CN101132773A - 药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种药物组合物和微粒组合物,所述微粒组合物包含生物降解性聚合物、免疫原性单链核糖核酸(ss-RNA)物质、生物活性大分子和稳定剂,其中,所得微粒的外表面没有被吸附的分子。所述组合物能在树突细胞中有效产生免疫应答,尤其是通过刺激IFN-α生成的增加来产生免疫应答。本发明还描述并要求保护源自所述微粒的药物组合物的制备方法和在医学中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及微粒和药物组合物,所述微粒和药物组合物含有稳定的、具有免疫原性的、微胶囊化的单链核糖核酸(RNA),所述单链核糖核酸刺激在哺乳动物细胞中的免疫应答。本发明还描述并要求保护所述药物组合物的制备方法及其在免疫疗法中的应用。
技术背景
哺乳动物免疫系统具有检测器组形式的特化“早期预警系统”,以快速感知微生物侵入体的出现并触发对该侵入体出现的应答。各种“Toll样受体”(toll-like receptor,TLR)识别在病原体中保守但未出现在多细胞生物体中的不同结构体和化学物质。TLR受其适当的激动剂的刺激时会导致信号转导途径的活化,从而引起特异性促炎和/或抗病毒细胞因子的生成。目前人们对使用某种TLR激动剂,如CpG寡脱氧核苷酸作为免疫疗法和疫苗佐剂抱有相当大的兴趣(参见例如Nature Reviews Immunology2004,第4卷,第248-257页和第512-520页)。
在感染诱导的细胞因子中,I型干扰素(INF-α和INF-β)因其在抗病毒应答中的重要性而闻名。I型干扰素很早就开始介入先天性免疫应答,并且对感染后抗病毒状态的快速形成而言是非常重要的。I型干扰素还调节任何针对病毒继发的适应性应答;刺激树突细胞交叉激活并诱导具有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。
浆细胞样树突细胞能生成极高水平的I型干扰素(高达普通细胞的1000倍)。据认为,浆细胞样树突细胞负责对许多病毒感染作出系统性干扰素应答。浆细胞样树突细胞受某些CpG寡聚核苷酸的刺激时,会导致高水平的干扰素-α的生成。据认为,CpG DNA与TLR9在内体区室中相互作用。最近已证明,鼠浆细胞样树突细胞在受到富含鸟嘌呤(guanidine)和尿嘧啶的单链(ss)RNA序列的刺激后,能生成高水平的IFN-α(Diebold等,Science 2004,303,1529)。有很好的证据表明,该作用受到TLR7(在小鼠中)的介导。据认为,TLR7类似于TLR9,其在内体区室中以病原相关分子模式相互作用。TLR7的细胞定位(即在内体区室中)可防止其被细胞溶质中的自身ssRNA所活化。然而,普遍接受的是,仅有ssRNA并不能有效地刺激浆细胞样树突细胞生成IFN-α。这是因为ssRNA非常容易受到核酸酶攻击,并且还因为ss-RNA极少有跨质膜摄取。
发明内容
因此,需要提供一种使所述ss-RNA分子稳定的方法,以使它们适合用在免疫疗法中。这样的使ss-RNA稳定的方法应当使RNA免受核酸酶攻击,同时维持其免疫刺激性能。此外,所述使ss-RNA稳定的方法应当与已有的用于输送免疫原性化合物的方法互补,由此使得由ss-RNA引起的普通免疫应答不会影响所实施或共实施的特效疗法,这样的形式是理想的。
本发明人现在已经发现,某些含有ss-RNA的制剂能够成功地稳定和保护ss-RNA,并且与其他普通治疗试剂相比还能刺激更强的细胞因子应答,其中所述ss-RNA在稳定剂存在下进行微胶囊化。具体而言,本发明的组合物刺激IFN-α和IL-12的水平,该水平即使不优于也至少相当于与常用体外转染试剂(例如聚乙烯亚胺,下文中称为“PEI”)缩合(condense)的ss-RNA所刺激的水平。该类型的组合物对体内施用而言具有特别的优点:因为含有相对较低水平的稳定剂,所以往往具有比上述传统的稳定化ssRNA更小的毒性。同时,可根据施用途径对所述微粒制剂的粒度进行优化。例如,可将本发明的微粒形成为能提供对输送至下呼吸道而言可以感觉到处于优化范围的平均粒度,即1μm~10μm。
本发明的微粒和药物组合物刺激细胞因子在宿主细胞中生成,由此可用作适用于宽范围的疾病和感染的普通免疫疗法。这在未知或不能提供特效疗法时是非常有利的。本发明的又一个优点在于,所述组合物可选地含有特效治疗试剂,使得在施用了所述组合物的受累个体中引发普通免疫应答和特异性免疫应答。本发明的微粒组合物的还有的其他优点是,它能以干粉形式长期保存(至少数月)而不丧失其生物效力。在保存后,所述组合物可以直接作为干粉形式施用(例如通过吸入),或者在本领域中已知的药用溶剂或缓冲剂中再次水化,并根据需要而通过肠胃外施用。
本发明的组合物也可用于引发细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答,这对于清除胞内病原体和癌细胞是非常重要的。所述组合物的这一特征突出了本发明的特别的优点,其原因在于,根据IFN-α在诱导CTL应答中的重要性,该特征可以提供一种能诱导CTL应答的疫苗输送系统。这样的疫苗输送系统特别适用于肿瘤免疫疗法。
