PT1162999E

PT1162999E - Vacina contra streptococcus pneumoniae

Info

Publication number: PT1162999E
Application number: PT00916983T
Authority: PT
Inventors: Jean-Paul Prieels; Jan Poolman; Carine Capiau; Marguerite Deschamps; Pierre Michel Desmons; Craig A J Laferriere
Original assignee: Glaxosmithkline Biolog Sa
Priority date: 1999-03-19
Filing date: 2000-03-17
Publication date: 2007-02-28
Also published as: HUP0200664A2; US20030147922A1; DE60043930D1; DE60032120D1; AR022963A1; JP2002540075A; EP1880735A2; CZ301445B6; AU3430700A; CY1107561T1; AU3291900A; TR200102736T2; CZ20013380A3; ES2275499T3; JP2002539273A; CZ20013378A3; FR10C0008I2; EP1880735A3; JP2002540074A; HUP0200367A2

Description

DESCRIÇÃO "VACINA CONTRA STREPTOCOCCOS PNEUMONIAE"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a vacinas de antigénio polissacaridico bacteriano, à sua produção e à utilização desses polissacáridos em medicamentos.

Em particular, a presente invenção refere-se a vacinas compreendendo um antigénio polissacaridico de Streptococcus pneumoniae, misturado com um antigénio proteico de Streptococcus pneumoniae e um adjuvante indutor de Thl.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 Streptococcus pneumoniae é uma bactéria Gram positiva responsável por morbidez e mortalidade consideráveis (em particular em jovens e idosos), causando doenças invasivas, tais como, pneumonia, bacteremia e meningite e doenças associadas com colonização, tais como Otite média aguda. A taxa de pneumonia pneumocócica nos EU, para pessoas com mais de 60 anos de idade é estimada como sendo 3 a 8 por 100000. Em 20% dos casos, isto origina bacteremia e outras manifestações, tal como meningite, com uma taxa de mortalidade próxima de 30%, mesmo com tratamento com antibiótico. 1 0 pneumococo está encapsulado com um polissacárido ligado quimicamente, o qual confere a especificidade do serotipo. São conhecidos 90 serotipos de pneumococos e a cápsula é o principal determinante da virulência para pneumococos, dado que a cápsula, não apenas protege a superfície interna das bactérias do complemento, como é fracamente imunogénica. Os polissacáridos são antigénios independentes de T e não podem ser processados ou apresentados em moléculas MHC, para interagir com células T. Estes podem, no entanto, estimular o sistema imunitário, através de um mecanismo alternativo que envolve a reticulação de receptores superficiais nas células B.

Foi mostrado em várias experiências que a protecção contra a doença invasiva dos pneumococos está correlacionada mais significativamente com anticorpos específicos para a cápsula e a protecção é específica para o serotipo.

As vacinas baseadas em antigénios polissacarídicos são bem conhecidas na técnica. Quatro das que foram autorizadas para utilização humana incluem o polissacárido Vi de Salmonella typhi, o polissacárido PRP de Haemophilus influenzae, a vacina meningocócica tetravalente composta pelos serotipos A, C, W135 e Y e a vacina pneumocócica 23-Valente composta pelo polissacárido correspondente aos serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33 (dizendo respeito a, pelo menos, 90% dos isolados pneumocócicos sanguíneos).

As últimas três vacinas conferem protecção contra bactérias que causam infecções respiratórias que resultam em morbidez e mortalidade graves em bebés, ainda que estas vacinas não tenham sido autorizadas para utilização em crianças com menos de dois 2 anos de idade, uma vez que estas são inadequadamente imunogénicas neste grupo etário [Peltola et al. (1984), N. Engl. J. Med. 310: 1561-1566]. Streptococcus pneumoniae é a causa mais comum de doença bacteriana invasiva e Otite média em bebés e crianças pequenas. Do mesmo modo, os idosos apresentam respostas fracas às vacinas pneumocócicas [Roghmann et al., (1987), J. Gerontol. 42: 265-270], dai a incidência aumentada de pneumonia bacteriana nesta população [Verghese e Berk, (1983) Medicine (Baltimore) 62: 271-285].

As estratégias que foram concebidas para superar esta falta de imunogenicidade em bebés, incluem a ligação do polissacárido a grandes proteínas imunogénicas, as quais proporcionam o auxilio de células T espectadoras e que induzem memória imunológica contra o antigénio polissacarídico ao qual são conjugadas. As vacinas de conjugados de glicoproteínas pneumocócicas estão ser actualmente avaliadas em termos de segurança, imunogenicidade e eficácia em vários grupos etários. A) Vacinas de polissacáridos pneumocócicos A vacina pneumocócica 23-valente não conjugada apresentou uma ampla variação na eficácia clinica, de 0% a 81% (Fedson et al. (1994) Arch Intern Med. 154: 2531-2535). A eficácia parece estar relacionada com o grupo de risco que está a ser imunizado, tais como os idosos, doença de Hodgkin, esplenectomia, doença das células falciformes e agamaglobulinémicos (Fine et al. (1994) Arch Intern Med. 154: 2666-2677) e também à manifestação da doença. A vacina 23-valente não demonstra a protecção contra a pneumonia pneumocócica (em alguns grupos de risco elevado, tais como, os idosos) e doenças de otite média. 3

Existe, consequentemente, uma necessidade para composições melhoradas de vacinas pneumocócicas, particularmente, as que serão mais eficazes na prevenção ou na melhoria da doença pneumocócica (particularmente pneumonia) nos idosos e em crianças pequenas. A presente invenção proporciona essa vacina melhorada.

B) Composições Seleccionadas de Conjugado Polissacaridico Pneumocócico + 3D-MPL É geralmente aceite que a eficácia protectora da vacina pneumocócica não conjugada comercializada está, aproximadamente, relacionada com a concentração do anticorpo induzido após a vacinação; de facto, os 23 polissacáridos foram aceites para licenciamento, apenas com base na imunogenicidade de cada componente polissacaridico (Ed. Williams et ai. New York Academy of Sciences 1995 pp. 241-249). Consequentemente, uma maior intensificação das respostas dos anticorpos aos polissacáridos pneumocócicos pode aumentar a percentagem de bebés e idosos que respondem com niveis protectores do anticorpo à primeira injecção de polissacárido ou de conjugado de polissacárido e pode reduzir a dosagem e o número de injecções necessárias para induzir imunidade protectora contra infecções causadas por Streptococcus pneumoniae.

Desde o inicio do século 20 que os investigadores experimentaram um imenso número de compostos que podem ser adicionados a antigénios para melhorar a sua imunogenicidade em composições de vacina [revisto em M. F. Powell e M. J. Newman, 4

Plenum Press, NY, "Vaccine Design - the Subunit and Adjuvant Aproach" (1995) Capitulo 7 "A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients"]. Muitos são bastante eficientes, mas causam reacções adversas locais e sistémicas significativas que impedem a sua utilização em composições de vacinas humanas. Os adjuvantes à base de alumínio (tais como alúmen, hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio), inicialmente descritos em 1926, permanecem os únicos adjuvantes imunológicos utilizados em vacinas humanas autorizadas nos Estados Unidos.

Os adjuvantes à base de alumínio são exemplos da classe dos veículos adjuvantes, a qual actua através do "efeito de reservatório" que estes induzem. 0 antigénio é adsorvido na sua superfície e quando a composição é injectada, o adjuvante e o antigénio não se dissipam imediatamente no fluxo sanguíneo - em vez disso, a composição persiste no ambiente do local da injecção e resulta numa resposta imunitária mais pronunciada. Esses veículos adjuvantes têm a vantagem conhecida, adicional, de serem adequados para estabilizar antigénios que são propensos à quebra como, por exemplo, alguns antigénios polissacarídicos. 0 3D-MPL é um exemplo de um adjuvante não-veículo. 0 seu nome completo é monofosforil lípido A 3-desacilado (ou monofosforil lípido A 3-Des-O-acilado ou 3-0-desacil-4' monofosforil lípido A) e é designado como 3D-MPL para indicar que a posição 3 da extremidade glucosamina redutora está des-O-acilada. Para a sua preparação, ver o documento GB 2220211 A. Quimicamente este é uma mistura de monofosforil lípido A 3-desacilado com 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Foi originalmente preparado no início dos anos 1990 quando o método para 3-O-desacilar o derivado 4'-monofosforil lípido A (MPL) originou 5 uma molécula com toxicidade mais atenuada, sem modificação da actividade imunostimulante. 0 3D-MPL tem sido utilizado como um adjuvante, quer isoladamente, quer, de um modo preferido, combinado com um veiculo adjuvante do tipo reservatório, tal como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio ou emulsões de óleo-em-água. Nessas composições, o antigénio e o 3D-MPL estão contidos nas mesmas estruturas particuladas, permitindo uma distribuição mais eficiente de sinais antigénicos e imuno-estimulantes. Os estudos demonstraram que o 3D-MPL é capaz de intensificar adicionalmente a imunogenicidade de um antigénio adsorvido em alúmen [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708-14/ documento EP 689454-B1]. Essas combinações são também preferidas na técnica, para antigénios que são propensos à adsorção (por exemplo, conjugados de polissacáridos bacterianos), em que a adsorção no alúmen tende a estabilizar o antigénio. Os adjuvantes à base de alumínio precipitado são os mais utilizados, uma vez que estes são os únicos adjuvantes que são actualmente utilizados em vacinas humanas autorizadas. Consequentemente, as vacinas contendo 3D-MPL em combinação com adjuvantes à base de alumínio são favorecidas na técnica, devido à sua facilidade de desenvolvimento e velocidade de introdução no mercado.

O MPL (não 3-desacilado) tem sido avaliado como um adjuvante com vários antigénios de vacina de conjugados polissacarídicos monovalentes. A co-injecção de MPL em soro fisiológico intensificou a resposta dos anticorpos do soro para quatro conjugados polissacarídicos monovalentes: PS 6B pneumocócico-toxóide do tétano, PS 12 pneumocócico-toxóide da difteria e S. aureus do tipo 5 e S. aureus do tipo 8 conjugadas com a exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa [Schneerson et al. 6 J. Immunology (1991) 147: 2136-2140]. As respostas intensificadas demonstraram ser especificas para um antigénio. O MPL numa emulsão de óleo-em-água (um adjuvante de tipo veiculo) intensificou consistentemente o efeito do MPL em soro fisiológico, devido à presença de MPL e antigénio na mesma estrutura particulada e foram consideradas como sendo o sistema de adjuvante preferido para a distribuição óptima de outras vacinas de conjugado polissacaridico.

Devi et al. [Infect. Immun. (1991) 59:3700-7] avaliaram o efeito como adjuvante do MPL (não 3-desacilado, ) em soro fisiológico, na resposta de anticorpos murinos a um polissacárido capsular de Cryptococcus neoformans, conjugado com TT. Quando foi utilizado MPL simultaneamente com o conjugado, verificou-se apenas um aumento marginal na resposta ao PS, tanto especifica para IgG, como para IgM; no entanto o MPL teve um efeito muito maior quando administrado 2 dias após o conjugado.

As razões de ordem prática para utilizar um esquema de imunização que requer um atraso na administração do MPL em relação ao antigénio, especialmente em bebés, é duvidosa. 0 efeito de adjuvante do MPL com polissacáridos e conjugados polissacarídicos-proteina parece ser dependente da composição. Novamente, a incorporação do MPL num sistema de distribuição de libertação lenta adequado (por exemplo, utilizando um veiculo adjuvante) proporciona um efeito de adjuvante mais durável e contorna o problema dos tempos e da administração retardada.

Em resumo, o estado da técnica mostrou que, para um polissacárido ou antigénios conjugados polissacaridicos em particular, em que é utilizado MPL ou 3D-MPL como adjuvante, este é vantajosamente utilizado juntamente com um veiculo 7 adjuvante (por exemplo, os adjuvantes à base de alumínio), de forma a maximizar o seu efeito imuno-estimulante.

Surpreendentemente, o presente requerente verificou que, para determinados conjugado polissacarídicos pneumocócicos, a imunogenicidade da composição de vacina é significativamente superior quando o antigénio é formulado com 3D-MPL apenas e não com 3D-MPL juntamente com um adjuvante veículo (tal como um adjuvante à base de alumínio). Além disso a melhoria observada é independente da concentração de 3D-MPL utilizada e de se os conjugados particulares estão numa composição monovalente ou se estes estão combinados para formar uma composição polivalente.

C) Conjugados de Polissacáridos bacterianos - proteína D

Como referido acima, as vacinas baseadas num antigénio polissacarídico são bem conhecidas na técnica. As vacinas polissacarídicas autorizadas referidas acima têm diferentes eficácias clínicas demonstradas. Foi estimado que a vacina de polissacárido Vi tenha uma eficácia entre 55% e 77% na prevenção de febre tifoide confirmada por cultura (Plotkin e Carne, (1995) Arch Intern Med 155:2293-99). A vacina polissacarídica meningocócica C demonstrou ter uma eficácia de 79% em condições epidémicas (De Wals P, et al. (1996) Buli World Health Organ. 74:407-411). A vacina pneumocócica 23-valente demonstrou uma variação ampla em termos de eficácia clínica, de 0% a 81% (Fedson et al. (1994) Arch Intern Med. 154:2531-2535). Como referido acima, é aceite que a eficácia protectora da vacina pneumocócica esteja mais ou menos relacionada com a concentração do anticorpo induzido após a vacinação.

Entre os problemas associados com a abordagem polissacarídica da vacinação, encontra-se o facto de os polissacáridos per se serem imunogénios fracos. As estratégias que foram concebidas para superar esta falta de imunogenicidade incluem a ligação do polissacárido a veiculos proteicos grandes altamente imunogénicos, que proporcionam auxilio de células T espectadoras.

Os exemplos destes veiculos altamente imunogénicos que são, no presente, normalmente utilizados para a produção de imunogénios polissacaridicos, incluem o toxóide da Difteria (DT ou o mutante CRM197), toxóide do Tétano (TT) , hemocianina de Lapa da Califórnia (KLH) e o derivado de proteína purificada da Tuberculina (PPD).

Problemas Associados com Veículos Normalmente Utilizados

Encontram-se associados vários problemas a cada um destes veículos normalmente utilizados, incluindo na produção de conjugados de GMP e, também, nas características imunológicas dos conjugados.

Apesar da utilização comum destes veículos e do seu sucesso na indução de respostas de anticorpos anti-polissacarídicos, estes estão associados com vários inconvenientes. Por exemplo, é sabido que as respostas imunitárias específicas para um antigénio podem ser suprimidas (supressão do epitopo) pela presença de anticorpos pré-existentes dirigidos contra o veículo, neste caso, toxina do Tétano (Di John et al; (1989) Lancet, 2: 1415-8). No conjunto da população, uma percentagem muito elevada de pessoas terá imunidade pré-existente contra o 9 DT e o TT, uma vez que as a pessoas são rotineiramente vacinadas com estes antigénios. No Reino Unido, por exemplo, 95% das crianças recebe a vacina DTP compreendendo o DT e o TT. Outros autores descreveram o problema da supressão do epitopo em vacinas peptidicas em modelos animais (Sad et al, Immunology, 1991/ 74: 223-227; Schutze et al, J. Immunol. 135: 4,1985; 2319-2322) .

Para além disso, para vacinas que requerem reforços regulares, a utilização de veiculos altamente imunogénicos, tais como o TT e o DT, irá, provavelmente, suprimir a resposta do anticorpo polissacaridico, após várias injecções. Estas múltiplas vacinações podem ser, também, acompanhadas por reacções indesejáveis, tais como, hipersensibilidade do tipo retardado (DTH). A KLH é conhecida como um imunogénio potente e foi já utilizada como um veículo para péptidos de IgE em ensaios clínicos humanos. No entanto, foram observadas algumas reacções adversas (reacções semelhantes à DTH ou sensibilização a IgE), assim como respostas de anticorpo contra anticorpo.

Consequentemente, a selecção de uma proteína veículo para uma vacina baseada num polissacárido irá requerer um equilíbrio entre a necessidade de utilizar um veículo que funcione em todos os doentes (amplo reconhecimento do MHC), a indução de níveis elevados de resposta dos anticorpos anti-polissacáridos e baixa resposta dos anticorpos contra o veículo.

Os veículos utilizados anteriormente para vacinas baseadas em polissacáridos têm, por isso, muitas desvantagens. Isto é particularmente verdade em vacinas de combinação, em que a 10 supressão do epitopo é especialmente problemática, se for utilizado o mesmo veiculo para vários antigénios polissacaridicos. No documento WO 98/51339, foram utilizados vários veículos em vacinas de combinação, de forma a tentar eliminar este efeito. A presente invenção proporciona um novo veículo para utilização na preparação dos conjugados imunogénicos baseados em polissacárido/polipéptido que não apresenta as desvantagens referidas acima. A presente invenção proporciona uma proteína D (documento EP 0594610 Bl) de Haemophilus influenzae ou os seus fragmentos, como um veículo de composições imunogénicas baseadas em polissacáridos, incluindo vacinas. A utilização deste veículo é particularmente vantajosa em vacinas de combinação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A) Vacinas de polissacáridos Pneumocócicos

Consequentemente, a presente invenção proporciona uma composição de vacina, compreendendo, pelo menos, um antigénio polissacarídico de Streptococcus pneumoniae (o qual pode estar conjugado com um veículo proteico) misturado com um antigénio proteico de Streptococcus pneumoniae ou um seu equivalente imunologicamente funcional. Juntamente com um adjuvante, o qual, de um modo preferido, induz uma resposta imunitária Thl, seleccionado de monofosforil lipido A ou de um seu derivado. Um imuno-estimulante saponina ou um oligonucleótido CP4 imuno- 11 estimulante. As composições da invenção são particularmente adequadas ao tratamento da pneumonia em idosos.

As vacinas de polissacáridos pneumocócicos (conjugadas ou não) podem não ser capazes de proteger a população idosa contra a pneumonia, para a qual a incidência desta doença é muito elevada. 0 mecanismo chave de defesa contra o pneumococo é a opsonofagocitose (um evento humoral mediado por células B/neutrófilos causado pela produção de anticorpos contra o polissacárido pneumocócico, sendo a bactéria finalmente fagocitada), no entanto parte dos mecanismos opsónicos envolvidos está reduzida nos idosos, i. e. produção de superóxido por PMN (células polimorfonucleares), produção de outras espécies de oxigénio reactivas, mobilização das PMN, apoptose das PMN, deformabilidade das PMN. As respostas dos anticorpos podem, também, estar reduzidas nos idosos.

Ao contrário do dogma normalmente aceite, os niveis normais dos anticorpos anti-polissacáridos capsulares podem não ser eficazes na remoção completa de bactérias, uma vez que os pneumococos podem invadir as células hospedeiras para evitar esta parte do sistema imunitário.

Surpreendentemente, o presente requerente verificou que o estimulo simultâneo da parte do sistema imunitário mediado por células (por exemplo imunidade mediada por células T) , para além da parte humoral do sistema imunitário (mediado por células B) , resulta numa sinergia (ou cooperação), a qual é capaz de intensificar a remoção de pneumococos a partir do hospedeiro. Isto é uma descoberta que irá auxiliar a prevenção (ou o tratamento) da infecção pneumocócica em geral, mas será particularmente importante na prevenção (ou no tratamento) da 12 pneumonia no idoso, em que as vacinas baseadas em polissacáridos não apresentam eficácia. 0 presente requerente verificou que ambos os ramos do sistema imunitário podem produzir deste modo uma sinergia, se for administrado um polissacárido pneumocócico (de um modo preferido, conjugado) com uma proteina pneumocócica (de um modo preferido, uma proteina expressa na superfície de pneumococos ou segregada ou libertada, que pode ser processada e apresentada no contexto da Classe II e da classe I do MHC, na superfície de células de mamífero infectadas). Embora uma proteína pneumocócica possa, por si, desencadear a imunidade mediada por células, o requerentes verificou, também que a presença de um dos adjuvantes indutores de Thl, referidos acima, na formulação da vacina, auxilia este ramo do sistema imunitário e, surpreendentemente, intensifica adicionalmente a sinergia entre ambos os ramos do sistema imunitário.

