CN102834410B - 改性的h因子结合蛋白（fhbp）及其使用方法 - Google Patents

改性的h因子结合蛋白（fhbp）及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供了H因子结合蛋白及其使用方法，所述蛋白能够引发针对至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株具有杀菌性的抗体。

Description

改性的H因子结合蛋白(FHBP)及其使用方法
交叉引用
本申请要求申请号为61/319,181，申请日为2010年3月30日、申请号为61/334,542，申请日为2010年5月13日、申请号为61/381,025，申请日为2010年9月8日、申请号为61/423,757，申请日为2010年12月16日、以及申请号为61/440,227，申请日为2011年2月7日的美国临时专利申请的优先权，各申请的全部内容通过引用并入本申请。
关于联邦政府资助研究的声明
本发明在美国国家过敏与感染性疾病研究所和国立卫生研究院基金的资助下完成，基金号R01AI046464、R01AI 082263、和AI 070955。政府对本发明享有一定权利。
前言
脑膜炎奈瑟球菌是一种革兰氏阴性细菌，寄居在人上呼吸道，最值得注意的是，它导致脑膜炎和败血症在世界范围内的零星和周期性流行爆发。两岁以下儿童的发病率和死亡率最高。与其他革兰氏阴性细菌相似，脑膜炎奈瑟球菌通常具有细胞质膜、肽聚糖层、外膜和菌毛，外膜与荚膜多糖一起构成细菌细胞壁，菌毛突出在外环境中。有荚膜的脑膜炎奈瑟球菌菌株是青少年中导致细菌性脑膜炎和败血症的主要原因。侵袭性脑膜炎奈瑟球菌感染的流行和经济上的重要性促使人们研究有效的疫苗，使之能对各种菌株，特别是具有不同血清型或血清亚型的遗传多样性B群菌株产生免疫力。
H因子结合蛋白(fHbp，在本领域也称为脂蛋白2086(Fletcher et al(2004)InfectImmun72:2088-2100))、基因组衍生的奈瑟菌属抗原(GNA)1870(Masignani et al.(2003)J Exp Med197:789-99)或“741”)是一种脑膜炎奈瑟球菌蛋白，其在细菌中以表面暴露的脂蛋白形式表达。fHbp的一个重要功能是与人补体因子H(fH)结合，其能够下调补体的活性。fH与细菌表面的结合是病原体在未经免疫的人血清或血液中存活并逃避先天性宿主防御的重要机制。最近，发现人H因子基因簇的遗传变异影响对发生脑膜炎球菌疾病的易感性(Davila S et al.(2010)Nat Genetics doi:10.1038/ng.640)。fH与人fH的fHbp的特异性结合能够解释为何脑膜炎奈瑟球菌仅严格地作为人的病原体。
仍需要一种能够引发有效的杀菌抗体应答的fHbp多肽。
发明概述
本申请提供了H因子结合蛋白及其使用方法，所述蛋白能够引发针对至少一种脑膜炎奈瑟球菌种菌株具有杀菌性的抗体。
附图简述
图1：列A，以脑膜炎球菌fHbp作为各孔中的抗原，通过ELISA检测得到的人fH浓度的标准曲线。详细情况参见实施例1。列B，人fH转基因(Tg)小鼠血清中的人fH浓度，其中包括人fH-Tg阴性同窝小鼠或已知的野生型BALB/c小鼠，以及人血清中的人fH浓度。参见实施例1。
图2：经C群脑膜炎球菌偶联对照疫苗免疫后，人fH转基因(fH Tg)BALB/c小鼠和野生型(WT)BALB/c小鼠的血清IgG抗体应答(列A和列B)，以及针对C群4243菌株的血清杀菌性滴度(列C)。偶联疫苗不与人fH结合。详细情况参见实施例1。列D：人fH与野生型fHbp疫苗结合，但不与对照MenC-CRM偶联疫苗或某些突变的fHbp疫苗结合，如实施例部分表5的相应图示。小鼠(或家兔、或大鼠等)fH不与野生型fHbp结合。
图3：使用结合人fH的野生型fHbp接种(列A)、或不结合人fH的R41S突变体接种(列B)后，fH转基因小鼠血清中人fH的浓度与血清杀菌性抗体应答的关系。列C为利用一般线性回归模型估算的GMT比率(突变/野生型疫苗与免疫的fH转基因小鼠的人fH血清浓度的相关性)。详细情况参见实施例4。
图4：利用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定人fH、抗-fHbp mAb、JAR4、和JAR5与野生型和突变型fHbp(fHbpID1的突变体，包含Glu替换为Ala)的结合。
图5：WT fHbp ID 1和ID 1双突变体E218A/E239A的SDS-PAGE大小和纯度分析。分子量以kDa计，显示在左侧。
图6：通过ELISA，检测可溶性fHbp对抗fHbp MAb与固定的野生型fHbp的结合的抑制。
图7：列A和列B显示了野生型fHbp ID 1和E218A/E239A双突变体蛋白(列A)与野生型fHbp ID 1和R41S突变体蛋白(列B)的差示扫描量热法结果。列C显示了经ELISA法确定的小鼠的抗fHbp IgG抗体滴度，所述小鼠经野生型fHbp ID 1或E218A/E239A双突变体蛋白免疫。经WT或突变体fHbp免疫小鼠的抗fHbp IgG抗体应答。在研究3中，使用三个剂量的重组WT或突变体fHbp免疫小鼠，所述fHbp吸附于弗氏佐剂(FA)或氢氧化铝(Al(OH)3)；在研究4中，使用吸附于氢氧化铝(Al(OH)3)的一个剂量的WT或突变体fHbp免疫CD-1小鼠；在研究5中，使用吸附于氢氧化铝(Al(OH)3)的三个剂量的WT或突变体fHbp免疫BALB/c小鼠。阴影柱状图，WT fHbp；空心柱状图，E218A/E239A突变体fHbp。列D表示研究6中BALB/c小鼠的抗-fHbp IgG滴度，所述小鼠给予两个剂量的fHbp疫苗。
图8：列A表示fH与天然fHbp变体的结合。酶标板的各孔用表示变体fHbp ID 1、14、或15的重组fHbp包被。如实施例部分所述检测人fH的结合。列B和列C分别表示变体fHbpID 1、14、和15与Mab JAR4和JAR5的结合。
图9：列A，fHbp与人fH片段复合物的结构。在卡通示意图中，fHbp在底部用黑色表示，fH在顶部用灰色表示。fHbp与fH片段结合的结构模型基于已公开的原子坐标(Schneideret al.((2009)Nature 458:890-3))。黑色带分别表示fHbp分子的N-和C-末端结构域。灰色带表示此前已发表的人fH的第六和第七短同源重复结构域，所述结构域介导人fH与fHbp的相互作用(Schneideret al.((2009)Nature 458:890-3)。左边的局部放大图为位置41的精氨酸残基，其与fH之间形成了带电荷的H键，预计精氨酸被丝氨酸取代后，H键将消失(右下插图)。该图使用MacPyMol(www.pymol.org)生成。列B显示了人H因子(fH)的氨基酸序列，已知其GenBank登录号为NP_000177(P08603)，它的编码核酸为NM_000186。
图10：利用ELISA检测的fH(列A)或抗-fHbp Mab JAR 4(列B)或JAR 5(列C)与fHbp ID 1的R41S和R41A突变体的结合。人fH(列A)与抗-fHbp MAb(列B和列C)的结合检测见实施例2所述。
图11：人H因子(左列)或抗-fHbp Mab JAR 4(右列)与变体群1中不同的fHbp及其相应R41S突变体的结合。结合检测见实施例2。列A和列B显示了fHbp ID 4的结合结果。列C和列D显示了fHbp ID 9的结合结果。列E和列F显示了fHbp ID 74的结合结果。“ID”指fHbp氨基酸序列变体识别(Identification,ID)编号，如奈瑟菌属多基因座序列分类网站http://pubmlst(dot)org/neisseria/fHbp/中所述。
图12：人fH和抗-fHbp MAb对照与变体群2中fHbp及fHbp的相应R41S突变体的结合。列A和列B显示了人H因子与野生型(WT)fHbp ID 19和fHbp ID 19的R41S突变体的结合。列C和列D显示了人H因子与WT fHbp ID 22和fHbp ID 22的R41S突变体的结合。列E和列F显示了人H因子与WT fHbp ID 77和fHbp ID 77的R41S突变体的结合。MAb对照为JAR4(列B和列D)或JAR 11(列F)。
图13：在人fH转基因小鼠血清中引发的抗-fHbp抗体对fH与fHbp结合的影响。用ELISA检测fH与fHbp的结合，所述检测使用免疫前(列A，免疫前)和免疫后(列B，免疫后)血清的1:100稀释液，所述血清来自经野生型fHbp ID 1或R41S突变体ID 1fHbp疫苗免疫的各转基因小鼠。对于铝对照组，空心方块表示来自含有人fH的转基因小鼠的混合血清的数据，闭合三角表示来自不含人fH的野生型小鼠血清的数据。OD值表示结合人fH的量，所述量使用绵羊抗人fH和偶联至碱性磷酸酶的驴抗绵羊IgG检测。列C，免疫后血清中的抗-fHbp IgG滴度表明，针对两种疫苗产生了类似的抗体应答。列D，在加入的人fH存在的情况下，人fH与fHbp结合的抑制。列E，fH结合的抑制百分率与人fH转基因小鼠SBA滴度的关系，所述小鼠经fHbp疫苗免疫。
图14：列A和列B分别显示了fHbp ID 1的K241E突变体与fH的结合，以及与MAb JAR5的结合。列C和列D分别显示了fHbp ID 15的E241K突变体与fH的结合，以及与MAb JAR5的结合。如实施例2所述检测fH或抗fHbp MAb与fHbp的结合。
图15：利用ELISA检测fH或抗fHbp MAb与fHbp ID 1的H119A和R130A单突变体的结合。如实施例2所述检测人fH(列A)与抗fHbp MAb JAR 5(列B)或JAR 4(列C)的结合。
图16：六个最常见的fHbp模块群的示意图，所述模块群命名为I至VI。可变片段分别衍生自两个遗传谱系之一，命名为α(以灰色表示)或β(白色)。根据pubmlst.org/neisseria/fHbp/网站采用的命名法，也可以将α和β谱系命名为谱系1和2。片段VA起始于氨基酸残基8并延伸至位置73，而片段VB起始于位置79并延伸至位置93(所述氨基酸残基的编号基于fHbp ID 1的序列)。片段VC起始于氨基酸残基98并延伸至位置159，而片段VD起始于位置161并延伸至位置180。片段VE起始于氨基酸残基186并延伸至位置253。在分析的70个fHbp氨基酸序列变体中，33个仅含有α类片段，7个仅含有β类片段，两类片段分别命名为模块群I和II。其余的30个fHbp变体为含有α和β片段不同组合的天然嵌合体，可以分配至四个模块群(III-VI)之一。显示了模块群与Masignani变体群命名的关系，以及在各fHbp模块群中观察到的唯一序列的数量。图16的最后一个模块图显示了工程化(非天然存在的)fHbp嵌合体I的模块架构。对于来自fHbp ID 1和ID 77“嵌合体I”的工程化嵌合蛋白而言(Beernink et al.(2008)Infec.Immun.76:2568-2575)，位置136至139的四个氨基酸残基GEHT(SEQ ID NO:27)表示VC片段的结点(参见图19)。ID指的是在公开的网站http://pubmlst.org/neisseria/fHbp/中所描述的fHbp序列多肽识别号。
图17：fH与重组fHbp突变体S41P(fHbp ID 15的突变体)的结合。列A显示了fH与fHbp ID 15的S41P突变体的结合。列B和列C分别显示了fHbp ID 15的S41P突变体与MAbJAR 5和MAb JAR31的结合。“Pep28”为fHbp ID 28；“Pep1”为fHbp ID 1；“Pep 15WT”为fHbp ID 15；以及“Pep 15S41P”为fHbp ID 15的S41P突变体。
图18：人fH与fHbp嵌合体I的R41S突变体的结合(Beernink et al.(2008)Infec.Immun.76:2568-2575)(列A)以及相应JAR 5的结合(列B)。
图19：列A，天然变体与人工嵌合体(嵌合体I；Beernink et al.(2008)Infec.Immun.76:2568-2575)的fHbp序列比对。fHbp ID 1属于模块群I(根据Beernink and Granoff(2009)Microbiology 155:2873-83的定义，全部五个可变片段，A-E，均衍生自α谱系)。fHbp ID28属于模块群II(全部五个片段均衍生自β谱系)。fHbp ID 15是天然嵌合体(属于模块群IV，具有一个βA片段以及αB、C、D、和E片段)。fHbp ID 28的β-型A片段(VA；残基8-73)与fHbp ID 15的相应A片段(VA)相比较，后者也具有β-型A片段(VAβ)。长方形表示在E218A/E239A双突变fHbp中改变的残基。列B，fHbp ID 1和fHbp ID 77的A片段(氨基酸残基8至73)的比对。列C，fHbp ID 1和fHbp ID 77的C片段(氨基酸残基98至159)的比对。结点在残基136。嵌合fHbp包括从ID1至残基G136的氨基酸序列，以及fHbpID 77从残基136至C末端的序列。列D显示了在氨基酸位置41(编号基于fHbp ID 1的编号)的天然多态性的比对；某些变体具有精氨酸(R41，ID 1、19、4、9和74)，而其他变体具有丝氨酸(S41，ID 55、15)或脯氨酸(P41，ID 28)。ID指的是fHbp序列ID；MG指的是fHbp模块群；以及VG指的是变体群。列E，fHbp ID 1、fHbp ID 77和嵌合体I的比对。fHbp ID 77中用阴影表示的残基强调了片段VC中与嵌合体I中相应位置不同的残基。以从N-末端至C-末端的顺序，加粗和用阴影表示的残基对应于K113、K119、和D121。
图20：利用ELISA检测fH或抗fHbp MAb与fHbp ID 77的K113A、K119A、和D121A单突变体的结合。如实施例2所述检测人fH(列A)和抗-fHbp MAb JAR 31(列B)与fHbpID 77突变体的结合。
图21：利用ELISA检测fH或抗fHbp MAb与fHbp ID 77的R41S/K113A、R41S/K119A、和41S/D121A双突变体的结合。如实施例2所述检测人fH(列A)和抗-fHbp MAb JAR 31(列B)与fHbp ID 77突变体的结合。
图22：利用ELISA检测fH或抗-fHbp MAb与fHbp ID 77的K113A/D121A双突变体和R41S/K113A/D121A三突变体的结合。如实施例2所述检测人fH(列A)、抗-fHbp MAbJAR 4(列B)和抗-fHbp MAb JAR 31(列C)与fHbp ID 77突变体的结合。
图23：利用ELISA检测fH与fHbp ID 22突变体的结合。如实施例2所述检测人fH与D221A、R80A、或野生型fHbp的结合(列A)，人fH与E218A、E248A、或野生型fHbp的结合(列B)，以及人fH与R41S、Q38A、Q126A、或野生型fHbp的结合(列C)。
图24：利用ELISA检测抗fHbp MAb JAR31与fHbp ID 22突变体的结合。如实施例2所述检测R80A和D211A突变体与JAR31的结合(列A)，以及E218A和E248A突变体与JAR31的结合(列B)。
图25：利用ELISA检测抗fHbp Mab JAR4与fHbp ID 22突变体的结合。如实施例2所述检测R80A和D211A突变体与JAR4的结合(列A)，以及E218A和E248A突变体与JAR4的结合(列B)。
图26：利用ELISA检测抗fHbp MAb JAR35与fHbp ID 22突变体的结合。如实施例2所述检测R80A和D211A突变体与JAR35的结合(列A)，以及E218A和E248A体突变与JAR35的结合(列B)。
图27：利用ELISA检测抗fHbp MAb与fHbp ID 22的T220A/H22A双突变体，或G236I突变体的结合。如实施例2所述检测人fH(列A)、抗fHbp MAb JAR 31(列B)、JAR 35(列C)、或JAR 4(列D)与fHbp ID 22突变体的结合。
图28：利用ELISA检测fH或抗fHbp MAb与fHbp ID 22的R41S、Q38A、和A235G突变体的结合。如实施例2所述检测人fH(列A)、抗fHbp MAb JAR 31(列B)或JAR 35(列C)与fHbp ID 22突变体的结合。
图29：利用ELISA检测fH或抗fHbp MAb与fHbp ID 22的Q126A、D201A、和E202A突变体的结合。如实施例2所述检测人fH(列A)、抗fHbp MAb JAR 35(列B)与fHbp ID22突变体的结合。
图30：与fHbp ID 28(变体群3)突变体的结合。列A和列C，利用ELISA检测fH与K199A、E217A、和E218A突变体的结合。列B和列D显示了抗fHbp MAb JAR 31(列B)、和抗fHbp MAb JAR 33(列D，仅fHbp野生型ID 28WT和E218A突变体)与fHbp ID28突变体的结合。
图31描述了野生型BLAB/c小鼠的血清杀菌性滴度，所述小鼠经fHbp ID 1疫苗的指示突变体免疫，并用针对血清群B菌株H44/76(fHbp ID 1)检测滴度。
图32描述了小鼠的血清杀菌性滴度，所述小鼠经fHbp ID 22的指示突变体免疫，并用针对血清群W-135菌株Ghana 7/04(fHbp ID 23)检测滴度。上图，与野生型(WT)fHbpID22疫苗相比，滴度无显著性差异的突变疫苗(P>0.10)。下图，与对照WT ID 22疫苗相比，引发滴度显著降低的突变疫苗(P<0.05)。
图33描述了小鼠的杀菌性滴度，所述小鼠经fHbp ID 77的R41S/K113A/D121A三突变体免疫，并用针对血清群W-135菌株Ghana 7/04(fHbp ID 23)检测滴度。
图34：fHbp ID 1(SEQ ID NO:1)、fHbp ID 22(SEQ ID NO:2)、fHbp ID 77(SEQID NO:4)、fHbp ID 28(SEQ ID NO:3)、和ID1/ID77嵌合体(SEQ ID NO:8)氨基酸序列的比对。ID 28作为fHbp变体群3的对照序列。如Schneider et al.((2009)Nature 458:890-3)所述，根据与fH片段复合的fHbp ID 1的晶体结构，预测出的在H因子结合接触面形成氢键或离子间相互作用的残基(用灰色标出)。位置136至139的GEHT(SEQ ID NO:27)(加粗)表示嵌合fHbp ID 1与ID 77之间的结点。
图35：fHbp ID 1(SEQ ID NO:1)、fHbp ID 22(SEQ ID NO:2)、fHbp ID 77(SEQID NO:4)、fHbp ID 28(SEQ ID NO:3)、和ID1/ID77嵌合体(SEQ ID NO:8)氨基酸序列的比对。用灰色标出的残基表示突变的残基，其汇总于表7。
图36描述了在与fH片段形成的复合物中fHbp的模型。描述了已知影响抗fHbp mAbJAR 3和JAR 5(G121和K122)以及mAb 502(R204)表位的氨基酸残基的位置。
图37A-D描述了利用ELISA(列A)、等离子共振(列B)、针对活细菌的流式细胞术(列C，仅mAb；和列D，存在20％已除去IgG的人血清中的mAb)检测的人IgGa小鼠嵌合的fHbp特异性mAb与fHbp的结合。
图38A-B描述了人IgG1小鼠嵌合抗-fHbp mAb JAR 3、JAR 5和mAb 502，在有包膜的血清群B菌株H44/76细菌上，激活补体而产生的C1q依赖性C4b沉积作用。列A，将去C1q的人血清作为补体来源；列B，反应前，将纯化的C1q蛋白添加到去C1q的血清。列C描述了各mAb的由人补体介导的杀菌性活性，针对血清群B菌株H44/76进行检测。
图39A-C描述了将fHbp附着至酶标板各孔，通过ELISA检测抗fHbp mAb对fH结合的抑制作用(列A)，和使用血清群B菌株H44/76的活细菌，通过流式细胞术检测抗-fHbpmAb对fH结合的抑制作用(列B和列C)。
图40A-C描述了fH与血清群B H44/76突变体的结合，所述突变体使fHbp表达、或fHbp和NspA两者遗传失活。列A，对照抗-PorA mAb的结合；列B和列C，在已除去IgG的人血清中，fH的结合。
图41A-E描述了人IgG小鼠嵌合抗-fHbp mAb的杀菌性活性，针对NspA遗传失活的血清群B H44/76突变体进行检测。列A、列B、和列C：分别为抗-fhbp mAb JAR 3、JAR 5和mAb 502；列D和列E：分别为对照抗-PorA和抗荚膜mAb。
图42描述了抗-NspA抗体针对荚膜群A菌株(Senegal 1/99)的杀菌性活性，所述抗体针对fHbp敲除的血清群A菌株(上图)或对照抗-PorA mAb P1.9(下图)。
图43，列A-C描述了野生型小鼠的血清抗fHbp抗体应答，所述小鼠经重组fHbp疫苗或天然外膜囊泡疫苗免疫，所述疫苗来自fHbp过表达或fHbp敲除的血清群B菌株H44/76突变体。利用ELISA检测抗-fHbp抗体对免疫的应答(列A)，或血清抗-fHbp抗体抑制fH与fHbp结合的能力(列B和列C，也是利用ELISA检测)。小鼠经重组fHbp ID 1疫苗(实心三角)、或NOMV疫苗免疫，所述疫苗来自fHbp ID 1过表达(空心圈)或fHbp敲除(实心圈)的血清群B菌株H44/76突变体。
图44表示奈瑟菌属表面蛋白A(NspA)多肽(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列。
图45：各种天然存在的H因子结合蛋白(fHbp)的氨基酸序列：fHbp ID 1、fHbp ID15、fHbp ID 22、fHbp ID 28、fHbp ID 77、和嵌合体I(Beernink et al.(2008)Infec.Immun.76:2568-2575)。显示的FHbp ID序列无前导序列。在嵌合体I的序列中，小写字母对应于衍生自fHbp ID 1的氨基酸序列，而大写字母对应于衍生自ID 77的氨基酸。
在描述本发明和发明的特定示例性实施方式之前，应理解本发明不限于所描述的特定实施方式，因为这显然可以变化。还应理解本申请中所用的术语仅旨在描述特定实施方式，而非意在限制，因为本发明的范围将仅被后附的权利要求所限制。
当提到一个数值范围时，应理解为本发明包括了范围的上限和下限之间的每一个中间数值以及任何其他在所描述的范围内描述到的数值或者中间数值，所述中间数值小到下限单位的十分之一，除非上下文内容另有明示。本发明还包括这些可能被独立包括在较小范围之内的这些较小范围的上限和下限，在所描述到的范围中明确排除的端值除外。当所描述到的范围包括一个或两个端值时，本发明的范围也包括排除了这些包含在内的端值后的范围。
为清楚起见，本发明的某些特征分别在不同的实施方式中描述，应理解，这些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反地，为简要起见，本发明的多个特征在单个实施方式中描述，这些特征也可以单独提高或以任意适宜的亚组合形式提供。本发明特别包括并公开了与对照氨基酸序列相比，涉及氨基酸修饰，包括氨基酸取代，的实施方式的所有组合，就好像每一个组合均独立地和明确地公开，只要此类组合包含具有所需特征的多肽，例如，对人fH的亲和性低于fHbp ID 1的非天然存在的fHbp多肽。此外，在本发明中还明确包括且公开了在那些描述此类氨基酸修饰的实施方式中列出的此类氨基酸修饰的所有组合(包括氨基酸取代)，就好像此类氨基酸修饰的每一个此类组合均独立地和明确地在本申请中公开。
