CN102014874A - 免疫调节剂颗粒和治疗方法 - Google Patents

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Abstract

刺激受试者体内免疫应答的方法包括将与抗原偶联的微米尺度颗粒给予所述受试者，其中增加所述微米尺度颗粒的长宽比能增加免疫应答。刺激受试者体内免疫应答的方法包括给予所述受试者多个颗粒，其中每个颗粒都与免疫刺激剂和蛋白质偶联。疫苗颗粒组合物包含被构造成能以第一速率释放第一蛋白和以第二速率释放第二蛋白并且被构造成能以单剂量提供初次效能和加强效能的多个颗粒。

Description

免疫调节剂颗粒和治疗方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2008年3月4日申请的美国临时专利申请号61/068,227的权益，所述临时专利申请通过引用全部结合到本文中。
本发明的技术领域
在某些实施方案中，本发明涉及由快速、无细胞生产工艺制备的合成疫苗纳米粒。更具体地讲，在某些实施方案中，所述纳米粒包括抗原和/或免疫增强剂。
发明背景
对于包括疟疾、结核病、炭疽病、土拉菌病、布氏菌病、丙型肝炎感染、组织胞浆菌病、球孢子菌病、病毒性出血热、腺鼠疫、病毒性脑炎、黄热病和病毒性及细菌性肠胃炎在内的许多传染性疾病而言，仍然没有可用的或有效的疫苗。需要新疫苗以对付这些疾病。另外，在抗原变异性和免疫力类型上的挑战也需要新的方法。
在任何适合用做疫苗的组合物中，构象完整性和免疫原性表位和抗原位点的完整保留是必不可少的。在这些分子和化合物的结构构型、化学电荷或空间定向上的改变可能会导致抗原活性和用途的部分或完全丧失。主要需要考虑的是疫苗中的结合载体颗粒具有最少不良反应并仍促进抗原性化合物与免疫系统间相互作用的能力。在将组合物制备成用做疫苗或用做识别特异性受体的生物材料的缀合物时，所有这些因素都得考虑到。
为了诱导针对给定抗原的强免疫应答，需要蛋白质、佐剂或其它免疫增强剂。为了获得最佳免疫应答，抗原和免疫增强剂通常必须共同递送。然而，共同递送技术包括将这两种蛋白质融合在一起，这些技术包括以下缺陷：这两种组分间的物理干扰、每种组分到免疫系统的未受控的呈递，对可用于该技术的融合蛋白和组合物的限制，等等。
其它技术包括使用含有硫酸钾铝、传统的双层或多层脂质体、聚合物颗粒和病毒样颗粒的组合物。这样的技术具有显著缺陷，包括理化稳定性、与宽范围抗原的相容性、不能共同递送抗原和免疫调节剂，以及因基于细胞或鸡胚生产的安全性考虑和重组病毒的风险。因此，需要这样的新疫苗：所述疫苗能同时提供抗体响应和细胞响应，与宽范围的抗原相容，能够共同递送和具有多价性，并且具有安全和可重现的生产工艺，以确保稳定的产品。
发明概述
依据本发明的实施方案，刺激受试者体内免疫应答的方法包括给予所述受试者多个颗粒，其中每个颗粒都与免疫刺激剂和蛋白质偶联。在一个实施方案中，所述给予多个颗粒导致的抗体效价比给予不与所述颗粒偶联的免疫刺激剂和蛋白质所导致的效价高出至少大约10倍。在一个实施方案中，所述多个颗粒的基本上每个颗粒都包含尺寸为大约200nm乘大约200nm乘大约200nm的颗粒。在另一个实施方案中，所述多个颗粒的基本上每个颗粒都包含尺寸为大约2μm乘大约2μm乘大约2μm的颗粒，而且其中所述给予多个颗粒导致的抗体效价比给予不与所述颗粒偶联的免疫刺激剂和蛋白质所导致的效价高出至少大约100倍。
依据本发明的另一实施方案，刺激受试者体内免疫应答的方法包括将与抗原偶联的微米尺度颗粒给予所述受试者，其中增加所述微米尺度颗粒的长宽比能增加免疫应答。在一个实施方案中，所述微米尺度颗粒的长宽比为大约3∶1，所述免疫应答比给予长宽比为大约1∶1的颗粒所导致的免疫应答高出大约2至大约3倍。在一个实施方案中，所述微米尺度颗粒包含尺寸为大约1微米乘大约1微米乘大约3微米的颗粒。在另一个实施方案中，所述微米尺度颗粒包含尺寸为大约2微米乘大约2微米乘大约6微米的颗粒。在又一个实施方案中，所述微米尺度颗粒的长宽比为大约10∶1，所述免疫应答比给予长宽比为大约1∶1的颗粒所导致的免疫应答高出大约3至大约4倍。在一个这样的实施方案中，所述微米尺度颗粒包含尺寸为大约1微米乘大约1微米乘大约10微米的颗粒。
依据本发明的另一实施方案，通过降低由与纳米尺度颗粒偶联的抗原所导致的免疫应答的方法包括增加所述纳米尺度颗粒的长宽比。
在本发明的某些其它实施方案中，基本上抑制由给予受试者的免疫刺激剂所导致的免疫应答的方法包括在将所述免疫刺激剂给予所述受试者之前，使所述免疫刺激剂通过非降解性接头与颗粒偶联。在一个实施方案中，所述方法导致在将所述免疫刺激剂初次给予所述受试者之后基本上能抑制免疫应答。在另一个实施方案中，所述方法导致在将所述免疫刺激剂加强给予所述受试者之后基本上能抑制免疫应答。
本发明的某些实施方案的疫苗颗粒组合物包括被构造成能以第一速率释放第一蛋白和以第二速率释放第二蛋白并且被构造成能以单剂量提供初次效能和加强效能的多个颗粒。
附图简述
图1显示初次注射本发明一个实施方案的疫苗颗粒后3周的应答，其中对于200nm疫苗颗粒，抗体水平为1,280；对于2微米疫苗颗粒，抗体水平为10,240；对于r蛋白(rProtein)，抗体水平为101；
图2显示初次注射本发明一个实施方案的疫苗颗粒后的另一应答；
图3显示初次注射本发明一个实施方案的疫苗颗粒后的又一应答；
图4显示在初次注射后，对本发明一个实施方案的疫苗颗粒的应答，比较非降解性接头和降解性接头；
图5显示在加强注射后，对本发明一个实施方案的疫苗颗粒的应答，比较非降解性接头和降解性接头；
图6显示本发明一个实施方案的80nm x 80nm x 360nm聚(二甲基氨基甲基丙烯酸酯)(PLGA)疫苗颗粒；
图7显示本发明一个实施方案的疫苗颗粒的生物素-抗生物素蛋白连接系统的示意图；和
图8显示本发明一个实施方案的血细胞凝集测定，表明对以下进行比较的组合图像：(1)包被小鼠血清白蛋白的200nm x 200nm x 200nm疫苗颗粒(对照)；(2)包被HA蛋白的200nm x 200nm x 200nm疫苗颗粒(活性物质(Active))；(3)HA蛋白阳性对照；和(4)阴性对照，其中血细胞凝集显示在画出的孔中，表明颗粒表面HA蛋白的存在。
本发明实施方案的详述
本发明的某些实施方案通过纳米粒成型技术(nanoparticle molding technique)产生疫苗。一个令人惊奇的结果就是，将抗原，例如流感HA(“HA”)(来自Protein Sciences Corporation的流感WyomingHA蛋白)与免疫刺激或增强剂例如鞭毛蛋白或IL-12(eBiosciences，Inc.)组合在纳米粒上或其中，可触发强烈的适应性免疫应答。此外，在某些实施方案中的抗原和/或免疫增强剂(在下文中称为“免疫增强剂”)可包装在纳米粒内或展示在纳米粒外面，正如可为了特定用途和/或抗原/免疫增强剂组合而进行优化。此外，在某些实施方案中，免疫增强剂与纳米粒抗原组分的比例可被构造成能用于特定用途并可针对特定用途加以调整。在某些实施方案中，可将一种或多种免疫增强剂与纳米粒和一种或多种抗原包括在一起。在又一些实施方案中，所述纳米粒也可包括细胞特异性或组织特异性结合或靶向剂。
Figure BPA00001254367300041
技术(Liquidia Technologies，North Carolina)是一种纳米粒生产工艺，该工艺独有地允许控制颗粒大小、形状、组成、表面官能度和其它物理特性例如模数等。在本发明的某些实施方案中使用该技术，允许用于独特的共同递送策略、形状特异性和大小特异性免疫原性、生物货物(biological cargo)例如抗原和免疫增强剂的无病毒递送、合成递送载体和多种递送途径，包括腹腔、鼻腔、口服、皮下、皮内、肌内、腹膜内、吸入等。
