BRPI0708849A2

BRPI0708849A2 - métodos para a preparação de conjugados imunogênicos multivalentes complexos

Info

Publication number: BRPI0708849A2
Application number: BRPI0708849-3A
Authority: BR
Inventors: Che-Hung Robert Lee
Original assignee: Us Gov Health & Human Serv
Priority date: 2006-03-17
Filing date: 2007-03-16
Publication date: 2011-06-21
Also published as: WO2007109129A2; WO2007109129A8; KR101838938B1; KR20080103604A; US8173135B2; KR20130135399A; AU2007227504A1; US20120195922A1; AU2007227504B2; CN101405028A; BRPI0708849B1; KR20160038086A; EP1993604A2; AU2007227504A2; EP3006041A1; ZA200807961B; EP1993604B1; CA2644724A1; KR20150038626A; US20090092632A1

Abstract

MéTODOS PARA A PREPARAçAO DE CONJUGADOS IMUNOGENICOS MULTI VALENTES COMPLEXOS.A presente invenção refere-se a métodos para a preparação de conjugados imunogénicos multivalentes complexos que incluem a reação simultânea de diversos polissacarídeos imunogênicos distintos com pelo menos uma proteína para a produção dos conjugados imunogênicos multivalentes complexos. A reação simultânea envolve a reação de um grupo hidra- zida em um reagente com um grupo éster de aldeido ou cianato no outro reagente

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSPARA A PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS IMUNOGÊNICOS MULTIVA-LENTES COMPLEXOS".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se aos métodos para a produção deconjugados imunogênicos multivalentes, e aos conjugados feitos por taismétodos.

REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE

Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido U.S.Provisório N0 60/783.490, depositado em 17 de março de 2006, que é aquiincorporado por referência em sua totalidade.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido de patente está relacionado com o WO2005/014037, depositado em 6 de agosto de 2004, e WO 2005/037320, de-positado em 6 de agosto de 2004, ambos aqui incorporados por referênciaem suas totalidades.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Polissacarídeos bacterianos (PSs) são antígenos T-independentes que induzem imunidade de curto prazo em crianças mais ve-lhas e em adultos, mas freqüentemente não em crianças mais jovens. PSssão incapazes de se ligar às moléculas do complexo de histocompatibilidadeprincipal, o que é necessário para a apresentação de antígeno e estimulaçãode linfócitos T auxiliares. PSs são capazes de estimular linfócitos B para aprodução de anticorpos sem o auxílio de linfócitos T auxiliares. Em conse-qüência da estimulação T-independente dos linfócitos B, há uma ausênciade memória de indução após imunização por esses antígenos.

Antígenos polissacarídicos T-independentes podem ser conver-tidos em antígenos T-dependentes por adesão covalente dos polissacarí-deos às moléculas de proteína. Células B que se ligam ao componente po-lissacarídico da vacina conjugada podem ser ativadas por células T auxilia-res específicas para peptídeos que são parte da proteína veículo conjugada.

A resposta de células T auxiliares à proteína veículo serve para aumentar aprodução de anticorpos ao polissacarídeo. Vacinas conjugadas-PS são hí-bridos de polissacarídeo-proteína formados pela adesão covalente de umaproteína a um PS. A modificação química do PS antes da adesão é tipica-mente necessária, pois a maioria dos PSs bacterianos nativos não pode serligada quimicamente a uma proteína sem primeiro passar por alguma modifi-cação química ("ativação").

A adesão à proteína faz com que os PSs tenham acesso à pro-priedade imunológica de diversos epitopos de células T da proteína. Essesepitopos de células T interagem com células T auxiliares CD4, facilitandoenormemente uma resposta de anticorpo ao polissacarídeo anexado. A res-posta dependente de célula T auxiliar a um conjugado resulta tanto em anti-corpos séricos IgG quanto em memória imunológica, até mesmo em crian-ças pequenas, por exemplo, crianças abaixo de dois anos de idade. Adicio-nalmente, a imunogenicidade do PS-conjugado, em contraste com o PS na-tivo, é menos dependente do tamanho do PS conjugado. Conseqüentemen-te, conjugados preparados com PS ou oligossacarídeos podem ter imunoge-nicidade similar.

Há muitas reações de conjugação que foram empregadas para aligação de forma covalente de polissacarídeos a proteínas. Três desses mé-todos mais comumente empregados incluem: 1) aminação redutiva, em queo grupo aldeído ou cetona em um componente da reação reage com o grupoamino ou hidrazida no outro componente, e a ligação dupla C=N formada ésubseqüentemente reduzida a uma ligação simples C-N por um agente redu-tor; 2) conjugação por cianilação, em que o polissacarídeo é ativado porbrometo de cianogênios (CNBr) ou por tetrafluoroborato de 1 -ciano-4- dimeti-lamoniopiridínio (CDAP) para a introdução de um grupo cianato ao grupohidroxila, que forma uma ligação covalente com o grupo amino ou hidrazidamediante a adição do componente protéico; e 3) uma reação de carbodiimi-da, em que a carbodiimida ativa o grupo carboxila em um componente dareação de conjugação, e o grupo carbonila ativado reage com o grupo aminoou hidrazida no outro componente. Essas reações também são freqüente-mente empregadas para ativar os componentes do conjugado, antes da rea-ção de conjugação.

As vacinas conjugadas de Haemophilus influenzae tipo b (Hib)representam as primeiras vacinas conjugadas de PS-proteína produzidaspara uso clínico. Robbins e outros em 1980 utilizaram o processo biotecno-lógico de anexação química de sacarídeos de Hib aos veículos protéicos, umconceito desenvolvido 50 anos antes. Vide Avery et al., J. Exp. Med. 1929;50: 533-SSO; Schneerson et al., J. Exp. Med. 1980; 152: 361-376. Há agoraquatro vacinas conjugadas de Hib diferentes licenciadas nos Estados Uni-dos, cada uma diferente e cada uma possuindo suas próprias característicasfísicas, químicas e imunológicas, como resumido na Tabela A. Foi publicadauma revisão detalhada da química de conjugação e do controle de qualidadeusados nessas vacinas. Vide Kniskem et al., "(Conjugation: design, chemis-try, and analysis" em Ellis et al., "Development and clinicai uses of Haemo-philus b conjugate vaccinnes". Nova York: Mareei Dekker, 1994: 37-69.

Tabela A

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O primeiro conjugado de Hib comercial, conjugado de fosfato depolirribosilribitol - toxóide diftérico (PRP-D), consiste em PS de Hib com ta-manho parcialmente reduzido anexado por meio de um espaçador de seiscarbonos, diidrazida de ácido adípico (ADH), ao toxóide diftérico com o usodo o procedimento de Schneerson etal., J. Exp. Med. 1980; 152: 361-376. Oderivado de ADH do toxóide diftérico foi obtido nesse método por reaçãocom ADH na presença de cloridrato de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etil car-bodiimida (EDC). O PS de Hib foi então ativado por criação de grupos ciana-to nos grupos hidroxila com o uso de CNBr. O PS ativado foi conjugado aoADH-toxóide (conjugação por cianilação), mas o processo criou uma ligaçãoinstável, e o conjugado tinha solubilidade problemas.

A química de conjugação de Robbins foi posteriormente modifi-cada de forma que o espaçador de ADH é adicionado primeiro ao polissaca-rídeo, que é então conjugado à proteína purificada na presença de EDC (re-ação de carbodiimida). Vide Chu et al., Infect. Immun. 1983; 40: 245-256;Schneerson et al. Infect. Immun. 1986, 52: 519-528. Essa modificação au-mentou a eficiência da conjugação e a solubilidade do produto. A vacinaconjugada de fosfato de polirribosilribitol - proteína tetânica (PRP-T) utiliza aquímica aperfeiçoada para ligar de forma covalente o polissacarídeo de Hibao toxóide tetânico (vide Tabela 1).

A vacina de conjugado de toxóide diftérico mutante com reaçãocruzada com fosfato de polirribosilribitol (PRP-CRM), também denominadoconjugado de oligossacarídeo de Haemophilus b (HbOC), não contém PS deHib. Em vez disso, ela utiliza oligossacarídeos de cerca de 20 unidades derepetição derivados por oxidação com periodato da funcionalidade glicol naporção ribitol. Os oligossacarídeos oxidados são então anexados diretamen-te à CRM197, uma forma mutante atóxica de toxina diftérica na presença decianoboroidreto de sódio (aminação redutiva). Vide Anderson et al., J. Im-munol. 1989; 142: 2.464-8; e Anderson, Infect. Immun. 1983, 39: 233-238.Nesse método de conjugação, verificou-se que a proporção de oligossacarí-deo para proteína era crítica para a resposta de anticorpo ótima. Vide Knisk-ern et al., "Conjugation: design, chemistry, and analysis" em Ellis et al., "De-velopment and clinicai uses of Haemophilus b conjugate vaccinnes". NovaYork: Mareei Dekker, 1994: 37-69; Anderson et al., J. Immunol. 1989; 142:2.464-8.

Comparadas com outras vacinas conjugadas de Hib, a vacinaconjugada de polissacarídeo de Hib-complexo de proteínas da membranaexterna de Neisseria meningitidis (PRP-OMPC) possui várias propriedadesúnicas. O transportador protéico não é um componente da vacina de difteria,tétano e pertussis (DTP), mas consiste em vesículas da membrana externameningocócica com lipopolissacarídeos removidos às quais são anexadosPS de Hib com tamanho reduzido por meio de uma ligação tioéter. VideMarburg et ai, J. Amer. Chem. Soe. 1986; 108: 5.282-5287; Kniskern et ai,"Conjugation: design, chemistry, and analysis" em Ellis et ai, "Developmentand clinicai uses of Haemophilus b conjugate vaccinnes". Nova York: MareeiDekkcr, 1994: 37-69; Anderson et ai, J. Immunol. 1989; 142: 2.464-8. Nesseprocesso, vinculadores separados são anexados tanto à proteína quanto aopolissacarídeo de Hib, seguido por fusão dos vinculadores, para formar umaligação tioéter.

Neisseria meningitidis é uma causa importante de meningite esépsis bacterianas em todo o mundo. Meningococos patogênicos são enve-Iopados por uma cápsula de polissacarídeo que é anexada à superfície damembrana externa do organismo. Treze sorogrupos diferentes de meningo-cocos foram identificados com base na especificidade imunológica do polis-sacarídeo capsular (Frasch, C. E., et ai. 1985). Desses treze sorogrupos,cinco causam a maioria das doenças meningocócicas; esses incluem os so-rogrupos A, B, C, W135 e Υ. O sorogrupo A é responsável pela maior partedas doenças epidêmicas. Os sorogrupos B, C e Y causam a maior parte dasdoenças endêmicas e de surtos localizados. As defesas do hospedeiro con-tra meningococos invasivos dependem da bacteriólise mediada por comple-mento. Os anticorpos séricos que são responsáveis pela bacteriólise media-da por complemento são dirigidos, em grande parte, contra o polissacarídeocapsular externo.

As vacinas convencionais baseadas no polissacarídeo meningo-cócico despertam uma resposta imunológica contra o polissacarídeo capsu-lar. Esses anticorpos são capazes de bacteriólise mediada por complementodos meningococos sorogrupo específicos. As vacinas de polissacarídeo me-ningocócico demonstraram ser eficazes em crianças e adultos. No entanto, aeficácia era limitada em crianças pequenas e crianças jovens, e as dosessubseqüentes do polissacarídeo em populações mais jovens despertaramuma resposta de reforço fraca ou ausente.

Foram empregadas diversas abordagens para ativação do PSmeningocócico e para conjugação, como resumido na Tabela B. Cada modode ativação possui o potencial para alterar epitopos importantes, até mesmoquando relativamente poucos sítios são ativados na molécula de PS. A ati-vação com periodato do PS meningocócico do grupo C, por exemplo, produza quebra da cadeia, com a geração de unidades de sacarídeos menorescom grupos aldeído terminais que podem ser ligadas à proteína por meio deaminação redutiva. Richmond et a!., J. Infect. Dis. 1999; 179: 1.569-72.

Tabela B

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a. Diéster de hidroxisuccinimida de ácido adípico

b. PS de deacetililato só relatado para grupo meninqocócico C

Estudos iniciais sobre a produção e otimização de conjugadosmeningocócicos do grupo C foram relatados bem antes da comercializaçãodos conjugados de Hib. Vide Beuvery et ai, Infect. Immun. 1982; 37: 15-22;Beuvery etal., Infect. Immun. 1983; 40: 39-45; Beuvery etal., J. Infect. 1983;6: 247-55; Jennings, et al., J. Immunol. 1981; 127: 1.011-8.

Duas metodologias diferentes de conjugação foram relatadaspara ligação química do PS do grupo C a um transportador protéico. VideJennings etal., J. Immunol. 1981; 127:1011-8; Beuvery etal., Infect. Immun.1983; 40: 39-45. A primeira abordagem emprega PS despolimerizado parci-almente, que é ativado por criação de grupos aldeído terminais por meio daoxidação com periodato (Método N9 1 na Tabela 2). Os aldeídos são entãoreagidos por meio de aminação redutiva com grupos amino livres na proteí-na, principalmente lisinas, na presença de cianoboroidreto de sódio. VideJennings et ai, J. Immunol. 1981; 127: 1.011-8. Nesse método, a ativaçãoocorre em um sítio específico de des-O-acetilação no PS do grupo C.

A segunda abordagem utiliza a reação de carbodiimida (MétodoN9 2 na Tabela 2) para ligar de forma covalente grupos carboxílicos no PSde alto peso molecular aos grupos ε-amino de Iisina na proteína veículo. Ossítios de ativação nesse método são mais aleatórios, comparado com a ati-vação com periodato.

Os conjugados meningocócicos do grupo C preparados por es-ses dois métodos foram avaliados em animais. Vide Beuvery et ai, Dev.Biol. Stand. 1986; 65: 197-204; e Beuvery et ai, J. Infect. 1983; 6:247-55. Osconjugados estimularam respostas tanto células T-independentes quantocélulas T-dependentes com a imunização inicial. Vide Beuvery et al., J. In-fect. 1983; 6: 247-55. Estudos demonstraram que o PS deve, no entanto,estar ligado de forma covalente à proteína veículo para induzir uma respostade anticorpos de célula T-dependente.

Os primeiros meningocócicos do grupo A e do grupo C conjuga-dos a serem usados em experimentos clínicos foram preparados por ChironVaccines e foram relatados em 1992 (Método Nq 3 na Tabela 2). Vide Cos-tantino et ai, Vaccine 1992; 10: 691- 8. O método de conjugação era basea-do do na ativação seletiva do grupo terminal de pequenos oligossacarídeosproduzido por hidrólise de ácido leve, seguida por acoplamento a uma prote-ína por meio de um espaçador de hidrocarboneto. O mutante atóxico da to-xina diftérica, CRM, foi usado como o transportador protéico. Para ativar osoligossacarídeos para conjugação, um grupo amino era adicionado à extre-midade do oligossacarídeo, e depois reagido com o N-hidroxissuccinimidadiéster de ácido adípico para criar um éster ativo. Esse éster ativo foi entãoligado de forma covalente aos grupos ε-amino de Iisina na proteína CRM197,criando o conjugado.

Métodos convencionais para a preparação de vacinas conjuga-das de PS-proteína não utilizam química de hidrazida na reação de conjuga-ção de aminação redutiva, muito embora hidrazida na forma de ADH tenhasido usada na ativação do polissacarídeo. Esses métodos de técnicas esta-belecidas utilizam grupos ε-amino de resíduos de Iisina na proteína para re-ação com grupos funcionais em PSs ativados, por exemplo, grupos aldeído(aminação redutiva) e grupos carboxila. A eficiência da reação é baixa, tipi-camente apenas cerca de 20%. A reação também requer dois a três diaspara que a conjugação esteja completada, necessitando do uso de etapasde purificação para separar o conjugado do PS não-reagido. Vide Guo et al."Protein-polysaccharide conjugation" em: Pollard et al., "Methods in Molecu-lar Medicine", Vol. 66: "Meningococcal Vaccines: methods and Protocols",Humana Press, Totowa, NJ1 2001, pg 49-54. Há diversas explanações queforam propostas para os baixos rendimentos observados. Primeiro, o grupo£-amino de Iisina (pKa = 1 0,5) possui baixa reatividade nas condições deconjugação (pH 6,5-7,4). Vide Inman et al., Biochemistry 1969; 8: 4074-4.082. Em segundo lugar, a maioria dos métodos de conjugação empregatoxóides como as proteínas veículo. Os toxóides são derivados de toxinaspor detoxificação com formaldeído, que se combina com os grupos aminodas toxinas, deixando um número limitado de grupos amino disponível paraa conjugação. Em terceiro lugar, a solubilidade reduzida da proteína ativadae do conjugado proteína-PS resultantes pode levar à precipitação.

Conseqüentemente, são desejados métodos para síntese e fa-bricação de vacinas conjugadas de polissacarídeo-proteína em altos rendi-mentos. Também são desejáveis métodos nos quais a reação evolua emuma taxa rápida, com produção reduzida de subprodutos indesejados, e comquantidades reduzidas de proteína e polissacarídeo não-reagidos permane-cendo ao final da reação.

As vacinas baseadas em PSs existentes são de uso limitado emcrianças jovens e não fornecem proteção duradoura em adultos. Dessa for-ma, existe a necessidade de uma vacina conjugada de proteína-PS capazde conferir proteção de longo prazo contra doenças em crianças e adultosem risco para o desenvolvimento de, por exemplo, meningite bacteriana,pneumonia, tétano e outras infecções bacterianas. Os conjugados proteína-PS da modalidade preferida podem ser empregados para a preparação deformulações de vacina capazes de conferir proteção de longo prazo às cri-anças pequenas, crianças e adultos.

A administração de vacinas multivalentes (ou combinadas), quecontêm vacinas múltiplas, se tornou mais prevalecente recentemente emfunção das vantagens econômicas e logísticas, além de uma melhor aceita-ção do paciente na aplicação no campo. Tendências similares estão ocor-rendo para as vacinas conjugadas. Exemplos típicos desse tipo de vacinaconjugada combinada são Prevnar (Wyeth Lederle), a vacina pneumocócicaconjugada heptavalente, e Menactra (Aventis Pasteur), a vacina conjugadameningocócica tetravalente.SUMÁRIO DA INVENÇÃO

São aqui descritos métodos para a produção de conjugados i-munogênicos multivalentes complexos, incluindo vacinas conjugadas.

Em uma modalidade, é descrito um método para a produção deum conjugado imunogênico multivalente complexo, que compreende:

- reação de diversos polissacarídeos imunogênicos distintos comum agente oxidante, resultando em uma mistura de diversos polissacarídeosimunogênicos distintos ativados por aldeído;

- reação de pelo menos uma proteína com hidrazina, carboidra-zida, cloreto de hidrazina, uma diidrazida, ou uma mistura destas, sob condi-ções suficientes para produzir uma solução de pelo menos uma proteínaativada por hidrazida;

- contato da mistura dos diversos polissacarídeos imunogênicosdistintos ativados por aldeído com pelo menos uma proteína ativada por hi-drazida em um pH de cerca de 5 a cerca de 8, de tal forma que os diversospolissacarídeos imunogênicos ativados por aldeído distintos simultaneamen-te reajam com pelo menos uma proteína ativada por hidrazida, resultandoem um conjugado multivalente complexo que inclui pelo menos uma ligaçãodupla C=N formada entre cada polissacarídeo imunogênico distinto anexadoe a proteína; e

- redução de substancialmente todas as ligações duplas C=N doconjugado multivalente complexo em ligações C-N, resultando em um produ-to conjugado imunogênico multivalente complexo.

Em uma modalidade adicional, é descrito um método para aprodução de um conjugado imunogênico multivalente complexo, que com-preende:

- reação de diversos polissacarídeos imunogênicos distintos comum agente de cianilação, resultando em uma mistura de diversos polissaca-rídeos imunogênicos ativados por cianato distintos;

- reação de pelo menos uma proteína com hidrazina, carboidra-zida, dicloreto de hidrazina, uma diidrazida, ou uma mistura destas, sob con-dições suficientes para produzir uma solução de pelo menos uma proteínaativada por hidrazida; e

- contato da mistura dos diversos polissacarídeos imunogênicosativados por cianato distintos com pelo menos uma proteína ativada por hi-drazida em um pH de cerca de 6 a cerca de 8, de tal forma que os diversospolissacarídeos imunogênicos ativados por cianato distintos simultaneamen-te reajam com pelo menos uma proteína ativada por hidrazida, resultandoem um conjugado imunogênico multivalente complexo que inclui pelo menosuma ligação C-N formada entre cada polissacarídeo imunogênico distintoanexado e a proteína.

Em outra modalidade, é descrito um método para a produção deum conjugado imunogênico multivalente complexo, que compreende:

- reação de uma proteína com 1-amino-2,3-propanodiol (ADPO)na presença de cloridrato de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etil carbodiimida emum pH de cerca de 6 a cerca de 7, resultando em uma solução de uma pro-teína modificada por ADPO;

- reação da proteína modificada por ADPO com um agente oxi-dante, resultando em uma solução de uma proteína ativada por aldeído;

- contato de uma mistura dos diversos polissacarídeos imunogê-nicos ativados por hidrazida distintos com a proteína ativada por aldeído emum pH de cerca de 5 a cerca de 8, de tal forma que os diversos polissacarí-deos imunogênicos ativados por hidrazida distintos simultaneamente reajamcom pelo menos uma proteína ativada por aldeído, resultando em um conju-gado multivalente complexo que inclui pelo menos uma ligação dupla C=Nformada entre cada polissacarídeo imunogênico distinto anexado e a proteína; e

Também são aqui descritos métodos para a preparação de umaproteína ativada por hidrazida, que compreendem:

- reação de uma proteína com hidrazina, carboidrazida, cloretode hidrazina, uma diidrazida, ou uma mistura destas, na presença de: (i)uma carbodiimida e (ii) pelo menos um aminoácido, pelo menos um peptí-deo, ou uma mistura de pelo menos um aminoácido e pelo menos um peptí-deo.

Uma modalidade adicional aqui descrita para a produção de um conjugado imunogênico multivalente complexo inclui:

(a) o contato de pelo menos um primeiro polissacarídeo imuno-gênico ativado por aldeído distinto com pelo menos uma proteína ativada porhidrazida, sob condições suficientes para formar um primeiro intermediárioconjugado, de tal forma que se forme pelo menos uma ligação dupla C=Nentre o primeiro polissacarídeo imunogênico distinto e a proteína;

(b) o contato de pelo menos um segundo polissacarídeo imuno-gênico ativado por aldeído distinto com o primeiro intermediário conjugado,de tal forma que se forme pelo menos uma ligação dupla C=N entre o se-gundo polissacarídeo imunogênico distinto e a proteína; e

(c) redução de substancialmente todas as ligações duplas C=Nem ligações C-N, resultando em um produto conjugado imunogênico multiva-lente complexo (a redução é, de preferência, uma etapa única, de tal formaque toas as ligações duplas C=N sejam substancialmente reduzidas simul-taneamente);

em que a reatividade do primeiro polissacarídeo imunogênicoativado por aldeído distinto com a proteína ativada por hidrazida é menor doque a reatividade do segundo polissacarídeo imunogênico ativado por aldeí-do distinto com a proteína ativada por hidrazida.