除非另有说明，否则本申请所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。虽然也可采用与本申请所述的任何类似或等同的方法和材料实施或测试本发明，但以下描述的是优选的方法和材料。本申请提及的所有出版物均通过参考并入本申请，以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。
必须注意到，本申请和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”、和“所述”包括复数对象，除非上下文另有明确说明。因此，例如，指代“一种抗原”时也包括多个这样的抗原，指代“所述蛋白”时也包括一个或多个蛋白，等等。
在本申请中讨论的出版物仅因为其在本申请的申请日之前公开。本申请中所有内容均不应解释为承认本发明不能通过发明在先的方式而早于这些出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际公开日期不同，可能需要单独确认。
发明详述
本申请提供了H因子结合蛋白及其使用方法，所述蛋白能够引发针对至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株具有杀菌性的抗体。
定义
“H因子结合蛋白”(fHbp)，在文献中也称为GNA1870、GNA 1870、ORF2086、LP2086(脂蛋白2086)和“741”，指的是一类脑膜炎奈瑟球菌多肽。发现它在自然界中是细菌表面的脂蛋白。根据氨基酸序列的可变性和免疫交叉反应性(Masignani et al.(2003)J Exp Med 197:789-99)，脑膜炎奈瑟球菌菌株已被细分为三个fHbp变体群(在一些报道(Masignani et al.(2003)J Exp Med 197:789-99)中称为变体1(v.1)、变体2(v.2)和变体(v.3)，在其他报道(参见，例如Fletcher et al.(2004)Infect Immun72:2088-2100))中称为家族A和B)。根据neisseria.org或者pubmlst.org/neisseria/fHbp/网站，在脑膜炎奈瑟球菌中发现的各个唯一的fHbp均分配了一个fHbp肽ID。因为变体2(v.2)fHbp蛋白(来自菌株8047，fHbp ID 77)和变体3(v.3)fHBP(来自菌株M1239，fHbp ID 28)的长度与MC58(fHbp ID 1)的长度分别具有-1和+7氨基酸残基的差异，所以用来指代v.2和v.3fHbp蛋白质残基的编号与基于这些蛋白质实际氨基酸序列的编号不同。因此，例如，位于v.2或v.3fHbp序列166位的亮氨酸残基(L)分别对应于v.2蛋白165位和v.3蛋白173位的残基。
本申请中使用的人H因子(“人fH”)指的是包含图9B(SEQ ID NO：9)所示氨基酸序列的蛋白，及其天然存在的人等位基因变体。
术语“异源”或“嵌合”指的是由来自不同来源或祖源序列的结构定义的两种组分。例如，在嵌合多肽的上下文中使用“异源”时，所述嵌合多肽包含可操作性连接的氨基酸序列，所述氨基酸序列来自不同系统发生群的不同多肽(例如，来源于α祖源氨基酸序列的第一组分和来源于β祖源氨基酸序列的第二组分)。嵌合多肽含有两个或多个已定义的片段，每个片段分别来自不同的祖先，可以是天然存在的或人工制备的(非天然存在的)多肽。有关天然存在的嵌合体的更多细节，参见Beernink PT,Granoff DM(2009)Microbiology 155:2873-83。非天然存在的嵌合体指的是“人工制备的嵌合体”，其包含带有自然界中不存在的异种成分的fHbp。
“异源”或“嵌合”多肽还可以包含两种或多种不同的组分，每种组分分别来自不同的fHbp(例如，变体1、2、或3)。所述组分可以操作性连接在沿fHbp多肽长度的任意位点。
在编码任何如上文所述的嵌合多肽的多核苷酸的上下文中的“异源”包括来自不同基因的可操作地连接的核酸序列(例如，来源于编码fHbp v.1多肽核酸的第一组分和来源于编码fHbp v.2多肽核酸的第二组分)或来自不同的祖氨基酸序列(α或β)的核酸序列。
其他示例性“异源”核酸包括表达构建体，其中包含编码序列的核酸可操作地连接于调节元件(例如启动子)，所述调节元件的遗传来源不同于编码序列的遗传来源(例如，为提供在目标宿主细胞中表达，所述宿主细胞的遗传来源可能不同于启动子、编码序列或不同于二者)。例如，当T7启动子操作性连接于编码fHbp多肽或其结构域的多核苷酸时，T7启动子被称为是异源核酸。
重组细胞的上下文中的“异源”指的是宿主细胞中存在与之遗传来源不同的核酸(或基因产物，如多肽)。例如，一种奈瑟氏菌属菌株的氨基酸或核酸序列对于另一种奈瑟氏菌属菌株的宿主是异源的。
氨基酸序列或多核苷酸序列(例如，“衍生自”fHbp ID 1的氨基酸序列)的上下文中的“衍生自”用来表示所述多肽或核酸的序列是基于某对照多肽或核酸的序列(例如，天然存在的fHbp蛋白或编码核酸)，而不用来限制制备所述蛋白质或核酸的来源或方法。氨基酸序列或多核苷酸序列可以“衍生自”的对照多肽和对照多核苷酸的非限制性例子包括，天然存在的fHbp、fHbp ID1、和非天然存在的fHbp。细菌菌株的上下文中的“衍生自”用来表示通过亲本菌株的体内或体外传代培养而获得的菌株，和/或通过修饰亲本菌株而获得的重组细胞。
“保守性氨基酸取代”指氨基酸侧链上的一个氨基酸残基被其他化学和物理性质(例如，电荷、大小、疏水性/亲水性)类似的氨基酸所取代。“保守性取代”旨在包括下列氨基酸残基组内的取代：gly、ala；val、ile、leu；asp、glu；asn、gln；ser、thr；lys、arg；和phe、tyr。通过对存在感兴趣表位多肽的氨基酸序列进行比对，以指导此类取代。
术语“保护性免疫”指的是对哺乳动物给予疫苗或免疫方案，以诱导免疫应答，所述免疫应答防止、延迟由脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病的发展、或降低所述疾病的严重程度，或减少或一并消除所述疾病的症状。保护性免疫可伴随有杀菌性抗体的产生。应注意，在本领域中公认，产生针对脑膜炎奈瑟球菌的杀菌性抗体预示着疫苗在人中具有保护作用(Goldschneider et al.(1969)J.Exp.Med.129:1307；Borrow et al.(2001)Infect Immun.69:1568)。
短语“脑膜炎奈瑟球菌菌株所致疾病”包括人类感染脑膜炎奈瑟球菌所表现的任何临床症状或临床症状组合。这些症状包括但不限于：脑膜炎奈瑟球菌病原菌株寄居在上呼吸道(例如，鼻咽和扁桃体粘膜)、细菌进入粘膜和粘膜下血管床、败血症、脓毒性休克、炎症、出血性皮肤损伤、激活血纤蛋白溶解和血液凝结、器官功能失调，例如肾、肺和心力衰竭，肾上腺出血和肌肉梗死、毛细血管渗漏、水肿、外周肢体缺血、呼吸窘迫综合征、心包炎和脑膜炎。
在抗原(例如，多肽抗原)的上下文中，短语“与某抗体特异性结合”或发生“特异性免疫反应”指的是，在可能包含其他分子的异质群体的样品中，基于和/或检验其中存在的抗原的结合反应。因此，在指定的条件下，所述一种或多种特异性抗体能与样品中的一种或多种特定抗原结合，而不与样品中存在的其他分子大量结合。抗原的表位(例如，多肽的表位)“与某抗体特异性结合”或发生“特异性免疫反应”指的是，在可能包含其他表位的异质群体的抗原(例如，多肽)中，和在可能包含其他抗原的异质群体中，基于和/或检验其中存在的表位的结合反应。因此，在指定的条件下，所述一种或多种特异性抗体能与抗原中的一个特定表位结合，而不与抗原和/或样品中存在的其他表位大量结合。
短语“用量足以引发免疫应答”表示在给予特定抗原制品前后检测到的免疫应答指示物之间存在可检测的差异。免疫应答指示物包括但不限于通过以下试验检测到的抗体滴度或特异性：酶联免疫测定(ELISA)、杀菌试验、流式细胞术、免疫沉淀、Ouchterlony免疫扩散；例如斑点、Western印迹或抗原阵列的结合检测试验；细胞毒性试验等。
“表面抗原”是存在于脑膜炎奈瑟球菌的表面结构(例如，外膜、荚膜、菌毛等)中的抗原。
“分离的”指的是目标化合物的环境与其天然存在的环境不同。“分离的”旨在包括样品中的化合物，所述样品中充分富集了目标化合物，和/或其中的目标化合物部分或充分纯化。
“富集”表示对样品进行非天然操作(例如，通过实验者或临床医生)，使目标化合物的浓度大于(例如，至少大3倍、至少大4倍、至少大8倍、至少大64倍或更多)起始样品中化合物的浓度，所述起始样品例如生物样品(例如，所述化合物天然存在的样品或在给药后存在于其中的样品)或制备所述化合物的样品(例如，在细菌多肽、抗体、嵌合多肽等中的情况)。
靶基因“敲除”指的是导致靶基因功能降低的基因序列改变，例如，导致靶基因表达不可检测或不显著，和/或基因产物无功能或不具有显著功能。例如，将LPS合成中涉及的一个基因“敲除”后，基因功能大幅降低，导致基因表达不可检测，或仅处于不显著水平，和/或与修饰前相比，基因产品的生物学活性(例如，酶活性)显著降低或不可检测。“敲除”包括条件性敲除，例如当接触预先设定的条件(例如，温度、渗透压)时，以及当接触促进靶基因改变的物质等情形时，可以发生靶基因的改变。靶基因“敲入”指的是基因的遗传改变，所述改变导致所述靶基因产生的功能增强。
FH结合特性改变的FHBP多肽
在描述本发明拟公开的更多fHbp之前，描述一下一些天然存在的fHbp是很有帮助的。如neisseria.org和pubmlst.org/neisseria/fHbp的网站所示，在脑膜炎奈瑟球菌中发现的每一个独特且天然存在的fHbp均被分配一个fHbp肽ID。在本发明中将采用该fHbp命名规则。
出于方便和清楚的考虑，对本申请中所有天然存在和非天然存在的fHbp氨基酸序列，包括本申请中描述的fHbp嵌合体和/或变体，选择fHbp ID 1(脑膜炎奈瑟球菌菌株MC58的v.1fHbp)的天然氨基酸序列作为对照序列。fHbp ID 1的氨基酸序列见图45和下文：
fHbp ID1
CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ(SEQ ID NO:1)。
在涉及fHbp中氨基酸残基的位置时，本申请中使用的位置编号与fHbp ID 1的氨基酸残基编号对应。不同fHbp以及对应于fHbp ID 1的各fHbp氨基酸残基的比对见图19。如图19和SEQ ID NO:1所示，位置编号1指的是fHbp ID 1中的第一个氨基酸残基，为半胱氨酸。在某些情况下，本申请中涉及的fHbp的N-末端可以包含附加的前导序列。例如，fHbp ID1可以在N-末端具有前导序列MNRTAFCCLSLTTALILTA(SEQ ID NO:16)。但是，在本申请中，仍将任何fHbp中的氨基酸位置编号1定义为，如上所示的在比对中位于fHbp ID 1的氨基酸位置1的半胱氨酸所对应的位置，如果存在前导序列，位置编号1为前导序列之后的第一个残基。详细情况见图19。
本申请提供了fHbp、包含fHbp的组合物、以及所述fHbp和组合物的使用方法。所述fHbp对人fH的亲和性低于相应的对照fHbp(例如，天然存在的fHbp；或其他对照fHbp)。因为高亲和性fHbp与fH形成复合物的概率较高，而fH的结合能够掩盖fHbp上的一个或多个表位，不被宿主免疫系统识别。因而，与fH复合和/或结合的fHbp可能无法像未复合的fHbp那样作为有效的免疫原。相反地，对fH具有相对较低亲和性的fHbp作为免疫原(例如，在疫苗组合物中)给药时，能够向被免疫宿主的免疫系统提呈某些表位，而这些表位是与fH具有高亲和性的fHbp所不能提呈的，因为与fH的结合可能会掩盖此类表位。所述fHbp对人fH的亲和性较低，可用于引发针对脑膜炎奈瑟球菌的杀菌性抗体，和/或提供针对脑膜炎奈瑟球菌的保护性免疫。所述fHbp是非天然存在的fHbp。非天然存在的fHbp在自然界中无法找到，其由人工制备，和/或经过人工特意修饰。可以通过化学合成或重组方法制备非天然存在的所述fHbp。
如本申请所用，“低亲和性”、“较低亲和性”、或“fH低结合蛋白”是指，fHbp与人fH的结合亲和性与fHbp ID 1同样低，或比fHbp ID 1更低。因而，对象fHbp包括fHbp ID14和fHbp 15，因为fHbp ID 14和fHbp ID 15对人fH的亲和性低于fHbp ID 1。
低亲和性fHbp与人fH的结合亲和性不超过约100％、不超过约95％、不超过约90％、不超过约85％、不超过约80％、不超过约75％、不超过约70％、不超过约65％、不超过约60％、不超过约50％、不超过约45％、或低于高亲和性fHbp(例如，fHbp ID 1)与人fH的亲和性。例如，对象fHbp与人fH的亲和性低于fHbp ID 1与人fH亲和性的约50％。
在某些实施例中，对象非天然存在的fHbp与人fH的结合亲和性为野生型fHbp与人fH的结合亲和性的85％或更低。例如，在某些实施例中，对象非天然存在的fHbp与人fH的结合亲和性为野生型fHbp与人的fH结合亲和性的约85％至约75％、约75％至约65％、约65％至约55％、约55％至约45％、约45％至约35％、约35％至约25％、约25％至约15％、约15％至约10％、约10％至约5％、约5％至约2％、约2％至约1％、或约1％至约0.1％、或低于0.1％。例如，在某些实施例中，对象非天然存在的fHbp与人fH的结合亲和性为fHbp ID 1与人fH的结合亲和性的约85％至约75％、约75％至约65％、约65％至约55％、约55％至约45％、约45％至约35％、约35％至约25％、约25％至约15％、约15％至约10％、约10％至约5％、约5％至约2％、约2％至约1％、或约1％至约0.1％、或低于0.1％。
例如，在某些实施例中，对象fHbp ID1的突变体(例如，fHbp ID 1的R41S、R41A、R130A、H119A、E218A、或E239A突变体)与人fH的结合亲和性为fHbp ID 1与人fH的结合亲和性的约85％至约75％、约75％至约65％、约65％至约55％、约55％至约45％、约45％至约35％、约35％至约25％、约25％至约15％、约15％至约10％、约10％至约5％、约5％至约2％、约2％至约1％、或约1％至约0.1％、或低于0.1％。
又例如，在某些实施例中，对象fHbp ID 4、ID 9、或ID 74的突变体(例如，fHbpID4、ID9、或ID74的R41S突变体)与人fH的结合亲和性为fHbp ID4、ID9、或ID74与人fH的结合亲和性、或fHbp ID 1与人fH的结合亲和性的约85％至约75％、约75％至约65％、约65％至约55％、约55％至约45％、约45％至约35％、约35％至约25％、约25％至约15％、约15％至约10％、约10％至约5％、约5％至约2％、约2％至约1％、或约1％至约0.1％、或低于0.1％。
又例如，在某些实施例中，对象fHbp ID 22的突变体(例如，fHbp ID 22的R80A、D211A、E218A、E248A、G236I、或T220A/H222A突变体)与人fH的结合亲和性为fHbpID 22与人fH的结合亲和性、或fHbp ID 1与人fH的结合亲和性的约85％至约75％、约75％至约65％、约65％至约55％、约55％至约45％、约45％至约35％、约35％至约25％、约25％至约15％、约15％至约10％、约10％至约5％、约5％至约2％、约2％至约1％、或约1％至约0.1％、或低于0.1％。
又例如，在某些实施例中，对象fHbp ID 77的突变体(例如，fHbp ID 77的R41S/K113A、R41S/K119A、R41S/D121A、或R41S/K113A/D121A突变体)与人fH的结合亲和性为fHbp ID 77与人fH的结合亲和性、或fHbp ID 1与人fH的结合亲和性的约85％至约75％、约75％至约65％、约65％至约55％、约55％至约45％、约45％至约35％、约35％至约25％、约25％至约15％、约15％至约10％、约10％至约5％、约5％至约2％、约2％至约1％、或约1％至约0.1％、或低于0.1％。
又例如，在某些实施例中，对象fHbp ID 28的突变体(例如，fHbp ID 28的E218A突变体；fHbp ID 28的K199A突变体)与人fH的结合亲和性为fHbp ID 28与人fH的结合亲和性、或fHbp ID 1与人fH的结合亲和性的约85％至约75％、约75％至约65％、约65％至约55％、约55％至约45％、约45％至约35％、约35％至约25％、约25％至约15％、约15％至约10％、约10％至约5％、约5％至约2％、约2％至约1％、或约1％至约0.1％、或低于0.1％。
可以用术语解离常数(KD)描述结合亲和性。低亲和性fHbp与人fH的解离常数(KD；M)至少高于约80％、至少高于约100％、至少高于约120％、至少高于约140％、至少高于约160％、至少高于约200％、或高于高亲和性fHbp(例如，fHbp ID 1)与人fH的KD。也可以将低亲和性fHbp的KD描述为fHbp ID 1的KD的约2X(2倍)、约3X、约5X、约10X、约15X、约20X、高达约50X或更多倍。
如本申请所用，“与人fH的亲和性低于相应的fHbp”用于描述结合亲和性低于相应的对照fHbp的fHbp。
在很多情况下，用于比较对象fHbp结合亲和性的相应fHbp(“对照f’Hbp”)为fHbpID 1。能够作为典型对照的其他相应fHbp包括变体2fHbp(例如，fHbp ID 22或77)、变体3(例如，fHbp ID 28)(Masignani et al(2003)J Exp Med 197:789-99和Pajon R et al(2010)Vaccine28:2122-9)、其它变体1fHbp(例如，fHbp ID 4、9、或94)、天然存在的嵌合、或人工制备的嵌合fHbp。
天然存在的fHbp的某些例子和人工制备的嵌合体的氨基酸序列如下文所示，以及参见图45。
FHbp ID 22
CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPSGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ(SEQ ID NO:2)
FHbp ID 28
CSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ(SEQ ID NO:3)
FHbp ID 77
CSSGGGGVAADIGARLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ(SEQ ID NO:4)
FHbp ID 15
CSSGGGGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAERTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIVGEHTSFGKLPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDEKHHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIRHIGLAAKQ(SEQ ID NO:5)
FHbp ID 6
CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVNGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEHSRKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPKGDSATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGYGKIEHLKSPELNVDLAAAYIKPDEKHHAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVKTANGIRHIGLAAKQ(SEQ ID NO:6)
FHbp ID 14
CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQEQDPEHSGKMVAKRRFKIGDIAGEHTSFDKLPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVELATAYIKPDEKHHAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ(SEQ ID NO:7)
嵌合体I
cssggggvaadigagladaltapldhkdkglqsltldqsvrkneklklaaqgaektygngdslntgklkndkvsrfdfirqievdgqlitlesgefqvykqshsaltafqteqiqdsehsgkmvakrqfrigdiaGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ(SEQ ID NO:8)(Beernink et al.(2008)Infec.Immun.76:2568-2575)。如图45所示，小写字母对应于衍生自fHbp ID 1的氨基酸序列，而大写字母对应于衍生自fHbp ID 77的氨基酸。在fHbp ID 1中对应于R41的位置为粗体的小写字母“r”。
所述对应的fHbp可以是天然存在的和/或非天然存在的(例如，人工制备的嵌合)fHbp，对象fHbp由其衍生。天然存在的嵌合fHbp具有衍生自不同祖原(α或β)的可变片段。由于所述可变片段，分子架构显示为模块化，根据五个可变片段的不同组合，可以将fHbp变体再以模块群分类，每种变体均衍生自命名为α-或β-型的两个遗传谱系之一(Pajon R et al.(2010)Vaccine28:2122-9；Beernink PT,Granoff DM(2009)Microbiology155:2873-83)。命名为I至VI的六个模块群可以涵盖全部已知fHbp变体的>95％(Pajon Ret al.(2010)Vaccine28:2122-9)。天然存在的fHbp模块群的架构参见图16。
所述对应的fHbp可以在片段(例如，在模块架构中定义的可变片段)或全长成熟蛋白中与对象fHbp具有较高氨基酸序列同一性的fHbp(例如，具有至少约99％、至少约95％、至少约90％、至少约85％、至少约80％、或至少约75％的氨基酸序列同一性)。
在对象fHbp的结合亲和性比较中用作对照的相应fHbp还可以包含，在一个或多个片段中，与对象fHbp的相应片段具有相同祖源(α或β)的fHbp。
对象fHbp可以包含与对照fHbp具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且与对照fHbp的氨基酸序列有1个氨基酸(aa)至10个氨基酸的不同，例如，与对照fHbp的氨基酸序列有1个aa、2个aa、3个aa、4个aa、5个aa、6个aa、7个aa、8个aa、9个aa、或10个aa的不同。因此，例如相对于对象fHbp衍生自的天然存在的和/或非天然存在的(例如，嵌合)fHbp，对象fHbp具有至多一个、至多两个、至多三个、至多四个、高达至多10个或更多的修饰(例如，取代、删除、或插入)。与未改变的fHbp相比，一个或多个氨基酸改变可以降低fHbp与人fH的亲和性。如上文所示，对象fHbp衍生自的fHbp包含天然存在的fHbp和非天然存在的fHbp。非天然存在的fHbp可以包含人工制备的嵌合体，如本领域公知的嵌合体和在PCT申请号WO 2009/114485中描述的嵌合体，其公开的内容通过参考并入本申请。
