JP7001686B2 - 多価肺炎球菌多糖体－タンパク質コンジュゲート組成物 - Google Patents

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Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１６年８月５日付で出願された米国仮特許出願第６２／３７１，５２９号の利益を主張し、その出願日に依拠し、その開示全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
本出願は概して、混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物、該組成物を含むワクチン、並びに対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）感染又は疾患に対する予防のための、これらの組成物及びワクチンを使用する方法に関する。
肺炎球菌（Pneumococcus）（ストレプトコッカス・ニューモニエ）は、９０個を超える既知の血清型を有するグラム陽性のランセット型通性嫌気性菌である。ほとんどのＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）血清型が、疾患を引き起こすと示されており、２３個の最も一般的な血清型が、世界規模で侵襲性疾患のおよそ９０％を占める。血清型は、肺炎球菌に関して最も重要な病原性因子である莢膜多糖体の血清学的応答に基づいて分類される。莢膜多糖体は、ヘルパーＴ細胞の非存在下で抗体産生を誘導するＴ細胞非依存性抗原である。Ｔ細胞非依存性抗原は一般的に、免疫記憶をほとんど～全く有さずに、低親和性及び一時的な免疫応答を有する抗体を誘導する。
初期の肺炎球菌ワクチンは、異なる血清型由来の莢膜多糖体の組合せを含んでいた。これらのワクチンは、発達した免疫系又は健常な免疫系を有する患者において、Ｓ．ニューモニエに対する免疫力を付与することができるが、これらのワクチンは、発達した免疫系を欠如する乳幼児、及び免疫機能が損なわれている場合が多い高齢者においては有効ではなかった。特にＳ．ニューモニエ感染を発症するリスクがより高い乳幼児及び高齢者において、肺炎球菌ワクチンに対する免疫応答を改善するために、莢膜多糖体を、適切な担体タンパク質にコンジュゲートして、肺炎球菌コンジュゲートワクチン（pneumococcal conjugate vaccines）を作製した。適切な担体タンパク質へのコンジュゲーションは、莢膜多糖体を、Ｔ細胞非依存性抗原からＴ細胞依存性抗原へと変化させる。したがって、コンジュゲートされた莢膜多糖体に対する免疫応答は、ヘルパーＴ細胞に関与し、ヘルパーＴ細胞は、莢膜多糖体への再曝露時に、より強力かつ迅速な免疫応答を誘導するのを助長する。
肺炎球菌コンジュゲートワクチンの開発に対して、単一担体アプローチ及び混合担体アプローチという少なくとも２つのアプローチが存在する。異なる莢膜多糖体コンジュゲートの免疫原性は、肺炎球菌血清型及び使用する担体タンパク質に応じて多様であり得る。単一担体アプローチでは、異なる血清型由来の莢膜多糖体を、単一タンパク質担体にコンジュゲートする。Pfizer社のＰＲＥＶＮＡＲシリーズのワクチンは、異なる莢膜多糖体を、グリシンに代わってグルタミン酸の単一アミノ酸置換を有するジフテリアトキソイドの無毒性変異体であるＣＲＭ197タンパク質担体にコンジュゲートする単一担体アプローチの例である。７価ＰＲＥＶＮＡＲワクチン（ＰＲＥＶＮＡＲ）は、２０００年に最初に認可され、７つの最も流行している血清型：４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ及び２３Ｆ由来の莢膜多糖体を含有する。１３価ワクチンであるＰＲＥＶＮＡＲ１３は、血清型１、５、７Ｆ、３、６Ａ、及び１９Ａを、ＣＲＭ197タンパク質担体に付加したものである。単一担体のＰＲＥＶＮＡＲワクチンにおいて使用されるタンパク質担体であるＣＲＭ197は、肺炎球菌コンジュゲートワクチンにおける混合担体系の一部として使用されたことはこれまでにない。