Os objetivos, características e vantagens citados anteriormentee outros ficarão mais evidentes a partir da descrição detalhada que será a-presentada a seguir, que prossegue com referência às figuras anexas.BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 - Perfis de HPLC (280 nm, por uma coluna Superose 6)de produto de ativação de toxóide tetânico (TTH) com hidrazina ou diidrazidade ácido adípico (ADH), catalisada por várias concentrações de EDC e tem-pos de reação. As condições de reação são: (A) hidrazina, EDC a 24 mM por4 horas; (B) hidrazina, EDC a 12 mM, de um dia para o outro; (C) ADH, EDCa 36 mM por 4 horas; (D) ADH1 EDC a 48 mM por 2 horas. 0 produto possuipeso molecular muito alto para passar através da coluna e não mostra sinalde TTH no perfil (A). No perfil (B), somente uma pequena fração do produtopassa através da coluna e mostra um pico-sombra para TTH em 34 minutos.

Nos perfis (C) e (D)', o produto passa através da coluna e mostra um picopara TTH em 34 minutos.

Figura 2 - Perfis de HPLC (280 nm, por uma coluna Superose 6)de produto de ativação de toxóide tetânico (TTH) com hidrazina ou diidrazidade ácido adípico (ADH)1 catalisada por várias concentrações de EDC na pre-sença de diferentes concentrações de Iisina e tempos de reação. As condi-ções de reação são: (A) hidrazina, 24 mM de EDC, 36 mM Iisina por 2 horas;(B) hidrazina, EDC a 12 mM, Iisina a 144 mM por 2 horas; (C) ADH, EDC a12 mM, Iisina a 36 mM por 1 hora; e (D) ADH, EDC a 12 mM, Iisina a 72 mMpor 4 horas. Somente uma pequena fração do produto passa através da co-luna e mostra um pico-sombra em 34 minutos no perfil (A). O produto passaatravés da coluna e mostra um pico importante em 34 minutos para monô-mero e um pico menor em 31 minutos para dímero nos perfis (B)1 (C) e (D).

Figura 3 - Perfis de HPLC (280 nm, por uma coluna Superose 6)de produto de ativação de toxóide tetânico (TTH) com hidrazina ou diidrazidade ácido adípico (ADH), catalisada por várias concentrações de EDC na pre-sença de ácido glutâmico a 72 mM por vários tempos de reação. As outrascondições de reação são: (A) hidrazina, EDC a 24 mM por 1 hora; (B) hidra-zina, EDC a 48 mM por 1 hora; (C) ADH, EDC a 24 mM por 1 hora; e (D)ADH, EDC a 48 mM por 2 horas. O produto passes através da coluna e mos-tra um pico importante em 34 minutos para monômero e um pico menor em31 minutos para dímero.

Figura 4 - Perfis de HPLC (280 nm, por uma coluna Linear Wa-ters Ultrahidrogel) de (A) toxóide tetânico ativado (TTH) e (B) conjugado mul-tivalente polissacarídeo-toxóide tetânico combinado sintetizado (Conj.) pre-parado pelo método de conjugação A. Mediante conjugação à mistura depolissacarídeo ativado, o sinal de proteína muda de peso molecular baixo(17,5 minutos) para peso molecular alto (13,5 minutos).Figura 5 - Detecção por ELISA do componente de polissacarí-deo conjugado contido na vacina conjugada multivalente combinada sinteti-zada (B) na Figura 4. Apenas espécies que contêm proteína (ou seja, conju-gados e TTH livre) nas frações de HPLC aderiram à placa de ELISA duranterevestimento. Os polissacarídeos conjugados foram subseqüentemente de-tectados por anti-soros específicos para cada respectivo PS, mas não rea-gem de forma cruzada com o toxóide tetânico. Foi detectado um pico impor-tante em 12-15 minutos superpondo o sinal de proteína de (B) na Figura 4para todos os quatro polissacarídeos.

Figura 6 - Perfis de HPLC (280 nm, por uma coluna Linear Wa-ters Ultrahidrogel) de (A) toxóide tetânico ativado (TTH) e (B) conjugado mul-tivalente polissacarídeo-toxóide tetânico combinado sintetizado (Conj.) pre-parado pelo método de conjugação B. Mediante conjugação à mistura depolissacarídeo ativado, o sinal de proteína muda de peso molecular baixo(17,5 minutos) para peso molecular alto (13,5 minutos). Havia algum TTHlivre não-conjugado restante na mistura de produto.

Figura 7 - Detecção por ELISA do componente de polissacarí-deo conjugado na vacina conjugada multivalente combinada sintetizada de(B) na Figura 6. Apenas espécies que contêm proteína (ou seja, conjugadose TTH livre) das frações de HPLC aderiram à placa de ELISA durante reves-timento, e os polissacarídeos conjugados foram subseqüentemente detecta-dos por anti-soros específicos para cada respectivo PS, mas eles não rea-gem de forma cruzada com o toxóide tetânico. Foi detectado um pico impor-tante em 12-15 minutos superpondo o sinal de proteína de (B) na Figura 6para todos os quatro polissacarídeos.

Figura 8 - Perfis de HPLC (280 nm, por uma coluna Linear Wa-ters Ultrahidrogel) de (A) toxóide tetânico ativado (TTH) e (B) conjugado mul-tivalente polissacarídeo-toxóide tetânico combinado sintetizado (Conj.) pre-parado pelo método de conjugação C. Mediante conjugação à mistura depolissacarídeo ativado, o sinal de proteína muda de peso molecular baixo(17,5 minutos) para peso molecular alto (13,5 minutos). Havia algum TTHlivre não-conjugado restante na mistura de produto.Figura 9 - Detecção por ELISA do componente de polissacarí-deo conjugado na vacina conjugada multivalente combinada sintetizada de(B) na Figura 8. Apenas espécies que contêm proteína (ou seja, conjugadose TTH livre) das frações de HPLC aderiram à placa de ELISA durante reves-timento, e os polissacarídeos conjugados foram subseqüentemente detecta-dos por anti-soros específicos para cada respectivo PS, mas eles não rea-gem de forma cruzada com o toxóide tetânico. Foi detectado um pico impor-tante em 12-15 minutos superpondo o sinal de proteína de (B) na Figura 8para todos os quatro polissacarídeos.

Figura 10 - Perfis de HPLC (280 nm, por uma coluna Linear Wa-ters Ultrahidrogel) de (A) toxóide tetânico ativado (TTH) e (B) conjugado mul-tivalente polissacarídeo-toxóide tetânico combinado sintetizado (Conj.) pre-parado pelo método de conjugação A. Mediante conjugação à mistura depolissacarídeo ativado, o sinal de proteína muda de peso molecular baixo(17,5 minutos) para peso molecular alto (13,5 minutos).

Figura 11 - Detecção por ELISA do componente de polissacarí-deo conjugado na vacina conjugada multivalente combinada sintetizada de(B) na Figura 10. Apenas espécies que contêm proteína (ou seja, conjuga-dos e TTH livre) das frações de HPLC aderiram à placa de ELISA duranterevestimento, e os polissacarídeos conjugados foram subseqüentementedetectados por anti-soros específicos para cada respectivo PS, mas eles nãoreagem de forma cruzada com o toxóide tetânico. O sinal de ELISA elevadofoi detectado em 12-19 minutos para todos os quatro polissacarídeos. O si-nal de ELISA elevado em 12-15 minutos estava superposto ao sinal de pro-teína de (B) na Figura 10, enquanto o sinal de ELISA elevado em 15-19 mi-nutos era causado por conjugados residuais de pequeno peso molecular.

Figura 12 - Perfis de HPLC (280 nm, por uma coluna Linear Wa-ters Ultrahidrogel) de (A) toxóide tetânico ativado (TTH) e (B) conjugado mul-tivalente polissacarídeo-toxóide tetânico combinado sintetizado (Conj.) pre-parado pelo método de conjugação B. Mediante conjugação à mistura depolissacarídeo ativado, o sinal de proteína muda de peso molecular baixo(17,5 minutos) para peso molecular alto (13,5 minutos). Havia TTH livre não-conjugado substancial restante na mistura de produto.

Figura 13 - Detecção por ELISA do componente de polissacarí-deo conjugado na vacina conjugada multivalente combinada sintetizada de(B) na Figura 12. Apenas espécies que contêm proteína (ou seja, conjuga-dos e TTH livre) das frações de HPLC aderiram à placa de ELISA duranterevestimento, e os polissacarídeos conjugados foram subseqüentementedetectados por anti-soros específicos para cada respectivo PS, mas eles nãoreagem de forma cruzada com o toxóide tetânico. O sinal de ELISA elevadofoi detectado em 12-18 minutos para todos os quatro polissacarídeos. O si- nal de ELISA elevado em 12-15 minutos estava superposto ao sinal de pro-teína de (B) na Figura 12, enquanto o sinal de ELISA elevado em 15-18 mi-nutos era causado por conjugados residuais de pequeno peso molecular.

Figura 14 - Detecção por ELISA do componente de polissacarí-deo conjugado na vacina conjugada multivalente combinada sintetizada dolote TTHACWY061126. Uma amostra de conjugado de 25 μΙ contendo 0,05mg/ml de proteína (toxóide tetânico) e 0,0125 mg/ml de cada um de PS deMn A, C, W135 e Y foi analisada por HPLC. Apenas espécies que contêmproteína (ou seja, conjugados e TTH livre) das frações de HPLC aderiram àplaca de ELISA durante revestimento, e os polissacarídeos conjugados fo-ram subseqüentemente detectados por anti-soros específicos para cadarespectivo PS, mas eles não reagem de forma cruzada com o toxóide tetâni-co (símbolos sólidos). A incorporação significativa de PS de Mn A, W135 e Yno conjugado é indicada por seus respectivos sinais de ELISA, quando com-parado com o PS de Mn C de sinal de ELISA fraco. Isso foi atribuído à reati- vidade mais fraca de PS de Mn C ativado na conjugação ao TTH, quandocomparado com o PS ativado de Mn A, W135 e Y. Essa observação é con-sistente com os dados de imunogenicidade do conjugado que mostram umaeficácia menor para Mn C. Uma amostra da mistura de polissacarídeo nativotambém foi analisada em paralelo (símbolos abertos). Apenas o PS de Mn Anativo mostra sinal fraco, comparado com o conjugado nessa detecção porELISA.

Figura 15 - Detecção por ELISA do componente de polissacarí-deo conjugado na vacina conjugada multivalente combinada sintetizada dolote TTH2C/A/WY070209. Uma amostra de conjugado de 25 μΙ contendo0,05 mg/ml de proteína (toxóide tetânico) e 0,0125 mg/ml de cada um de PSde Mn A, C1 W135 e Y foi analisada por HPLC. Apenas espécies que contêmproteína (ou seja, conjugados e TTH livre) das frações de HPLC aderiram àplaca de ELISA durante revestimento, e os polissacarídeos conjugados fo-ram subseqüentemente detectados por anti-soros específicos para cadarespectivo PS, mas eles não reagem de forma cruzada com o toxóide tetâni-co (símbolos sólidos). Uma amostra da mistura de polissacarídeo nativotambém foi analisada em paralelo (símbolos abertos). A incorporação signifi-cativa de todos os quatro PSs no conjugado é indicada por seus respectivossinais de ELISA, quando comparados com seus PSs nativos. A reatividademais fraca do PS de Mn C ativado na conjugação ao TTH mostrada na Figu-ra 14 foi compensada com uma dose mais elevada (dupla, nesse caso) epela exposição precoce ao TTH, antes da reação com PS ativado de Mn A,W135 e Y.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Como aqui usados, os termos no singular "um", "uma", "o" e "a"incluem seus referentes no plural, a menos que o contexto indique claramen-te de forma diferente. Da mesma forma, a palavra "ou" visa incluir "e", a me-nos que o contexto indique claramente de forma diferente. Além disso, comoaqui usado, o termo "compreende" significa "inclui". Desse modo, "que com-preende A ou B" significa que inclui A, B, ou A e B. Deve-se entender aindaque todos os tamanhos de nucleotídeo ou todos os tamanhos de aminoáci-do, e todos os valores de peso molecular ou de massa molecular, dados pa-ra ácidos nucléicos ou polipeptídeos ou para outros compostos, são aproxi-mados e são fornecidos para fins descritivos. Embora métodos e materiaissimilares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prá-tica ou testes da presente descrição, métodos e materiais adequados serãodescritos abaixo. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenasilustrativos, e não visam ser limitantes. Os métodos e processos aqui descri-tos não têm seu desempenho limitado em quaisquer seqüências ou etapasespecíficas, a menos que observado de forma diferente. Por exemplo, a ati-vação dos polissacarídeos pode ocorre antes ou depois, ou em paralelo àativação das proteínas.

A fim de facilitar a revisão dos vários exemplos desta descrição,são fornecidas as seguintes explicações de termos específicos:

"Animal" inclui organismos vertebrados multicelulares vivos, umacategoria que inclui, por exemplo, mamíferos e pássaros. O termo "mamífe-ro" inclui mamíferos tanto humanos quanto não-humanos. Da mesma forma,o termo "indivíduo" inclui indivíduos tanto humanos quanto veterinários, porexemplo, seres humanos, primatas não-humanos, cachorros, gatos, roedo-res, cavalos e vacas.

Um "antígeno" é um composto, uma composição ou uma subs-tância que podem ser ligados especificamente pelos produtos da imunidadehumoral ou celular específica, por exemplo, uma molécula de anticorpo ouum receptor de célula T. Antígenos podem ser qualquer tipo de moléculabiológica, incluindo, por exemplo, metabólitos intermediários simples, açúca-res (por exemplo, oligossacarídeos), lipídeos e hormônios, além de macro-moléculas como, por exemplo, carboidratos complexos (por exemplo, polis-sacarídeos), fosfolipídeos, ácidos nucléicos e proteínas. Categorias comunsde antígenos incluem, sem limitação, antígenos virais, antígenos bacteria-nos, antígenos fúngicos, antígenos de protozoários e outros antígenos para-sitários, antígenos tumorais, antígenos envolvidos em doenças auto-imunes,alergia e rejeição de enxertos, toxinas, e outros antígenos diversos.

Um "veículo" é uma molécula imunogênica à qual um haptenoou um antígeno, por exemplo, um polissacarídeo, pode ser ligado. Quandoligada a um veículo, a molécula ligada pode se tornar mais imunogênica.Veículos são escolhidos para aumentar a imunogenicidade da molécula liga-da e/ou para despertar anticorpos contra o veículo que sejam benéficos emtermos diagnósticos, analíticos e/ou terapêuticos. A ligação covalente deuma molécula a um veículo confere imunogenicidade aumentada e depen-dência às células T (Pozsgay et ai, PNAS 96: 5.194-97, 1999; Lee et ai, J.Immunoi 116: 1.711-18, 1976; Dintzis et ai, PNAS 73: 3.671-75, 1976). Vei-culos úteis incluem veículos poliméricos, que podem ser naturais (por exem-plo, proteínas de bactérias ou vírus), materiais semi-sintéticos ou sintéticosque contêm um ou mais grupos funcionais aos quais uma porção do reagen-te pode ser anexada.

Exemplos de produtos bacterianos para uso como veículos in-cluem toxinas bacterianas como, por exemplo, PA de B. anthracis (incluindofragmentos que contêm pelo menos um epitopo antigênico e análogos ouderivados capazes de despertar uma resposta imunológica), LF e LeTx, eoutras toxinas e toxóides bacterianos, por exemplo, toxina/toxóide tetânico,toxina/toxóide diftérico, exotoxina/toxóide de P. aeruginosa, toxina/toxóide depertussis e exotoxina/toxóide de C. perfringens. Proteínas virais, por exem-plo, antígeno de superfície e antígeno central do vírus da hepatite B, tambémpodem ser usados como veículos.

Uma "ligação covalente" é uma ligação interatômica entre dois átomos, caracterizada pelo compartilhamento de um ou mais pares de elé-trons pelos átomos. Os termos "ligado de forma covalente" e "unidos de for-ma covalente" referem-se à transformação de duas moléculas separadas emuma molécula contígua.

Um "epitopo" é um determinante antigênico. Esses são gruposquímicos ou seqüências peptídicas contíguas ou não-contíguas em uma mo-lécula que são antigênicos, ou seja, que despertam uma resposta imunológi-ca específica. Um anticorpo se liga a um epitopo antigênico em particularcom base na estrutura tridimensional do anticorpo e no epitopo correspon-dente (ou cognato).

"Ligado", "unido", conjugado" ou "anexado" refere-se à união porligação covalente de um polissacarídeo a uma proteína veículo. A união porligação covalente pode ser direta ou indireta, por exemplo, ligada por meiode uma molécula espaçadora.

Um "conjugado imunogênico multivalente complexo" ou "vacinaconjugada multivalente complexa" compreende mais de um epitopo antigê-nico. Em uma primeira modalidade, os conjugados imunogênicos multivalen-tes complexos aqui descritos incluem misturas de diferentes moléculas, cadamolécula compreendendo diferentes polissacarídeos imunogênicos distintos,em que cada polissacarídeo imunogênico distinto diferente está conjugado aum transportador protéico separado. Em uma segunda modalidade, os con-jugados imunogênicos multivalentes complexos aqui descritos incluem molé-cuias nas quais diversos polissacarídeos imunogênicos distintos estão con-jugados a uma única molécula de proteína ou uma única construção de pro-teína (cuja própria construção de proteína inclui mais de uma proteína dife-rente). Uma terceira modalidade inclui uma mistura dos conjugados da pri-meira modalidade e dos conjugados da segunda modalidade. Um exemploda primeira modalidade pode ser apresentado como uma mistura das dife-rentes estruturas representadas por:

P1 - PS1; P1 - PS2; e P1 - PS3em que P1 é uma proteína veículo; e PS1, PS2 e PS3 são, cada um, polissa-carídeos imunogênicos distintos.

Um exemplo da segunda modalidade pode ser descrito comouma estrutura representada por:

<formula>formula see original document page 21</formula>

em que P1 é uma proteína veículo; PS11 PS2 e PS3 são, cada um, polissaca-rídeos imunogênicos distintos que estão anexados de forma covalente a P1.

A proteína e o polissacarídeo nas fórmulas acima podem serunidades estruturais singulares ou plurais, e há pelo menos uma ligaçãoformada entre a proteína e o polissacarídeo.

Uma "resposta imunológica" é uma resposta de uma célula doSafistema imunológico, por exemplo, uma célula B, célula T, macrófago ou po-limorfonuclear, a um estímulo. Uma resposta imunológica pode incluir qual-quer célula do corpo envolvida em uma resposta de defesa do hospedeiro,por exemplo, uma célula epitelial que secreta interferon ou uma citocina.Uma resposta imunológica inclui, sem limitação, uma resposta imunológicainata ou inflamação.

"Conjugado ou composição imunogênica" é um termo aqui utili-zado para significar uma composição útil para estimular ou despertar umaresposta imunológica específica (ou resposta imunogênica) em um vertebra-do. Em algumas modalidades, a resposta imunogênica é protetora ou forne-ce imunidade protetora, na medida em que permite que o animal vertebradoresista melhor à progressão da infecção ou doença pelo organismo contra oqual a composição imunogênica é dirigida. Um exemplo específico de umtipo de composição imunogênica é uma vacina.

Um "imunógeno" refere-se a um composto, uma composição ousubstância que é capaz, sob condições apropriadas, de estimular a produ-ção de anticorpos ou de uma resposta de células Tem um animal, incluindocomposições que são injetadas ou absorvidas em um animal.

Um "polissacarídeo imunogênico distinto" inclui um polissacarí-deo que desperta uma resposta imunológica que difere da resposta imuno-lógica despertada por outro tipo de polissacarídeo. Polissacarídeos imuno-gênicos distintos podem ter dois ou mais polissacarídeos de diferentes bac-térias encapsuladas. Por exemplo, um polissacarídeo pneumocócico é umpolissacarídeo imunogênico distinto comparado com um polissacarídeo me·ningocócico. Polissacarídeos imunogênicos distintos também incluem doisou mais polissacarídeos de diferentes sorogrupos ou sorotipos. Por exemplo,um polissacarídeo meningocócico do sorogrupo A é um polissacarídeo imu-nogênico distinto comparado com um polissacarídeo meningocócico do so-rogrupo B.

"Inibição ou tratamento de uma doença" inclui a inibição do de-senvolvimento total de uma doença ou condição, por exemplo, em um indiví-duo que esteja em risco para uma doença, por exemplo, antraz. "Tratamen-to" refere-se a uma intervenção terapêutica que atenua um sinal ou sintomade uma doença ou condição patológica após ela ter começado o seu desen-volvimento. Como aqui usado, o termo "atenua", com referência a uma do-ença, condição patológica ou sintoma, refere-se a qualquer efeito benéficoobservável do tratamento. O efeito benéfico pode ser evidenciado, por e-xemplo, por um surgimento retardado de sintomas clínicos da doença em umindivíduo suscetível, uma redução da gravidade de alguns ou de todos ossintomas clínicos da doença, em um retardo da progressão da doença, umaredução no número de recidivas da doença, uma melhora da saúde geral oudo bem-estar do indivíduo, ou por outros parâmetros bem-conhecidos natécnica que são específicos para a doença em particular.

Um "peptídeo" inclui uma molécula na qual as unidades estrutu-rais são pelo menos dois resíduos de aminoácidos que estão unidos em con-junto por meio de ligações amida. Um peptídeo inclui um dipeptídeo, um tri-peptídeo ou um oligopeptídeo. O termo "resíduo" ou "resíduo de aminoácido"inclui referência a um aminoácido que esteja incorporado em um peptídeo.

Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a umaquantidade de um agente especificado suficiente para obter um efeito dese-jado em um indivíduo tratado com este agente. Por exemplo, ela pode ser aquantidade de um polissacarídeo conjugado multivalente útil no aumento daresistência, prevenção, melhora e/ou tratamento de uma infecção e doençacausadas por uma infecção bacteriana em um indivíduo. Idealmente, a quan-tidade terapeuticamente eficaz de um agente é uma quantidade suficientepara aumentar a resistência, evitar, melhorar e/ou tratar infecção e doençacausadas por infecção em um indivíduo, sem causar um efeito citotóxicosubstancial no indivíduo. A quantidade eficaz de um agente útil para aumen-tar a resistência, evitar, melhorar e/ou tratar infecção e doença causadas porinfecção em um indivíduo dependerá do indivíduo tratado, da gravidade daenfermidade e do modo de administração da composição terapêutica.

Uma vacina é uma composição farmacêutica que desperta umaresposta imunológica profilática ou terapêutica em um indivíduo. Em algunscasos, a resposta imunológica é uma resposta protetora. Tipicamente, umavacina desperta uma resposta imunológica antígeno-específica a um antíge-no de um patógeno, por exemplo, um patógeno bacteriano ou viral, ou a umconstituinte celular correlacionado a uma condição patológica. Uma vacinapode incluir um polinucleotídeo, um peptídeo ou polipeptídeo, um polissaca-rídeo, um vírus, uma bactéria, uma célula ou um ou mais constituintes celu-lares. Em alguns casos, o vírus, bactéria ou célula pode ser inativado ou a-tenuado para evitar ou reduzir a probabilidade de infecção, mantendo-se aimunogenicidade do constituinte da vacina.São descritos novos métodos para a preparação de conjugadosimunogênicos multivalentes complexos e vacinas conjugadas. Em uma mo-dalidade, os conjugados multivalentes e as vacinas conjugadas são sinteti-zados por conjugação de misturas de mais de um polissacarídeo em umaproporção desejada dos polissacarídeos componentes a pelo menos umaproteína veículo, com o uso do método de química de hidrazida. Por causada alta eficiência da química de hidrazida na conjugação, os polissacarídeossão conjugados eficazmente à(s) proteína(s) veículo(s), de forma que osprodutos complexos sintetizados de vacina conjugada resultantes, sem ne-cessitar de procedimentos de purificação trabalhosos e complicados como,por exemplo, cromatografia e/ou precipitação com sulfato de amônio, sãoeficazes na indução de anticorpos em camundongos contra cada polissaca-rídeo componente. Os métodos de certas modalidades aqui descritas simpli-ficam a preparação de vacinas conjugadas multivalentes por utilização dereações de conjugação simultâneas em uma única mistura ou batelada dereação que inclui pelo menos dois polissacarídeos imunogênicos distintos.