因此，在某些实施例中，对象fHbp包含相对于对照fHbp(例如，其中对照fHbp是天然存在的fHbp(例如，fHbp ID1，或人工制备的嵌合体))的单氨基酸取代。在某些实施例中，对象fHbp包含相对于天然存在的fHbp(例如，fHbp ID 6、fHbp ID 14、fHbp ID 15、fHbp ID 22、fHbp ID 28、fHbp ID 77、或其他天然存在的fHbp)的单氨基酸取代(即，仅有一个氨基酸取代)。fHbp ID 1、fHbp ID 15、fHbp ID 22、fHbp ID 28、和fHbp ID 77的氨基酸序列如图19和图45所示；fHbp ID 6和fHbp ID 14的氨基酸序列如上文所述。在某些实施例中，对象fHbp包含相对于fHbp ID 1的单氨基酸取代(即，仅有一个氨基酸取代)。在某些实施例中，对象fHbp包含相对于对照fHbp的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个氨基酸取代。在某些实施例中，对象fHbp包含相对于fHbp ID1的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个氨基酸取代。在某些实施例中，对象fHbp包含相对于天然存在的fHbp(例如，fHbp ID 6、fHbp ID 14、fHbp ID 15、fHbp ID28，如图19所示，或其他天然存在的fHbp)的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个氨基酸取代。在某些实施例中，对象fHbp包含相对于fHbp ID 1、fHbp ID 15、fHbp ID 22、fHbp ID 28、和fHbp ID 77中的一个氨基酸序列的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个氨基酸取代。
通过比较fH低结合蛋白的氨基酸序列(例如，fHbp ID 14和/或fHbp ID 15)，和对人fH的亲和性与，例如，fHbp ID 1相当的fHbp的氨基酸序列，可以确定引入氨基酸残基改变的位置。在本申请中，与人fH的亲和性和fHbp ID 1相当或比fHbp ID 1更高的fHbp，被称为“fH高结合蛋白”。fH高结合蛋白的某些例子包括fHbp ID 1、fHbp ID 6、和fHbp ID28。可以在序列比对中比较共享一个或多个祖源片段的低fH结合蛋白和fH高结合蛋白。图19是序列比对的例子，所述序列比对用于确定天然存在的fHbp可以进行哪些氨基酸改变，从而获得对象fHbp。
对象fHbp变体可以衍生自变体1fHbp、变体2fHbp、或变体3fHbp(例如，与之相比，可以包含一个或多个氨基酸取代)。对象fHbp变体可以衍生自模块群I fHbp、模块群II fHbp、模块群III fHbp、模块群IV fHbp、模块群V fHbp、模块群VI fHbp、模块群VIIfHbp、模块群VIII fHbp、模块群IX fHbp、或模块群X fHbp(例如，与之相比，可以包含一个或多个氨基酸取代)。
与对照fHbp相比，可能降低fHbp与fH的亲和性的氨基酸取代包括，在fHbp氨基酸中与fH结合的接触残基的氨基酸取代；在fHbp氨基酸中表面暴露的氨基酸取代；在fHbp氨基酸中位于氨基末端和羧基末端结构域界面处的氨基酸取代；以及在fHbp氨基酸中与fH结合残基邻近的氨基酸取代，其中与fH结合氨基酸“邻近的”氨基酸是指，与fH结合氨基酸的氨基末端或羧基末端距离一至十个残基的氨基酸。在某些实施例中，使得与fH的亲和性降低的氨基酸取代不是fH接触残基。某些接触残基见图19中的加粗部分。
当fHbp包含相对于天然存在的或相对于fHbp ID 1的氨基酸取代时，氨基酸取代可以相对于所述氨基酸取代保守。例如，如果R41被修饰为S，产生R41S取代，并且特别是R41S取代使得其对人fH的亲和性降低，则本申请的公开内容还包括相对于S的保守氨基酸取代，由此也包括R41T的氨基酸取代。
本申请提供了相对于fHbp ID 1在位置41具有氨基酸取代的非天然存在的fHbp，其中氨基酸取代的结构干扰fHbp与人H因子之间的相互作用，但前提是fHbp突变体保留免疫原性。适于相对于fHbp ID1在位置41进行取代的氨基酸包括，疏水性残基(例如，Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro)；小的极性残基(例如，Ser、Cys、Thr、Met、Asn、Gln)；小的带电残基(例如，Asp、Glu)；以及大的疏水性残基(例如，Phe，Trp)。预计某些取代不会明显干扰fHbp与人H因子之间的相互作用，因此应避免使用，这样的取代的例子包括，大的带电残基(例如，Lys)。
在某些实施例中，一个或多个下述残基的氨基酸取代被特别地排除：R41、Q38、Q87、Q113、K113、K119、D121、G121、Q126、Q128、R130、D201、E202、E218、A235、E239、和K241。在某些实施例中，例如，当对象fHbp包含相对于对照fHbp的单氨基酸取代时(例如，当对照fHbp是天然存在的fHbp或fHbp ID 1时)，单氨基酸取代可以位于位置E218或E239。
对象fHbp中的氨基酸改变包括，图19中用阴影标出的残基和/或在框中的残基，并在下文列出。在序列分析的一个例子中，比较了低结合蛋白fHbp ID 15的片段A(VA；残基8-73)与fH高结合蛋白fHbp ID 28中具有相同祖源序列的VA。这样，除位置41和60以外，fHbp ID 15和fHbp ID 28的VA片段的氨基酸序列相同。如图19所示，fHbp 15的VA具有S41和R60；fHbp ID 28的VA具有P41和K60。在这项分析的基础上，将对应于fHbp ID 15的位置41和60的氨基酸残基位置作为通过引入改变以获得对象fHbp的候选位置。换言之，在对应于fHbp 15位置41和60的残基位置分别不具有S和R的对照fHbp可以突变为在对应于fHbp 15的位置41和60具有S和/或R。包含一个或多个氨基酸取代的对象fHbp与人fH的亲和性可能低于未取代的fHbp(例如，S41P、S41A、R41P、或R41A)。对象fHbp中包括了此类fHbp，其在所需对象中用作引发杀菌性抗体的免疫原。
在下文的例子中讨论可以引入氨基酸改变的其它候选残基位置。例如，本发明的fHbp可以在一个或多个位置具有氨基酸取代，所述位置对应于一个或多个选自fHbp ID 1的41、60、114、113、117、119、121、128、130、147、148、149、178、195、218、239、241、或247(例如，基于成熟fHbp的编号)的氨基酸残基。本发明的fHbp可以在一个或多个位置具有氨基酸取代，所述位置对应于一个或多个选自fHbp ID 1的41、60、80、113、114、117、119、121、128、130、147、148、149、178、195、199、211、220、222、236、241、247、或248的氨基酸残基，基于成熟fHbp的编号。本发明的fHbp可以在一个或多个位置具有氨基酸取代，所述位置对应于一个或多个选自fHbp ID 1的87、109、115、118、126、138、197、201、202、203、209、217、225、235、或245的氨基酸残基，基于成熟fHbp的编号。当对应的fHbp为变体2或变体3fHbp(或分别对应的模块群)时，可以在位置113、119、和/或121，或其任意组合处引入修饰。例如，变体2fHbp(例如，fHbp ID 77)可以在位置113、119、和/或121的一个或多个位置处含有取代，以及在位置41含有丝氨酸取代，或在位置41含有上文所述的其他适宜取代。当对应的fHbp为ID 22变体时，可以在位置80、211、218、220、222、236、或248、或其任意组合处引入修饰。
本发明的变体H因子结合蛋白(fHbp)还可以在一个或多个位置具有氨基酸取代，所述位置对应于一个或多个选自fHbp ID 1的60、114、117、147、148、149、178、195、或247的氨基酸残基。与上文中讨论的fHbp ID 15的VA相似，通过对fH低结合蛋白与fH高结合蛋白之间进行序列比对研究，可以确定其他位置。
本发明的变体fHbp可以是fHbp ID 1的变体，并且可以包括一个、两个、三个、或四个下述取代：R41S、R41A、R130A、H119A、E218A、和E239A。如上文所讨论的，本发明的变体fHbp可以包括单氨基酸取代。本发明的变体fHbp还可以包括双氨基酸取代。例如，本发明的变体fHbp可以包括R41S、R41A、R130A、H119A、E218A、和E239A中的两个取代。
本发明的变体fHbp还可以在一个或多个位置具有氨基酸取代，所述位置对应于一个或多个选自fHbp ID 1的80、211、218、220、222、236、和248的氨基酸残基。fHbp变体中的对应位置易于确定，例如通过图19、34、和35中的比对确定。作为非限制性例子，本发明的变体fHbp可以是fHbp ID 22的变体，并且可以包括一个、两个、三个、或四个下述取代：R80A、D211A、E218A、T220A、H222A、G236I、和E248A。如上文所讨论的，本发明公开的变体fHbp可以包括单氨基酸取代。本发明的变体fHbp还可以包括双氨基酸取代。例如，本发明的变体fHbp可以包括在R80、D211、E218、T220、H222、G236、和E248中的两个位置的取代。作为一个非限制性例子，变体fHbp可以包括T220A/H222A双取代。
本发明的变体fHbp可以在一个或多个位置具有氨基酸取代，所述位置对应于一个或多个选自fHbp ID 77的41、113、119、121的氨基酸残基。作为非限制性例子，本发明的变体fHbp可以是fHbp ID 77的变体，并且可以包括一个、两个、三个、或四个下述取代：R41S、K113A、K119A、D121A。如上文所讨论的，本发明的变体fHbp可以包括单氨基酸取代。本发明的变体fHbp还可以包括双氨基酸取代。例如，本发明的变体fHbp可以包括R41S、K113A、K119A、和D121A中的两个的取代。作为一个非限制性例子，变体fHbp可以包括R41S/K113A双取代、R41S/K119A双取代、或R41S/D121A双取代。
本发明的变体fHbp可以在一个或多个位置具有氨基酸取代，所述位置对应于一个或多个选自fHbp ID 28的113、121、199、和218的氨基酸残基。
当本发明的fHbp的位置41被丝氨酸取代时，其对应的fHbp属于图16所示的模块群之一。例如，对应的fHbp可能来自于模块群I，所述模块群I的所有可变片段均为α谱系。此类对象fHbp的例子包括fHbp ID 1、4、9、和94的R41S突变体。在某些实施例中，对象fHbp不包括相对其对应的fHbp，与人fH的亲和性没有降低的突变体。例如，对象fHbp不包括fHbp ID 19和22的R41S突变体。
嵌合fHbp
如上文所示，天然存在的fHbp或人工制备的fHbp(例如，人工制备的嵌合fHbp)可以引入一个或多个修饰。修饰可以包括一个片段或一个结构域中的修饰，而其他片段和/或结构域可以衍生自任何fHbp(例如，不同变体群的天然存在的fHbp)。
在已描述具有模块架构VA、VB、VC、VD、和VE片段的fHbp中，可以将修饰引入α谱系的VA中(例如，在fHbp ID 1的VA中引入R41S)，而fHbp的其他片段(例如，VB、VC、VD、和VE)均可以独立地衍生自任意谱系、任意变体群、或任意fHbp ID。在另一个例子中，对象fHbp的VA、VC、和VE片段可以衍生自α谱系(谱系1)，而VB和VD可以衍生自β谱系。当修饰为使用丝氨酸取代位置41的精氨酸时，所述修饰被引入到α祖源的VA(VAα)处。所述VA片段是指起始于残基位置7并终止于残基位置73的连续氨基酸序列，其位置编号对应于对照序列fHbp ID 1的位置编号。
本发明的fHbp可以在VAα片段中包含R41S突变，所述VAα片段包含与下述序列具有至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约98％、至少约99％、直至100％同一性的氨基酸序列：
VAADIGAGLA DALTAPLDHK DKSLQSLTLD QSVRKNEKLK LAAQGAEKTYGNGDSLN TGKLKNDKV(SEQ ID NO:17)。VAα序列列于此处，R41S突变以粗体表示。因此，包含R41S修饰的fHbp在VAα片段中具有R41S突变，并且可以具有VB、VC、VD、和VE片段，所述片段分别独立地衍生自任意其他fHbp(例如，不同的谱系、不同的变体群、或fHbp的突变体)。
还可以将本发明的嵌合fHbp描述为在fHbp的N-末端结构域(fHbpN)具有修饰，而C-末端结构域(fHbpC)可以衍生自不同的fHbp(例如，不同的变体群或不同的谱系)。“fHbpN”是指起始于约残基位置8并终止于约残基位置136的连续氨基酸序列。“fHbpC”是指起始于约残基位置141并终止于约残基位置255的连续氨基酸序列。fHbpN和fHbpC之间的插入序列是两个结构域之间的连接子。例如，对象fHbp的fHbpN可以在衍生自fHbp ID 1的序列中包含R41S突变，而fHbpC衍生自变体2或变体3fHbp(例如，fHbpID 77)。
对应的嵌合fHbp可以是任意已知的人工制备的嵌合体，如Beernink et al.(2008)Infec.Immun.76:2568-2575和WO 2009/114485中所描述的那些嵌合体，其公开的内容通过引用并入本申请。包含修饰的嵌合体相对于嵌合fHbp对人fH的亲和性降低，但仍保留了对引发杀菌性应答具有重要作用的表位，例如在对应的嵌合fHbp中发现的表位。可以保留在修饰的嵌合体中的fHbp表位包括在对应嵌合fHbp中发现的表位，如在WO 2009/114485中所描述的表位，其公开的内容通过引用并入本申请。例如，修饰的嵌合fHbp可以包含对引发杀菌性应答具有重要作用的表位，所述杀菌性应答针对含有变体1fHbp的菌株(例如，在N-末端结构域的表位，如mAb JAR 4和/或JAR 5定义的表位)和/或含有变体2或3fHbp的菌株(例如，mAb JAR 10、JAR 11、JAR 13、和/或JAR 36定义的表位)。例如，如图19和图45所示，R41S突变是可以引入嵌合fHbp的修饰，以降低与人fH的结合，但仍保留JAR 4和JAR 5表位。
对象fHbp的一个特征为，当给予宿主(例如，哺乳动物如小鼠或人)时，对象fHbp可以引发与fHbp ID 1、或其他相应的对照(例如，fHbp ID 4、9、22、28、74、或77)所引发的杀菌性应答水平相当或略高的杀菌性应答。确定杀菌性应答水平的方法是本领域所公知的，参见下文实施例部分的描述。例如，经对象fHbp免疫小鼠的杀菌性滴度几何平均数为经fHbp ID 1免疫小鼠的杀菌性滴度几何平均数的至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约150％、至少约175％、至少约200％、或200％以上。在某些情况下，经对象fHbp免疫的小鼠的杀菌性滴度几何平均数比经fHbp ID 1免疫对照小鼠杀菌性滴度几何平均数高至少2倍、至少2.5倍、至少5倍、至少10倍、或10倍以上。
对象fHbp可以排除那些引发的杀菌性应答显著低于fHbp ID 1的fHbp。对象fHbp可以排除在残基位置218和239均有突变(例如，E218A/E239A双突变体)的fHbp。在某些实施例中，对象fHbp仅包含非天然存在的fHbp；因此，在某些实施例中，对象fHbp排除天然存在的fHbp。
在很多情况下，对象fHbp变体保持并存在与杀菌性抗体结合的构型表位，所述抗体对一种或多种脑膜炎奈瑟球菌菌株具有杀菌活性。因此，此类fHbp突变体可以保持在天然存在的fHbp中发现的表位，并且与天然存在的fHbp对fH的结合亲和性相比，此类fHbp突变体与fH的结合降低。对fHbp的构型具有最小影响或无影响，从而使得突变疫苗能够引发杀菌性抗体的变体被认为是良好的疫苗候选物。可以通过多种途径确定变体是否对fHbp的构型有影响，包括列于表9中的抗体结合。
本发明的fHbp可能具有其他的特征，详见下文所述。
偶联物
本发明的对象fHbp可以在多肽的N-和/或C-末端含有一个或多个附加元件，如多肽(例如，具有与对象fHbp异源的氨基酸序列)和/或载体分子。可以融合附加的异源氨基酸序列，例如，作为在细菌宿主细胞(例如，大肠杆菌)中的表达结果以提供N-末端甲硫氨酸或其衍生物(例如，焦谷氨酸盐)，和/或提供在其N-末端或C-末端具有融合伴侣的嵌合多肽。目标融合伴侣包括，例如，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、His6-标签等，以及来自其他蛋白，特别是脂蛋白的前导肽。融合伴侣可以提供附加特征，例如便于对象fHbp的分离、纯化、检测、发挥免疫原性。
可以连接至对象fHbp的其他元件包括载体分子(例如，载体蛋白，例如，钥孔戚血蓝蛋白(KLH))。其他元件可以通过连接子连接至肽，例如，柔性连接子。载体包含免疫调节剂，一种直接或间接修饰免疫应答的分子。特定的一类免疫调节剂包括刺激或辅助刺激免疫应答的免疫调节剂。例子包括抗原和抗原载体，例如毒素或其衍生物，包括破伤风毒素。还包括其他载体，其可便于给药和/或在针对脑膜炎奈瑟球菌免疫或治疗的对象中增加免疫原性。载体分子也可以促进向目标细胞或组织的递送。附加部分也可能有助于免疫原性或与疫苗中的组分形成复合物。载体分子可能起支架蛋白的作用，以便于展示膜表面抗原(例如，囊泡疫苗)。
在一个例子中，对象fHbp在其N-和/或C-末端修饰以引入脂肪酸(例如，脂肪族的羧酸基团)。脂肪酸可以通过柔性连接子与fHbp共价连接。可以用于修饰对象fHbp末端(例如，N-末端，例如在N末端)的脂肪酸的例子为月桂酸。当共价连接至其他分子时，月桂酸是指月桂酰基团(例如，月桂酰硫酸酯)。月桂酸含有十二个碳原子，有十个亚甲基，分子式为CH3-(CH2)10-COOH。可以连接至对象肽的其他脂肪酸包括辛酸(10C)、肉豆蔻酸(14C)、和棕榈酸(16C)。详细情况，参见Westerink MA et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4021-4025。也可以预期，本申请还包括能够将对象fHbp锚定至细菌外膜的任意疏水性部分，其可用于偶联至本发明的fHbp的N-和/或C-末端(例如，在N-末端)，其中所述疏水性部分可以通过连接子，例如如本申请所述的柔性连接子，操作性地偶联至肽。例如，疏水性五肽FLLAV(SEQ ID NO:18)，如Lowell GH et al.(1988)J.Exp.Med.167:658-63所述。
如上文所示，脂肪酸以及上文所述的其他附加元件连接至fHbp的一种方法为通过连接子(例如，月桂酰-Gly-Gly)。适用于修饰本发明的fHbp的连接子包括“柔性连接子”。可以容易地选择适宜的连接子，连接子可以是任意适宜的不同长度，例如1个氨基酸(例如，Gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸，以及可以是1个、2个、3个、4个、5个、6个、或7个氨基酸。
柔性连接子的例子包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括，例如(GS)n、GSGGSn(SEQ ID NO:19)和GGGSn(SEQ ID NO:20)，其中n是至少为1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、以及本领域公知的其他柔性连接子。优选甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物，因为这些氨基酸均是相对未结构化的，因此可以作为组分之间的中性连接。特别优选甘氨酸聚合物，因为与平坦的丙氨酸相比，甘氨酸能够进入具有显著更大的Ramachandran(或phi-psi)空间，并且与带有更长侧链的残基相比具有更低的限制(参见Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142(1992))。示例性的柔性连接子包括，但不限于，GGSG(SEQ ID NO:21)、GGSGG(SEQ IDNO:22)、GSGSG(SEQ ID NO:23)、GSGGG(SEQ ID NO:24)、GGGSG(SEQ IDNO:25)、GSSSG(SEQ ID NO:26)，等等。普通技术人员将会意识到，偶联至上文所述的任意元件的fHbp的设计，可以包括全部或部分柔性的连接子，从而连接子可以包括柔性连接子以及一个或多个具有较低柔性结构的部分。
天然fHbp通常含有N-末端半胱氨酸，其上可以共价附着脂质基团。该半胱氨酸残基在天然存在的蛋白中通常是脂质化的，其在本发明的对象fHbp中可以是脂质化的。因此，在本申请所述的氨基酸序列中，涉及在该特定位置的“半胱氨酸”或“C”包括指未经修饰的半胱氨酸和被脂质化的半胱氨酸(例如，由于翻译后修饰)。因此，对象fHbp可以是脂质化或非脂质化的。在体外(参见，例如Andersson et al.(2001)J.ImmunologicalMethods 255:135-48)或体内生产脂质化蛋白的方法是本领域公知的。例如，通过去垢剂提取的方法，已经从大肠杆菌蛋白的膜成分中纯化得到脂质化的fHbp(Fletcher et al.(2004)Infection and Immunity 72:2088-100)，该方法可能适于生产脂质化的fHbp。可以优选脂质化的蛋白，因为其与可溶性蛋白相比具有更高的免疫原性(参见，例如Fletcher et al.(2004)Infection and Immunity 72:2088-100)。
可以理解的是，可以修饰编码异源性fHbp的核苷酸序列，以优化使用的密码子，从而促进在目标宿主细胞(例如，大肠杆菌、脑膜炎奈瑟球菌、人(基于DNA的疫苗的情况)等)中的表达。生产优化的密码子序列的方法是本领域公知的。
编码fHbp的核酸
本申请提供了一种编码对象fHbp的核酸。在某些实施例中，对象核酸存在于重组表达构建体中。还提供了包含对象核酸的遗传修饰的宿主细胞。
本发明的fHbp多肽和编码核酸可以衍生自任意适宜的脑膜炎奈瑟球菌菌株。正如本领域所公知的，根据与不同的表面抗原发生相互作用的多克隆(Frasch,C.E.and Chapman,1973,J.Infect.Dis.127:149-154)或单克隆抗体的反应，将脑膜炎奈瑟球菌菌株分为血清群(荚膜群)、血清型(PorB表型)和亚型(PorA表型)。通常根据荚膜多糖中免疫学可检测的差异进行荚膜分群，但该检测方法正被编码特异性酶基因的PCR取代，所述基因负责结构不同的荚膜多糖的生物合成。已知约有12种荚膜群(包括A、B、C、X、Y、Z、29-E、和W-135)。荚膜群A、B、C、Y和W-135的菌株可导致几乎所有的脑膜炎球菌疾病。习惯上可根据单克隆抗体确定的称为通道蛋白B(PorB)的外膜蛋白的抗原性差异区分血清型。目前已知的抗体可以确定约21种血清型(Sacchi et al.,1998,Clin.Diag.Lab.Immunol.5:348)。已将称为通道蛋白A(PorA)的外膜蛋白通过抗体确定其抗原性差异，由此区分血清亚型。血清分型和血清亚型分型正被PCR和/或DNA测序所替代，其分别鉴别编码与mAb反应性有关的PorB和PorA可变区的基因(例如，Sacchi,Lemos et al.,同上；Urwin et al.,1998,Epidem.and Infect.120:257)。
尽管可以使用脑膜炎奈瑟球菌菌株的任意荚膜群，但是特别优选将荚膜群B型的脑膜炎奈瑟球菌菌株作为编码fHbp的核酸来源，及其结构域的衍生来源。