本发明某些实施方案的纳米粒组合物可被构造成能延时释放不同剂量抗原和/或抗原和免疫增强剂组分，以优化与免疫系统和抗体形成的相互作用。在某些实施方案中，所述纳米粒组合物可构造成能以预定速率和/或响应预定环境条件(例如pH、含水环境、特定酶等)而降解。在某些实施方案中，可通过预选交联剂和/或交联剂密度而使纳米粒转向降解，以促进颗粒在预选环境中或以预选降解速率而降解。在某些实施方案中，纳米粒可包含不同种类和数量的表面免疫增强剂，以筛选、结合或掩蔽来往于所需细胞的颗粒。也可设计本发明某些实施方案的纳米粒，即通过控制纳米粒的聚合物基质，在纳米粒分解之前将抗原递送到胞内空间，因此提供抗原和/或抗原/免疫增强剂的胞内递送。本发明某些实施方案的组合物可包含生物降解材料、亲水材料、GRAS(通常被认为是安全的)材料等。在某些实施方案中，本发明的颗粒可包含聚(乙二醇)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚己内酯等或者由它们而形成。
在某些实施方案中，颗粒组合物包含抗原和免疫增强剂两者。在某些实施方案中，颗粒组合物仅包含抗原或免疫增强剂中的一种。在某些实施方案中，使一种或多种抗原或免疫增强剂缀合在纳米粒表面。在某些实施方案中，可通过控制形成纳米粒的或与纳米粒表面缀合的组合物而控制免疫增强剂与抗体的比率。
在某些实施方案中，表面上的抗原量占颗粒重量的大约0至大约50％。在某些实施方案中，表面上的抗原量占颗粒重量的大约0至大约40％。在某些实施方案中，表面上的抗原量占颗粒重量的大约0至大约30％。在某些实施方案中，表面上的抗原量占颗粒重量的大约0至大约20％。在某些实施方案中，表面上的抗原量占颗粒重量的大约0.1至大约20％。在某些实施方案中，表面上的抗原量占颗粒重量的大约0.1至大约10％。
在某些实施方案中，所述免疫增强剂占抗原量的大约0至大约70％。在某些实施方案中，所述免疫增强剂占抗原量的大约0至大约60％。在某些实施方案中，所述免疫增强剂占抗原量的大约0至大约50％。在某些实施方案中，所述免疫增强剂占抗原量的大约0至大约40％。在某些实施方案中，所述免疫增强剂占抗原量的大约0至大约30％。在某些实施方案中，所述免疫增强剂占抗原量的大约0至大约20％。在某些实施方案中，所述免疫增强剂占抗原量的大约0至大约10％。在某些实施方案中，所述免疫增强剂占抗原量的大约0.1至大约30％。在某些实施方案中，所述免疫增强剂占抗原量的大约0.1至大约20％。在某些实施方案中，所述免疫增强剂占抗原量的大约0.1至大约10％。
在某些实施方案中，本发明的纳米粒提供颗粒介导的控制释放，其可改进应答并降低针对当前免疫调节性疫苗技术的反应原性。也可构造某些实施方案的纳米粒，以产生剂量有节制的(dose-sparing)和加强有节制的(boost sparing)方案以及增加产品稳定性和货架期，例如通过操纵基质组合物。在某些实施方案中的免疫调节性疫苗的纳米粒包装可进一步最小化或控制在预选环境条件下的体内分解。本发明某些实施方案中的纳米粒进一步提供在单个纳米粒中或者在包含单剂量或多剂量的多个纳米粒中的额外免疫调节剂和/或抗原的潜在共同包装。
在又一些实施方案中，本发明的纳米粒提供多价疫苗和Th1/Th2调节。在某些实施方案中，所述纳米粒也可产生颗粒介导的递送，通过内涵体逃逸(endosomal escape)递送到细胞溶胶，允许抗原的有效呈递，用于T细胞诱导。本发明某些实施方案的纳米粒也可提供在单个颗粒中或其上鞭毛蛋白和免疫原的共同包装，其可无需融合蛋白。在某些实施方案中，在本发明的纳米粒增强对鞭毛蛋白和/或免疫原正确构象的维持，增加APC寻靶，降低对剂量的需求，降低反应原性，其组合等。在某些实施方案中，在本发明纳米粒上增强鞭毛蛋白和/或免疫原的正确构象，因为在颗粒制造并使用所有含水条件和化学后，免疫原和/或鞭毛蛋白连接在颗粒上。
在某些实施方案中，通过引用结合在本文中的纳米粒成型技术(
Figure BPA00001254367300071
(Liquidia Technologies，Inc.North Carolina))中所述的纳米粒制造允许在颗粒基质内容易地掺入许多生物剂，包括抗原、免疫调节、佐剂和其它免疫增强剂。在某些实施方案中，纳米粒成型技术也允许将靶向配体连接在颗粒表面。对于某些实施方案的疫苗应用，靶向所述治疗剂降低具有系统反应原性的机会和/或减少对剂量的需求。在本发明的某些实施方案中，颗粒在某一表面、在所有表面或在颗粒内部，含有一种或多种免疫增强剂和一种或多种抗原。在某些实施方案中，颗粒包含一种或多种目标抗原、免疫增强剂和靶向剂。在某些实施方案中，纳米粒成型技术也允许用于多价疫苗。在某些实施方案中，纳米粒含有或包含多种疫苗抗原。
在某些实施方案中，包括这样的纳米粒：所述纳米粒使得抗原和免疫增强剂物理分离。在某些实施方案中，用于物理分离抗原和免疫增强剂的一项技术包括包封抗原并用免疫增强剂使颗粒表面官能化，或反过来。在某些实施方案中，用于物理分离抗原和免疫增强剂的另一项技术包括将抗原和免疫增强剂两者连接在同一颗粒表面的不同区域，使颗粒连接在抗原和免疫增强剂之间。在某些实施方案中，这允许保留蛋白质形状，即构象，这对于产生合适的免疫应答(例如用于抗体诱导)是至关重要的，而且对于免疫增强剂活性而言是必不可少的。
在本发明的某些实施方案中，根据所包含的免疫增强剂，设计所述颗粒，以使免疫应答偏向Th1或Th2偏性。在某些实施方案中，设计颗粒基质的降解，以诱导给定应答。在某些实施方案中，设计所述颗粒，以在核内体中降解，捕获它并产生CD8响应。在某些实施方案中，设计所述颗粒，使其在核内体/溶酶体途径中分解并呈递给CD4T细胞，最终诱导更多抗体应答。
在某些实施方案中，设计所述颗粒，从而以不同速率释放两种或更多种蛋白质。在某些实施方案中，两种或更多种蛋白质中的每一种都以不同速率释放。在某些实施方案中，调整释放速率，使单个纳米粒设计可在同一剂量中提供初次和加强效能。在某些实施方案中，设计某些颗粒，以快速释放某些蛋白质，而与纳米粒结合或连接的其它蛋白质则慢速释放。在某些实施方案中，所述货物(cargo)被掩蔽，以增加随后强化效能。在某些实施方案中，保护所述货物以免在体内分解，因而改善效能并可能会导致对剂量需求的降低。
在某些实施方案中，可对本发明疫苗颗粒进行工程化改造，使其具有特定形状，以诱导所需的、增加的或减少的抗体反应。在某些情况下，高长宽比的颗粒与较低长宽比的颗粒相比能引发更大的免疫原性反应。在其它情况下，较低长宽比引发更大的免疫原性反应。长宽比是指颗粒的最长轴与最短轴之比。在某些实施方案中，优选的颗粒形状可以随摄取机制、抗原、免疫刺激剂、反应类型等而变。在某些实施方案中，优选具有更大的表面/体积比的颗粒形状。
在某些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为至少大约1∶1。在某些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为至少大约2∶1。在某些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为至少大约3∶1。在某些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为至少大约4∶1。在某些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为至少大约5∶1。在某些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为至少大约6∶1。在某些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为至少大约7∶1。在某些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为至少大约8∶1。在某些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为至少大约9∶1。在某些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为至少大约10∶1。依据某些实施方案，可将疫苗颗粒制造成长宽比范围为大约1∶1至大约60∶1。在替代实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比范围为大约1∶1至大约50∶1。