B) Composições Seleccionadas de Conjugado polissacaridico pneumocócico + 3D-MPL

Consequentemente, a presente invenção proporciona, também, uma composição antigénica compreendendo um ou mais conjugados polissacarídicos pneumocócicos adjuvados com 3D-MPL e substancialmente isentos de adjuvantes à base de alumínio, em que, pelo menos, um dos conjugados polissacarídicos pneumocócicos é significativamente mais imunogénico em composições compreendendo 3D-MPL, em comparação com composições compreendendo 3D-MPL juntamente com um adjuvante à base de alumínio. 13

As formas de realização preferidas proporcionadas são composições antigénicas compreendendo conjugados de um ou mais dos seguintes polissacáridos capsulares pneumocócicos: serotipo 4, 6B, 18C, 19F, e 23F. Nessas composições, cada um dos polissacáridos é surpreendentemente mais imunogénico em composições compreendendo 3D-MPL apenas, em comparação com composições compreendendo 3D-MPL e um adjuvante à base de alumínio.

Deste modo, é uma forma de realização da invenção ser proporcionada uma composição antigénica, compreendendo o serotipo 4,6B, 18C, 19F ou 23F do polissacárido capsular de

Streptococcus pneumoniae conjugado com uma proteína imunogénica e adjuvante 3D-MPL, em que a composição é substancialmente isenta de adjuvantes à base de alumínio.

Numa segunda forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição antigénica de combinação substancialmente isenta de adjuvantes à base de alumínio e compreendendo adjuvante 3D-MPL e dois ou mais polissacáridos pneumocócicos conjugados escolhidos do grupo consistindo em: serotipo 4; serotipo 6B; serotipo 18C; serotipo 19F; e serotipo 23F.

C) Conjugados de polissacáridos bacterianos - Proteina D

Consequentemente, a presente invenção proporciona um antigénio conjugado polissacarídico, compreendendo um antigénio polissacarídico derivado de uma bactéria patogénica conjugado com a proteína D de Haemophilus influenzae ou um seu fragmento de proteína D. Para além disso, a invenção proporciona 14 composições de vacina polivalentes, em que um ou mais dos antigénios polissacaridicos estão conjugados com a proteina D.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A) Vacinas de polissacáridos Pneumocócicos A presente invenção proporciona uma vacina melhorada, particularmente para a prevenção ou melhoria da infecção pneumocócica do idoso (e/ou de bebés e crianças pequenas).

No contexto da invenção, um doente é considerado idoso se tiver 55 ou mais anos de idade, tipicamente, mais de 60 anos e, mais geralmente, mais de 65 anos.

Deste modo, numa forma de realização da invenção, é proporcionada uma composição de vacina, adequada para a utilização em idosos (e/ou em bebés e crianças pequenas) compreendendo, pelo menos, um antigénio polissacarídico de Streptococcus pneumoniae e, pelo menos, um antigénio proteico de Streptococcus pneumoniae.

Numa segunda a forma de realização preferida, a presente invenção proporciona uma vacina (adequada para a prevenção da pneumonia no idoso) , compreendendo, pelo menos, um antigénio polissacarídico de Streptococcus pneumoniae e, pelo menos, um antigénio proteico de Streptococcus pneumoniae e um dos adjuvantes Thl referidos acima. É pretendido que essa vacina seja também útil no tratamento de infecção pneumocócica (por exemplo, otite média) em outros 15 grupos de risco elevado da população, tais como, bebés e crianças pequenas.

Numa terceira forma de realização é proporcionada uma composição de vacina compreendendo um antigénio polissacarídico pneumocócico e Thl, um dos adjuvantes referidos acima.

Antigénios Polissacarídicos de Streptococcus pneumoniae da Invenção

Tipicamente, a vacina contra Streptococcus pneumoniae da presente invenção irá compreender antigénios polissacarídicos (os quais podem estar conjugados), em que os polissacáridos são derivados de, pelo menos, quatro serotipos de pneumococo. De um modo preferido, os quatro serotipos incluem 6B, 14, 19F e 23F.

De um modo mais preferido, pelo menos, são incluídos 7 serotipos na composição, por exemplo os derivados dos serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, e 23F. De um modo ainda mais preferido são incluídos, pelo menos, 11 serotipos na composição, por exemplo a composição, numa forma de realização, inclui o polissacárido capsular derivado dos serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F (de um modo preferido, conjugados) . Numa forma de realização preferida da invenção são incluídos, pelo menos, 13 antigénios polissacarídicos (de um modo preferido, conjugados) , embora sejam também contemplados pela invenção antigénios polissacarídicos adicionais, por exemplo, 23 valentes (tais como os serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F) .

Para a vacinação de idosos (por exemplo, para a prevenção da pneumonia) é vantajoso incluir os serotipos 8 e 12F (e, de um 16 modo mais preferido, também os 15 e 22) na composição antigénica 11 valente, descrita acima, para formar uma vacina 15 valente, enquanto que para bebés e crianças pequenas (em que a otite média é mais preocupante) são vantajosamente incluidos os serotipos 6A e 19A, para formar uma vacina 13 valente.

Para a prevenção/melhoria da pneumonia na população idosa ( + 55 anos) e da Otite média em bebés (até 18 meses) e crianças pequenas (tipicamente, de 18 meses a 5 anos) , esta é uma forma de realização preferida da invenção, para combinar um polissacárido multivalente de Streptococcus pneumoniae, como aqui descrito, com uma proteina de Streptococcus pneumoniae ou seu equivalente imunologicamente funcional.

Proteínas Pneumocócicas da Invenção

Para os objectivos desta invenção, "equivalente imunologicamente funcional" é definido como um péptido proteico compreendendo, pelo menos, um epitopo protector das proteínas da invenção. Esses epitopos estão caracteristicamente expostos à superfície, altamente conservados e podem promover uma resposta de anticorpo bactericida num hospedeiro ou prevenir efeitos tóxicos. De um modo preferido, o equivalente funcional tem, pelo menos, 15 e, de um modo preferido, 30 ou mais aminoácidos contíguos da proteína da invenção. De um modo muito preferido, podem ser utilizados fragmentos, eliminações da proteína, tais como suas variantes de eliminação transmembranares (i. e. a utilização do domínio extracelular das proteínas), fusões, derivados química ou geneticamente destoxifiçados e semelhantes, com a condição de que estes sejam capazes de aumentar 17 substancialmente a mesma resposta imunitária do que a proteina nativa.

As proteínas preferidas da invenção são as proteínas pneumocócicas que se encontram expostas na superfície externa do pneumococo (capazes de serem reconhecidas pelo sistema imunitário de um hospedeiro durante, pelo menos, parte do ciclo de vida do pneumococo) ou são proteínas que são segregadas ou libertadas pelo pneumococo. De um modo muito preferido, a proteina é uma toxina, adesina, transdutor de sinal de 2 componentes ou lipoproteina de Streptococcus pneumoniae ou seus equivalentes imunologicamente funcionais.

As proteínas particularmente preferidas, a serem incluídas numa dessas vacinas de combinação, incluem, mas não estão limitadas, a: pneumolisina (de um modo preferido, destoxifiçada por tratamento quimico ou mutação) [Mitchell et al. Nucleic Acids Res. 1990 11 Jul; 18(13): 4010 "Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.", Mitchell et al. Biochim Biophys Acta 1989 23 Jan; 1007(1): 67-72 "Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties.", documento WO 96/05859 (A. Cyanamid), documento WO 90/06951 (Paton et al) , documento WO 99/03884 (NAVA)]; PspA e as suas variantes de eliminação transmembranares (documento US 5804193 - Briles et al.); PspC e as suas variantes de eliminação transmembranares (documento WO 97/09994 - Briles et al); PsaA e as suas variantes de eliminação transmembranares (Berry & Paton, Infect Immun Dez 1996; 64(12): 5255-62 "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae"); proteínas pneumocócicas de ligação à colina e suas variantes de eliminação transmembranares; CbpA e 18 suas variantes de eliminação transmembranares (documento WO 97/41151; documento WO 99/51266); Desidrogenase de gliceraldeido-3-fosfato (Infect. Immun. 1996 64: 3544); HSP70 (documento WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato et al. FEMS Microbiol Lett 1998, 164: 207-14); proteina semelhante a M, pedido de patente SB N°. EP 0837130; e adesina 18627, pedido de patente SB N°. EP 0834568.

As proteínas utilizadas na presente invenção são, de um modo preferido, seleccionadas do grupo pneumolisina, PsaA, PspA, PspC, CbpA ou uma combinação de duas ou mais dessas proteínas. A presente invenção abrange, também, equivalentes imunologicamente funcionais dessas proteínas (como definidos acima).

Dentro da composição, a proteina pode auxiliar a induzir uma resposta mediada por células T contra a doença pneumocócica - particularmente requerida para a protecção contra a pneumonia - a qual coopera com a parte humoral do sistema imunitário para inibir a invasão por pneumococos e estimular a opsonofagocitose.

As vantagens adicionais de incluir o antigénio proteico, consistem na apresentação de antigénios adicionais para o processo de opsonofagocitose e a inibição da adesão bacteriana (se for utilizada uma adesina) ou a neutralização da toxina (se for utilizada uma toxina).

Consequentemente, numa forma de realização da invenção é proporcionada uma vacina contra Streptococcus pneumoniae compreendendo uma vacina de conjugado polissacaridico de Pneumococcus, compreendendo antigénios polissacaridicos derivados de, pelo menos, quatro serotipos, de um modo preferido, pelo menos, sete serotipos, de um modo mais 19 preferido, pelo menos, onze serotipos e, pelo menos, uma, mas, de um modo preferido, duas, proteínas de Streptococcus pneumoniae. De um modo preferido, uma das proteínas é Pneumolisina ou PsaA ou PspA ou CbpA (de um modo mais preferido, pneumolisina destoxifiçada). Uma combinação preferida contém, pelo menos, pneumolisina ou um seu derivado e PspA.

Como referido acima, um problema associado com a abordagem polissacarídica à vacinação, é o facto dos polissacáridos, per se, serem imunogénios fracos. Para superar isto, podem ser conjugados polissacáridos com veículos proteicos, os quais proporcionam auxílio de células T espectadoras. É, consequentemente, preferido que o polissacárido utilizado na invenção seja ligado a esse veículo proteico. Os exemplos desses veículos que são actualmente normalmente utilizados para a produção de imunogénios polissacarídicos incluem os toxóides da Difteria e do Tétano (respectivamente, DT, DT CRM197 e TT) , hemocianina de Lapa da Califórnia (KLH), OMPC de N. meningitidis e o derivado de proteína purificada da Tuberculina (PPD).

No entanto, estão associados vários problemas com cada um destes veículos normalmente utilizados (ver secção "Problemas Associados com Veículos Normalmente Utilizados", acima) A presente invenção proporciona, numa forma de realização preferida, um novo veículo para utilização na preparação de construções de imunogénios baseados em polissacáridos, que não sofrem dessas desvantagens. 0 veículo preferido para as composições (ou vacinas) imunogénicas baseadas em polissacáridos, é a proteína D de Haeinophilus influenzae (documento EP 594610-B) ou os seus fragmentos. Os fragmentos adequados para utilização incluem fragmentos abrangendo epitopos 20 de T auxiliadoras. Em particular, um fragmento de proteina D irá, de um modo preferido, conter o 1/3 N-terminal da proteina.

Um veiculo adicional preferido para o polissacárido pneumocócico é a própria proteina pneumocócica (como definida acima na secção "Proteínas Pneumocócicas da invenção").

As vacinas da presente invenção são, de um modo preferido, adjuvadas. Os adjuvantes adequados incluem um sal de aluminio tais como gel de hidróxido de aluminio (alúmen) ou fosfato de aluminio, mas podem ser, também, um sal de cálcio, ferro ou zinco ou podem ser uma suspensão insolúvel de tirosina acilada ou açúcares acilados, polissacáridos derivatizados cationicamente ou anionicamente ou polifosfazenos. É preferido que o adjuvante seja seleccionado para ser um indutor preferido da resposta de tipo TH para auxiliar a parte da resposta imunitária mediada por células.

Adjuvantes TH1 da Invenção

Os níveis elevados de citocinas do tipo Thl tendem a favorecer a indução de respostas imunitárias mediadas por células para um dado antigénio, enquanto que níveis elevado de citocinas de tipo Th2, tendem a favorecer a indução de respostas imunitárias humorais ao antigénio. É importante recordar que a distinção entre respostas imunitárias do tipo Thl e Th2 não é absoluta. Na realidade, um indivíduo irá suportar uma resposta imunitária, a qual é descrita como sendo predominantemente Thl ou predominantemente 21

Th2. No entanto, é muitas vezes conveniente considerar as famílias de citocinas em termos do descrito para clones de células CD4 +ve T murinas, por Mosmann e Coffman (Mosmann, T. R. e Coffman, R. L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p 145-173) . Tradicionalmente, as respostas do tipo Thl estão associadas com a produção de citocinas INF-γ e IL-2 por linfócitos T. Outras citocinas, muitas vezes directamente associadas com a indução de respostas imunitárias do tipo Thl, não são produzidas por células T, tal como a IL-12. Pelo contrário as respostas do tipo Th2 estão associadas com a secreção de IL-4, IL-5, IL-6, IL-10. Os sistemas de adjuvante adequados que promovem uma resposta predominantemente de Thl incluem, Monofosforil lipido A ou um seu derivado, particularmente Monofosforil lipido A 3-des-0-acilado e uma combinação de Monofosforil lipido A, de um modo preferido, Monofosforil lipido A 3-des-0-acilado (3D-MPL), juntamente com um sal de alumínio.

Um sistema intensificado envolve a combinação de um

Monofosforil lipido A e um derivado de saponina, particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL, como divulgado no documento WO 94/00153 ou uma composição menos reactogénica em que o QS21 é atenuado com colesterol, como divulgado no documento WO 96/33739.

No documento WO 95/17210, é descrita uma formulação de adjuvante particularmente potente, envolvendo QS21, 3D-MPL e tocoferol, numa emulsão de óleo em água e é uma formulação preferida.

De um modo preferido, a vacina compreende, adicionalmente, uma saponina, de um modo mais preferido, QS21. A formulação 22 pode, também, compreender uma emulsão de óleo em água e tocoferol (documento WO 95/17210). A presente invenção proporciona, também, um método para produzir uma formulação de vacina compreendendo a mistura de uma proteina da presente invenção juntamente com um excipiente farmaceuticamente aceitável, tal como 3D-MPL.

Os oligonucleótidos contendo CpG não metilado (documento WO 96/02555) são, também, indutores preferidos de uma resposta TH1 e são adequados para a utilização na presente invenção.

As composições particularmente preferidas da invenção compreendem um ou mais polissacáridos pneumocócicos conjugados, misturados com uma ou mais proteínas pneumocócicas e um adjuvante Thl, seleccionado a partir dos referidos acima. A indução de uma resposta mediada por células, através de uma proteína pneumocócica (como descrito acima) e a cooperação entre ambos os ramos do sistema imunitário podem ser auxiliadas, utilizando um desses adjuvantes Th-1, resultando numa vacina particularmente eficaz contra a doença pneumocócica em geral, e, de um modo importante, contra a pneumonia pneumocócica no idoso.

Num aspecto adicional da presente invenção, é proporcionado um imunogénio ou vacina, como aqui descritos, para utilização em medicina.

Num aspecto ainda adicional da invenção, é proporcionada uma composição compreendendo um conjugado polissacarídico pneumocócico e um adjuvante Thl (de um modo preferido, 3D-MPL), o qual é capaz de seroconversão ou indução de uma resposta 23 humoral de anticorpos contra o antigénio polissacarídico dentro de uma população de não-respondentes. É conhecido que 10-30% da população seja não-respondente à imunização com polissacáridos (não responde a mais de 50% dos serotipos numa vacina) (Konradsen et al., Scand. J. Immun 40: 251 (1994); Rodriguez et al., JID, 173: 1347 (1996)). Isto também pode-se verificar para vacinas conjugadas (Musher et al. Clin. Inf. Dis. 27: 1487 (1998)). Isto pode ser particularmente grave para grupos de risco elevado da população (bebés, crianças pequenas e idosos). O presente requerente verificou que uma combinação de um polissacárido pneumocócico conjugado (o qual é propenso a uma resposta baixa numa população particular) misturado com uma proteína pneumocócica e um adjuvante Thl (ver "Adjuvantes Thl da invenção", acima) pode, surpreendentemente, superar esta ausência de resposta. De um modo preferido, deve ser utilizado 3D-MPL e, de um modo muito preferido, 3D-MPL isento de adjuvante à base de aluminio (o qual proporciona uma ainda melhor resposta). A presente invenção proporciona, deste modo, essas composições e, adicionalmente, proporciona um método de tratamento de não-respondentes a polissacáridos pneumocócicos, administrando essas composições e ainda proporciona adicionalmente uma utilização de um adjuvante Thl na produção de um medicamento compreendendo antigénios polissacarídicos pneumocócicos conjugados, no tratamento contra (ou protecção contra) doença pneumocócica em indivíduos que são não-respondentes ao antigénio polissacarídico.

Numa forma de realização existe um método de prevenção ou de melhoria da pneumonia num idoso humano, compreendendo a 24 administração de uma quantidade segura e eficaz de uma vacina, como aqui descrita, compreendendo um antigénio polissacaridico de Streptoccocus pneumoniae e um adjuvante Thl ou uma proteina pneumocócica (e, de um modo preferido, ambos), ao referido doente idoso.

Numa forma de realização adicional é proporcionado um método para a prevenção ou a melhoria da otite média em bebés ou crianças pequenas, compreendendo a administração de uma quantidade segura e eficaz de uma vacina compreendendo um antigénio polissacaridico de Streptococcus pneumoniae e, quer um antigénio proteico de Streptococcus pneumoniae, quer um adjuvante Thl (e, de um modo preferido, ambos) , ao referido bebé ou criança pequena.

De um modo preferido, nos métodos da invenção, como descrito acima, o antigénio polissacaridico está presente como um conjugado de polissacárido e proteína.

Preparações de Vacina da Invenção

As preparações de vacina da presente invenção podem ser utilizadas para proteger ou tratar um mamífero susceptível à infecção, através da administração da referida vacina atreavés a via sistémica ou mucosal. Estas administrações podem incluir a injecção através das vias intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea; ou através de administração mucosal aos tractos oral/alimentar, respiratório, genito-urinário. É preferida a administração intranasal de vacinas para o tratamento de pneumonia ou de otite média (uma vez que o transporte nasofaríngico de pneumococos pode ser mais 25 eficazmente prevenido, atenuando, deste modo, a infecção na sua etapa mais inicial). A quantidade do antigénio conjugado em cada dose de vacina é seleccionada como uma quantidade que induz uma resposta imunitária protectora sem efeitos secundários adversos significativos, em vacinas típicas. Essa quantidade irá variar dependendo de qual imunogénio específico é utilizado e de como é apresentado. Geralmente, é esperado que cada dose compreenda 0,1-100 pg do polissacárido, de um modo preferido, 0,1-50 pg, de um modo preferido, 0,1-10 pg, das quais 1 a 5 pg é a gama mais preferida. O conteúdo em antigénios proteicos na vacina estará tipicamente na gama de 1-100 pg, de um modo preferido, de 5-50 pg, mais tipicamente, na gama de 5-25 pg.