编码fHbp多肽的核酸可用于构建本申请所包括的对象fHbp，这些核酸为本领域内公知。不同fHbp及其序列可以在neisseria.org和pubmlst.org/neisseria/fHbp网站获得。fHbp多肽的举例也可以参见，例如，US专利申请号61/174,424、PCT申请号PCT/US09/36577、WO 2004/048404；Masignani et al.(2003)J Exp Med 197:789-799；Fletcher et al.(2004)InfectImmun 72:2088-2100；Welsch et al.J Immunol 2004172:5606-5615；和WO 99/57280。fHbp变体和亚变体的核酸(及氨基酸序列)也可见于GenBank，其登记号为：NC_003112,GeneID:904318(NCBI Ref.NP_274866)，来自脑膜炎奈瑟球菌菌株MC58的fHbp ID 1；AY548371(AAT01290.1)(来自脑膜炎奈瑟球菌菌株CU385)；AY548370(AAT01289.1)(来自脑膜炎奈瑟球菌菌株H44/76)；AY548377(AAS56920.1)fHbpID 4，来自脑膜炎奈瑟球菌菌株M4105；AY548376(AAS56919.1)(来自脑膜炎奈瑟球菌菌株M1390)；AY548375(AAS56918.1)(来自脑膜炎奈瑟球菌菌株NZ98/254)；AY548374(AAS56917.1)(来自脑膜炎奈瑟球菌菌株M6190)；AY548373(AAS56916.1)(来自脑膜炎奈瑟球菌菌株4243)；和AY548372(AAS56915.1)(来自脑膜炎奈瑟球菌菌株BZ83)。
为了鉴定本发明的对象fHbp中预期使用的相关氨基酸序列，应注意未成熟的fHbp包括约19个残基的前导序列。此外，当提供了一个氨基酸序列时，本领域的普通技术人员很容易想到能够编码并表达具有此氨基酸序列的多肽的核酸序列。
除了本申请提供的特定氨基酸序列和核酸序列以外，本发明还涵盖了与这些多肽和核酸序列例子具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的多肽和核酸序列。在两个或多个多核苷酸序列，或两个或多个氨基酸序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分率是指在指定区域范围内，例如，VE或对照氨基酸或核苷酸序列中的长度至少为约40、45、50、55、60、65或以上，直至全长的氨基酸或核苷酸区域(例如，全长fHbp)，当比较或以最大对应情况进行比对时，两种或多种序列或子序列相同，或具有特定百分率的相同氨基酸残基或核苷酸(例如，在特定区域内至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％相同)。本发明特别包括天然以多种形态存在的和合成产生的氨基酸序列及其编码核酸。
在进行序列比较时，通常将一个序列作为对照序列(例如，天然存在的fHbp多肽序列或其片段)，将待测序列与之比较。当使用序列比较算法时，将待测和对照序列输入计算机程序，如有必要，设定序列坐标，并设定序列算法程序的参数。随后，序列比较算法将根据设定的程序参数计算待测序列与对照序列的序列同一性百分率。
适于确定序列同一性百分率的算法示例为BLAST和BLAST 2.0算法，Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul et al.(1977)Nucleic Acids Res.25:3389-3402分别对其有所描述。公众可以从美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)获得进行BLAST分析的软件。进一步的示例性算法包括ClustalW(Higgins D.,et al.(1994)Nucleic Acids Res 22:4673-4680)，可以从www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html获得。
某些残基不同的位置，其区别在于保守性氨基酸。保守性氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的互换。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有包含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有酸性侧链的一组氨基酸是天冬氨酸和谷氨酸；具有碱基侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。
两个核酸之间的序列同一性也可以利用两个分子之间在严格条件下的杂交情况进行描述。杂交条件选自本领域的下述标准方法(参见，例如，Sambrook,et al.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,第2版,(1989)Cold Spring Harbor,N.Y.)。严格杂交条件的一个例子为，在50℃或以上以及0.1×SSC(15mM氯化钠/1.5mM柠檬酸钠)条件下杂交。严格杂交条件的另一个例子为，42℃在下述溶液中孵育过夜：50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt氏溶液、10％葡聚糖硫酸盐以及20mg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA，随后在约65℃条件下使用0.1×SSC洗涤滤器。严格杂交条件为严格程度至少与上述代表性条件相同的杂交条件，其中当严格程度至少为上述特定严格条件的约80％，典型的至少为90％时，认为其至少为严格条件。
生产方法
可以采用任意适宜的方法生产本发明的fHbp，包括重组和非重组方法(例如，化学合成)。当采用重组技术生产对象fHbp时，该方法可以涉及任何适宜的构建体和任何适宜的宿主细胞，可以是原核细胞或真核细胞，常用的是细菌或酵母宿主细胞，更常用的是细菌细胞。将遗传物质引入宿主细胞的方法包括，例如，转化、电穿孔、偶联和磷酸钙法，等等。可以选择转移的方法，使得拟导入的fHbp编码核酸稳定表达。所述fHbp编码核酸可以作为可遗传的游离体元件(例如，质粒)提供或被整合至基因组。
在组合物中，用于转移fHbp编码核酸的适宜载体可以发生改变。整合载体可以有条件地复制，或是自杀性质粒、噬菌体，等等。构建体可以包括多种元件，包括例如，启动子、选择性遗传标记(例如，对抗生素(例如卡那霉素、红霉素、氯霉素或庆大霉素)具有抗性的基因)、复制起点(启动宿主细胞中的复制，例如，细菌宿主细胞)，等等。载体的选择依赖于多种因素，例如期望用于繁殖的细胞类型和繁殖目的。某些载体可用于扩增和制备大量的目标DNA序列。其他载体适用于在培养细胞中表达。还有其他载体适用于在整体动物细胞中转移和表达。选择适宜的载体属于本领域公知的技术。很多此类载体可以购买获得。
在一个例子中，所述载体是基于附加型质粒的表达载体，所述附加型质粒含有可选择药物抗性标记和元件，并可以在不同宿主细胞中提供自我复制(例如大肠杆菌和脑膜炎奈瑟球菌)。这种“穿梭载体”的一个例子是质粒pFP10(Pagotto et al.(2000)Gene244:13-19)。
可通过，例如，将目标多核苷酸插入到构建体主链中，一般通过采用DNA连接酶连接到载体中切割的限制性酶位点，来制备构建体。或者，可通过同源重组或位点特异性重组插入目标核苷酸序列。通常通过将同源区域与载体在目标核苷酸序列的侧翼连接来完成同源重组，而通过采用促进位点特异性重组的序列(例如，cre-lox、att位点等)来完成位点特异性重组。可通过，例如，以下方法加入含有此序列的核酸：连接寡核苷酸，或使用引物的聚合酶链反应，所述引物包含同源区域和目标核苷酸序列的一部分。
载体可在宿主细胞中保持处于染色体外，或可整合到宿主细胞基因组中。本领域技术人员公知的大量出版物详细描述了载体，包括，例如，Short Protocols in MolecularBiology,(1999)F.Ausubel,et al.,eds.,Wiley&Sons。载体可表达编码对象fHbp的核酸，可扩增所述对象核酸，或二者皆可。
可采用的示例性载体包括，但不限于，衍生自重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA的载体。例如，可采用质粒载体，如pBR322、pUC 19/18、pUC 118、119和M13mp系列载体。pET21也是可采用的表达载体。噬菌体载体可包括λgt10、λgt11、λgt18-23、λZAP/R和EMBL系列噬菌体载体。可利用的其他载体包括，但不限于，pJB8、pCV 103、pCV 107、pCV 108、pTM、pMCS、pNNL、pHSG274、COS202、COS203、pWE15、pWE16和卡隆粒9系列载体。
对于对象fHbp的表达，可采用表达盒。因此，本发明提供包含对象核酸的重组表达载体。所述表达载体提供转录和翻译调节序列，并可提供诱导型或组成型表达，其中在转录起始区、以及转录和翻译终止区的转录控制下操作性连接编码区。这些控制区可以是对象fHbp衍生自的fHbp所先天具有的，或衍生自外部来源。通常，所述转录和翻译调节序列包括，但不限于，启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、以及增强子或激活子序列。启动子可以是组成型或诱导型，并且可以是强组成型启动子(例如，T7，等等)。
表达载体通常具有位于启动子序列附近的方便的限制性位点，以便插入编码目标蛋白质的核酸序列。在表达宿主中可存在可操作的选择性标记，以促进对包含所述载体的细胞进行选择。此外，所述表达构建体可包含其他元件。例如，所述表达载体可具有一个或两个复制系统，从而使其能保持于用于表达的生物中，例如哺乳动物或昆虫细胞，和用于克隆和扩增的原核宿主中。此外，所述表达构建体可包含选择性标记基因，以允许对转化的宿主细胞进行选择。选择基因是本领域的公知常识，随采用的宿主细胞而变化。
应注意，本发明的fHbp可包含其他元件，如可检测标记，例如，放射性标记、荧光标记、生物素标记和免疫可检测标记(例如，HA标签、多组氨酸标签)，等等。可提供fHbp的其他元件，以便于通过多种方法(例如，亲和捕获等)进行分离(例如，生物素标签、免疫可检测标签)。对象fHbp可以通过共价或非共价连接可选地固定于支持物。
可根据本领域已知的方法完成fHbp的分离和纯化。例如，可以通过免疫亲和纯化从经遗传修饰能够表达fHbp的细胞裂解产物或合成反应混合物中分离fHbp，免疫亲和纯化通常涉及：使所述样品接触抗fHbp抗体(例如，抗fHbp mAb，如JAR 5MAb或本领域公知的其他适宜的JAR MAb)，洗涤以除去非特异性结合的材料，并洗脱特异性结合的fHbp。可通过透析和其他通常用于蛋白质纯化的方法来进一步纯化分离的fHbp。在一个例子中，可以采用金属螯合色谱法分离fHbp。
宿主细胞
多种适宜的宿主细胞均可用于生产fHbp。一般情况下，根据常规技术，本发明所述的fHbp可以在原核细胞或真核细胞中表达，常用的是细菌，更常用的是大肠杆菌或奈瑟菌属(例如，脑膜炎奈瑟球菌)。因此，本发明进一步提供了经过基因修饰的宿主细胞，其包含编码对象fHbp的核酸。用于生产(包括大规模生产)对象fHbp的宿主细胞可以选自多种可用的宿主细胞中的任何一种。用于表达的宿主细胞例子包括原核或真核单细胞生物的细胞，例如细菌(例如，大肠杆菌菌株)、酵母菌(例如，酿酒酵母、毕赤酵母，等等)，以及可以包括来源于更高等的生物，例如昆虫、脊椎动物，特别是哺乳动物(例如，CHO、HEK，等等)的宿主细胞。通常，在对象fHbp的生产中，特别优选细菌宿主细胞和酵母菌。
对象fHbp可以被制成充分纯化或充分分离的形式(即，从其他奈瑟菌属或宿主细胞多肽中充分分离)或充分分离的形式。对象fHbp可以存在于组合物中，在组合物中与其他可能存在的成分相比(例如，其他多肽或其他宿主细胞成分)，所述多肽是富集的。可以提供纯化的对象fHbp，使得多肽存在于组合物中，而所述组合物基本上不含有其他表达的多肽，例如，所述组合物的90％以下、通常为60％以下和更通常为50％以下由其他表达的多肽组成。
用于生产囊泡的宿主细胞
当在膜囊泡中提供对象fHbp时(将在下文中详细讨论)，将对奈瑟菌属宿主细胞进行遗传修饰以表达对象fHbp。在本发明公开的方法中，可以使用多种奈瑟菌属菌株中的任何一种，其能够被修饰以产生对象fHbp，以及任选地，能够产生或能够经修饰后产生其他目标抗原，如PorA。
对奈瑟菌属菌株进行遗传修饰以及表达目标多肽的方法和载体均为本领域的公知常识。载体和方法的例子，请参见WO 02/09746和O’Dwyer et al.(2004)Infect Immun72:6511-80。特别优选强启动子，特别是强组成型启动子。启动子的例子包括porA、porB、lbpB、tbpB、p110、hpuAB、lgtF、opa、p110、lst、hpuAB和rmp的启动子。
为用于膜囊泡生产，优选致病性奈瑟菌属菌株或衍生自奈瑟菌属的菌株，特别是对人具有致病性的菌株或衍生自对人具有致病性或共生性的菌株。奈瑟菌属的例子包括，脑膜炎奈瑟球菌、金黄奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、乳酸奈瑟球菌、多糖奈瑟球菌、灰色奈瑟球菌、粘膜奈瑟球菌、浅黄奈瑟球菌、干燥奈瑟球菌、长形奈瑟球菌，等等。
特别优选用脑膜炎奈瑟球菌菌株进行遗传修饰，以表达对象fHbp和生产囊泡。可以根据多种不同的目标特征选择用于囊泡生产的菌株。例如，可以根据以下方面选择菌株：目标PorA的类型(“血清亚型”，如上文所述)、荚膜群、血清型，等等；荚膜多糖的产生减少，等等。例如，生产菌株可以生产任何目标PorA多肽，并且可以表达一种或多种PorA多肽(天然的或经遗传工程改造的)。这样的菌株的例子包括，生产能赋予血清亚型P1.7,16；P1.19,15；P1.7,1；P1.5,2；P1.22a,14；P1.14；P1.5,10；P1.7,4；P1.12,13的PorA多肽的菌株；以及生产这种PorA多肽变体的菌株，所述变体可以保留或不保留与在血清亚型分型中使用的常规血清学试剂的反应性。还优选的是，根据porA可变区(VR)而鉴别的PorA多肽(参见，例如，Russell et al.(2004)Emerging Infect Dis10:674-678；Sacchi CT et al.(1998)Clin Diagn Lab Immunol 5:845-55；Sacchi et al(2000)J.InfectDis182:1169-1176)。已鉴定出了大量不同的VR类型，这些类型可分类为VR1和VR2家族“原型”。描述此术语及其与以前分型方案之间关系的网络访问数据库见neisseria.org/nm/typing/pora。某些VR1和VR2型PorA的比对，请参见Russell et al.(2004)Emerging Infect Dis 10:674-678。
可选地或另外，生产菌株可以是荚膜缺陷型菌株。荚膜缺陷型菌株可以提供囊泡疫苗，可以在疫苗给药对象中降低引发显著自身抗体应答的风险(例如，由于产生了能与宿主细胞表面的唾液酸交叉反应的抗体)。本申请所用的“荚膜缺陷”或“缺乏荚膜多糖”表示细菌表面的荚膜多糖水平低于天然存在的菌株，或者，当菌株经遗传修饰时，细菌表面的荚膜多糖水平低于衍生所述荚膜缺陷型菌株的亲代菌株。荚膜缺陷型菌株包括，表面荚膜多糖产生降低至少10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％或更多的菌株，也包括在细菌表面检测不到荚膜多糖的菌株(例如，通过使用抗荚膜多糖抗体的全细胞酶联免疫吸附试验(ELISA))。
荚膜缺陷型菌株包括因天然存在的或重组产生的遗传修饰而缺乏荚膜的菌株。天然存在的荚膜缺陷型菌株(参见，例如，Dolan-Livengood et al.(2003)J.Infect.Dis.187:1616-28)，以及鉴定和/或产生荚膜缺陷型菌株的方法(参见，例如，Fisseha et al.(2005)Infect.Immun.73:4070-4080；Stephens et al.(1991)Infect Immun59:4097-102；Frosch et al.(1990)Mol Microbiol.4:1215–1218)均为本领域的公知常识。
修饰奈瑟菌属宿主细胞以降低荚膜多糖产生可包括，修饰涉及荚膜合成的一个或多个基因，与修饰前的亲代细胞相比，所述修饰可以降低荚膜多糖的水平。这种遗传修饰包括，改变一个或多个荚膜生物合成基因的核苷酸和/或氨基酸序列，使得该菌株缺乏荚膜(例如，由于一个或多个荚膜生物合成基因中有一个或多个插入、缺失、取代，等等)。荚膜缺陷型菌株可缺乏一个或多个荚膜基因，或所述基因无功能。
特别优选的是在唾液酸的生物合成中有缺陷的菌株。这种菌株可以产生囊泡，所述囊泡可降低引发与人唾液酸抗原起交叉反应的抗唾液酸抗体的风险，这种菌株还可改进生产安全性。具有唾液酸生物合成缺陷(因天然产生的修饰或工程改造的修饰)的菌株可以在唾液酸生物合成途径中的许多不同基因中的任意基因中有缺陷。特别优选的是N-乙酰葡糖胺-6-磷酸2-差向异构酶基因(称为synX AAF40537.1或siaA AAA20475)编码的基因产物有缺陷的菌株，尤其优选的是该基因灭活的菌株。例如，在一个实施例中，通过破坏功能性synX基因产物的产生来生成荚膜缺陷型菌株(参见，例如，Swartley et al.(1994)J Bacteriol.176:1530-4)。
也可采用非重组技术，从天然存在的菌株获得荚膜缺陷型菌株，例如用杀菌性抗荚膜抗体来选择荚膜多糖减少的菌株。
当本发明涉及采用两种或两种以上菌株时(例如，为产生抗原性组合物，所述抗原性组合物包含来自不同菌株的带有对象fHbp的囊泡)，可选择在一个或多个菌株特征上有所不同的菌株，例如，使提供的囊泡具有不同的对象fHbp，PorA等。
囊泡的制备
本发明所述的抗原性组合物通常包括由表达对象fHbp的奈瑟菌属细胞制备的囊泡。本申请所述的“囊泡”包括外膜囊泡以及微囊泡(也称为细胞泡(blebs))。
所述抗原性组合物可以包含外膜囊泡(OMV)，所述外膜囊泡由经遗传修饰以表达对象fHbp的脑膜炎奈瑟球菌属培养菌株的外膜制备。可通过以下途径获得OMV：将脑膜炎奈瑟球菌培养在肉汤或固体培养基中，优选地通过分离细菌细胞与培养基(例如，通过过滤或低速离心来沉淀细胞，等等)、裂解细胞(例如，通过加入去垢剂、渗透休克、超声波处理、空腔化、匀浆，等等)以及从细胞质分子中分离外膜组分(例如，通过过滤；或通过差别性沉淀或使外膜和/或外膜囊泡聚集；或通过使用配体的亲和分离方法，所述配体可以特异性识别外膜分子；或通过高速离心来沉淀外膜和/或外膜囊泡，等等)；可以利用外膜组分制备OMV。
所述抗原性组合物可以包含含有对象fHbp的微囊泡(MV)(或“细胞泡”)，其中经遗传修饰以表达对象fHbp的脑膜炎奈瑟球菌菌株在培养期间释放所述MV或细胞泡。例如，可通过以下途径获得MV：将脑膜炎奈瑟球菌培养在肉汤培养基中，从肉汤培养基中分离出完整的细胞(例如，通过过滤或低速离心，从而只沉淀细胞，但不沉淀较小的细胞泡，等等)，然后收集无细胞培养基中的MV(例如，通过过滤、差别性沉淀或使MV聚集，或通过高速离心来沉淀细胞泡，等等)。通常可以根据培养基中产生的细胞泡数量来选择用于制备MV的菌株(例如，可培养合理数量的细菌来制备适合于本申请所述方法中分离和给药的细胞泡)。能产生高水平细胞泡的示例性菌株在PCT公开号WO01/34642中有所描述。除了根据细胞泡产量，也可根据NspA产量选择用于制备MV的菌株，特别优选的是，能产生较高NspA水平的菌株(具有不同NspA产生水平的脑膜炎奈瑟球菌的例子可参见，例如，Moe et al.(1999Infect.Immun.67:5664)。用于生产细胞泡的其他目标菌株包括，具有无活性GNA33基因的菌株，该基因编码细胞分离、膜结构和毒性所需的脂蛋白(参见，例如，Adu-Bobie et al.(2004)Infect Immun.72:1914-1919)。
本发明所述的抗原性组合物可以含有来自一种菌株，或2种、3种、4种、5种或更多种菌株的囊泡，这些菌株彼此可以是同源性的或异源性的，通常是异源性的。例如，就PorA和/或对象fHbp衍生自的fHbp而言，所述菌株可以是同源性或异源性的。可以采用表达一种以上对象fHbp(例如，1种、2种、3种或更多种对象fHbp)的菌株制备囊泡，所述对象fHbp可以由不同变体(v.1、v.2或v.3)或亚变体(例如，v.1、v.2或v.3的亚变体)fHbp的氨基酸序列组成。
抗原性组合物可以包含提供相同或不同对象fHbp的OMV和MV的混合物，其中所述对象fHbp可以任选地提供来自fHbp变体和/或亚变体的不同组合的表位，且其中所述OMV和/或MV可以来自相同或不同的菌株。不同菌株的囊泡可以作为混合物给药或顺续给药。
需要时(例如，用于产生囊泡的菌株伴有内毒素或特别高水平的内毒素)，可以任选地处理所述囊泡以减少内毒素，例如，以降低给药后的毒性。可用合适的去垢剂(例如，BRIJ-96、脱氧胆酸钠、月桂酰肌氨酸钠、Empigen BB、Triton X-100、吐温20(聚氧乙烯失水山梨糖醇单月桂酸酯)、吐温80，浓度0.1-10％，优选0.5-2％，以及SDS)提取来减少内毒素，虽然如下文所述这可能存在不足。使用去垢剂提取时，最好使用除脱氧胆酸盐以外的去垢剂。
可以不使用去垢剂制备抗原性组合物的囊泡，例如，不使用脱氧胆酸盐。虽然可用去垢剂处理除去内毒素活性，但在囊泡产品制备期间，通过提取的步骤可能会去除天然fHbp脂蛋白和/或对象fHbp(包括脂化的fHbp)。因此，特别需要采用无需去垢剂的技术来降低内毒素活性。在一个方法中，使用产生内毒素(脂多糖，LPS)较少的菌株，从而避免在用于人体前从最终制品中除去内毒素。例如，可以用奈瑟菌属突变体制备囊泡，在所述突变体中，脂寡糖或在疫苗中可能有害的其他抗原(例如，Rmp)被降低或清除。
可以采用包含遗传修饰的脑膜炎奈瑟球菌菌株制备囊泡，使得脂质A的毒活性降低或不可检测。例如，可对所述菌株进行脂质A生物合成的遗传修饰(Steeghs et al.(1999)Infect Immun67:4988-93；van der Ley et al.(2001)Infect Immun69:5981-90；Steeghs et al.(2004)J Endotoxin Res10:113-9；Fissha et al,(2005)Infect Immun 73:4070)。通过修饰LPS，例如分别使得编码lpxL1或lpxL2的酶下调和/或失活，可以使免疫原性组合物脱毒。在lpxL1突变体中产生五酰化脂质A，提示由lpxL1编码的酶在GlcN II的2’位将C12加入N连接的3-OH C14。在lpxL2突变体中，主要的脂质A种类为四酰化物，提示由lpxL2编码的酶在GlcN I的2位加入其他的C12，即加入到N-连接的3-OH C14。突变导致这些基因的表达降低(或不表达)(或这些基因的产物减少或无活性)，并改变脂质A的毒性(van derLey et al.(2001)Infect Immun69:5981-90)。四酰化(lpxL2突变体)和五酰化(lpxL1突变体)脂质A的毒性低于野生型脂质A。脂质A 4’-激酶编码基因(lpxK)突变也能够降低脂质A的毒活性。对于囊泡(例如，MV或OMV)生产，特别优选的是经遗传修饰的脑膜炎奈瑟球菌，使得功能性LpxL 1编码的蛋白减少或不可检测，例如，对奈瑟菌属(例如，脑膜炎奈瑟球菌菌株)进行遗传修饰，使得lpxL1基因产物的活性降低或无活性。例如，可以对奈瑟菌属进行遗传修饰，以敲除lpxL1基因，例如，破坏所述lpxL1基因。参见，例如，美国专利公开号2009/0035328。可以对奈瑟球菌菌属进行遗传修饰，使得lpxL2基因产物的活性降低或无活性。可以对奈瑟球菌菌属进行遗传修饰，使得lpxL1基因和lpxL2基因产物的活性降低或无活性。与能够产生LPS的野生型脑膜炎奈瑟球菌菌株相比，此类囊泡的毒性降低，但仍能保持fHbp的免疫原性。
