剂在第0、14和28天被用来免疫每组10只小鼠的组，天然多糖作为对照。通过ELISA测定的在第三次注射后2周时诱导的抗体水平的几何平均值(单位/mL)，对于对照组来说是Mn A为11(1，195；1SD置信区间)、Mn C为672(328，1379)、Mn W135为72(32，162)、Mn Y为298(105，844)，对于结合物组来说是Mn A为5214(2532，10739)、Mn C为6430(1797，23008)、Mn W135为8211(490，137609)、Mn Y为81833(26489，252808)，假定每种血清组PS的参比血清为3200单位/mL(表7)。与天然的Mn PS对照相比，结合物在小鼠中诱导的抗Mn PS特异性抗体高10-474倍。通过杀菌分析测定的在第三次注射后2周时诱导的杀菌滴度的几何平均值，对于对照组来说是Mn A为329(113，598；1SD置信区间)、Mn C为329(163，668)、Mn W135为2743(1851，4066)、Mn Y为12958(10197，16559)，对于结合物组来说是Mn A为1255(696，2263)、Mn C为3203(1536，6679)、Mn W135为33774(9346，122041)、Mn Y为171471(93450，314632)(表7b)。与天然的Mn PS对照相比，结合物在小鼠中诱导的杀菌滴度高4-13倍。
表7a、使用多价结合物批次ACWY040723B5中每种Mn PS1μg/剂对小鼠组(每组10只小鼠)进行第三次接种免疫后2周时，在1个SD置信区间内抗Mn PS抗体水平的几何平均值a
多糖     天然PS混合物     批次ACWY040723B5     增加的倍数
A        11(1，195)       5214(2532，10739)    474
C        672(328，1379)   6430(1797，23008)    10
W135     72(32，162)      8211(490，137609)    114
Y        298(105，844)    81833(26489，252808) 275
a.与指定的抗Mn PS抗体水平为3200单位/mL的每种PS参比血清相比。
表7b、使用多价结合物批次ACWY040723B5中每种Mn PS 1μg/剂对小鼠组(每组10只小鼠)进行第三次接种免疫后2周时，在1个SD置信区间内杀菌滴度的几何平均值。
多糖      天然PS混合物       批次ACWY040723B5      增加的倍数
A         329(113，598)      1255(696，2263)       4
C         329(163，668)       3203(1536，6679)     10
W135      2743(1851，4066)   33774(9346，122041)   12
Y         12995(10197，16559)171471(93450，314632) 13
方法C——联合的合成多价脑膜炎球菌A、C、W135和Y群多糖-破伤风类毒素结合物批次ACWY040723C5
活化TT以含有醛基基团
1.破伤风类毒素(4.2mg/mL)用0.42M1-氨基-2，3-丙二醇(APDO)在存在20mM EDC、0.1M MES、pH6.5的情况下在20-24℃下活化。
2.反应4小时后，用1N NaOH将反应混合物的pH升高到7.5-10以终止反应。
3.使用12-14KDa的透析膜在4℃下用30mM NaCl、3mMNa2CO3、pH大约10.5对反应混合物进行缓冲液交换。
4.通过purpald分析[31]和Lowry分析[26]测定TT被APDO修饰的程度。
5.将TT-APDO的等份试样与6mM NaIO4反应3小时，然后用30mM NaCl、3mM Na2CO3、pH大约10.5进行缓冲液交换。
活化Mn A、C、W135和YPS混合物以含有酰肼基团
1.将Mn A、C、W135和Y PS混合物(0.04mL，10mg/mL总PS；2.5mg/mL每种成分PS)用5μL CDAP(100mg/mL，在乙腈中)在5μL0.2M三乙胺存在下在20-24℃下活化2-2.5分钟。
2.在活化结束时，加入0.01mL pH7的5M肼并混合。
3.将反应混合物在20-24℃下孵育4小时。
4.使用12-14KDa的透析膜在4℃下用pH7.5的10mM HEPES对样品进行透析。
5.测定被活化的PS混合物的体积(0.12mL)。
活化的Mn A、C、W135和Y PS混合物与活化的TT结合
1.将含有酰肼的Mn A、C、W135和Y PS混合物(0.5mg，0.12mL)与0.03mL pH7.5的1M HEPES混合。
2.将含有醛的TT的等份试样(0.5mg；0.148mL3.38mg/mL)加入到活化的Mn A、C、W135和Y PS混合物中。(总体积0.298mL)
3.将反应混合物在20-24℃下孵育18小时。
4.将反应混合物用5μL1M NaBH4处理6小时。
5.使用截留分子量为12-14KDa的膜，用盐水、10mM HEPES、pH7.5、1mM EDTA对溶液进行缓冲液交换。
6.测定透析过的结合物的体积，根据投入的质量计算蛋白(TT)和每种多糖(Mn A、C、W135和Y)的浓度。
联合的合成多价结合物批次ACWY040723C5的性质
图8显示了结合物批次ACWY040723C5的HPSEC洗脱图谱(在280nm处监测)。在结合后，观察到了蛋白信号从17.5分钟移向14分钟，在结合后留下了残余的未结合的游离蛋白。在HPLC图谱的每个级份中每种脑膜炎球菌血清组A、C、W135或Y的结合多糖都通过使用相应的特异性针对每种多糖的抗体进行了ELISA检测(图9)。
联合的合成多价结合物批次ACWY040723C5的免疫原性