As quantidades óptimas de componentes para uma vacina particular podem ser apuradas por estudos padrão, que envolvem a observação de respostas imunitárias apropriadas em indivíduos. Após uma vacinação inicial, os indivíduos podem receber uma ou mais imunizações de reforço adequadamente espaçadas.

A preparação da vacina é descrita, de um modo geral, em Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenum Press New York). A encapsulação dentro de lipossomas é descrita por Fullerton, Patente US 4235877.

B) Composições Seleccionadas de Conjugado polissacaridico pneumocócico + 3D-MPL 26

Para os objectivos desta invenção, o termo "conjugados polissacarídicos pneumocócicos da invenção" descreve os conjugados do polissacárido capsular de Streptococcus pneumoniae que são mais imunogénicos em composições compreendendo 3D-MPL, em comparação com composições compreendendo 3D-MPL juntamente com um adjuvante à base de aluminio (por exemplo, conjugados do serotipo 4; serotipo 6B; serotipo 18C; serotipo 19F; ou serotipo 23F) .

Para os objectivos desta invenção, o termo "substancialmente isento de adjuvantes à base de aluminio" descreve uma composição que não contém adjuvante à base de aluminio suficiente (por exemplo, hidróxido de aluminio e, particularmente, fosfato de aluminio) para causar qualquer redução da imunogenicidade de um conjugado polissacarídico pneumocócico da invenção, em comparação com uma composição equivalente compreendendo 3D-MPL sem adjuvante à base de aluminio adicionado. De um modo preferido, a composição antigénica deve conter o adjuvante que consiste, essencialmente, em 3D-MPL. As quantidades de adjuvante à base de aluminio adicionado por dose devem ser, de um modo preferido, inferiores a 50 pg, de um modo mais preferido, inferiores a 30 pg, de um modo ainda mais preferido, inferiores a 10 pg e, de um modo muito preferido, não é adicionado qualquer adjuvante à base de aluminio às composições antigénicas da invenção.

Para os objectivos desta invenção, a determinação de se um polissacárido pneumocócico conjugado é significativamente mais imunogénico em composições compreendendo 3D-MPL, em comparação com composições compreendendo 3D-MPL, juntamente com um adjuvante à base de aluminio, deve ser estabelecida como 27 descrito no Exemplo 2. Como uma indicação se uma composição é significativamente mais imunogénica quando compreendendo 3D-MPL apenas, a proporção da concentração da GMC da IgG (como determinada no Exemplo 2) entre composições compreendendo 3D-MPL apenas, em relação a uma composição equivalente compreendendo 3D-MPL juntamente com o adjuvante de fosfato de aluminio, deve ser superior a 2, de um modo preferido, superior a 5, de um modo muito preferido, superior a 7, de um modo ainda mais preferido, superior a 9 e de um modo muito preferido, superior a 14.

Entre os problemas associados com a abordagem polissacaridica da vacinação, encontra-se o facto dos polissacáridos, per se, serem imunogénios fracos. As estratégias, as quais foram concebidas para superar esta falta de imunogenicidade, incluem a ligação (conjugação) do polissacárido a veiculos proteicos grandes, os quais proporcionam o auxilio de células T espectadoras. É preferido que os polissacáridos pneumocócicos da invenção estejam ligados a um veiculo proteico, o qual proporciona o auxilio de células T espectadoras. Os exemplos desses veiculos que podem ser utilizados incluem os toxóides da Difteria, Difteria mutante e do Tétano (respectivamente, DT, CRM197 e TT) , hemocianina de Lapa da Califórnia (KLH), o derivado de proteína purificada da Tuberculina (PPD) e OMPC de Neisseria meningitidis.

De um modo muito preferido, é utilizada a proteína D de Haemophilus influenzae (documento EP 0594610-B) ou os seus fragmentos (ver a secção C), como o veículo proteico imunogénico para o polissacárido pneumocócico da invenção.

Numa forma de realização, a composição antigénica da invenção compreende uma mistura de uma proteína pneumocócica com 28 um polissacárido pneumocócico de serotipo (PS) 4 conjugado com uma proteína imunogénica e formulado com o adjuvante 3D-MPL, em que a composição está substancialmente isenta de adjuvante à base de alumínio. Em formas de realização adicionais, a composição antigénica compreende, respectivamente, PS 6B, 18C, 19F ou 23F, conjugado com uma proteína imunogénica e formulado com o adjuvante 3D-MPL, em que a composição é substancialmente isenta de adjuvante à base de alumínio.

Ainda numa forma de realização adicional da invenção, é proporcionada uma composição antigénica de combinação compreendendo dois ou mais conjugados polissacarídicos pneumocócicos do grupo PS 4, PS 6B, PS 18C, PS19F e PS 23F formulados com o adjuvante 3D-MPL, em que a composição é substancialmente isenta de adjuvante à base de alumínio e em que a composição contém, também, uma proteína pneumocócica. A imunogenicidade dos conjugados polissacarídicos pneumocócicos da invenção não é significativamente afectada pela combinação com outros conjugados polissacarídicos pneumocócicos (Exemplo 3) . Consequentemente, um aspecto preferido da invenção proporciona uma composição antigénica de combinação compreendendo um ou mais conjugados polissacarídicos pneumocócicos da invenção em combinação com um ou mais conjugados polissacarídicos pneumocócicos adicionais, em que a composição é formulada com o adjuvante 3D-MPL, mas é substancialmente isenta de adjuvante à base de alumínio e em que está, também, presente uma proteína pneumocócica.

Em formas adicionais de realização preferidas da invenção, são proporcionadas composições antigénicas de combinação, as quais contém, pelo menos, um e, de um modo preferido, 2, 3, 4 ou 29 a totalidade dos 5 conjugados polissacarídicos pneumocócicos PS 4, 6B, 18C, 19F, ou 23F e, adicionalmente, qualquer combinação de outros conjugados polissacarídicos pneumocócicos, os quais são formulados com o adjuvante 3D-MPL, mas são substancialmente isentos de adjuvante à base de alumínio.

Tipicamente a composição antigénica de combinação de Streptococcus pneumoniae da presente invenção irá compreender antigénios conjugados polissacarídicos e antigénios proteicos, em que os polissacáridos são derivados de, pelo menos, quatro, sete, onze, treze, quinze ou vinte e três serotipos (ver "Antigénios Polissacarídicos de Streptococcus pneumoniae da Invenção" acima, para combinações preferidas de serotipos, dependendo da doença a ser tratada).

As composições antigénicas da invenção são, de um modo preferido, utilizadas como composições de vacina para prevenir (ou tratar) infecções pneumocócicas, particularmente, nos idosos e em bebés e crianças pequenas.

As formas de realização adicionais da presente invenção incluem: o fornecimento das composições antigénicas acima para utilização em medicina; um método de indução de uma resposta imunitária a um conjugado de polissacárido capsular de Streptococcus pneumoniae, compreendendo os passos de administração de uma quantidade segura e eficaz de uma das referidas composições antigénicas acima a um doente; e a utilização de uma das referidas composições antigénicas acima na produção de um medicamento para a prevenção (ou tratamento) de doença pneumocócica. 30

Para a prevenção/melhoria da pneumonia na população idosa ( + 55 anos) e da Otite média em bebés (até 18 meses) e crianças pequenas (tipicamente, de 18 meses a 5 anos) , esta é uma forma de realização preferida adicional da invenção para combinar um conjugado polissacaridico multivalente de Streptococcus pneumoniae, formulado como aqui descrito com uma proteina de Streptococcus pneumoniae ou seu equivalente imunologicamente funcional. Ver secção acima "Proteínas Pneumocócicas da invenção" para proteínas/combinações de proteína preferidas.

De um modo preferido, as composições antigénicas (e vacinas) aqui anteriormente descritas são liofilizadas até estas estarem prestes a serem utilizadas, em que, nesse momento, estas são extemporaneamente reconstituídas com um diluente. De um modo mais preferido, estas são liofilizadas na presença de 3D-MPL e são extemporaneamente reconstituídas com solução salina. A liofilização das composições resulta numa composição mais estável (por exemplo, previne a quebra dos antigénios polissacarídicos). Surpreendentemente, o processo é também responsável por um título de anticorpos mais elevado, ainda contra polissacáridos pneumocócicos. Isto demonstrou ser particularmente significativo para conjugados de PS 6B. Um outro aspecto da invenção é, consequentemente, uma composição antigénica liofilizada compreendendo um conjugado de PS 6B adjuvado com 3D-MPL e substancialmente isento de adjuvantes à base de alumínio.

Para a preparação das vacinas, ver acima a secção "Preparações de Vacina da Invenção". 31

C) Conjugados de polissacáridos bacterianos - Proteína D A tendência para as vacinas de combinação tem a vantagem de reduzir o desconforto do receptor, facilitando planeamento, e assegurando a realização do regime; mas existe, também, o risco concomitante de redução da eficácia da vacina (ver acima, para discussão sobre a supressão do epitopo pela sobre-utilização de proteínas veiculo). Seria, por isso, vantajoso preparar combinações de vacina de acordo com as necessidades de uma população e as quais, para além disso, não apresentem interferência imunogénica entre os seus componentes. Estas vantagens podem ser obtidas pelas composições imunogénicas (ou vacinas) da invenção, as quais são particularmente benéficas para a administração de vacinas de combinação a grupos de risco elevado tais como bebés, crianças pequenas ou idosos. A presente invenção proporciona uma proteína D de Haemophilus influenzae ou seus fragmentos, como um veículo para uma composição imunogénica baseada em polissacáridos, incluindo vacinas. Os fragmentos adequados para a utilização incluem fragmentos que abrangem epitopos de T auxiliadoras. Em particular, o fragmento de proteína D irá conter, de um modo preferido, o 1/3 N-terminal da proteína. A Proteína D é uma proteína de ligação à IgD de Haemophilus influenzae (documento EP 0594610 Bl) e é um imunogénio potente.

Os polissacáridos a serem conjugados com a Proteína D, contemplados pela presente invenção, incluem, mas não são limitados ao antigénio de polissacárido Vi contra Salmonella typhi, polissacáridos meningocócicos (incluindo do tipo A, C, W135 e Y e o polissacárido e os polissacáridos modificados do 32 grupo B de meningococo) , polissacárido de Staphylococcus aureus, polissacáridos de Streptococcus agalactae, polissacáridos de Streptococcus pneumoniae, polissacáridos de Mycobacterium, e. g. Mycobacterium tuberculosis (tais como trialoses manofosfoinisitídicas, ácido micólico, arabinomananos terminados com manose, a sua cápsula e arabinogalactanos), polissacáridos de Cryptococcus neoformans, os lipopolissacáridos de Haemophilus influenzae não-tipável, o polissacárido capsular de Haemophilus influenzae b, os lipopolissacáridos de Moraxella catharralis, os lipopolissacáridos de Shigella sonnei, o lipopeptidofosfoglicano (LPPG) de Trypanosoma cruzi, os gangliósidos GD3 associados ao cancro, GD2, as mucinas associadas a tumores, especialmente, o antigénio T-F e o sialilo de antigénio T-F e o polissacárido associado ao HIV que é estruturalmente relacionado com o antigénio T-F. 0 polissacárido pode ser ligado à proteína veículo por qualquer método conhecido (por exemplo, por Likhite, Patente U.S. 4372945 e por Armor et al., Patente U.S. 4474757) . De um modo preferido, é realizada a conjugação com CDAP (documento WO 95/08348).

No CDAP, o reagente de cianação tetrafluoroborato de 1-ciano-dimetilaminopiridínio (CDAP) é, de um modo preferido, utilizado na síntese de conjugados polissacarídicos de proteína. A reacção de cianação pode ser realizada sob condições relativamente suaves, as quais evitam a hidrólise dos polissacáridos sensíveis a bases. Esta síntese permite a ligação directa a uma proteína veículo. O polissacárido é solubilizado em água ou numa solução salina. O CDAP é dissolvido em acetonitrilo e é imediatamente 33 adicionado à solução de polissacárido. O CDAP reage com os grupos hidroxilo do polissacárido para formar éster de cianato. A proteína veículo é adicionada após o passo de activação. Os grupos amina da lisina reagem com o polissacárido activado para formar uma ligação isoureia covalente.

Após a reacção de ligação, é então adicionado um grande excesso de glicina, para atenuar funções residuais activadas. 0 produto é, então, passado através de uma permeação em gel para remover a proteína veículo e reagentes residuais que não reagiram. Consequentemente, a invenção proporciona um método para preparar conjugados polissacarídicos de proteína D, compreendendo os passos de activação do polissacárido e ligação do polissacárido à proteína D.

Numa forma de realização preferida da invenção é proporcionada uma formulação de composição imunogénica (ou vacina) para a prevenção de infecções de Streptococcus pneumoniae.

Os mecanismos pelos quais os pneumococos alastram ao pulmão, ao fluido cerebrospinal e ao sangue estão pouco compreendidos. 0 crescimento de bactérias que atingem os alvéolos pulmonares normais é inibido pela sua secura relativa e pela actividade fagocítica dos macrófagos alveolares. Quaisquer alterações anatómicas ou fisiológicas destas defesas coordenadas tende a aumentar a susceptibilidade dos pulmões à infecção. A parede celular de Streptococcus pneumoniae tem um papel importante na produção de respostas anti-inflamatórias nos alvéolos pulmonares (Gillespie et al. (1997), I & I 65: 3936). 34

Tipicamente, a vacina contra Streptococcus pneumoniae da presente invenção irá compreender conjugados polissacaridicos de proteina D, em que o polissacárido é derivado de, pelo menos, quatro, sete, onze, treze, quinze ou 23 serotipos. Ver "Antigénios Polissacaridicos de Streptococcus pneumoniae da Invenção", acima, para combinações preferidas de serotipos, dependendo da doença a ser tratada.

Numa forma de realização adicional da invenção é proporcionada uma vacina contra Neisseria meningitidis; em particular contra os serotipos A, B, C W-135 e Y. A Neisseria meningitidis é uma das causas mais importantes de meningite bacteriana. A cápsula de carbo-hidrato destes organismos pode actuar como um determinante da virulência e um alvo de anticorpos protectores. É bem conhecido, contudo, que os carbo-hidratos são imunogénios fracos em crianças pequenas. A presente invenção proporciona um veiculo proteico particularmente adequado para estes polissacáridos, a proteina D, a qual proporciona epitopos de células T que podem activar uma resposta das células T para auxiliar a proliferação e a maturação de células B especificas para antigénios polissacaridicos, assim como a indução de uma memória imunológica.

Numa forma de realização alternativa da invenção, é proporcionado um conjugado de polissacárido capsular de Haemophilus influenzae b (PRP) - proteina D. vacinas de uma variedade proteina D é vacinas de A presente invenção contempla, também, combinação, as quais proporcionam protecção contra de agentes patogénicos diferentes. Um veiculo de surpreendentemente útil como um veiculo em 35 combinação, em que são conjugados vários antigénios polissacaridicos. Como referido acima, a supressão do epitopo irá, provavelmente, ocorrer se for utilizado o mesmo veiculo para cada polissacárido. 0 documento WO 98/51339 apresentou composições para tentar minimizar esta interferência, conjugando uma proporção do polissacárido na composição com o DT e o restante com o TT.

Surpreendentemente, o presente requerente verificou que a proteína D é particularmente adequada para minimizar esses efeitos de supressão epitópica em vacinas de combinação. Um ou mais polissacáridos, numa combinação, podem ser vantajosamente conjugados com a proteína D e, de um modo preferido, todos os antigénios estão conjugados com a proteína D, dentro dessas vacinas de combinação.

Uma combinação preferida inclui uma vacina que fornece protecção contra infecção com Neisseria meningitidis C e Y (e, de um modo preferido, A) em que o antigénio polissacarídico de um ou mais dos serotipos Y e C (e, de um modo muito preferido, A) está ligado à proteína D.

As vacinas baseadas em polissacáridos de Haemophilus influenzae (PRP conjugado com, de um modo preferido, TT, DT ou CRM197 ou de um modo muito preferido, com a proteína D) podem ser formuladas com as vacinas de combinação acima.

Muitas vacinas Pediátricas são, presentemente, administradas como uma vacina de combinação, de forma a reduzir o número de injecções que uma criança tem de receber. Deste modo, para as vacinas Pediátricas, podem ser formulados outros antigénios com as vacinas da invenção. Por exemplo as vacinas da 36 invenção podem ser formuladas juntamente ou administradas separadamente, mas, ao mesmo tempo, com a bem conhecida vacina de combinação "trivalente", compreendendo o toxóide da Difteria (DT) , o toxóide do tétano (TT) e componentes da tosse convulsa [tipicamente, toxóide da Tosse convulsa destoxifiçado (PT) e hemaglutinina filamentosa (FHA) com pertactina opcional (PRN) e/ou aglutinina 1+2], por exemplo, a vacina comercializada INFANRIX-DTPa™ (SmithKlineBeecham Biologicals), a qual contém antigénios DT, TT, PT, FHA e PRN ou com um componente de célula completa da tosse convulsa, por exemplo, como comercializada por SmithKlineBeecham Biologicals s.a., como Tritanrix™. A vacina combinada pode, também, compreender outro antigénio, tal como antigénio de superfície da Hepatite B (HBsAg), antigénios do virus da Poliomielite (por exemplo, do virus da poliomielite inactivado trivalente - IPV), proteínas da membrana externa de Moraxella catarrhalis, proteínas de Haemophilus influenza não-tipável, proteínas da membrana externa de N. meningitidis B.

Os exemplos de antigénios proteicos preferidos de Moraxella catarrhalis que podem ser incluídos numa vacina de combinação (especialmente para a prevenção da otite média) são: OMP106 [documento WO 97/41731 (Antex) e documento WO 96/34960 (PMC)]/ OMP21; LbpA & LbpB [documento WO 98/55606 (PMC)]; TbpA & TbpB [documento WO 97/13785 e documento WO 97/32980 (PMC)]; CopB

[Helminen ME, et al. (1993) Infect. Immun. 61:2003-2010];

UspAl/2 [documento WO 93/03761 (University of Texas)]; e OmpCD. Os exemplos de antigénios de Haemophilus influenzae não-tipáveis que podem ser incluídos numa vacina de combinação (especialmente para a prevenção da otite média) incluem: proteina de Fimbrina [(documento US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] e fusões compreendendo péptidos desta [e. g. fusões de péptidos LB1 (f) ; documento US 5843464 (OSU) ou documento WO 99/64067]; OMP26 37 [documento WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [EP 281673 (New York State University)]; TbpA e TbpB; Hia; Hmw 1,2; Hap; e D15.

As vacinas Pediátricas preferidas contempladas pela presente invenção são: a) conjugado polissacaridico de N. meningitidis C e conjugado polissacaridico de Haemophilus influenzae b, opcionalmente com conjugado polissacaridico de N. meningitidis A e/ou Y, contanto que, pelo menos, um antigénio polissacaridico e, de um modo preferido, a totalidade, esteja conjugada com a proteína D. b) Vacina a) com componentes de DT, TT, tosse convulsa (preferido PT, FHA e PRN), antigénio de superfície da Hepatite B e IPV (vacina trivalente de virus da poliomielite inactivado). c) Antigénios polissacarídicos de Streptococcus pneumoniae conjugados com a proteína D. d) Vacina c) com um ou mais antigénios de Moraxella catarrhalis e/ou Haemophilus influenzae não-tipável.