也可以通过在涉及多粘菌素B耐药(这种耐药与脂质A的4’磷酸基上加入氨基阿拉伯糖有关)的基因/基因座中引入突变来改变LPS的毒性。这些基因/基因座可以是编码UDP-葡萄糖脱氢酶的pmrE，或者是许多肠菌素共有的抗微生物肽抗性基因的某一区域，所述肠菌素涉及氨基阿拉伯糖合成和转移。存在于该区域的pmrF基因编码多萜醇-磷酸酯甘露糖基转移酶(Gunn J.S.,Kheng,B.L.,Krueger J.,Kim K.,Guo L.,Hackett M.,Miller S.I.1998.Mol.Microbiol.27:1171-1182)。
PhoP-PhoQ调节系统中的突变，所述系统是磷酸化两组分调节系统(例如，PhoP组成型表型，PhoPc)，或低Mg++环境或培养条件(所述条件激活PhoP-PhoQ调节系统)，可导致在4’磷酸上加入氨基阿拉伯糖和以2-羟基肉豆蔻代替肉豆蔻(肉豆蔻羟基化)。该修饰的脂质A具有降低的刺激人内皮细胞表达E-选择素的能力和刺激人单核细胞分泌TNF的能力。
多粘菌素B耐药菌株也适用，因为这些菌株的LPS毒性降低(参见，例如，van der Leyet al.(1994)In:Proceedings of the ninth international pathogenic Neisseria conference.TheGuildhall,Winchester,England)。可选地，可将能模拟多粘菌素B结合活性的合成肽加入所述抗原性组合物以降低LPS毒活性(参见，例如，Rustici et al.(1993)Science 259:361-365；Porro et al.(1998)Prog Clin Biol Res.397:315-25)。
也可通过选择培养条件来减少内毒素。例如，将菌株培养在每升含0.1mg-100mg氨基阿拉伯糖的生长培养基中来降低脂质毒性(参见，例如，WO 02/097646)。
组合物和制剂
本申请所用的“组合物”、“抗原组合物”、“抗原性组合物”或“免疫原性组合物”一般情况下均为对包含本发明所述对象fHbp组合物的简称，对象fHbp可以任选地偶联以进一步增强免疫原性。在本发明中特别包括用于在人体中引发抗体的组合物，例如针对脑膜炎奈瑟球菌的抗体，例如针对脑膜炎奈瑟球菌的杀菌抗体。抗原性组合物可以包含1种、2种或多种不同的对象fHbp。当存在一种以上类型的fHbp时，各对象fHbp可以提供来自fHbp变体和/或亚变体的不同组合的表位。
抗原性组合物含有免疫有效量的对象fHbp，如有需要，可以进一步包含其他相容性组分。本发明的组合物可以含有作为fH低结合蛋白的fHbp。对象组合物中的fH低结合蛋白包括上文所述的任何fHbp，例如非天然存在的或天然存在的fHbp(例如，fHbp ID 14和/或fHbp ID 15)。所述组合物含有一种或多种fHbp，其中至少一种fHbp是fH低结合蛋白。当组合物中有一种以上的fHbp时，各fHbp可以不同(例如，氨基酸序列和/或偶联物不同)。
本发明的免疫原性组合物包括，但不限于，包含以下内容的组合物：
1)非天然存在的fHbp(例如，对人fH的亲和性低于fHbp ID 1的非天然存在的fHbp)；以及
2)fHbp(例如，非天然存在的fHbp，例如，对fH的亲和性低于fHbp ID 1的非天然存在的fHbp)和NspA；
其中所述fHbp和/或NspA可以作为重组蛋白和/或在囊泡组合物(例如，OMV)中提供。应注意的是，当所述组合物包括NspA和fHbp时，通过组合物给药引发的抗体的杀菌活性是针对一种或两种抗原的抗体共同作用的结果。本发明提供的免疫原性组合物的例子包括：
a)包含上文所述的非天然存在的fHbp变体的免疫原性组合物(例如，针对至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株引发杀菌性抗体应答的非天然存在的fHbp)；
b)包含上文所述的非天然存在的fHbp变体的免疫原性组合物(例如，对人fH的亲和性低于fHbp ID 1的非天然存在的fHbp)；以及重组NspA蛋白；
c)包含分离的fHbp的免疫原性组合物，所述分离的fHbp与fHbp ID 14或fHbp ID 15具有至少85％的氨基酸序列同一性，其中所述fHbp对人H因子(fH)的亲和性低于fHbp ID1；
d)包含分离的fHbp的免疫原性组合物，以及重组NspA蛋白；所述分离的fHbp与fHbpID 14或fHbp ID 15具有至少85％的氨基酸序列同一性，其中所述fHbp对人H因子(fH)的亲和性低于fHbp ID 1；
e)包含来自经遗传修饰的奈瑟菌属宿主细胞的天然OMV的免疫原性组合物，所述宿主细胞采用核酸进行遗传修饰，所述核酸编码如上文所述的非天然存在的fHbp变体(例如，对人fH的亲和性低于fHbp ID 1的非天然存在的fHbp)，使得经遗传修饰的宿主细胞产生编码的非天然存在的fHbp，其中所述OMV包含编码的非天然存在的fHbp；以及
f)包含来自经遗传修饰的奈瑟菌属宿主细胞的天然OMV的免疫原性组合物，所述宿主细胞采用核酸进行遗传修饰，所述核酸编码如上文所述的非天然存在的fHbp变体，(例如，对人fH的亲和性低于fHbp ID 1的非天然存在的fHbp)，使得经遗传修饰的宿主细胞产生编码的非天然存在的fHbp，其中所述OMV包含编码的非天然存在的fHbp；并且所述奈瑟菌属宿主细胞也产生高水平的NspA，使得所述OMV还含有NspA。例如，所述奈瑟菌属宿主细胞可以经遗传修饰，使得NspA表达增加。
“免疫有效量”表示将所述量给予个体时，不管是作为单一剂量或作为相同或不同免疫原性组合物连续给药的一部分，能够有效引发用于治疗或预防由例如奈瑟菌属感染导致的症状或疾病的有效抗体应答，所述菌属特别是脑膜炎奈瑟球菌，更特别地是脑膜炎奈瑟球菌B群。该用量根据以下因素而不同：待治疗个体的健康和身体状况、年龄、个体的免疫系统产生抗体的能力、目标保护程度、疫苗制剂、主治医师对医疗状况的评估以及其他相关因素。预期所述用量可以在相对较宽的范围，其能通过常规试验测定。
NspA多肽的氨基酸序列是本领域公知的。参见，例如，WO 96/29412；和Martin et al.(1997)J.Exp.Med.185:1173；GenBank登录号U52066；以及GenBank登录号AAD53286。“NspA多肽”可以包含一氨基酸序列，其与图44中所示的氨基酸序列中的约75个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约150个氨基酸、或约150个氨基酸至约174个氨基酸的连续链具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％、或100％的氨基酸序列同一性。“NspA多肽”可以包含一氨基酸序列，其与图44中所示的氨基酸序列中的20至174个氨基酸中的约75个氨基酸至约100个氨基酸、或约100个氨基酸至约155个氨基酸的连续链具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％、或100％的氨基酸序列同一性。在某些情况下，所述NspA多肽缺少信号序列；在其他情况下(例如，在宿主细胞中表达)，所述NspA多肽包括信号序列。
剂量方案可以是单剂量方案或多剂量方案(例如，包括加强剂量)，所述多剂量方案在不同时间给予单位剂型的抗原性组合物。本申请中所用的术语“单位剂型”是指适用于人和动物对象的可作为单位剂量的物理上不连续的单位，各单位含有足以产生目标效果的预定含量的本发明抗原性组合物，所述组合物与药学上可接受的辅料(例如，药学上可接受的稀释剂、载体或溶剂)结合提供。所述抗原性组合物可与其他免疫调节剂联合给药。
在药学上可接受的辅料，或粉末中提供抗原性组合物，所述辅料可以是溶液，如无菌水性溶液，通常是生理盐水溶液。如有必要，所述辅料基本上是惰性的。
在某些实施例中，对象免疫原性组合物包含存在于囊泡中的对象fHbp。在某些实施例中，对象免疫原性组合物包含存在于MV中的对象fHbp。在某些实施例中，对象免疫原性组合物包含存在于OMV中的对象fHbp。在某些实施例中，对象免疫原性组合物包含含有对象fHbp的MV与OMV的混合物。上文中已描述了囊泡，例如如MV和OMV。
抗原性组合物可以进一步包含佐剂。可用于人体的已知适宜佐剂的例子包括，但不一定限于：明矾、磷酸铝、氢氧化铝、MF59(4.3％w/v角鲨烯、0.5％w/v吐温80TM、0.5％w/v司盘85)、含CpG的核酸(其中胞嘧啶未甲基化)、QS21、MPL、3DMPL、Aquilla提取物、ISCOMS、LT/CT突变体、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、Quil A、白介素，等等。对于实验动物，可使用弗氏佐剂、N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称为正-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二-棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，称为MTP-PE)、以及RIBI，所述RIBI含有在2％角鲨烯/吐温80乳液中提取自细菌的三种组分：单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。可通过检测针对免疫原性抗原或其抗原表位的抗体量来测定佐剂的效力。
能够提高所述组合物效力的进一步示例性佐剂包括，但不限于：(1)水包油乳剂(含有或不含其他特异性免疫刺激剂，例如胞壁酰肽(见下文)或细菌细胞壁组分)，例如例子(a)MF59TM，含有5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85(任选地含有MTP-PE)(WO 90/14837；Chapter 10in Vaccine design:the subunit and adjuvant approach,eds.Powell&Newman,Plenum Press 1995)，利用微流化仪制成亚微米颗粒；(b)SAF，含有10％角鲨烯、0.4％吐温80、5％普朗尼克嵌段聚合物L121、以及thr-MDP，微流化为亚微米乳液，或旋振产生粒径较大的乳液，和(c)RIBI TM佐剂系统(RAS)(RibiImmunochem,Hamilton,Mont.)，含有2％角鲨烯、0.2％吐温80、以及一种或多种细菌细胞壁组分，例如单磷脂酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(Detox TM)；(2)皂苷佐剂，例如可以使用QS21或StimulonTM(Cambridge Bioscience,Worcester,Mass.)或由其产生的颗粒，例如ISCOM(免疫刺激复合物)，所述ISCOMS可缺乏额外的去垢剂，例如WO 00/07621；(3)完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；(4)细胞因子，例如白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(WO99/44636)等)、干扰素(例如，γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(5)单磷酰脂质A(MPL)或3-O-脱酰基MPL(3dMPL)，例如见GB-2220221、EP-A-0689454，任选地，当与肺炎球菌糖联用时，基本上不含明矾，例如WO 00/56358；(6)3dMPL与，例如，QS21和/或水包油乳液的组合物，如EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231；(7)含有CpG基序的寡核苷酸(Krieg Vaccine 2000,19,618-622；Krieg Curr opin MolTher2001 3:15-24；Roman et al.,Nat.Med,1997,3,849-854；Weiner et al.,PNAS USA,1997,94,10833-10837；Davis et al,J.Immunol,1998,160,810-876；Chu et al.,J.Exp.Med,1997,186,1623-1631；Lipford et al,Ear.J.Immunol.,1997,27,2340-2344；Moldoveami e/al.,Vaccine,1988,16,1216-1224,Krieg et al.,Nature,1995,374,546-549；Klinman et al.,PNASUSA,1996,93,2879-2883；Ballas et al,J.Immunol,1996,157,1840-1845；Cowdery et al,J.Immunol,1996,156,4570-4575；Halpern et al,Cell Immunol,1996,167,72-78；Yamamoto etal,Jpn.J.Cancer Res.,1988,79,866-873；Stacey et al,J.Immunol.,1996,157,2116-2122；Messina et al,J.Immunol,1991,147,1759-1764；Yi et al,J.Immunol,1996,157,4918-4925；Yiet al,J.Immunol,1996,157,5394-5402；Yi et al,J.Immunol,1998,160,4755-4761；和Yi et al,J.Immunol,1998,160,5898-5906；国际专利申请WO 96/02555、WO 98/16247、WO98/18810、WO 98/40100、WO 98/55495、WO 98/37919和WO 98/52581)，即含有至少一个CG二核苷酸，其中胞嘧啶未甲基化；(8)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯，例如WO99/52549；(9)聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂与辛苯聚醇的组合物(WO 01/21207)，或聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂与至少一种其他非离子表面活性剂，例如辛苯聚醇的组合物(WO 01/21152)；(10)皂苷和免疫刺激性寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)(WO 00/62800)；(11)免疫刺激剂和金属盐颗粒，例如WO 00/23105；(12)皂苷和水包油乳剂，例如WO 99/11241；(13)皂苷(例如，QS21)+3dMPL+IM2(任选+激素)，例如WO 98/57659；(14)用作免疫刺激剂来提高所述组合物效力的其他物质。胞壁酰肽包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-25乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(正-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰基-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)等。特别优选的是适于向人给药的佐剂。
抗原组合物可以包含其他成分，例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、镁、碳酸盐，等等。所述组合物可以根据需要含有药学上可接受的辅助物质来模拟生理条件，例如pH调节和缓冲剂、毒性调解剂，等等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠，等等。
制剂中对象fHbp的浓度可以在大范围内变动(例如，以体重计，从小于约0.1％，通常是或至少是约2％到多达20％至50％或更高)，主要按照所选择的具体给药方式和患者的需要，根据液体体积、粘度、以及基于患者的因素来选择。
包含fHbp的制剂可以以溶液、混悬液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、凝胶、乳膏、洗剂、软膏、气雾剂等形式提供。已知口服给药时需要保护组合物以免其被消化。一般通过将组合物制成耐酸解和酶解的制剂，或使用适宜的抗性载体对组合物进行包衣来保护组合物。保护不被消化的方法为本领域的公知常识。
还可以提供包含fHbp的制剂，使得fHBP的血清半衰期在给药后增加。例如，当将单独的fHbp制成注射剂时，所述fHbp可以制成脂质体制剂，制成胶体，或其他能够延长血清半衰期的传统制剂。可以采用多种方法制备脂质体，参见，例如Szoka et al.,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467(1980)，U.S.专利号4,235,871、4,501,728和4,837,028。所述制剂还可以制成控释或缓释制剂。
免疫接种
本发明提供了一种在哺乳动物宿主中诱导至少针对一种奈瑟菌属菌株产生免疫应答的方法。所述方法通常涉及给予所需个体有效量的对象免疫原性组合物。
一般向处于获得奈瑟菌属疾病风险的人给药包含fHbp的抗原性组合物，以预防或至少部分阻止疾病及其并发症的发展。将足以实现此目的的用量定义为“治疗有效量”。治疗有效量取决于，例如抗原性组合物、给药方式、患者的体重和总体健康状况，以及处方医师的判断。所述抗原性组合物是单剂量给药还是多剂量给药，取决于患者所需和可耐受的剂量和频率，以及给药途径。
通常给予宿主有效量的包含fHbp的抗原性组合物以引发免疫应答，特别是体液免疫应答，例如杀菌性抗体应答。如上文所述，免疫接种的量可以发生改变，其通常用量范围为约1μg至100μg/70kg患者，更常见5μg至50μg/70kg。口服、鼻部或局部给药基本上可采用较高的剂量(例如，10mg至100mg或更高)。初次给药后可用相同或不同的包含fHbp的抗原性组合物进行加强免疫。通常疫苗接种至少加强一次，更常见加强两次。
一般情况下，免疫接种可以通过任何适宜的途径给药，包括口服、鼻部、鼻咽部、胃肠外、肠道、胃部、局部、皮下、肌肉内，以片剂、固体、粉末、液体、气雾剂形式，局部或全身性给药组合物，可以加入或不加入辅料。有关本领域技术人员已知或明白的制备可胃肠外给药的组合物的实际方法的更详细描述，参见，例如Remington'sPharmaceutical Science,第15版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1980)。
可以通过已知方法评估抗fHbp的免疫应答(例如，分别于首次免疫接种前后收集个体的血清，通过例如免疫沉淀检测，或ELISA、或杀菌试验、或Western印迹、或流式细胞检测等，证明个体的免疫状况改变)。
可以向人对象给药所述抗原性组合物，所述人对象没有经脑膜炎奈瑟球菌免疫(immunologically naive)。在一个特定实施例中，所述对象为约5岁或更小的儿童，优选约两岁或更小的儿童，所述且所述抗原性组合物在一个或多个以下时间给药：出生后两周、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个月，或1年或15、18或21个月，或在2岁、3岁、4岁或5岁时。
一般希望在疾病症状首次体征出现前，或在首次出现可能或实际接触感染或疾病(例如，由于接触或感染奈瑟菌属)的体征时进行首次免疫接种。
筛选方法
在一个例子中，评估对象fHbp在疫苗组合物中有效性的方法包括：(a)使用包含本发明fHbp的组合物免疫宿主动物(例如，非人哺乳动物宿主动物，例如啮齿类，例如小鼠)；以及(b)检测宿主中杀菌性抗体的水平。所述对象方法还可以包括评估宿主动物对细菌性病原体的易感性，向所述宿主动物给药包含对象fHbp的疫苗。
在另一个例子中，所述方法可以包括制备和鉴定所述对象fHbp引发的抗体。所述方法包括，从宿主动物中分离对fHbp具有结合亲和性的抗体，将细菌细胞与所述分离的抗体接触；以及评估所述抗体与所述细菌细胞的结合。附加步骤可以包括，评估针对fHbp的抗体与人H因子的竞争性结合；当向具有细菌性病原体的动物给药所述抗体时，评估针对细菌性病原体的杀菌活性。在某些实施例中，抗体在抗体群中，并且所述方法可以进一步包括：从与所述抗体群中分离一种或多种结合所述细菌细胞的抗体。一个具有特色的方面是，分离的抗体对细菌细胞具有杀菌性，例如，通过补体介导的杀菌活性和/或噬菌细胞活性，所述活性能够降低细菌在人血液中的生存能力。
特别优选的细菌性病原体为脑膜炎奈瑟球菌多种荚膜群的任何或全部变体群，如脑膜炎奈瑟球菌血清群B、脑膜炎奈瑟球菌血清群C、脑膜炎奈瑟球菌血清群X、脑膜炎奈瑟球菌血清群Y、脑膜炎奈瑟球菌血清群W-135，等等。
评估对FHBP应答的方法
本发明提供了确定fHbp在个体中引发杀菌性应答可能性的方法；以及评估适于加入免疫原性组合物的fHbp变体的方法。
确定fHbp引发杀菌性应答的可能性
本发明提供了一种确定fHbp(例如，存在于奈瑟菌属疫苗中的fHbp)在个体中针对至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株引发杀菌性应答可能性的方法。所述方法通常包括，确定抗体抑制fH与fHbp结合的能力，所述抗体存在于从已免疫fHbp的个体获得的血清中。所述抗体对fH与fHbp结合的抑制水平比对照抗体对fH与fHbp结合的抑制水平至少高约10％、至少高约25％、至少高约50％、至少高约75％、至少为约2倍、至少为约10倍、至少为约50倍、至少为约100倍、或高于100倍，所述对照抗体抑制fH与fHbp的结合，但不产生杀菌性应答，则表明fHbp可能针对至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株引发出杀菌性应答。在某些实施例中，如上文所述，所述fHbp是非天然存在的fHbp，其对人H因子(fH)的亲和性低于fHbp ID 1。
可以采用本申请所述的检测方法，或任何其他已知的检测方法确定fHbp变体引发的抗体抑制fH与fHbp结合的程度。例如，所述fH和/或所述fHbp可以包含可检测标记，通过检测在fH/fHbp复合物中存在的标记组分的量，和/或检测在游离fH和/或游离fHbp(例如，不在fH/fHbp复合物中的fH或fHbp)中存在的标记的量，可以确定fH/fHbp结合的抑制。
在一个例子中，评估fH与fHbp结合的检测方法包括，使用固定于支持物上的fHbp(例如，固定于酶标板孔中的fHbp)。在孔中加入混合物，所述混合物含固定浓度的人fH与待测抗体的稀释物(例如，抗血清，例如，来自接受过抗体激发剂量的免疫原性组合物的人或非人受试动物(例如，小鼠))，并孵育足够长的时间以供抗体结合。洗涤孔后，使用含有标记组分的特异性抗fH抗血清(例如，山羊或驴)，或第二标记抗体(例如，家兔抗山羊或抗驴抗血清)检测结合的fH。通过未加入人或小鼠抗体时结合fH的量，可以计算结合fH的抑制百分率。
在此类检测的另一个变化方式中，利用流式细胞术评估在待测抗血清存在或不存在时，fH与活细菌的结合。将细菌细胞与固定浓度的fH(例如，可检测的标记fH)和含有抗体的待测血清的不同稀释物共同孵育。洗涤细菌并检测结合的fH(例如，如上文所述)。