结合物以1μg多糖/剂在第0、14和28天被用来免疫每组10只小鼠的组，天然多糖作为对照。通过ELISA测定的在第三次注射后2周时诱导的抗体水平的几何平均值(单位/mL)，对于对照组来说是Mn A为11(1，195；1SD置信区间)、Mn C为672(328，1379)、Mn W135为72(32，162)、Mn Y为298(105，844)，对于结合物组来说是Mn A为17250(6786，43847)、Mn C为11035(5996，20309)、Mn W135为8321(3505，19755)、Mn Y为84643(46669，153517)，假定每种血清组PS的参比血清为3200单位/mL(表8)。与天然的Mn PS对照相比，结合物在小鼠中诱导的抗Mn PS特异性抗体高16-1568倍。通过杀菌分析测定的在第三次注射后2周时诱导的杀菌滴度的几何平均值，对于对照组来说是Mn A为329(113，598；1SD置信区间)、Mn C为329(163，668)、Mn W135为2743(1851，4066)、Mn Y为12958(10197，16559)，对于结合物组来说是Mn A为3941(921，16862)、Mn C为6860(2812，16733)、Mn W135为72403(39288，133431)、Mn Y为82832(43591，157400)(表8b)。与天然的Mn PS对照相比，结合物在小鼠中诱导的杀菌滴度高6-26倍。
表8a、使用多价结合物批次ACWY040723C5中每种Mn PS1μg/剂对小鼠组(每组10只小鼠)进行第三次免疫后2周时，在1个SD置信区间内抗Mn PS抗体水平的几何平均值a
多糖　　　天然PS混合物　　批次ACWY040723C5　　　　增加的倍数
A         11(1，195)      17250(6786，43847)      1568
C         672(328，1379)  11035(5996，20309)      16
W135      72(32，162)     8321(3505，19755)       116
Y         298(105，844)   84643(46669，153517)    284
a.与具有指定的抗Mn PS抗体水平为3200单位/mL的每种PS的对照血清相比，。
表8b、使用多价结合物批次ACWY040723C5中每种Mn PS1μg/剂对小鼠组(每组10只小鼠)进行第三次接种免疫后2周时，在1个SD置信区间内杀菌滴度的几何平均值。
多糖　　　天然PS混合物　　　批次ACWY040723C5　　　增加的倍数
A         329(113，598)     3941(921，16862)      12
C         329(163，668)     6860(2812，16733)     21
W135      2743(1851，4066)  72403(39288，133431)  26
Y　　12958(10197，16559)　　82832(43591，157400)　　6
方法A——联合的合成的多价脑膜炎球菌A、C、W135和Y群多糖-破伤风类毒素结合物批次MnACWYTTD(K72)050131A6
活化TT以含有酰肼基团
1.破伤风类毒素(4.2mg/mL)用0.36M己二酸二酰肼在存在72mM赖氨酸、12mM EDC、0.1M MES、pH5.5的情况下在20-24℃下活化。
2.反应2小时后，使用12-14KDa的透析膜在4℃下用30mMNaCl、10mM HEPES、pH大约7.5对反应混合物进行缓冲液交换。
3.测定样品的体积，并计算被活化的TT的浓度(3.48mg/mL)。
活化Mn A、C、W135和Y PS混合物以含有醛基
1.将Mn A、C、W135和Y PS混合物(10mg/mL总PS；2.5mg/mL每种成分PS)与6mM NaIO4在4℃下反应过夜。
2.使用12-14KDa的透析膜在4℃下用pH7.5的10mM HEPES对样品进行透析。
3.测定样品的体积，并计算被活化的PS混合物的浓度(7.25mg/mL总PS)。
活化的Mn A、C、W135和Y PS混合物与活化的TT结合
1.加入含有醛的Mn A、C、W135和Y PS混合物的等份试样(1mg；0.138mL，7.25mg/mL)和0.0284mL pH7.5的1M HEPES和0.0189mL0.5M EDTA。
2.将混合物置于冰上。
3.在冰上将含有酰肼的TT的等份试样(1mg；0.288mL，3.475mg/mL)加入到活化的PS混合物中并混合。
4.将反应混合物在4℃孵育过夜。
5.用10μL 1M NaBH4将反应混合物处理6小时。
6.使用截留分子量为12-14KDa的膜，在4℃下用盐水、10mMHEPES、pH7.5、1mM EDTA对溶液进行缓冲液交换。
7.测定透析过的结合物的体积，根据投入的质量计算蛋白(TT)和每种多糖(Mn A、C、W135和Y)的浓度。
联合的合成多价结合物批次MnACWYTTD(K72)050131A6的性质
图10显示了结合物批次MnACWYTTD(K72)050131A6的HPSEC洗脱图谱(在280nm处监测)。在结合后，观察到蛋白信号从17.5分钟移向13分钟，在结合后几乎没有留下未结合的游离蛋白。在HPLC图谱的每个级份中每种脑膜炎球菌血清组A、C、W135或Y的结合多糖都通过使用相应的特异性针对每种多糖的抗体进行了ELISA检测(图11)。
联合的合成多价结合物批次MnACWYTTD(K72)050131A6的免疫 原性
结合物以每种多糖1μg/剂在第0、14和28天被用来免疫5只小鼠的组，天然多糖混合物(10只小鼠)作为对照。通过ELISA测定的在第三次注射后2周时诱导的抗体水平的几何平均值(单位/mL)，对于对照组来说是Mn A为11(1，195；1SD置信区间)、Mn C为672(328，1379)、Mn W135为72(32，162)、Mn Y为298(105，844)，对于结合物来说是Mn A为8308(5282，13071)、Mn C为4090(1424，11746)、Mn W135为11314(5981，21403)、Mn Y为90779(63135，130528)，假定每种PS的参比血清为3200单位/mL(表9)。与天然的Mn PS对照相比，结合物在小鼠中诱导的抗Mn PS特异性抗体高6-305倍。
表9、使用多价结合物批次MnACWYTTD(K72)050131A6中每种Mn PS1μg/剂对小鼠组(天然PS混合物对照组10只小鼠，实验组5只小鼠)进行第三次接种免疫后2周时，在1个SD置信区间内抗Mn PS抗体水平的几何平均值a
多糖　　天然PS混合物　　批次MnACWYTTD(K72)050131A6　　增加的倍数
A       11(1，195)      8308(5282，13071)             755
C       672(328，1379)  4090(1424，11746)             6