本发明提供了一种微粒组合物,该微粒组合物包含生物降解性聚合物、免疫原性单链核糖核酸(下文中称为“ss-RNA”)物质、生物活性大分子和稳定剂,其中,所述生物活性大分子、单链核糖核酸(ss-RNA)和稳定剂被胶囊化在所述生物降解性聚合物的内侧和/或内部,以使所述微粒具有“空闲(free)”的外表面。本领域技术人员应当理解的是,尽管所述微粒的外表面上基本不存在被包封的组分,但是不可避免的是,小部分的所述ss-RNA、生物活性大分子和稳定剂各自仍可能存在于所述微粒的表面上。然而,如此处所述,所述微粒的外表面基本不存在被包封的组分。因此,本文所使用的“空闲的外表面”是指在形成后不直接包含被吸附的组分的所述微粒的外表面。然而,具有这样的空闲外表面的微粒可能会经过处理,导致其他材料,例如药物化合物、大分子和核酸被吸附在其上。此处使用的“被吸附的组分”是指,作为微粒形成过程的结果而部分存在于所述微粒表面上的被包封组分,并且“被吸附的组分”涉及在微粒形成后被吸附于微粒外表面上的物质。
此处所使用的术语“微粒”是指直径为约10nm~约100μm的颗粒,优选直径为200nm~30μm的颗粒,更优选为500nm~10μm的颗粒。通过本领域内公知的技术(例如激光衍射或扫描电子显微镜)可以容易地确定微粒尺寸,并且所述微粒尺寸通常以平均直径表示。术语颗粒、粒子、微粒、微小颗粒和微球体可相互交换使用,并且全部落在上述微粒的定义范围之内。
可使用任何生物相容的生物降解性聚合物来形成本发明的微粒,但优选使用已知能在哺乳动物组织内降解并适用于药物施用的聚合物。这样的生物降解性聚合物的例子包括但不局限于脂肪族聚酯、衍生自聚(α-羟基酸)的聚合物,如聚(丙交酯)(“PLA”),或者D,L-丙交酯和乙交酯或乙醇酸的共聚物,如聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”或者“PLGA”),或者聚乙交酯、聚己内酯及其共聚物。优选所述生物降解性聚合物是聚(丙交酯)。
胶囊化在所述微粒内部的所述ss-RNA物质可以是任何这样的单链RNA序列,所述单链RNA序列能刺激或增强免疫应答,尤其是通过刺激促炎细胞因子(如肿瘤坏死因子(TNF-α))和/或抗病毒细胞因子(如IFN-α、IFN-β或IL-12)的生成来刺激或增强免疫应答。优选ss-RNA能够刺激INF-α的生成和分泌。本领域技术人员应当理解的是,IFN-α可通过许多机制生成,但优选选择所述ss-RNA,使之能通过与哺乳动物宿主内的树突细胞的Toll样受体(TLR)相互作用并对其进行刺激,从而刺激细胞因子的生成。本领域技术人员还应当理解的是,不同的TLR可促进IFN-α的分泌,但优选所述ss-RNA刺激TLR-7和/或TLR-8,二者很可能参与细胞因子在人体内的表达。
合适的ss-RNA序列是那些具有较高单一碱基比例的序列,即其中包含富含A、U、C或G中任一种的区域的序列。优选所述ss-RNA含有富含G或富含U的序列。ss-RNA的优选实例包括聚尿苷酸和聚鸟苷酸。所述ss-RNA更优选为聚尿苷酸。
ss-RNA的微胶囊化优选在生物活性大分子的存在下进行。所述大分子包括已知可引发普通免疫应答的治疗试剂,如寡脱氧核苷酸;CpG寡核苷酸;多肽和蛋白,还有能提供特疗效果的物质,如能对已知病原体引起特异性免疫效果的试剂,如病原体特异性抗原,或者,作为另一种选择,能对肿瘤或癌症细胞上表达的抗原引起特异性免疫效果的物质。
此处所使用的术语“抗原”是指这样的分子,其中含有一个或多个在抗原存在时能刺激宿主免疫系统产生抗原特异性免疫应答或者能引起体液抗体应答的表位。术语抗原是指亚单元抗原或者已被杀死、减毒或失活的细菌、病毒或其他微生物。能模仿抗原或抗原决定簇的抗体以及抗体片段也包括在抗原的定义中。
在一个优选的实施方式中,所述微粒组合物含有对细菌病原体具有特异性的抗原,例如炭疽杆菌(Bacillus anthracis)的重组的保护性抗原(rPA)或来自于鼠疫杆菌(Yersinia pestis)的F1和/或V抗原,但本领域技术人员应理解的是,任何已知的抗原都可配制到所述微粒组合物中。该实施方式对病菌感染,例如炭疽热、瘟疫、类鼻疽、鼻疽病(glander)和衣原体疾病等此类疾病的治疗特别有用,而且对病毒、真菌和寄生物感染也可以提供合适的抗原或抗原模拟物。
所述微粒制剂的稳定剂可以是选自在本技术领域中已知的大量稳定剂中的任何一种。稳定剂包括但不局限于去污剂、表面活性剂、分散剂、悬浮剂或乳化稳定剂。稳定剂的优选实例包括脂质和表面活性剂。然而,优选所选择的稳定剂是药用试剂,由此可以避免体内施用时可能有毒性的稳定剂。进一步优选的是,所述稳定剂能与ss-RNA形成复合物。这样的复合物能通过所述稳定剂与ss-RNA之间的直接共价连接形成,例如作为缩合反应的结果,或者作为另外一种选择,所述复合物可以通过静电、离子或疏水相互作用而形成。更为优选的是,所述稳定剂带有正电荷,由此实现与ss-RNA的静电相互作用。这样的稳定剂的合适例子是阳离子聚合物和/或阳离子脂质。优选的例子是阳离子脂质,如鲸蜡基三甲基溴化铵(下文中称为“CTAB”),二甲基二(十八烷基)溴化铵(“DDA”)和N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(“DOTAP”)以及诸如此类的阳离子脂质。