在其它实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比范围为大约1∶1至大约40∶1。依据某些实施方案，可将疫苗颗粒制造成长宽比范围为大约1∶1至大约30∶1。在再一些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比范围为大约1∶1至大约20∶1。在再一些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比范围为大约1∶1至大约15∶1。在再一些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比范围为大约1∶1至大约10∶1。在再一些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比范围为大约1∶1至大约9∶1。在再一些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比范围为大约1∶1至大约8∶1。在再一些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比范围为大约1∶1至大约7∶1。在再一些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比范围为大约1∶1至大约6∶1。在再一些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比范围为大约1∶1至大约5∶1。在再一些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比范围为大约1∶1至大约4∶1。在再一些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比范围为大约1∶1至大约3∶1。在再一些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比范围为大约1∶1至大约2∶1。在某些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为大约1∶1。在某些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为大约2∶1。在某些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为大约3∶1。在某些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为大约4∶1。在某些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为大约5∶1。在某些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为大约6∶1。在某些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为大约7∶1。在某些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为大约8∶1。在某些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为大约9∶1。在替代实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为大约10∶1。在其它实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为大约15∶1。在其它实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为大约20∶1。依据某些实施方案，可将疫苗颗粒制造成长宽比为大约30∶1。在又一些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为大约40∶1。在再一些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为大约50∶1。在再一些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为大约60∶1。在再一些实施方案中，可将疫苗颗粒制造成长宽比为大于大约60∶1。
因此，可将本发明疫苗颗粒制造成具有控制在纳米尺度上的任意尺寸。例如，可将具有上述长宽比的本发明疫苗颗粒制造成尺寸为大约80nm x大约90nm的圆柱状颗粒；尺寸为大约80nm x大约80nmx大约360nm的颗粒；尺寸为大约80nm x大约80nm x大约2000nm的颗粒；尺寸为大约80nm x大约80nm x大约5000nm的颗粒；尺寸为大约1微米x大约1微米的颗粒；尺寸为大约1微米x大约3微米的圆柱状颗粒；和尺寸为大约1微米x大约10微米的颗粒。
与接受两种可溶性蛋白质混合物的小鼠所产生的反应相比，共同递送HA和IL-12的本发明某些实施方案的疫苗颗粒(例如实施例2的颗粒)诱导针对HA蛋白的更强烈抗体反应，如图1所示。在某些实施方案中抗体反应的增加范围为大约10至大约100倍的增加。另外，在某些实施方案中，颗粒大小影响抗体应答。如图1所示，在初次注射后3周，可溶性蛋白产生大约100抗体效价的应答，本发明的200nmx 200nm x 200nm疫苗颗粒产生大约1280抗体效价的应答，而本发明的2微米x 2微米x 2微米疫苗颗粒产生大约10,240抗体效价的应答。在某些实施方案中，可在形状、大小和长宽比方面来调整本发明疫苗颗粒，以有效地共同递送抗原和蛋白质佐剂并获得所需免疫原性。
依据其它实施方案，本发明疫苗纳米粒的长宽比可影响针对疫苗纳米粒而产生的应答。在某些实施方案中，在初次注射后，随着疫苗纳米粒的长宽比的增加，在其表面偶联有流感HA的微米尺度的疫苗纳米粒的长宽比产生增加的免疫应答，如图2所示。在某些实施方案中，长宽比大约3∶1的颗粒的免疫应答是长宽比为1∶1的颗粒的免疫应答的大约2-3倍。在某些实施方案中，长宽比大约10∶1的微米尺度颗粒的免疫应答是长宽比为1∶1的微米尺度颗粒的免疫应答的大约3-4倍。单次注射后诱导的抗体反应见图2。
在某些实施方案中，纳米尺度疫苗颗粒的长宽比导致在初次注射之后，免疫应答随其表面偶联流感HA的疫苗颗粒的长宽比增加而降低，如图3所示。图3所示的疫苗颗粒组合物包括交联聚乙二醇(PEG)基的(由79％聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、20％甲基丙烯酸氨基乙基酯盐酸盐、1％HCPK组成，然后通过生物素接头表面修饰进行表面处理)。
在某些实施方案中，本发明的疫苗颗粒是在低表面能模具中成型，利用以下专利申请中所描述的方法和材料：2006年6月19日申请的美国专利申请顺序号10/583,570和2006年11月7日申请的美国专利申请顺序号11/594,023；和2004年12月20日申请的PCT国际专利申请顺序号PCT/US04/42706；2006年6月19日申请的PCT/US/06/23722；2006年9月7日申请的PCT/US06/34997；2006年11月7日申请的PCT/US06/43305；和2007年1月29日申请的PCT/US07/02476；所述文献各自通过引用全部结合到本文中。另见2003年12月19日申请的美国临时专利申请顺序号60/531,531；2004年6月25日申请的60/583,170；2004年8月27日申请的60/604,970；2005年6月17日申请的60/691,607；2005年9月7日申请的60/714,961；2006年1月27日申请的60/762,802；2006年5月9日申请的60/798,858；2005年11月7日申请的60/734,228；2006年1月9日申请的60/757,411；2006年5月12日申请的60/799,876；2006年7月27日申请的；2007年10月12日申请的60/979,710和2006年10月9日申请的60/828,719；所述文献各自通过引用全部结合到本文中。