W135    72(32，162)     11314(5981，21403)            157
Y       298(105，844)   90779(63135，130528)          305
a.与指定抗Mn PS抗体水平为3200单位/mL的每种PS的参比血清相比。
方法B——联合的合成多价脑膜炎球菌A、C、W135和Y群多糖-破伤风类毒素结合物批次MnACWYTTD(K72)050201B6
活化TT以含有酰肼基团
1.破伤风类毒素(4.2mg/mL)用0.36M己二酸二酰肼在存在72mM赖氨酸、12mM EDC、0.1M MES、pH5.5的情况下在20-24℃下活化。
2.反应2小时后，使用12-14KDa的透析膜在4℃下用30mMNaCl、10mM HEPES、pH大约7.5对反应混合物进行缓冲液交换。
3.测定样品的体积，并计算被活化的TT的浓度(3.48mg/mL)。
活化Mn A、C、W135和Y PS混合物以含有氰酸酯基团
1.将Mn A、C、W135和Y PS混合物(0.1mL，10mg/mL总PS；2.5mg/mL每种成分PS)用6μL CDAP(100mg/mL，于乙腈中)在6μL0.2M三乙胺存在下在20-24℃活化2-2.5分钟。
2.将活化的多糖与1.25mL冰冷的0.2M HEPES、pH7.5、30mMEDTA溶液混合，并马上用于结合。
活化的Mn A、C、W135和Y PS混合物与活化的TT结合
1.将活化的多糖加入到0.5mg活化的TT(冰冷的，0.144mL，3.84mg/mL)中；涡旋振荡。
2.将反应混合物在4℃下轻轻摇动孵育3个通宵。(延长孵育是为了确保剩余的残留未反应的氰酸酯基团分解)
3.使用截留分子量为12-14Kda的膜，用盐水、10mM HEPES、pH7.5、1mM EDTA对溶液进行缓冲液交换。
4.测定透析过的结合物的体积，根据投入的质量计算蛋白(TT)和每种多糖(Mn A、C、W135和Y)的浓度。
联合的合成多价结合物批次MnACWYTTD(K72)050201B6的性质
图12显示了结合物批次MnACWYTTD(K72)050201B6的HPSEC洗脱图谱(在280nm处监测)。在结合后，观察到蛋白信号从17.5分钟移向14和16分钟，在结合后留下了相当量的未结合的游离蛋白。在HPLC图谱的每个级份中每种脑膜炎球菌血清组A、C、W135或Y的结合多糖都通过使用相应的特异性针对每种多糖的抗体进行了ELISA检测(图13)。
联合的合成多价结合物批次MnACWYTTD(K72)050201B6的免疫 原性
结合物以每种多糖1μg/剂在第0、14和28天被用来免疫5只小鼠的组，天然多糖混合物(10只小鼠)作为对照。通过ELISA测定的在第三次注射后2周时诱导的抗体水平的几何平均值(单位/mL)，对于对照组来说是Mn A为11(1，195；1SD置信区间)、Mn C为672(328，1379)、Mn W135为72(32，162)、Mn Y为298(105，844)，对于结合物组来说是Mn A为2752(1355，5589)、Mn C为2930(1190，7212)、Mn W135为4755(1455，15542)、Mn Y为22494(10466，48347)，假定每种PS的参比血清为3200单位/mL(表10)。与天然的Mn PS对照相比，结合物在小鼠中诱导的抗Mn PS特异性抗体高4-250倍。
表10、使用多价结合物批次MnACWYTTD(K72)050201B6中的每种Mn PS1μg/剂对小鼠组(天然PS混合物对照组10只小鼠，实验组5只小鼠)进行第三次接种免疫后2周时，在1个SD置信区间内抗Mn PS抗体水平的几何平均值a
多糖　　天然PS混合物　　批次MnACWYTTD(K72)050201B6　　增加的倍数
A       11(1，195)      2752(1355，5589)              250
C       672(328，1379)  2930(1190，7212)              4
W135    72(32，162)     4755(1455，15542)             66
Y       298(105，844)   22494(10466.48347)            75
a.与指定抗Mn PS抗体水平为3200单位/mL的每种PS的参比血清相比。
方法A——联合的合成多价脑膜炎球菌A、C、W135和Y群多糖-破伤风类毒素结合物批次TTHACWY061126
活化TT以含有酰肼基团
1.破伤风类毒素(4.2mg/mL)用0.42M肼在存在20mM EDC、的0.1M MES、pH5.5的情况下在20-24℃下活化。
2.反应4小时后，用1N NaOH将反应混合物的pH升高到7.5-10以终止反应。
3.使用12-14KDa的透析膜在4℃下用30mM NaCl、3mMNa2CO3、pH大约10.5对反应混合物进行缓冲液交换。
用NaIO 4 活化个体Mn A、C、W135和Y PS以含有醛基
1.将Mn A PS(10mg/mL)用15mM NaIO4在4℃活化72小时，用25mM甘油淬灭并在4℃下用水透析。
2.将Mn C PS(10mg/mL)用6mM NaIO4在室温活化4小时，用25mM甘油淬灭并在4℃下用水透析。
3.将Mn W135PS(10mg/mL)用3mM NaIO4在4℃活化过夜，用25mM甘油淬灭并在4℃下用水透析。
4.将Mn Y PS(10mg/mL)用3mM NaIO4在4℃活化过夜，用25mM甘油淬灭并在4℃下用水透析。
活化的Mn A、C、W135和Y PS混合物与活化的TT结合
1.将活化的含醛Mn A、C、W135和Y PS的等份试样以1:1:1:1的比例混合(W/W，总PS＝0.1mg)。
2.将PS混合物置于冰上并与1μL pH6的1M MES混合。
3.将PS的总体积用冰冷的水调整到36.8μL。
4.在冰上将含有酰肼的TT的等份试样(1mg；29.9μL，3.41mg/mL)加入到活化的PS混合物中并混合。
5.将反应混合物在4℃孵育两个通宵。
6.加入1μL pH6.5的1M MES。
7.用2μL1M NaBH4将反应混合物在4℃处理过夜。
8.使用截留分子量为12-14KDa的膜，在4℃下用盐水、10mMHEPES、pH7.5、1mM EDTA对溶液进行缓冲液交换。
9.测定透析的结合物的体积，根据投入的质量计算蛋白(TT)和每种多糖(Mn A、C、W135和Y)的浓度。