第２の肺炎球菌ワクチンアプローチは、混合担体アプローチである。混合担体アプローチでは、単一タンパク質担体を使用する代わりに、２つ以上のタンパク質担体が使用され、特異的な血清型由来の莢膜多糖体が、第１のタンパク質担体にコンジュゲートされ、異なる血清型由来の莢膜多糖体が、少なくとも第２の異なるタンパク質担体にコンジュゲートされる。例えば、GlaxoSmithKline社は、タンパク質担体としてＨ．インフルエンザエ（H influenzae）タンパク質Ｄ、破傷風トキソイド及びジフテリアトキソイドを使用する１０価（血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ及び２３Ｆ）の混合担体の肺炎球菌コンジュゲートワクチンであるＳＹＮＦＬＯＲＩＸを開発している。ＳＹＮＦＬＯＲＩＸにおいて、血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、及び２３Ｆは、タンパク質Ｄにコンジュゲートされ、血清型１８Ｃは、破傷風トキソイドにコンジュゲートされ、血清型１９Ｆは、ジフテリアトキソイドにコンジュゲートされる［７］。血清型３は、急性中耳炎の治験において血清型特異的な有効性を示さなかったので、ＳＹＮＦＬＯＲＩＸの１１価の前駆体から除かれた［１］。別のグループのAventis Pasteur社は、タンパク質担体としてジフテリアトキソイド及び破傷風トキソイドを使用する１１価（血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ及び２３Ｆ）の混合担体の肺炎球菌コンジュゲートワクチンを開発した［２、３］。血清型３、９Ｖ、１４及び１８Ｃ由来の莢膜多糖体は、破傷風トキソイドにコンジュゲートされた場合よりも、ジフテリアトキソイドにコンジュゲートされた場合により良好な応答を誘発することができる［２、６］。したがって、血清型３、６Ｂ、１４及び１８Ｃは、ジフテリア毒素にコンジュゲートされ、血清型１、４、５、７Ｆ、９Ｖ、１９Ｆ、及び２３Ｆは、破傷風トキソイドにコンジュゲートされた。この混合担体の肺炎球菌ワクチンの開発は、幾分技術的な理由及び無細胞百日咳ワクチンと組み合わせた場合の応答の低減の可能性に起因して終了した［３］。近年、血清型５及び１は、全てのＰＲＥＶＮＡＲ１３血清型の中で由来の観察されるＯＰＡ力価が最小であるものの１つであり、ＩｇＧ力価とＯＰＡ活性との間に相関関係が関連付けられると報告された［４］。また、血清型３に関しては、はるかに高い血清ＩｇＧ濃度が、防御に必要とされると示唆された［５］。
本出願は、新たな改善された混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物及び該組成物を含むワクチンを提供する。１つの態様において、本出願は、１６個の異なる肺炎球菌莢膜多糖体－タンパク質コンジュゲートを含み、肺炎球菌莢膜多糖体－タンパク質コンジュゲートはそれぞれ、異なる血清型のストレプトコッカス・ニューモニエ由来の莢膜多糖体にコンジュゲートされたタンパク質担体を含み、該ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型は、１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆから選択され、該タンパク質担体は、ＣＲＭ197又は破傷風トキソイドであり、該莢膜多糖体のうちの２つは、破傷風トキソイドにコンジュゲートされ、残りの莢膜多糖体は、ＣＲＭ197にコンジュゲートされ、破傷風トキソイドにコンジュゲートされる該２つの莢膜多糖体は、血清型１、３及び５からなる群から選択される、混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物を提供する。
幾つかの実施の形態において、血清型１及び５由来の莢膜多糖体は、破傷風トキソイドにコンジュゲートされ、血清型３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆ由来の莢膜多糖体は、ＣＲＭ197にコンジュゲートされる。
別の実施の形態において、血清型１及び３由来の莢膜多糖体は、破傷風トキソイドにコンジュゲートされ、血清型４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆ由来の莢膜多糖体は、ＣＲＭ197にコンジュゲートされる。
更に別の実施の形態において、血清型３及び５由来の莢膜多糖体は、破傷風トキソイドにコンジュゲートされ、血清型１、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆ由来の莢膜多糖体は、ＣＲＭ197にコンジュゲートされる。
幾つかの実施の形態において、混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物は、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、及び水酸化アルミニウムを含むがこれらに限定されない、アルミニウムベースのアジュバント等のアジュバントを更に含む。
別の態様は、ワクチンとしての混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物の使用に関する。
更に別の態様は、混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物と薬学的に許容可能な賦形剤とを含むワクチンに関する。