在某些实施方案中，将本发明的疫苗颗粒配制成不产生免疫应答。某些实施方案的颗粒的免疫原性可通过使用接头基团化学将抗原和/或免疫增强剂与颗粒缀合而得以控制。具体地讲，在某些实施方案中，免疫原性可通过接头基团的降解动力学而得以控制。与用含有经非降解性键与其表面连接的HA的颗粒注射的小鼠相比，在用含有经降解性二硫化物交联剂与其表面连接的HA的颗粒注射的小鼠中，发现更高的抗体反应。在初免注射和加强注射之后均可观察到这一效果。
依据某些实施方案，如图4和图5所示，通过非降解性交联接头与纳米粒连接的蛋白质不产生活性或产生有限活性，而通过降解性交联接头连接的蛋白质则产生应答。在某些实施方案中，纳米粒具有通过非降解性交联剂与其连接的佐剂，使得对于该佐剂不产生免疫应答，或产生最小的免疫应答。这可有助于维持佐剂对多次注射的作用，仅通过将佐剂经非降解性接头与纳米粒连接，允许使用高效力佐剂而更少考虑所含数量，允许使用通常能触发不良反应的佐剂，等等。如图4所示，当用降解性接头来连接时，在接受包被有HA蛋白的疫苗纳米粒的小鼠中产生抗HA抗体的应答；但当HA蛋白用非降解性接头连接时，在初次注射后却没有产生可检测的应答。用200nm x 200nm x 200nm疫苗颗粒和2微米x 2微米x 2微米的疫苗颗粒都可观察到这些结果。第二次注射之后，如图5所示，用含有经非降解性接头连接的HA蛋白的颗粒，抗HA抗体的应答是可检测到的，然而，比起用具有经降解性接头连接的HA的200nm疫苗颗粒所产生的应答，200nm疫苗颗粒的应答要小大约3-4倍，而且比起用具有经降解性接头连接的HA的2微米疫苗颗粒所产生的应答，2微米疫苗颗粒的应答要小大约5-6倍。
依据本发明的某些实施方案，可以用非降解性接头连接剂、抗原、分子等构成疫苗颗粒，对于这些非降解性接头连接剂、抗原、分子等，不希望产生免疫应答或仅产生有限的免疫应答。例如，可将靶向剂或其它蛋白质或分子通过非降解性接头连接在本发明的疫苗颗粒上并且疫苗颗粒上所述免疫增强剂的存在将不会诱导免疫应答或者将会诱导有限的免疫应答。
在某些实施方案中，以特定形式递送抗原，以改进针对抗原的免疫应答。在某些实施方案中，佐剂和/或免疫增强剂的剂量是不同的，以给出合适的应答。在某些实施方案中，调整剂量，以有节制地给出免疫原性免疫调节剂，同时又不必减少所递送的抗原量。在某些实施方案中，将反应原性蛋白包封在颗粒内。在某些实施方案中，颗粒靶向目标细胞。在某些实施方案中，所述细胞是抗原呈递细胞。在其它实施方案中，设计颗粒，使其摄入胞内，一旦颗粒内在化就被降解。在某些实施方案中，可用一种或多种抗原、免疫增强剂和靶向配体使颗粒表面官能化。在某些实施方案中，将一种或多种抗原、免疫增强剂和靶向配体通过降解性接头基团连接在表面上。在某些实施方案中，将一种或多种抗原、免疫增强剂和靶向配体通过非降解性接头基团连接在表面上。在某些实施方案中，将一种或多种抗原、免疫增强剂和靶向配体通过降解性接头基团连接在表面上，而将其它通过非降解性接头基团连接在表面上。例如，在一个实施方案中，PGLA纳米粒可具有连接在表面的不同数量的HA、IL-12和细胞靶向配体；可将HA和IL-12通过降解性接头基团而连接，并且可将细胞靶向配体通过非降解性接头基团而连接。
用于本发明纳米粒疫苗的抗原可以是任何类型的抗原，例如包括但不限于病原体相关抗原、肿瘤相关抗原、变应原相关抗原、神经缺损相关抗原、心血管病抗原、类风湿性关节炎相关抗原、其它疾病相关抗原、激素、妊娠相关抗原、胚胎抗原和/或胎儿抗原等。在一个实施方案中，所述纳米粒疫苗是重组蛋白、或重组脂蛋白、或重组糖蛋白以及一种或多种抗原。
可将本发明的纳米粒疫苗给予有需要的受试者以触发针对目标抗原的免疫应答和抗体形成。可通过以下方式给予所述纳米粒疫苗：注射、吸入、经皮、经粘膜、肛门、阴道、眼、摄食、静脉内、其组合等。在某些实施方案中，病毒抗原/免疫增强剂纳米粒产物，例如抗原-鞭毛蛋白纳米粒，可产生甚至针对并非很强免疫原性的目标(包括病毒蛋白质的高度保守区)的应答。
给予人类受试者或动物受试者后，本发明某些实施方案的纳米粒疫苗可与例如树突细胞和巨嗜细胞相互作用。这样的相互作用将会有两个结果：第一，纳米粒疫苗的免疫刺激剂部分将与信号转导途径相互作用并刺激信号转导途径，例如NF-kappa.B、JNK和/或p38途径。第二，因为这类与受体的相互作用，纳米粒疫苗将会通过吞噬、胞吞或巨胞饮(macropinocytosis)而摄入到树突细胞和巨嗜细胞中，这取决于细胞类型、纳米粒疫苗的大小和刺激剂的特性。其次，信号转导途径的活化将会导致诱导树突细胞和巨嗜细胞(和在某些情况下，B细胞)表达细胞因子、趋化因子、粘附分子和共同刺激分子。对纳米粒的摄取将会导致对包含在纳米粒中或其上的抗原的加工以及MHC I类分子和MHC II类分子的呈递。这将会产生幼稚T细胞活化所需的两种信号：特异性抗原信号和共同刺激信号。另外，纳米粒疫苗所诱导的趋化因子将会使幼稚T细胞募集到APC和细胞因子(例如IL-12)，其可诱导T细胞分化为Th-1效应细胞。结果，将会诱导强烈T细胞免疫应答，这反过来又将会活化适应性免疫应答的其它方面，例如抗原特异性B细胞和巨嗜细胞的活化。
在某些实施方案中，适用于本发明的材料可在下列文献中找到：美国专利号US7,285,535，名称为Toll/interleukin-1receptor adapter protein(TIRAP)(Toll/白介素-1受体连接物蛋白(TIRAP))；和US6,960,343，名称为Toll/interleukin-1receptor adapter protein(TIRAP)(Toll/白介素-1受体连接物蛋白(TIRAP))；和已公布的美国申请US20070160623，名称为Innate immune system-directed vaccines(天然免疫系统定向疫苗)；US20070122421，名称为Innate immune system-directed vaccines(天然免疫系统定向疫苗)；US20060188933，名称为IRAK-M is a negative regulator of toll-like receptor signaling(IRAK-M是toll样受体信号转导的负调节剂)；US20060130164，名称为Toll/interleukin-1receptor adapter protein(TIRAP)(Toll/白介素-1受体连接物蛋白(TIRAP))；US20060121460，名称为Toll-like receptor 11(Toll样受体11)；US20050163764，名称为Treatment with agonists of toll-like receptors(用toll样受体激动剂进行治疗)；US20030232055，名称为Innate immune system-directed vaccines(天然免疫系统定向疫苗)；US20030224388，名称为RIP2：a mediator of signaling in the innate and adaptive immune systems(RIP2：天然和适应性免疫系统中信号转导的介导物)；US20030175287，名称为Innate immune system-directed vaccines(天然免疫系统定向疫苗)；US20030157539，名称为IRAK-Mis a negative regulator of toll-like receptor signaling(IRAK-M是toll样受体信号转导的负调节剂)；US20030023993，名称为Toll/interleukin-1receptor adapter protein(TIRAP)(Toll/白介素-1受体连接物蛋白(TIRAP))；和US20020061312，名称为Innate immune system-directed vaccines(天然免疫系统定向疫苗)；所述文献各自通过引用全部结合到本文中，用于其中公开的所有目的。在某些实施方案中，上述所结合的参考文献中的某些信息包括免疫刺激蛋白或免疫增强剂、抗原、融合蛋白、递送技术、剂量方案等。