Essa reação simultânea em batelada única elimina a necessidade de múlti-plos processos de síntese em paralelo para cada componente polissacarídi-co da vacina conjugada, como empregado em métodos convencionais paraa produção de vacinas conjugadas multivalentes. Em outras palavras, deacordo com métodos convencionais, cada componente individual de polissa-carídeo conjugado é preparado por um processo separado, e depois oscomponentes polissacarídicos conjugados individuais resultantes são mistu-rados em conjunto em uma única formulação de dosagem (vide, por exem-pio, U.S. 2005/0002948 A1, parágrafo [0033]). A síntese de conjugados mul-tivalentes e vacinas de acordo com os métodos da invenção atualmente a-presentados irá reduzir significativamente os custos de produção e facilitar aaplicação no campo de vacinação, beneficiando, dessa forma, enormementea saúde pública.

Nos métodos atualmente descritos, a alta eficiência química éaplicada à síntese combinada de vacinas conjugadas multivalentes, uma vezque todos os componentes de polissacarídeos ativados são capazes de for-mar um conjugado com a proteína ativada, como detectado por HPLC emconjunto com ELISA, com o uso dos respectivos anticorpos PS específicospara detecção.

Em certas modalidades, polissacarídeos menos reativos são ini-cialmente reagidos com a proteína ativada. Os polissacarídeos mais reativossão então subseqüentemente reagidos com o conjugado intermediário dePS/proteína menos reativo. Os polissacarídeos menos reativos são reagidosprimeiro, para fornecerem um tempo de reação mais longo sem competiçãodos polissacarídeos mais reativos, de forma que uma quantidade maior dospolissacarídeos menos reativos seja conjugada.

A reatividade relativa de um polissacarídeo ativado com umaproteína ativada refere-se à taxa de reação e/ou à quantidade de polissaca-rídeo conjugada. Uma maior taxa de reação e/ou uma maior quantidade deconjugação obtida são indicativas de um polissacarídeo mais reativo. A rea-tividade de um polissacarídeo ativado depende de pelo menos vários fato-res: do grau de ativação (quanto mais grupos funcionais anexados, maior areatividade); do comprimento da cadeia (no mesmo grau de ativação, umacadeia mais longa que contém mais grupos funcionais possui uma reativida-de maior); e da estrutura do polissacarídeo (impedimento estérico, estabili-dade estrutural etc.).

No caso específico de conjugação por aminação redutiva, o graude ativação do polissacarídeo é controlado pelo agente de ativação (por e-xemplo, NaIO4), pela temperatura, pelo tempo de reação e pela estrutura dopolissacarídeo. O agente de ativação quebra a cadeia do polissacarídeo deMn C, mas não dos polissacarídeos de Mn A, Mn W 135 e Mn Y. No casoespecífico de conjugação por cianilação, o grau de ativação do polissacarí-deo é controlado pelo agente de ativação, pelo pH, pelo tempo de reação epela densidade de grupo hidroxila do polissacarídeo. Os polissacarídeos deMn A e Mn C possuem uma densidade de hidroxila mais baixa em relaçãoaos polissacarídeos de Mn W135 e Mn Y. Verificou-se que, em geral, a rea-tividade de polissacarídeos ativados de Mn C e Mn A é mais baixa em rela-ção à reatividade de polissacarídeos de Mn W135 e Mn Y.Como descrito anteriormente, também é aqui descrito um novométodo para ativação de uma proteína veículo que inclui a reação de umaproteína com hidrazina, carboidrazida, dicloridrato de hidrazina, uma diidra-zida (por exemplo, succinil diidrazida ou diidrazida de ácido adípico), ou umamistura destes, na presença de: (i) cloridrato de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etil carbodiimida e (ii) pelo menos um aminoácido, pelo menos um peptídeo,ou uma mistura de pelo menos um aminoácido e pelo menos um peptídeo. Onovo método de ativação de proteína pode ser usado para a conjugação apolissacarídeos para vacinas conjugadas monovalentes ou para misturas depolissacarídeos para vacinas conjugadas multivalentes (ou multivalentescomplexas), como descrito abaixo. Aminoácidos úteis incluem aminoácidosde proteínas na forma alfa-L (ou isômero, normalmente denominados L-aminoácidos). Outros aminoácidos incluem na forma alfa-D (D-aminoácidos),na forma beta (beta-aminoácidos), na forma gama, na forma delta e na for-ma épsilon etc. Aminoácidos ilustrativos incluem lisina, arginina, histidina,glicina, serina, treonina, ácido glutâmico, cisteína, e misturas destes. As fai-xas de concentração amplas, preferidas e mais preferidas para os aminoáci-dos presentes na composição de ativação são 1-500 a mM, 20-300 a mM e36-144 a mM, respectivamente.

Embora sem se prender a uma teoria, acredita-se que os amino-ácidos também possam ser incorporados à molécula de proteína como ahidrazina durante a reação de ativação. Os resíduos de aminoácidos incor-porados podem possivelmente perturbar o ambiente de hidratação da prote-ína e também gerar impedimento estérico, levando à prevenção da agrega-ção e precipitação da proteína.

Em um exemplo, esse método inclui a introdução de pelo menosum grupo hidrazida na proteína veículo por reação da proteína com excessode hidrazina, carboidrazida, succinil diidrazida ou ADH, catalisada por umacarbodiimida sob condições controladas, incluindo: 1) o tempo de reação, 2)a concentração de EDC, e 3) a concentração de aminoácido ou mistura deaminoácidos na reação. A proteína ativada por hidrazida transportadora re-sultante pode ser mantida solúvel em pH neutro por um período de tempoprolongado (por exemplo, por pelo menos cerca de um ano).

Métodos convencionais para a síntese e fabricação de vacinasconjugadas de polissacarídeo-proteína tipicamente empregam reações deconjugação com baixa eficiência (tipicamente cerca de 20%). Isso significaque até 80% do polissacarídeo ativado adicionado são perdidos. Além disso,tipicamente é necessário um processo cromatográfico para purificação dosconjugados do PS não-conjugado. Os métodos sintéticos das modalidadespreferidas utilizam a propriedade química característica de grupos hidrazidaem um reagente para reagir com grupos ésteres de aldeído ou cianato nooutro reagente com um rendimento de conjugado aumentado (tipicamentede até cerca de 60%).

Quando a reação de conjugação evolui com maior eficiência deconjugação, a quantidade de proteína e polissacarídeo não-conjugados quepermanece após a reação pode ser suficientemente baixa de modo a tornarsua remoção desnecessária. Conseqüentemente, o processo de purificaçãodo produto conjugado pode ser simplificado, por exemplo, a uma etapa dediafiltração para a remoção de subprodutos de moléculas pequenas. A rea-ção de conjugação baseada em hidrazida pode ser realizada até o términodentro de um a três dias em concentrações de reagente de cerca de 1 a cer-ca de 50, particularmente cerca de 1 a cerca de 40 mg/ml, ou cerca de 1 acerca de 50 mg/ml, em proporções de peso de PS/proteína de cerca de 1:5 acerca de 5:1, de preferência de cerca de 1:2 a cerca de 2: 1 e, principalmen-te, cerca de 1:1, embora em certas modalidades possam ser preferidas pro-porções maiores ou menores. A reação de conjugação é, de preferência, realizada em temperaturas de cerca de 4°C a cerca de 40°C, de preferênciade cerca de 4, 10, 15, ou 20°C a cerca de 25, 30, ou 35°C, e em um pH decerca de 6 a cerca de 8,5, de preferência de cerca de 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, ou6,5 a cerca de 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9,8,0, 8,1, 8,2, 8,3 ou 8,4, com as condições ótimas variando de acordo com opolissacarídeo. Conseqüentemente, a vacina conjugada pode ser fabricadacom custos menores quando é empregada uma reação de conjugação ba-seada em hidrazida.Para superar certas desvantagens dos métodos convencionaispara a síntese de vacinas conjugadas, é fornecido um método para conjuga-ção de PSs às proteínas veículo com o uso de química de hidrazida em rea-ções de conjugação por aminação redutiva e cianilação. Grupos de hidrazidaque possuem a estrutura -NH-NH2 são introduzidos nos grupos carboxila dosresíduos de ácido aspártico e/ou ácido glutâmico de moléculas de proteínapor reação de carbodiimida com hidrazina, ADH, carboidrazida, ou dihidretode succinil. Em uma modalidade, a proteína ativada é mantida solúvel emum pH de cerca de 10 a cerca de 11,5, de preferência de cerca de 10,1,10,2, 10,3 ou 10,4 a cerca de 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, 11,0, 11,1, 11,2, 11,3 ou11,4 e, principalmente, cerca de 10,5, com um tampão a uma concentraçãode cerca de 3 ou menos a cerca de 10 mM ou mais, de preferência de cercade 4 ou 5 mM a cerca de 6, 7, 8, ou 9; mM, antes da conjugação. Tampõesadequados incluem, sem limitação, Na2COs, ácido 3 (cicloexilamino)-l-propanossulfônico (CAPS) e ácido (2-(N-cicloexilamino)etano sulfônico(CHES). Em outra modalidade, a proteína ativada é mantida solúvel em pHneutro ou aproximadamente neutro (por exemplo, pH de cerca de 7 a cercade 7,5) por ativação da proteína na presença de pelo menos um aminoácido,como descrito acima e exemplificado com mais detalhe abaixo.

A proteína ativada é então reagida com polissacarídeo ativadocontendo grupos aldeído (aminação redutiva) ou cianato (conjugação porcianilação) em um pH de cerca de 6 a cerca de 8,5, de preferência de cercade 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 ou 6,5 a cerca de 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7.0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4,7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0 na presença de um tampão a uma concentraçãode cerca de 100 mM ou menos a cerca de 200 mM, de preferência de cercade 110, 120, 130, 140 ou 150 mM a cerca de 160, 170, 180 ou 190 mM.

Tampões adequados incluem, sem limitação, N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(ácido 2-etanossulfônico) (HEPES), solução salina tamponada com fosfato(PBS), ácido 2-morfolinopropanossulfônico (MOPS) e ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanossulfônico (BES).

Alternativamente, o PS pode ser funcionalizado com grupos hi-drazida. O PS ativado pode ser conjugado, em pH 6,5-7,5 com um tampãoforte, a proteínas ativadas contendo grupos aldeído (aminação redutiva). Aproteína é mantida solúvel em um pH de cerca de 10,5 com um tampão fra-co, até o ponto de conjugação. Por causa da maior reatividade de gruposhidrazida (pKa - 2,6) comparados com o grupo épsilon-amino de Iisina (pKa= 10,5) em condições neutras/levemente ácidas, e da solubilidade do conju-gado aumentada com o uso de proteína ativada mantida solúvel em um pHem torno de 10,5 antes da conjugação, o rendimento da reação de conjuga-ção é grandemente aumentado.

Os conjugados preparados por esses métodos são imunogêni-cos em animais experimentais, como demonstrado em experimentos emcamundongos. Além disso, a reação de conjugação pode ser realizada efici-entemente sem cianoboroidreto de sódio, evitando, dessa forma, a introdu-ção de íon cianeto no produto conjugado. A reação pode ser realizada sobcondições de pH levemente ácido ou neutro a 4°C por 1-3 dias ou em tem-peratura ambiente de um dia para o outro, e não em dias como nos métodosconvencionais de conjugação por aminação redutiva. Isso novamente asse-gura a produção de vacina conjugada com alto rendimento para polissacarí-deos instáveis como, por exemplo, aqueles de Haemophilus influenzae tipob, Streptococcus pneumonia tipo 19F e Neisseria meningitidis grupo A. Osmétodos de modalidades preferidas podem ser empregados para a produ-ção de vacinas conjugadas multivalentes complexas menos dispendiosas,promovendo grandemente, dessa forma, a saúde pública.

O polissacarídeo

O termo "polissacarídeo", como aqui usado, é um termo amplo eé usado em seu significado comum, incluindo, sem limitação, sacarídeos quecompreendem diversas unidades de repetição, incluindo, sem limitação, po-lissacarídeos que possuem 50 ou mais unidades de repetição, e oligossaca-rídeos que possuem 50 ou menos unidades de repetição. Tipicamente, ospolissacarídeos possuem de cerca de 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou95 unidades de repetição a cerca de 2.000 ou mais unidades de repetição e,de preferência, de cerca de 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600,700, 800, 900 ou 1.000 unidades de repetição até cerca de 1.100, 1.200,1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800 ou 1.900 unidades de repetição.Oligossacarídeos tipicamente possuem de cerca de 6, 7, 8, 9 ou 10 unidadesde repetição a cerca de 15, 20, 25, 30 ou 35 a cerca de 40 ou 45 unidadesde repetição.

Polissacarídeos adequados para uso nas modalidades preferi-das incluem polissacarídeos e oligossacarídeos de bactérias encapsuladas.Os polissacarídeos e oligossacarídeos podem ser de qualquer fonte, por e-xemplo, eles podem ser derivados de bactérias de ocorrência natural, bacté-rias desenvolvidas por engenharia genética, ou podem ser produzidos sinte-ticamente. Os polissacarídeos e oligossacarídeos podem ser submetidos auma ou mais etapas de processamento, antes da ativação, por exemplo,purificação, funcionalização, despolimerização com o uso de condições oxi-dativas leves, desacetilação, e similares. Também podem ser empregadasetapas pós-processamento, se desejado. Qualquer método adequado co- nhecido na técnica para síntese, preparação e/ou purificação de polissacarí-deos e oligossacarídeos adequados pode ser empregado.

Polissacarídeos e oligossacarídeos para uso em modalidadespreferidas incluem polissacarídeos pneumocócicos, por exemplo, dos soro-grupos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F; polissacarídeos meningocócicos dos soroti-pos A, B, C, W135 e Y, fosfato de polirribossilribitol de polissacarídeo de Ha-emophilus influenzae do tipo b, polissacarídeos estreptocócicos do grupo Bdos sorotipos Ill e V, e polissacarídeo Vi de Salmonella typhi. Outros polis-sacarídeos de sorotipos pneumocócicos e estreptocócicos do grupo B e so- rogrupos meningocócicos também são adequados para uso na invenção,bem como outros antígenos de polissacarídeo e oligossacarídeo T-independentes, por exemplo, polissacarídeos ou oligossacarídeos derivadosde estreptococos do grupo A, estafilococos, enterococos, Klebsiella pneu-moniae, E. coli, Pseudomonas aeruginosa e Bacillus anthracis. Embora po- lissacarídeos e oligossacarídeos bacterianos sejam particularmente preferi-dos, lipopolissacarídeos e lipooligossacarídeos bacterianos gram-negativose seus derivados de polissacarídeo e oligossacarídeo e polissacarídeos eoligossacarídeos virais também podem ser empregados.

Polissacarídeos com fósforo da cadeia lateral e/ou fósforo naestrutura central são adequados para uso em modalidades preferidas. Asreações de conjugação de modalidades preferidas são particularmente ade-quadas ao uso com polissacarídeos que possuem fósforo na estrutura cen-tral. Esses polissacarídeos são sensíveis à fragmentação e à degradação e,portanto, a condição de reação em temperatura baixa (4°C) e a rapidez dareação de conjugação resultam em um conjugado de maior qualidade emfunção da redução da degradação do polissacarídeo.

Após o término de quaisquer etapas de pré-processamento, opolissacarídeo ou oligossacarídeo é submetido a uma etapa de "ativação". Otermo "ativação" refere-se a um tratamento químico do polissacarídeo para ofornecimento de grupos químicos capazes de reagir com a proteína. Em umamodalidade particularmente preferida, a ativação envolve a funcionalizaçãodo polissacarídeo ou do oligossacarídeo com grupos aldeído, grupos cetonaou grupos cianato que são reagidos com grupos hidrazida em uma proteínafuncionalizada. Alternativamente, o polissacarídeo ou oligossacarídeo podeser funcionalizado com grupos hidrazida que são reagidos com grupos alde-ído ou grupos cetona em uma proteína funcionalizada.

De acordo com uma modalidade, uma mistura de mais de umpolissacarídeo pode ser ativada simultaneamente por reação com um únicoagente de ativação (ou uma mistura de agentes de ativação) em etapa debatelada única. Por exemplo, uma mistura de polissacarídeos de Mn A, MnC, Mn W135 e Mn Y pode ser reagida com um agente de funcionalização dealdeído em uma reação de batelada única. De acordo com outra modalida-de, cada polissacarídeo individual pode ser ativado por reação com um a-gente de ativação em um processo separado. Os polissacarídeos ativadosseparadamente podem então ser misturados em conjunto, antes da etapa deconjugação, de forma que os polissacarídeos ativados possam ser simulta-neamente conjugados em um processo único.

Qualquer reação de funcionalização adequada pode ser empre-gada para ativar o polissacarídeo ou oligossacarídeo com grupos cianato.De preferência, o polissacarídeo ou oligossacarídeo é reagido com tetrafluo-roborato de 1-ciano-4-dimetilamoniopiridínio na presença de trietilamina.

Qualquer reação de funcionalização adequada pode ser empre-gada para ativar o polissacarídeo ou oligossacarídeo com grupos aldeído.

Certos polissacarídeos e oligossacarídeos possuem grupos aldeído termi-nais que podem participar da reação de conjugação. Caso o polissacarídeoou oligossacarídeo seja ativado com grupos aldeído, uma reação preferidaenvolverá a reação com um agente oxidante, por exemplo, NaIO4. Agentesoxidantes possuem o potencial para fragmentar o polissacarídeo ou oligos-sacarídeo. A fragmentação indesejada pode ser evitada ou controlada pormeio da seleção do agente oxidante em particular e da concentração do a-gente oxidante empregada. Grupos cetona também são capazes de reagircom hidrazida e, portanto, a ativação do polissacarídeo ou do oligossacarí-deo com grupos cetona pode ser empregada em certas modalidades.

Qualquer reação de funcionalização adequada pode ser empre-gada para ativar o polissacarídeo ou oligossacarídeo com grupos hidrazida.Uma reação de funcionalização preferida é a aminação redutiva, em que opolissacarídeo ou oligossacarídeo é reagido com NaIO4 em uma reação deativação com periodato para a geração de grupos aldeído, que são entãoreagidos com hidrazina e diidrazida de ácido adípico, seguido por reduçãosubseqüente com NaBH4. Alternativamente, pode ser empregada uma rea-ção de conjugação por cianilação, em que o polissacarídeo ou o oligossaca-rídeo é reagido com brometo de cianogênio ou tetrafluoroborato de 1 -ciano-4- dimetilamoniopiridínio para introduzir um grupo cianato, que é subseqüen-temente reagido com hidrazina e diidrazida de ácido adípico. Também podeser empregada uma reação de carbodiimida, em que o polissacarídeo ou ooligossacarídeo é reagido com diidrazida de ácido adípico na presença decloridrato de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etil carbodiimida.

Uma solução fortemente tamponada (em pH de cerca de 6,5 acerca de 8, a uma concentração elevada de tampão de cerca de 100 mM acerca de 200 mM) de polissacarídeo ativado é, de preferência, empregadana reação de conjugação na forma de uma solução fortemente tamponada.Qualquer tampão adequado pode ser empregado, de preferência um tampãocomo, por exemplo, N-(2-Hidroxietil) piperazina-N'-(ácido 2-etanossulfônico)ou solução salina tamponada com fosfato.

A proteína

O polissacarídeo ou oligossacarídeo ativado é acoplado a umaproteína para gerar uma vacina conjugada. Proteínas adequadas incluemtoxinas bacterianas que são veículos imunologicamente eficazes que foramtornados seguros por meios químicos ou genéticos para administração a umindivíduo. Exemplos incluem toxinas bacterianas inativadas, por exemplo,toxóide diftérico, CRM197, toxóide tetânico, toxóide de pertussis, LT de E.coli, ST de E. coli e exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. Proteínas damembrana externa bacteriana como, por exemplo, complexo c da membranaexterna (OMPC), porinas, proteínas de ligação de transferrina, pneumòlise,proteína pneumocócica de superfície A (PspA), proteína pneumocócica ade-sina (PsaA) ou proteínas pneumocócicas de superfície BVH-3 e BVH-11também podem ser usadas. Outras proteínas, por exemplo, antígeno prote-tor (PA) de Bacillus anthracis e fator de edema detoxificado (EF) e fator letal(LF) de Bacillus anthracis, ovalbumina, hemocianina keyhole Iimpet (KLH),albumina sérica humana, albumina sérica bovina (BSA) e derivado de prote-ína purificada de tuberculina (PPD) também podem ser usados. As proteínassão preferivelmente proteínas atóxicas e não-reatogênicas e passíveis deobtenção em quantidade e pureza suficientes que sejam factíveis pelos mé-todos de conjugação de modalidades preferidas. Por exemplo, a toxina difté-rica pode ser purificada de culturas de Corynebacterium diphtheriae e quimi-camente detoxificada com o uso de formaldeído para gerar uma proteínaadequada.

Fragmentos das toxinas ou toxóides nativos, que contêm pelomenos um epitopo de célula T, também são úteis, bem como complexos pro-téicos da membrana externa, além de certos análogos, fragmentos e/oufragmentos de análogos das várias proteínas listadas acima. As proteínaspodem ser obtidas de fontes naturais, podem ser produzidas por tecnologiarecombinante, ou por métodos sintéticos como são conhecidos na técnica.Análogos podem ser obtidos por vários meios, por exemplo, certos aminoá-cidos podem ser substitutos para outros aminoácidos em uma proteína, semperda apreciável de capacidade de ligação interativa com estruturas como,por exemplo, regiões de ligação de antígeno de anticorpos ou sítios de Iiga-ção em moléculas de substrato. Outras proteínas também podem ser em-pregadas, tais como aquelas que contêm grupos ácido glutâmico ou ácidoaspártico expostos na superfície.

Qualquer reação de funcionalização adequada pode ser empre-gada para ativar a proteína com grupos hidrazida. Métodos convencionaispara a preparação de proteínas modificadas por hidrazida incluem catálisepor EDC e um processo em duas etapas com a utilização de iodoacetato deN-succinimidila e tiol hidrazida por meio de grupos ε-amino de Iisina da pro-teína. Vide King et ai, Biochemistry 1986; 25: 5.774-5.779. Proteínas modifi-cadas preparadas por catálise por EDC tipicamente precisam ser fraciona-das a fim de que se tornem adequadas para o uso em conjugação, e o pro-cesso em duas etapas é trabalhoso. Conseqüentemente, geralmente não seprefere empregar esses métodos para a preparação da proteína modificadapor hidrazida. No entanto, em certas modalidades, tais métodos podem seraceitáveis ou até mesmo desejáveis.