本领域技术人员可按常规确定稳定剂的合适用量,但优选的是,ss-RNA、生物降解性聚合物和稳定剂的质量比为约1∶8∶6至约1∶15∶12,更优选所述组分的质量比为大约2∶25∶18。
本发明人已发现,稳定剂的选择和用量可影响所述稳定剂存在时形成的微粒的总电荷,由此使所述药物组合物可带有净负电荷或正电荷。优选所述组合物带有如通过合适的电荷测量装置(例如测量ζ电势(zetapotential,跨所有固液界面存在的电势)的ZetasizerTM)来测量的净正电荷。更优选的是,由所得组合物测得的ζ电势为约0mV~100mV,更优选为20mV~80mV,进一步更优选为30mV~60mV。本发明人已发现,具有大约50mV的ζ电势的药物组合物对刺激INF-α的生成特别有效。
理想的是,所述微粒组合物包含具有以下尺寸的微粒,所述尺寸使之能进行有效施用并运输至免疫系统,并且特别适用于吸入施用。所述微粒优选具有0.1μm~5μm的平均直径,更优选具有0.2μm~4μm的平均直径。最优选所述微粒具有大约1μm的平均直径。这样的微粒可合适通过将所述微粒与药用佐剂和/或赋形剂(如粘合剂、填充剂、稀释剂、润滑剂、颜料、甜味剂和分散剂等类似赋形剂)混合而配制成药物组合物。
可将所述药物组合物配制成能够提供一种共施用所述微粒与其他治疗试剂或佐剂的方法。所述微粒的空闲外表面提供了方便的位置以供吸附另外的治疗试剂(如另外的抗原、免疫原性蛋白和多肽、核酸如CpG寡核苷酸和DNA载体)之用。这些另外的治疗试剂可用于修饰所述微粒的空闲外表面以提供增强的免疫应答。
本发明的第二方面提供了制备所述微粒和药物组合物的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)制备生物降解性聚合物的溶液;
(b)将含有免疫原性ss-RNA和生物活性大分子的溶液加入到步骤(a)的所述溶液中以形成乳液;
(c)将来自步骤(b)的所述乳液加入到含有稳定剂的溶液中以形成双乳液;
(d)除去溶剂;以及
(e)收集所得的微粒。
用在本方法中的ss-RNA选自本文已经描述的名单,并可方便地将其溶于水性溶液,例如蒸馏水或水性缓冲液中,而所述生物降解性聚合物则溶解在与水不混溶的溶剂如有机溶剂(例如二氯甲烷)中,但本领域技术人员应当理解的是,可以使用任何溶剂的组合,只要其能在混合时形成乳液即可。生物降解性聚合物可以方便地选自已经在本文提供的替代物名单。同样应当理解的是,所述稳定剂可以选自已经在上文中描述的稳定剂,并且所述稳定剂可以溶解在任何溶剂中,使得当将稳定剂溶液加入到第一乳液(即在步骤(b)中形成的乳液)时能形成双乳液。因此,优选的是,在步骤(c)中使用水性溶剂或与水混溶性溶剂来溶解所述稳定剂。这样的组合可以制得水-油-水(w-o-w)双乳液,但应当理解的是,油-水-油(o-w-o)双乳液也同样合适。在步骤(c)中,将所述第一乳液(即步骤(b)中制得的乳液)加入到稳定剂溶液中。虽然优选按此顺序进行添加,但也可以通过将稳定剂溶液加入到步骤(b)的乳液中来形成合适的双乳液(因此而形成微粒)。优选在搅拌的同时,将步骤(b)的乳液加入到稳定剂溶液中,这是因为本发明人已发现,这样能够提供更好的所得微粒。更优选在剧烈搅拌的同时,将来自步骤(b)的乳液滴加到稳定剂溶液中。可通过任何常规范方法来实施溶剂去除步骤(c),例如持续搅拌、真空或加热蒸发并通过例如过滤或离心收集所得微粒。更优选通过超速离心收集所述微粒。然后收集所述微粒并直接使用,或者对其进行进一步的处理、加工或配制,例如将其与药用化合物混合来形成药物组合物。虽然对于一些应用而言,希望进行进一步的加工,但在大多数情况下是没有必要进行进一步的加工的,因为所得微粒具有在使用时有效的尺寸,而不需要进一步的加工。
根据本发明方法制备的微粒组合物可进一步经过冻干步骤,使之能作为干燥粉末长期保存。本发明人已发现,这些经过冻干的组合物可以稳定数月,并且对于通过例如普通吸入器装置而进行的粘膜施用,其具有可直接作为干燥粉末使用的优点。作为另外一种选择,根据需要以及在需要时,将所述干燥粉末重新水化,这对于制备适用于肠胃外施用的组合物来说是特别有利的。
附图说明
下文将通过实施例的方式,并参考下述附图来对本发明进行详细描述:
图1显示使用激光衍射测量法测得的、装载有RNA的微粒的粒度分布图,所述微粒使用聚乙烯醇(PVA)或N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)作为稳定剂进行制备。数据为三次独立试验的结果。
图2显示装载有poly-U的聚丙交酯微粒的扫描电子显微图,所述微粒使用聚乙烯醇(PVA)或N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)作为稳定剂进行制备。
图3显示来自于Flt3L扩增性骨髓来源树突细胞的大批培养物(bulkculture)的上清液的干扰素-α的水平,所述树突细胞经过在一定浓度范围的溶液中的poly-U(游离PoIy-U)、胶囊化在聚丙交酯微粒中的poly-U(MS(微粒)中的Poly-U)、聚丙交酯空微粒(空的MS)和与PEI缩合的poly-U(Poly-U PEI)刺激过夜。聚丙交酯微粒使用N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)或聚乙烯醇(PVA)作为稳定剂来制备。作为对照用的细胞也与1nmol的CpG共培养。数据是三份小量培养物的平均值(±SD),并代表三次独立的试验。