因此，评估来自经fHbp免疫的个体的抗血清抑制fH/fHbp结合的能力，可以代替直接评估所述抗血清的杀菌性活性。本发明中用于确定fHbp在个体中引发杀菌性应答可能性的方法，可以向临床医师或其他医疗人员提供信息，确定特定免疫原性组合物是否已在个体中引发有效的杀菌性应答。
用ELISA测定免疫个体，他们具有相似的血清IgG抗fHbp抗体滴度。如果抗血清在总体上提供更好的fH结合抑制，则表明产生了更为有效、质量更高的抗-fHbp抗体应答，并且会提供更好的保护。因此，例如，在比较两个个体产生的抗奈瑟菌属抗体应答时(通过比较抗-fHbp抗体，即，将1:10,000血清稀释物的抑制与其他个体1:3000稀释物相比)，抑制活性更高的个体具有的抗fHbp抗体质量更高，将提供更好的保护。因此，可以将fH抑制检测用于替代补体介导的杀菌性滴度检测，与fH抑制相比，补体介导的杀菌性滴度检测通常需要花费更多时间，且其检测难度也更大。
评估fHbp变体
本发明提供了评估或预测fHbp变体在个体中有效引发杀菌性抗体应答可能性的方法。所述方法通常包括评估对fHbp变体具有特异性的抗体抑制fH与fHbp结合的能力。由fHbp变体免疫引发的抗体对fH与fHbp结合的抑制强度，与所述fHbp变体引发的抗体的杀菌活性呈正相关。如果fHbp变体引发的抗体能在较高的血清稀释度下抑制fH与fHbp结合，则可以考虑作为适宜的疫苗候选物，用于引发针对一种或多种奈瑟菌属菌株的保护。
例如，本发明提供了一种确定非天然存在的fHbp在个体中针对至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株引发杀菌性抗体的可能性的方法，所述fHbp对人fH的亲和性低于fHbp ID 1。所述方法通常包括，确定在非人受试动物中由非天然存在的fHbp引发的抗体抑制fH与fHbp结合的能力。所述由非天然存在的fHbp引发的抗体对fH与fHbp结合的抑制水平比在非人受试动物中由fHbp ID 1引发的抗体对fH与fHbp结合的抑制水平至少高约10％、至少高约25％、至少高约50％、至少高约75％、至少为约2倍、至少为约10倍、至少为约50倍、至少为约100倍、或高于100倍，表明所述非天然存在的fHbp有可能引发针对至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株的杀菌性应答。
适宜的非人受试动物包括，例如，小鼠、大鼠、家兔，等等。可以采用本申请所述的检测方法，或任何其他已知的检测方法确定fHbp变体引发的抗体抑制fH与fHbp结合的程度。采用本申请所述的检测方法，或任何其他已知的检测方法可以很容易地确定抗体的杀菌活性。
对某给定的与人fH的亲和性低于fHbp ID 1的非天然存在的fHbp，确定其在个体中针对至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株引发杀菌性抗体可能性的方法，可以在例如疫苗开发过程中，用于鉴定适宜的免疫原(和/或消除不适宜的免疫原)。
实施例
应该理解，本申请所述的例子和实施例只是为了说明目的，本领域技术人员鉴于这些例子和实施例可提出各种改进或变化，这些改进和变化应包括在本申请的构思和权限以及附加的权利要求书的范围内。本申请引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的而整体参考并入。
实施例概述
H因子(fH)在血清中以较高浓度(～200至800μg/ml)存在。fH与fHbp的结合对人fH具有特异性(Granoff et al.(2009)Infect Immun 77:764)。一种含意为，当使用fHbp对人进行免疫时，分子能够与fH形成复合物。相反地，当非人灵长类或其他实验动物被免疫时，抗原存在于免疫系统，但不与fH结合。在人类中，fH与fHbp的复合物可能影响fHbp的免疫原性(例如，通过覆盖表位和影响抗原呈递)。
本申请提供了证据表明，人fH的存在会降低与fH结合的fHbp疫苗的保护性抗体应答。而且，虽然具有一个或两个氨基酸取代的某些突变疫苗不与fH结合(例如，E218A和/或E239A)，但是用于改变分子的特异性突变导致了改变，即降低了疫苗引发血清杀菌性抗体的能力。已确定，其他的单氨基酸突变体(例如，fHbp ID 1的R41S或R41A突变体；fHbp ID 4、9、74或嵌合fHbp I的R41S突变体；fHbp ID 1的R130A突变体；fHbp ID 22的R80A、D211A、E218A、E248A、或G236I突变体；fHbp ID 22的T220A/H222A突变体；fHbp ID 77的R41S/K113A、R41S/K119A、R41S/D121A、或R41S/K113A/D121A突变体；以及fHbp ID 28的K199A或E218A突变体)与fH的结合降低。具有R41S突变的fHbp疫苗引发杀菌性抗体的能力不会降低，并且在存在人fH时，其比与fH结合的野生型fHbp ID 1疫苗具有更高的保护性抗体应答。其他突变，例如fHbp ID 1的K241E或来自于fHbp ID 1晶体结构的fHbp ID 15的E241K，预计将与fH接触，但对fH结合没有影响。此外，R41S突变，在fHbp ID 1、4、9、和74中减少fH结合，在fHbp ID 22或77中不会减少fH结合。减少fH结合但对fHbp的构型具有极小影响或无影响的突变(如fHbp ID 1中的R41S，以及下文中讨论的其他突变)，使得突变体疫苗引发杀菌性抗体，可以作为非常好的疫苗候选物。因此，fHbp变体维持并呈递构型表位，所述表位与杀菌性抗体结合，所述抗体具有针对一种或多种脑膜炎奈瑟球菌菌株的杀菌性活性。
揭示本发明的研究的详细情况如下文所示。
材料和方法
人fH转基因小鼠模型。将3.9kbp人补体fH(cfh)cDNA克隆至质粒pCAGGS(Niwa etal.(1991)Gene108:193-9)。将～6kbp SalI-PstI限制性片段显微注射至BALB/c小鼠的胚胎，并植入假性妊娠雌性BALB/c小鼠。通过Western印记检测胎仔血清中人fH的表达。
血清中人fH的浓度。为区分人与小鼠的fH，使用了特异性与人fH结合的fHbp捕获酶联免疫吸附试验(ELISA)。将在无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中的重组fHbp(2μg/ml)加入酶标板的各孔中。经1％牛血清白蛋白(BSA)封闭后，加入未经免疫的小鼠或人血清的稀释物。使用绵羊抗人fH抗血清(Lifespan Biosciences,Seattle,WA；1:2000稀释)检测结合的人fH。使用与碱性磷酸酶偶联的抗绵羊IgG对ELISA显色。加入磷酸酶底物p-硝基苯磷酸酯(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)，然后室温条件下孵育30min，在405nm处测定光密度。通过与含471μg/ml fH的人对照血清稀释物进行比较确定fH的浓度。作为对照，对旧金山湾地区成人受试者的25份血清中的fH进行检测，这些受试者参与了经IRB批准的一项试验，以筛选作为血清杀菌性检测补体来源的正常血清。
重组fHbp疫苗。按照已描述的方法对野生型fHbp和R41S突变蛋白重组体进行纯化(Beernink PT et al.(2008)Infect Immun76:2568-2575)。采用已经过马萨诸塞大学医学院动物饲养和使用委员会批准的试验方案，在六至八周龄的BALB/c野生型或人fH转基因小鼠中评估疫苗的免疫原性。腹腔注射给予三剂量含20μg fHbp的疫苗，每次间隔三周，所述fHbp吸附于600μg氢氧化铝。对照脑膜炎球菌群C偶联疫苗(Meningitec；Wyeth,Montreal,Canada)含有吸附于100μg磷酸铝上的2μg多糖和3μg CRM197。
统计学分析。采用双侧学生氏t检验比较两个独立的小鼠组之间血清抗体应答几何平均滴度(GMT)的倒数。还使用了单侧t检验以检验，经野生型fHbp疫苗免疫的转基因小鼠的抗fHbp抗体应答是否不低于经免疫的野生型小鼠。采用一般线性回归模型检验fHbp疫苗的类型和人fH的浓度是否影响血清杀菌性抗体应答。为符合正态假设，在回归和相关性分析中，对血清杀菌性抗体检测结果和fH的浓度进行了log10转换。双侧P值小于或等于0.05被认为具有统计学意义。
实施例1：人 F H的结合降低 F H BP 疫苗的免疫原性。
fH与fHbp的结合可能会覆盖表位，并削弱针对细菌表面暴露的fHbp分子部分的抗体应答，该部分对杀菌活性最为有效。因为人fH与fHbp的结合特异性针对人fH，所以使用人fH转基因动物模型研究fH对疫苗免疫原性的影响。使用上文所述的fHbp捕获ELISA检测转基因小鼠的血清中人fH的浓度，所述检测对人fH具有特异性。对照孔中含有浓度范围为0.15至5μg/ml的纯化人fH(图1，列A)。实验孔含有转基因小鼠的不同血清稀释物(从1:100开始以2倍的比例倍比稀释)。转基因小鼠的血清中，人fH的浓度>100μg/ml。血清H因子阴性的同窝小鼠中的浓度<12μg/ml，其低于检测限。已知野生型小鼠中的人fH也<12μg/ml。相比之下，成人补体供体的储存血清样品中fH浓度>100μg/ml(图1，列B)。在下文所述的实验中，<12μg/ml的转基因小鼠的同窝小鼠或已知的野生型小鼠将被称为“野生型”小鼠。
在研究1中，使用与人fH结合的重组fHbp疫苗免疫人fH转基因或野生型小鼠(下表1)。第三次疫苗注射三周后，转基因小鼠的血清杀菌性抗体应答比血清fH与疫苗不结合的野生型小鼠低8倍(GMT的倒数为59对比野生型小鼠的453，P＝0.03)。研究1中未包括不与fH结合的对照疫苗。因此，应确定转基因小鼠中的fHbp疫苗免疫原性降低是不是疫苗抗原与人fH结合的结果，或者小鼠是不是可能对一般性的疫苗抗原具有更低的血清抗体应答。在研究2中，重复接种fHbp，其中包括使用对照脑膜炎球菌群C多糖-CRM197偶联疫苗免疫的转基因和野生型小鼠组，所述疫苗不与人fH结合。经脑膜炎球菌偶联疫苗免疫的转基因小鼠的代表性血清IgG和杀菌性抗体应答与在野生型小鼠中得到的结果相比不存在显著性差异(图2)。如在研究1中所观察到的，在研究2中使用与人fH结合的fHbp疫苗免疫的转基因小鼠具有更低的血清杀菌性抗体应答(GMT的倒数为31对比野生型小鼠的115，P＝0.05，单侧T检验)。而且，转基因小鼠血清中的人fH浓度与同人fH结合的fHbp疫苗的血清杀菌性抗体应答之间呈负相关(图3，列A；皮尔森相关系数，r＝-0.65；P＝0.02)。因此，人fH血清浓度越高，对疫苗的血清杀菌性应答越低。
在这两项研究中，转基因小鼠的血清IgG抗fHbp抗体应答低于野生型小鼠(研究1，GMT的倒数为30,000对比97,000，P＝0.03；研究2，GMT的倒数为107,000对比190,000，P＝0.025)。总的数据表明，人fH与fHbp疫苗的结合同时削弱了IgG抗fHbp抗体的滴度和杀菌性抗体应答。
表1.经与人fH结合的重组fHbp疫苗免疫的野生型小鼠或人fH转基因小鼠的补体介导的血清杀菌性抗体应答
与fH结合的WT fHbp疫苗。a,bP＝0.03(双侧)；c,d P＝0.05(单侧)，假设基于研究1的结果。
实施例2：在位置218和/或239突变的 F H BP 导致与 F H的结合减少。
发现在谷氨酸残基219和239(E218和E239)有两个丙氨酸取代的fHbp突变体可以消除fH结合(Schneider MC et al.(2009)Nature 458:890-3)。通过已描述的Ni2+亲和层析进行纯化制备重组fHbp E218A、E239A和E218A/E239A突变体(Beernink et al(2010)ClinVaccine Immunol 17:1074-8)。如上文所述，采用纯化的重组突变体或WT fHbp作为抗原在酶标板上通过ELISA测定人fH与fHbp突变体的结合。使用该方法确认双突变体减少了fH的结合(图4)。而且，在E218或E239单突变的fHbp突变体也能够减少人fH的结合(图4)。
实施例3： F H BP 的E218A和/或E239A突变体在野生型小鼠中具有削弱的免疫原性。
将野生型ID 1fHbp和E218A/E239A双突变fHbp分别进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。利用Ni2+亲和层析纯化在大肠杆菌中表达的重组fHbp，在凝胶中上样5μg纯化蛋白。将NuPAGE 4-12％聚丙烯酰胺梯度凝胶(Invitrogen,Carlsbad,CA)在MES缓冲液(Invitrogen)中200V电泳45min，并使用Simply Blue Safe Stain(Invitrogen)染色。分子量标准品为Kaleidoscope Broad Range(Bio-Rad,Richmond,CA)。利用考马斯亮蓝染色对蛋白进行目测检查，其具有相似的重量和纯度(图5)。
对野生型fHbp ID 1和E218A/E239A双突变体均进行抑制ELISA(Beernink et al(2010)Clin Vaccine Immunol 17:1074-8)。使用2μg/ml的重组fHbp(ID 1)在4℃条件下将ELISA板包被过夜。经PBS/1％BSA封闭后，将小鼠抗fHbp MAb(0.5μg/ml的JAR 1或JAR 4；0.1μg/ml的mAb 502或JAR 5)与初始浓度为50μg/ml(终浓度)并按照五倍的比例倍比稀释的可溶性重组蛋白抑制剂稀释物预混合后，加入酶标板的各孔中，在37℃条件下孵育1h。使用碱性磷酸酶偶联的山羊抗小鼠IgG(1:10,000；Sigma-Aldrich)在室温条件下孵育1h检测MAb的结合。如实施例1所述，对酶标板进行显色。结果显示，与野生型fHbp相比，在E218A/E239A双突变体中存在由四个抗fHbp MAb识别的表位，其根据可溶性突变体或野生型蛋白抑制各mAb与吸附于酶标板各孔中的野生型fHbp结合的能力进行判断(图6)。
还确定了fHbp的热稳定性。使用PBS(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)在4℃条件下将纯化的重组蛋白透析过夜。利用280nm处的UV吸光度测定浓度，摩尔消光系数为0.8940M-1cm-1，并且将浓度调整至0.5mg/ml。分别将Degassed蛋白溶液和PBS上样至VP-DSC微量热计(MicroCal,Northampton,MA)的样品孔和对照孔。加热速率为60℃/h，使用中间的增益设置。使用缓冲液对比缓冲液扫描对数据进行基线校正，根据蛋白浓度进行归一化处理。E218A/E 239A双突变体与野生型蛋白具有相似的热稳定性(图7A)，R41S突变体亦是如此(图7B)。
在利用小鼠进行的四项研究中测定了fHbp ID 1野生型(WT)和E218A/E 239A突变体疫苗的免疫原性(研究3-6)。在研究3中，使用吸附于弗氏佐剂(FA)或氢氧化铝(Al(OH)3)的重组WT或突变fHbp对CD-1小鼠进行三个剂量的免疫；在研究4中，使用吸附于氢氧化铝(Al(OH)3)的野生型(WT)或突变fHbp对CD-1小鼠进行一个剂量的免疫；在研究5和6中，使用吸附于氢氧化铝(Al(OH)3)的WT或突变fHbp对BALB/c小鼠进行三个剂量的免疫。在研究3中，血清是混合的(每个疫苗组3个混合物，各混合物来自3至4只小鼠的血清)。在研究4、5和6中，分别对各个血清进行检测(每个疫苗组N＝7至9只小鼠)。
为检测血清抗fHbp IgG的滴度，使用2μg/ml重组fHbp ID 1在4℃条件下将ELISA板活化过夜。经PBS/1％BSA封闭后，将小鼠抗血清稀释物(从1:100开始按照五倍的比例倍比稀释)加入酶标板的各孔中，将板在37℃条件下孵育1h。使用山羊抗小鼠IgG(1:10,000；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)在室温条件下孵育1h检测结合的抗fHbp抗体。使用p-硝基苯磷酸酯底物(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)在室温条件下孵育30min对板进行显色，在405nm处测定光密度。
如图7C和D所示，在所有四项研究中(研究3、4和5，图7C；研究6，图7D)，与对照野生型fHbp疫苗相比，在常规BALB/c或CD-1小鼠中，E218A/E239A双突变体的血清IgG抗fHbp抗体应答降低。在研究4、5和6中，当采用对各只动物的血清进行检测代替研究3中使用混合血清进行检测后，其差异均具有显著性(P<0.05)。研究6中(图7D)还包括了具有单氨基酸取代E239A的fHbp突变体疫苗，所述疫苗的IgG滴度低于WT fHbp疫苗(p＝0.05)。
下表2中汇总了针对群B菌株H44/76进行检测的对E218A/E 239A突变体疫苗的血清杀菌性抗体应答。在所有研究中，突变体疫苗引发了更低的血清杀菌性滴度。在研究4、5和6中的差异均具有显著性(P<0.05)。
在这些研究中，双突变或野生型fHbp均不结合小鼠fH。尽管如此，E218A/E239A突变体的免疫原性更低表明，双突变的引入干扰了对引发保护性杀菌性抗体十分重要的表位。因此，消除fH结合的E218A/E239A突变不一定能维持最佳结构的疫苗特征，以引发保护性抗体。
表2.经fHbp E218A/E239A突变体疫苗免疫的野生型小鼠的补体介导的血清杀菌性抗体应答。
实施例4：使 F H结合减少的天然 F H BP 变体的鉴定。
在针对此前已经描述的亚家族B(Fletcher et al(2004)Infect Immun72:2088-2100)也称为变体1群(Masignani et al.(2003)，如上所述)中的天然存在的fHbp变体与fH结合的研究中，两个fHbp变体的重组蛋白，ID 14和15，显示出的浓度依赖性fH结合显著性地低于fHbp蛋白ID 1(图8)。相反地，fHbp ID 14显示了预期的与抗fHbp MAb JAR 4和JAR 5的浓度依赖性结合，并且fHbp ID 15显示了预期的与抗fHbp mAb JAR 5而非JAR 4的结合(注释，预计fHbp ID 15不与JAR 4结合，因为该蛋白缺乏这个表位)(Beernink et al.(2009)Mol Immunol 46:1647-1653；Pajon et al.(2009)Vaccine 28:2122-2129)。
此前的数据表明，变体群1、2或3的fHbp与fH的结合相似(Shaughnessy J et al.(2009)Infect Immun 77:2094-103)。这样，两个天然存在的fHbp变体(如图8所示的fHbp ID 14和15)与fH结合的减少是预料之外的。
图8显示这两个天然存在的fHbp变体具有较低的fH结合，从中获得的数据显示，可以通过对fH高结合蛋白和fH低结合蛋白的fHbp氨基酸序列进行比对分析，来鉴定促成这种fH结合降低的氨基酸残基。该策略与靶向至保守残基，例如E218A和E239A残基不同。
可以根据五个可变片段的不同组合对fHbp变体进行进一步分类，其均衍生自命名为α-或β-型的两个遗传谱系之一(Pajon et al.(2009)Vaccine28:2122；Beernink and Granoff(2009)Microbiology 155:2873-83)。具有fH高结合的fHbp ID 1和具有fH低结合的ID 14均来自模块群I(全部五个片段均为α-型)。相反地，另一个fH低结合蛋白fHbp ID 15来自于模块群IV，是天然的嵌合体(具有β-型A片段和α-型B、C、D和E片段)。因此，使用了天然的fH高结合变体肽ID 28的序列作为肽ID 15βA片段的对照，其仅含有β片段(模块群II)。各氨基酸比对参见图19A和图19D。出于比较不同变体序列的目的，在本申请中使用fHbp ID 1的编号指代特定残基。这些氨基酸残基之一，肽15(fH低结合)的A(β)片段的位置41的丝氨酸(S)，不同于对照肽28(fH高结合)的Aβ片段的脯氨酸(P)残基。另一个氨基酸，在这两个fH低结合变体的Eα片段中位置241的E与fH高结合变体肽1中位置241的K不同。
实施例5：使 F H结合减少的在位置41突变的新 F H BP 的鉴定。
位置41的精氨酸残基(R41)与fH之间形成带电的氢键(图9，列A)。将精氨酸替换为丝氨酸后，将该带电的键消除(S41，右下图)。使用重组WT fHbp ID 1或R41S突变体ID 1包被酶标板的各孔。ELISA检测结果显示，所述R41S突变体不与人fH结合(图10，列A)。对照抗fHbp MAb、JAR 4和JAR 5，与fHbp突变体和野生型fHbp的结合几乎相当(图10，列B和列C)。这些对照表明，酶标板各孔吸附的蛋白量相当。而且，R41S突变并不影响MAb的结合，所述突变与JAR 4MAb识别的fHbp构型表位在相同结构域，且非常接近(Beernink PT(2009)Mol Immunol46:1647-53)。在fHbp ID 1中将丙氨酸替换为精氨酸的另一个突变R41A也不与fH结合(图10A)。因此，在位置41的非丝氨酸的取代也能够减少与fH的结合。
在表面等离子体共振实验中，通过胺基偶联将人fH(2400个响应单位)固定在CM5芯片(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上，对可溶性fHbp的结合进行检测。R41S突变蛋白(0.5μM)不与fH结合(-0.6个响应单位)，而相比之下，0.5μM的野生型fHbp抗原为+22.5个响应单位，其独立地确认了ELISA的结果。R41S突变蛋白与野生型fHbp相比，也具有热稳定性(图7，列B)。
当将突变引入模块群I中变体群1的其他fHbp序列变体时，R41S突变也能够消除fH结合。这些变体包括fHbp ID 4、9、和74(图11，分别为列A、列C、和列E)。然而，在变体群2(模块群III或VI)的三个序列变体中，R41S突变并不减少fH结合。这些变体包括fHbp ID 19、22和77(图12，分别为列A、列C、和列E)。
实施例6：野生型小鼠中 F H BP R41S突变体的免疫原性。
在野生型小鼠中，R41S突变体fHbp(ID 1)疫苗引发与野生型疫苗类似的血清杀菌性抗体应答(表3，下文，研究2和6)。在研究6中，双突变体fHbp疫苗E218A/E239A作为阴性对照，此前已报道，所述疫苗不与fH结合(Schneider MC et al.(2009)Nature 458:890-3)，但在WT小鼠中免疫原性削弱(Beernink et al.(2010)Clin VaccineImmunol17:1074)。该疫苗引发显著降低的杀菌性滴度(表3，研究6)，因此确证了已在上表2中描述的数据，表2显示对E218A/E239A疫苗的抗体应答降低，因为突变体分子可能丧失了表位或出现了微小的失稳作用(Beernink et al.(2010)Clin Vaccine Immunol 17:1074-8)。相反地，对R41S突变体fHbp疫苗的正常抗体应答表明，由丝氨酸代替精氨酸后，在小鼠模型中并没有降低免疫原性，在所述模型中fH不与突变体或野生型fHbp疫苗结合。
表3.经fHbp重组fHbp疫苗免疫的野生型小鼠的补体介导的血清杀菌性抗体应答。
WT fHbp疫苗结合人fH；R41S突变体和之前描述的E218A/E239突变体(Schneider etal.(2009)Nature 458:890-3)不结合人fH。在WT小鼠中，天然fH与这两种疫苗均不结合(图1，列D)。a,bP＝0.62；c,dP＝0.01；d,iP＝0.92，T检验(双侧)。