De preferência, grupos hidrazida são introduzidos em proteínaspor meio dos grupos carboxila de resíduos de ácido aspártico e ácido glutâ-mico na proteína com o uso de uma reação de carbodiimida, por exemplo,por reação com hidrazina, carboidrazida, succinil diidrazida, diidrazida deácido adípico, cloreto de hidrazina (por exemplo, dicloridrato de hidrazina) ouquaisquer outras diidrazidas na presença de EDC. EDC é empregada comocatalisador para ativar e modificar o reagente de proteína com hidrazina ou adiidrazida. Qualquer carbodiimida hidrossolúvel, incluindo EDC, pode serusada como catalisador. As proteínas catalisadas por EDC geralmente pos-suem uma tendência para polimerizar e precipitar. Vide Schneerson et ai,Infect. Immun. 1986, 52: 519-528; Shafer et ai, Vaccine 2000; 18(13): 1.273-1.281; e Inman et ai., Biochemistry 1969; 8: 4.074-4.082. A agregação e pre-cipitação da proteína ativada depende, em parte, de seu pH ambiente. Con-seqüentemente, a tendência para polimerizar e precipitar pode ser controla-da mantendo-se essas proteínas modificadas por hidrazida solúveis em umasolução tamponada. Trocando-se o tampão da mistura de reação com a fina-lidade de manter a proteína ativada em um pH de cerca de 10,5, a proteínaativada permanece solúvel e estável para conjugação. Qualquer tampão a-dequado pode ser empregado. De preferência, é empregado um tampãofraco como, por exemplo, Na2C03, a uma concentração baixa de cerca de 3mM a cerca de 10 mM.

A proteína modificada por hidrazida tamponada pode então serempregada na preparação de conjugados de proteína-polissacarídeo, semprecipitação quando adicionados ao polissacarídeo ativado em um pH decerca de 6 a 8,5, de preferência de cerca de 6,5 a cerca de 8. Qualquer rea-ção de funcionalização adequada pode ser empregada para ativar a proteínacom grupos aldeído. De preferência, a proteína é reagida com 1-amino-2,3-propanodiol na presença de EDC, seguida por oxidação com NaIO,*. Açúca-res amino como, por exemplo, glicosamina, galactosamina, e similares, po-dem ser usados no lugar de 1-amino-2,3-propanodiol. Nessa reação, EDCtambém é empregada como catalisador para ativar e modificar o reagente deproteína com o aminodiol por meio dos grupos carboxila de resíduos de áci- do aspártico e ácido glutâmico da proteína.

A proteína também pode ser ativada na presença de um amino-ácido ou de misturas de aminoácidos, como descrito acima, e mantida solú-vel em pH neutro de cerca de 7 a cerca de 7,5.Preparação de Conjugados por aminacão redutiva

Conjugados podem ser preparados por meio da reação de gru-pos aldeído e hidrazida (aminação redutiva). A reação de conjugação de a -minação redutiva pode ser empregada para conjugar um reagente modifica-do por hidrazida (proteína ou polissacarídeo) ao outro componente que con-tém grupos aldeído.

Na aminação redutiva convencional, a reação entre aldeído eamino grupos é reversível e desfavorável, de tal forma que o cianoboroidretode sódio é necessário para facilitar a conjugação por conversão da ligaçãodupla C=N em uma ligação simples C-N para tornar todo o evento de amina-ção redutiva irreversível. Em contraste, a reação de conjugação de amina-ção redutiva de modalidades preferidas evolui sem o auxílio de cianoboroi-dreto de sódio, por causa da alta eficiência da reação de hidrazida-aldeído.

Ao final da reação de conjugação de aminação redutiva, o boroidreto de só-dio ou outro redutor adequado é empregado para reduzir a ligação duplaC=N em uma ligação simples C-N1 bem como para reduzir quaisquer gruposaldeído residuais em grupos álcool. A reação de conjugação de aminaçãoredutiva de modalidades preferidas evita a contaminação do conjugado re-sultante com cianeto, um subproduto do cianoboroidreto de sódio.

Para reduzir a precipitação da proteína ativada durante a reaçãode conjugação, a proteína ativada está, de preferência, na forma de umasolução fracamente tamponada a uma baixa concentração de tampão decerca de 3 mM a cerca de 10 mM, que é adicionada a uma solução de polis-sacarídeo ativado fortemente tamponada (em um pH de cerca de 6,5 a cercade 7,5, com uma alta concentração de tampão de cerca de 100 mM a cercade 200 mM). De preferência, o pH da solução de proteína ativada é tampo-nado até um pH de cerca de 10 pH a cerca de 11,5, principalmente até umpH de cerca de 10,5. A solução de polissacarídeo ativado é, de preferência,fortemente tamponada até um pH de cerca de 6 pH a cerca de 8, principal-mente, até um pH de cerca de 6,5 pH a cerca de 7,5. A reação de aminaçãoredutiva de hidrazida-aldeído evolui em uma taxa rápida, e o efeito precipi-tante de um pH abaixo de 10,5 (por exemplo, um pH tão baixo quanto cercade 8,5 a cerca de 9,5) na proteína ativada é superado pelas propriedadesmoleculares do reagente de polissacarídeo ativado.

Preparação de conjugados por conjugação por cianilação

Os conjugados podem ser preparados por meio da reação dehidrazida e grupos cianato (conjugação por cianilação). A reação de conju-gação por cianilação é eficiente e reversível, favorecendo a formação doproduto. Em certas modalidades, são empregados agentes de bloqueio paraa remoção de grupos cianato residuais. No entanto, a adição de um agentede bloqueio à mistura de reação retrocede a reação de conjugação e reduz o36rendimento da conjugação em 5-12%. O efeito de vários agentes de blo-queio sobre o rendimento foi investigado. O polissacarídeo pneumocócicoPS Pn 18C foi ativado com CDAP e depois conjugado ao toxóide tetânicoativado por hidrazida (TTH) de um dia para o outro. Foram adicionadas cinco alíquotas com água ou um agente de bloqueio a 0,2 M. Após incubação de 4horas, as amostras foram analisadas por HPSEC com o uso de uma colunaWaters Ultrahidrogel 2000 com um monitor de 280 nm. O rendimento daconjugação de cada amostra, fornecido na Tabela C, foi determinado com o% da área do pico de conjugado em 15,5 minutos em relação à proteína to-tal, ou seja, o pico de conjugado mais o pico de TTH livre (em 22 minutos).Embora em certas modalidades possa ser desejável empregar agentes debloqueio para extinguir os grupos cianato residuais restantes, prefere-se ge-ralmente evitar seu uso a fim de evitar a redução no rendimento de conjugado.

Tabela C

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Para a remoção de grupos cianato residuais no produto de con-jugação sem utilizar um agente de bloqueio, o tempo de conjugação podeser prolongado. De preferência, a conjugação é realizada em uma tempera-tura de cerca de 0°C a cerca de 5°C por cerca de 36 a cerca de 48 horas,principalmente a cerca de 4°C por cerca de 36 horas, seguida por um adi-cional de cerca de 18 a 24 horas em uma temperatura de cerca de 20°C acerca de 25°C, principalmente a cerca de 18 horas a cerca de 20 a 24°C, deforma que os grupos cianato residuais reajam com água e se decompo-nham. Tempos de conjugação mais longos ou mais curtos e/ou temperaturas de conjugação maiores ou menores podem ser empregados, e seqüênciasdiferentes de etapas em vários tempos e temperaturas podem ser efetuadas,como desejado. É desejável, no entanto, efetuar a reação de conjugação,pelo menos inicialmente, em temperaturas baixas, de preferência de cercade O0C a cerca de 5°C, mais preferivelmente a cerca de 4°C, de modo a re-duzir o grau de precipitação do conjugado.

Com altos rendimentos da conjugação e alta imunogenicidadedo produto de conjugação, os processos de purificação como, por exemplo,cromatografia em coluna e/ou precipitação com sulfato de amônio, do conju-gado de polissacarídeo não-conjugado podem não ser necessários. No en-tanto, em certas modalidades, pode ser desejável realizar uma ou mais eta-pas de purificação.

Os conjugados

Ambos os reagentes contêm múltiplos grupos reativos por molé-cula. Uma molécula de polissacarídeo ativado pode reagir com e formarmais de uma ligação com mais de uma molécula de proteína ativada. Damesma forma, uma molécula de proteína ativada pode reagir com e formarmais de uma ligação com mais de uma molécula de polissacarídeo ativado.

Portanto, o produto conjugado é uma mistura de várias estrutu-ras em treliça entrecruzadas do tipo matriz. Por exemplo, uma ligação sim-ples pode estar presente, ou 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais ligações podemestar presentes. O número médio de ligações entre um polissacarídeo e umaproteína pode ser ajustado, como preferido. O número médio preferido deligações pode depender do tipo de polissacarídeo, do tipo de proteína, dométodo de conjugação, das condições de reação, e similares. Geralmente,uma média de 1 ligação a cerca de 2, 3, 4 ou 5 ligações está presente, demodo a evitar interferência com a habilidade da proteína para estimular osistema imunológico por superconjugação, e de forma a não causar mudan-ças na estrutura do polissacarídeo. No entanto, em certas modalidades,mais de 5 ligações podem ser toleradas ou até mesmo desejáveis.

Como descrito anteriormente, conjugados multivalentes comple-xos são produzidos pelos métodos aqui descritos. O número de polissacarí-deos imunogênicos distintos incluídos em um conjugado multivalente com-plexo não é limitado, e pode variar de 2 a 28, de preferência 5 a 25 e, princi-palmente, 15, em certas modalidades. O número de proteínas veículo dife-rentes incluídas em um conjugado multivalente complexo também não é limi-tado, e pode variar de 1 a 10, de preferência 4 a 6 e, principalmente, 5, emcertas modalidades. Por exemplo, uma molécula de proteína veículo podeser conjugada a 2, 3, 4, 5, 6 etc. polissacarídeos imunogênicos distintos. Umconjugado da construção pode incluir uma estrutura em treliça que inclui du-as ou mais moléculas de proteína diferentes conjugadas entre si e 2, 3, 4, 5,6 etc. polissacarídeos imunogênicos distintos.

Após conjugação, o conjugado pode ser purificado por qualquermétodo adequado. A purificação é empregada para a remoção de polissaca-rídeo não-reagido, proteína, ou subprodutos de pequena molécula da rea-ção. Os métodos de purificação incluem ultrafiltração, cromatografia por ex-clusão de tamanho, centrifugação por gradiente de densidade, cromatografiapor interação hidrofóbica, fracionamento com sulfato de amônio, e similares,como são conhecidos na técnica. Como discutido acima, as reações de con-jugação de modalidades preferidas evoluem com rendimento maior, e gerammenos subprodutos de reação de pequena molécula indesejáveis. Conse-qüentemente, pode não ser necessária purificação, ou apenas um pequenograu de purificação como, por exemplo, diafiltração, pode ser desejável. Oconjugado pode ser concentrado ou diluído, ou processado em qualquerforma adequada para uso em composições farmacêuticas, como desejado.

Métodos de tratamento

Conjugados preparados de acordo com a modalidade preferidasão administrados a um indivíduo em uma dose imunologicamente eficaz emuma forma adequada para evitar e/ou tratar doenças infecciosas. O termo"indivíduo", como aqui usado, refere-se aos animais como, por exemplo,mamíferos. Por exemplo, mamíferos contemplados incluem seres humanos,primatas, cachorros, gatos, carneiros, gado, cabras, porcos, cavalos, ca-mundongos, ratos, coelhos, porquinhos-da-índia, e similares. Os termos "in-divíduo", "paciente" e "hospedeiro" são usados de forma intercambiável.

Como aqui usado, uma dose "imunologicamente eficaz" da vacina conjugadaé uma dose que é adequada para despertar uma resposta imunológica. Adosagem específica depende da idade, do peso e da condição médica doindivíduo a ser tratado, bem como do método de administração. Doses ade-quadas podem ser facilmente determinadas por aqueles versados na técni-ca.

Composições farmacêuticas que compreendem vacinas conju-gadas de modalidades preferidas podem oferecer várias vantagens em rela-ção às vacinas convencionais, incluindo imunogenicidade aumentada deantígenos fracamente imunogênicos, redução potencial na quantidade deantígeno usada, imunizações de reforço menos freqüentes, eficácia aumen-tada, estimulação preferencial de imunidade ou direcionamento potencial derespostas imunológicas. As vacinas podem ser administradas a um indivíduopor várias vias, como discutido abaixo, incluindo, sem limitação, a via deadministração parenteral (por exemplo, por técnicas de injeção e infusãointra-cisterna), intradérmica, transmembranosa, transdérmica (incluindo tópi-ca), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, intra-arterial, intra-lesional,subcutânea, oral e intranasal (por exemplo, inalação). Vacinas conjugadaspodem ser administradas por injeção em bolo ou por infusão contínua, bemcomo por administração localizada, por exemplo, em um local de doença ou de lesão. A vacina conjugada pode ser opcionalmente administrada em umveículo farmacêutica ou fisiologicamente aceitável.

O termo "vacina", como aqui usado, é um termo amplo e é usa-do em seu significado comum, incluindo, sem limitação, conjugados de mo-dalidades preferidas ou de outros antígenos formulados com adjuvantes,diluentes, excipientes, veículos, e outras substâncias farmaceuticamenteaceitáveis. O termo "farmaceuticamente aceitável" é usado para se referir aum material atóxico compatível com um sistema biológico como, por exem-plo, uma célula, cultura de células, tecido ou organismo.

Protocolos de imunização para uso com os conjugados de mo-dalidades preferidas fornecem composições e métodos para a prevenção outratamento de uma doença, um distúrbio e/ou uma infecção em um indiví-duo. O termo "tratamento", como aqui usado, é um termo amplo e é usadoem seu significado comum, incluindo, sem limitação, tratamento curativo,preventivo, profilático, paliativo e/ou atenuante.

As composições de vacina são preferivelmente estéreis e con-têm uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz do conjugado emuma unidade de peso ou volume adequada à administração a um indivíduo.

O termo "veículo farmaceuticamente aceitável", como aqui usado, significaum ou mais enchimentos compatíveis sólidos ou líquidos, diluentes ou subs-tâncias de encapsulação que são adequadas à administração em um indiví-duo. O termo "veículo" denota um ingrediente orgânico ou inorgânico, naturalou sintético, com o qual o ingrediente ativo é combinado para facilitar a apli-cação. As características do veículo dependem da via de administração. Ve-ículos fisiológica e farmaceuticamente aceitáveis incluem diluentes, enchi-mentos, sais, tampões, estabilizantes, solubilizantes e outros materiais quesão bem-conhecidos na técnica.

Os componentes das composições farmacêuticas também sãocapazes de ser co-misturados com os conjugados da modalidade preferida,e uns com os outros, de tal forma que não haja interação que substancial-mente prejudique a eficácia farmacêutica desejada.

A formulação das vacinas conjugadas de modalidades preferidasem composições farmacêuticas pode ser obtida com a utilização de métodosconhecidos na técnica. As composições de vacina também podem conter umou mais adjuvantes. Adjuvantes adequados incluem, por exemplo, adjuvan-tes de alumínio, por exemplo, hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio,adjuvante de Freund, BAY, DC-chol, pcpp, monofosforil lipídeo A, CpG, QS-21, toxina colérica e formil metionil peptídeo. Vide, por exemplo, "VaccineDesign, the Subunit and Adjuvant Approach", 1995 (M. F. Powell e M. J.Newman, eds., Plenum Press, N.Y.).

A dosagem de vacina conjugada a ser administrada a um indiví-duo e o regime de administração podem ser determinados de acordo comtécnicas padronizadas bem-conhecidas por aqueles versados nas técnicasfarmacêuticas e veterinárias, levando-se em conta fatores tais como o usopretendido, o antígeno em particular, o adjuvante (se presente), a idade, osexo, o peso, a espécie, a condição geral, doenças e/ou tratamentos anterio-res e a via de administração. Doses preliminares podem ser determinadasde acordo com testes em animais, e o escalonamento de dosagens paraadministração em seres humanos é feito de acordo com práticas aceitáveisna técnica como, por exemplo, experimentos padronizados de dosagem. Porexemplo, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente apartir de testes do nível de anticorpos séricos. A dosagem depende da ativi-dade específica do conjugado, e pode ser determinada facilmente por expe-rimentação de rotina.

Na prática de protocolos de imunização para tratamento e/ouprevenção de doenças especificadas, uma quantidade terapeuticamente efi-caz de conjugado é administrada a um indivíduo. O termo "quantidade efi-caz" significa a quantidade total de agente terapêutico (por exemplo, conju-gado) ou de outro componente ativo que é suficiente para exibir um benefí-cio significativo ao indivíduo como, por exemplo, resposta imunológica au-mentada, tratamento, cicatrização, prevenção ou melhora da condição médi-ca relevante (doença, infecção, ou similares), ou um aumento da taxa detratamento, cicatrização, prevenção ou melhora dessas condições. Quandouma "quantidade eficaz" é aplicada a um agente terapêutico individual admi-nistrado isoladamente, o termo refere-se somente àquele agente terapêutico.Quando aplicado a uma combinação, o termo refere-se às quantidadescombinadas dos ingredientes que resultam no efeito terapêutico, sejam elesadministrados em combinação, em série ou simultaneamente. Como aquiusado, a frase "administração de quantidade eficaz" de um agente terapêuti-co significa que o indivíduo é tratado com o(s) referido(s) agente(s) terapêu-tico^) em uma quantidade e por um período suficiente para induzir uma me-lhora e, de preferência, uma melhora sustentada, em pelo menos um indica-dor que reflita a gravidade da doença, infecção ou distúrbio.

Uma melhora é considerada "sustentada" caso o paciente exibaa melhora em pelo menos duas ocasiões separadas por um período de tem-po. O grau de melhora pode ser determinado com base, por exemplo, emdados imunológicos ou em sinais ou sintomas de uma doença, infecção oudistúrbio. Vários indicadores que refletem a extensão da doença do pacientepodem ser avaliados para se determinar se a quantidade e o período do tra-tamento são suficientes. O valor de base para o indicador ou indicadoresescolhidos pode ser estabelecido por exame do paciente antes da adminis-tração da primeira dose do agente terapêutico, ou com base em valores es-tatísticos gerados a partir de uma população de pacientes saudáveis. Caso oagente terapêutico seja administrado para o tratamento de sintomas agudos,a primeira dose será administrada logo que for praticamente possível. A me-lhora é induzida por administração de agentes terapêuticos até que o indiví-duo manifeste uma melhora em relação aos valores de base para o indica-dor ou indicadores escolhidos. No tratamento de condições crônicas, essegrau de melhora é obtido administrando-se repetidamente os agentes tera-pêuticos ao longo de um período de tempo, por exemplo, por um, dois outrês meses ou mais, ou indefinidamente. Uma única dose pode ser suficientepara tratar ou evitar certas condições. O tratamento pode ser continuadoindefinidamente no mesmo nível ou em uma dose ou freqüência reduzida,independentemente da condição do paciente, se desejado. Após o tratamen-to ter sido reduzido ou interrompido, ele pode mais tarde ser reiniciado nonível original, caso os sintomas reapareçam.

Geralmente, a quantidade de conjugado que fornece uma doseeficaz ou uma dose terapeuticamente eficaz para vacinação contra infecçãobacteriana é de cerca de I pg ou menos a cerca de 100 pg ou mais, de prefe-rência de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1 0, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50pg a cerca de 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou 95 pg por kg de peso corpo-ral. Uma dosagem eficaz pode necessitar de menos anticorpos caso o tempopós-infecção decorrido seja menor, na medida em que há menos tempo paraque as bactérias proliferem. Uma dosagem eficaz também pode dependerda carga bacteriana no momento do diagnóstico. Múltiplas injeções adminis-tradas ao longo de um período de dias podem ser consideradas para usoterapêutico.

As vacinas conjugadas podem ser administradas como uma do-se única ou em uma série que inclui um ou mais reforços. Por exemplo, umacriança pequena ou uma criança pode receber uma dose única precocemen-te em sua vida, e depois pode receber uma dose de reforço até 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10 ou mais anos mais tarde. A dose de reforço gera anticorpos decélulas B sensibilizadas, ou seja, uma resposta anamnéstica. Ou seja, a va-cina conjugada desperta uma resposta funcional primária de anticorpo ele-vada em crianças pequenas ou crianças, e é capaz de despertar uma res-posta anamnéstica após uma administração de reforço, demonstrando que aresposta imunológica protetora despertada pela vacina conjugada é de longaduração.

As vacinas conjugadas podem ser formuladas em preparaçõeslíquidas para, por exemplo, administração oral, nasal, anal, retal, bucal, va-ginal, peroral, intragástrica, mucosa, perlingual, alveolar, gengival, na muco-sa olfatória ou respiratória. Formas adequadas para essa administração in-cluem suspensões, xaropes e elixires. As vacinas conjugadas também po-dem ser formuladas para administração injetável parenteral, subcutânea,intradérmica, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa, liberação susten-tada por implantes, ou administração por colírios. Formas adequadas paraessa administração incluem suspensões e emulsões estéreis. Essas vacinasconjugadas podem estar misturadas com um veículo, diluente ou excipienteadequado como, por exemplo, água estéril, soro fisiológico, glicose, e simila-res. As vacinas conjugadas também podem ser liofilizadas. As vacinas con-jugadas podem conter substâncias auxiliares como, por exemplo, agentesumidificantes ou emulsificantes, agentes de tamponamento do pH, aditivosde gelificação ou de aumento da viscosidade, conservantes, agentes flavori-zantes, agentes corantes, e similares, dependendo da via de administraçãoe da preparação desejadas. Textos-padrão, por exemplo, "Remington: TheScience and Practice of Pharmacy", Lippincott Williams & Wilkins; 20â edição(1S de junho de 2003) e "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Pub.Co.; 185 e 19- edições (dezembro de 1985 e junho de 1990, respectivamen-te), aqui incorporados por referência em sua totalidade, podem ser consulta-dos para a preparação de preparações adequadas, sem experimentaçãodesnecessária. Tais preparações podem incluir agentes de formação decomplexos, íons metálicos, compostos poliméricos como, por exemplo, ácidopoliacético, ácido poliglicólico, hidrogéis, dextrana, e similares, lipossomos,microemulsões, micelas, vesículas unilamelares ou multilamelares, fantas-mas de eritrócitos ou esferoblastos. Lipídeos adequados para formulaçãolipossômica incluem, sem limitação, monoglicerídeos, diglicerídeos, sulfati-das, lisolecitina, fosfolipídeos, saponina, ácidos biliares, e similares. A pre-sença desses componentes adicionais pode influenciar o estado físico, asolubilidade, estabilidade, a taxa de liberação in vivo e a taxa de depuraçãoin vivo, e eles são, dessa forma, escolhidos de acordo com a aplicação de-sejada, de tal forma que as características do veículo sejam ajustadas à viade administração selecionada.

As vacinas conjugadas são fornecidas preferivelmente comosuspensões líquidas ou como produtos liofilizados. Preparações líquidas a-dequadas incluem, por exemplo, soluções aquosas isotônicas, suspensões,emulsões ou composições viscosas que são tamponadas até um pH sele-cionado. Preparações transdérmicas incluem loções, géis, sprays, pomadasou outras técnicas adequadas. Caso a administração nasal ou respiratória(mucosa) seja desejada (por exemplo, inalação ou insuflação em aerossol),as composições podem estar em uma forma e dispensadas por um dispen-sador de spray por compressão, um dispensador de bomba ou um dispen-sador de aerossol. Aerossóis estão normalmente sob pressão por meio deum hidrocarboneto. Dispensadores de bomba podem preferivelmente dis-pensar uma dose metrificada ou uma dose que possui um tamanho de partí-cula em particular, como discutido abaixo.