Todas as vacinas de combinação referidas acima, pode beneficiar com a inclusão da proteína D como um veículo. Manifestamente, quantos mais veículos estão envolvidos numa vacina de combinação (por exemplo para superar a supressão de epitopo), mais dispendiosa e complexa é a vacina final. Ter a totalidade ou a maioria dos antigénios polissacarídicos de uma vacina de combinação conjugados com proteína D proporciona, deste modo, uma vantagem considerável. 38

Para a prevenção da pneumonia na população idosa (+55 anos) e da Otite média em bebés ou crianças pequenas, é uma forma de realização preferida da invenção, combinar antigénios multivalentes de polissacáridos de Streptococcus pneumoniae -proteina D como aqui descritos com uma proteina de Streptococcus pneumoniae ou seu equivalente imunologicamente funcional. Ver secção acima "Proteínas Pneumocócicas da invenção" para proteínas/combinações de proteína preferidas que podem ser incluídas nessa combinação.

Consequentemente, a presente invenção proporciona uma composição imunogénica compreendendo um conjugado de polissacárido de Streptococcus pneumoniae - proteína D e um antigénio proteico de Streptococcus pneumoniae.

Os antigénios conjugados de polissacárido - proteína D da presente invenção são, de um modo preferido, adjuvados na formulação de vacina da invenção. Os adjuvantes adequados incluem um sal de alumínio tal como gel de hidróxido de alumínio (alúmen) ou fosfato de alumínio, mas podem, também, ser um sal de cálcio, ferro ou zinco ou podem ser uma suspensão insolúvel de tirosina acilada ou de açúcares acilados, polissacáridos derivatizados cationicamente ou anionicamente ou polifosfazenos.

Para vacinas para idosos é preferido que o adjuvante seja seleccionado para ser um indutor preferido de uma resposta do tipo TH1.

Para adjuvantes Thl em particular, ver "Adjuvantes Thl da invenção", acima. 39

Num aspecto adicional da presente invenção, é fornecido um imunogénio ou vacina, como aqui descrito, para utilização em medicina.

Para a preparação/administração do conjugado em vacina, ver "Preparação de Vacinas da Invenção", acima. A Proteina D é, também, vantajosamente utilizada numa vacina contra a otite média, uma vez que esta é, por si, um imunogénio capaz de produzir protecção mediada por células B contra H. influenzae não-tipável (ntHi). 0 ntHi pode invadir as células hospedeiras e evitar os efeitos mediados por células B, induzidos pelo antigénio proteico. 0 presente requerente verificou, surpreendentemente, uma forma de aumentar a eficácia da proteina D (quer por si, quer como um veiculo de um polissacárido), como um antigénio de uma vacina contra a Otite média. Isto é conseguido por adjuvar a proteina D, de forma a ser induzida uma resposta Thl forte no sujeito, de forma a que o ramo do sistema imunitário mediado por células seja optimizado contra a proteina D. Isto é, surpreendentemente, realizado, utilizando uma composição liofilizada compreendendo a proteina D e um adjuvante Thl (de um modo preferido, 3D-MPL) , o qual é reconstituído pouco antes da administração. Deste modo, a invenção também proporciona essas composições, um processo para preparar essas composições (pela liofilização de uma mistura compreendendo a proteina D e um adjuvante Thl) e uma utilização dessa composição no tratamento da otite média.

Num sentido mais amplo, os requerentes prevêm que a liofilização de um imunogénio na presença de um adjuvante Thl (ver "Adjuvantes Thl da invenção") , de um modo preferido, 3D-MPL, irá, de um modo geral, aumentar a resposta imunitária Thl 40 contra o imunogénio. A presente invenção é, consequentemente, aplicável a qualquer imunogénio para o qual seja necessária uma resposta imunitária Thl mais forte. Esses imunogénios compreendem antigénios proteicos bacterianos, virais e tumorais, assim como as próprias proteínas e péptidos.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Polissacárido capsular de S. pneumoniae: A vacina candidata 11-valente inclui os serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F dos polissacáridos capsulares que foram preparados, essencialmente, como descrito no documento EP 72513. Cada polissacárido é activado e derivatizado utilizando química de CDAP (documento WO 95/08348) e é conjugado com o veículo proteico. Todos os polissacáridos são conjugados na sua forma nativa, excepto o serotipo 3 (que foi sujeito a redução de tamanho, para reduzir a sua viscosidade).

Veículo proteico: O veículo proteico seleccionado é a proteína D (PD) recombinante de Haemophilus influenzae não-tipável, expressa em E. coli. 41

EXPRESSÃO DA PROTEÍNA D

Proteína D de Haemophilus influenzae

Construção genética para a expressão da proteína D

Materiais iniciais

ADN codificando a Proteína D A Proteína D é altamente conservada entre H. influenzae de todos os serotipos e estirpes não-tipáveis. 0 vector pHIC348 contendo a sequência de ADN codificando o gene completo da proteína D foi obtido do Dr. A. Forsgren, Departamento de Microbiologia Médica, Universidade de Lund, Hospital Geral de Malmõ, Malmõ, Suécia. A sequência de ADN da proteína D foi publicada por Janson et al. (1991) Infect. Immun. 59: 119-125. O vector de expressão pMGl 0 vector de expressão pMGl é um derivado do pBR322 (Grosa et al., 1985), no qual foram introduzidos elementos de controlo derivados do bacteriófago λ, para a transcrição e tradução de genes exógenos inseridos (Shatzman et al., 1983). Para além disso, o gene de resistência à Ampicilina foi permutado com o gene de resistência à Canamicina. 42 A estirpe AR58 de E. coli A estirpe AR58 de E. coli foi produzida pela transdução da N99 com um armazenamento de fago de PI anteriormente cultivado num derivado da SA500 (galE::TN10, lambdaKil~cI857 ΔΗ1) . N99 e SA500 são estirpes derivadas de E. coli K12 do laboratório do Dr. Martin Rosenberg do National Institute of Health. O vector de expressão pMGl

Para a produção da proteina D, o ADN codificando a proteina foi clonado no vector de expressão pMGl. Este plasmideo utiliza sinais do ADN do fago lambda, para controlar a transcrição e a tradução de genes exógenos inseridos. 0 vector contém o promotor PL, o operador OL e dois locais de utilização (NutL e NutR) para aliviar os efeitos de polaridade da transcrição, quando é proporcionada a proteína N (Gross et al., 1985). Os vectores contendo o promotor PL, são introduzidos em E. coli lisogénica hospedeira, para estabilizar o ADN plasmídico. As estirpes hospedeiras lisogénicas contêm o ADN do fago lambda deficiente para a replicação integrado no genoma (Shatzman et al., 1983). 0 ADN do fago lambda cromossómico controla a síntese da proteína repressora cl, a qual se liga ao repressor OL do vector e impede a ligação da polimerase de ARN ao promotor PL e, deste modo, a transcrição do gene inserido. 0 gene cl da estirpe de expressão AR58 contém um mutante sensível à temperatura, de forma a que a transcrição controlada por PL possa ser regulada por alteração da temperatura, i. e. um aumento na temperatura da cultura inactiva o repressor e a síntese da proteína exógena é iniciada. Este sistema de expressão permite a síntese controlada de 43 proteínas exógenas, especialmente das que podem ser tóxicas para a célula (Shimataka e Rosenberg, 1981). A coli estirpe de AR58E. A estirpe AR58 lisogénica de E. coli utilizada para a produção do veículo de proteína D é derivada da estirpe padrão N99 de E. coli K12 NIH (F“su~galK2, lacZ“thr~) . Esta contém um fago lambda lisogénico deficiente (galE::TN10, lambdaKil~cI857 ΔΗ1) . 0 fenótipo Kil' impede a interrupção da síntese macromolecular do hospedeiro. A mutação de cI857 confere uma lesão sensível a temperatura ao repressor cl. A eliminação ΔΗ1 remove o operão direito do fago lambda e os loci bio, uvr3 e chlA dos hospedeiros. A estirpe AR58 foi produzida pela transdução de N99 com um armazenamento de fago PI anteriormente cultivado num derivado SA500 (galE::TN10, lambdaKil- cI857 ΔΗ1). A introdução do lisogénico deficiente em N99 foi seleccionada com tetraciclina em virtude da presença de um transposão TN10, codificando para a resistência à tetraciclina, no gene galE adj acente.

Construção de vector pMGMDPPrD

Foi utilizado o vector pMG 1, o qual contém o gene codificando a proteína SI não-estrutural do vírus Influenzae (pMGNSI), para construir o pMGMDPPrD. 0 gene da proteína D foi amplificado por PCR, a partir do vector pHIC348 (Janson et al. 1991) com iniciadores de PCR contendo os locais de restrição Ncol e Xbal, respectivamente, nas extremidades 5' e 3'. 0 fragmento Ncol/Xbal foi então introduzido no pMGNSI entre Ncol e 44

Xbal, criando, deste modo, uma proteína de fusão contendo os 81 aminoácidos N-terminais da proteína NS1 seguidos pela proteína PD. Este vector foi designado como pMGNSIPrD.

Com base na construção descrita acima, foi produzida a construção final para a expressão da proteína D. Foi removido um fragmento BamHI/BamHI a partir de pMGNSIPrD. Esta hidrólise do ADN remove a região codificante da NS1, excepto os três primeiros resíduos N-terminais. Após a religação do vector, foi produzido um gene codificando uma proteína de fusão com a seguinte sequência de aminoácidos N-terminal: -----mdp sshssnmant-----

NS 1 Proteína D A proteína D não contém um péptido líder ou a cisteína N-terminal, aos quais as cadeias lipídicas estão normalmente ligadas. Consequentemente, a proteína não é nem excretada para o periplasma nem lipidada e permanece no citoplasma sob uma forma solúvel. A construção final pMG-MDPPrD foi introduzida na estirpe hospedeira AR58 por choque térmico a 37 °C. As bactérias contendo o plasmídeo foram seleccionadas na presença de Canamicina. A presença da proteína D codificando a inserção de ADN foi demonstrada por digestão do ADN plasmídico isolado com endonucleases seleccionadas. A estirpe recombinante de E. coli é designada como ECD4. A expressão da proteína D ocorre sob o controlo do promotor PL/Operador 0L de lambda. A estirpe hospedeira AR58 contém um 45 gene cl sensível a temperatura no genoma, que bloqueia a expressão da PL de lambda a temperatura baixa por ligação a Ol. Quando a temperatura é elevada a cl é libertada de Ol e a proteína D é expressa. No final da fermentação as células são concentradas e congeladas. A extracção a partir de células recolhidas e a purificação da proteína D foram realizadas como se segue. 0 sedimento de cultura celular congelado é descongelado e ressuspendido numa solução de rebentamento celular (Tampão citrato pH 6,0) para uma OD650 = 60 final. A suspensão é passada duas vezes através de um homogenizador de pressão elevada a P = 1000 bar. O homogeneizado de cultura celular é clarificado por centrifugação e os detritos celulares são removidos por filtração. No primeiro passo de purificação o lisado filtrado é aplicado numa coluna de cromatografia de permuta catiónica (SP Sepharose Fast Flow). A PD liga-se à matriz de gel por interacção iónica e é eluída por um passo de aumento da força iónica do tampão de eluição.

Num segundo passo purificação, as impurezas são conservadas numa matriz de permuta aniónica (Q Sepharose Fast Flow). A PD não se liga ao gel e pode ser recolhida no fluxo de saída.

Em ambos os passos de cromatografia em coluna, a recolha das fracções é controlada por OD. O fluxo de saída da cromatografia em coluna de permuta aniónica contendo a proteína D purificada é concentrado por ultrafiltração. O retido de ultrafiltração contendo a proteína D é finalmente passado através de uma membrana com 0,2 pm. 46

Química:

Química de activação e ligação:

As condições de activação e de ligação são especificas para cada polissacárido. Estas são fornecidas na Tabela 1. 0 polissacárido nativo (excepto para PS3) foi dissolvido em NaCl 2 M ou em água para injecção. Foi avaliada a concentração óptima em polissacáridos para todos os serotipos.

Foi adicionado CDAP (proporção CDAP/PS de 0,75 mg/mg PS) à solução de polissacáridos, a partir de uma solução de armazenamento em acetonitrilo 100 mg/mL. Após 1,5 minutos, foi adicionada trietilamina 0,2 M, para obter o pH de activação especifico. A activação do polissacárido foi realizada a este pH durante 2 minutos a 25 °C. A Proteína D (a quantidade depende da proporção inicial de PS/PD) foi adicionada ao polissacárido activado e a reacção de ligação foi realizada no pH específico, durante 1 hora. A reacção foi, então, atenuada com glicina durante 30 minutos a 25 °C e durante a noite a 4 °C.

Os conjugados foram purificados por filtração em gel utilizando uma coluna de filtração em gel Sephacryl 500HR equilibrada com NaCl 0,2 M.

Foi determinado o conteúdo em proteínas e carbo-hidratos das fracções eluídas. Os conjugados foram combinados e esterilizados por filtração numa membrana esterilizante com 0,22 pm. Soram determinadas as proporções PS/Proteína nas preparações de conjugado. 47

Caracterização:

Cada conjugado foi caracterizado e satisfez as especificações descritas na Tabela 2. 0 conteúdo em polissacáridos (pg/mL) foi medido pelo teste do Resorcinol e o conteúdo em proteína (pg/mL), pelo teste de Lowry. A proporção PS/PD final (p/p) é determinada pela proporção das concentrações.

Conteúdo residual de DMAP (ng/pg PS) : A activação do polissacárido com CDAP introduz um grupo cianato no polissacárido e é libertado DMAP (4-dimetilamino-piridina) . 0 conteúdo residual em DMAP foi determinado por um ensaio específico desenvolvido em SB.

Conteúdo em polissacárido livre (%): 0 conteúdo em polissacárido livre dos conjugados mantidos a 4 °C ou armazenados 7 dias a 37 °C foi determinado no sobrenadante obtido, após incubação com anticorpos α-PD e sulfato de amónio saturado, seguido por uma centrifugação.

Foi utilizado um ELISA α-PS/a-PS para a quantificação de polissacárido livre no sobrenadante. A ausência de conjugados foi também controlada por um ELISA α-PD/a-PS. A redução da quantidade de polissacárido livre resulta numa vacina conjugada melhorada. 48

Antigenicidade; A antigenicidade nos mesmos conjugados foi analisada num ELISA de tipo sanduíche em que a captura e a detecção de anticorpos foram, respectivamente, α-PS e a-PD.

Conteúdo em proteína livre (%): 0 nível de proteína D "livre" residual foi determinado utilizando um método com tratamento com SDS da amostra. 0 conjugado foi aquecido 10 minutos a 100 °C na presença de SDS 0,1% e foi injectado numa coluna de filtração em gel SEC-HPLC (TSK3000-PWXL) . Como a proteína D é um dímero, existe um risco de sobre-estimar o nível de proteína D "livre" pela dissociação da estrutura com SDS.

Tamanho molecular (Kav) : O tamanho molecular foi determinado numa coluna de filtração em gel SEC-HPLC (TSK 5000-PWXL).

Estabilidade: A estabilidade foi medida em filtração em gel HPLC-SEC (TSK6000-PWXL) para conjugados mantidos a 4 °C e armazenados durante 7 dias a 37 °C. A caracterização 11-valente é fornecida na Tabela 2 49

Os conjugados de proteína podem ser adsorvidos em fosfato de alumínio e combinados para formar a vacina final.

Conclusão:

Foram produzidos conjugados imunogénicos, que, desde então, demonstraram serem componentes de uma vacina promissora. As condições CDAP optimizadas para um produto polissacarídico pneumocócico conjugado final da melhor qualidade, foram determinadas para cada uma das 11 valências. Os conjugados destes polissacáridos pneumocócicos, obteníveis pelo processo melhorado (optimizado) de CDAP, acima, (independentemente da proteína veículo, mas, de um modo preferido, proteína D) são, deste modo, um aspecto adicional da invenção.

Exemplo 2 - Estudo do Efeito de Adjuvantes Avançados sobre a Imunogenicidade da Vacina 11-Valente de Conjugado PS-PD Pneumocócico em Ratos bebés

Os ratos bebés foram imunizados com vacina 11-valente de conjugado PS-PD pneumocócico, numa dosagem de 0,1 pg de cada polissacárido (preparada de acordo com o método do Exemplo 1) e utilizando as seguintes formulações de adjuvante: nenhum, AIPO4, 3D-MPL, 3D-MPL em A1P04. A formulação com apenas 3D-MPL foi estatisticamente (e surpreendentemente) mais imunogénica (maior GMC da IgG) do que para as outras formulações para 5 de 11 antigénios. Isto foi verificado, tanto em concentrações elevadas como baixas de 3D-MPL. 50 A opsonofagocitose confirmou os resultados da GMC.

Materiais e Métodos

Protocolo de Imunização

Os ratos OFA bebés foram atribuídos aleatoriamente a mães diferentes e tinham 7 dias de idade quando estes receberam a primeira imunização. Estes receberam 2 imunizações adicionais, ao fim de 14 e 28 dias. Foi recolhido sangue no dia 56 (28 dias após III) . A totalidade das vacinas foi injectada s. c. e houve 10 ratos por grupo de vacina.

Os ratos foram imunizados com vacina de conjugado pneumocócico 11 valente, compreendendo os seguintes serotipos de polissacárido, conjugados com a proteína D: 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 23F.

Formulação

Para examinar o efeito de diferentes adjuvantes avançados, a dosagem do conjugado foi mantida constante em 0,1 pg de cada polissacárido e os adjuvantes AIPO4 e 3D-MPL foram formulados em diferentes dosagens e combinações, não incluindo qualquer adjuvante. Estes estão listados numericamente na Tabela 3 para referência. 51

Adsorção em A1P04

Os monovalentes adsorvidos, concentrados, foram preparados de acordo com o seguinte processo. Foram misturados 50 pg de AIPO4 (pH 5,1) com 5 pg de polissacáridos conjugados, durante 2 horas. O pH foi ajustado para pH 5,1 e a mistura foi deixada durante mais 16 horas. Foi adicionado NaCl 1500 mM para originar uma concentração de sal de 150 mM. Após 5 minutos foi adicionado 2-fenoxietanol 5 mg/mL. Após mais 30 minutos, o pH foi ajustado para 6,1 e foi deixada durante mais de 3 dias a 4 °C.

Preparação de diluentes

Foram preparados três diluentes em NaCl 150 mM/fenoxietanol 5 mg/mL A: AIPO4 a 1 mg/mL. B: 3D-MPL em A1P04 a, respectivamente, 250 e 1000 pg/mL,

Proporção de peso 3D-MPL/A1P04 = 5/20 C: 3D-MPL em AIPO4 a, respectivamente, 561 e 1000 pg/mL,

Proporção de peso 3MPL/ AIPO4 = 50/89

Preparação de undecavalente adsorvido

Os onze monovalentes PS-PD concentrados, adsorvidos foram misturados na proporção correcta. O complemento de A1P04 foi adicionado como diluente A. Quando necessário, o 3D-MPL foi adicionado, quer como uma solução aquosa (não adsorvido, Via 1, 52 ver abaixo) , quer como o diluente B ou C (3D-MPL adsorvido em AIPO4 em 2 doses, Via 2, ver abaixo).

Via 1

Foi adicionado 3D-MPL aos conjugados adsorvidos combinados, sob a forma de uma suspensão aquosa. Este foi misturado com o undecavalente durante 10 minutos à temperatura ambiente e foi armazenado a 4 °C até a administração.