联合的合成多价结合物批次TTHACWY061126的性质
结合物批次TTHACWY061126进行了HPSEC洗脱图谱分析(在280nm处监测)。在结合后，观察到蛋白信号从17.5分钟移向14分钟，在结合后几乎没有留下未结合的游离蛋白。在HPLC图谱的每个级份中每种脑膜炎球菌血清组A、C、W135或Y的结合多糖都通过使用相应的特异性针对每种多糖的抗体进行了ELISA检测(图14)。
联合的合成多价结合物批次TTHACWY061126的免疫原性
结合物以每种多糖1μg/剂在第0、14和28天被用来免疫一组15只小鼠，天然多糖混合物(5只小鼠)作为对照。通过ELISA测定的在第三次注射后2周时诱导的抗体水平的几何平均值(单位/mL)，对于对照组来说是Mn A为108(39，296；1SD置信区间)、Mn C为416(221，784)、Mn W135为52(29，96)、Mn Y为386(232，644)，对于结合物组来说是Mn A为29819(18049，49266)、Mn C为1319(372，4674)、Mn W135为11075(4610，26607)、Mn Y为39901(24295，65530)，假定每种PS的参比血清为3200单位/mL(表11a)。与天然的Mn PS对照相比，结合物在小鼠中诱导的抗Mn PS特异性抗体高了3-268倍。通过杀菌分析测定的在第三次注射后2周时诱导的杀菌滴度的几何平均值，对于对照组来说是Mn A为394(114，1358；1SD置信区间)、Mn C为226(97，529)、Mn W135为10396(6146，17585)、Mn Y为9050(9050，9050)，对于结合物组来说是Mn A为12125(3800，38689)、Mn C为1811(621，5282)、Mn W135为89595(28643，280251)、Mn Y为128062(25097，653452)(表11b)。与天然的Mn PS对照相比，结合物在小鼠中诱导的杀菌滴度高了8-31倍。
表11a、使用多价结合物批次TTHACWY061126中每种Mn PS1μg/剂对小鼠组(天然PS混合物对照5只小鼠，实验组15只小鼠)进行第三次接种免疫后2周时，在1个SD置信区间内抗Mn PS抗体水平的几何平均值a
多糖　　　天然PS混合物　　批次TTHACWY061126　　增加的倍数
A         108(39，296)    29819(18049，49266)  268
C         416(221，784)   1319(372，4674)      3
W135      52(29，96)      11075(4610，26607)   213
Y         386(232，644)   39901(24295，65530)  103
a.与指定抗Mn PS抗体水平为3200单位/mL的每种PS的参比血清相比，。
表11b、使用多价结合物批次TTHACWY061126中每种Mn PS1μg/剂对小鼠组(天然PS混合物对照5只小鼠，实验组15只小鼠)进行第三次接种免疫后2周时，在1个SD置信区间内杀菌滴度的几何平均值。
多糖　天然PS混合物　　　　批次TTHACWY061126　　　　增加的倍数
A     394(114，1358)      12125(3800，38689)       31
C     226(97，529)        1811(621，5282)          8
W135  10396(6146，17585)  89595(28643，280251)     9
Y     9050(9050，9050)    128062(25097，653452)    14
方法B——联合的合成多价脑膜炎球菌A、C、W135和Y群多糖-破伤风类毒素结合物批次TTHVIIACWYa060922B(2:2)
活化TT以含有酰肼基团
1.破伤风类毒素(4.2mg/mL)用0.42M肼在存在30mM EDC、0.1M MES、pH5.5的情况下在20-24℃下活化。
2.反应1小时后，用1N NaOH将反应混合物的pH升高到7.5-10以终止反应。
3.使用12-14KDa的透析膜在4℃下用30mM NaCl、3mMNa2CO3、pH大约10.5对反应混合物进行缓冲液交换。
活化Mn A、C、W135和Y PS混合物以含有氰酸酯基团
将Mn A、C、W135和Y PS混合物(1:1:1:1，W/W；0.0125mL，10mg/mL)用0.75μL CDAP(100mg/mL，在乙腈中)在0.5μL 0.2M三乙胺存在下在20-24℃下活化2-2.5分钟。
活化的Mn A、C、W135和Y PS混合物与活化的TT的结合
1.将活化的多糖与50μL冰冷的pH7.4的2x PBS混合，然后加入0.125mg TTH(32.3μL，3.87mg/mL，冰冷的)。
2.将反应混合物在4℃下轻轻摇动孵育3个通宵。(延长孵育是为了确保结合完全以及剩余的残留未反应的氰酸酯基团分解)
3.使用截留分子量为12-14KDa的膜，用盐水、10mM HEPES、pH7.5、1mM EDTA对溶液进行缓冲液交换。
4.测定透析的结合物的体积，根据投入的质量计算蛋白(TT)和每种多糖(Mn A、C、W135和Y)的浓度。
联合的合成多价结合物批次TTHVIIACWYa060922B(2:2)的性质
结合物批次TTHVIIACWYa060922B(2:2)通过HPSEC洗脱图谱(在280nm处监测)分析。在结合后，观察到蛋白信号从17.5分钟移向14分钟，在结合后几乎没有留下未结合的游离蛋白。在HPLC图谱的每个级份中每种脑膜炎球菌血清组A、C、W135或Y的结合多糖都通过使用相应的特异性针对每种多糖的抗体进行了ELISA检测。
联合的合成多价结合物批次TTHVIIACWYa060922B(2:2)的免疫 原性