Quando na forma de soluções, suspensões e géis, as formula-ções do conjugado podem tipicamente conter uma quantidade importante deágua (preferivelmente água purificada), além do ingrediente ativo. Quantida-des menores de outros ingredientes como, por exemplo, agentes de ajustedo pH, emulsificantes, agentes de dispersão, agentes de tamponamento,conservantes, agentes umidificante, agentes de gelificação, agentes coran-tes, e similares, também podem estar presentes.

As composições são preferivelmente isotônicas em relação aosangue ou a outro líquido do corpo do receptor. A isotonicidade das compo-sições pode ser obtida com o uso de tartarato de sódio, propileno glicol ououtros solutos inorgânicos ou orgânicos. O cloreto de sódio é particularmen-te preferido. Agentes de tamponamento podem ser empregados, por exem- pio, ácido acético e seus sais, ácido cítrico e seus sais, ácido bórico e seussais, e ácido fosfórico e seus sais. Veículos parenterais incluem solução decloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer-lactato ou óleos fixos. Veículos intravenosos incluem reabastecedores delíquidos e nutrientes, reabastecedores de eletrólitos (como, por exemplo,aqueles que se baseiam em dextrose de Ringer), e similares.

A viscosidade das composições pode ser mantida no nível sele-cionado com o uso de um agente espessante farmaceuticamente aceitável.Prefere-se metilcelulose pelo fato de ser fácil e economicamente disponívele de ser um material fácil de ser trabalhado. Outros agentes espessantesadequados incluem, por exemplo, goma xantana, carboximetil celulose, hi-droxipropil celulose, carbômero, e similares. A concentração preferida doespessante pode depender do agente selecionado. O ponto importante é ouso de uma quantidade que possa obter a viscosidade selecionada. Compo-sições viscosas são normalmente preparadas a partir de soluções pela adi-ção desses agentes espessantes.

Um conservante farmaceuticamente aceitável pode ser empre-gado para aumentar o prazo de validade das composições. Álcool benzílicopode ser adequado, embora vários conservantes, incluindo, por exemplo,parabenos, timerosal, clorobutanol ou cloreto benzalcônio, também possamser empregados. Uma concentração adequada do conservante pode ser de0,02% a 2%, com base no peso total, embora possa haver uma variaçãoapreciável, dependendo do agente selecionado.

A liberação pulmonar do conjugado também pode ser emprega-da. O conjugado é liberado aos pulmões de um mamífero durante a inalaçãoe atravessa o revestimento epitelial do pulmão até alcançar a corrente san-güínea. Uma ampla faixa de dispositivos mecânicos projetados para a libe-ração pulmonar de produtos terapêuticos pode ser empregada, incluindo,sem limitação, nebulizadores, inaladores de dose metrificada e inaladores depó, todos familiares àqueles versados na técnica. Esses dispositivos empre-gam formulações adequadas à liberação do conjugado. Tipicamente, cadaformulação é específica para o tipo de dispositivo empregado, e pode envol-ver o uso de um material propelente apropriado, além de diluentes, adjuvan-tes e/ou veículos úteis em terapia.

O conjugado é vantajosamente preparado para liberação pulmo-nar em forma particulada com um tamanho de partícula médio de 0,1 pm oumenos a 10 pm ou mais, mais preferivelmente de cerca de 0,2, 0,3, 0,4, 0,5,0,6, 0,7, 0,8 ou 0,9 pm a cerca de 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0,5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, ou 9,5 pm para liberação pulmonar. Veí-culos farmaceuticamente aceitáveis para liberação pulmonar dos conjugadosincluem carboidratos como, por exemplo, trealose, manitol, xilitol, sacarose,Iactose e sorbitol. Outros ingredientes para uso em formulações podem in-cluir DPPC, DOPE, DSPC e DOPC. Podem ser usados tensoativos naturaisou sintéticos, incluindo polietileno glicol e dextranas, por exemplo, ciclodex-trana. Sais biliares e outros intensificadores relacionados, além de celulose ederivados de celulose, e aminoácidos, também podem ser usados. Liposso-mos, microcápsulas, microesferas, complexos de inclusão e outros tipos deveículos também podem ser empregados.

Formulações adequadas para uso com um nebulizador, de jatoou ultra-sônico, tipicamente compreendem o conjugado dissolvido ou sus-penso em água, em uma concentração de cerca de 0,01 ou menos a 100 mgou mais de conjugado por ml de solução, de preferência de cerca de 0,1, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mg a cerca de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90 mg de conjugado por ml de solução. A formula-ção também pode incluir um tampão e um açúcar simples (por exemplo, pa-ra estabilização da proteína e regulação da pressão osmótica). A formulaçãopara nebulizador também pode conter um tensoativo, para reduzir ou evitar aagregação do conjugado induzida na superfície causada por atomização dasolução na formação do aerossol.

Formulações para uso com um dispositivo inalador .de dose me-trificada geralmente compreendem um pó finamente dividido contendo ocomposto da invenção suspenso em um propelente com o auxílio de umtensoativo. O propelente pode incluir propelentes convencionais como, porexemplo, clorofluorocarbono, hidroclorofluorocarbonos, hidrofluorocarbonos,e hidrocarbonetos, por exemplo, triclorofluorometano, diclorodifluorometano,diclorotetrafluoretanol, e 1,1,1,2-tetrafluoretano, e combinações destes.

Tensoativos adequados incluem trioleato de sorbitano, lecitinade soja e ácido oléico.

Formulações para dispensa de um dispositivo inalador de pótipicamente compreendem um pó seco finamente dividido contendo o conju-gado, opcionalmente incluindo um agente de formação de volume, por e-xemplo, lactose, sorbitol, sacarose, manitol, trehalose ou xilitol, em umaquantidade que facilita a dispersão do pó pelo dispositivo, tipicamente decerca de 1 % do peso ou menos de 99 % do peso ou mais, da formulação,de preferência de cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50% do pesoa cerca de 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90% do peso da formulação.

Quando o conjugado é administrado por injeção intravenosa,cutânea, subcutânea ou outra injeção, a vacina conjugada está, de preferên-cia, na forma de uma solução aquosa isenta de pirogênio, parenteralmenteaceitável. A preparação de soluções parenteralmente aceitáveis com pH,isotonicidade, estabilidade adequados, e similares, está dentro dos conhe-cimentos da técnica. Uma composição farmacêutica preferida para injeçãopreferivelmente contém um veículo isotônico, por exemplo, injeção de cloretode sódio, injeção de Ringer, injeção de dextrose, injeção de dextrose e clore-to de sódio, injeção de Ringer-Iactato ou outros veículos, como são conheci-dos na técnica. As composições farmacêuticas também podem conter esta-bilizantes, conservantes, tampões, antioxidantes, ou outros aditivos conheci-dos por aqueles versados na técnica.

A duração da injeção pode variar, dependendo de vários fatores,e pode compreender uma injeção única administrada ao longo de poucossegundos ou menos, até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17,18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 horas ou mais de administração intravenosacontínua.

O conjugado pode ser administrado topicamente, sistemicamen-te ou localmente, por meio de um líquido ou gel, ou como um implante oudispositivo.

Os conjugados de modalidades preferidas, ou os métodos deconjugação de modalidades preferidas, podem ser úteis na preparação devacinas para o tratamento de diversas infecções bacterianas, incluindo in-fecções por Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophi-Ha, Mycobacteria sps. (por exemplo, M. tuberculosis, M. avium, At. intracellu-lare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoe-ae, Neisseria meningitidis, Listeria monoeytogenes, Streptoeoceus pyogenes(estreptococo do Grupo A), Streptoeoceus agalaeiae (estreptococo do GrupoB), Streptoeoceus (grupo viridans), Streptoeoceus faecalis, Streptoeoceusbovis, Streptoeoceus (sps. anaeróbicas), Streptoeoceus pneumoniae, Camp-ylobaeter sp. patogênica, Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacil-Ius anthracis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium sp., Erysipelo-thrix rhusiopathiae, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Enterobacteraerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides At.,Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidum,Treponema pertenue, Leptospira e Actinomyces israelli.

Certos métodos das modalidades preferidas também podem terutilização na preparação de vacinas para o tratamento ou a vacinação deindivíduos contra câncer, por exemplo, sarcomas e carcinomas de mamífe-ros, por exemplo, fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossar-coma, sarcoma osteogênico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma,linfangiossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma,tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma de cólon,câncer pancreático, câncer de mama, câncer ovariano, câncer de próstata,carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, adenocarci- noma, carcinoma de glândulas sudoríparas, carcinoma de glândulas sebá-ceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma,carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de célula renal, he-patoma, carcinoma de dueto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinomaembrionário, tumor de Wilms, câncer cervical, tumor testicular, carcinoma depulmão, carcinoma de pulmão de pequenas células, carcinoma de bexiga,carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma,ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neurônio acústico, oligoden-droglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma; Ieuce-mias como, por exemplo, leucemia linfocítica aguda e leucemia mielocíticaaguda (mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica e eritro-leucemia); leucemia crônica (leucemia mielocítica crônica (granulocítica) eleucemia linfocítica crônica); e policitemia Vera, Iinfoma (doença de Hodgkine doença não Hodgkin), mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldens-trom e doença da cadeia pesada, distúrbios linfoproliferativos, incluindo sín-drome Iinfoproliferativea autoimune (ALPS), leucemia linfoblástica crônica,leucemia de células pilosas, leucemia linfática crônica, Iinfoma de células Tperiféricas, Iinfoma linfocítico pequeno, Iinfoma de células do manto, Iinfomafolicular, Iinfoma de Burkitt, Iinfoma de células T positivo para o vírus de Eps-tein-Barr, Iinfoma histiocítico, doença de Hodgkin, Iinfoma agressivo difuso,Ieucemias linfáticas agudas, doença Iinfoproliferativa gama T, Iinfoma cutâ-neo de células B, Iinfoma cutâneo de células T (ou seja, micose fungóide) esíndrome de Szary.

Os conjugados podem ser administrados em combinação comvárias vacinas usadas atualmente ou em desenvolvimento, destinadas a in-divíduos humanos ou não-humanos. Exemplos de vacinas para indivíduoshumanos e dirigidas a doenças infecciosas, incluem a vacina combinada detoxóides diftérico e tetânico; vacina de pertussis de célula inteira; a vacinainativada de influenza; a vacina pneumocócica 23-valente; a vacina viva desarampo; a vacina viva de caxumba; vacina viva de rubéola; vacina de tu-berculose com bacilo de Calmette-Guerin I (BCG); vacina de hepatite A; va-cina de hepatite B; vacina de hepatite C; vacina anti-rábica (por exemplo,vacina de célula diplóide humana); vacina inativada de pólio; vacina de po-lissacarídeo meningocócico; vacina conjugada meningocócica quadrivalente;vacina de vírus vivo contra a febre amarela; vacina tifóide morta de célulainteira; vacina contra cólera; vacina de vírus morto contra encefalite japone-sa B; vacina de adenovírus; vacina de citomegalovírus; vacina de rotavírus;vacina de varicela; vacina contra antraz; vacina contra varíola; e outras vaci-nas comercialmente disponíveis e experimentais.

Os conjugados podem ser fornecidos a um médico assistente oua outro profissional de saúde na forma de um kit. O kit é uma embalagemque abriga um recipiente que contém a vacina conjugada e instruções paraadministração da vacina conjugada a um indivíduo. O kit também pode op-cionalmente conter um ou mais outros agentes terapêuticos. O kit pode op-cionalmente conter uma ou mais ferramentas diagnosticas e instruções parauso. Por exemplo, uma coquetel de vacinas contendo duas ou mais vacinaspode ser incluído, ou composições farmacêuticas separadas contendo dife-rentes vacinas ou agentes terapêuticos. O kit também pode conter dosesseparadas da vacina conjugada para administração serial ou seqüencial. Okit pode conter dispositivos de liberação adequados, por exemplo, seringas,dispositivos de inalação, e similares, juntamente com instruções para admi-nistração dos agentes terapêuticos. O kit pode opcionalmente conter instru-ções para armazenamento, reconstituição (se aplicável) e administração dequalquer um ou todos os agentes terapêuticos incluídos. Os kits podem in-cluir diversos recipientes que refletem o número de administrações a seremdadas a um indivíduo. Caso o kit contenha um primeiro e um segundo reci-pientes, diversos destes poderão estar presentes.

Exemplos - MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais - O toxóide tetânico (TT) era de Lederle Vaccines, Pe-arl River, NY e Serum Institute of índia, Pune, índia. Os polissacarídeos dosgrupos meningocócicos AeC (PS de Mn A e PS de Mn C, respectivamente)eram da Bio-Manguinhos, Rio de Janeiro, Brasil. PS de Mn A também foiobtido de SynCo Bio Partners, Amsterdam, Holanda. PSs de Mn W135 e Yeram de Aventis Pasteur e Chiron. Hidrazina, carboidrazida, diidrazida deácido adípico (ADH), hidrazida acética, cloridrato de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etil carbodiimida (EDC), N-(2-Hidroxietil)piperazina-N'-(ácido 2-etanossulfônico) (HEPES), periodato de sódio, boroidreto de só-dio, cianoboroidreto de sódio, tetrafluoroborato de 4-ciano-dimetilaminopirídio (CDAP) e 1-amino-2,3-propanodiol e vários aminoácidosforam adquiridos de Sigma/AIdrich Chemical Company. Kits de ensaio deTNBSA (ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfônico) e BCA (ácido bicinconínico)foram adquiridos de Pierce.

Métodos - Como descrito anteriormente, é aqui descrito um mé-todo para ativação de proteínas com grupos hidrazida catalisado por carbo-diimida na presença de aminoácidos, mistura de aminoácidos, peptídeos emisturas de peptídeos, e três métodos gerais para a conjugação de polissa-carídeos e misturas de polissacarídeos a proteínas. Os polissacarídeos bac-terianos usados para a conjugação à proteína por esses métodos incluempolissacarídeos meningocócicos dos sorogrupos A, C, W135 e Y.

Ativação de proteína com grupos hidrazida catalisada por carbodiimida napresença de aminoácidos, mistura de aminoácidos, peptídeos e misturas depeptídeos

1. Proteína (toxóide tetânico ou TT1 4 mg/ml, medido pelo ensaiode Lowry [26] ou pelo ensaio de BCA [35]) reagido com hidrazina a 0,36 Mou diidrazida de ácido adípico (ADH) na presença de 12-72 mM de EDC,MES a 0,2 M, pH 5-6,5 e 0-144 mM de aminoácidos ou mistura de aminoáci-dos por 1 -24 horas.

2. A mistura de reação foi neutralizada com NaOH a 1 N e diali-sada contra NaCI a 30 mM, HEPES a 10 mM, pH 7,5, 4°C.

3. Após diálise, as amostras foram registradas quanto à forma-ção de precipitado.

4. As amostras foram armazenadas a 4°C por 1-8 semanas, aformação de precipitado foi examinada e registrada.

5. As amostras que exibem pouco ou nenhum precipitado foramanalisadas por HPLC com uma coluna Superose 6.

6. A concentração de proteína é determinada por ensaio de BCA[35], e a concentração de hidrazida é determinada por ensaio de TNBS [34].

O número de grupos hidrazida por molécula de TT, ou seja, o grau de ativa-ção (DA), é calculado.Método geral A para conjugação - PS ou mistura de PS ativada por aldeídogue reagem com proteína ativada por hidrazida (conjugação por aminacãoredutiva)

1. Foram usados dois métodos para ativar o toxóide tetânico. Otoxóide tetânico foi ativado com hidrazina ou diidrazida de ácido adípico napresença de EDC em pH 5,5-6,5, e depois foi feita a troca do tampão comNaCI 30 mM, Na2CO3 a 3 mM, pH em torno de 10,5. Alternativamente, otoxóide tetânico foi ativado com hidrazina ou diidrazida de ácido adípico napresença de EDC em pH 5,5 e 0-144 mM de aminoácidos ou mistura de a-minoácido, e depois foi feita a troca do tampão com NaCI a 30 mM, HEPESa 10 mM, pH 7,5, 4°C.

2. O polissacarídeo ou uma mistura de polissacarídeos (em umaproporção de peso desejada dós polissacarídeos componentes) foi ativadocom NaIO4, e foi feita a troca do tampão com HEPES a 10 mM, pH 7,5, 4°C.

3. TT ativado por hidrazida foi reagido com polissacarídeo oumistura de polissacarídeo ativada por aldeído em proporções de 2:1 a 1:2 euma faixa de concentração de 1-40 mg/ml de um dia para o outro, pH 6,5-7,5, 4-40°C.

4. NaBH4 (dez vezes os moles dos grupos aldeído no reagenteinicial) foi então adicionado por 6 horas até de um dia para o outro para re-duzir a ligação dupla C=N em ligação simples C-N, e também reduzir osgrupos aldeído não reagidos em álcool.

5. A solução teve o tampão trocado por solução salina, HEPES a10 mM, pH 7,5, EDTA a 1 mM, com o uso de uma membrana com valor decorte do peso molecular de 12-14 KDa.

6. O volume da amostra foi determinado.

7. A concentração de proteína foi calculada com base na quanti-dade de partida inicial medida pelo ensaio de Lowry [26] ou pelo ensaio deBCA [35].

8. A concentração de polissacarídeo foi calculada com base naquantidade de partida inicial medida por métodos de ensaio apropriados pa-ra cada polissacarídeo componente, antes da mistura, por exemplo, peloensaio de resorcinol [27] para PSs de Mn A e C, pelo ensaio de antrona [32]para PSs de Mn W135 e Y1 pelo ensaio de fósforo [33] para PS de Mn A, epelo ensaio de Purpald [31] para PSs de Mn W135 e Y.

Método geral B para conjugação - PS ou mistura de PS ativada por cianatogue reagem com proteína ativada por hidrazida (conjugação por cianilação)

1. Foram usados dois métodos para ativar o toxóide tetânico. Otoxóide tetânico foi ativado com hidrazina ou diidrazida de ácido adípico napresença de EDC em pH 5,5-6,5, e depois foi feita a troca do tampão comNaCI a 30 mM, Na2CO3 a 3 mM, pH em torno de 10,5. Alternativamente, to-xóide tetânico foi ativado com hidrazina ou diidrazida de ácido adípico napresença de EDC em pH 5,5 e 0-144 mM de aminoácidos ou mistura de a-minoácidos, e depois foi feita a troca do tampão com NaCI a 30 mM, HEPESa 10 mM, pH 7,5, 4°C.

2. O polissacarídeo ou uma mistura de polissacarídeos (em umaproporção de peso desejada dos polissacarídeos componentes) foi ativadocom CDAP por 2-2,5 minutos a 20-24°C na presença de trietilamina.

3. A 4°C, TT ativado por hidrazida foi reagido com polissacarídeoou mistura de polissacarídeos ativada por cianato em proporções de 2:1 a1:2 e uma faixa de concentração de 0,2-1 mg/ml, pH 6,5-7,5.

4. Após reação por 3 dias inteiros a 4°C (a incubação prolonga-da é para assegurar a decomposição dos grupos cianato não reagidos resi-duais que sobraram), a solução teve o tampão trocado por solução salina,HEPES a 10 mM, pH 7,5, EDTA a 1 mM, com o uso de uma membrana comvalor de corte do peso molecular de 12-14 KDa.

5. O volume da amostra foi determinado.

6. A concentração de proteína foi calculada com base na quanti-dade de partida inicial medida pelo ensaio de Lowry [26] ou pelo ensaio deBCA [35].

7. A concentração de polissacarídeo foi calculada com base naquantidade de partida inicial medida por métodos de ensaio apropriados pa-ra cada polissacarídeo componente, antes da mistura, por exemplo, peloensaio de resorcinol [27] para PSs de Mn A e C, pelo ensaio de antrona [32]para PSs de Mn W135 e Y1 pelo ensaio de fósforo [33] para PS de Mn A, epelo ensaio de Purpald [31 ] para PSs de Mn W135 e Y.

O tempo de conjugação para a reação do método B para prepa-rar vacinas multivalentes conjugadas combinadas sintetizadas sem uso deum agente de bloqueio é de 3 dias inteiros a 4°C. Em função do alto rendi-mento da conjugação e da alta imunogenicidade do produto de conjugação,é necessário um processo de purificação como, por exemplo, cromatografiaem coluna e/ou precipitação com sulfato de amônio do conjugado do polis-sacarídeo não-conjugado.

Método geral C para conjugação - mistura de PS ou PS ativado por hidrazidague reagem com proteína ativada por aldeído (conjugação por aminaçãoredutiva)

1. Foram usados dois métodos para ativar o toxóide tetânico. Otoxóide tetânico foi reagido com 1-amino-2,3-propanodiol (APDO) na pre-sença de EDC em pH 5,5-6,5, e depois o tampão foi trocado com NaCI a 30mM, Na2CO3 a 3 mM, pH em torno de 10,5, 4°C. TT-APDO foi reagido comNaIO4 para criar grupos aldeído, e depois foi feita a troca do tampão comNaCI a 30 mM, Na2CO3 a 3 mM, pH em torno de 10,5, 4°C. Alternativamen-te, o toxóide tetânico foi reagido com 1-amino-2,3-propanodiol (APDO) napresença de EDC em pH 5,5-6,5 e 0-144 mM de aminoácidos ou mistura deaminoácidos, e depois foi feita a troca do tampão com NaCI a 30 mM, HE-PES a 10 mM, pH 7,5, 4°C. TT-APDO foi reagido com NaIO4 para criar gru-pos aldeído, e depois foi feita a troca do tampão com NaCI a 30 mM, HEPESa 10 mM, pH 7,5, 4°C.

2. Foram usados três métodos para a preparação de polissaca-rídeo ou mistura de polissacarídeos ativada por hidrazida (em uma propor-ção de peso desejada dos polissacarídeos componentes): a) PS ou misturade PS foi reagido com NaIO4 e depois hidrazina ou diidrazida de ácido adípi-co com subseqüente redução com NaBH4 (aminação redutiva); b) PS oumistura de PS foi ativado com CDAP e depois reagido com hidrazina ou dii-drazida de ácido adípico (reação de conjugação por cianilação); e c) PS oumistura de PS foi reagido com hidrazina ou diidrazida de ácido adípico napresença EDC (reação de carbodiimida).

3. TT ativado por aldeído foi reagido com PS ou mistura de PSsativada por hidrazida em proporções de 2:1 a 1:2 e uma faixa de concentra-ção de 1-5 mg/ml por 18 horas, pH 6,5-7,5, 4-40°C.

4. NaBH4 (dez vezes os moles do aldeído no reagente inicial) foientão adicionado por 6 horas, de um dia para o outro, para reduzir a ligaçãodupla C=N em ligação simples C-N, e também reduzir os grupos aldeído nãoreagidos em álcool.

6. O volume da amostra foi determinado.

8. A concentração de polissacarídeo foi calculada com base naquantidade de partida inicial medida por métodos de ensaio apropriados pa-ra cada polissacarídeo componente, antes da mistura, por exemplo, peloensaio de resorcinol [27] para de Mn A e C PSs, pelo ensaio de antrona [32]para Mn W135 e Y PSs, pelo ensaio de fósforo [33] para Mn A PS, e peloensaio de Purpald [31 ] para Mn W135 e Y PSs.