Via 2 O 3D-MPL foi pré-adsorvido em A1P04 antes da adição aos conjugados adsorvidos combinados (diluente B e C). Para preparar 1 mL do diluente, foi misturada uma suspensão aquosa de 3D-MPL (250 ou 561 pg) com 1 mg de AIPO4 em NaCl 150 mM pH 6,3 durante 5 minutos à temperatura ambiente. Esta solução foi diluída em NaCl pH 6,1/fenoxilo e foi incubada, durante a noite, a 4 °C.

Preparação de undecavalente não-adsorvido

Os onze conjugados PS-PD foram misturados e diluídos na proporção correcta em NaCl 150 mM pH 6,1, fenoxilo. Quando necessário, foi adicionado 3D-MPL sob a forma de uma solução (não adsorvido).

As formulações para todas as injecções foram preparadas 18 dias antes da primeira administração. 53

ELISA 0 ELISA foi realizado para medir as IgG de rato, utilizando o protocolo derivado do workshop WHO sobre o processo ELISA, para a quantificação do anticorpo IgG contra os polissacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae no soro humano. Essencialmente, o polissacárido capsular purificado é utilizado para revestir directamente a placa de microtitulação. As amostras de soro são pré-incubadas com o polissacárido da parede celulra comum à totalidade dos pneumococos (substância C) e que está presente na ca. de 0,5% dos polissacáridos pneumocócicos, purificados de acordo com a divulgação (documento EP 72513 Bl). Foram utilizados reagentes de Jackson Immuno Laboratories Inc, para detectar IgG murina ligada. As curvas de titulação foram referentes a padrões internos (anticorpos monoclonais) modelados pela equação logística logarítmica. Os cálculos foram realizados utilizando o programa informático SoftMax Pro. É previsto que o erro absoluto máximo nestes resultados se encontre dentro de um factor de 2. O erro relativo é inferior a 30%.

Opsonofagocitose

Os títulos opsónicos foram determinados para os serotipos 3, 6B, 7F, 14, 19F e 23F, utilizando o protocolo CDC (Opsonofagocitose de Streptococcus pneumoniae utilizando células HL60 diferenciadas, versão 1.1) com PMN humanas purificadas e complemento de coelho bebé. A modificação incluiu a utilização de estirpes pneumocócicas produzidas internamente e as células HL60 fagocíticas foram substituídas por neutrófilos humanos purificados PMN (existe um elevado grau de correlação entre estas células fagocíticas). Para além disso, foram adicionadas 54 esferas de vidro com 3 mm aos poços de microtitulação, para aumentar a mistura, e isto permitiu a redução da proporção fagócito:bactérias, a qual foi recomendada ser 400.

Resultados

Concentrações de IgG A média geométrica das concentrações da IgG, determinadas para cada serotipo e PD, são apresentadas nas Tabelas 4 a 10. Para os serotipos 6B, 14, 19F e 23F, os resultados anteriores, obtidos utilizando uma formulação tetravalente, são incluídos para comparação.

As concentrações de IgG mais elevadas encontram-se destacadas nas Tabelas 4 a 10. O valor de p estatístico para as composições de 3D-MPL vs. composições de 3D-MPL/AIPO4 encontra-se na Tabela 11. A formulação de adjuvante número 4 (conjugados não-adsorvidos com uma dose elevada de 3D-MPL) que origina as GMC mais elevadas para 9 em cada 11 casos. Em 5/11 casos, o MPL na dose baixa é o segundo mais imunogénico. Para além disso, a adjuvantação origina GMC mais elevadas, do que por modificação da dose para todos os serotipos (dados não apresentados) e isto é estatisticamente significativo para os serotipos 4, 6B, 7F, 18C e 23F (p < 0,05 de Cl a 95%).

Opsonofagocitose

Nas Tabelas 4 a 8 são apresentados os resultados de opsonofagocitose em soros combinados para os serotipos 3, 6B, 55 7F, 14, 19F e 23F. Na sua maioria, estes títulos opsónicos confirmam a GMC da IgG. De facto, a correlação com a concentração da IgG é superior a 85% para os serotipos 6B, 19F, 23F (dados não apresentados) . Para o serotipo 3, é importante observar que apenas o grupo 3D-MPL induziu actividade opsónica acima do limiar.

Conclusões

Nesta experiência, foi inesperado que a utilização de 3D-MPL isolada induzisse as concentrações de IgG mais elevadas. A GMC da IgG máxima, obtida com a modificação do adjuvante foi comparada com as GMC máximas obtidas pela modificação da dosagem de PS e foi verificado que o 3D-MPL pode induzir respostas significativamente mais elevadas em 5/11 dos serotipos. A Tabela 11 mostra que, quando são comparadas as composições 3D-MPL e 3D-MPL/AIPO4 (comparando o processo de formulação e a dose de 3D-MPL) , 5 dos conjugados de polissacáridos são significativamente melhorados, quanto à imunogenicidade, quando formulados com apenas 3D-MPL, em relação a 3D-MPL mais A1P04: PS 4, PS 6B, PS18C, PS 19F e PS 23F. 56

Exemplo 3 - Estudo dos efeitos da combinação sobre a imunogenicidade de conjugados de PS 4, PS 6B, PS 18C, PS19F e PS 23F em ratos adultos

Os ratos adultos foram imunizados com vacinas de conjugado de polissacárido pneumocócico - proteína D, quer individualmente, quer em combinação numa composição multivalente (tetra-, penta-, hepta- ou decavalente). Foram imunizados grupos de 10 ratos, duas vezes, separadas por 28 dias e foram obtidas sangrias de teste no dia 28 e no dia 42 (14 dias após a 2a dose) .

Os soros foram testados por ELISA para anticorpos IgG contra os polissacáridos pneumocócicos. A totalidade dos conjugados induziram anticorpos IgG específicos, como medido por ELISA. A Tabela 12 mostra o efeito da combinação de conjugados de PS 6B, PS 18C, PS 19F e PS 23F monovalentes e proteína D, em termos de imunogenicidade em ratos adultos, como medido pela concentração de IgG a 14 dias após a 2a dose.

Foi realizada análise estatística em todas as amostras, para determinar se as diferenças na concentração de anticorpos após a combinação eram significativas. A combinação de qualquer dos serotipos PS 6B, PS 18C, PS 19F e PS 23F conjugados com proteína D numa vacina multivalente não modificou significativamente a sua imunogenicidade. 57

Tabela 1

Condições de activação/ligação/atenuação especificas para conjugados de PS de S. Pneumoniae-proteína D

Serotipo 1 3 (pfluid,) 4 5 6B 7F Cone. do PS (mg/mL) 2,0 3,0 2,0 7,5 5,4 3,0 Dissolução do PS NaCl 2 M NaCl 2 M h2o H20 NaCl 2 M NaCl 2 M Cone. da PD (mg/mL) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Proporção Inicial PS/PD (p/p) 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1 Cone. da CDAP (mg/mg PS) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 pHa=pHc=pHq 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0

Serotipo 9V 14 18C 19F 23F Cone. do PS (mg/mL) 2,5 2,5 2,0 4,0 3,3 Dissolução do PS NaCl 2 M NaCl 2 M h2o NaCl 2 M NaCl 2 M Cone. da PD (mg/mL) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Proporção Inicial PS/PD (p/p) 1/0,75 1/0,75 1/1 1/0,5 1/1 Cone. da CDAP (mg/mg PS) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 pHa=pHc=pHq 8,5/8,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 10/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 58 TABELA 2 valente-PD serotipo) (os

Especificações da vacina de primeiros números do código pneumocócico 11 de lote indicam o

PS

Critérios D01PDJ227 D03PDJ236 D4PDJ228 D5PDJ235 D6PDJ209 Proporção PS/Prot (p/p) 1/0,66 1/1,09 1/0,86 1/0,86 1/0,69 Conteúdo em polisac. livres (%) <10% 1 1 7 9 0 Conteúdo em proteína livre (%) <15% 8 <1 19 21 9 Conteúdo em DMAP (ng/pg PS) <0,5 ng/pg PS 0,2 0, 6 0,4 1,2 0,3 Tamanho molecular (Kav) 0,18 0,13 0,12 0, 11 0,13 Estabilidade sem alteração sem alteração sem alteração pouca alteração sem alteração D07PDJ225 D09PDJ222 D14PDJ202 D18PDJ221 D19PDJ206 D23PDJ212 Proporção PS/Prot (p/p) 1/0,58 1/0,80 1/0,68 1/0,62 1/0,45 1/0,74 Conteúdo em polisac. livres (%) <10% 1 <1 <1 4 4 0 Conteúdo em proteína livre (%) <15% 8 0,3 3 21 10 12 Conteúdo em DMAP (ng/pg PS) <0,5 ng/pg PS 0, 1 0, 6 0,3 0,2 0, 1 0, 9 Tamanho molecular (Kav) 0, 14 0, 14 0, 17 0, 10 0, 12 0, 12 Estabilidade sem alteração sem alteração sem alteração sem alteração alteração sem alteração 59

Tabela 3. Tabela Resumo de Formulações de Adjuvante testadas com PS Pneumocócico 11-Valente-PD em Ratos Bebés

Grupo A1P04 MPL Método Descrição 1 Nenhum 2 100 A1P04 3 5 MPL baixo 4 50 MPL elevado 5 100 5 Via 1 Via 1 baixo 6 100 50 Via 1 Via 1 elevado 7 100 5 Via 2 Via 2 baixo 8 100 50 Via 2 Via 2 elevado 60

Tabela 1. Média Geométrica da Concentração de IgG, Seroconversão e Titulo Opsónico Médio do Serotipo 6B, no Dia 28 Após Imunização III de Ratos Bebés com PS 11-Valente-PD, utilizando Diferentes Adjuvantes (E Comparação com Imunização Tetravalente) Τ 9

Grup 0 AIPO 4 pg MP L Métcd 0 6B GMC IgG (pg/mL) 5B Seroconversão 6B Titulo Opso* 6B GMC IgG (pg/mL) 6B Seroconversão 6B Titulo Opso* Tetravalent e Dndecavalent e 1 0,047 2/10 12,5 0,004 1/10 <6,25 2 100 0,048 4/10 55 0,019 4/10 <6,25 3 5 1,345 10/10 43 4 50 4,927 10/10 192 5 100 5 1 0,042 7/10 <6,25 8 100 50 1 0,255 10/10 <6,25 7 100 5 2 0,033 3/10 <6,25 0,048 8/10 <6,25 8 100 50 2 0,057 8/10 <6,25

Tabela 5. Média Geométrica da Concentração de IgG, Seroconversào e Título Opsónico Médio do Serotipo 14, no Dia 28 Após Imunização III de Ratos Bebés com PS 11-Valente-PD, utilizando Diferentes Adjuvantes (E Comparação com Imunização Tetravalente)

Grupo ALP 04 PG MPL Método 14 GMC IgG (pg/mL) 14 Seroconversã 14 Titulo Opsónico* 14 GMC IgG (pg/mL) 14 Seroconversào 14 Título Opsónico* Tetravalente Dndecaval ente 1 0,048 3/10 64 0,022 3/10 <6,25 2 100 0,99 10/10 88 0,237 8/10 27 3 5 0,233 10/10 41 4 50 0,676 10/10 81 5 100 5 1 0,460 9/10 67 8 100 50 1 0,477 10/10 98 7 100 5 2 0,81 10/10 49 0,165 8/10 81 8 100 50 2 1,611 10/10 133

Tabela 6. Média Geométrica da Concentração de IgG, Seroconversào e Título Opsónico Médio do Serotipo 19F, no Dia 28 Após Imunização III de Ratos Bebés com PS 11-Valente-PD, utilizando Diferentes Adjuvantes (E Comparação com Imunização Tetravalente) 6 3

Grupo ALP 04 PG MPL pg Método 19F GMC IgG (pg/mL) 19F Seroconversã 19F Titulo Opsónico* 19F GMC IgG (pg/mL) 19F Seroconversão 19F Titulo Opsónico* Tetravalente Undecaval Lente 1 0,04 2/10 84 0,021 2/10 <6,25 2 100 1,07 9/10 367 0,222 7/10 79 3 5 4,028 10/10 296 4 50 21,411 10/10 1276 5 100 5 1 1,649 10/10 172 8 100 50 1 2,818 10/10 208 7 100 5 2 1,09 10/10 193 0,766 10/10 323 8 100 50 2 3,539 10/10 241

Tabela 7. Média Geométrica da Concentração de IgG, Seroconversào e Título Opsónico Médio do Serotipo 23F, no Dia 28 Após Imunização III de Ratos Bebés com PS 11-Valente-PD, utilizando Diferentes Adjuvantes (E Comparação com Imunização Tetravalente) 6 4

Grupo ALP 04 PG MPL pg Método 23F GMC IgG (pg/mL) 23F Seroconversã 23F Titulo Opsónico* 23F GMC IgG (pg/mL) 23F Seroconversão 23F Titulo Opsónico* Tetravalente Undecaval Lente 1 0,06 2/10 <6,25 0,152 3/10 <6,25 2 100 0,29 10/10 70 0,56 8/10 <6,25 3 5 2,296 9/10 389 4 50 4,969 10/10 >1600 5 100 5 1 0,462 5/10 17 8 100 50 1 0,635 8/10 54 7 100 5 2 0,38 10/10 <6,25 0,203 3/10 18 8 100 50 2 - 0,501 7/10 43

Tabela 8. Média Geométrica da Concentração de IgG, Seroconversào e Título Opsónico Médio dos Serotipos 3 e 7F, no Dia 28 Após Imunização III de Ratos Bebés com PS 11-Valente-PD, utilizando Diferentes Adjuvantes 6 5

Grupo ALP 04 pg MPL pg Método 3 GMC IgG (pg/mL) 3 Seroconversào 3 Titulo Opsónico* 7F GMC IgG (pg/mL) 7F Seroconversào 7F Titulo Opsónico* 1 0,003 1/10 <6,25 0,040 7/10 <6,25 2 100 0,008 6/10 <6,25 0,25 9/10 43 3 5 0,070 10/10 <6,25 2,435 10/10 477 4 50 0,108 10/10 18 2,569 10/10 332 5 100 5 1 0,015 10/10 <6,25 0,579 10/10 54 6 100 50 1 0,027 10/10 <6,25 0,611 9/10 59 7 100 5 2 0,008 10/10 <6,25 0,154 8/10 30 8 100 50 2 0,034 10/10 <6,25 0,638 9/10 140

Tabela 9. Média Geométrica da Concentração de IgG e Seroconversão dos Serotipos 1, 4 e 5, no Dia 28 Após Imunização III de Ratos Bebés com PS 11-Valente-PD, utilizando Diferentes Adjuvantes 6 6

Grup 0 AL P 04 E MP L pg Métod 0 1 GMC IgG (pg/mL ) 1 Seroconversã 0 4 GMC IgG (pg/mL ) 4 Seroconversã 0 5 GMC IgG (pg/mL ) 5 Seroconversã 0 1 0,020 4/10 0,005 0/10 0,040 3/10 2 10 0 0,282 8/10 0,052 5/10 0,774 9/10 3 5 1,014 10/10 3,452 10/10 7,927 10/10 4 50 2,201 10/10 7,102 10/10 13,974 10/10 5 10 0 5 1 0,508 10/10 0,076 10/10 3,015 1/10 8 10 0 50 1 1,430 10/10 0,419 9/10 5,755 10/10 7 10 0 5 2 0,478 10/10 0,267 9/10 2,002 10/10 8 10 0 50 2 1,458 10/10 0,423 10/10 5,009 10/10

6 V

Tabela 10. Média Geométrica da Concentração de IgG e Seroconversão dos Serotipos 9V, 18C e PD, no Dia 28 Após Imunização III de Ratos Bebés com PS 11-Valente-PD, utilizando Diferentes Adjuvantes 6 8

Grup 0 AI P 04 n MP L dg Métod 0 9V GMC IgG (pg/mL ) 9V Seroconversã 0 18C GMC IgG (pg/iriL ) 18C Seroconversã 0 PD GMC IgG (pg/mL ) PD Seroconversã 0 1 0,018 0/10 0,013 1/10 0,003 0/10 2 10 0 0,489 6/10 0,092 5/10 0,993 10/10 3 5 0,482 7/10 6,560 10/10 3,349 10/10 4 50 11,421 10/10 14,023 10/10 5,446 10/10 5 10 0 5 1 2,133 9/10 0,690 10/10 11,407 10/10 0 10 0 50 1 2,558 10/10 1,771 10/10 1,258 10/10 7 10 0 5 2 1,536 10/10 0,528 10/10 1,665 8/10 8 10 50 2 2,448 9/10 0,980 10/10 5,665 10/10 6 9

Tabela 11: 0 significado estatístico (valor de p) de se determinados conjugados polissacarídicos pneumocócicos apresentavam imunogenicidade melhorada quando formulados com 3D-MPL isolado versus com 3D-MPL/A1P04. Um valor de p inferior a 0,01 é considerado altamente significativo. A Via 1 e a Via 2 indicam o método de formulação. serotipo 50 pg 3D-MPL vs 3D-MPL/AIPO4 5 pg 3D-MPL vs 3D-MPL/A1P04 Via 1 Via 2 Via 1 Via 2 1 0,3 0,05 0,079 0,11 3 0,075 0,01 0,27 0,008 4 0,002 0,0003 0,02 0,003 5 0,04 0,002 0,1 0,12 6B 0,001 0,0001 0,001 0,0006 7F 0,13 0,15 0,01 0,005 9V 0,02 0,02 0,1 0,04 14 0, 65 0,21 0,3 0, 66 18C 0,0008 0,0002 0,006 0,004 19F 0,0009 0,006 0,21 0,04 23F 0,002 0,0004 0,01 0,0004 70

Tabela 12: Média Geométrica da Concentração de IgG (pg/mL) no dia 14 após a 2a dose após imunização de ratos adultos com 1,0 pg de conjugado de polissacárido - proteína D apenas ou combinado com vacina tetravalente, pentavalente, heptavalente ou decavalente. Estes dados são combinados a partir de 5 experiências distintas.

Serotipos Vacinas 4 H 6B T 18C H 19F T 23F T Isolado 9,3 0,11 15 5,2 2,5 Combinado 4 0,23 3,7 3,7 2,8 T: combinado em vacinas de combinação tetravalentes (T) (PS 6B, 14, 19F, 23F), pentavalentes (T mais PS 3), heptavalentes (Η) (T mais PS 4, 9V e 18C) e decavalentes (H mais PS 1, 5 e 7F) . H: combinado em vacinas de combinação heptavalentes (Η) (T mais PS 4,9V e 18C) e decavalentes (H mais PS 1, 5 e 7F).

Exemplo 4 - Impacto benéfico da adição de pneumolisina e 3D-MPL sobre a eficácia protectora de vacina de polissacárido 11-valente conjugado com PD, contra a colonização pneumocócica do pulmão em murganhos

Leituras Imunológicas

Dosagem por ELISA de IgG do soro, especificas para a pneumolisina

As imunoplacas Maxisorp Nunc foram revestidas durante 2 horas a 37 °C com 100 pL/poço de pneumolisina nativa recombinante 2 pg/mL (PLY) diluída em PBS. As placas foram lavadas 3 vezes com tampão NaCl 0,9% Tween-20 0,05%. 71

Seguidamente, foram incubadas diluições 2 vezes seriadas (em PBS/ Tween-20 0,05%, 100 pL por poço) de um padrão de soro anti-PLY adicionadas como uma curva padrão (iniciando em 670 ng/mL de IgG) e amostras do soro (iniciando numa diluição 1/10), durante 30 minutos a 20 °C, sob agitação. Após lavagem, como anteriormente descrito, a IgG de cabra anti-murganho conjugada com peroxidase (Jackson) diluída 5000x em PBS/Tween-20 0,05% foi incubada (100 pL/poço) durante 30 minutos a 20 °C sob agitação. Após a lavagem, as placas foram incubadas durante 15 min à temperatura ambiente com 100 pL/poço de tampão de revelação (OPDA 0,4 mg/mL e H2O2 0,05% em tampão citrato 100 mM pH 4,5) . A revelação foi inactivada adicionando 50 pL/poço de HC1 1 N. As densidades ópticas foram lidas a 490 e 620 nm, utilizando um Emax immunoreader (Molecular Devices). O título do anticorpo foi calculado pelo método matemático de 4 parâmetros, utilizando o programa informático SoftMaxPro.