结合物以每种多糖1μg/剂在第0、14和28天被用来免疫一组5只小鼠，天然多糖作为对照。通过ELISA测定的在第三次注射后2周时诱导的抗体水平的几何平均值(单位/mL)，对于对照来说是Mn A为108(39，296；1SD置信区间)、Mn C为416(221，784)、Mn W135为52(29，96)、Mn Y为386(232，644)，对于结合物组来说是Mn A为24828(16738，36829)、Mn C为10641(6118，18506)、Mn W135为15068(7374，30788)、Mn Y为99827(56810，175416)，假定每种PS的参比血清为3200单位/mL(表12a)。与天然的Mn PS对照相比，结合物在小鼠中诱导的抗Mn PS特异性抗体高了26-290倍。通过杀菌分析测定的在第三次注射后2周时诱导的杀菌滴度的几何平均值，对于对照组来说是Mn A为394(114，1358；1SD置信区间)、Mn C为226(97，529)、Mn W135为10396(6146，17585)、Mn Y为9050(9050，9050)，对于结合物组来说是Mn A为5970(3212，11099)、Mn C为19400(8185，45985)、Mn W135为68593(19473，241620)、Mn Y为111431(45134，275106)(表12b)。与天然的Mn PS对照相比，结合物在小鼠中诱导的杀菌滴度高了7-86倍。
表12a、使用多价结合物批次TTHVIIACWYa060922B(2:2)中每种Mn PS1μg/剂对小鼠组(天然PS混合物对照5只小鼠，实验组5只小鼠)进行第三次接种免疫后2周时，在1个SD置信区间内抗Mn PS抗体水平的几何平均值a
多糖　　天然PS混合物　　　　　　批次　　　　　　　增加的倍数
　　　　　　　　　　　TTHVIIACWYa060922B(2:2)
A　　　108(39，296)　　　24828(16738，36829)　　　　　230
C      416(221，784)     10641(6118，18506)           26
W135   52(29，96)        15068(7374，30788)           290
Y      386(232，644)     99827(56810，175416)         259
a.与指定抗Mn PS抗体水平为3200单位/mL的每种PS的参比血清相比。
表12b、使用多价结合物批次TTHVIIACWYa060922B(2:2)中每种Mn PS1μg/剂对小鼠组(每组5只小鼠)进行第三次接种免疫后2周时，在1个SD置信区间内杀菌滴度的几何平均值。
多糖　　天然PS混合物　　　　批次TTHVIIACWYa060922B(2:2)　　增加的倍数
A       394(114，1358)      5970(3212，11099)              15
C       226(97，529)        19499(8185，45985)             86
W135    10396(6146，17585)  68593(19473，241620)         7
Y       9050(9050，9050)    111431(45134，275106)          12
方法A——联合的合成多价脑膜炎球菌A、C、W135和Y群多糖-破伤风类毒素结合物批次TTH2C/A/WY070209
活化TT以含有酰肼基团
1.破伤风类毒素(4.2mg/mL)用0.42M肼在存在20mM EDC、0.1M MES、pH5.5的情况下在20-24℃下活化。
2.反应4小时后，用1N NaOH将反应混合物的pH升高到7.5-10以终止反应。
3.使用12-14KDa的透析膜在4℃下用30mM NaCl、3mMNa2CO3、pH大约10.5对反应混合物进行缓冲液交换。
用NaIO 4 活化个体Mn A、C、W135和Y PS以含有醛基
1.将Mn A PS(10mg/mL)用15mM NaIO4在4℃活化72小时，用25mM甘油淬灭并在4℃下用水透析。
2.将Mn C PS(10mg/mL)用6mM NaIO4在室温活化4小时，用25mM甘油淬灭并在4℃下用水透析。
3.将Mn W135 PS(10mg/mL)用3mM NaIO4在4℃活化过夜，用25mM甘油淬灭并在4℃下用水透析。
4.将Mn Y PS(10mg/mL)用3mM NaIO4在4℃活化过夜，用25mM甘油淬灭并在4℃下用水透析。
活化的MnA、C、W135和Y PS混合物与活化的TT结合
1.活化的Mn C PS的等份试样(0.1mg)被冷冻干燥并重新溶解在1μL pH6的1M MES中。
2.含有酰肼的TT的等份试样(0.2mg)被冷冻干燥并重新溶解在2μL水中。
3.在第一天在4℃下将蛋白溶液加入到活化的Mn C PS溶液中；混合；在4℃孵育过夜。
4.在第二天在4℃下将2-7μL的0.05mg活化的Mn A PS加入到含有酰肼的TT/活化的Mn C PS反应混合物中；混合；在4℃孵育过夜。
5.在第三天在4℃下，将冰冷的盐水和0.05mg每种活化的MnW135和Y PS加入到第(4)步的反应混合物中，使总体积为200μL；混合；在4℃孵育过夜。
6.加入2μL pH6.5的1M MES。
7.用3μL 1M NaBH4将反应混合物在4℃处理过夜。
8.使用截留分子量为12-14KDa的膜，在4℃下用盐水、10mMHEPES、pH7.5、1mM EDTA对溶液进行缓冲液交换。
9.测定透析的结合物的体积，根据投入的质量计算蛋白(TT)和每种多糖(Mn A、C、W135和Y)的浓度。
联合的合成多价结合物批次TTH2C/A/WY070209的性质
结合物批次TTH2C/A/WY070209通过HPSEC洗脱图谱(在280nm处监测)分析。在结合后，观察到蛋白信号从17.5分钟移向14分钟，在结合后几乎没有留下未结合的游离蛋白。在HPLC图谱的每个级份中每种脑膜炎球菌血清组A、C、W135或Y的结合多糖都通过使用相应的特异性针对每种多糖的抗体进行了ELISA检测(图15)。
联合的合成多价结合物批次TTH2C/A/WY070209的免疫原性
结合物在第0、7和14天被用来免疫一组15只小鼠，使用天然多糖混合物(5只小鼠)作为对照，对于Mn A、W135和Y来说为每种PS0.1μg/剂，对于Mn C来说为0.2μg/剂。通过ELISA测定的在第三次注射后1周时诱导的抗体水平的几何平均值(单位/mL)，对于对照组来说是Mn A为1(1，1；1SD置信区间)、Mn C为34(10，109)、Mn W135为1(1，1)、Mn Y为28(5，166)，对于结合物来说是Mn A为10303(5480，19371)、Mn C为12815(7350，22343)、Mn W135为3111(1490，6494)、Mn Y为9457(4280，20894)，假定每种PS的参比血清为3200单位/mL(表13a)。与天然的Mn PS对照相比，结合物在小鼠中诱导的抗Mn PS特异性抗体高了338-10303倍。通过杀菌分析测定的在第三次注射后1周时诱导的杀菌滴度的几何平均值，对于对照组来说是Mn A为260(127，533；1SD置信区间)、Mn C为92(76，111)、Mn W135为858(587，1254)、Mn Y为462(53，3998)，对于结合物组来说是Mn A为4321(2192，8521)、Mn C为1755(931，3310)、Mn W135为20030(4288，93566)、Mn Y为7728(2811，21244)(表13b)。与天然的Mn PS对照相比，结合物在小鼠中诱导的杀菌滴度高了17-23倍。