用于本发明的更多材料可包括美国专利号7,060,284，其中讨论了包含多肽和多核苷酸的组合物用于刺激免疫系统和用于治疗HER-2蛋白过量表达相关的恶性肿瘤；Brennan等，“Cowpea Mosaic Virus as a Vaccine Carrier of Heterologous Antigens(豇豆花叶病毒作为异源抗原的疫苗载体)，”Mol.Biotechnol.17(1)：15-26(2001)，其中讨论了嵌合病毒颗粒作为异源抗原的载体；授予Adams等人的美国专利号6,060,064，其中讨论了使用蛋白质载体用于展示免疫原性氨基酸序列，用作疫苗；授予Frey等人的美国专利号6,086,881，其中描述了包含金属氧化物颗粒的其它多价疫苗构建体；授予Speaker等人的美国专利号5,686,113，其中描述了基于多糖的精胺，藻酸盐胶囊，它们是非合成的；授予Schwendeman等人的美国专利号6,326,021，其中描述了合成的聚乙交酯-共-丙交酯生物相容性基础聚合物；授予Barchfeld等人的美国专利号5,709,879；授予Betbeder等人的美国专利号6,342,226；授予Popescu等人的美国专利号6,090,406；和Lian等人，Trends and Developments in Liposome Drug Delivery Systems(脂质体药物递送系统的趋势和发展)，J.of Pharma.Sci.90(6)：667-680(2001)和van Slooten等人，Liposomes Containing Interferon-gamma as Adjuvant in Tumor Cell Vaccines(肿瘤细胞疫苗中含有干扰素-γ作为佐剂的脂质体)，Pharm Res.17(1)：42-48(2000)，其中描述了纳米粒载体用作由脂质或其它脂肪酸制备而来的疫苗；和Kreuter，“Nanoparticles and Microparticles for Drug and Vaccine Delivery(用于药物和疫苗递送的纳米粒和微粒)，”J.Anat.189：503-505(1996)，其中描述了非脂质组合物；所述文献各自通过引用全部结合到本文中，用于其中公开的所有目的。
“疫苗”可指包含抗原和任选其它辅助分子的组合物，其目的是将所述组合物给予受试者以刺激专门针对所述抗原的免疫应答并优选造成免疫记忆，导致在未来某个时刻当受试者遇到该抗原时将会产生免疫应答。其它辅助分子的实例是作为非特异性免疫刺激分子的佐剂和改善抗原的药代动力学和/或药效动力学特性的其它分子。常规地，疫苗通常包含引起疾病的生物体(经适当减毒或杀死的)或病原生物体的某些部分作为抗原。减毒生物体，例如减毒病毒或减毒细菌，经操纵后使其丧失在其自然宿主中生长的某些或全部能力。目前有多种生物技术方法用于产生疫苗。(参见例如W.Bains(1998)Biotechnology From A to Z，第2版，Oxford University Press)；其通过引用全部结合到本文中。
“抗原”是指由适应性免疫系统的抗原受体特异性识别的物质。因此，本文所用的术语“抗原”包括抗原、抗原的免疫原性衍生物或部分和衍生自抗原的免疫原性分子。优选地，本发明所用的抗原是分离的抗原。具体用于本发明的抗原包括但不限于病原体相关的、变应原相关的或疾病相关的那些。
抗原也是在任何潜伏期(通常在人体内为数天至数周)之后诱导敏感性和/或免疫应答状态并以可证明方式在体内或体外与致敏受试者的抗体和/或免疫细胞发生反应的物质。抗原的实例包括但不限于微生物相关抗原，尤其是病原体抗原，例如病毒、真菌或细菌，或衍生自它们的免疫原性分子；包括含有正常移植抗原和/或肿瘤相关抗原的细胞在内的细胞抗原；RR Rh抗原；特定细胞或组织或体液的特征抗原或者对特定细胞或组织或体液的具有特异性的抗原；和变应原相关抗原，例如与环境变应原相关的那些(例如草、花粉、霉菌、粉尘、昆虫和皮屑)、职业性变应原(例如乳胶、皮屑、尿烷、环氧树脂)、食物(例如贝类、花生、蛋类、乳制品)、药物(例如抗生素、麻醉剂)和疫苗(例如流感疫苗)。
T淋巴细胞对所展示肽的抗原加工和识别大部分取决于抗原的氨基酸序列，而不是抗原的三维结构。因此，用于本发明纳米粒疫苗的抗原部分可含有表位或特异性目标结构域，而非完整序列。事实上，本发明纳米粒疫苗的抗原部分可包含抗原的一个或多个免疫原性部分或衍生物，而非完整抗原。另外，本发明的纳米粒疫苗可含有具有完整三维结构的完整抗原或保留抗原决定簇的三维结构的抗原部分，以产生针对抗原空间表位的抗体应答。
病原体相关抗原。病原体相关抗原的具体实例包括但不限于选自以下的抗原：牛痘、禽痘病毒、火鸡流感病毒、牛白血病病毒、猫白血病病毒、禽流感、鸡肺病毒、犬细小病毒、马流感、FHV、新城疫病毒(NDV)、Chicken/Pennsylvania/1/83流感病毒、感染性支气管炎病毒；登革热病毒、麻疹病毒、风疹病毒、假狂犬病、Epstein-Barr病毒、HIV、SIV、EHV、BHV、HCMV、汉坦(Hantaan)、破伤风梭菌(C.tetani)、腮腺炎、麻疹病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、人巨细胞病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、人乳头瘤病毒、流感病毒、沙门氏菌、奈瑟氏菌、包柔氏螺旋体(Borrelia)、衣原体、博德特氏菌(Bordetella)以及疟原虫和弓形体、隐球菌、链球菌、葡萄球菌、嗜血杆菌、白喉、破伤风、百日咳、埃希氏菌、念珠菌、曲霉、内阿米巴、贾第鞭毛虫和锥虫。
癌症相关抗原。本发明的方法和组合物也可用于产生针对肿瘤相关蛋白抗原的疫苗，所述抗原例如黑素瘤相关抗原、乳癌相关抗原、结直肠癌相关抗原、前列腺相关抗原等。
用于所述疫苗的肿瘤相关性或组织特异性蛋白质抗原的具体实例包括但不限于选自以下的抗原：前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、Her-2、表皮生长因子受体、gpl20和p24。为了使肿瘤产生增殖细胞和恶性细胞，它们必须形成血管。阻止肿瘤血管形成的策略具有成为治疗药的潜力。本发明的方法和组合物也可用于产生针对肿瘤血管形成的纳米粒疫苗。用于这类纳米粒疫苗的靶抗原的实例是血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体、成纤维细胞生长因子和成纤维细胞生长因子受体等。
变应原相关抗原。本发明的方法和组合物可用于预防或治疗变态反应和哮喘。依据本发明，可将一种或多种蛋白质变应原与一种或多种纳米粒或免疫刺激剂连接，产生免疫刺激剂/抗原嵌合构建体，并将其给予对抗原过敏的受试者。因此，本发明的方法和组合物也可用于构建可抑制变态反应的纳米粒疫苗。
可用于本发明方法和组合物的变应原相关蛋白抗原的具体实例包括但不限于：源自花粉的变应原，例如源自树木的那些，例如日本扁柏(柳杉属(Cryptomeria)，日本柳杉(Cryptomeria japonica))、牧草(禾本科(Gramineae))，例如果园草(鸭茅属(Dactylis)，鸭茅(Dactylis glomerata))、野草例如豚草(豚草属(Ambrosia)，豚草(Ambrosia artemisiifolia))；花粉变应原的具体实例包括日本扁柏花粉变应原Cryj1(J.Allergy Clin.Immunol.(1983)71：77-86)和Cry j 2(FEBS Letters(1988)239：329-332)，其通过引用全部结合到本文中，和豚草变应原Amb a I.1、Amba I.2、Amb a I.3、Amnb a I.4、Amb a II等；源自真菌(曲霉、念珠菌、链格孢菌等)的变应原；源自螨虫的变应原(尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)、粉尘螨(Dermatophagoides farinae)等的变应原)；螨虫变应原的具体实例包括Der p I、Der p II、Der p III、Der p VII、Der f I、Der f II、Der f III、Der f VII等)；室内灰尘；源自动物皮屑、粪便和毛发的变应原(例如猫变应原Fel d I)；源自昆虫的变应原(例如鳞毛或蛾、蝶、摇蚊的鳞屑等，黄蜂例如金环胡蜂(Vespa mandarinia)的蜂毒)；食物变应原(蛋、奶、肉、海鲜、豆类、谷物水果、坚果和蔬菜类等)；源自寄生虫(例如蛔虫和线虫，例如异尖线虫(Anisakis))的变应原；以及基于蛋白质或肽的药物(例如胰岛素)。