Inibição da Hemólise

Este ensaio foi realizado para medir a capacidade de anticorpos de soro inibirem a actividade hemolítica da pneumolisina (PLY). Para eliminar o colesterol (susceptível de interacção com a PLY), as amostras de soro foram tratadas 2x como se segue: estas foram misturadas com 1 volume igual de clorofórmio e, seguidamente, incubadas durante 45 minutos sob agitação. Os sobrenadantes foram recolhidos após centrifugação durante 10 minutos a 1000 rpm. Os soros libertados de colesterol foram diluídos (diluições 2 vezes seriadas em ditiotreitol 1 mM, BSA 0,01%] TRIS 15 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) em microplacas de 96 poços (Nunc). Foram adicionados cinguenta pL de uma solução contendo 4 HU (Unidades de Hemólise) de PLY a cada poço e foram 72 incubados durante 15 minutos a 37 °C. Seguidamente, foram adicionados 100 gL de glóbulos sanguíneos vermelhos de ovelha (solução a 1%), durante 30 minutos a 37 °C. Após centrifugação durante 10 minutos a 1000 rpm, os sobrenadantes (150 gL) foram recolhidos e colocados numa outra microplaca de 96 poços para a leitura da densidade óptica a 405 nm. Os resultados foram expressos como os titulos de diluições do ponto médio

Destoxificação química da pneumolisina A pneumolisina nativa recombinante (PLY) foi dialisada contra tampão Fosfato 50 mM NaCl 500 mM pH 7,6. A totalidade dos passos seguintes foi realizadda a 39,5 °C sob agitação episódica. No dia 1, foram adicionados Tween-80 10% (1/250 v/v) , N-acetiltriptofano 57, mM pH 7. (3/100 v/v), glicina 2,2 M em tampão Fosfato (1/100 v/v) e formaldeido 10 % em tampão Fosfato (3/100 v/v), à solução de PLY. Nos dias 2 e 3, foi adicionado, novamente, formaldeido a 10%, respectivamente, na proporção 3/100 e 2/100 v/v. A incubação a 39,5 °C foi mantida até ao dia 7, sob agitação episódica. Finalmente, a PLY foi dialisada contra tampão Fosfato 50 mM NaCl 500 mM pH 7,6. A inactivação completa da PLY foi demonstrada no ensaio de hemólise.

Desafio Pneumocócico Intranasal em murganhos OF1

Foram inoculados intranasalmente, murganhos OF1 do sexo feminino com sete semanas sob anestesia, com 5 x 105 CFU do serotipo 6B de S. pneumoniae adaptado a murganho. Os pulmões foram removidos 6 horas após o desafio e homogeneizados (Ultramax, 24000 rpm, 4°C) em Meio Liquido de Todd Hewith (THB, 73

Gibco). As diluições 10 vezes seriadas dos homogeneizados de pulmão foram plaqueadas durante a noite a 37°C em placas de Petri contendo THB agar suplementado com extracto de levedura. A infecção pulmonar Pneumocócica foi determinada como o número de CFU/murganho, expresso como a média ponderada logarítmica. O limite de detecção foi de 2,14 log CFU/murganho.

Exemplo 4A Efeito do adjuvante 3D-MPL sobre a resposta imunitária anti-pneumolísina

No exemplo presente, foi avaliado o impacto da adjuvantação com 3D-MPL, sobre a resposta imunitária à pneumolisina recombinante nativa (PLY, fornecida por J. Paton, Children's Hospital, North Adelaide, Austrália) e ao seu homólogo quimicamente destoxifiçado (DPLY) . A detoxificação química foi realizada como descrito acima.

Foram imunizados intramuscularmente grupos de 10 murganhos Balb/c do sexo feminino com 6 semanas de idade nos dias 0, 14 e 21 com 1 pg de PLY ou de DPLY, contido quer em A: 100 pg de A1P04; quer em B: 100 pg de A1P04 + 5 pg de 3D-MPL (Monofosforil lípido A 3 des-O-acilado, fornecido por Ribi Immunochem) . As figuras IA e 1B mostram ELISA de IgG e os titulos de Inibição da HemóLise (HLI) medido em soros após III.

Seja qual for o antigénio, as melhores respostas imunitárias foram induzidas em animais vacinados com formulações suplementadas com 3D-MPL. Curiosamente, a DPLY foi tão imunogénica como a PLY, quando administrada com A1P04 + 3D-MPL, sendo um imunogénio mais fraco na formulação com A1P04. Isto demonstrou a capacidade vantajosa do 3D-MPL melhorar a resposta dos anticorpos à pneumolisina destoxifiçada.

Em composições contendo pneumolisina, pode ser preferido utilizar pneumolisina quimicamente destoxifiçada e não pneumolisina destoxifiçada por mutação. Isto é devido aos mutantes destoxifiçados obtidos até ao momento, terem ainda actividade de toxina residual - a pneumolisina quimicamente destoxifiçada não tem. Por isso, é considerado um outro aspecto da invenção que, em geral, as composições que compreendem pneumolisina (ou mutantes da pneumolisina) que foi quimicamente destoxifiçada para a utilização numa vacina, devem ser adjuvadas com um adjuvante Thl, de um modo preferido 3D-MPL. Essas composições são proporcionadas pela invenção. É, também, visado um método para aumentar a resposta imunitária da pneumolisina quimicamente destoxifiçada, dentro de uma composição imunogénica, compreendendo os passos de adição de um adjuvante Thl (de um modo preferido 3D-MPL) à composição.

Exemplo 4B Impacto benéfico da adição de um mutante atenuado de pneumolisina e adjuvante 3D-MPL na eficácia de protecção da vacina de polissacárido 11-valente conjugado com PD contra a colonização pneumocócica do pulmão em murganhos OF1 desafiados intranasalmente com o serotipo 6B.

No exemplo presente, foi avaliada a eficácia profilática de uma vacina contendo o conjugado de polissacárido 11-valente -proteina D, antigénio da pneumolisina mutante atenuada (PdB, documento WO 90/06951) e adjuvantes A1P04 + 3D-MPL, em comparação com a formulação clássica de conjugado de polissacárido 11-valente-proteina D adsorvido a A1P04. 75

Foram imunizados, subcutaneamente, grupos de 12 murganhos 0F1 fêmea com 4 semanas, nos dias 0 e 14 com formulações contendo A: 50 pg de A1P04; B: 0,1 pg de PS/serotipo de vacina de polissacárido 11-valente conjugado com PD + 50 pg A1P04; ou C: 0,1 pg de PS/serotipo de vacina de polissacárido 11-valente conjugado com PD + 10 pg PdB (fornecida por J. Paton, Children's Hospital, North Adelaide, Austrália) + 50 pg de A1P04 + 5 pg 3 de D-MPL (fornecido por Ribi Immunochem) . O desafio foi realizado no dia 21 como descrito acima.

Como mostrado na Figura 1 C, foi conferida uma protecção muito significativa (p <0,007) pela vacina de conjugado de polissacárido 11-valente, suplementada com PdB e adjuvada com A1P04 + MPL (as barras a negro representam a média aritmética). Pelo contrário, não foi observada qualquer protecção significativa em animais imunizados com a formulação de conjugado polissacárido ll-valente/AlP04. Este resultado comprovou que a adição de antigénio de pneumolisina (mesmo atenuado) e de adjuvante 3D-MPL, intensificou a eficácia da vacina de conjugado de polissacárido 11-valente contra a pneumonia.

Exemplo 4C, Correlação imunitária da protecção apresentada no exemplo 4B

Para estabelecer a correlação imunitária da protecção conferida no exemplo 4B, pela vacina de conjugado de polissacárido 11-valente, suplementada com pneumolisina mutante atenuada (PdB) e 3D-MPL, as respostas serológicas de anticorpos 76 contra o polissacárido 6B e PdB, pré-desafio, foram medidas como descrito acima.

Os títulos de anticorpo foram, então, comparados com o número de colónias bacterianas medidas nos pulmões dos animais correspondentes, recolhidos às 6 horas após o desafio. Os R2 foram calculados em regressões lineares Log/Log.

Os R2 calculados foram iguais a 0,18 e 0,02, respectivamente, para respostas de anticorpos anti-PdD e anti-6B. Isto demonstrou a ausência de correlação entre respostas imunitárias humorais e a protecção para ambos os antigénios. Os títulos do anticorpo anti-6B não foram significativamente diferentes nos grupos imunizados com a vacina de conjugado 11-valente (GMT =0,3 ng/mL) ou com a mesma vacina suplementada com PdD e 3D-MPL (GMT = 0,458 ng/mL). Consequentemente, a melhoria da protecção verificada para a formulação C não foi apenas devida a uma resposta mais elevada dos anticorpos ao polissacárido 6B.

No seu conjunto, os resultados sugerem que a protecção não foi mediada apenas por respostas imunitárias humorais, mas também por uma imunidade mediada por células induzida pelo antigénio PdB na presença de 3D-MPL. Isto forneceu suporte adicional à adição de antigénio(s) proteico(s) e adjuvante(s) potente(s) na vacina de conjugado polissacarídico pneumocócico, de forma a coordenar ambos os ramos do sistema imunitário para uma protecção óptima. 77

Exemplo 5 A Cooperação de ambos os ramos do Sistema Imunitário em murganhos imunizados activamente com pneumolisina e imunizados passivamente com anticorpos contra PS pneumocócicos

Exemplo 5A Determinar a Concentração de Anticorpos Anti-Polissacárido 6B (anti-PS) Protegendo Contra a Pneumonia, Administrados Passivamente Método

Grupos de Vacina: Foram imunizados passivamente quatro grupos de 16 murganhos (i.p.), no dia -1, com 100 pL de antisoros anti-polissacárido de rato não diluídos de acordo com os grupos detalhados abaixo, (total de 64 murganhos)

Grupo Especificidade Concentração de IgG nos Antisoros G1 OÍ-PS-6B 5 pg/mL. G2 OÍ-PS-6B 2 pg /mL. G3 OÍ-PS-6B 0,75 pg/mL. G4 Controlo 0 pg/ mL.

Animais: 64 murganhos CD-I do sexo masculino de Charles River, Canadá, pesando, aprox 35g (aprox 10 semanas de idade).

Anestesia: Os murganhos foram anestesiados com isoflurano (3%) mais 02 (1 L/min).

Organismo: S. pneumoniae N1387 (serotipo 6) foi recolhido a partir de placas de agar de tripticase de soja (TSA) 78 suplementado com sangue de cavalo a 5% e foi suspenso em 6 mL de PBS. Imediatamente antes da infecção, foi diluido 1 mL de suspensão bacteriana em 9 mL de agar nutritivo fundido arrefecido (BBL) e mantido a 41 °C. Os murganhos receberam, aproximadamente, 6,0 log 10 cfu/murganho num volume de 50 pL.

Infecção: Os murganhos foram anestesiados no dia 0, como descrito acima e foram infectados com S. pneumoniae N1387 (50 pL de suspensão bacteriana arrefecida), por instilação intra-bronquial via intubação intra-traqueal não-cirúrgica. Este método foi descrito por Woodnut e Berry (Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43: 29 (1999)).

Amostras: Foram sacrificados 8 murganhos/grupo, no dia 3 após infecção, por sobredose de C02 e os pulmões foram excisados e homogeneizados em 1 mL de PBS. As diluições dez vezes seriadas foram preparadas em PBS para contar os números de bactérias viáveis. As amostras foram inoculadas (20 pL) em triplicado nas placas de TSA suplementadas com sangue de cavalo a 5% e incubadas durante a noite a 37 °C, antes da avaliação. Foram sacrificados grupos de murganhos adicionais no dia 7 e foram amostrados como acima. 79

Resultados :

Cone de IgG (pg/mL) em soros de rato Números de bactérias (log 10 cfu/pulmões) em dias após a infecção 3 8 5 6,7 ± 0,7 (1/7) 7,21 ± 0,7 (5/8) 2 6,5 ± 0,7 (1/7) 6,9 ± 1,8 (4/7) 0,75 7,7 ± 0,5 (5/8) 4,8 ± 1,4 (2/8) 0 6,7 ± 1,5 (3/6) 6,3 ± 1,5 (3/9)

Os números entre parêntese são os números de animais que morreram antes do tempo de amostragem.

Conclusão: Em geral, não se verificou qualquer diferença significativa nos números de bactérias isoladas a partir de qualquer dos grupos de tratamento. Isto indica que não foi conferida qualquer protecção mensurável pelo anti-polissacárido em concentrações até e incluindo 5 pg/mL.

Isto é semelhante ao observado em alguns ensaios clínicos humanos, ou seja, o conjunto anti-polissacaridico é insuficiente para proteger contra a pneumonia pneumocócica em algumas populações. 80

Exemplo 5B - Determinar a protecção contra a pneumonia conferida pela administração activa de Ply (pneumolisina) com ou sem adjuvante e sinergia com anticorpo anti-PS sub-óptimo. Método

Animais: 128 murganhos CD-I do sexo masculino (6 semanas de idade na imunização, 10 semanas de idade na infecção) de Charles River, St. Constant, Quebec, Canadá. Os animais pesavam, aproximadamente, 20 g às 6 semanas e 38 g às 10 semanas.

Imunizações: Foram imunizados seis grupos de 16 murganhos, por injecção subcutânea, nos dias -22 e -14 com 100 pL da vacina como detalhado abaixo. (Um total de 128 murganhos). A PdB (documento WO 90/06951) foi obtida por cortesia do Dr. James Paton, Austrália. O 3D-MPL foi obtido de Ribi/Corixa.

No dia -1, foram imunizados grupos específicos (ver a Tabela abaixo) (i.p. 100 pL) , passivamente, com uma concentração de 4,26 pg/mL (4 mL de 5 pg/mL + 1,3 mL de 2 pg/mL) de anticorpo de murganho anti-polissacárido.

Grupo Volume de Inj ecção Activa Vacina administrada dias -22, -14 (Dosagem pg) Volume de Inj ecção Passiva IgG passiva (dia -1) 1-1 100 pL s.c. PdB/AlP04 (10/50) - Nenhum 1-2 100 pL s.c. PdB/MPL/AlP04 (10/5/50) Nenhum 1-3 100 pL s.c. PdB/AlP04 (10/50) 100 pL i.p. a-PS 1-4 100 pL s.c. PdB/MPL/AlP04 (10/5/50) 100 pL i.p. a-PS 1-5 100 pL s.c. MPL/A1P04 (5/50) 100 pL i.p. a-PS 1-6 100 pL s.c. MPL/A1P04 (5/50) Nenhum 81

Infecção: No dia 0, os murganhos foram anestesiados (3% isoflurano mais 1 L/min 02). Os inóculos bacterianos foram preparados por recolha do crescimento de S. pneumoniae N1387 (serotipo 6) a partir de placas de agar de tripticase de soja (TSA) suplementado com sangue de cavalo a 5% e suspendendo em 6 mL de PBS. Foi preparada uma diluição de dez vezes (1 mL mais 9 mL) em agar nutritivo fundido arrefecido (mantido a 41 °C) , imediatamente antes da infecção. Os murganhos foram infectados por instilação intra-bronquial via intubação intra-traqueal e receberam, aproximadamente, 6,0 log 10 cfu/murganho num volume de 50 pL. Este método foi descrito por Woodnut e Berry (Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43: 29 (1999)).

Amostras: Às 72 após a infecção, foram sacrificados 8 murganhos/grupo por sobredose de C02 e os pulmões foram excisados e homogeneizados em 1 mL PBS. Foram preparadas diluições dez vezes seriadas em PBS para contar os números de bactérias viáveis. As amostras foram inoculadas (20 pL) em triplicado em placas de TSA suplementadas com sangue de cavalo a 5% e foram incubadas durante a noite a 37 °C, antes da avaliação. Foram sacrificados grupos de murganhos adicionais, no dia 8 após a infecção e amostras como acima.

Análise de Dados A medida dos resultado para a comparação do tratamento consistiu no número de bactérias nos pulmões no dia 3 e 7 após a infecção. Os resultados são apresentados como médias do grupo com desvios padrão. A análise estatística foi realizada utilizando o teste t de Student, em que um valor de P <0,05 foi considerado significativo. 82

Resultados : 12 h após a infecção

As contagens bacterianas a partir do grupo 1-4 foram significativamente mais baixas (p <0,05) do que as do grupo 1-3. As contagens bacterianas a partir do grupo 1-4 foram significativamente mais baixas (p <0,05) do que as do grupo 1-5. 168 h após a infecção

Os números de bactérias em todos os grupos foi, aproximadamente, 2 logs mais baixos nos dias 8 do que nos dias 3, indicando que a infecção se estava a dissipar.

As contagens bacterianas do grupo 1-2 foram significativamente mais baixas (p <0,05) do que as do grupo 1-5.

Grupo Dia 3 Dia 8 Log CFU/pulmão Desvio Padrão Log CFU/pulmão Desvio Padrão 1-1 6, 93 0,61 5,23 1,28 1-2 5,95 1,25 4,08 1,34 1-3 7,09 0,8 5,32 1,26 1-4 6,09 1,43 4,46 2,32 1-5 7,19 0,89 5,42 1,05 1-6 6, 68 1,14 5,01 1,48 83

Como demonstrado acima, o anticorpo anti-polissacárido isolado (grupo 1-5) não confere protecção contra o crescimento de pneumococos no pulmão. A PdB adjuvada com A1P04 também não confere protecção, mas, no dia 8, verifica-se uma tendência para a protecção, quando a PdB é combinada com 3D-MPL (grupo 1-2).

No Dia 3, o grupo mais significativamente protegido, grupo 1-4, apresentou os três elementos, PdB, 3D-MPL e anticorpo anti-polissacárido administrado passivamente. Esta conclusão é apoiada pela taxa de mortalidade. 0 grupo 1-4 teve apenas 2/8 de mortes em comparação com 5/10 dos grupos 1-5 e 1-3.

Conclusão:

Uma vez que a experiência foi realizada com animais imunizados passivamente, o efeito sinérgico de também imunizar activamente com pneumolisina e MPL não pode ser devido a um aumento no nivel de anticorpos contra o antigénio polissacaridico.

Como os animais foram apenas imunizados passivamente contra o polissacárido pneumocócico, no dia 8, os niveis desse anticorpo deveriam ter-se, francamente, dissipado do hospedeiro.

Apesar disso, pode ser observada protecção significativa contra a pneumonia pneumocócica em grupos imunizados com pneumolisina mais 3D-MPL e, especialmente, em grupos imunizados com pneumolisina mais 3D-MPL mais o anticorpo anti-polissacárido administrado passivamente, indicando a sinergia desta combinação. 84

Se a imunização anti-polissacárido tivesse sido realizada activamente (de um modo preferido, com polissacárido conjugado), o efeito teria sido ainda mais marcado, uma vez que o efeito da memória de células B e os niveis constantes do anticorpo anti-PS teriam contribuído para a cooperação da resposta imunitária (ver, por exemplo, a Fig. 1C, em que muitos dos animais imunizados activamente com polissacárido e proteína revelaram não apresentar quaisquer bactérias nos pulmões após o desafio).