Ensaios físico-químicos de proteína ativada e produtos conjugadosCromatoqrafia por exclusão de tamanho de alto rendimento (HPSEC)

Amostras de proteínas, polissacarídeos e produtos conjugados(25 μΙ, 0,05-1 mg/ml) foram processadas através de uma coluna Waters Ul-trahidrogel 2000 ou Ultrahidrogel Linear ou de uma coluna Superose 6 comsolução salina, Tris a 10 mM, pH 7,5, EDTA a 1 mM a 0,5 ml/minuto em umsistema Dionex HPLC com o uso do software Chromelean e um detector deUV a 280 nm. O detector de UV a 280 nm monitora os sinais de espéciesque contêm proteína, além de compostos que contêm porções aromáticas. Odetector de Rl mede os sinais de proteínas, polissacarídeos, conjugados esais. Quando as vacinas multivalentes conjugadas combinadas sintetizadasforam analisadas por HPLC, frações foram coletadas em cada minuto paradetecção do conjugado de polissacarídeo-proteína por ELISA.Método de ELISA para detecção de conjugado de PS-proteína

Placas Immunolon 1 (Dynatech) foram revestidas com 20 μΙ decada fração de HPLC mais 80 μΙ de 1x PBS (um volume total de 100 μΙ desolução de revestimento) por 3 horas. Somente as espécies que contêm pro-teína (ou seja, proteína livre conjugada e não-conjugada) aderem à placa depoliestireno. Após lavagem três vezes com 150 μΙ de tampão de lavagem(PBS com Tween 20 0,05%, NaN3 0,02%), 100 μΙ do respectivo anti-soro PS-específico (mas que não reage de forma cruzada com a proteína veículo)(1/100 -1/250, diluído com tampão contendo PBS, 5% de soro de bezerrorecém-nascido, NaN3 0,02%) foram adicionados a cada cavidade. Após in-cubação de um dia para o outro, a placa foi lavada três vezes e incubadacom 100 μΙ de Fc de IgG de cabra anticamundongo conjugado com fosfatoalcalino (diluição de 1/10.000 em tampão de diluição) por três horas. Apóslavagem (3 χ 150 μΙ), as placas foram incubadas com 100 μΙ de fosfato de p-nitrofenila (1 mg/ml em Tris a 1 M, pH 9,8, MgCI2 a 0,3 mM) por 30-180 mi-nutos, e as leituras de ELISA a 405 nm foram medidas com uma leitora deplacas. Após subtrair o valor fundo, a leitura representa o conjugado de PS em cada fração, uma vez que o PS livre não-conjugado não cola ou adere àplaca durante o revestimento da placa. A presença de todas as espécies dopolissacarídeo componente nas vacinas multivalentes conjugadas combina-das sintetizadas foi, dessa forma, demonstrada.

Imunogenicidade de conjugados de polissacarídeo-proteína em camundon-pós

Imunização de camundongos

A menos que especificado, camundongos (NIH-Swiss; grupos de5 ou 10) foram imunizados com 1 μg/dose de cada polissacarídeo (em mis-tura de PS ou nos conjugados preparados pelos Métodos de conjugação A,B e C) nos dias 0, 14 e 28 com anti-soros coletados no 429 dia. ELISA foirealizado para determinação dos níveis de anticorpos contra os respectivospolissacarídeos nativos.Método de ELISA para determinação de titulação de anticorpos

Placas Immunolon 1 (Dynatech) foram revestidas com 100 μl desolução de revestimento contendo polissacarídeo (5 pg/ml para Mn A, C,W135 ou Y) por 18 horas. Após lavagem três vezes com 150 μl de tampãode lavagem (PBS com Tween 20 0,05%, NaN3 0,02%), 100 μl de amostrascom especificidade de anti-soro e soro de referência (com 3.200 unidades/mlde anticorpo anti-polissacarídeo atribuídas arbitrariamente; duplicata) emuma diluição serial de duas vezes partindo de 1/200 (diluído com tampão dediluição contendo PBS, 4% de soro de bezerro recém-nascido, 0,02% deNaN3 com 2 μg/ml de polissacarídeo da parede celular em casos pneumocó-cicos) foram adicionados a cada cavidade. Após incubação de um dia para ooutro, as placas foram lavadas três vezes e incubadas com 100 μl de Fc deIgG de cabra anticamundongo conjugado com fosfato alcalino (diluição de1/10.000 em tampão de diluição) por duas horas. Após lavagem (3 χ 150 μl),as placas foram incubadas com 100 μΙ de fosfato de p-nitrofenila (1 mg/mlem Tris a 1 M, pH 9, MgC^ a 0,3 mM) por 30-45 minutos, e a reação foi in-terrompida com 50 μΙ de NaOH a 1 N. As leituras de ELISA foram medidas a405 nm com uma leitora de placas, e os níveis de anticorpos antipolissacarí-deo das amostras de anti-soro foram calculados a partir de suas leituras deELISA e da curva-padrão do soro de referência co-testado na mesma placa.

A média geométrica do nível de anticorpo para cada grupo de camundongosfoi calculada.

Ensaio bactericida para determinação da funcionalidade biológica de anti-corpo (titulação bactericida)

A função biológica do anticorpo induzido foi determinada por en-saio bactericida dos anti-soros induzidos contra a cepa bacteriana homólogade acordo com o método em [Maslanka S.E., Gheesling L.L., Libutti D.E.,Donaldson K.B., Harakeh H.S., Dykes J.K. et ai "Standardization and a mul-tilaboratory comparison of Neisseria meningitidis serogroup A and C serumbactericidal assays. The Multilaboratory Study Group". Clin. Diagn. Lab. Im-munol. 1997; 4(2): 156-167] com pequenas modificações. Resumidamente,as bactérias foram inicialmente cultivadas de um dia para o outro em umaplaca com infusão cérebro-coração (BHI)/soro normal de cavalo 5% (NHS), edepois transferidas para uma placa fresca e cultivadas por 4-5 horas. Foipreparada uma suspensão bacteriana com 80% de transmitância a 530 nmem DPBS a partir da cultura fresca de 4-5 horas, e ela foi diluída até 50-80unidades formadoras de colônia (CFU)/25 μΙ com DPBS (diluição de aproxi-madamente 1:50.000). O complemento foi descongelado em temperaturaambiente, enquanto se preparava a diluição bacteriana, e ela foi armazena-da em gelo até ser usada. Em uma placa de cultura de tecido de 96 cavida-des, uma série de diluições de duas vezes de amostras de teste e de contro-le foi feita com DPBS contendo MgCI2 a 0,5 mM e CaCI2 a 0,9 mM. Foramadicionados 25 μΙ de suspensão bacteriana a cada cavidade, seguidos por25 μl de complemento (Lote Ng 34426-A, Pel-Freez, Rogers, Aakansas). A-pós incubação a 37°C por 30 minutos sem CO2, 10 μΙ de suspensão bacteri-ana de cada cavidade foram plaqueados. As colônias foram contadas apósincubação de um dia para o outro a 37°C com CO2 5%. A titulação bacterici-da é a maior diluição da amostra de teste que gera uma redução de 50% emCFU, quando comparado com a cavidade de controle contendo complemen-to sem anti-soro.

EXEMPLOS ESPECÍFICOS

Ativação de proteína com hidrazina ou hidrazida catalisada por carbodiimidasob condições controladas que incluem o tempo de reação, a concentraçãode EDC e a concentração de aminoácidos e da mistura de aminoácidos

Foi relatado que a reação de proteína com hidrazina ou diidrazi-da catalisada por EDC tende a causar agregação e precipitação do produto.Foram exploradas várias condições de reação para a reação de 4 mg/ml deTT com hidrazina a 0,36 M ou ADH a fim de obter o produto de reação semprecipitação.

Reação de ativação na ausência de aminoácido

Na ausência de aminoácido, a reação foi realizada na presençade EDC a 12-48 mM por 1-24 horas. A mistura de reação teve o tampão tro-cado com NaCI a 30 mM, HEPES a 10 mM, pH 7,5, e foi armazenada a 4°C.

Alguns produtos dessas reações formaram precipitado durante a reação ouapós armazenamento do produto dialisado a 4°C por 1 -8 semanas. O graude ativação (DA; número de grupos hidrazida por molécula de TT) das a-mostras restantes foi determinado e listado na Tabela 3. Os perfis de HPLCde alguns desses produtos são mostrados na Figura 1.Tabela 3. Grau de ativação (DA; número de grupos hidrazida por moléculade TT) para toxóide tetànico ativado resultado de várias condições de ativa-ção na ausência de aminoácido.

<table>table see original document page 60</column></row><table>

a. DA não é determinado para amostra que exibe precipitado.

b. O número entre parênteses é o valor do DA da amostra sem precipitação, mas que apresenta redução substancial do sinal de proteína no perfil de H-

PLC(FiguraI1PerfisAeB).

Reação de ativação na presença de lisina, arqinina. histidina, glicina, serina,treonina e mistura de aminoácidos de lisina, arginina, histidina, glicina, seri-na, treonina, ácido glutâmico e cisteína

A reação do toxóide tetânico (4 mg/ml) com hidrazina a 0,36 M eADH catalisada por EDC a 12 e 24 mM na presença de 36, 72 e 144 mM deaminoácido lisina, arginina, treonina, serina, glicina, histidina ou uma misturade aminoácidos composta de molaridade igual de lisina, arginina, treonina,serina, glicina, histidina, ácido glutâmico e cisteína foi realizada por 1, 2, 4 e24 horas. O grau de ativação (DA) dos produtos da reação sem precipitaçãofoi determinado e listado na Tabela 4. Os perfis de HPLC de alguns dessesprodutos são mostrados na Figura 2.Tabela 4. Grau de ativação (Da; número de grupos hidrazida por moléculade TT) para toxóide tetânico ativado resultado de várias condições de ativa-ção na presença de aminoácido lisina, arginina, treonina, serina, glicina, his-tidina ou mistura de aminoácidos.

<table>table see original document page 61</column></row><table><table>table see original document page 62</column></row><table><table>table see original document page 63</column></row><table>

a. DA não é determinado para amostra que exibe precipitado.

b. O número entre parênteses é o valor do DA da amostra sem precipitação,mas que apresenta redução substancial do sinal de proteína no perfil de H-PLC (Figura 2, Perfil A).

Reação de ativação na presença de ácido glutâmico (e ácido aspártico)

A reação do toxóide tetânico (4 mg/ml) com hidrazina a 0,36 M eADH catalisada por EDC a 12, 24, 48 e 72 mM na presença de 36, 72 e 144mM de ácido glutâmico foi realizada por 1, 2, 4 e 24 horas. O grau de ativa-ção (DA) dos produtos da reação sem precipitação foi determinado e listadona Tabela 5. Os perfis de HPLC de alguns desses produtos são mostradosna Figura 3.

Tabela 5. Grau de ativação (DA; número de grupos hidrazida por moléculade TT) para toxóide tetânico ativado resultado de várias condições de ativa-cão na presença de ácido glutâmico.

<table>table see original document page 63</column></row><table><table>table see original document page 64</column></row><table>

a. DA não é determinado para amostra que exibe precipitado.

b. O número entre parênteses é o valor do DA da amostra sem precipitação,mas que apresenta redução substancial do sinal de proteína no perfil de H-PLC.

Conjugação de misturas de polissacarídeos a proteínas

Método A rConiuaado dos Grupos A, C. W135 - Meninqocócicos multivalen-tes sintetizados combinados e polissacarídeos v-toxóide tetânicol loteACWY040228a1

Ativação de TT para conter grupos hidrazida

1. Toxóide tetânico (4,2 mg/ml) foi ativado com hidrazina a 0,42M na presença de EDC a 20 mM, MES a 0,1 M, pH 6,5 a 20-24°C.

2. Após reação por 4 horas, o pH da mistura de reação foi ele-vado até 7,5-10 com NaOH a 1 N para interromper a reação.

3. A mistura de reação teve o tampão trocado com NaCI a 30mM, Na2CO3 a 3 mM, pH em torno de 10,5 a 4°C com o uso de uma mem-brana de diálise de 12-14 KDa.

Ativação da mistura de PSs de Mn A. C. W135 e Y para conter grupos aldeí-do

1. A mistura de PSs de Mn A, C, W135 e Y (10 mg/ml, PS total;2,5 mg/ml, cada PS componente) foi reagida com 6 mM de NaIO4 a 20-24°Cpor 4 horas.

2. A amostra foi dialisada contra HEPES a 10 mM, pH 7,5 a 4°Ccom o uso de uma membrana de diálise de 12-14 KDa.

Conjugação de mistura de PS ativado de Mn A. C1 W135 e Y ao TT ativado

1. Alíquota de TT contendo hidrazida (0,4 mg) foi ajustada até 10mg/ml por liofilização e dissolução em 0,04 ml de água.

2. Alíquota de mistura de PS de Mn A, C, W135 e Y contendoaldeído foi ajustada até 10 mg/ml por liofilização e dissolução em 0,04 ml deHEPES a 0,2 M pH 7,5, EDTA a 30 mM.

3. Adicionada a solução de TT ativado a um volume igual damistura de PS ativado de Mn e turbilhonada.

4. Incubada a mistura de reação a 20-24°C de um dia para ooutro.

5. A mistura de reação foi tratada com 6 μΙ de NaBH4 a 1 M (10vezes o equivalente molar em relação à concentração inicial de aldeído noPS ativado) por 6 horas.

6. A solução teve o tampão trocado por solução salina, HEPES a10 mM, pH 7,5, EDTA a 1 mM, 4°C, com o uso de uma membrana com valorde corte do peso molecular de 12-14 KDa.

7. O volume do conjugado dialisado foi determinado, e as con-centrações da proteína (TT) e de cada polissacarídeo (Mn A, C, W135 e Y)foram calculadas a partir das massas inseridas.

Caracterização do conjugado multivalente combinado sintetizado loteACWY040228a1

A Figura 4 mostra o perfil de eluição por HPSEC (monitorado a280 nm) do conjugado lote ACWY040228a1. A mudança do sinal de proteínade 17,5 para 13 minutos foi observada com a conjugação, e pouca proteínalivre não-conjugada restava após conjugação. O polissacarídeo conjugadode cada sorogrupo meningocócico A, C, W135 ou Y em cada fração do perfilde HPLC foi detectado por ELISA com respectivos anticorpos específicospara cada polissacarídeo (Figura 5).

Imunogenicidade do conjugado multivalente combinado sintetizado loteACWY040228a1

O conjugado foi usado para imunizar grupos de 10 camundon-gos com polissacarídeo nativo como controle a 1 pg de polissacarídeo/dosenos dias 0, 14 e 28. As médias geométricas dos níveis induzidos de anticor-pos (unidades/ml) duas semanas após a 3ê injeção determinadas por ELISAsão: Mn A, 11 (1, 195; 1 intervalo de confiança SD), MnC, 672 (328, 1.379);Mn WÍ35, 72 (32, 162); e Mn Y, 298 (105, 844) para o grupo de controle, eMn A, 9.291 (3.535, 24.421), Mn C, 4.080 (1.694, 9.824); Mn W135, 17.450(9.502, 32.050); e Mn Y, 114.429 (60.462, 216.566) para as bateladas deconjugado, presumindo-se 3.200 unidades/ml para o soro de referência decada PS de sorogrupo (Tabela 6). Os conjugados induziram 6-845 vezesmais anticorpo anti-PS de Mn específico em camundongos, quando compa-rados com o controle de PS de Mn nativo. As médias geométricas da titula-ção bactericida induzida duas semanas após a 3- injeção determinadas porensaio bactericida são: Mn A1 329 (113, 598; 1 intervalo de confiança SD),MnC, 329 (163, 668); Mn W135, 2.743 (1.851, 4.066); e Mn Y, 12.958(10.197, 16.559) para o grupo de controle, e Mn A, 9.699 (3.373, 27.895),Mn C, 1.657 (854, 3.214); Mn W135, 6.625 (2.076, 21.143); e Mn Y, 77.262(32.824, 181.863) para a batelada de conjugado (Tabela 6b). Os conjugadosinduziram 2,4-29 vezes mais titulação bactericida em camundongos, quandocomparados com o controle de PS de Mn nativo.

Tabela 6a. A média geométrica dos níveis3 de anticorpos anti-PS de Mn com1 intervalo de confiança SD de grupos de camundongos (10 camundongospor grupo) duas semanas após a 3g imunização com 1 ug/dose de cada umdos PS de Mn no conjugado multivalente lote ACWY040228a1

<table>table see original document page 66</column></row><table>

a. Comparado com um soro de referência de cada PS com um nível de anti-corpo anti-PS de Mn presumido de 3200 unidades/mlTabela 6b. A média geométrica da titulação bactericida com 1 de intervalo deconfiança SD de grupos de camundongos (10 camundongos por grupo) duassemanas após a 3a imunização com 1 ug/dose de cada um dos PSs de Mnno conjugado multivalente lote ACWY040228a1<table>table see original document page 67</column></row><table>

Método B [Conjugado dos Grupos A, C, W135 - Meningocócicos multivalen- tes sintetizados combinados e polissacarídeos v-toxóide tetânicol loteACWY040723B5

Ativação de TT para conter grupos hidrazida

Ativação da mistura de PS de Mn A. C. W135 e Y para conter grupos cianato

1. Mistura de PS de Mn A, C, W135 e Y (0,04 ml, 10 mg/ml, PStotal; 2,5 mg/ml, cada PS componente) foi ativada com 5 μΙ CDAP (100mg/ml em acetonitrila) por 2-2,5 minutos a 20-24°C na presença de 5 μΙ trie-tilamina a 0,2 M.

2. O polissacarídeo ativado foi misturado com 0,625 ml de HE-PES a 0,2 M gelado, pH 7,5, EDTA a 30 mM, e usado imediatamente paraconjugação.

Conjugação da mistura de PSs ativados de Mn A, C. W135 e Y ao TT ativado

1. O polissacarídeo ativado foi adicionado a 0,25 mg de TT ati-vado (gelado, 0,0065 ml, 3,84 mg/ml); vortex.

2. Incubada a mistura de reação a 4°C com agitação suave por 3dias inteiros (a incubação prolongada é para assegurar a decomposição dosgrupos cianato residuais não reagidos que sobram).

3. A solução teve o tampão trocado por solução salina, HEPES a10 mM, pH 7,5, EDTA a 1 mM, com o uso de uma membrana com valor decorte do peso molecular de 12-14 Kda.

4. O volume do conjugado dialisado foi determinado, e as con-centrações da proteína (TT) e de cada polissacarídeo (Mn A, C, W135 e Y)foram calculadas a partir das massas inseridas.

Caracterização do conjugado multivalente combinado sintetizado loteACWY040723B5

A Figura 6 mostra os perfis de eluição por HPSEC (monitoradosa 280 nm) do conjugado lote ACWY040723B5. A mudança do sinal de prote-ína de 17,5 para 14,5 minutos foi observada com a conjugação, e uma quan-tidade significativa de proteína livre não-conjugada foi deixada após a conju-gação. O polissacarídeo conjugado de cada sorogrupo meningocócico A, C,W135 ou Y em cada fração do perfil de HPLC foi detectado por ELISA comrespectivos anticorpos específicos para cada polissacarídeo (Figura 7).Imunoqenicidade do conjugado multivalente combinado sintetizado loteACWY040423B5

O conjugado foi usado para imunizar grupos de 10 camundon-gos com polissacarídeo nativo como controle a 1 pg de polissacarídeo/dosenos dias 0, 14 e 28. As médias geométricas dos níveis induzidos de anticor-pos (unidades/ml) duas semanas após a 3ê injeção determinadas por ELISAsão: Mn A, 11 (1, 195; 1 intervalo de confiança SD), MnC, 672 (328, 1.379);Mn W135, 72 (32, 162); e Mn Y, 298 (105, 844) para o grupo de controle, eMn A, 5214 (2.532, 10.739), Mn C, 6.430 (1.797, 23.008); Mn W135, 8.211(490, 137.609); e Mn Y, 81.833 (26.489, 252.808) para as bateladas de con-jugado, presumindo-se 3.200 unidades/ml para o soro de referência de cadaPS de sorogrupo (Tabela 7). Os conjugados induziram 10-474 vezes maisanticorpo anti-PS de Mn específico em camundongos, quando comparadoscom o controle de PS de Mn nativo. As médias geométricas da titulação bac-tericida induzida duas semanas após a Z- injeção determinadas por ensaiobactericida são: Mn A, 329 (113, 598; 1 intervalo de confiança SD), MnC,329 (163, 668); Mn W135, 2743 (1.851, 4.066); e Mn Y, 12.958 (10.197,16.559) para o grupo de controle, e Mn A, 1.255 (696, 2.263), Mn C, 3.203(1.536, 6.679); Mn W135, 33.774 (9.346, 122.041); e Mn Y, 171.471 (93.450,314.632) para a batelada de conjugado (Tabela 7b). Os conjugados induzi-ram 4-13 vezes mais titulação bactericida em camundongos, quando compa-rados com o controle de PS de Mn nativo.

Tabela 7a. A média geométrica dos níveis8 de anticorpos anti-PS de Mn com1 intervalo de confiança SD de grupos de camundongos (10 camundongospor grupo) duas semanas após a 3a imunização com 1 ug/dose de cada umdos PSs de Mn no conjugado multivalente lote ACWY040723B5

<table>table see original document page 69</column></row><table>

a. Comparado com um soro de referência de cada PS com um nível de anti-corpo anti-PS de Mn presumido de 3.200 unidades/ml.

Tabela 7b. A média geométrica da titulação bactericida com 1 intervalo deconfiança SD de grupos de camundongos (10 camundongos por grupo) duassemanas após a 3- imunização com 1 ug/dose de cada um dos PS de Mn noconjugado multivalente lote ACWY040723B5

Polissacarídeo Mistura de PS na- Lote ACWY040723B5 Aumento

<table>table see original document page 69</column></row><table>

Método C - rConiugado dos Grupos A. C. W135 - Meningocócicos multiva-lentes sintetizados combinados e polissacarídeos v-toxóide tetânicol loteACWY040723C5Ativação de TT para conter grupos aldeído

1. Toxóide tetânico (4,2 mg/ml) foi ativado com 1-amino-2,3-propanodiol a 0,42 M (APDO) na presença de EDC a 20 mM, MES a 0,1 M,pH 6,5 a 20-24°C.

4. O grau de TT modificação com APDO foi determinado peloensaio de Purpald [31] e pelo ensaio de Lowry [26].

5. Alíquota de TT-APDO foi reagida com NaIO4 a 6 mM por 3horas, e depois foi feita a troca do tampão com NaCI a 30 mM, Na2COa a 3mM, pH em torno de 10,5.

Ativação da mistura de PS de Mn A, C, W135 e Y para conter grupos hidra-zida

2. Ao final da ativação, 0,01 ml de hidrazina a 5 M, pH 7, foi adi-cionado e misturado.

3. A mistura de reação foi incubada por 4 horas a 20-24°C.

4. A amostra foi dialisada contra HEPES a 10 mM, pH 7,5 a 4°C,com o uso de uma membrana de diálise de 12-14 KDa.

5. O volume da mistura de PS ativado foi determinado (0,12 ml).Conjugação da mistura de PS ativado de Mn A. C. W135 e Y ao TT ativado

1. A mistura de PS de Mn A, C, W135 e Y contendo hidrazida(0,5 mg em 0,12 ml) foi misturada com 0,03 ml de HEPES a 1 M, pH 7,5.

2. Uma alíquota de TT contendo aldeído (0,5 mg; 0,148 ml 3,38mg/ml) foi adicionada à mistura de PS ativado de Mn A, C, W135 e Y (volu-me total, 0,298 ml).3. Incubar a mistura de reação a 20-24°C por 18 horas.

4. A mistura de reação foi tratada com 5 μΙ de NaBH4 a 1 M por 6horas.

6. O volume do conjugado dialisado foi determinado, e as con-centrações da proteína (TT) e de cada polissacarídeo (Mn A, C, W135 e Y)foram calculadas a partir das massas inseridas.