实施例7：经R41S突变体 F H BP 疫苗免疫的转基因小鼠的血清杀菌性抗体应答。
经R41S突变体疫苗免疫的人fH转基因小鼠的血清杀菌性抗体应答比经对照野生型fHbp疫苗免疫的人fH转基因小鼠高～3倍，所述R41S突变体疫苗不与人fH结合，所述对照野生型fHbp疫苗与fH结合(研究2，下表4)。当利用血清人fH的浓度对数据进行分层时，fH浓度<250μg/ml的小鼠显示了与突变体和野生型疫苗相似的应答。然而，在人fH浓度>250μg/ml的小鼠中，经R41S突变体疫苗免疫的小鼠的杀菌性抗体应答比经与人fH结合的野生型fHbp疫苗免疫的小鼠高10倍(P<0.05；表4)。
表4.经R41S突变体疫苗免疫的人fH转基因小鼠的血清杀菌性抗体应答。
WT fHbp疫苗结合人fH；R41S突变体不与人fH结合。经野生型疫苗免疫的fH转基因小鼠的数据参见研究2，上表1a,b。使用一般线性回归模型分析，结果显示，血清人fH浓度不同的fHbp R41S突变体或野生型疫苗类型对杀菌性滴度的作用不同，P＝0.018。c,dP>0.5。e，fP＝0.05。
在已免疫的人fH转基因小鼠中，不结合人fH的突变体fHbp疫苗的血清杀菌性抗体应答，与血清中人fH的浓度之间没有显著的相关性(图3，列B；r＝+0.17；P＝0.58)，然而如上文所述(图3，列A)，在转基因小鼠中，结合fH的野生型疫苗引发的杀菌性滴度与之呈负相关(r＝-0.65；P＝0.02)。两种疫苗之间的相关系数存在显著性差异(P＝0.03)。
采用一般线性回归模型确认fHbp疫苗的类型(fHbp野生型或R41S突变体)或血清人fH的浓度是否影响转基因小鼠的血清杀菌性抗体应答。在fHbp疫苗的类型和人fH浓度与杀菌性应答之间存在显著的相互作用(似然比检验，P＝0.018)。基于回归模型，估算在不同的血清人fH浓度下，经R41S突变体疫苗免疫的转基因小鼠与经结合人fH的fHbp疫苗免疫的转基因小鼠的血清杀菌性GMT倒数的比率(图3，列C)。当血清人fH浓度较低时(<250μg/ml)，杀菌性应答无显著性差异，但当血清fH浓度较高时(fH>250μg/ml，P<0.05；fH>316μg/ml，P<0.01)，对R41S突变体疫苗的杀菌性应答显著增加。由于多数人的fH浓度在此范围内(图1，列B)，因而在转基因小鼠中的结果提示，不与fH结合的突变体fHbp分子可能在人体内是非常好的疫苗。
上文所述的不同免疫研究的实验方案以及结果汇总于下表。
表5.在人fH转基因小鼠中进行的免疫研究总结。
图2，列D提供了对应于本申请中不同研究的各实验方案的示意图。在图2D各幅示意图上方的数字均与上表中的上标对应。在图2，列D中，群C PS-CRM偶联物是指脑膜炎球菌群C多糖(PS)和交叉反应性突变体白喉毒素(CRM)的偶联物，称为MenC-CRM。
实施例8：经R41S突变体 F H BP 疫苗免疫的转基因小鼠的抗体谱优先与接近 F H结合位点的 表位结合。
检测了覆盖fHbp表位的人fH对具有保护功能活性的抗体引发过程的重要性。利用ELISA检测了存在于转基因小鼠血清1:100稀释物中的内源性人fH与fHbp结合的能力。与预期结果一致，不存在血清抗fHbp抗体时，两个疫苗组和仅给予氢氧化铝的对照转基因(Tg)小鼠组，免疫前血清中的人fH结合接近(图13，列A)。在给予氢氧化铝的对照WT小鼠中无结合，因为天然fH不与fHbp结合。接种疫苗后，在经R41S突变体fHbp免疫的小鼠血清中检测到的“游离”人fH，少于经结合人fH的疫苗免疫的小鼠血清(P＝0.001，图13，列B)，或仅给予氢氧化铝的转基因小鼠的血清(图13，列B)。由于在两个fHbp疫苗组中抗fHbp抗体的IgG滴度接近(图13，列D)，在R41S免疫后血清中可检测的人fH浓度较低，抗-fHbp抗体抑制人fH与fHbp结合的能力高于结合人fH的野生型疫苗引发的抗fHbp抗体，这两点是一致的。在存在5％正常人血清作为fH来源的条件下，还对各只小鼠血清的不同稀释物进行了检测(每组N＝11)。在1:100和1:400的稀释物中，R41S突变体疫苗组的抑制作用显著增加(P<0.03)(图13，列C)。总的来说，在R41S突变体疫苗组的fH抑制增加，提示两种疫苗引发的抗体谱之间存在差异。例如，突变体fHbp疫苗引发的抗体可能更多作用于fH结合位点附近的表位，这些抗体比结合fH的疫苗引发的抗体谱更有效地阻断fH结合。而且，当抗体针对于fHbp中结合fH的表面暴露区域时，预期将具有更强的功能性杀菌活性。
在各只小鼠血清抑制人fH与fHbp结合的能力和血清杀菌性滴度的倒数之间还观察到了明显的相关性(Spearman r值，0.69，且P值为0.0004)(图13，列E)。在血清杀菌性反应中，补体抑制剂fH与待测有机体细菌表面的结合降低，这可能促成了突变体fHbp疫苗引发的杀菌性滴度升高。因此，通过抗fHbp抗体抑制fH结合的能力预测保护性抗体活性的结果显示，R41S疫苗较好。
实施例9： F H结合减少的 F H BP ID 1中其它突变体的鉴定。
位置241位于fHbp ID 1的fH结合表面。研究了在fHbp ID 1序列残基241的氨基酸取代对fH结合的影响。如图14，列A所示，在fHbp ID 1中赖氨酸(K)残基241被谷氨酸(E)取代(K241E)不影响fH的结合。反向取代时，模块群IV中fHbp ID 15的E241K突变体(图14，列C)对fH的结合与野生型fHbp相比也没有明显影响(<2倍；图14，列C)。(氨基酸残基的编号基于fHbp ID 1的序列)。
在fHbp ID 1中，突变在位置R41、H119、R130、和K241。fHbp突变体的生产如上文所述。然后评估R41A、H119A、R130A、和K241E单取代突变体与人fH的结合，以及与MAb的结合。
如图10，列A所示，fHbp ID 1中的R41S取代和R41A取代使与人fH的结合减少。如图10，列B和列C所示，R41S和R41A突变体分别保持与MAb JAR 4和JAR 5的结合，表明在R41S和R41A突变体中保留了这些表位。
如图15，列A所示，fHbp ID 1中的H119A和R130A取代使与人fH的结合减少。如图15所示，与相应的野生型fHbp ID 1(列C)相比，R130A突变体保持与MAb JAR5的结合(列B)，但与MAb JAR4的结合降低。这些数据表明，氨基酸取代后，H119A和R130A突变体中保留了JAR 5表位；部分保留了JAR4表位。
实施例10： F H BP 模块群IV的 F H BP 序列变体的突变体。
对分类为模块群IV变体1的fHbp序列(图16)而言，在变体群1中的“VA”片段是衍生自遗传谱系(β)，这不同于模块群I fHbp序列变体的变体群1中的相应的“VA”片段，其被命名为α片段(Beernink et al(2009)Microbiology 155:2873)。根据pubmlst.org/neisseria/fHbp/网站采用的命名法，还可以分别将α和β谱系命名为谱系1和2。
在模块群IV fHbp氨基酸序列变体中，位置41通常是丝氨酸，而不是精氨酸。在fHbpID 15(模块群IV)的突变体中，由脯氨酸取代丝氨酸(S41P)消除了与fH的结合(图17)。对照蛋白包括重组fHbp ID 1和28(天然fH高结合蛋白)和fHbp ID 15(天然fH低结合蛋白)。如上文所述，利用ELISA检测人H因子或抗fHbp MAb与fHbp的结合。抗fHbpMAb JAR 5与WT fHbp ID 1和15，以及fHbp ID 15的S41P突变体的结合类似(图17，列B)。JAR 31显示了预期的与fHbp ID 28的结合(图17，列C)。
实施例11：模块群III和VI的 F H BP 序列变体中的R41S氨基酸取代不影响 F H的结合。
分类为变体2的所有fHbp序列变体均为天然嵌合体，其含有衍生自α和β谱系的片段(图16)。特别地，在变体2蛋白中的“VA”片段衍生自α谱系，并且其与模块群I一样通常在位置41含有精氨酸(残基的编号基于fHbp ID 1)。尽管已检测发现在所有模块群I蛋白中的R41S均消除了fH结合(图11和10以及表6)，但是变体2群(模块群III或VI)中的fHbp ID 19、22和77的R41S突变并不消除fH结合(图12，列A、C和E，以及表7)。
实施例12：不结合人 F H的合成 F H BP 嵌合蛋白。
图16中的最后一个模块示意图为fHbp嵌合体I(Beernink and Granoff(2008)Infect.Immun.76:2568-75)。fHbp ID 1部分(变体1，模块群I)与fHbp 77部分(变体2，模块群VI)的融合结点在VC片段中的G136。在图16中，将嵌合蛋白中的VC用一半灰和一半白表示，代表该片段是α谱系序列和β谱系序列的融合。当将R41S取代引入变体2fHbp蛋白后，其对fH的结合没有影响(图12，列A、C、和E)。相反地，当将R41S取代插入fHbp嵌合体I蛋白时，突变消除了fH的结合(图18)。该结果是没有预料到的，因为嵌合体I和fHbp ID 77的VA片段之间的氨基酸差异仅为一个氨基酸残基(在嵌合抗原中是Gly30，而不是Ser30；图19)。在VC片段中，位置98至135之间有八个残基不同(图19)，这可能解释了为何在嵌合蛋白中R41S突变消除了fH结合，而在天然变体2蛋白中没有(见图16中的示意图；完整的氨基酸序列见图19A)。这些观察结果暗示，对变体2群中的fHbp而言，Vc区域的该位置处的残基对fHbp-fH复合物的稳定性具有重要影响。
实施例13： F H BP ID 77(模块群VI)中的其他氨基酸取代对 F H结合的影响。
将位置K113、K119、D121的丙氨酸突变引入fHbp 77(模块群VI，抗原变体群2)。如上文所示，残基位置编号基于fHbp ID 1。依据上文材料和方法部分的描述产生fHbp。
如上文实施例2所述，采用ELISA检测这些突变体结合至人fH的能力，并与相应的野生型fHbp进行比较。与野生型fHbp ID 77相比，引入K119A突变使fH结合增加约4倍(图20，列A)；K113A对fH结合没有影响(图20，列A)，而与野生型fHbp ID 77与fH的结合相比，D121A使fH结合减少约4倍(图20，列A)。抗fHbp JAR 31与所有三个突变体结合，表明氨基酸取代对该mAb识别的表位没有影响。
在fHbp ID 77中还构建了双氨基酸取代R41S/K113A、R41S/K119A和R41S/D121A。采用ELISA的检测结果显示，与野生型fHbp ID 77相比，R41S/K119A突变体使fH结合减少约5倍(图21，列A)，而R41S/K113A和R41S/D121突变体使fH结合减少约10倍(图21，列A和表6)。抗-fHbp mAb JAR 31与ID 77的所有三个双突变体和野生型fHbp ID 77显示出了类似的结合，表明酶标板的孔中吸附的所有fHbp变体的量接近，且这些氨基酸取代对该mAb识别的表位没有影响。
在fHbp ID 77中引入了三氨基酸取代R41S/K113A/D121A。所述三突变体不与fH结合(图22，列A)。所述突变体fHbp保持了与JAR 31的结合(图22，列C)，但消除了与JAR 4的结合(图22，列B)。相反地，K113A/D121A双突变体使fH的结合降低了约10倍，表明除R41S取代以外，这些取代也促成了fH结合的丧失。
实施例14： F H BP ID 22(模块群III)中的氨基酸取代对 F H结合的影响。
fHbp ID 22是模块群III中具有代表性的fHbp序列变体(变体群2，图16)。在fHbp ID22的位置R80、D211、E218、D248、G236(表6)以及R41、Q38、A235、Q126、D201和E202(表7)引入突变。如上文所述生产fHbp突变。特别地，在fHbp ID 22中单一地引入R80A、D211A、E218A、E248A、R41S、Q38A、Q126A、G236I、A235G、D201A、和E202A取代。此外，在fHbp ID 22中引入T220A/H222A双取代。然后利用ELISA描述突变体与fH结合以及结合至抗fHbp mAb的特征(图6和图7)。
如上文实施例2所述，检测这些突变体结合至人fH的能力，并与野生型fHbp ID 22结合至人fH的能力进行比较。结果见图23，列A-C，并且汇总于表6和表7。如图23，列A和列B所示，与野生型fHbp ID 22同fH的结合相比，fHbp ID 22中的D211A、R80A、E218A、和E248A取代使其与fH的结合降低50倍以上(亦参见表6)。如图23，列C所示，R41S、Q38A、和Q126A取代不会显著降低与fH的结合(<4倍，亦参见表7)。
如图24，列A和列B所示，fHbp ID 22的R80A、D211A、E218A、和E248A突变体保持了与MAb JAR31的结合，表明这些突变体保留了JAR31表位。
如图25，列A和列B所示，fHbp ID 22的D211A和E218A突变体保持了与MAb JAR4的结合，表明这些突变体保留了JAR4表位。如图25所示，R80A突变体未保留与MAb JAR4的结合(列A)，E248A突变体显示与MAb JAR4的结合减少(列B)。
如图26，列A和列B所示，fHbp ID 22的R80A、D211A、E218A、和E248A突变体保持了与MAb JAR35的结合，表明这些突变均保留了JAR35表位。
如图27，列A所示，与野生型fHbp ID 22同人fH的结合相比，fHbp ID 22的T220A/H222A双取代和G236I单取代使其与人fH的结合降低50倍以上(亦参见表6)。如
图27所示，fHbp ID 22的T220A/H222A突变体保持了与MAb JAR31(列B)、MAb JAR 35(列C)、和MAb JAR 4(列D)的结合，表明T220A/H222A突变体保留了JAR31、JAR35、和JAR4表位。如图27所示，fHbp ID 22中的G236I突变体保持了与MAb JAR 35的结合(列C)，但与MAb JAR 31的结合减少(列B)，并且与JAR 4的结合较少或不结合(列D)。
如图28，图4所示，fHbp ID 22的R41S、Q38A、和A235G单取代不会显著降低与人fH的结合。如图28所示，R41S、Q38A、和A235G突变体保持了与MAb JAR31(列B)和MAb JAR 35(列C)的结合，表明在R41S、Q38A、和A235G突变体中保留了JAR31和JAR35的表位。
如图29，列A所示，fHbp ID 22的Q126A、D201A、和E202A单取代不会显著降低与人fH的结合。如图29，列B所示，Q126A、D201A、和E202A突变体保持了与MAb JAR35的结合，表明这些突变均保留了JAR35表位。
单一或双氨基酸取代对fHbp ID 1、ID 22、和ID 77与人fH结合，以及与不同单克隆抗体结合能力的影响汇总于表6和表7。
如图30，列A所示，fHbp ID 28的E218A单取代与人fH的结合低于野生型fHbp ID 28与fH的结合。亦如图30，列A所示，fHbp ID 28的E197A、K245A、和D201A单取代并未明显减少与fH的结合。图30，列B显示了小鼠多克隆抗-fHbp ID 28抗血清与不同蛋白的结合(WT fHbp；以及fHbp ID28的E197A、K245A、和D201A单取代)。图30，列B中的数据表明ELISA板中不同fHbp的量相似。如图30，列C和列D所示，E218A突变体与JAR31和JAR33MAb结合，表明其保留了供这些MAb识别的表位的全部构型。
可以将fHbp突变体作为疫苗给药野生型小鼠来确定总体免疫原性，所述野生型小鼠的天然fH不与突变体或野生型疫苗结合。该模型产生的数据可以总体评价突变体疫苗是否保持了对引发血清杀菌性抗体十分重要的表位。例如，fHbp ID 1的E218A/E239A突变体消除了与人fH的结合，但是在多项研究中发现，其在WT小鼠中引发杀菌性抗体应答的能力减弱(上表2)。如上文实施例1所述进行免疫原性实验。测量IgG和杀菌性抗体的滴度，并与给予相应野生型和/或阴性对照的小鼠中的相应水平进行比较。如果突变体疫苗保留了引发杀菌活性所需的关键表位，则预计在野生型小鼠中引发的抗体水平不会与相应野生型fHbp疫苗引发的水平存在显著差异。
实施例15： F H BP 变体诱导的杀菌性应答。
对野生型BALB/c小鼠(其fH不与WT fHbp结合)腹腔注射三个剂量的重组fHbp疫苗进行免疫，各剂量之间间隔三周。各剂量中含有10μg重组fHbp和300μg Al(OH)3，体积为100μl(最终的缓冲液组成为10mM组氨酸，150mM NaCl，pH 6.5)。给予第三个剂量三周后，通过心脏穿刺收集血液样品。
使用除去IgG的人补体，测定针对群B菌株H44/76(ID 1)或群W-135菌株Ghana 04/07(ID 22)的血清杀菌性滴度(Beernink et al,J Immunology 2011)。无差异，是指突变体和各WT疫苗的几何平均滴度(GMT)之间无显著性差异(对经log10转换的滴度进行T检验，P>0.10)。
数据见图31-33。图31显示了经fHbp ID 1突变体疫苗免疫的小鼠的血清杀菌性滴度，所述疫苗与人fH的结合减少。各符号表示针对群B菌株H44/76(ID 1)检测的各只小鼠的滴度。水平线表示几何平均滴度。各突变体疫苗的各GMT与WT fHbp ID 1疫苗引发的GMT无显著性差异(P>0.10)。
图32显示了经突变体fHbp ID 22疫苗免疫的小鼠的血清杀菌性滴度，所述疫苗与人fH的结合降低。各符号表示针对群W-135菌株Ghana 7/04(ID 22)检测的各只小鼠的杀菌性滴度。水平线表示几何平均滴度。上图，突变体疫苗(D211A、E218A、E248A和T220A/H222A)的GMT与WT ID 22疫苗之间无显著性差异(P>0.10)。下图，突变体疫苗(R80A和G236I)引发的GMT显著低于WT ID 22疫苗(P<0.05)。
图33显示了经突变体fHbp ID 77疫苗免疫的小鼠的血清杀菌性滴度，所述疫苗与人fH的结合降低。各符号表示针对群W-135菌株Ghana 7/04(ID 22)检测的各只小鼠的杀菌性滴度。水平线表示几何平均滴度。经R41S/K113A/D121A三突变体ID 77疫苗免疫的小鼠的GMT显著低于经WT疫苗免疫的小鼠(P<0.05)。
表8汇总了图31-33显示的免疫原性数据。无差异，是指突变体和各WT疫苗的几何平均滴度(GMT)之间无显著性差异(对经log10转换的滴度进行T检验，P>0.10)。
表8 fH结合降低的fHbp突变体的免疫原性
实施例16：序列比对。
图34和图35提供了fHbp ID 1(SEQ ID NO:1)、fHbp ID 22(SEQ ID NO:2)、fHbpID 77(SEQ ID NO:4)、fHbp ID 28(SEQ ID NO:3)、和ID1/ID77嵌合体(SEQ IDNO:8)氨基酸序列的氨基酸序列比对。ID 28为fHbp变体群3的对照序列。如Schneider etal.((2009)Nature 458:890-3)所述，H因子结合界面残基(用灰色标出)被描述为为氢键或离子间的相互作用。在位置136至139的GEHT(SEQ ID NO:27)表示嵌合fHbp的ID1和ID77之间的结点。
图35：fHbp ID 1(SEQ ID NO:1)、fHbp ID 22(SEQ ID NO:2)、fHbp ID 77(SEQID NO:4)、fHbp ID 28(SEQ ID NO:3)、和ID1/ID77嵌合体(SEQ ID NO:8)氨基酸序列的比对。用灰色标出的残基表示突变的残基，将其汇总于表7。
下表9汇总了fHbp ID 1、ID 22、ID 77、和ID 28的MAb反应性。
表9
实施例17：FH/ F H BP 结合抑制的效力与杀菌活性之间的相关性；以及NSPA作用。
材料和方法
鼠抗fHbp mAb。使用产生鼠fHbp特异性单克隆抗体(mAb)JAR 3(IgG3)、JAR 5(IgG2b)和mAb502(IgG2a；Giuliani et al.(2005)Infect.Immun.73:1151；和Scarselli et al.(2009)J.Mol.Biol.386:97)的杂交瘤细胞系。对照mAb包括与群B荚膜反应的SEAM 12(Granoff et al.(1998)J.Immunol.160:5028)，以及抗-PorA P1.7(NIBSC编码01/514，来自英国国家生物标准品和对照品研究所，Potters Bar,United Kingdom)。
人IgG1嵌合小鼠抗-fHbp mAb。根据生产厂商的说明，使用Omniscript RT试剂盒(Qiagen)，将从杂交瘤细胞中分离的RNA转换成cDNA。使用免疫球蛋白重链(H)和轻链(L)特异性引物扩增cDNA(Wang et al.(2000)Infect.Immun.68:1871)，并将其插入pGem载体(Promega)以用于测序。根据测得的序列，设计特异性引物，以便于将鼠VH和VL序列插入修饰的FRT双顺反真核表达载体(Invitrogen)。对于各抗体而言，将鼠VL序列插入人κL链前导序列的下游，并且在人κL链恒定序列的框架内。将鼠VH序列插入人H链前导序列的下游，并且在完整的人IgG1恒定区序列的框架内。载体在VH和VL序列之间利用了内部核糖体入口片段(IRES)，以便于使两个链平衡的翻译。转染前对所有构建体的DNA序列进行验证。
将Flp-In CHO细胞(Invitrogen)接种于NunclonΔ6孔板的各孔(含2mL Flp-In培养基)中，每孔3.5x 105个细胞，然后在37℃、5％CO2条件下培养过夜。一旦细胞达到80％汇合，利用TransFast转染试剂(Promega)，使用pOG44和含有VH和VL嵌入物(比例为9:1)的FRT载体进行转染。转染48小时后，用胰酶对细胞进行消化并将其置于新的6孔板中，使用600μg/ml潮霉素对其进行药物选择。使用Excell 302培养基(Sigma Aldrich)对转染细胞进行无血清悬浮培养，生长约两周。纯化前使用200ml搅动池(Amicon)和应用氮气压对来自细胞培养上清液的抗体进行浓缩。使用HiTrap蛋白G柱(GE Healthcare)对抗体进行纯化，随后经PBS广泛透析。加入BSA使其终浓度为1％，分装后在-30℃条件下保存。
ELISA。利用捕获ELISA、通过结合至酶标板各孔的山羊抗人κ链特异性抗体(Biosource)测定人IgG小鼠嵌合mAb的浓度。使用与碱性磷酸酶偶联的山羊抗人IgG抗体(Invitrogen)检测结合的人IgG。通过与人IgG1标准品(来自人骨髓瘤的单克隆κ链抗体，Sigma)的浓度依赖性结合进行比较，确定抗体浓度。利用ELISA、通过酶标板上的重组fbp，测定抗fHbp mAb与fHbp的结合。第二检测抗体为与碱性磷酸酶偶联的山羊抗人κ链特异性抗体(Biosource)。
表面等离子体共振。通过胺基偶联(Amine Coupling kit,GE Healthcare)将重组fHbp(500或1000个响应单位)固定在CM5芯片(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上，利用表面等离子体共振测定人-小鼠嵌合mAb与fHbp结合的动力学。在mAb浓度范围为0.016至50μg/ml(0.1μM至333μM)之间时，使用Biacore T/100仪器(GE Healthcare,Piscataway,NJ)测定结合动力学。