Exemplo 6 - Imunogenicidade da vacina de conjugado de polissacárido pneumocócico 11-valente - Proteína D adjuvada com 3DMPL em murganhos Balb/C com 1 ano de idade.

Introdução e objectivo(s): A protecção contra a infecção pneumocócica é mediada pelo anticorpo específico para um serotipo por opsonofagocitose. Pode ser presumido que os aumentos na concentração de anticorpo irão resultar numa maior protecção e, consequentemente, foi despendido muito esforço para encontrar formas de aumentar a resposta humoral. Uma estratégia que foi aplicada com sucesso a vacinas conjugadas em estudos pré-clínicos foi a utilização de adjuvantes imuno-estimulantes (revisto em Poolman et al. 1998, Carbohydrate-Based Bacterial Vaccines. em: Handbook of Experimental Pharmacology eds. P. Perlmann e H. Wigsell. Springer-Verlag, Heidelberg, D).

Os dados apresentados nesta secção mostram os resultados da última experiência utilizando lotes clínicos, num protocolo concebido para se assemelhar a um ensaio clínico. 85

Protocolo :

Os murganhos balb/c com um ano de idade foram imunizados com 1/10 da dose humana da vacina de conjugado de polissacárido pneumocócico - proteína D ou vacina simples de polissacárido 23-valente. As vacinas utilizadas foram os lotes clínicos DSP009, DSP013 ou DSP014, correspondentes, respectivamente, a uma dosagem de 1 mcg dos serotipos 6B e 23F e 5 mcg dos restantes serotipos da vacina conjugada 11-valente, dosagem de 0,1 mcg da vacina conjugada 11-valente ou a uma dosagem de 0,1 mcg da vacina conjugada 11-valente adjuvada com 5 mcg de 3D- MPL, . A totalidade das vacinas conjugadas 11-valentes foi também adjuvada com 50 pg de A1P04.

Foram imunizados grupos de 20 murganhos, intramuscularmente. As injecções dos grupos listados na tabela seguinte foram realizadas nos dias 0 e 21. As sangrias de teste foram obtidas no dia 35 (14 dias após a segunda dose). 86

Tabela: Programa de Imunização para murganhos Balb/c com 1 ano de idade, imunizados com lotes clinicos de vacina de conjugado de polissacárido pneumocócico - proteína D.

Grupo Vacina do Dia 0 Dose 1 Vacina do Dia 21 Dose 2 Número de murganhos 1 Pneumovax-23 2,5 mcg Tampão 20 2a 11-valente Pn-PD 0,1 mcg Tampão 20 2b 11-valente Pn-PD 0,1 mcg 11-valente Pn-PD 0,1 mcg 20 3a 11-valente Pn-PD + MPL 1 mcg + 5 mcg Tampão 20 3b 11-valente PNn-PD + MPL 0,1 mcg + 5 mcg 11-valente Pn-PD + MPL 0,1 mcg + 5 mcg 20 4a 11-valente Pn-PD 1/0,5 mcg Tampão 20 4b 11-valente Pn-PD 1/0,5 mcg 11-valente Pn-PD 1/0,5 mcg 20 Controlo Tampão Tampão 20

Os soros foram testados por ELISA para anticorpos IgG contra o polissacárido pneumocócico, seguindo o protocolo mútuo CDC/WHO, ou seja, após neutralização dos soros com polissacárido da parede celular. 0 ELISA foi calibrado para fornecer concentrações de anticorpo em mcg/mL, utilizando anticorpos monoclonais IgGl específicos para um serotipo.

As análises estatísticas das comparações foram calculadas utilizando UNISTAT versão 5.0 beta. O ANOVA pelo método de Tukey-HSD foi realizado sobre as concentrações da IgG transformadas por log. A comparação emparelhada das taxas de seroconversão foi realizada utilizando o teste exacto de Fisher. 87

Resultados : A GMC da IgG e o intervalo de confiança a 95% contra os 11 serotipos e a proteina D, induzida 14 dias após a segunda imunização (dose 2), são apresentados na tabela seguinte. São apresentadas as taxas de seroconversão quando não pôde ser calculado um intervalo de confiança a 95%. 0 grupo 1 apresenta o efeito da imunização com polissacáridos simples, os quais, normalmente, induzem apenas IgM em animais. A maioria dos niveis de IgG estão abaixo do limiar de detecção; contudo, os murganhos balb/c foram capazes de produzir IgG contra alguns polissacáridos pneumocócicos, nomeadamente, os serotipos 3, 19F e 14. A imunização com vacinas conjugadas induziu anticorpos IgG com taxas elevadas de seroconversão contra todos os serotipos excepto o 23F.

Foi observada uma resposta dependente da dosagem (grupo 4 vs grupo 2) apenas para os serotipos 7F e 19F, mas estas observações não foram estatisticamente significativas. Foi observada uma maior resposta após duas doses (grupos b vs grupos a) para os serotipos 3, 6B, 7F e 19F e PD e estas observações foram estatisticamente significativas em muitos casos, com todas as 3 formulações. 0 efeito do 3D-MPL é muito interessante. Duas doses da vacina formulada com 3D-MPL (grupo 3b) induziram as GMC mais elevadas para IgG especificas e isto foi estatisticamente significativo para todos os serotipos, excepto o 23F, em que, 88 nesse caso, este teve uma taxa de seroconversão significativamente mais elevada (p = 0,02 grupo 3b vs 2b, exacto de Fisher).

Tabela: Média Geométrica [IgG] e Intervalos de Confiança a 95% de Serotipos Pneumocócicos Seleccionados e Proteína D em Balb/c com 1 ano de idade, 14 dias após Imunização II com Vacina de Conjugado PS 11-valente-PD

Grupo 1 2a 2b 3a 3b 4a 4b Serotipo GM [IgG] gg/mL (95% Cl) GM [IgG] gg/mL (95% Cl) GM [IgG] gg/mL (95% Cl) GM [IgG] pg/mL (95% Cl) GM [IgG] pg/mL (95% Cl) GM [IgG] Ug/mL (95% Cl) GM [IgG] μg/mL (95% Cl) 3 0,24 (0,16-0,06) 0, 18 (0,11-0,27) 0,84 (0,47-1,5) 0,72 (0,51-1,0) 4,84 (3,0-7, 9) 0,22 (0,14-0,35) 0, 95 (0,19-1,8) 6B 0,02 0/20* 0,04 8/19 0,19 (0,09-0,41) 0,14 (0,07-0,27) 0,74 (0,29-1, 9) 0,09 (0,05-0,16) 0,11 (0,05-0,23) 7F 0,04 0/20* 0,07 (0,04-0,12) 0,19 (0,10-0,39) 0,15 (0,10-0,22) 0, 97 (0,49-2,0) 0,09 (0,06-0,14) 0,45 (0,20-1,02) 14 0,15 3/20* 4,5 (2,5-8,1) 6, 2 (3, 6-10,5) 12, 9 (7,8-21,2) 13, 6 (9, 4-19,7) 4,0 (2,0-8,0) 6, 9 (4, 6-10, 6) 19F 1,2 (0,5 6-2,6) 6, 7 (3, 6-12,5) 12,1 (7, 6-19,3) 10,1 (5,5-18,5) 58,5 (42-81) 5, 9 (3,5-9,5) 22,0 (16,0-30,2) 23F 0,07 2/10* 0,08 3/20* 0,08 2/19* 0,07 1/20* 0,17 9/20* 0,06 1/18* 0,10 4/20* PD* 0,25 1/20* 5,2 (3,3-8,3) 11, 9 (6, 9-20,7) 13,5 (9, 5-19,0) 98,0 (49, 1-195, ) 10, 9 (6, 4-18,4) 38,7 (21,3-70,3) *Em UE/mL; #Taxa de seroconversão, definida como 2 desvios padrão acima da média do controlo negativo. Por favor, remeter para a tabela anterior para as definições dos grupos.

Conclusão:

Os 3D-MPL dados aqui apresentados à vacina de conjugado demonstram que a adição de polissacaridico pneumocócico 89 11-valente Proteína D, aumentou a resposta imunitária em murganhos balb/c idosos, para todos os serotipos testados.

Na maioria dos casos, duas doses de vacina induziram médias geométricas de concentrações de IgG mais elevadas que uma dose. Uma vez que isto não é observado utilizando vacina de polissacárido simples, mesmo em humanos, isto é considerado uma indicação de uma resposta imunitária dependente de célula T e da indução de memória imunitária.

Estes dados suportam um esquema de administração de vacina utilizando polissacáridos pneumocócicos conjugados, adjuvadas com adjuvantes Thl (de um modo preferido, 3D-MPL), pelo qual são administradas, pelo menos, duas doses de vacina adjuvada, de um modo preferido, separadas por 1-12 semanas e, de um modo muito preferido, separadas por 3 semanas. Esse esquema de administração é considerado um aspecto adicional da invenção.

Os murganhos utilizados na experiência foram não-respondentes ao PS 23 (simples ou conjugado). Curiosamente, apesar dos níveis de anticorpo contra o polissacárido terem permanecido baixos, independentemente da composição de vacina utilizada, muito mais murganhos responderam a PS 23 quando foi utilizado 3D-MPL como adjuvante (sendo a seroconversão significativamente mais elevada). Uma utilização de adjuvantes Thl, particularmente 3D-MPL, nas composições de vacina compreendendo polissacáridos pneumocócicos conjugados, de forma a atenuar a ausência de resposta a um polissacárido pneumocócico num vacinado, constitui um aspecto ainda adicional da invenção. Constitui ainda outro aspecto, um método para atenuar ausência de resposta com a composição acima referida, utilizando o esquema de administração de duas doses descrito acima. 90

Exemplo 7 - Conjugado de polissacárido C de Neisseria

Meningitidis - Proteína D (PSC-PD)

A: EXPRESSÃO DA PROTEÍNA D

Como no Exemplo 1.

B: PRODUÇÃO DO POLISSACÁRIDO C A fonte de polissacárido do grupo C é a estirpe Cll de N. meningitidis. Esta é fermentada utilizando técnicas de fermentação clássicas (documento EP 72513). Os polissacáridos em pó seco utilizados no processo de conjugação são idênticos a Mencevax (SB Biologicals s.a.). É descongelada uma aliguota da estirpe Cll e são inoculados 0,1 mL da suspensão por riscamento de uma placa de petri com meio de Mueller Hinton suplementado com dialisado de extracto de levedura (10%, v/v) e são incubadas 23 a 25 horas a 36 °C numa incubadora de ar saturada com a água. O crescimento superficial é então ressuspenso em meio de fermentação esterilizado e inoculado com esta suspensão numa garrafa de Roux contendo meio de Mueller Hinton suplementado com dialisado de extracto de levedura (10%, v/v) e esferas de vidro estéreis. Após a incubação da garrafa de Roux durante 23 a 25 horas a 36 °C numa incubadora de ar saturada com água, o crescimento superficial é ressuspenso em 10 mL de meio de fermentação estéril e 0,2 a 0,3 mL desta suspensão são 91 inoculados em outras 12 garrafas de Roux com meio de Mueller Hinton.

Após incubação durante 23 a 25 horas a 36 °C numa incubadora de ar saturada com água, o crescimento superficial é ressuspenso em 10 mL de meio de fermentação estéril. A suspensão bacteriana é combinada num frasco cónico.

Esta suspensão é, então, transferida assepticamente para o fermentador, utilizando seringas estéreis. A fermentação do meningococo é realizada em fermentadores contidos numa sala branca sob pressão negativa. A fermentação é, geralmente, concluída após 10-12 horas correspondendo a, aproximadamente, a IO10 bactérias/mL (i. e. o inicio da fase estacionária) e é detectada pelo aumento do pH.

Nesta etapa, a totalidade do meio é inactivada por calor (12 minutos a 56 °C) antes da centrifugação. Antes e após a inactivação, é recolhida uma amostra do meio que é inoculada por riscamento em placas de petri com meio de Mueller Hinton.

C: PURIFICAÇÃO DO PS O processo de purificação é um processo de vários passos realizado sobre a totalidade do meio de fermentação. Na primeira etapa de purificação, a cultura inactivada é clarificada por centrifugação e o sobrenadante é recuperado. A purificação dos polissacáridos é baseada na precipitação com um sal de amónio quaternário (Brometo de Cetiltrimetilamónio 92 /CTAB, CETAVLON R). O CTAB forma complexos insolúveis com polianiões, tais como, polissacáridos, ácidos nucleicos e proteínas, dependendo do seu pi. Seguindo condições iónicas controladas, este método pode ser utilizado para precipitar as impurezas (conductividade baixa) ou polissacáridos (conductividade elevada).

Os polissacáridos incluídos no sobrenadante clarificado são precipitados utilizando uma terra de diatomácias (CELITER 545) como matriz, para evitar a formação de massa inerte insolúvel durante as diferentes precipitações/purificações.

Esquema de purificação para o polissacárido C de N. meningitidis.

Passo 1: fixação do complexo PSC-CTAB em CELITER 545 e remoção dos detritos celulares, ácidos nucleicos e proteínas por lavagem com CTAB a 0,05%.

Passo 2: Eluição do PS com EtOH 50%. As primeiras fracções, as quais são túrbidas e contêm impurezas e LPS, são descartadas. A presença de PS nas fracções seguintes é verificada pelo teste da floculação.

Passo 3: Re-fixação do complexo PS-CTAB em CELITE R 545 e remoção dos ácidos nucleicos e proteínas mais pequenos por lavagem com CTAB a 0,05%.

Passo 4: Eluição do PS com EtOH 50%. As primeiras fracções túrbidas são descartadas. A presença de PS nas fracções seguintes é verificada pelo teste da floculação. 93 0 eluído é filtrado e o filtrado contendo polissacárido bruto é recolhido. 0 polissacárido é precipitado do filtrado adicionando etanol para uma concentração final de 80%. O polissacárido é, então, recuperado sob a forma de um pó branco, secado sob vácuo e armazenado a -20 °C.

D: CONJUGAÇÃO COM CDAP

Conjugação de PSC e PD

Para a conjugação de PSC e PD, foi preferida a tecnologia de conjugação com CDAP, à activação clássica do CNBr e ligação, através de adaptador, à proteína veículo. O polissacárido é inicialmente activado por cianilação com tetrafluoroborato de l-ciano-4-dimetilamino-piridina (CDAP) . O CDAP é um reagente de cianilação solúvel em água, no qual a electrofilicidade do grupo ciano é aumentada acima da do CNBr, permitindo a realização da reacção de cianilação sob condições relativamente suaves. Após a activação, o polissacárido pode ser ligado directamente à proteína veículo através dos seus grupos amino sem introduzir qualquer molécula espaçadora. Os grupos éstercianato que não reagiram são atenuados através de uma reacção extensa com glicina. O número total de passos envolvidos na preparação de vacinas conjugadas é reduzido e, mais importante, não estão presentes moléculas adaptadoras potencialmente imunogénicas no produto final. A activação de polissacáridos com CDAP introduz um grupo cianato no polissacárido e é libertada dimetilaminopiridina (DMAP). O grupo cianato reage com grupos NH2 na proteína, 94 durante o processo de ligação subsequente e é convertido num carbamato.

Activação do PSC e ligação PSC-PD A activação e a ligação são realizadas a +25 °C. São dissolvidos 120 mg de PS durante, pelo menos, 4 h em WFI . A solução de CDAP (100 mg/mL recentemente preparada em acetonitrilo) é adicionada para atingir uma proporção de CDAP/PS (p/p) de 0,75.

Após 1 min 30, o pH é aumentado até ao pH de activação (pH 10) pela adição de trietilamina e é estabilizado até a adição da PD.

No tempo 3 min 30, é adicionado NaCl para uma concentração final de 2 M.

No tempo 4 min, a PD purificada é adicionada para atingir uma proporção PD/PS de 1,5/1; o pH é imediatamente ajustado para pH de ligação (pH 10) . A solução é deixada 1 h sob regulação do pH.

Atenuação

São adicionados 6 mL de uma solução de glicina 2 M à mistura PS/PD/CDAP. O pH é ajustado para o pH de atenuação (pH 95 8,8). A solução é agitada durante 30 min à temperatura de trabalho e, seguidamente, durante a noite a +2-8 °C com agitação lenta continua.

Purificação de PS-PD

Após filtração (5 pm) , o conjugado PS-PD é purificado numa câmara fria por cromatografia de permeação em gel num gel S400HR Sephacryl, para remover moléculas pequenas (incluindo DMAP) e PD não conjugada: Eluição-NaCl 150 mM pH 6,5; Monitorização - UV 280 nm, pH e conductividade.

Com base no diferente tamanho molecular dos componentes da reacção, os conjugados PS-PD são eluidos inicialmente seguidos pela PD livre e, finalmente, DMAP. São combinadas as fracções contendo conjugado como detectado por DMAB (PS) e pBCA (proteína). As fracções combinadas são esterilizadas por filtração (0,2 pm)

E: FORMULAÇÃO DE VACINA CONJUGADA DE PSC-PD ADSORVIDA

Lavagem de A1P04

Para optimizar a adsorção do conjugado PSC-PD em AIPO4, o AIPO4 é lavado para reduzir a concentração de PO43": - Ο A1P04 é lavado com NaCl 150 mM e centrifugado (4x); O sedimento é, então, ressuspenso em NaCl 150 mM e, seguidamente, filtrado (100 pm); e 96 - o filtrado é esterilizado por calor.

Este AIPO4 lavado é designado como WAP (fosfato autoclavado lavado).

Processo de formulação O conjunto do conjugado PSC-PD é adsorvido em A1P04 WAP antes da formulação final do produto terminado. 0 A1P04 WAP foi agitado com PSC-PD durante 5 minutos à temperatura ambiente. 0 pH foi ajustado para 5,1 e a mistura foi agitada durante mais 18 horas à temperatura ambiente. Foi adicionada uma solução de NaCl para 150 mM e a mistura foi agitada durante 5 minutos à temperatura ambiente. Foi adicionado 2-fenoxietanol 5 mg/mL, a mistura foi agitada durante 15 minutos à temperatura ambiente e, seguidamente, ajustada para pH 6,1.

Composição final/dose

- PSC-PD: 10 pg PS - A1P04 WAP: 0,25 mg Al3+

- NaCl: 150 mM - 2-fenoxietanol: 2,5 mg

- Água para Injecção: para 0,5 mL - pH: 6,1 97

F: INFORMAÇÃO PRÉ-CLÍNICA

Imunogenicidade do conjugado de polissacáridos em murganhos A imunogenicidade do conjugado PSC-PD foi avaliada em murganhos Balb/C com 6 a 8 semanas de idade. 0 conjugado simples (não adsorvido) ou o conjugado adsorvido em A1P04 foi injectado como uma vacina monovalente. Os anticorpos Anti-PSC induzidos foram medidos por ELISA, enquanto que os anticorpos funcionais foram analisados utilizando o teste bactericida, sendo ambos os métodos baseados no protocolos do CDC (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, EUA). Dão apresentados os resultados das duas diferentes experiências, realizadas para avaliar a resposta em relação à dose e efeito do adjuvante (A1P04).