图4显示来自于Flt3L扩增性骨髓来源树突细胞的大批培养物的上清液的TNF-α水平,所述树突细胞经过在一定浓度范围的溶液中的poly-U(游离PoIy-U)、胶囊化在聚丙交酯微粒中的poly-U(MS中的Poly-U)、聚丙交酯空微粒(空的MS)和与PEI缩合的poly-U(Poly-U PEI)刺激过夜。聚丙交酯微粒使用N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)或聚乙烯醇(PVA)作为稳定剂来制备。作为对照用的细胞也与1nmol的CpG共培养。数据是三份小量培养物的平均值(±SD),并代表三次独立的试验。
图5显示来自于Flt3L扩增性骨髓来源树突细胞的大批培养物的上清液的IL-12 p40的水平,所述树突细胞经过在一定浓度范围的溶液中的poly-U(游离PoIy-U)、胶囊化在聚丙交酯微粒中的poly-U(MS中的Poly-U)、聚丙交酯空微粒(空的MS)和与PEI缩合的poly-U(Poly-U PEI)刺激过夜。聚丙交酯微粒使用N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)或聚乙烯醇(PVA)作为稳定剂来制备。作为对照用的细胞也与1nmol的CpG共培养。数据是三份小量培养物的平均值(±SD),并代表三次独立的试验。
图6显示Flt-3L扩增性骨髓来源树突细胞(BMDC)在微胶囊化的OVA、微胶囊化的poly-U、共微胶囊化的OVA和poly-U、表面吸附有CpG的微胶囊化的OVA、在溶液中的CpG和OVA或者单独的培养基进行过夜刺激后的细胞因子分泌。结果是三次独立试验的平均值(±SD)。*表示与微胶囊化的OVA处理相比具有统计学上的显著差异(P<0.05)。
图7显示在使用微胶囊化的OVA、共微胶囊化的OVA和poly-U、表面吸附有CpG的微胶囊化的OVA、在溶液中的CpG和OVA或者在溶液中的poly-U和OVA来对BALB/c小鼠进行皮下免疫之后的血清抗-OVAIgG的滴度。结果是每处理组6只小鼠的平均值(±SD)。*表示与幼稚(naive)对照相比具有统计学上的显著差异(P<0.05)。
图8显示在使用微胶囊化的OVA、共微胶囊化的OVA和poly-U、表面吸附有CpG的微胶囊化的OVA、在溶液中的CpG和OVA或者在溶液中的poly-U和OVA对BALB/c小鼠进行皮下免疫之后的OVA特异性的IFN-γ和IL-4 ELISPOTS。结果是每处理组6只小鼠的平均值(±SD)。*表示与幼稚对照相比具有统计学上的显著差异(P<0.05)。**表示与所有其他处理相比较具有显著差异(P<0.05)。
图9显示取自经共微胶囊化的OVA和poly-U免疫的6只小鼠(上图)或幼稚小鼠(下图)的四聚体染色淋巴结细胞的FACS分析。如由增强的FL2信号所证实,经共微胶囊化的OVA和poly-U免疫的小鼠具有数量更多的带结合四聚体(bound tetramer)的CD8细胞。
具体实施方式
实施例1
Poly-U在聚乙烯醇稳定化的聚丙交酯微粒中的胶囊化
将聚尿苷酸(poly-U,Sigma,Dorset UK)胶囊化在聚丙交酯微粒中。简言之,将10mg的poly-U悬浮在0.5ml的聚乙烯醇(PVA)(13kDa~23kDa;1.5%w/v(重量/体积比);Sigma,Dorset UK)的水溶液中,并使用Silverson匀浆器(Silverson,Bucks.UK)激烈搅拌,使之与溶解在9ml的二氯甲烷(DCM;Sigma,Dorset UK)中的125mg聚丙交酯(PLA)混合。将所得乳液滴加入经激烈搅拌的含有3.0%w/v的PVA(13kDa~23kDa)的第二水相(90ml)中。在溶剂蒸发后,通过超速离心收获硬化的聚合微粒,然后进行冷冻干燥(Edwards,Crawley UK)。
实施例2
Poly-U在N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)稳定化的聚丙交酯微粒中的胶囊化
将10mg的poly-U溶解在0.5ml体积的蒸馏水中。使用Silverson匀浆器(Silverson,Bucks.UK)激烈搅拌,使之与溶解在9ml的DCM(Sigma,Dorset UK)中的125mg PLA混合。将所得乳液滴加入经激烈搅拌的含有0.1%w/v DOTAP的第二水相(90ml)中。在溶剂蒸发后,通过超速离心收获硬化的聚合微粒,然后在1%w/v海藻糖(Sigma,DorsetUK)中进行冻干(Edwards,Crawley UK)。
实施例3
Poly-U和卵清蛋白(OVA)在DOTAP稳定化的聚丙交酯微粒中的胶囊化
通过共加入在0.5ml蒸馏水中的5mg的OVA和10mg的poly-U,按照实施例2所描述的那样,将卵清蛋白(OVA;Sigma,Dorset,UK)胶囊化在聚丙交酯微粒中。
在上述实施例中,如通过纳米微滴(NanoDrop)技术所证实,从PVA-和DOTAP稳定化的微粒中成功地提取出RNA(结果未示出)。
实施例4
卵清蛋白(OVA)微粒的制备
在没有poly-U的情况下,按照实施例3所述制备微胶囊化的OVA。
实施例5
poly-U在N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵稳定化的聚丙交酯微粒表面上的吸附