其它疾病抗原。本发明还涵盖针对并非癌症、变态反应和哮喘的疾病相关抗原的纳米粒疫苗。作为许多实例中的一个实例和并非限制性实例，β-淀粉样蛋白前体蛋白(称为“淀粉样蛋白-β肽”)的蛋白质裂解产物的胞外累积，与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)的发病机制相关(Janus等，Nature(2000)408：979-982；Morgan等，Nature(2000)408：982-985)；其通过引用全部结合到本文中。因此，用于本发明纳米粒疫苗的嵌合构建体可包含淀粉样蛋白β肽，或淀粉样蛋白β肽的抗原结构域，作为构建体的抗原部分。
“免疫增强剂”或“免疫刺激剂”或“免疫增强剂”可指在微生物、而非人体中发现的一种分子类型，其可触发天然免疫应答。因此，本文所用的该术语包括任何这样的微生物分子类型并且不限于病原微生物相关的那些。本文所用的该术语包括作为潜在的天然免疫应答启动者的结构或其衍生物。免疫刺激结构可在以下分子中发现或由以下分子组成：包括但不限于脂多糖；磷脂酰胆碱；细胞因子佐剂；聚糖，包括肽聚糖；磷壁酸，包括脂磷壁酸；蛋白质，包括脂蛋白和脂肽；外膜蛋白(OMP)、外表面蛋白(OSP)和细菌细胞壁的其它蛋白组分；细菌DNA；单链和双链病毒RNA；非甲基化CpG-DNA；甘露聚糖；分枝杆菌膜；孔蛋白；和各种各样的其它细菌和真菌的细胞壁组分，包括在酵母菌中发现的那些。
本文所用的免疫刺激剂是由一大类微生物共享的分散的分子结构。它们通常是微生物代谢的保守产物，其不受限于抗原变异性并且不同于自体抗原，参见Medzhitov等(1997)Current Opinion in Immunology 9：4；其通过引用全部结合到本文中。
免疫刺激剂可由以下分子类型组成或在以下分子类型中发现，但不限于以下分子类型：脂多糖(LPS)、孔蛋白、脂质A相关蛋白(LAP)、脂多糖、菌毛蛋白、非甲基化CpG基序、细菌DNA、双链病毒RNA、甘露聚糖、细胞壁相关蛋白、热激蛋白、糖蛋白、脂质、细胞表面多糖、聚糖(例如肽聚糖)、磷脂酰胆碱、磷壁酸(例如脂磷壁酸质)、分枝杆菌细胞壁组分/膜、细菌脂蛋白(BLP)、外膜蛋白(OMP)和外表面蛋白A(Osp A)。其它有用的佐剂公开于Henderson等(1996)Microbiol.Review 60：316；Medzhitov等(1997)Current Opinion in Immunology 9：4-9)；The European Medicines Agency Evaluation of Medicines for Human Use，2005年1月20日，http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/vwp/13471604en.pdf；所述文献各自通过引用全部结合到本文中。
在本发明的一个实施方案中，优选的本发明免疫刺激剂包括含有DNA编码的蛋白质组分的那些，例如BLP、奈瑟氏菌孔蛋白、OMP和OspA。一种用于本发明的免疫刺激剂是BLP，因为已知BLP能诱导天然免疫应答的活化(Henderson等(1996)Microbiol.Review 60：316)并已证明能被免疫系统识别(Aliprantis等(1999)Science 285：763)；所述文献各自通过引用全部结合在本文中。
本发明也包括筛选多种免疫增强剂、抗原和/或靶向剂的方法，即通过大规模分批或连续工艺来制造相同或不同组合物的多个纳米粒。纳米粒可仅包含免疫增强剂/抗原作为纳米粒的全部组合物或者组合免疫增强剂/抗原可与第三组合物混合或包封在第三组合物中，其可提供所需的体内活性。这样的所需体内活性可包括但不限于增加循环时间，掩蔽以防降解，掩蔽以防不良免疫应答，与细胞膜交联，胞内降解，其组合等。此外，纳米粒可由抗原制造，然后可将免疫增强剂与纳米粒结合或者可将靶向剂与纳米粒偶联。在一个筛选方法中，含有所需抗原的大量纳米粒可由包括接头基团的基质来制造，所述接头基团例如伯胺、羟基、硫化物、羧酸等。然后，可采用本领域已知的有机化学，通过这些接头基团，使免疫增强剂与包含抗原的颗粒亚类进行化学或物理偶联。当从模具中收获颗粒之后，可在溶液或干粉中使所述颗粒官能化，或者以组合方式，在颗粒阵列上直接官能化。通过该方法，可使颗粒官能化，使得以受控密度、比率和位置，在其表面上含有一种或多种不同免疫调节剂。然后可以在合适的体外或体内模型中，筛选这样的表面官能化颗粒的文库，以确定最佳免疫增强剂、免疫增强剂组合和目标抗原的相对浓度。进一步的筛选方法包括除了改变表面的免疫增强剂之外，还改变颗粒中的抗原浓度。
在又一些实施方案中，本发明的纳米粒疫苗可用于筛选受试者中抗体的存在或者筛选样品中一系列不同刺激剂/抗原组合纳米粒，以确定抗体是否存在或刺激剂/抗原组合的功能。可将纳米粒构造成具有一种组分，当与目标抗体接触时其经历可检测的或可产生信号的理化变化，例如，纳米粒可包含生物传感器或者就是生物传感器，当纳米粒与特定靶标结合时可被触发。因此，可将具有刺激剂与抗原的不同组合和/或比率的各种各样的纳米粒组合给予受试者或者可将其用于检测抗体的存在或免疫增强剂/抗原组合的功能或活力。
在某些实施方案中，本发明的纳米粒可用于从生物体或样品中吸引特定细胞或蛋白质，与特定细胞或蛋白质结合，并有助于对特定细胞或蛋白质进行标记或过滤。依据这样的实施方案，可将纳米粒构造成具有细胞、蛋白质或病毒的特异性结合剂，例如捕获配体，其一旦结合，就可将这样的细胞、蛋白质或病毒标记为非自体，并因此有助于将这样的细胞、蛋白质或病毒从机体中除去。在又一些实施方案中，纳米粒可包括免疫刺激剂，所述刺激剂能刺激目标免疫系统组分，以收集、聚集或迁移到纳米粒上或其周围，因而促进纳米粒捕获配体与免疫系统细胞的结合并标记为非自体，从而导致将所述细胞从受试者中除去。在某些实施方案中，标记自体细胞或蛋白质或病毒(其被非识别性蛋白层掩蔽)的方法可通过促进免疫系统识别与自体物质结合的纳米粒(从而成为非自体物质)来处理受试者，因而有助于将所述物质从受试者中除去。
实施例
给出以下实施例，为本领域普通技术人员提供指南，用于实施本文所公开主题的代表性实施方案。根据本说明书和本领域技术人员一般水平，技术人员可以理解，以下实施例仅仅是示例性的并且在不偏离本文所公开主题的范围之内可以采用众多变化、修改和替代。
实施例1.颗粒制造和分析方法
蛋白质修饰：通过以下标准方法，用或者[琥珀酰亚胺基2-(生物素酰胺基)-乙基-1，3′-二硫代丙酸](降解性二硫化物生物素接头)或者硫代琥珀酰亚胺基-6-[生物素酰胺基]己酸(非降解性生物素接头)来修饰蛋白质。
Wyoming H3 HA：(Protein sciences)：将Wyoming HA溶液(120μg/mL，1.75mL，210μg总蛋白)用14.2μL 10mM[琥珀酰亚胺基2-(生物素酰胺基)-乙基-1，3′-二硫代丙酸](6mg溶于1mL H2O)处理。将所得混合物振摇30分钟，然后使用10MWCO经γ-辐照的slide-a-lyzer盒(Pierce)，通过透析来纯化。样品对150mL H2O透析，以30分钟的间隔更换7次H2O。然后从透析盒中回收蛋白质并用于颗粒修饰。
重组小鼠IL-12：(eBiosciences)：用0.3μL 10mM[琥珀酰亚胺基2-(生物素酰胺基)-乙基-1，3′-二硫代丙酸](6mg溶于1mL H2O)处理小鼠IL-12溶液(400μg/mL，5μL，2μg总蛋白)。将所得混合物振摇30分钟，再用0.025μm硝基纤维素膜(Millipore)通过液滴透析(drop dialysis)而纯化。将样品放在漂浮在50mL H2O上的膜上，并透析30分钟。然后从透析膜回收蛋白质并用H2O稀释4倍，用于颗粒修饰。