Experiência da gama da dose

Nesta experiência, a PSC-PD foi injectada duas vezes (separada por duas semanas) em murganhos Balb/C. Foram utilizadas quatro doses diferentes dos conjugados formulados com A1P04: 0,1; 0,5; 2,5; e 9,6 pg/animal. Os murganhos (10/grupo) foram sangrados nos dias 14 (14 Após I), 28 (14 Após II) e 42 (28

Após II). As concentrações médias geométricas (GMCs) dos anticorpos específicos para o polissacárido C medidas por ELISA, foram expressas em pg IgG/mL, utilizando IgG purificada como referência. Os anticorpos bactericidas foram medidos em soros combinados e os títulos foram expressos como o recíproco da diluição capaz de matar 50% das bactérias, utilizando a estirpe Cll de N. Meningitidis em presença de complemento de coelho bebé. 98 A resposta de dose obtida apresenta uma fase estacionária, a partir da dose de 2,5 pg. Os resultados indicam que existe uma boa resposta de reforço entre 14 Após I e 14 Após II. Os niveis de anticorpo em 28 Após II são, pelo menos, equivalentes aos de 14 Após II. Os títulos de anticorpo bactericida são concordantes com as concentrações de ELISA e confirmam a imunogenicidade do conjugado PSC-PD.

Efeito do adjuvante

Nesta experiência, foi avaliado um lote de conjugado PSC-PD formulado com A1P04, o conjugado simples (não-adjuvado) foi injectado para comparação. Foram injectados 10 murganhos/grupo, duas vezes, separadas por duas semanas, por via subcutânea, com 2 pg de conjugado. Os murganhos foram sangrados nos dias 14 (14

Após I), 28 (14 Após II) e 42 (28 Após II) e os títulos de ELISA e de anticorpos funcionais foram medidos (apenas em 14 Após II e 28 Após II para os testes bactericidas) . A formulação com A1P04 induz títulos de anticorpo até 10 vezes mais elevados, em comparação com as formulações não-adjuvadas.

Conclusões

Podem ser realizadas as seguintes conclusões gerais, a partir dos resultados das experiências descritas acima: - O conjugado PSC-PD induz uma resposta anamnéstica, demonstrando que o PSC, quando conjugado, se torna um antigénio dependente de células T. 99 - As concentrações de anticorpo anti-PSC, medidas por ELISA, correlacionam-se bem com os títulos de anticorpo bactericida, mostrando que os anticorpos induzidos pelo conjugado PSC-PD são funcionais contra o serogrupo C de N. meningitidis. - Aproximadamente 2,5 pg do conjugado adsorvido em A1P04 parece promover uma resposta óptima de anticorpo em murganhos. - A química CDAP parece ser um método adequado para preparar conjugados PSC-PD imunogénicos.

Exemplo 8 - Preparação de um Conjugado de Polissacárido do Serogrupo A de N. meningitidis - PD É dissolvido um pó seco de polissacárido A (PSA), durante uma hora numa solução de NaCl 0,2 M para uma concentração final de 8 mg/mL. O pH é, então, fixado num valor de 6, quer com HC1, quer com NaOH e a solução é regulada termicamente a 25 °C. São adicionados 0,75 mg CDAP/mg PSA (uma preparação de 100 mg/mL acetonitrilo) à solução PSA. Após 1,5 minutos sem regulação de pH, é adicionado NaOH 0,2 M para obter um pH de 10. Após 2,5 minutos, é adicionada a proteína D (concentrada para 5 mg/mL) de acordo com uma proporção PD/PSA de, aproximadamente, 1. É mantido um pH de 10 durante o período de 1 hora da reacção de ligação. Seguidamente, são adicionados 10 mg de glicina (2 M pH 9,0)/mg de PSA e o pH é regulado para um valor de 9,0 durante 30 minutos a 25 °C. A mistura é, então, conservada durante a noite a 4 °C antes da purificação por cromatografia de exclusão em coluna (Sephacryl S400HR de Pharmacia). O conjugado elui primeiro, seguido da PD que não reagiu e dos subprodutos (DMAP, 100 glicina, sais). 0 conjugado é combinado e esterilizado por de filtração a 0,2 μιη numa membrana Sartopore de Sartorius.

Exemplo 9 - Caracterizações in vitro dos produtos dos

Exemplos 7 e 8

As caracteristicas principais são aqui resumidas na tabela abaixo: r Descrição do conjugado Conteúdo em Proteína e PS (pg/mL) Proporção PS/proteína (p/p) Proteína Livre (%) PS Livre(%) 1 PS C - PD NaOH para regulação do pH PD: 210 PS: 308 1/0,68 <2 1 00 2 PS C - PD TEA para regulação do pH PD: 230 PS: 351 1/0,65 <2 5-6 3 PS C - PD NaOH para regulação do pH PD: 159 PS: 149 1/1,07 5 5-9

Resultados in vivo

Foram utilizados murganhos Balb/C como modelo animal para testar a imunogenicidade dos conjugados. Os conjugados foram adsorvidos em A1P04 ou em Al(OH)3 (10 pg de PS em 500 pg de A1J+) ou não adsorvidos. Os murganhos foram injectados como se segue: 2 injecções em intervalos de duas semana (2 pg PS/injecção). A partir destes resultados, pode ser concluído, primeiro, que o PS livre influencia significativamente a resposta imunitária. Os melhores resultados foram obtidos com conjugados tendo menos de 10% de PS livre. As melhorias acima do processo de CDAP são, deste modo, um aspecto adicional da invenção. 101 A formulação é também importante. 0 A1P04 parece ser o adjuvante mais apropriado neste modelo. 0 conjugado induz um efeito de reforço, o qual não é observado quando é apenas injectado polissacárido.

Conclusões

Os conjugados de N. meningitidis A e C foram obtidos com uma proporção final de PS/proteína, respectivamente, de 1 e 0,6-0,7 (p/p). O PS livre e a proteina veiculo livre situaram- se, respectivamente, abaixo de 10% e 15%. A recuperação dos polissacáridos é superior a 70%. Os conjugados de PSA e PSC obteníveis pelo processo CDAP melhorado (optimizado), acima, (independentemente da proteina veiculo, mas, de um modo preferido, proteina D) é, deste modo, um aspecto adicional da invenção.

Exemplo 10 - Preparação de um Conjugado de polissacárido de

H. influenzae B - PD O H. influenzae b é uma das principais causas de meningite em crianças com menos de 2 anos. O polissacárido capsular de H. influenzae (PRP) como um conjugado com o toxóide do tétano é bem conhecido (conjugado com a quimica desenvolvida por J. Robbins). O CDAP constitui uma quimica melhorada. O seguinte descreve as condições óptimas de CDAP, determinadas para conjugar PRP, de um modo preferido, com PD. 102

Os parâmetros que influenciam a reacção de conjugação são os seguintes: • A concentração inicial do polissacárido (a qual pode ter um impacto duplo sobre os niveis finais de polissacáridos livres e sobre o passo de esterilização por filtração). • A concentração inicial da proteina veiculo. • A proporção inicial entre o polissacárido e a proteina (a qual pode ter também um impacto duplo sobre os niveis finais de polissacáridos livres e sobre o passo de esterilização por filtração. • A quantidade de CDAP utilizado (normalmente em grande excesso). • A temperatura de reacção (a qual pode influenciar a quebra do polissacárido, a cinética da reacção e a quebra dos grupos reactivos). • 0 pH de activação e ligação. • 0 pH de atenuação (influencia o nivel de DMAP residual). • 0 tempo de activação, ligação e atenuação. 0 presente requerente verificou que os 3 parâmetros mais críticos para optimizar a qualidade do produto final são: a proporção inicial polissacárido/proteína; a concentração inicial do polissacárido; e o pH de ligação. 103

Deste modo, foi concebido um cubo de reacção com as 3 condições acima como os três eixos. Os pontos centrais (a gama de valores experimentada) para estes eixos foram: proporção PS/proteina - 1/1 (± 0,3/1); [PS] =5 mg/mL (± 2 mg/mL); e pH de ligação =8,0 (±1,0 unidades de pH).

Os parâmetros menos essenciais foram fixados no seguinte: foram utilizados 30 mg do polissacárido; temperatura a 25 °C; [CDAP] = 0,75 mg/mg de PS; pH titulado com NaOH 0,2M; pH de activação = 9,5; temperatura para activação = 1,5 minutos; temperatura de ligação - 1 hora; [proteína] = 10 mg/mL; atenuação pH = 9,0; temperatura de atenuação = 1 hora; temperatura de dissolução do PS no solvente = 1 hora em NaCl 2 M; purificação em Sephacryl S-400HR eluída com NaCl 150 mM a 12 cm/hora; e esterilização por filtração com um SARTOLAB P20 a 5 mL/minuto.

Os dados que se verificou estabelecerem condições optimizadas na preparação de produtos dentro do acima referido cubo de reacção foram: dados do processo - rendimento máximo após filtração, o nivel máximo da proteína incorporada; e dados da qualidade do produto - proporção final PS/proteína, nível de PS livre, nível de proteína livre, níveis mínimos de DMAP residual (um produto de quebra de CDAP).

Produto da filtração O factor que afecta a produção após filtração é a interacção entre a [PS] inicial e o pH de ligação e proporção inicial de PS/proteína. A uma baixa [PS] verifica-se pouca 104 interacção com os últimos 2 factores e resulta sempre uma boa filtrabilidade (aproximadamente 95% da totalidade dos produtos). No entanto, em concentrações elevadas a filtrabilidade diminui se o PH e a proporção inicial aumentam ([PS] elevada, proporção mais baixa, pH mais baixo = filtração de 99%; mas [PS] elevada, proporção e pH mais elevados = filtração de 19%). Nível de incorporação da proteína A proporção da proporção final PS/proteina no que respeita à proporção inicial é uma medida da eficiência da ligação. A uma [PS] elevada, o pH não afecta a proporção das proporções. No entanto, a proporção inicial fá-lo (1,75 na proporção inicial baixa, 1,26 nas proporções iniciais elevadas). Em baixas [PS], a proporção das proporções é, na sua maioria, mais baixa, no entanto o pH apresenta, então, um efeito mais significativo (pH baixo, proporção baixa = 0,96; pH baixo, proporção elevada = 0,8; pH elevado, proporção baixa = 1,4; e pH elevado, proporção elevada = 0,92).

Proporção final de PS/proteina A proporção final depende da proporção inicial e da [PS]. As maiores proporções finais são obtidas com uma combinação de proporções iniciais elevadas e de [PS] elevadas. O efeito do pH na proporção final não é tão significativo como uma baixa [PS]. 105 Nível de proteína D livre

As menores quantidades de proteína D livre são observadas a pH elevado e [PS] elevadas (níveis que se aproximam de 0,0). O efeito da [PS] elevada é especialmente significativo quando o pH é baixo. O aumento da proporção inicial contribui um pouco para o aumento da proteína D livre. DMAP residual A proporção inicial não tem um efeito significativo. Pelo contrário, o nível de DMAP aumenta com a [PS] e diminui quando o pH é aumentado.

Conclusões

As condições de conjugação muito preferidas são, deste modo, as seguinte: pH de ligação = 9,0; [PS] = 3 mg/mL; e proporção inicial = 1/1. Com essas condições, as características do produto final são como se segue:

Proporção final PS obtido da Proporção das Proteína D livre (%) Níveis de DMAP PS/proteina filtração (%) proporções (ng/10 pg PS) valor gama valor gama valor gama valor gama valor gama 1, 10 0,91-1,30 92, 6 50-138 1,16 1,03-1,29 0,71 0-10,40 4, 95 2,60-7,80

Os conjugados de PRP obteníveis pelo processo CDAP melhorado (optimizado), acima, (independentemente da proteína veículo, mas, de um modo preferido, proteína D) são, deste modo, um aspecto adicional da invenção. 106 como a sua

Exemplo 11: Proteína D como um antigénio -

eficácia protectora contra H. influenzae não-tipável pode ser melhorada por formulação com 3D-MPL

Foram imunizados murganhos Balb/c do sexo feminino (10 por grupo) (intramuscularmente) com vacina de conjugado polissacaridico pneumocócico undecavalente-proteína D, numa primeira vez, às 20 semanas de idade (DO), e receberam uma segunda imunização após duas semanas (D14). Foi recolhido sangue, 7 dias após a segunda imunização. Os títulos de anticorpo contra a proteína D foram medidos em termos de quantidade de anticorpos do tipo IgGl, IgG2a e IgG2b.

As vacinas undecavalentes liofilizadas (sem A1P04) foram preparadas combinando os conjugados com lactose a 15,75%, misturando durante 15 minutos à temperatura ambiente, ajustando o pH para 6,1 ± 0,1 e liofilizando (iniciando, normalmente, o

ciclo a -69 °C, ajustando, gradualmente, para -24 °C ao longo de 3 horas, seguidamente, conservando esta temperatura durante 18 horas, seguidamente, ajustando, gradualmente, a -16 °C ao longo de 1 hora, seguidamente, conservando esta temperatura durante 6 horas, seguidamente, ajustando, gradualmente, a +34 °C ao longo de 3 horas e, finalmente, conservando esta temperatura ao longo de 9 horas). A composição das formulações e reconstituintes dos liofilisados é apresentada na Tabela 13. A medição mais característica em termos de ter ocorrido uma resposta imunitária mediada por células do tipo Thl é conhecida como estando correlacionada com o nível de anticorpo IgG2a. Como 107 pode ser verificado pelos dados, resulta um aumento surpreendentemente grande de IgG2a, se a proteina D tiver sido liofilizada com um adjuvante Thl (neste caso, 3D-MPL). 108

Tabela 13: Composição de formulações (por dose humana) e títulos de anticorpo contra a proteína D em murganhos (com 1/10 dose)

I_. d_ s ]o o> a. , 29 cie Jane ã jc o cie 2 Ο Ο V

Estado PS AIPO, Imuno- Agente Conservante Reconstituinte IgGl IgG2a IgG2b Ig61 IgG2a IgG2b físico (/500 pl) (/500 pL) estimulante aglutinante g/mL g 0 líquido 1 pg 500 μg não não 2-PEJ não 76 0,425 0,24 99,1 0,554 0,313 liquido 5 pg 500 μg não não 2-PE não 66 0,284 0,176 99,3 0,427 0,265 líquido 1 pg 0 pg não não 2-PE não 6,6 0,207 0,036 96,4 3,02 0,526 líquido 5 pg 0 pg não não 2-PE não 5,2 0,169 0,043 96,1 3,12 0,795 Liofil- ízado 1 pg 0 pg não Lactose 3,15¾ não NaCl 150 mH1 5,2 0,147 0,046 96,4 2,73 0,853 Liofil- ízado 5 pg 0 pg não Lactose 3,15¾ não HaCl 150 mM' 11,1 0,11 0,168 97,6 0,967 1,477 Líofil- izado 1 pg 0 pg não Lactose 3,15¾ não AIPO, 500 pg' 45 1,86 0,075 95,9 3,96 0,160 Liofil- izado 5 pg 0 pg não Lactose 3,15¾ não AIPO,500 pg‘ 19 0,077 0,119 99,0 0,401 0,620 Liofil- izado 1 pg 0 pg não Lactose 3,15¾ não MPL 50 pg1 45 2,6 3,5 88,1 5,09 6,849 Liofil- ízado 5 pg 0 pg não Lactose 3,15¾ não MPL 50 pg1 135 25 5,1 81,8 15,1 3,089 Liofil- ízado 1 pg 0 pg MPL (50 pg) Lactose 3,15¾ não Tampão1 43 22 5,7 60,8 31,1 8,062 líquido 1 pg 500 μg MPL (50 pg) não 2-PE não 441 7,1 3,1 96,5 1,55 1,990 líquido 5 pg 500 μg MPL (50 pg) não 2-PE não 299 1,4 0,899 99,2 0,465 0,298 ‘antes de injecçâo; +/-2 horas antes da injecção; 32-fenoxíetanol

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composição imunogénica compreendendo, pelo menos, um antigénio polissacarídico de Streptococcus pneumoniae misturado com, pelo menos, um antigénio proteico de Streptococcus pneumoniae ou seu equivalente imunologicamente funcional e um adjuvante, o qual é um indutor preferido de um adjuvante de uma resposta TH1 e compreende, pelo menos, um dos seguintes: Monofosforil lipido A ou um seu derivado, imuno-estimulante de saponina ou oligonucleótido CpG imuno-estimulante.
2. Composição imunogénica da reivindicação 1, em que o antigénio proteico é uma proteína da superfície externa ou uma proteína segregada de Streptococcus pneumoniae ou os seus equivalentes imunologicamente funcionais.
3. Composição imunogénica das reivindicações 1 ou 2, em que o antigénio proteico é uma toxina, adesina ou lipoproteina de Streptococcus pneumoniae ou os seus equivalentes imunologicamente funcionais.
4. Composição imunogénica das reivindicações 1-3, em que o antigénio proteico ou o seu equivalente imunologicamente functional é seleccionado do grupo: pneumolisina, PspA ou suas variantes de eliminação transmembranares, PspC ou suas variantes de eliminação transmembranares, PsaA ou suas variantes de eliminação transmembranares, desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato e CbpA ou suas variantes de eliminação transmembranares. 1
5. Composição imunogénica das reivindicações 1-4, em que o antigénio polissacarídico é apresentado sob a forma de um conjugado polissacárido-veiculo proteico.
6. Composição imunogénica da reivindicação 5, em que a veiculo proteico é seleccionada do grupo consistindo em: toxóide da Difteria, toxóide do Tétano, CRM197, hemocianina de Lapa da Califórnia (KLH), derivado de proteína da Tuberculina (PPD) e proteína D de H. influenzae.
7 . Composição imunogénica como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 6, em que a vacina compreende, pelo menos, quatro antigénios polissacarídicos pneumocócicos de serotipos diferentes.
8. Composição imunogénica como reivindicado em qualquer das reivindicações 1-7, em que o adjuvante compreende um veículo adjuvante seleccionado do grupo compreendendo: emulsão de óleo em água, lipossomas e sal de alumínio.
9. Composição imunogénica como reivindicada em qualquer das reivindicações 1-8 para utilização como um medicamento.
10. Vacina compreendendo a composição imunogénica das reivindicações 1-8.
11. Utilização de um antigénio polissacarídico pneumocócico misturado com um antigénio proteico de Streptococcus pneumoniae e um adjuvante indutor de TH1, o qual compreende, pelo menos, um dos seguintes: Monofosforil lípido A ou um seu derivado, imuno-estimulante de saponina ou oligonucleótido CpGI imuno-estimulante, na produção de 2 um medicamento para a prevenção de pneumonia em doentes com mais de 55 anos.
12. Utilização de um antigénio polissacaridico pneumocócico misturado com um antigénio proteico de Streptococcus pneumoniae e um adj uvante indutor de TH1, o qual compreende, pelo menos, um dos seguintes: Monofosforil lip ido A ou um seu derivado, imuno-estimulante de saponina ou oligonucleótido CpGI imuno-estimulante, na produção de um medicamento para a prevenção ou melhoria da Otite média em Bebés.
13. Método de preparação da composição imunogénica das reivindicações 1-9, compreendendo os passos de: seleccionar um ou mais antigénio(s) polissacaridico(s) pneumocócico(s); seleccionar um ou mais antigénio(s) proteico(s) pneumocócico(s); seleccionar um adjuvante indutor de TH1, o qual compreende, pelo menos, um dos seguintes: Monofosforil lípido A ou um seu derivado, imuno-estimulante de saponina ou oligonucleótido CpGI imuno-estimulante; e misturar os referidos antigénios polissacaridicos e proteicos e adjuvante com um excipiente adequado.
14. Composição imunogénica como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1-9, a vacina da reivindicação 10, a utilização das reivindicações 11 ou 12 ou o método da 3 reivindicação 13, em que o adjuvante indutor de TH1 compreende 3D-MPL. Lisboa, 29 de Janeiro de 2007 4