采用改进的单乳液溶剂蒸发法制备阳离子微粒。使用Silverson匀浆器(Silverson,Bucks.UK)激烈搅拌,将溶解在9ml的DCM(Sigma,DorsetUK)中的125mg PLA与90ml体积的0.1%w/v DOTAP混合。在溶剂蒸发后,通过超速离心收获硬化的聚合微粒,然后进行冻干(Edwards,Crawley UK)。在即将使用前,poly-U随后以5重量%的装载量吸附到微粒上。
实施例6
CpG DNA在装载有OVA的微粒的表面上的吸附
通过使CpG吸附到所述微粒的表面上,用CpG(MWG-BIOTECHLtd,Bucks,UK)“修饰”按照实施例3所述而制备的装载有卵清蛋白的微粒。将装载有7mg OVA的微粒悬浮在0.7ml的CpG DNA(ggTGCATCGATGCAgggggG)溶液中,所述CpG DNA溶液为800μg/ml的所述CpG DNA在无菌盐水中的溶液。在室温下,将微粒在此溶液中孵育20分钟。
实施例7
采用激光衍射分析来测定微粒粒度分布
使用Mastersizer 2000(Malvern Instruments,Malvern,UK)测定按如上所述在实施例1、2、3和4中制备的微粒的尺寸。激光衍射测量法揭示,所述经装载的聚丙交酯微粒具有大约1μm的粒度分布(如图1所示)。PVA稳定化的制剂(图1A)和DOTAP稳定化的制剂(图1B)都有相似的粒度分布。
实施例8
扫描电子显微镜
使用扫描电子显微镜(Hitachi S800)研究微球体的尺寸和形状。使用Pro Plus图像分析软件来分析图像。图2显示,PVA稳定化的制剂(图2A)和DOTAP稳定的制剂(图2B)均有相似的粒度分布和形状。
实施例9
微粒表面电荷的分析
使用Zetamaster(Malvern Instruments,Malvern,UK)测定根据实施例1、2、3和4制备的微粒的ζ电势。结果总结在以下的表1中,该结果表明,与使用PVA作为稳定剂制备的微球体(-0.90)相比,用DOTAP稳定的微粒具有明显要多的正ζ电势(+41.81)。
表1使用聚乙烯醇(PVA)或N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)作为稳定剂制备的空微粒或装载有RNA的微粒的ζ电势的测量结果(重复数=3)
制剂 | ζ电势(平均数±SE) |
含有RNA的PVA稳定化的微粒 | -0.90±1.03 |
PVA稳定化的空微粒 | -5.57±1.48 |
含有RNA的DOTAP稳定化的微粒 | +41.81±3.77 |
DOTAP稳定化的空微粒 | +46.54±4.78 |
实施例10
Poly-U与聚乙烯亚胺(PEI)的复合
在即将用以与如上述实施例1、2和5制备的微胶囊化的poly-U进行比较研究之前,将20μg的poly-U与30μl在150mM NaCl中的20mM聚乙烯亚胺(2kD PEI;Aldrich)混合。
实施例11
Flt3-L扩增性骨髓来源树突细胞的分离和培养
使用由Gillet等改进的方法(Journal of Experimental Medicine,195,(2002)953)制备含有骨髓来源浆细胞样和骨髓样树突细胞(BMDC)的大批培养物。简言之,通过脱颈法(根据1986年动物科学程序法案(Animal(Scientific Procedures)Act 1986)杀死6~8周龄的雌性C57/BL6(CharlesRiver,UK)。从后腿中移除胫骨和腓骨,然后放置在无菌培养基(RPMI-1640)(Sigma,UK)中,所述无菌培养基补充有10%热灭活胎牛血清(FBS)(Sigma,UK)、1%青霉素/链霉素/谷氨酰胺(Sigma,UK)和50μM的2-巯基乙醇(2-ME)(Sigma,UK)以送至二级微生物安全柜中。随后使用25号针头通过骨干注射所述补充型培养基而将骨髓排出。清洗细胞,然后再悬浮于1mL的培养基中,并测定存活细胞数。将细胞浓度调节至2×106个细胞/mL,然后往培养基中进一步补充100ng/mL的鼠Fms样酪氨酸激酶受体-3配体因子(Flt3L;R&D Systems,Oxford,UK)。将细胞铺在6孔组织培养板(Sterilin,Stone,UK)上,并在存在5%CO2的充分潮湿环境中,在37℃孵育。5天之后,移去一半培养基并更换以新鲜Flt3L补充型培养基。10天之后,清洗细胞,并以2×106个细胞/ml重新接种在无菌平底96孔组织培养板(Sterilin,Stone,UK)中。
实施例12
树突细胞激活测试:装载有poly-U的微球体
按照实施例11所述进行制备的C57BL/6 Flt3L BMDC的大批培养物与逐步提高剂量的poly-U在无菌96孔平底板中进行共培养。DC也与逐步提高剂量的如实施例1和2所述的聚丙交酯微粒胶囊化的ssRNA进行共培养。添加到培养物中的微胶囊化的poly-U的质量与使用的游离ssRNA的剂量相当(基于100%的理论装载效率;即假设在配制过程中使用的100%的ssRNA均已加入)。也测试了将所述细胞与逐步增加量的聚丙交酯空微粒进行孵育的效果。DC也与逐步提高剂量的PEI缩合ssRNA(如实施例10所述进行制备)进行共培养。1nmol的K-型(常规的)CpG(ODN1668:tccatgacgttcctgatgct)和A/D-型CpG(D19:ggTGCATCGATGCAgggggG)用作阳性对照。将细胞与各种刺激物共培养18小时。通过将细胞和制剂在10000rpm下离心10分钟,得到培养物上清液。使用商购的ELISA试剂盒(R&D systems,Oxford UK)对使用poly-U和CpG进行刺激的DC培养物进行量化。