表13a、使用多价结合物批次TTH2C/A/WY070209中Mn A、W135和Y每种PS0.1μg/剂和Mn C0.2μg/剂对小鼠组(天然PS混合物对照5只小鼠，实验组15只小鼠)进行第三次接种免疫后1周时，在1个SD置信区间内抗Mn PS抗体水平的几何平均值a。
多糖　　　天然PS混合物　　　批次TTH2C/A/WY070209　　　增加的倍数
A         1(1，1)           10303(5480，19371)        10303
C         34(10，109)       12815(7350，22343)        377
W135      1(1，1)           3111(1490，6494)          3111
Y         28(5，166)        9457(4280，20894)         338
a.与指定抗Mn PS抗体水平为3200单位/mL的每种PS的参比血清相比。
表13b、使用多价结合物批次TTH2C/A/WY070209中Mn A、W135和Y每种PS0.1μg/剂和Mn C0.2μg/剂对小鼠组(天然PS混合物对照5只小鼠，实验组15只小鼠)进行第三次接种免疫后1周时，在1个SD置信区间内杀菌滴度的几何平均值。
多糖　　　天然PS混合物　　　批次TTH2C/A/WY070209　　增加的倍数
A         260(127，533)     4321(2192，8521)        17
C         92(76，111)       1755(931，3310)         19
W135      858(587，1254)    20030(4288，93566)      23
Y         462(53，3998)     7728(2811，21244)       17
方法B——联合的合成多价脑膜炎球菌A、C、W135和Y群多糖-破伤风类毒素结合物批次TTHIAC/WY070210B(2:2)
活化TT以含有酰肼基团
1.破伤风类毒素(4.2mg/mL)用0.42M肼在存在30mM EDC、0.1M MES、pH5.5的情况下在20-24℃下活化。
2.反应3小时后，用1N NaOH将反应混合物的pH升高到7.5-10以终止反应。
3.使用12-14KDa的透析膜在4℃下用30mM NaCl、3mMNa2CO3、pH大约10.5对反应混合物进行缓冲液交换。
活化Mn A和C PS混合物以含有氰酸酯基团
将Mn A和C PS混合物(1:1，W/W；0.025mL，10mg/mL)用1.5μL CDAP(100mg/mL，在乙腈中)在1μL 0.2M三乙胺存在下在20-24℃下活化2-2.5分钟。
活化的Mn A和C PS混合物与活化的TT结合
1.将活化的多糖与200μL冰冷的pH7.4的2x PBS混合，然后加入0.5mg冰冷的TTH。
2，将反应混合物在4℃下轻轻摇动孵育过夜。
活化Mn W135和Y PS混合物以含有氰酸酯基团
将Mn W135和Y PS混合物(1：1，W/W；0.025mL，10mg/mL)用1.5μL CDAP(100mg/mL，在乙腈中)在1μL 0.2M三乙胺存在下在20-24℃下活化2-2.5分钟。
活化的Mn W135和Y PS混合物与活化的TT在TTH+活化的Mn A 和C反应混合物中的结合
1.将活化的Mn W135和Y混合物与TTH+活化的Mn A和C反应混合物在冰上混合。
2.将反应混合物在4℃下轻轻摇动孵育3个通宵。(延长孵育是为了确保结合完全以及剩余的残留未反应的氰酸酯基团分解)
3.使用截留分子量为12-14KDa的膜，用盐水、10mM HEPES、pH7.5、1mM EDTA对溶液进行缓冲液交换。
4.测定透析的结合物的体积，根据投入的质量计算蛋白(TT)和每种多糖(Mn A、C、W135和Y)的浓度。
联合的合成多价结合物批次TTHIAC/WY070210B(2:2)的性质
结合物批次TTHIAC/WY070210B(2:2)通过HPSEC洗脱图谱(在280nm处监测)分析。在结合后，观察到蛋白信号从17.5分钟移向14分钟，在结合后几乎没有留下未结合的游离蛋白。在HPLC图谱的每个级份中每种脑膜炎球菌血清组A、C、W135或Y的结合多糖通过使用相应的特异性针对每种多糖的抗体进行了ELISA检测。
联合的合成多价结合物批次TTHIAC/WY070210B(2:2)的免疫原 性
结合物以每种多糖0.1μg/剂在第0、7和14天被用来免疫一组5只小鼠，使用天然多糖作为对照。通过ELISA测定的在第三次注射后1周时诱导的抗体水平的几何平均值(单位/mL)，对于对照组来说是Mn A为1(1，1；1SD置信区间)、Mn C为34(10，109)、Mn W135为1(1，1)、Mn Y为28(5，166)，对于结合物组来说是Mn A为5873(3966，8699)、Mn C为3465(2109，5695)、Mn W135为3798(2090，6900)、Mn Y为22423(11933，42133)，假定每种PS的参比血清为3200单位/mL(表14a)。与天然的Mn PS对照相比，结合物在小鼠中诱导的抗Mn PS特异性抗体高了102-5873倍。通过杀菌分析测定的在第三次注射后1周时诱导的杀菌滴度的几何平均值，对于对照组来说是Mn A为260(127，533；1SD置信区间)、Mn C为92(76，111)、Mn W135为858(587，1254)、Mn Y为462(53，3998)，对于结合物组来说是Mn A为4127(2196，7756)、Mn C为1331(588，3010)、Mn W135为38508(17971，82515)、Mn Y为11506(7700，17194)(表14b)。与天然的Mn PS对照相比，结合物在小鼠中诱导的杀菌滴度高了14-45倍。