利用流式细胞术测定与脑膜炎奈瑟球菌的结合。利用菌株H44/76(B:15:P1.7，16；ST-32)检测嵌合mAb与活的有荚膜细菌表面的结合，所述菌株是fHbp ID 1的相对高表达体(Welsch et al.(2008)J.Infect.Dis.197:1053；Welsch et al.(2004)J.Immunol.172:5606)。在某些实验中，检测H44/76同基因敲除(KO)突变体，所述突变体不表达fHbp、NspA、或两种蛋白均不表达。各基因型为fHbp:Erm、NspA:Spc、和fHbp:Erm/NspA:Spc(Lewis et al.(2010)PLoS Pathog.6:e1001027)。根据此前的描述进行结合检测，但待测和对照抗体在室温条件下与细胞共同孵育1小时，而不是在冰上孵育2小时。使用CF488A山羊抗人IgG(BioTium)检测结合至细菌的抗体。
fH结合的抑制。利用ELISA检测抗fHbp mAb抑制fH与fHbp结合的能力。使用重组fHbp(2μg/ml)包被酶标板的各孔。加入mAb稀释物，在37℃条件下孵育2小时，随后加入2μg/ml人fH(Complement Tech.)，在室温条件下再孵育1小时。使用PBS-0.05％吐温20洗涤后，加入fH的绵羊多克隆抗血清(Abcam)，再加入与碱性磷酸酶偶联的驴抗-绵羊IgG抗体(Sigma Aldrich)，来检测结合的fH。结果表示为，在抗fHbp mAb存在的条件下fH的结合，对比mAb不存在的条件下fH结合的抑制百分率。
利用流式细胞术检测抗fHbp mAb抗体抑制fH与活细菌细胞表面结合的能力。将H44/76细菌与50μg/ml抗fHbp mAb和不同浓度的纯化fH在室温条件下孵育30分钟。洗涤细胞后，加入fH的绵羊多克隆抗血清(Lifespan Bioscience)，再加入偶联绿色荧光AlexaFluor 488染料的驴抗绵羊IgG抗体(Invitrogen)，来检测结合的fH。在某些实验中，将含有90μg/ml fH的20％的去IgG人血清作为人fH的来源。为避免溶菌作用，将人血清在56℃条件下加热30分钟，以便将溶菌作用所必须的不耐热的补体成分灭活。该加热处理不影响fH的活性。
人补体来源。用于检测杀菌活性和C4b沉积作用时，主要补体来源为健康成人血清，所述血清具有正常的总溶血补体活性，并且没有针对待测菌株的可检测的血清杀菌活性。为了消除可能促进或抑制待测mAb活性的无杀菌性IgG抗体，使用蛋白G柱(HiTrapProtein G,GE Life Sciences,Piscataway,NJ)除去补体来源中的IgG。将1ml人血清分装物通过经PBS平衡的蛋白G柱(1ml HiTrap Protein G,GE Life Sciences,Piscataway,NJ)，并收集流出的组分。利用IgG捕获ELISA监测IgG是否充分除去，并使用商品化的检测(EZComplement CH50检测试剂盒，Diamedix Corp.,Miami,FL)测定CH50活性。在检测C4b沉积作用时，为避免溶菌作用，使用抗人补体C6亲和柱除去补体来源，如上文所述(Plested and Granoff(2008)Clin.Vaccine Immunol.15:799)。在某些实验中，使用的商品化的人补体来源中，已除去fH或C1q(Complement Tech.)，并且如上文所述也已经除去了IgG。
血清杀菌性检测。如此前所述(Beernink et al.(2009)J.Infect.Dis.199:1360)，使用对数期的群B菌株H44/76细菌和20％已除去IgG的人血清作为补体来源测定杀菌活性。在检测即将开始前，将抗fHbp mAb 100,000x g离心两小时以除去聚合物。杀菌活性(BC50％)定义为，与阴性对照孔在零时刻的CFU/ml相比，在反应混合物孵育60分钟后，使CFU/ml降低50％的mAb浓度。
在脑膜炎奈瑟球菌上的C1q-依赖性C4b沉积作用。采用流式细胞术检测人C4b在群B菌株H44/76活细菌表面的沉积作用。如上文杀菌性检测部分那样生长细菌，使用5％的去C1q的人血清(Complement Tech.)孵育细菌，所述血清也已经除去补体C6以避免溶菌作用(见上文)。加入含有或不含20μg/ml纯化C1q蛋白(Complement Tech.)的不同浓度的嵌合人-小鼠抗fHbp mAb。使用与荧光异硫氰酸酯偶联的抗人C4b抗体(Meridian LifeScience)检测结合至细菌的人C4b。
结果
JAR 3和JAR 5mAbs相互抑制与fHbp的结合，并且识别重叠的表位，其包含分别在位置121和122的甘氨酸和赖氨酸。两个互补位(paratope)各自识别的表位在用不同fHbp氨基酸序列变体进行Western印迹分析时，两者的结合不同，由此可以进行区分。鼠源性杂交瘤JAR 3和JAR 5来自于相同VH和VL的种系基因，但是其各自CDR区域的序列不同(VL CDR2除外)。编码鼠mAb502的VH和VL种系基因与JAR 3或JAR 5不同。mAb502识别的构型表位要求在位置204处为精氨酸，并且不抑制JAR 3或JAR 5与fHbp的结合。因此，mAb502识别的fHbp表位与JAR mAb识别的不同。mAb502的vL基因和vH基因的Genbank登录号分别为EU835941和EU835942。JAR3和JAR5抗体的VL和VH区域的GenBank登录号如下：JF715928，JAR3可变重链；JF715929，JAR3可变轻链；JF715926，JAR5可变重链；以及JF715927，JAR5可变轻链。
图36：依据晶体结构坐标，fHbp与fH片段的复合物模型(Schneider et al.(2009)Nature 458:890)。在与fHbp的复合物中，用浅灰色标出了此前已报道的影响抗-fHbpmAb502、以及JAR 3和JAR 5与fHbp fH片段结合的氨基酸序列的空间关系。
三个人IgG1小鼠嵌合抗fHbp mAb具有类似的结合特性。构建三个人-小鼠嵌合抗fHbp抗体，其中将JAR 3、JAR 5和mAb502各自的互补位与人IgG1的恒定区配对。在ELISA中，三个mAb对吸附于酶标板各孔中的重组fHbp表现出类似的结合(图37，列A)。表面等离子体共振的检测结果显示，三个mAb与200、500或1000RU固定fHbp的结合动力学类似，其检测浓度均为0.016至2.25μg/ml。0.25μg/ml(1.7μM)mAb和1000RU固定fHbpID 1的代表性数据见列B。虽然mAb502与fHbp结合的峰值低于JAR 3或JAR 5，但是各结合速率Ka相似(JAR 3、JAR 5和mAb 502分别为4.25E+06、2.26E+06和1.19E+06)。所有三个mAb的解离速率均较慢，使得无法计算准确的解离常数。各mAb的Kd值的数量级为E-05。
通过间接荧光流式细胞术检测了结合至群B菌株H44/76活细菌表面的mAb。当mAb的浓度在0.8至40μg/ml之间时，三个mAb的结合互相之间难以区分。4μg/ml的结合结果见图37，列C。当存在热灭活的20％去IgG的人血清时，不影响结合，所述血清含有～90μg/ml的人fH(比较图37，列D和图37，列C)。
图37-D：fHbp-特异性mAb与fHbp的结合。A.ELISA。使用碱性磷酸酶偶联的抗人κ轻链特异性抗体对结合的IgG进行检测。B.表面等离子体共振。抗fHbp mAb(0.25μg/ml)与固定的重组fHbp(1000RU)的结合。C.流式细胞术。抗fHbp mAb(4μg/ml)与脑膜炎奈瑟球菌群B菌株H44/76活细菌细胞的结合。JAR 3，黑色虚线；JAR 5，灰色线；mAb502，黑色线。将无关mAb(100μg/ml)作为阴性对照(灰色柱状图)。三条抗fHbpmAb的结合曲线重叠。D.流式细胞术。mAb浓度与列C相同，并加入20％除去IgG的人血清作为人fH来源(～90μg/ml)。
所有三个人-小鼠嵌合mAb激活人经典补体途径，但仅JAR 3和JAR 5具有杀菌活性。当IgG结合至细菌表面时，开始激活经典补体途径，有足够的抗原-抗体复合物以使得抗体Fc区域的近端吸引C1q，其依次活化C4b。检测与脑膜炎奈瑟球菌群B菌株H44/76活细胞表面结合的C4b，用以替代C1q结合和C4b活化的检测，并且作为经典补体途径激活的标志。
当补体来源为5％去C1q且已除去IgG的人血清时，抗fHbp mAb引发的C4b沉积作用可以忽略不计(图38，列A)。当将20μg/ml纯化的C1q再加入至反应混合物时，各mAb均激活C4b沉积作用(图38，列B)。尽管各mAb的结合均激活经典补体途径，但仅有JAR 3和JAR 5具有补体介导的杀菌活性(图38，列C)。JAR 3在三次检测中50％杀菌的平均浓度±SE为9±0.85μg/ml；JAR 5为15±2μg/ml(P＝0.024)；以及mAb502为>100μg/ml(与JAR 3或JAR 5相比，P<0.0003)。
图38A-C：在有荚膜群B细菌菌株H44/76上的C1q-依赖性补体激活。A.流式细胞术。4μg/ml mAb和已除去C1q的补体(5％已除去IgG的人血清)激活了C4b的沉积作用。抗fHbpmAb JAR 3，黑色虚线；JAR 5，灰色线；mAb502，黑色线；以及无关的人mAb(100μg/ml；灰色柱状图)(各个数据均有重叠)。B.流式细胞术。除了在反应物中加入20μg/ml纯化的C1q蛋白以外，符号和条件均与列A相同。C.杀菌活性。在37℃条件下同各mAb和补体(20％已除去IgG的人血清)孵育60分钟后，存活的细菌。
嵌合mAb JAR 3和JAR 5，而非mAb502，抑制fH的结合。在此前的研究中，鼠mAbJAR 3和JAR 5抑制fH与fHbp的结合，而鼠mAb502不抑制fH结合。ELISA的结果显示，人IgG1嵌合JAR 3和JAR 5mAb也抑制fH与fHbp的结合，而嵌合mAb502不抑制fH的结合(图39，列A)。当使用20％热灭活的已除去IgG的人血清作为fH来源时，50μg/ml的嵌合JAR 3或JAR 5，而非mAb502，抑制fH与活细菌细胞表面结合(图39，列B)。低至2μg/ml的JAR 3或JAR 5也能够抑制fH的结合(列C)，尽管抑制与50μg/ml mAb相比并不完全(列B)。
图39A-C：抗fHbp mAb对fH结合的抑制。A.ELISA：使用fH(4μg/ml)与固相的重组fHbp。B和C.流式细胞术，使用群B菌株H44/76的活细菌细胞；浅灰色区域，使用细菌和在已除去IgG的不含mAb的20％人血清中的fH(～90μg/ml)；黑色实线，使用细菌和血清fH+mAb502，50μg/ml；黑色虚线，使用细菌和血清fH+JAR 3，50μg/ml；灰色实线，使用细菌和血清fH+JAR 5，50μg/ml；深灰色区域，使用细菌，没有fH或mAb，作为阴性对照。使用fH特异性绵羊抗体检测fH的结合。C.除采用2μg/ml，而非50μg/ml，的各抗fHbp mAb进行检测以外，条件与列B相同。
在杀菌活性与mAb对fH结合的抑制之间观察到的相关性并不一定能证明，抑制作用是JAR 3或JAR 5的杀菌活性高于mAb502的原因。例如，抑制fH结合的抗fHbp mAb所识别的在细菌表面的fHbp表位的空间关系，不同于不抑制fH结合的抗fHbp mAb所识别的表位的空间关系(比较，例如，此前已报道的影响mAb 502(Scarselli et al.(2009)J Mol Biol386:97-108)结合的氨基酸残基的位置与JAR 3和JAR 5结合的氨基酸残基的位置(Beernink et al.(2008)Infect Immun 76:4232-4240))(图36)。这些空间差异可能会潜在影响功能性膜攻击复合物的形成，而不依赖于fH的下调。
为确定影响杀菌活性的各表位位置的差异是否依赖于fH的抑制作用，使用已除去fH的补体(20％的人血清，也已除去IgG)检测抗fHbp的杀菌活性。不存在fH时，所有三个mAb均显示出类似的补体介导杀菌活性(BC50％，1.2至1.4μg/ml，表10)。相反地，当将纯化的人fH加入至反应混合物时，mAb502不再具有杀菌性(BC50％>100μg/ml，列B)。向反应混合物中加入fH也降低了两个对照鼠mAb与群B荚膜或PorA反应的杀菌性活性(将利用已除去fH的补体检测得到的各BC50％值(列C)与加入fH的补体的各BC50％值(列C)进行比较)，但是加入fH的作用不及抗fHbp mAb的作用显著。
表10使用已除去fH的人补体检测的抗fHbp mAb的杀菌活性
消除fH与NspA的结合可增加抗fHbp mAb JAR 3和JAR 5，而非mAb502，的杀菌活性。与加入fH补体时相比，已除去fH的抗fHbp mAb作为溶菌剂时需要的浓度更低，提示当存在fH时，JAR 3或JAR 5对fH结合的抑制作用是不完全的(例如，因为fH还结合另一个脑膜炎球菌配体如NspA(Lewis et al.(2010)PLoS Pathog.6:e1001027))。为研究与fHbp配体的结合之外的fH结合，采用群B菌株H44/76的同基因突变体测定fH结合，所述突变体中编码fHbp的基因已被失活(fHbp KO菌株)。以fHbp和NspA基因均被失活的另一个突变体作为对照，以评估NspA可能的作用。
流式细胞术的检测结果显示，两个突变体和亲本菌株与对照鼠抗PorA P1.7mAb的结合类似(图40，列A)。与预期结果一致，fHbp KO突变体与fH(100μg/ml)的结合低于WT菌株(在图40，列B中比较黑线与灰线)。在不存在fHbp和NspA表达(虚线)的情况下，在不加入fH时，fH的结合与阴性对照WT细菌(浅灰色的柱状图)之间无差异。当使用已除去IgG的20％人血清作为fH的来源时，获得的结果也类似(图40，列C)。
图40A-C：fH与群B H44/76突变体的结合，所述突变体的fHbp表达被遗传失活，或fHbp和NspA的表达均被遗传失活。A.抗PorA mAb(P1.7,20μg/ml)。黑线，WT；灰线，fHbp KO；虚线，fHbp KO与NspA KO的组合。B.纯化的人fH(100μg/ml)的结合。标识与列A中一致。C.人血清中fH的结合(20％，已除去IgG)。标识与列A中一致。两次独立检测的结果重复。
使用同基因NspA KO突变体检测抗fHbp的杀菌活性(图41)，以确定fH与NspA的结合(以及相应的补体激活的下调)是否可能导致在fH存在时需要较高的抗fHbp mAb浓度才能溶菌。当抑制fH与fHbp结合的嵌合JAR 3或JAR 5存在时，对NspA KO突变体的杀菌作用显著高于对照WT菌株(分别见图41，列A和列B)。相反地，不抑制fH结合的嵌合mAb502对各菌株均没有杀菌活性(图41，列C)。两个对照小鼠mAb，抗-PorA和抗荚膜，对WT和突变体NspA KO菌株均显示出了相似的杀菌活性(分别见图41，列D和列E)。
图41A-E：检测群B H44/76突变体对抗fHbp mAb的杀菌性活性，所述突变体中NspA表达遗传失活。使用各mAb和已除去IgG的20％人血清作为补体来源，在37℃条件下孵育60分钟后细菌的存活情况。空心三角，NspA KO突变体；实心三角，对照WT菌株。A.嵌合JAR 3。B.嵌合JAR 5。C.嵌合mAb502。D.对照鼠抗-Por A mAb(P 1.7)。E.对照鼠mAb，SEAM 12，与群B荚膜具有反应性。结果为使用三个独立的mAb稀释物进行两次实验的结果。结果显示，WT和NspA KO菌株与mAb稀释物共同孵育后，各自的存活情况结果存在显著性差异(*P≤0.02；**P<0.001)。
fH与fHbp的结合对抗fHbp mAb杀菌活性的重要性。如上文所示，使用群B菌株H44/76的NspA KO突变体，数据显示不存在fH与NspA的结合，此时抑制fH结合的抗fHbp mAb(JAR 3或JAR 5)的杀菌活性高于对用具有NspA的野生型菌株进行的检测。还进行了相反的实验：用针对群A菌株的fHbp敲除突变体(Senegal 1/99)进行了抗-NspA mAb AL12(Moe et al,Infect.Immun.(2002)70:6021)检测。如图42所示，fHbp KO突变体对抗NspAmAb的杀菌敏感性比WT菌株高50倍。相反地，针对PorA P1.9的对照mAb没有显著增强fHbp KO突变体的杀菌敏感性。使用人补体(已除去IgG的人血清)对mAb的杀菌性活性进行了检测。
抗fHbp抗体对fH的抑制作用对杀菌活性具有重要意义的进一步数据。由fHbp ID 1过表达的群B菌株H44/76制备得到原型天然外膜囊泡(NOMV)疫苗，经该疫苗免疫的小鼠的抗血清对已检测的九个非洲脑膜炎球菌分离株中的八个都具有杀菌活性(表11)。相反地，全部九个分离株均对经重组fHbp ID 1疫苗免疫的小鼠的抗血清具有抗性(杀菌性滴度<1:10)，在九个分离株中仅有一个被经由fHbp KO突变体(X5，滴度1:36)制备的NOMV疫苗免疫的小鼠的对照抗血清杀灭。将NOMV fHbp KO抗血清与针对重组fHbp ID1疫苗的抗血清混合后，不会增加针对任何待测菌株的杀菌活性(表11)。因此，过表达fHbp的NOMV疫苗引发的抗fHbp抗体，似乎导致了对带有fHbp序列变体的分离株的杀菌活性，所述变体与NOMV疫苗中的fHbp ID 1不匹配。也没有证据表明，针对fHbp的抗体与在NOMV疫苗中存在的针对其它抗原的抗体之间具有共同的杀菌活性。
表11经由fHbp ID 1过表达的群B菌株H44/76制备的天然外膜囊泡疫苗免疫小鼠的血清的杀菌活性。
突变体NOMV疫苗引起的广泛的血清交叉反应性抗fHbp杀菌活性，涉及比重组fHbp疫苗更高的抗fHbp抗体应答和对fH与fHbp结合的阻断作用。ELISA检测的结果显示，与经重组fHbp ID 1疫苗免疫的小鼠相比，经由fHbp ID 1过表达的突变体制备的NOMV疫苗免疫的小鼠具有更高的血清抗fHbp ID 1抗体浓度(几何平均数分别为2203和746U/ml，P<0.02，图43，列A)。ELISA检测的结果显示，经突变体NOMV疫苗免疫小鼠的血清也显示出对fH与fHbp ID 4的结合具有更高的抑制作用，所述fHbp ID 4是由群A菌株表达的序列变体(图43，列B，各个已检测的稀释液均为P<0.05)。在突变体NOMV疫苗组中，fH抑制的增加不仅仅是血清抗fHbp浓度升高的结果，因为在该组中fH抑制所需的抗fHbp抗体的平均浓度比重组fHbp疫苗ID 1组低接近4倍(几何平均数分别为1.17和4.04U/ml，P<0.05，图43，列C)。
图43，列A。通过ELISA测定针对疫苗接种的抗fHbp抗体应答(列A)，以及血清抗fHbp抗体对fH与fHbp结合的抑制能力(列B和列C，也通过ELISA测定)。使用重组fHbpID 1疫苗(实心三角)，或由fHbp ID 1过表达的群B菌株H44/76突变体(空心圈)或fHbp敲除(实心圈)制备的NOMV疫苗免疫小鼠。对于重组fHbp疫苗和fHbp ID 1过表达的NOMV疫苗，每个符号(列A和列C)均代表一只小鼠的结果(每个疫苗组10只小鼠)。对于NOMV fHbp KO疫苗组，每个符号均代表来自3至4只动物的测试混合血清的结果。A)抗fHbp ID 1抗体的浓度以任意单位每ml表示。与经重组fHbp疫苗免疫的小鼠相比，NOMV OE疫苗组具有更高的几何平均浓度(水平线)(p＝0.02)。B)fH与fHbp ID 4结合的抑制，所述fHbp ID 4与疫苗中的fHbp ID 1具有异源性。在所有稀释物中，由fHbp过表达突变体制备的NOMV疫苗群(空心圈)的平均抑制活性高于重组fHbp疫苗群(实心三角；p<0.05)。C)使fH与fHbp ID 4(与ID 1具有96％的氨基酸同一性)的结合达到50％抑制的血清抗fHbp ID 1抗体的浓度。NOMV OE fHbp组(空心圈)使fH的结合达到50％抑制的几何平均抗fHbp抗体的浓度，低于重组fHbp疫苗组(实心三角，p<0.05)。
通过上述特定实施例已对本发明进行了描述，但本领域技术人员应理解，在不背离本发明主旨及保护范围的前提下，可对本发明进行多种改变以及等同替代。此外，为适应特定的环境、材料、物料组成、工艺、工艺步骤，尚可对本发明的目的、主旨及范围进行多种变化。所有上述变化均应视为处于本申请所附的权利要求书的范围之内。

Claims (20)

1.一种包含非天然存在因子H结合蛋白(fHbp)和药学上可接受的辅料的免疫原性组合物，
其中所述非天然存在fHbp特征在于：1)由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成；2)在SEQ ID NO:1的第41位精氨酸(R41)处包含氨基酸取代；3)以低于fHbp ID1对人fH的亲和性50％的亲和性结合人因子H(fH)；4)存在供抗体结合的构象表位，所述抗体对至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株具有杀菌活性；和5)包含衍生自α谱系的VA、VC和VE可变片段，
且其中：
i)R41处的氨基酸取代选自R41S、R41A、R41T和R41P，或
ii)该组合物包含氢氧化铝、磷酸铝、MF59、水包油乳剂、RIBI或皂苷佐剂；或
iii)该组合物包含自表达所述非天然存在fHbp的脑膜炎奈瑟球菌细胞制备的外膜囊泡；或
iv)该组合物包含自表达所述非天然存在fHbp的脑膜炎奈瑟球菌细胞制备的微囊泡。
2.权利要求1的组合物，其中R41处的氨基酸取代为R41S或R41A。
3.权利要求1的组合物，其中R41处的氨基酸取代为R41T或R41P。
4.权利要求1的组合物，其中该组合物包含氢氧化铝、磷酸铝、MF59、水包油乳剂、RIBI或皂苷佐剂。
5.权利要求1的组合物，其中该组合物包含自表达所述非天然存在fHbp的脑膜炎奈瑟球菌细胞制备的外膜囊泡(OMV)和/或自表达所述非天然存在fHbp的脑膜炎奈瑟球菌细胞制备的微囊泡(MV)。
6.权利要求1的组合物，其中所述非天然存在fHbp以不高于fHbp ID1对人fH的亲和性约45％的亲和性结合人fH。
7.权利要求1的组合物，其中所述非天然存在fHbp包含R41S作为所述氨基酸取代。
8.权利要求1的组合物，其中所述非天然存在fHbp包含R41A作为所述氨基酸取代。
9.权利要求1的组合物，其中所述非天然存在fHbp以fHbp ID1对人fH的亲和性25％、10％、5％或更低的亲和性结合人fH。
10.权利要求1的组合物，其中所述非天然存在fHbp在表达人fH的转基因小鼠中引发的针对脑膜炎奈瑟球菌的杀菌性抗体的血清水平至少与fHbpID1引发的水平一样高。
11.一种包含非天然存在fHbp和药学上可接受的辅料的免疫原性组合物，其中所述非天然存在fHbp特征在于：
a)由fHbp ID 4的氨基酸序列组成且包含R41S氨基酸取代；
b)由fHbp ID 9的氨基酸序列组成且包含R41S氨基酸取代；
c)由fHbp ID 74的氨基酸序列组成且包含R41S氨基酸取代；或
d)由SEQ ID NO:8所示嵌合体I的氨基酸序列组成且包含R41S氨基酸取代。
12.权利要求1-11任一项的组合物，其进一步包含NspA。
13.一种免疫原性组合物，其包含：
a)权利要求1-11任一项的非天然存在fHbp，其中所述非天然存在fHbp在由表达所述非天然存在fHbp的脑膜炎奈瑟球菌菌株制备的囊泡制剂中；和
b)药学上可接受的辅料。
14.权利要求13的组合物，其中所述组合物包含佐剂。
15.权利要求13或14的组合物，其包含NspA。
16.权利要求1-15任一项的组合物在制备用于在哺乳动物中引发抗体应答的药物中的用途，其中所述哺乳动物是人。
17.权利要求16的用途，其中所述抗体应答包括针对脑膜炎奈瑟球菌的杀菌性抗体的产生。
18.一种核酸，其编码根据权利要求1-11任一项的非天然存在fHbp。
19.一种重组体表达载体，其包含权利要求18的核酸。
20.一种经遗传修饰的宿主细胞，其包含权利要求18的核酸或权利要求19的重组体表达载体。
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