结果
Flt3-L扩增性骨髓来源树突细胞的大批培养物的细胞因子分泌量因刺激物的性质和剂量而异。正如所料,CpG DNA刺激IFN-α的高水平生成(如图3所示)。最近,Diebold等[Science,303,(2004),1529]已证明,PEI复合的poly-U能用于有效地刺激浆细胞样树突细胞分泌I型干扰素。图3中所示的结果证实了这一点,并且还指出,恰当配制的含有ssRNA的聚合(聚丙交酯)微粒能用于刺激从浆细胞样树突细胞中分泌IFN-α。为此,使用DOTAP作为稳定剂制备的装载有poly-U的聚丙交酯微粒是IFN-α生成的有效刺激物。与暴露于未配制(游离)的poly-U的DC相比,由DOTAP稳定化的装载有poly-U的微粒所刺激的IFN-α的水平明显(P<0.001)更高,该水平与用PEI缩合的poly-U刺激形成的IFN-α的水平相当。相反,DC与使用PVA作为稳定剂制备的装载有poly-U的聚丙交酯微粒进行共培养,结果导致低水平的IFN-α的生成。DC与聚丙交酯“空”微粒的共培养物未能刺激IFN-α的生成,而不管在制剂中所使用的稳定剂类型如何。此外,在通过DC刺激IFN-α的生成方面,用带正电荷的表面装载有poly-U的聚丙交酯微粒对DC进行的刺激是无效的。
如图4所示,游离的poly-U和聚丙交酯微粒胶囊化的poly-U能刺激Flt3L扩增性骨髓来源树突细胞的大批培养物的TNF-α生成。通过使用PVA作为稳定剂制备的装载有poly-U的聚丙交酯微粒的刺激能引发最高水平的TNF-α生成。通过对比,使用DOTAP作为稳定剂制备的装载有poly-U的聚丙交酯微粒是较低效率的TNF-α生成刺激物。用PEI浓缩的poly-U未能引起显著水平的TNF-α生成。
Flt3-L扩增性骨髓来源树突细胞的大批培养物的IL-12p40生成在如图5所示的宽范围的刺激后发生。游离的poly-U在高刺激剂量(1μg~100μg)下能有效地引发适当水平的IL-12p40分泌。然而,在低刺激剂量(1μg~100ng)下,微胶囊化在DOTAP稳定化的微粒中的poly-U是IL-12 p40生成的最有效的刺激物(P<0.05,与所有其他poly-U处理组相比)。
实施例13
树突细胞活性测试:装载有OVA的微粒
按照实施例11所述制备C57BL/6 Flt3L扩增性骨髓来源树突细胞的大批培养物,并将其与含有共胶囊化的OVA或者OVA与1μg的poly-U的微粒制剂进行共培养。还使用装载有OVA并用CpG修饰的微粒以及OVA和CpG的溶液对细胞进行刺激。蛋白质和核酸装载值假定为100%的最大理论值。因此用相当于OVA和CpG的最大量的剂量水平对细胞进行刺激,其中所述OVA和CpG的最大量理论上存在于与具有100%效率的胶囊化/吸附过程相当的微粒处理组中。还测试了所述细胞与相当量的聚丙交酯空微粒孵育的效果。将细胞与各种刺激物共培养18小时。通过将细胞和制剂在10000rpm下离心10分钟,得到培养物上清液。使用商购的ELISA试剂盒(R&D systems,Oxford UK)对上清液中的细胞因子水平进行量化。使用ANOVA(方差分析)和Student-Newman-Keuls检验确定统计差异。
结果
如使用流式细胞计确定的那样,Flt3L扩增性BMDC的大批培养物同时含有CD11bHi B220Low(骨髓样)和CD11bLow B220Hi(浆细胞样)型DC(未示出)。Flt3-L扩增性BMDC的大批培养物的细胞因子分泌的数量和模式因刺激物的性质而异。图6显示,混合有CpG DNA的OVA刺激干扰素-α(IFN-α)的高水平生成。然而,当使用装载有OVA并用CpG修饰的微粒刺激细胞时,IFN-α分泌依然较高(P<0.05)。与空微粒或者仅装载有OVA的微粒相比较,含有poly-U或者poly-U和OVA的微粒刺激更高水平的IFN-α(P<0.05)。
当使用装载有OVA并用CpG修饰的微粒刺激细胞时,上清液中的TNF-α水平最高(P<0.05)。相对于其他处理,用可溶性抗原和CpG对细胞进行刺激也导致显著的TNF-α生成(P<0.05)。
当用装载有OVA并用CpG修饰其表面的微粒或者溶液中的CpG和OVA对BMDC进行刺激时,在培养物上清液中的IL-12p40浓度最高。与用装载有OVA的微粒刺激的培养物相比,用含有poly-U(还有OVA或者不再有OVA)的微粒进行刺激引起IL-12p40分泌水平的提高(P<0.05)。
用在溶液中的“裸露”poly-U刺激Flt3L扩增性BMDC的大批培养物引发其量可忽略的IFN-α、TNF-α和IL-12p40(结果未示出)。在所有测试浓度(10μg~0.001μg)下,PoIy-U“修饰”的微粒也根本未能刺激IFN-α或IL-12p40的生成。
实施例14
体内免疫化研究