PEG颗粒制造和修饰：采用PRINT工艺，使用所需大小和形状模槽的Fluorocur模具，制造颗粒。用含有20wt％甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐、79wt％聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯(MW～1000)和1％1-羟基环己基苯基甲酮的单体混合物填充模具。填充后的模具对PET片进行层压，再暴露给紫外光进行固化。固化后，从PET片上取下模具，留下颗粒分离在PET片上。通过用聚乙烯刀片刮取，从PET片上将颗粒收集到溶液(无菌H2O)中。离心沉淀颗粒悬液(16K x g，10分钟)，去除上清液，然后通过超声处理，重新分散在70∶30乙醇∶水中。该工序重复3次，将颗粒以10mg/mL重新分散在70％乙醇中并贮存于4℃。
PLGA颗粒制造：采用PRINT工艺，用PLGA(50∶50，0.3i.v.)和聚(二甲氨基甲基丙烯酸)(MW～20,000)的95∶5混合物在DMF中的5wt％溶液，制备用于表面吸附HA的阳离子PLGA颗粒
Figure BPA00001254367300231
(Novartis，2008-2009seasonal)。用含有80nm x 80nm x 360nm模槽的
Figure BPA00001254367300232
(Liquidia Technologies，Inc.，North Carolina)，将该聚合物混合物倒模。颗粒通过离心而纯化，然后重悬于0.1wt％聚乙烯醇溶液中。
通过首先经使用10K MWCO透析膜对H2O的透析，从蛋白质中脱去所有盐分，使HA蛋白
Figure BPA00001254367300233
吸附在表面上。对于靶标，颗粒表面上的10wt％剂量的蛋白质，将10μg蛋白质(100μL)加入到0.1mg颗粒悬浮的200μL 0.1wt％聚乙烯醇溶液中。将悬液在4℃振摇15分钟，然后离心沉淀颗粒(16,000x g，10分钟)。去除上清液，用BCA测定来分析残余蛋白含量。再将颗粒重新分散在0.4mL 0.1wt％聚乙烯醇溶液中，使蛋白浓度为25μg/mL。所得80nm x 80nm x 360nm PLGA疫苗颗粒见图6。
生物素-抗生物素蛋白化学：采用以下标准方法，使用或者[琥珀酰亚胺基2-(生物素酰胺基)-乙基-1，3′-二硫代丙酸](降解性二硫化物生物素接头)或者硫代琥珀酰亚胺基-6-[生物素酰胺基]己酸(非降解性生物素接头)，对颗粒进行表面修饰。将200nm x 200nm x 200nm颗粒的70％乙醇悬浮液(1mL，10mg/mL)沉淀，然后重悬于1mL无水DMF中，3次。将含有10mg[琥珀酰亚胺基2-(生物素酰胺基)-乙基-1，3′-二硫代丙酸]和70mg三乙胺的0.5mL DMF溶液加入到颗粒悬液中，再将所得混合物放入振动台上过1小时。通过重复离心并重悬于70％乙醇(3x 1mL)中，纯化所得混合物并悬浮在70％乙醇中达10mg/mL。
表面官能化：按照以下两步法，将颗粒用蛋白质包被。通过离心和重悬浮，将生物素化颗粒的悬浮液(0.2mL，10mg/mL的70％乙醇悬液)沉淀并在或者1wt％小鼠白蛋白溶液或者0.1wt％聚乙烯醇溶液中洗涤2次。将颗粒在含水溶媒中重悬到其原来的体积，再加入等体积的3mg/mL抗生物素蛋白溶液。然后将所得混合物在室温下振摇15分钟。然后通过离心和重悬浮在含水溶媒中3次，将所得颗粒纯化。然后将抗生物素蛋白包被的颗粒以10mg/mL重悬于溶媒中。
然后在第二步骤中，将颗粒用HA和/或IL-12包被。将所需量的蛋白质加入到微量离心管的H2O中，然后加入抗生物素蛋白包被的颗粒。将所得悬液在4℃振摇15分钟，然后离心沉淀。去除上清液，将颗粒重悬于溶媒中至一定体积，使得所需量的蛋白质/注射在40μL内。如果将颗粒悬浮于0.1wt％聚乙烯醇中，采用Bradford测定来分析上清液中的残留蛋白(通常＞95％蛋白质从上清液中除去)。如果将颗粒悬浮于1％小鼠白蛋白中，采用将生物素化蛋白与抗生物素蛋白在颗粒上相结合的化学计量学，间接测定颗粒的结合能力。用荧光标记蛋白(用生物素和Hylite 647两者标记的牛IgG)处理抗生物素蛋白包被的颗粒。沉淀颗粒，比较颗粒处理前后的荧光强度并对所生成的标准曲线校准。对各颗粒计算结合能力，然后以小于等于测定结合能力的数值将颗粒与HA和IL-12一起给予。本发明生物素-抗生物素蛋白纳米粒的示意图见图7。
阳离子表面吸附：通过离心和重悬浮，从乙醇悬液中沉淀未修饰颗粒(20％甲基丙烯酸氨基乙基酯盐酸盐、79％PEG1K-二甲基丙烯酸酯、1％HCPK)并在0.1wt％聚乙烯醇溶液中洗涤2次。将颗粒(1mg，10mg/mL)加入到HA溶液(10μg，222μL@45μg/mL)中，所述溶液已经对H2O透析，以从蛋白制备物中除去NaCl。将悬液在4℃振摇15分钟，然后沉淀颗粒并重悬于0.25mL 0.1wt％聚乙烯醇中。通过Bradford测定来分析上清液中蛋白质的存在，＞95％蛋白质吸附到颗粒上。可按类似方式，单独或与HA蛋白组合，使重组小鼠IL-12吸附到颗粒上。
分析：HA ELISA标准ELISA方法用于测定抗HA抗体反应。在测定中，96孔板用50ng/孔的血凝素蛋白(H3A/Wyoming/03/2003，Protein Sciences，目录号3006)包被。在系列两倍稀释液中测定血清样品。用在山羊中产生的具有碱性磷酸酶的抗小鼠IgG完整分子(Sigma，目录号A3688)来测定抗体。用Sigma FastTM磷酸对硝基苯酯片(Sigma，目录号N2770-50SET)进行测定并在Molecular Devices SpectraMaxM5读板器上读数。
对于HA/IL12包被的颗粒进行抗体染色：使表面连接IL12的颗粒暴露给IL12的标记抗体(抗小鼠IL12PE，BioLegend，目录号505203)并洗涤。通过荧光显微镜术，颗粒呈现红色，归因于对IL12具有特异性的红色标记抗体。
使表面连接HA的颗粒暴露给HA抗体(抗H3流感血凝素兔多克隆，Protein Sciences，目录号6100)。洗涤颗粒，留下与颗粒表面上存在的HA结合的抗体。用具有绿色标记的抗兔第二抗体(抗兔IgGAlexaFluor 488，Invitrogen，目录号A21206)识别抗体结合。将过量第二抗体洗去，通过荧光显微镜术对颗粒成像，以检测绿色荧光，其可表明颗粒表面上HA的存在。
将表面连接IL12和HA的颗粒暴露给带标记的IL12抗体(抗小鼠IL12PE，BioLegend，目录号505203)和HA抗体(抗H3流感血凝素兔多克隆，Protein Sciences，目录号6100)。洗涤颗粒，留下一种与颗粒表面上存在的HA结合的抗体和另一种与颗粒表面上的IL12结合的抗体。用具有绿色标记的抗兔第二抗体(抗兔IgG AlexaFluor 488，Invitrogen，目录号A21206)识别HA抗体结合。将过量第二抗体洗去，通过荧光显微镜术对颗粒成像，以检测绿色荧光，其可表明颗粒表面上HA的存在，并检测红色荧光，其可表明颗粒表面上IL12的存在，如图8所示。
实施例2：PRINT递送的蛋白疫苗颗粒的免疫原性
测定表面上含有HA和IL12的疫苗颗粒(由79％聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、20％甲基丙烯酸氨基乙基酯盐酸盐、1％HCPK组成，然后通过降解性生物素接头进行表面处理)刺激干扰素γ的能力。首先，从完整的小鼠脾脏(BALB/c小鼠，来自Charles River Laboratories)中分离脾细胞并接种在96孔板中。将测试颗粒给予脾细胞并让其孵育过夜。使用标准ELISA试剂盒(Mouse INFg ELISA kit，eBiosciences，目录号88-7314-77)，分析这些细胞上清液中干扰素γ的产生。数据参见表1，表明IL12在颗粒上并保持功能。
Figure BPA00001254367300261
表1.