表14a、使用多价结合物批次TTHIAC/WY070210B(2:2)中每种Mn PS0.1μg/剂对小鼠组(天然PS混合物对照5只小鼠，实验组5只小鼠)进行第三次接种免疫后1周时，在1个SD置信区间内抗Mn PS抗体水平的几何平均值a。
多糖     天然PS混合物               批次          增加的倍数
                            TTHIAC/WY070210B(2:2)
A          1(1，1)             5873(3966，8699)      5873
C          34(10，109)         3465(2109，5695)      102
W135       1(1，1)             3798(2090，6900)      3798
Y          28(5，166)          22423(11933，42133)   801
a.与指定抗Mn PS抗体水平为3200单位/mL的每种PS的参比血清相比。
表14b、使用多价结合物批次TTHIAC/WY070210B(2:2)中每种Mn PS0.1μg/剂对小鼠组(每组5只小鼠)进行第三次接种免疫后1周时，在1个SD置信区间内杀菌滴度的几何平均值。
多糖     天然PS混合物              批次           增加的倍数
                           TTHIAC/WY070210B(2:2)
A        260(127，533)        4127(2196，7756)        16
C        92(76，111)          1331(588，3010)         14
W135     858(587，1254)       38508(17971，82515)     45
Y        462(53，3998)        11506(7700，17194)      25
鉴于可以应用本发明公开的原理的许多可能的实施方案，应该认识到所说明的实施方案仅仅是本发明的优选实施例，而不应该被当作对本发明的范围的限制。相反，本发明的范围由所附的权利要求来限定。因此我们对所有在这些权利要求的范围和精神之内的发明要求权利。
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Claims (46)

1.用于制造复合的多价免疫原性结合物的方法，包括：
将多种免疫原性不同的多糖与氧化剂进行反应，产生多种醛活化的免疫原性不同的多糖的混合物；
将至少一种蛋白与肼、碳酰肼、盐酸肼、二酰肼或其混合物在足以产生至少一种酰肼活化的蛋白的溶液条件下进行反应；
将多种醛活化的免疫原性不同的多糖的混合物与至少一种酰肼活化的蛋白在pH5到8下相接触，使得多种醛活化的免疫原性不同的多糖同时与至少一种酰肼活化的蛋白发生反应，产生复合的多价结合物，该结合物含有在每种结合的免疫原性不同的多糖和蛋白之间形成的至少一个C＝N双键；以及
将复合的多价结合物的C＝N双键还原成C-N键，产生复合的多价免疫原性结合产物。
2.权利要求1中的方法，其中至少一种酰肼活化的蛋白在中性pH下可溶。
3.权利要求1中的方法，其中在含有多种醛活化的免疫原性不同的多糖的混合物和至少一种酰肼活化蛋白的组合物中，实现了所述多种醛活化的免疫原性不同的多糖与至少一种酰肼活化蛋白的同时反应。
4.权利要求1中的方法，其中多种醛活化的免疫原性不同的多糖的混合物与至少一种酰肼活化蛋白的接触和C＝N双键的还原包括在硼氢化钠的存在下提供多种由醛活化的免疫原性不同的多糖的混合物与至少一种酰肼活化蛋白形成的组合物。
5.权利要求2中的方法，其中至少一种蛋白与肼、碳酰肼、盐酸肼、二酰肼或其混合物在(i)碳二亚胺以及(ii)至少一种氨基酸、至少 一种肽、或至少一种氨基酸与至少一种肽的混合物存在下进行反应。
6.权利要求5中的方法，其中氨基酸选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸或半胱氨酸的至少一种。
7.权利要求1中的方法，其中至少一种蛋白与肼、碳酰肼、琥珀酰二酰肼、己二酸二酰肼或其混合物在碳二亚胺盐酸盐存在下在pH6到7下反应以获得酰肼活化的蛋白的溶液，并且还包括对酰肼活化蛋白的溶液进行缓冲液交换，使pH达到10.0到11.0。
8.权利要求1中的方法，其中至少一种蛋白与肼、碳酰肼、琥珀酰二酰肼、己二酸二酰肼或其混合物在碳二亚胺盐酸盐存在下在pH5.5到6.5下反应以获得酰肼活化的蛋白的溶液，并且还包括对酰肼活化的蛋白的溶液进行缓冲液交换，使pH达到10.0到11.0。
9.权利要求1中的方法，其中2-28种醛活化的免疫原性不同的多糖同时与至少一种酰肼活化的蛋白反应。
10.权利要求9中的方法，其中免疫原性不同的多糖选自脑膜炎球菌(Meningococcal)多糖、肺炎球菌(Pneumococcal)多糖、b型流感嗜血杆菌(Hemophilus influenzae type b)多糖、伤寒沙门氏菌(Salmonnella typhi)Vi多糖和B类链球菌(group B Streptococcus)多糖。
11.权利要求1中的方法，其中免疫原性不同的多糖选自A群脑膜炎球菌、C群脑膜炎球菌、W135群脑膜炎球菌和Y群脑膜炎球菌。
12.权利要求1中的方法，其中醛活化的免疫原性不同的多糖与单个的酰肼活化的蛋白反应。
13.权利要求1中的方法，其中醛活化的免疫原性不同的多糖与 多种不同的酰肼活化的蛋白反应。
14.权利要求7中的方法，其中碳二亚胺盐酸盐是l-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
15.权利要求1中的方法，其中多种免疫原性不同的多糖是免疫原性不同的多糖的混合物。
16.权利要求1中的方法，其中每种免疫原性不同的多糖最初与氧化剂反应，然后将获得的个体醛活化的免疫原性不同的多糖混合在一起，形成醛活化的免疫原性不同的多糖的混合物。
17.制造复合的多价免疫原性结合物的方法，包括：
将多种免疫原性不同的多糖与氰基化试剂进行反应，产生多种氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖的混合物；
将至少一种蛋白与肼、碳酰肼、盐酸肼、二酰肼或其混合物在足以产生至少一种肼活化的蛋白的溶液条件下进行反应；以及