Caracterização do conjugado multivalente combinado sintetizado loteACWY040723C5

A Figura 8 mostra os perfis de eluição por HPSEC (monitoradosa 280 nm) do conjugado lote ACWY040723C5. A mudança do sinal de prote-ína de 17,5 para 14 minutos foi observada com a conjugação, e proteína Ii-vre não-conjugada residual restava após a conjugação. O polissacarídeoconjugado de cada sorogrupo meningocócico A, C, W135 ou Y em cada fra-ção do perfil de HPLC foi detectado por ELISA com respectivos anticorposespecíficos para cada polissacarídeo (Figura 9).

Imunogenicidade do conjugado multivalente combinado sintetizado loteACWY040423C5

O conjugado foi usado para imunizar grupos de 10 camundon-gos com polissacarídeo nativo como controle a 1 pg de polissacarídeo/dosenos dias 0, 14 e 28. As médias geométricas dos níveis induzidos de anticor-pos (unidades/ml) duas semanas após a 3a injeção determinadas por ELISAsão: Mn A, 11 (1, 195; 1 intervalo de confiança SD), MnC, 672 (328, 1.379);Mn W135, 72 (32, 162); e Mn Y, 298 (105, 844) para o grupo de controle, eMn A, 17.250 (6.786, 43.847), Mn C, 11.035 (5.996, 20.309); Mn W135,8.321 (3.505, 19.755); e Mn Y1 84.643 (46.669, 153.517) para as bateladasde conjugado, presumindo-se 3.200 unidades/ml para o soro de referênciade cada PS de sorogrupo (Tabela 8). Os conjugados induziram 16-1.568vezes mais anticorpo anti-PS de Mn específico em camundongos, quandocomparados com o controle de PS de Mn nativo. As médias geométricas datitulação bactericida induzida duas semanas após a 3- injeção determinadaspor ensaio bactericida são: Mn A, 329 (113, 598; 1 intervalo de confiançaSD), MnC, 329 (163, 668); Mn W135, 2.743 (1.851, 4.066); e Mn Y, 12.958(10.197, 16.559) para o grupo de controle, e Mn A, 3.941 (921, 16.862), MnC, 6.860 (2.812, 16.733); Mn W135, 72.403 (39.288, 133.431); e Mn Y,82.832 (43.591, 157.400) para a batelada de conjugado (Tabela 8b). Os con-jugados induziram 6-26 vezes mais titulação bactericida em camundongos,quando comparados com o controle de PS de Mn nativo.

Tabela 8a. A média geométrica dos níveis3 de anticorpos anti-PS de Mn com1 intervalo de confiança SD de grupos de camundongos (10 camundongospor grupo) duas semanas após a 3g imunização com 1 ug/dose de cada umdos PS de Mn no conjugado multivalente lote ACWY040723C5

<table>table see original document page 72</column></row><table>

Tabela 8b. A média geométrica da titulação bactericida com 1 DP de interva-lo de confiança de grupos de camundongos (10 camundongos por grupo)duas semanas após a 3g imunização com 1 ug/dose de cada um dos PS deMn no conjugado multivalente lote ACWY040723C5

<table>table see original document page 72</column></row><table>Método A - [Conjugado dos Grupos A, C. W135 - Meninqocócicos multiva-lentes sintetizados combinados e polissacarídeos v-toxóide tetânicol loteMnACWYTTD(K72)050131A6

Ativação de TT para conter grupos hidrazida

1. Toxóide tetânico (4,2 mg/ml) foi ativado com diidrazida de áci-do adípico a 0,36 M na presença de Iisina a 72 mM, EDC a 12 mM, MES a0,1 M1 pH 5,5 a20-24°C.

2. Após reação por 2 horas, a mistura de reação teve o tampãotrocado com NaCI a 30 mM, HEPES a 10 mM, pH em torno de 7,5 a 4°Ccom o uso de uma membrana de diálise de 12-14 KDa.

3. O volume da amostra foi determinado, e a concentração doTT ativado foi calculada (3,48 mg/ml).

Ativação da mistura de PSs de Mn A, C, W135 e Y para conter grupos aldeído

1. A mistura de PS de Mn A, C, W135 e Y (10 mg/ml, PS total;

2,5 mg/ml, cada PS componente) foi reagida com NaIO4 a 6 mM a 4°C deum dia para o outro.

3. O volume da amostra foi determinado, e a concentração damistura de PS ativado foi calculada (7,25 mg/ml de PS total).Conjugação da mistura de PS ativados de Mn A. C. W135 e Y ao TT ativado

1. Uma alíquota de mistura de PS de Mn A, C, W135 e Y con-tendo aldeído (1 mg; 0,138 ml, 7,25 mg/ml) foi adicionada a 0,0284 ml deHEPES a 1 M, pH 7,5 e 0,0189 ml de EDTA a 0,5 M.

2. A mistura foi mantida no gelo.

3. A alíquota de TT contendo hidrazida (1 mg; 0,288 ml, 3,475mg/ml) foi adicionada à mistura de PS ativado em gelo e misturada.

4. Incubada a mistura de reação a 4°C de um dia para o outro.

5. A mistura de reação foi tratada com 10 μl de NaBH4 a 1 M por 6 horas.

6. A solução teve o tampão trocado por solução salina, HEPES a10 mM, pH 7,5, EDTA a 1 mM, 4°C com o uso de uma membrana com valorde corte do peso molecular de 12-14 KDa.

Caracterização do conjugado multivalente combinado sintetizado loteMnACWYTTD(K72)050131A6

A Figura 10 mostra o perfil de eluição por HPSEC (monitorado a280 nm) do conjugado lote MnACWYTTD(K72)050131A6. A mudança dosinal de proteína de 17,5 para 13 minutos foi observada com a conjugação, epouca proteína livre não-conjugada restava após conjugação. O polissacarí-deo conjugado de cada sorogrupo meningocócico A, C, W135 ou Y em cadafração do perfil de HPLC foi detectado por ELISA com respectivos anticorposespecíficos para cada polissacarídeo (Figura 11).

Imunogenicidade do conjugado multivalente combinado sintetizado loteMnACWYTTD(K72)050131A6

O conjugado foi usado para imunizar um grupo de 5 camundon-gos com uma mistura de polissacarídeo nativo (10 camundongos) como umcontrole, a 1 pg de cada polissacarídeo/dose nos dias 0, 14 e 28. As médiasgeométricas dos níveis induzidos de anticorpos (unidades/ml) duas semanasapós a 3â injeção determinadas por ELISA são: Mn A, 11 (1, 195; 1 intervalode confiança SD); MnC, 672 (328, 1.379); Mn W135, 72 (32, 162); e Mn Y,298 (105, 844) para o grupo de controle, e Mn A, 8.308 (5.282, 13.071); MnC, 4.090 (1.424, 11.746); Mn W135, 11.314 (5.981, 21.403); e Mn Y, 90.779(63.135, 130.528) para o conjugado, presumindo-se 3.200 unidades/ml parao soro de referência de cada PS (Tabela 9). Os conjugados induziram 6-305vezes mais anticorpo anti-PS de Mn específico em camundongos, quandocomparados com o controle de PS de Mn nativo.

Tabela 9. A média geométrica dos níveis8 de anticorpos anti-PS de Mn com1 intervalo de confiança SD de grupos de camundongos (10 camundongospara controle de mistura de PSs nativos e 5 camundongos para o experi-mento) duas semanas após a 3- imunização com 1 ug/dose de cada um dosPS de Mn no conjugado multivalente lote MnACWYTTD(K72)050131A6.

<table>table see original document page 75</column></row><table>

Método B - [Coniugado dos Grupos A, C, W135 - Meningocócicos multiva- lentes sintetizados combinados e polissacarídeos y-toxóide tetânico] loteMnACWYTTD(K72)050201 B6

Ativação de TT para conter grupos hidrazida

1. Toxóide tetânico (4,2 mg/ml) foi ativado com diidrazida de áci-do adípico a 0,36 M na presença de Iisina a 72 mM, EDC a 12 mM, MES a0,1 Μ,ρΗ 5,5 a 20-24°C.

2. Após reação por 2 horas, a mistura de reação teve o tampãotrocado com NaCI a 30 mM, HEPES a 10 mM, pH em torno de 7,5 a 4°Ccom o uso de uma membrana de diálise de 12-14 KDá.

Ativação da mistura de PS de Mn A, C, W135 e Y para conter grupos cianato

1. Mistura de PS de Mn A, C, W135 e Y (0,1 ml, 10 mg/ml, PStotal; 2,5 mg/ml, cada PS componente) foi ativada com 6 μΙ de CDAP (100mg/ml em acetonitrila) por 2-2,5 minutos a 20-24°C na presença de 6 μΙ trie-tilamina a 0,2 M.

2. O polissacarídeo ativado foi misturado com 1,25 ml de HEPESgelado a 0,2 M, pH 7,5, EDTA a 30 mM, e usado imediatamente para conju-gação.

Conjugação da mistura de PS ativados de Mn A. C. W135 e Y ao TT ativado

1. O polissacarídeo ativado foi adicionado a 0,5 mg TT ativado(gelado, 0,144 ml, 3,48 mg/ml); vortex.

Caracterização do conjugado multivalente combinado sintetizado loteMnACWYTTD(K72)050201 B6

A Figura 12 mostra os perfis de eluição por HPSEC (monitora-dos a 280 nm) do conjugado lote MnACWYTTD(K72)050201B6. A mudançado sinal de proteína de 17,5 para 14 e 16 minutos foi observada com a con-jugação, e uma quantidade substancial de proteína livre não-conjugada res-tava após a conjugação. O polissacarídeo conjugado de cada sorogrupomeningocócico A, C, WI35 ou Y em cada fração do perfil de HPLC foi detec-tado por ELISA com respectivos anticorpos específicos para cada polissaca-rídeo (Figura 13).

Imunogenicidade do conjugado multivalente combinado sintetizado loteMnACWYTTD(K72)050201 B6

O conjugado foi usado para imunizar um grupo de 5 camundon-gos com polissacarídeo nativo como controle (10 camundongos) a 1 pg decada polissacarídeo/dose nos dias 0, 14 e 28. As médias geométricas dosníveis induzidos de anticorpos (unidades/ml) duas semanas após a 3- inje-ção determinadas por ELISA são: Mn A, 11 (1, 195; 1 intervalo de confiançaSD); MnC, 672 (328, 1.379); Mn W135, 72 (32, 162); e Mn Y, 298 (105, 844)para o controle, e Mn A, 2.752 (1.355, 5.589); Mn C, 2.930 (1.190, 7.212);Mn W135, 4.755 (1.455, 15.542); e Mn Y, 22.494 (10.466, 48.347) para ogrupo de conjugado, presumindo-se 3.200 unidades/ml para o soro de refe-rência de cada PS (Tabela 10). Os conjugados induziram 4-250 vezes maisanticorpo anti-PS de Mn específico em camundongos, quando comparadoscom o controle de PS de Mn nativo.

Tabela 10. A média geométrica dos níveis3 de anticorpos anti-PS de Mn com1 DP de intervalo de confiança de grupos de camundonqos (10 camundon-gos para controle de mistura de PSs nativos e 5 camundongos para o expe-rimento) duas semanas após a 3§ imunização com 1 uq/dose de cada umdos PSs de Mn no conjugado multivalente loteMnACWYTTD(K72)050201B6.

<table>table see original document page 77</column></row><table>

Método A - [Conjugado dos Grupos A. C. W135 - Meningocócicos multiva-Ientes sintetizados combinados e polissacarídeos y-toxóide tetânicol loteTTHACWY061126

Ativação de TT para conter grupos hidrazida

1. Toxóide tetânico (4,2 mg/ml) foi ativado com hidrazina a 0,42M na presença de EDC a 20 mM, MES a 0,1 M, pH 5,5 a 20-24°C.

3. A mistura de reação teve o tampão trocado com NaCI a 30mM, Na2C03 a 3 mM, pH em torno de 10,5 a 4°C com o uso de uma mem-brana de diálise de 12-14 KDa.

Ativação de PS individual de Mn A, C. W135 e Y por NaIO4 para conter gru-pos aldeído

1. PS de Mn A (10 mg/ml) foi ativado com 15 mM de NaICU a4°C por 72 horas, extinto com 25 mM de glicerol e dialisado contra H2O a4°C.

2. PS de Mn C (10 mg/ml) foi ativado com NaIO4 a 6 mM emtemperatura ambiente por 4 horas, extinto com glicerol a 25 mM e dialisadocontra H2O a 4°C.

3. PS de Mn W135 (10 mg/ml) foi ativado com NaIO4 a 3 mM a4°C de um dia para o outro, extinto com glicerol a 25 mM e dialisado contraH20 a 4°C.

4. PS de Mn Y (10 mg/ml) foi ativado com NaIO4 a 3 mM a 4°Cde um dia para o outro, extinto com glicerol a 25 mM e dialisado contra H2Oa 4°C.

Conjugação da mistura de PS ativados de Mn A, C. W135 e Y ao TT ativado

1. Alíquota de PS ativado de Mn A, C, W135 e Y contendo aldeí-do foi misturada em uma proporção de 1:1:1:1 (P/P; PS total = 0,1 mg).

2. A mistura de PSs foi mantida no gelo e misturada com 1 μΙ deMES a 1M, pH 6.

3. O volume total do PS foi trazido até 36,8 μΙ com água gelada.

4. Uma alíquota de TT contendo hidrazida (0,1 mg; 29,9 μΙ, 3,41mg/ml) foi adicionada à mistura de PS ativado em gelo e misturada.

5. Incubada a mistura de reação a 4°C por dois dias inteiros.

6. Adicionado 1 μΙ MES a 1 M, pH 6,5.

7. A mistura de reação foi tratada com 2 μΙ de NaBH4 a 1 M a4°C de um dia para o outro.

8. A solução teve o tampão trocado por solução salina, HEPES a10 mM, pH 7,5, EDTA a 1 mM, 4°C com o uso de uma membrana com valorde corte do peso molecular de 12-14 KDa.

9. O volume do conjugado dialisado foi determinado, e as con-centrações da proteína (TT) e de cada polissacarídeo (Mn A, C, W135 e Y)foram calculadas a partir das massas inseridas.

Caracterização do conjugado multivalente combinado sintetizado lote T-THACWY061126

O conjugado lote TTHACWY061126 foi analisado por perfis deeluição por HPSEC (monitorados a 280 nm). A mudança do sinal de proteínade 17,5 a 14 minutos foi observada com a conjugação, e pouca proteína livrenão-conjugada restava após conjugação. O polissacarídeo conjugado decada sorogrupo meningocócico A, C, W135 ou Y em cada fração do perfil deHPLC foi detectado por ELISA com respectivos anticorpos específicos paracada polissacarídeo (Figura 14).Imunoqenicidade do conjugado multivalente combinado sintetizado lote T-THACWY061126

O conjugado foi usado para imunizar um grupo de 15 camun-dongos com mistura de polissacarídeo nativo (5 camundongos) como contro-Ie a 1 pg de cada polissacarídeo/dose nos dias O, 14 e 28. As médias geo-métricas dos níveis induzidos de anticorpos (unidades/ml) duas semanasapós a 3§ injeção determinadas por ELISA são: Mn A, 108 (39, 296; 1 DP deintervalo de confiança); Mn C1 416 (221, 784); Mn W135, 52 (29, 96); e MnY, 386 (232, 644) para o grupo de controle, e Mn A, 29.819 (18.049, 49.266);Mn C, 1.319 (372, 4.674); Mn W135, 11.075 (4.610, 26.607); e Mn Y, 39.901(24.295, 65.530) para o conjugado, presumindo-se 3.200 unidades/ml para osoro de referência de cada PS (Tabela 11a). Os conjugados induziram 3-268vezes mais anticorpo anti-PS de Mn específico em camundongos, quandocomparados com o controle de PS de Mn nativo. As médias geométricas datitulação bactericida induzida duas semanas após a 3§ injeção determinadaspor ensaio bactericida são: Mn A, 394 (114, 1.358; 1 intervalo de confiançaSD), MnC, 226 (97, 529); Mn W135, 10.396 (6.146, 17.585); e Mn Y, 9.050(9.050, 9.050) para o grupo de controle, e Mn A, 12125 (3.800, 38.689), MnC, 1.811 (621, 5.282); Mn W135, 89.595 (28.643, 280.251); e Mn Y, 128.062(25.097, 653.452) para a batelada de conjugado (Tabela 11b). Os conjuga-dos induziram 8-31 vezes mais titulação bactericida em camundongos,quando comparados com o controle de PS de Mn nativo.

Tabela 11a. A média geométrica dos níveis3 de anticorpos anti-PS de Mncom 1 DP de intervalo de confiança de grupos de camundongos (5 camun-dongos para controle de mistura de PS nativo e 15 camundongos para o ex-perimento) duas semanas após a 3g imunização com 1 ug/dose de cada umdos PSs de Mn no conjugado multivalente lote TTHACWY061126.

<table>table see original document page 79</column></row><table><table>table see original document page 80</column></row><table>

a. Comparado com um soro de referência de cada PS com um nível de anti-corpo anti-PS de Mn presumido de 3.200 unidades/ml.Tabela 11b. A média geométrica da titulação bactericida com 1 intervalo deconfiança SD de grupos de camundonqos (5 camundonaos para controle demistura de PS nativos e 15 camundongos para o experimento) duas sema-nas após a 3ã imunização com 1 ug/dose de cada um dos PS de Mn no con-jugado multivalente lote TTHACWY061126.

Polissacarídeo MisturadePS Lote TTHACWY061126 Aumentonativo em vezes

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Método B - "Conjugado dos Grupos A, C, W135 - Meningocócicos multiva- lentes sintetizados combinados e polissacarídeos y-toxóide tetânicol loteTTHVIIACWYa060922B (2:2)

Ativação de TT para conter grupos hidrazida

1. Toxóide tetânico (4,2 mg/ml) foi ativado com hidrazina a 0,42M na presença de EDC a 30 mM, MES a 0,1 M, pH 5,5 a 20-24°C.

2. Após reação por 1 hora, o pH da mistura de reação foi eleva-do até 7,5-10 com NaOH a 1 N para interromper a reação.

Ativação da mistura de PS de Mn A. C, W135 e Y para conter grupos cianato

A mistura de PS de Mn A, C, W135 e Y (1:1:1:1, P/P; 0,0125 ml,10 mg/ml) foi ativada com 0,75 μΙ de CDAP (100 mg/ml em acetonitrila) por2-2,5 minutos a 20-24°C na presença de 0,5 μΙ de trietilamina a 0,2 M.Conjugação da mistura de PS ativados de Mn A, C, W135 e Y ao TT ativado

1. O polissacarídeo ativado foi misturado com 50 μΙ de 2x PBSgelado, pH 7,4, seguido por adição de 0,125 mg de TTH (32,3 μΙ, 3,87mg/ml, gelado).

2. Incubada a mistura de reação a 4°C com agitação suave por 3dias inteiros (a incubação prolongada é para assegurar a conjugação com-pleta, bem como a decomposição dos grupos cianato residual não reagidosque sobram).

3. A solução teve o tampão trocado a 4°C com solução salina,HEPES a 10 mM, pH 7,5, EDTA a 1 mM, com o uso de uma membrana comvalor de corte do peso molecular de 12-14 KDa.

Caracterização do conjugado multivalente combinado sintetizado lote TTHVI-IACWYa060922B(2:2)

O conjugado lote TTHVIIACWYa060922B(2:2) foi analisado porperfis de eluição por HPSEC (monitorados a 280 nm). A mudança do sinalde proteína de 17,5 a 14 minutos foi observada com a conjugação, e poucaproteína livre não-conjugada restava após conjugação. O polissacarídeoconjugado de cada sorogrupo meningocócico A, C, W135 ou Y em cada fra-ção do perfil de HPLC foi detectado por ELISA com respectivos anticorposespecíficos para cada polissacarídeo.

Imunogenicidade do conjugado multivalente combinado sintetizado lote T-THVI IACWYa060922B (2:2)

O conjugado foi usado para imunizar um grupo de 5 camundon-gos com polissacarídeo nativo como controle a 1 μg de cada polissacarí-deo/dose nos dias 0, 14 e 28. As médias geométricas dos níveis induzidosde anticorpos (unidades/ml) duas semanas após a 3ê injeção determinadaspor ELISA são: Mn A, 108 (39, 296; 1 intervalo de confiança SD); MnC, 416(221, 784); Mn WT35, 52 (29, 96); e Mn Y, 386 (232, 644) para o controle, eMn A, 24.828 (16.738, 36.829); Mn C, 10.641 (6.118, 18.506); Mn W135,15.068 (7.374, 30.788); e Mn Υ, 99.827 (56.810, 175.416) para ο grupo deconjugado, presumindo-se 3.200 unidades/ml para o soro de referência decada PS (Tabela 12a). Os conjugados induziram 26-290 vezes mais anticor-po anti-PS de Mn específico em camundongos, quando comparados com ocontrole de PS de Mn nativo. As médias geométricas da titulação bactericidainduzida duas semanas após a 3- injeção determinadas por ensaio bacteri-cida são: Mn A, 394 (114, 1.358; 1 intervalo de confiança SD), MnC, 226 (97,529); Mn W135, 10.396 (6.146, 17.585); e Mn Y, 9.050 (9.050, 9.050) para ogrupo de controle, e Mn A, 5.970 (3.212, 11.099), Mn C, 19.400 (8.185,45.985); Mn W135, 68.593 (19.473, 241.620); e Mn Y, 111.431 (45.134,275.106) para a batelada de conjugado (Tabela 12b). Os conjugados induzi-ram 7-86 vezes mais titulação bactericida em camundongos, quando compa-rados com o controle de PS de Mn nativo.

Tabela 12a. A média geométrica dos níveis3 de anticorpos anti-PS de Mncom 1 intervalo de confiança SD de grupos de camundongos (5 camundon-gos para controle de mistura de PS nativo e 5 camundongos para o experi-mento) duas semanas após a 33 imunização com 1 ug/dose de cada um dosPSs de Mn no conjugado multivalente lote TTHVIIACWYa060922B(2:2).

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Tabela 12b. A média geométrica da titulação bactericida com 1 DP de inter-valo de confiança de grupos de camundongos (5 camundongos por grupo)duas semanas após a 3g imunização com 1 ug/dose de cada um dos PSs deMn no conjugado multivalente lote TTHVIIACWYa060922B(2:2).<table>table see original document page 83</column></row><table>

Método A - ÍConiuoado dos Grupos A, C, W135 - Meninoocócicos multiva- lentes sintetizados combinados e polissacarídeos v-toxóide tetânicol loteTTH2C/A/WY070209

Ativação de TT para conter grupos hidrazida

Ativação de PS individual de Mn A. C. W135 e Y por NaIO4 para conter gru-pos aldeído

1. PS de Mn A (10 mg/ml) foi ativado com NaIO4 a 15 mM a 4°Cpor 72 horas, extinto com glicerol a 25 mM e dialisado contra H2O a 4°C.

2. PS de Mn C (10 mg/ml) foi ativado com 6 mM de NaIO4 emtemperatura ambiente por 4 horas, extinto com 25 mM de glicerol e dialisadocontra H2O a 4°C.

3. PS de Mn W135 (10 mg/ml) foi ativado com NaIO4 a 3 mM a4°C de um dia para o outro, extinto com 25 mM de glicerol e dialisado contraH2O a 4°C.