所有试验均严格遵守1986年科学程序法案(1986 ScientificProcedures Act)。在试验的第0、14和28天,通过皮下注射至侧腹部而对6~8周龄的雌性C57/BL6(Charles River,UK)小鼠进行免疫。微粒装载值假设为最大理论值,即100%。因此,与用微粒材料进行免疫的小鼠相比,用可溶性抗原/TLR激动剂给药的小鼠接受或者相同或者更高的剂量。
小鼠接受100μl无菌盐水的注射液,所述无菌盐水包含:(1)1mg含有40μg OVA的微粒,(2)1mg含有40μg OVA和80μg poly-U的微粒,(3)1mg含有40μg OVA和80μg吸附在表面上的CpG的微粒,(4)含有40μg OVA和80μg CpG的溶液,或(5)含有40μg OVA和80μg poly-U的溶液。第六组作为幼稚对照。
实施例15
血清抗OVA抗体水平的测定
对按照实施例14进行免疫的小鼠在第32天采血而得到血清。使用标准ELISA方法分析血清的抗OVA抗体。简言之,将个体血清样品均分至用OVA(在PBS中,5μg/ml)预先涂布的微量滴定板上。用抗小鼠IgG1和IgG2a的过氧化物酶标记的第二抗体(Harlan-SeraLab,Crawley Down,UK)检测血清抗体的结合。由于每一个亚类特异性偶联物与其亚类分子的反应性可能不同,为便于将一个亚类的滴度与另一个的进行比较,因此分析了浓度为0.2ng/ml~50.0ng/ml的每一亚类抗体的标准溶液(Harlan-SeraLab,Crawley Down,UK)。绘得的标准曲线能测出得自各个处理组的血清中的每个IgG亚类的平均浓度。使用统计检验(Dunnett)来确定,与对照(幼稚)动物相比,任一免疫处理是否刺激了更高水平的特异性抗体。
结果
通过与幼稚小鼠进行比较,注射装载有OVA并用CpG修饰的微粒的小鼠具有显著的抗OVA抗体滴度,但注射含有OVA和poly-U的微粒的小鼠表现出增强的抗体应答(如图7所示)。在血清转化小鼠中,IgG1是检测到的主导抗OVA抗体。对小鼠注射装载有OVA的微粒或者注射可溶性OVA与CpG的混合物,可在一些小鼠中引起特异性血清抗OVAIgG1应答,但组内变异使得该效果在与幼稚动物比较时缺乏统计学上的显著性。注射混合有poly-U的OVA溶液引起可忽略的血清抗OVA IgG水平。抗OVA IgG2a只是在使用和CpG或poly-U共配制的抗原进行免疫的小鼠中才被检测到。
实施例16
细胞应答的分析:ELISPOT分析
在第35天,杀死按照实施例14进行免疫的小鼠,并按个体(而不是集中)将脾取下。在补充型RPMI-1640中制备单细胞悬浮液。
根据制造商的指导来使用IFN-γ和IL-4 ELISPOT试剂盒(BDBiosciences,Oxford,UK)。简言之,用100μl的5μg/ml在PBS中的捕获抗体涂布具有硝化纤维素底部的96孔板,并在40℃孵育过夜。用200μl的补充型RPMI处理2小时而封闭游离结合位点。将脾细胞浓度调节为2.5×106个细胞/ml,并将其加至适当的孔中。分析细胞时,总是按来自于每个处理组中的单只小鼠来进行。或者使用5μg/ml在补充型RPMI-1640中的OVA,或者单独使用补充型RPMI-1640作为阴性对照,或者使用2.5μg/ml刀豆球蛋白A(Concanavalin A)(Sigma,Dorset,UK)作为阳性对照来对细胞进行过夜刺激,设三次重复。通过先使用dH2O然后使用含有0.05%吐温-20的PBS清洗而移除细胞。用生物素标记的抗小鼠细胞因子抗体和与链菌亲和素结合的辣根过氧化物酶来检测细胞因子分泌位点。使用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)底物试剂组(Sigma,Dorset,UK)对酶反应进行显色。使用解剖光显微镜(dissecting light microscope;ZeissStemi 2000)测定斑点形成细胞的数目,并以相对于铺板的1×106个细胞表示。采用ANOVA和Student-Newman-Keuls检验来确定统计差异。
结果
如使用ELISPOT所进行的检测,注射装载有OVA的微粒会引发比IFN-γ分泌细胞更多的OVA特异性IL-4分泌脾细胞数量;指示Th2型应答的曲线如图8所示。如果用同时含有OVA和ssRNA的微粒对小鼠进行注射,则该趋势得到逆转。实际上,与任何其他处理组相比,注射共胶囊化的OVA和ssRNA会产生最多数量的OVA特异性IFN-γ分泌细胞(P<0.05)。与CpG促进Th1应答的见解相吻合的是,注射装载有OVA并用CpG修饰的微粒或者在含有CpG的溶液中的OVA,会诱发合适数量的OVA特异性IFN-γ分泌T细胞(P<0.05)。与用装载有OVA的微粒或者装载有OVA和poly-U的微粒进行免疫的小鼠相比,用装载有OVA并用CpG修饰的微粒或者在溶液中的OVA与CpG进行免疫的小鼠的OVA特异性IL-4分泌细胞的数目明显偏低(P<0.05)。注射混合有poly-U的OVA溶液,会导致其量可忽略的OVA特异性IL-4和IFN-γ分泌脾细胞。
实施例17
细胞应答的分析:淋巴结细胞的四聚体染色和FACS分析