将多种氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖的混合物与至少一种酰肼活化的蛋白在pH6到8下相接触，使得多种氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖同时与至少一种酰肼活化的蛋白发生反应，产生复合的多价免疫原性结合物，该结合物含有在每种结合的免疫原性不同的多糖和蛋白之间形成的至少一个C-N键。
18.权利要求17中的方法，其中氰基化试剂选自1-氰基-4-二甲基铵吡啶四氟硼酸盐、溴化氰或N-氰基-N,N,N-三乙基铵四氟硼酸盐。
19.权利要求17中的方法，其中在含有多种氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖的混合物和至少一种酰肼活化的蛋白的组合物中，实现了多种氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖与至少一种酰肼活化的蛋白同时反应。
20.权利要求17中的方法，其中多种氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖的混合物与至少一种酰肼活化的蛋白的接触包括制备含有多种氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖的混合物与至少一种酰肼活化的蛋白的反应组合物。
21.权利要求17中的方法，还包括将第二多种第二种免疫原性不同的多糖与氰基化试剂进行反应，产生多种第二种氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖的第二混合物；以及
将多种氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖的第二混合物与复合的多价免疫原性结合物相接触，从而在每种第二种氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖和蛋白之间形成至少一个C-N键。
22.权利要求21中的方法，其中第二种免疫原性不同的多糖与氰基化试剂的反应性比权利要求17中的免疫原性不同的多糖与氰基化试剂的反应性高。
23.权利要求22中的方法，其中权利要求17中的免疫原性不同的多糖选自A群脑膜炎球菌或C群脑膜炎球菌的至少一种。
24.权利要求22中的方法，其中第二种免疫原性不同的多糖选自W135群脑膜炎球菌或Y群脑膜炎球菌的至少一种。
25.制造复合的多价免疫原性结合物的方法，包括：
将蛋白与l-氨基-2,3-丙二醇(ADPO)在l-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐存在下在pH5.5到7下进行反应，产生ADPO修饰的蛋白的溶液；
将ADPO修饰的蛋白与氧化剂进行反应，产生醛活化的蛋白的溶液；
将多种酰肼活化的免疫原性不同的多糖的混合物与醛活化的蛋白 在pH5到8下相接触，使得多种酰肼活化的免疫原性不同的多糖同时与至少一种醛活化的蛋白发生反应，产生复合的多价结合物，该结合物含有在每种结合的免疫原性不同的多糖和蛋白之间形成的至少一个C＝N双键；以及
将复合的多价结合物中的C＝N双键还原成C-N键，产生复合的多价免疫原性结合产物。
26.权利要求25中的方法，其中蛋白与ADPO在pH5.5到6.5下反应。
27.权利要求25中的方法，其中蛋白与ADPO在pH6到7下反应。
28.制备酰肼活化的蛋白的方法，包括：
将蛋白与肼、碳酰肼、盐酸肼、二酰肼或其混合物在存在下述物质下进行反应：(i)碳二亚胺以及(ii)至少一种氨基酸、至少一种肽、或至少一种氨基酸和至少一种肽的混合物。
29.权利要求28中的方法，其中氨基酸选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸或半胱氨酸的至少一种。
30.权利要求28中的方法，其中至少一种酰肼活化的蛋白在中性pH下可溶。
31.制造复合的多价免疫原性结合物的方法，包括：
(a)将至少一种第一种醛活化的免疫原性不同的多糖与至少一种酰肼活化的蛋白在足以形成第一种结合物中间体的条件下相接触，使得第一种免疫原性不同的多糖与蛋白之间形成至少一个C＝N双键；
(b)将至少一种第二种醛活化的免疫原性不同的多糖与第一种结合物中间体相接触，使得第二种免疫原性不同的多糖与蛋白之间形成至少一个C＝N双键；以及
(c)将C＝N双键还原成C-N键，产生复合的多价免疫原性结合产物；
其中第一种醛活化的免疫原性不同的多糖与酰肼活化的蛋白的反应性比第二种醛活化的免疫原性不同的多糖与酰肼活化的蛋白的反应性低。
32.权利要求31中的方法，其中第一种醛活化的免疫原性不同的多糖选自A群脑膜炎球菌或C群脑膜炎球菌的至少一种。
33.权利要求31中的方法，其中第二种醛活化的免疫原性不同的多糖选自W135群脑膜炎球菌或Y群脑膜炎球菌的至少一种。
34.权利要求32中的方法，其中第二种醛活化的免疫原性不同的多糖选自W135群脑膜炎球菌或Y群脑膜炎球菌的至少一种。
35.按照权利要求1的方法制备的复合的多价免疫原性结合物。
36.按照权利要求17的方法制备的复合的多价免疫原性结合物。
37.按照权利要求25的方法制备的复合的多价免疫原性结合物。
38.按照权利要求31的方法制备的复合的多价免疫原性结合物。
39.药物组合物，包含权利要求35的复合的多价免疫原性结合物和至少一种可药用的载体。
40.药物组合物，包含权利要求36的复合的多价免疫原性结合物和至少一种可药用的载体。
41.药物组合物，包含权利要求37的复合的多价免疫原性结合物 和至少一种可药用的载体。
42.药物组合物，包含权利要求38的复合的多价免疫原性结合物和至少一种可药用的载体。
43.权利要求1中的方法，其中多种免疫原性不同的多糖包括b型流感嗜血杆菌、19F型肺炎链球菌和A类脑膜炎奈瑟菌的多糖。
44.权利要求17中的方法，其中多种免疫原性不同的多糖包括b型流感嗜血杆菌、19F型肺炎链球菌和A类脑膜炎奈瑟菌的多糖。
45.权利要求1，17，25或31中任一项的方法，其中复合的多价免疫原性结合物包括分子，所述分子中多种免疫原性不同的多糖与单个蛋白构建物结合。
46.权利要求1，17，25或31中任一项的方法，其中复合的多价免疫原性结合物由下式的结构所示：
其中P1是载体蛋白；PS1、PS2和PS3各是共价连接到P1上的免疫原性不同的多糖。
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