4. PS de Mn Y (10 mg/ml) foi ativado com 3 mM de NaIO4 a 4°Cde um dia para o outro, extinto com 25 mM de glicerol e dialisado contra H2O a 4°C.Conjugação da mistura de PSs ativados de Mn A, C, W135 e Y ao TT ativado

1. Alíquota (0,1 mg) de PS de Mn C ativado foi Iiofilizada e re-dissolvida em 1 μΙ de 1 M de MES, pH 6.

2. Alíquota de TT contendo hidrazida (0,2 mg) foi Iiofilizada e re-dissolvida em 2 μl de H2O.

3. Adicionar a solução de proteína à solução de PS de Mn C ati-vado a 4°C no 19 dia; misturar; e incubar de um dia para o outro a 4°C.

4. A 4°C, adicionar 0,05 mg de PS de Mn A ativado em 2-7 μΙ àmistura de reação de TT contendo hidrazida/PS de Mn C ativado no 2o dia;misturar; e incubar de um dia para o outro a 4°C.

5. A 4°C, adicionar solução salina gelada e 0,05 mg de cada umdos PSs ativados de Mn W135 e Y à mistura de reação da etapa (4) no 3odia até um volume total de 200 μΙ; misturar; e incubar de um dia para o outroa 4°C.

6. Adicionar 2 μΙ de MES a 1 M, pH 6,5.

7. A mistura de reação foi tratada com 3 μΙ de NaBH4 a 1 M a4°C de um dia para o outro.

Caracterização do conjugado multivalente combinado sintetizado lote T-TH2C/A/WY070209

O conjugado lote TTH2C/A/WY070209 foi analisado por perfisde eluição por HPSEC (monitorados a 280 nm). A mudança do sinal de pro-teína de 17,5 a 14 minutos foi observada com a conjugação, e pouca proteí-na livre não-conjugada restava após conjugação. O polissacarídeo conjuga-do de cada sorogrupo meningocócico A, C, W135 ou Y em cada fração doperfil de HPLC foi detectado por ELISA com respectivos anticorpos específi-cos para cada polissacarídeo (Figura 15).

Imunogenicidade do conjugado multivalente combinado sintetizado lote T-TH2C/A/WY070209

O conjugado foi usado para imunizar um grupo de 15 camun-dongos com mistura de polissacarídeo nativo (5 camundongos) como contro-le a 0,1 pg de cada PS/dose para Mn A, W135 e Y e 0,2 pg/dose para Mn Cnos dias 0, 7 e 14. As médias geométricas dos níveis induzidos de anticor-pos (unidades/ml) uma semana após a 3ã injeção determinados por ELISAsão Mn A, 1 (1, 1; 1 intervalo de confiança SD); Mn C, 34 (10, 109); MnW135, 1 (1, 1); e Mn Y1 28 (5, 166) para o grupo de controle, e Mn A, 10.303(5.480, 19.371); Mn C, 12.815 (7.350, 22.343); Mn W135, 3.111 (1.490,6.494); e Mn Y1 9.457 (4.280, 20.894) para o conjugado, presumindo-se3.200 unidades/ml para o soro de referência de cada PS (Tabela 13a). Osconjugados induziram 338-10.303 vezes mais anticorpo anti-PS de Mn es-pecífico em camundongos, quando comparados com o controle de PS de Mnnativo. As médias geométricas da titulação bactericida induzida uma semanaapós a 3§ injeção determinada por ensaio bactericida são Mn A, 260 (127,533; 1 DP de intervalo de confiança), MnC, 92 (76, 111); Mn W135, 858(587, 1.254); e Mn Y, 462 (53, 3.998) para o grupo de controle, e Mn A,4.321 (2.192, 8.521), Mn C, 1.755 (931, 3.310); Mn W135, 20.030 (4.288,93.566); e Mn Y, 7.728 (2.811, 21.244) para a batelada de conjugado (Tabe-la 13b). Os conjugados induziram 17-23 vezes mais titulação bactericida emcamundongos, quando comparados com o controle de PS de Mn nativo.

Tabela 13a. A média geométrica dos níveis3 de anticorpos anti-PS de Mncom 1 DP de intervalo de confiança de grupos de camundongos (5 camun-dongos para controle de mistura de PSs nativos e 15 camundongos para oexperimento) uma semanas após a 3a imunização com 0,1 ug/dose de cada

PS de Mn A. W135 e Y e 0,2 uo/dose para Mn C no conjugado multivalentelote TTH2C/A/WY070209.Polissacarídeo Mistura de Lote TTH2C/A/WY070209 Aumento

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a. Comparado com um soro de referência de cada PS com um nível de anti-corpo anti-PS de Mn presumido de 3.200 unidades/ml.Tabela 13b. A média geométrica da titulação bactericida com 1 intervalo deconfiança SD de grupos de camundongos (5 camundongos para controle demistura de PS nativo e 15 camundongos para o experimento) uma semanaapós a 3a imunização com 0.1 ug/dose de cada PS de Mn A. W135 e Y e 0.2ug/dose para Mn C no conjugado multivalente lote TTH2C/A/WY070209

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Método B - [Conjugado dos Grupos A. C. W135 - Meningocócicos multiva-lentes sintetizados combinados e polissacarídeos v-toxóide tetânicol loteTTHIAC/WY070210B(2:2)

Ativação de TT para conter grupos hidrazida

1. Toxóide tetânico (4,2 mg/ml) foi ativado com hidrazina a 0,42M na presença de EDC a 30 mM, 0,1 M de MES, pH 5,5 a 20-24°C.

2. Após reação por 3 horas, o pH da mistura de reação foi ele-vado ate 7,5-10 com NaOH a 1N pra interromper a reacao.

3. A mistura de reacao teve o tampao trocado com NaCl a 30nM, Na2CO3 a 3 mM, pH em torno de 10,5 a 4°C com o uso de uma mem-brana de dialise de 12-14 KDa.

Ativação

Uma mistura de PSs de Mn A e C (1:1, P/P; 0,025 ml, 10 mg/ml)foi ativada com 1,5 μΙ de CDAP (100 mg/ml em acetonitrila) por 2-2,5 minu-tos a 20-24°C na presença de 1 μΙ de trietilamina a 0,2 M.Conjugação de mistura de PSs ativados de Mn A e C ao TT ativado

1.0 polissacarídeo ativado foi misturado com 200 μΙ de 2x PBSgelado, pH 7,4, seguido por adição de 0,5 mg de TTH gelado.

2. Incubada a mistura de reação a 4°C com agitação suave deum dia para o outro.

Ativação de mistura de PSs de Mn W135 e Y para conter grupos cianato

Uma mistura de PSs de Mn W135 e Y (1:1, P/P; 0,025 ml, 10mg/ml) foi ativada com 1,5 μΙ de CDAP (100 mg/ml em acetonitrila) por 2-2,5minutos a 20-24°C na presença de 1 μΙ de trietilamina a 0,2 M.Conjugação de mistura de PSs ativados de Mn W135 e Y ao TT ativado namistura de reação de TTH + MnAeC ativado

1. A mistura ativada de Mn W135 e Y foi misturada com a mistu-ra de reação de TTH + Mn A e C ativado no gelo.

2. Incubada a mistura de reação a 4°C com agitação suave por 3dias inteiros (a incubação prolongada é para assegurar a conjugação com-pleta, bem como a decomposição dos grupos cianato residuais não reagidosque sobrem).

Caracterização do conjugado multivalente combinado sintetizado lote TTHI-AC/WY070210B(2:2)

O conjugado lote TTHIAC/WY070210B(2:2) foi analisado porperfis de eluição por HPSEC (monitorados a 280 nm). A mudança do sinalde proteína de 17,5 a 14 minutos foi observada com a conjugação, e poucaproteína livre não-conjugada restava após conjugação. O polissacarídeoconjugado de cada sorogrupo meningocócico A, C, W135 ou Y em cada fra-ção do perfil de HPLC foi detectado por ELISA com respectivos anticorposespecíficos para cada polissacarídeo.

Imunogenicidade do conjugado multivalente combinado sintetizado lote T-THIAC/WY070210B(2:2)

O conjugado foi usado para imunizar um grupo de 5 camundon-gos com polissacarídeo nativo como controle a 0,1 pg de cada polissacarí-deo/dose nos dias 0, 7 e 14. As médias geométricas dos níveis induzidos deanticorpos (unidades/ml) uma semana após a 3- injeção determinadas porELISA são: Mn A, 1 (1, 1; 1 intervalo de confiança SD); MnC, 34 (10, 109);Mn W135, 1 (1, 1); e Mn Y, 28 (5, 166) para o controle, e MnA, 5.873 (3.966,8.699); Mn C, 3.465 (2.109, 5.695); Mn W135, 3.798 (2.090, 6.900); e Mn Y,22.423 (11.933, 42.133) para o grupo de conjugado, presumindo-se 3.200unidades/ml para o soro de referência de cada PS (Tabela 14a). Os conju-gados induziram 102-5.873 vezes mais anticorpo anti-PS de Mn específicoem camundongos, quando comparados com o controle de PS de Mn nativo.

As médias geométricas da titulação bactericida induzida uma semana após a3ã injeção determinadas por ensaio bactericida são: Mn A, 260 (127, 533; 1intervalo de confiança SD), MnC, 92 (76, 111); Mn W135, 858 (587, 1.254); eMn Y, 462 (53, 3.998) para o grupo de controle, e Mn A, 4.127 (2.196,7.756), Mn C, 1.331 (588, 3.010); Mn W135, 38.508 (17.971, 82.515); e MnY, 11.506 (7.700, 17.194) para a batelada de conjugado (Tabela 14b). Osconjugados induziram 14-45 vezes mais titulação bactericida em camundon-gos, quando comparados com o controle de PS de Mn nativo.

Tabela 14a. A média geométrica dos níveis3 de anticorpos anti-PS de Mncom 1 intervalo de confiança SD de grupos de camundongos (5 camundon-gos para controle de mistura de PSs nativos e 5 camundongos para o expe-rimento) uma semana após a 3a imunização com 0.1 ug/dose de cada umdos PSs de Mn no conjugado multivalente lote TTHIAC/WY070210B(2:2).<table>table see original document page 89</column></row><table>

Tabela 14b. A média geométrica da titulação bactericida com 1 intervalo deconfiança SD de grupos de camundongos (5 camundongos por grupo) umasemana após a 3g imunização com 0,1 ug/dose de cada um dos PSs de Mnno conjugado multivalente lote TTHIAC/WY070210B(2:2).

Polissacarídeo Mistura de PS LotTTHIAC/WY070210B(2:2) Aumentonativo em vezes

<table>table see original document page 89</column></row><table>

Em função das muitas modalidades possíveis às quais os princí-pios da invenção descrita podem ser aplicados, deve-se reconhecer que asmodalidades ilustradas são apenas exemplos preferidos da invenção e nãodevem ser consideradas como Iimitantes do escopo da invenção. Em vezdisso, o escopo da invenção é definido pelas reivindicações seguintes. Por-tanto, reivindicamos como incluído em nossa invenção tudo que estiver den-tro do escopo e do espírito das reivindicações.

LISTAGEM DE REFERÊNCIAS

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Claims

1. Método para a produção de um conjugado imunogênico multi-valente complexo, que compreende:- a reação de diversos polissacarídeos imunogênicos distintoscom um agente oxidante, resultando em uma mistura de diversos polissaca-rídeos imunogênicos distintos ativados por aldeído;- a reação de pelo menos uma proteína com hidrazina, carboi-drazida, cloreto de hidrazina, uma diidrazida ou uma mistura destas sobcondições suficientes para produzir uma solução de pelo menos uma proteí-na ativada por hidrazida;- o contato da mistura dos diversos polissacarídeos imunogêni-cos distintos ativados por aldeído com pelo menos uma proteína ativada porhidrazida em um pH de cerca de 5 a cerca de 8, de tal forma que os diversospolissacarídeos imunogênicos ativados por aldeído distintos simultaneamen-te reajam com pelo menos uma proteína ativada por hidrazida, resultandoem um conjugado multivalente complexo que inclui pelo menos uma ligaçãodupla C=N formada entre cada polissacarídeo imunogênico distinto anexadoe a proteína; e- a redução de substancialmente todas as ligações duplas C=Ndo conjugado multivalente complexo em ligações C-N1 resultando em umproduto conjugado imunogênico multivalente complexo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menosuma proteína ativada por hidrazida é substancialmente solúvel em pH neutro.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a reaçãosimultânea dos diversos polissacarídeos imunogênicos ativados por aldeídodistintos com pelo menos uma proteína ativada por hidrazida resulta em umacomposição que inclui a mistura dos diversos polissacarídeos imunogênicosdistintos ativados por aldeído e pelo menos uma proteína ativada por hidrazida.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o contato damistura dos diversos polissacarídeos imunogênicos distintos ativados poraldeído com pelo menos uma proteína ativada por hidrazida e a redução dasligações duplas C=N compreende o fornecimento, na presença de boroidretode sódio, de uma composição formada pela mistura dos diversos polissaca-rídeos imunogênicos distintos ativados por aldeído e pelo menos uma prote-ína ativada por hidrazida.

5. Método de acordo com a reivindicação 2, em que pelo menosuma proteína é reagida com hidrazina, carboidrazida, cloreto de hidrazina,uma diidrazida ou uma mistura das mesmas, na presença de: (i) uma carbo-diimida e (ii) pelo menos um aminoácido, pelo menos um peptídeo, ou umamistura de pelo menos um aminoácido e pelo menos um peptídeo.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que o aminoáci-do é selecionado de pelo menos um de lisina, arginina, histidina, glicina, se-rina, treonina, ácido glutâmico ou cisteína.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menosuma proteína é reagida com hidrazina, carboidrazida, succinil diidrazida, dii-drazida de ácido adípico ou uma mistura das mesmas, na presença de umcloridrato de carbodiimida em um pH de cerca de 6 a cerca de 7 para obteruma solução de proteína ativada por hidrazida, e que ainda compreende atroca de tampão da solução de proteína ativada por hidrazida até um pH de cerca de 10,0 a cerca de 11,0.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menosuma proteína é reagida com hidrazina, carboidrazida, succinil diidrazida, dii-drazida de ácido adípico ou uma mistura das mesmas, na presença de umcloridrato de carbodiimida em um pH de cerca de 5,5 a cerca de 6,5 paraobter uma solução de proteína ativada por hidrazida, e que ainda compreen-de a troca de tampão da solução de proteína ativada por hidrazida até umpH de cerca de 10,0 a cerca de 11,0.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, em que 2 a 28 polis-sacarídeos imunogênicos ativados por aldeído distintos são reagidos simul-taneamente com pelo menos uma proteína ativada por hidrazida.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que os polissa-carídeos imunogênicos distintos são selecionados do grupo que consiste empolissacarídeos meningocócicos, polissacarídeos pneumocócicos, polissaca-rídeo de Haemophilus influenzae do tipo b, polissacarídeo Vi de Salmonnellatyphie polissacarídeos de estreptococos do grupo B.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, em que os polissa-carídeos imunogênicos distintos são selecionados do grupo que consiste nogrupo meningocócico A, grupo meningocócico C, grupo meningocócicoW135 e grupo meningocócico Y.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, em que os polissa-carídeos imunogênicos ativados por aldeído distintos são reagidos com umaúnica proteína ativada por hidrazida.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, em que os polissa-carídeos imunogênicos ativados por aldeído distintos são reagidos com di-versas proteínas ativadas por hidrazida diferentes.

14. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a carbodi-imida é cloridrato de 1 -[3-(dimetilamino)propil]-3-etil carbodiimida.

15. Método de acordo com a reivindicação 7, em que a carbodi-imida é cloridrato de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etil carbodiimida.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, em que uma mistu-ra de polissacarídeos imunogênicos distintos é reagida com o agente oxidante.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, em que cada polis-sacarídeo imunogênico distinto é inicialmente reagido com um agente oxi-dante, e a seguir os polissacarídeos imunogênicos ativados por aldeído dis-tintos resultantes individuais são misturados em conjunto para formar a mis-tura de polissacarídeos imunogênicos ativados por aldeído distintos.

18. Método para a produção de um conjugado imunogênico mul-tivalente complexo, que compreende:- a reação de diversos polissacarídeos imunogênicos distintoscom um agente de cianilação, resultando em uma mistura de diversos polis-sacarídeos imunogênicos ativados por cianato distintos;- a reação de pelo menos uma proteína com hidrazina, carboi-drazida, dicloreto de hidrazina, uma diidrazida, ou uma mistura das mesmas,sob condições suficientes para produzir uma solução de pelo menos umaproteína ativada por hidrazida; e- o contato da mistura dos diversos polissacarídeos imunogêni-cos ativados por cianato distintos com pelo menos uma proteína ativada porhidrazida em um pH de cerca de 6 a cerca de 8, de tal forma que os diversospolissacarídeos imunogênicos ativados por cianato distintos simultaneamen-te reajam com pelo menos uma proteína ativada por hidrazida, resultandoem um conjugado imunogênico multivalente complexo que inclui pelo menosuma ligação C-N formada entre cada polissacarídeo imunogênico distintoanexado e a proteína.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o agentede cianilação é selecionado de tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamoniopiridínio, brometo de cianogênio ou tetrafluoroborato de N-ciano-N,N,N-trietilamônio.

20. Método de acordo com a reivindicação 18, em que a reaçãosimultânea dos diversos polissacarídeos imunogênicos ativados por cianatodistintos com pelo menos uma proteína ativada por hidrazida resulta em umacomposição que inclui a mistura dos diversos polissacarídeos imunogênicosativados por cianato distintos e pelo menos uma proteína ativada por hidrazida.

21. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o contatoda mistura dos diversos polissacarídeos imunogênicos ativados por cianatodistintos com pelo menos uma proteína ativada por hidrazida compreende apreparação de uma composição de reação que inclui a mistura dos diversospolissacarídeos imunogênicos ativados por cianato distintos com pelo menosuma proteína ativada por hidrazida.

22. Método de acordo com a reivindicação 18, que ainda com-preende a reação de um segundo grupo de segundos polissacarídeos imu-nogênicos distintos com um agente de cianilação, resultando em uma se-gunda mistura de diversos segundos polissacarídeos imunogênicos ativadospor cianato distintos; e- o contato da segunda mistura de diversos polissacarídeos imu-nogênicos ativados por cianato distintos com o conjugado imunogênico mul-tivalente complexo para formar pelo menos uma ligação C-N entre cada se-gundo polissacarídeo imunogênico ativado por cianato distinto e a proteína.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que a reativi-dade dos segundos polissacarídeos imunogênicos distintos com o agente decianilação é maior do que a reatividade dos primeiros polissacarídeos imu-nogênicos distintos com o agente de cianilação.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que o primeiropolissacarídeo imunogênico distinto é selecionado de pelo menos um dogrupo meningocócico A ou grupo meningocócico C.

25. Método de acordo com a reivindicação 23, em que o segun-do polissacarídeo imunogênico distinto é selecionado de pelo menos um en-tre o grupo meningocócico W135 ou o grupo meningocócico Y.

26. Método para a produção de um conjugado imunogênico mul-tivalente complexo, que compreende:- a reação de uma proteína com 1-amino-2,3-propanodiol (AD-PO) na presença de cloridrato de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etil carbodiimi-da em um pH de cerca de 5,5 a cerca de 7, resultando em uma solução deuma proteína modificada por ADPO;- a reação da proteína modificada por ADPO com um agenteoxidante, resultando em uma solução de uma proteína ativada por aldeído;- o contato de uma mistura de diversos polissacarídeos imuno-gênicos ativados por hidrazida distintos com a proteína ativada por aldeídoem um pH de cerca de 5 a cerca de 8, de tal forma que os diversos polissa-carídeos imunogênicos ativados por hidrazida distintos simultaneamente rea-jam com pelo menos uma proteína ativada por aldeído resultando em umconjugado multivalente complexo que inclui pelo menos uma ligação duplaC=N formada entre cada polissacarídeo imunogênico distinto anexado e aproteína; e- a redução de substancialmente todas as ligações duplas C=Ndo conjugado multivalente complexo em ligações C-N, resultando em umproduto conjugado imunogênico multivalente complexo.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, em que a proteínaé reagida com ADPO em um pH de cerca de 5,5 a cerca de 6,5.

28. Método de acordo com a reivindicação 26, em que a proteínaé reagida com ADPO em um pH de cerca de 6 a cerca de 7.

29. Método para a preparação de uma proteína ativada por hi-drazida, que compreende:- a reação de uma proteína com hidrazina, carboidrazida, cloretode hidrazina, uma diidrazida, ou uma mistura destas, na presença de: (i)uma carbodiimida e (ii) pelo menos um aminoácido, pelo menos um peptí-deo, ou uma mistura de pelo menos um aminoácido e pelo menos um peptídeo.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, em que a carbodi-imida é cloridrato de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etil carbodiimida.

31. Método de acordo com a reivindicação 29, em que o amino-ácido é selecionado de pelo menos um de lisina, arginina, histidina, glicina,serina, treonina, ácido glutâmico ou cisteína.

32. Método de acordo com a reivindicação 29, em que pelo me-nos uma proteína ativada por hidrazida é substancialmente solúvel em pHneutro.

33. Método para a produção de um conjugado imunogênico mul-tivalente complexo que compreende:(a) o contato de pelo menos um primeiro polissacarídeo imuno-gênico ativado por aldeído distinto com pelo menos uma proteína ativada porhidrazida, sob condições suficientes para formar um primeiro intermediárioconjugado, de tal forma que se forme pelo menos uma ligação dupla C=Nentre o primeiro polissacarídeo imunogênico distinto e a proteína;(b) o contato de pelo menos um segundo polissacarídeo imuno-gênico ativado por aldeído distinto com o primeiro intermediário conjugado,de tal forma que se forme pelo menos uma ligação dupla C=N entre o se-gundo polissacarídeo imunogênico distinto e a proteína; e(c) a redução de substancialmente todas as ligações duplas C=Nem ligações C-N, resultando em um produto conjugado imunogênico multiva-lente complexo;em que a reatividade do primeiro polissacarídeo imunogênicoativado por aldeído distinto com a proteína ativada por hidrazida é menor doque a reatividade do segundo polissacarídeo imunogênico ativado por aldeí-do distinto com a proteína ativada por hidrazida.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o primeiropolissacarídeo imunogênico ativado por aldeído distinto é selecionado depelo menos um do grupo meningocócico A ou grupo meningocócico C.

35. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o segun-do polissacarídeo imunogênico ativado por aldeído distinto é selecionado depelo menos um entre o grupo meningocócico W135 ou o grupo meningocó-cico Y.

36. Método de acordo com a reivindicação 34, em que o segun-do polissacarídeo imunogênico ativado por aldeído distinto é selecionado depelo menos um entre o grupo meningocócico W135 ou o grupo meningocó-cico Y.

37. Conjugado imunogênico multivalente complexo preparado deacordo com a reivindicação 1.

38. Conjugado imunogênico multivalente complexo preparado deacordo com a reivindicação 18.

39. Conjugado imunogênico multivalente complexo preparado deacordo com a reivindicação 26.

40. Conjugado imunogênico multivalente complexo preparado deacordo com a reivindicação 33.

41. Composição farmacêutica que compreende o conjugado i-munogênico multivalente complexo como definido na reivindicação 37 e pelomenos um veículo farmaceuticamente aceitável.

42. Composição farmacêutica que compreende o conjugado i-munogênico multivalente complexo como definido na reivindicação 38 e pelomenos um veículo farmaceuticamente aceitável.

43. Composição farmacêutica que compreende o conjugado i-munogênico multivalente complexo como definido na reivindicação 39 e pelomenos um veículo farmaceuticamente aceitável.

44. Composição farmacêutica que compreende o conjugado i-munogênico multivalente complexo como definido na reivindicação 40 e pelomenos um veículo farmaceuticamente aceitável.