设计体内研究，以测定针对流感HA蛋白而产生的免疫应答，当在有和没有免疫刺激剂IL-12时，以可溶性蛋白形式或与疫苗颗粒连接的形式递送时。基于交联聚乙二醇(PEG)的PRINTTM颗粒(由79％聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、20％甲基丙烯酸氨基乙基酯盐酸盐、1％HCPK组成，然后通过降解性生物素接头进行表面处理)用于提供HA抗原和IL-12蛋白。HA∶IL12为100∶1。
体内研究使用来自Charles River Laboratories的雌性BALB/c小鼠。小鼠在研究开始时是7周龄。动物体重介于15-25g/小鼠。在某些组中，给予动物40uL(每侧20uL)颗粒溶液的肌内(IM)剂量，使每只动物接受0.150mg颗粒上的2ug HA蛋白。在其它组中，给予动物后脚掌注射40uL(每脚掌20uL)颗粒溶液，使每只动物接受2ug HA蛋白。研究采用每组3只动物接受相同剂量。在第1天给予动物初次注射，接着在第21天给予加强注射。在第0、8、21天通过眼窝后放血，对所有组采血。在第29天，通过CO2窒息对动物处以安乐死并通过放血而证实。从每只放血动物中采集血清样品并通过ELISA测定抗体效价。
实施例3.大小和形状对免疫原性的差异
设计本研究，以评价针对流感HA蛋白而产生的免疫应答，当以可溶性蛋白形式或与多种大小和形状的疫苗颗粒连接的形式递送时。基于交联聚乙二醇(PEG)(由79％聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、20％甲基丙烯酸氨基乙基酯盐酸盐、1％HCPK组成，然后通过生物素接头表面修饰进行表面处理)的PRINT颗粒系统将用于提供HA抗原。
体内研究使用来自Charles River Laboratories的雌性BALB/c小鼠。小鼠在研究开始时是7周龄。动物体重介于15-25g/小鼠。给予动物40uL(每侧20uL)颗粒溶液的肌内(IM)剂量，使每只动物接受2ug HA蛋白以及范围介于0.08至0.3mg之间颗粒/注射(取决于结合能力)的颗粒剂量。本研究采用每组6只动物，给予试样样品。在第1天给予动物初次注射，接着在第21天给予加强注射。在第0天和第20天通过眼窝后放血，对所有组采血。在第29天，通过CO2窒息对动物处以安乐死并通过放血而证实。尸检将包括采血和采集脾脏。从每只放血动物中采集血清样品并通过ELISA测定抗体效价。结果见图2和图3。
实施例4.降解性接头与非降解性接头：
设计本研究，以评价针对流感HA蛋白而产生的免疫应答，当以可溶性蛋白形式或使用不同接头基团化学而与疫苗颗粒连接的形式递送时。基于交联聚乙二醇(PEG)(由79％聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、20％甲基丙烯酸氨基乙基酯盐酸盐、1％HCPK组成，然后通过降解性生物素接头进行表面处理)的PRINT颗粒系统将用于提供HA抗原。
体内研究使用来自Charles River Laboratories的雌性BALB/c小鼠。小鼠在研究开始时是7周龄。动物体重介于15-25g/小鼠。给予动物40uL(每侧20uL)颗粒溶液的肌内(IM)剂量，使每只动物接受在介于0.1至0.3mg之间(取决于颗粒结合能力)颗粒上的2ug HA蛋白。本研究采用每组6只动物，给予试样样品。在第1天给予动物初次注射，接着在第21天给予加强注射。在第0天和第20天通过眼窝后放血，对所有组采血。在第29天，通过CO2窒息对动物处以安乐死并通过放血而证实。尸检将包括采血和采集脾脏。从每只放血动物中采集血清样品并通过ELISA测定抗体效价。结果见图4和图5。
尽管以上已经参考具体实施方案描述了本发明，但是在本发明精神和范围内的修改和替代对于本领域技术人员而言将会是显而易见的。还显而易见的是，在本文中认为属于具体实施方案的各要素也可包括在本发明的其它实施方案中。只要不偏离其重要属性，可以按照其它特定形式来实施本发明。因此，所阐明和描述的实施方案和实施例将被认为无论如何都是说明性的而非限制性的，对于所附权利要求书给出参考文献，以表明本发明的范围。

Claims (15)

1.刺激受试者体内免疫应答的方法，所述方法包括：
将与抗原偶联的微米尺度颗粒给予所述受试者，其中增加所述微米尺度颗粒的长宽比能增加所述免疫应答。
2.权利要求1的方法，其中所述微米尺度颗粒的长宽比为大约3∶1，并且其中所述免疫应答比给予长宽比为大约1∶1的颗粒所导致的免疫应答高出大约2至大约3倍。
3.权利要求2的方法，其中所述微米尺度颗粒包含尺寸为大约1微米乘大约1微米乘大约3微米的颗粒。
4.权利要求2的方法，其中所述微米尺度颗粒包含尺寸为大约2微米乘大约2微米乘大约6微米的颗粒。
5.权利要求1的方法，其中所述微米尺度颗粒的长宽比为大约10∶1，且其中所述免疫应答比给予长宽比为大约1∶1的颗粒所导致的免疫应答高出大约3至大约4倍。
6.权利要求5的方法，其中所述微米尺度颗粒包含大约1微米乘大约1微米乘大约10微米的颗粒。
7.降低由与纳米尺度颗粒偶联的抗原所导致的免疫应答的方法，所述方法包括：
增加所述纳米尺度颗粒的长宽比。
8.基本上抑制由给予受试者的免疫刺激剂所导致的免疫应答的方法，所述方法包括：
在将所述免疫刺激剂给予所述受试者之前，使所述免疫刺激剂通过非降解性接头与颗粒偶联。
9.权利要求8的方法，其中所述方法导致在将所述免疫刺激剂初次给予所述受试者之后基本上能抑制免疫应答。
10.权利要求8的方法，其中所述方法导致在将所述免疫刺激剂加强给予所述受试者之后基本上能抑制免疫应答。
11.疫苗颗粒组合物，所述组合物包含：
被构造成能以第一速率释放第一蛋白和以第二速率释放第二蛋白并且被构造成能以单剂量提供初次效能和加强效能的多个颗粒。
12.刺激受试者体内免疫应答的方法，所述方法包括：
给予所述受试者多个颗粒，其中每个颗粒都与免疫刺激剂和蛋白质偶联。
13.权利要求12的方法，其中所述给予多个颗粒导致的抗体效价比给予不与所述颗粒偶联的免疫刺激剂和蛋白质所导致的抗体效价高出至少大约10倍。
14.权利要求12的方法，其中所述多个颗粒的几乎每个颗粒都包含尺寸为大约200nm乘大约200nm乘大约200nm的颗粒。
15.权利要求1的方法，其中所述多个颗粒的几乎每个颗粒都包含尺寸为大约2μm乘大约2μm乘大约2μm的颗粒，而且其中所述给予多个颗粒导致的抗体效价比给予不与所述颗粒偶联的免疫刺激剂和蛋白质所导致的抗体效价高出至少大约100倍。
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