在第35天,杀死按照实施例14进行免疫的小鼠,取下与注射部位连通(draining)的腹股沟淋巴结并收集用于四聚体分析。在补充型RPMI-1640中制备单细胞悬浮液。在增湿的5%CO2环境下,在37℃,用OVA(50μg/ml)刺激淋巴结细胞的单细胞悬浮液72小时。在刺激后,从培养板上分离细胞并使用iTAgTM MHC I类鼠四聚体-SA-PE试剂盒(Beckman Coulter,Immunomics,France)染色。除四聚体染色以外,还使用FITC偶联CD 3(Pharmingen,BD Biosciences,UK)和Cy 5.5偶联CD8(Pharmingen,BD Biosciences,UK)抗体来染色细胞。所有染色和固定过程均按照制造商的说明书进行。在固定后,在BD FACScan流式细胞计上对细胞进行分析。使用相应的同型对照来确立用于分析的象限和/或区域。使用Cell Quest Pro流式细胞计分析软件进行分析。
结果
来自于经免疫的小鼠的淋巴结细胞的四聚体染色揭示,OVA和poly-U的共微胶囊化可生成抗原特异性CD8+T细胞(如图9所示)。如增强的FL2信号所证实,用共微胶囊化的OVA和poly-U(图9A)进行免疫的小鼠具有更多数量的带有结合四聚体的CD8细胞。图9B显示由幼稚小鼠得到的曲线。
Claims (30)
1.一种微粒组合物,所述微粒组合物含有:
(a)生物降解性聚合物;
(b)免疫原性单链核糖核酸;
(c)生物活性大分子;和
(d)稳定剂;
其中,所述生物活性大分子、单链核糖核酸和稳定剂被胶囊化在所述生物降解性聚合物的内侧和/或内部,以使所述微粒的外表面空闲。
2.如权利要求1所述的微粒组合物,其中,所述生物降解性聚合物具有生物相容性并且在哺乳动物组织中降解。
3.如权利要求1或2所述的微粒组合物,其中,所述生物降解性聚合物是脂肪族聚酯。
4.如权利要求1~3中任一项所述的微粒组合物,其中,所述生物降解性聚合物是聚丙交酯。
5.如前述权利要求中任一项所述的微粒组合物,其中,所述免疫原性单链核糖核酸能够刺激促炎细胞因子和/或抗病毒细胞因子的生成。
6.如权利要求5所述的微粒组合物,其中,所述单链核糖核酸刺激抗病毒细胞因子的生成。
7.如权利要求6所述的微粒组合物,其中,所述抗病毒细胞因子是INF-α和/或INF-β和/或IL-12。
8.如权利要求1~7中任一项所述的微粒组合物,其中,所述单链核糖核酸能够刺激宿主细胞的Toll样受体。
9.如权利要求8所述的微粒组合物,其中,所述单链核糖核酸刺激TLR-7和/或TLR-8。
10.如前述权利要求中任一项所述的微粒组合物,其中,所述单链核糖核酸具有主要富含单一碱基的序列。
11.如权利要求10所述的微粒组合物,其中,所述单链核糖核酸序列主要由鸟嘌呤和/或尿嘧啶组成。
12.如权利要求10或11所述的微粒组合物,其中,所述单链核糖核酸是聚尿苷酸。
13.如前述权利要求中任一项所述的微粒组合物,其中,所述生物活性大分子是寡脱氧核苷酸或病原体特异性抗原。
14.如权利要求13所述的微粒组合物,其中,所述生物活性大分子是细菌病原体特异性抗原或病毒病原体特异性抗原。
15.如权利要求13或14所述的微粒组合物,其中,所述生物活性大分子是炭疽杆菌的重组的保护性抗原。
16.如前述权利要求中任一项所述的微粒组合物,其中,所述生物活性大分子是在肿瘤细胞上表达的抗原。
17.如前述权利要求中任一项所述的微粒组合物,其中,所述稳定剂是能与所述单链核糖核酸形成复合物的药用化合物。
18.如权利要求17所述的微粒组合物,其中,所述稳定剂是阳离子聚合物或阳离子脂质。
19.如权利要求17或18所述的微粒组合物,其中,所述稳定剂是N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵。
20.如前述权利要求中任一项所述的微粒组合物,其中,所述组合物具有总净正电荷。
21.如权利要求20所述的微粒组合物,其中,所述组合物具有0mV~100mV的ζ电势,优选具有20mV~80mV的ζ电势,更优选具有30mV~60mV的ζ电势。
22.如前述权利要求中任一项所述的微粒组合物,其中,得到的所述微粒具有0.1μm~5μm的平均直径,更优选具有0.2μm~4μm的平均直径。
23.如权利要求22所述的微粒组合物,其中,所述微粒具有约1μm的平均直径。
24.制备权利要求1~23所述的微粒组合物的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)制备生物降解性聚合物的溶液;
(b)将含有免疫原性单链核糖核酸和生物活性大分子的溶液加入到步骤(a)的所述溶液中以形成乳液;
(c)将来自步骤(b)的所述乳液加入到含有稳定剂的溶液中以形成双乳液;
(d)除去溶剂;以及
(e)收集所得的微粒。
25.如权利要求24所述的方法,其中,所述微粒进一步经过冻干步骤。
26.一种药物组合物,该药物组合物含有权利要求1~23中任一项所述的微粒组合物和药用佐剂和/或赋形剂。
27.如权利要求26所述的药物组合物,该药物组合物应用于医学中。
28.权利要求26所述的药物组合物在制备用于治疗病原体感染的药物中的应用。
29.权利要求26所述的药物组合物在制备用于刺激宿主细胞的Toll样受体的药物中的应用。
30.权利要求26所述的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
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