更に別の態様は、対象、例えばヒトにおけるストレプトコッカス・ニューモニエ感染又は疾患を予防する方法であって、予防上有効な量の混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物又は該組成物を含むワクチンを、該対象に投与することを含む、方法に関する。
或る特定の実施の形態において、対象は、少なくとも５０歳のヒトであり、疾患は、肺炎又は侵襲性肺炎球菌感染症（ＩＰＤ）である。
他の実施の形態において、対象は、少なくとも６週齢のヒトであり、疾患は、肺炎、侵襲性肺炎球菌感染症（ＩＰＤ）、又は急性中耳炎（ＡＯＭ）である。幾つかの実施の形態において、ヒト対象は、６週齢から５歳である。他の実施の形態において、ヒト対象は、２ヵ月齢から１５ヵ月齢、又は６歳から１７歳である。
或る特定の実施の形態において、混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物又はワクチンは、筋内注射によって投与される。或る特定の実施の形態において、混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物又はワクチンは、一連の免疫付与の一部として投与される。
混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物の上述及び他の目的、特色及び利点は、下記の詳細な説明からより明らかとなる。
定義
本開示のより容易な理解のために、幾つかの用語を初めに下記に規定する。以下の用語及び他の用語の付加的な定義は本明細書を通して示され得る。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合に、文脈上他に明らかに指示されない限り、数量を特定していない単数形（the singular forms "a," "an," and "the"）は複数の指示対象を含む。このため、例えば「方法（a method）」への言及には１つ以上の方法、及び／又は本明細書に記載される及び／又は本開示を読むことで当業者に明らかとなるタイプの工程等が含まれる。
アジュバント：本明細書中で使用する場合、「アジュバント」は、抗原に対する免疫応答を非特異的に増強する物質又はビヒクル（vehicle）を指す。
投与する：本明細書で使用する場合、組成物を対象に「投与する」ことは、対象に組成物を与える、適用する又は対象を組成物と接触させることを意味する。投与は例えば局所、経口、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、髄腔内及び皮内等の多数の経路のいずれかによって達成することができる。
およそ：本明細書で使用する場合、「およそ」又は「約」という用語は対象となる１つ以上の値に適用される場合、述べられる参照値と同様の値を指す。或る特定の実施形態では、「およそ」又は「約」という用語は、他に指定のない限り又は文脈から明らかでない限りにおいて（かかる数が可能な値の１００％を超える場合を除いて）、述べられる参照値のいずれかの方向で（それを上回る又は下回る）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又はそれ以下に含まれる値の範囲を指す。
コンジュゲート：本明細書中で使用する場合、また適正な状況から理解されるように、「コンジュゲート（複数の場合もある）」又は「複合糖質（複数の場合もある）」という用語は、任意の共有結合又は非共有結合的なバイオコンジュゲーション戦略を使用して、担体タンパク質にコンジュゲートされたストレプトコッカス・ニューモニエ多糖体を指す。
賦形剤：本明細書中で使用する場合、「賦形剤」という用語は、例えば所望の一貫性（consistency）又は安定化効果を提供するか、又はそれに寄与するために組成物中に含まれ得る非治療用作用物質を指す。
混合担体：本明細書中で使用する場合、混合担体の肺炎球菌コンジュゲート組成物は、２つ以上のタイプのタンパク質担体を有する肺炎球菌コンジュゲート組成物を指す。
多価：本明細書中で使用する場合、「多価」という用語は、２つ以上のストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の肺炎球菌莢膜多糖体を有する肺炎球菌コンジュゲート組成物を指す。
混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物：本明細書中で使用する場合、「混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物（複数の場合もある）」は、１６個の異なる肺炎球菌莢膜多糖体－タンパク質コンジュゲートを含む組成物を指し、ここで、肺炎球菌莢膜多糖体－タンパク質コンジュゲートはそれぞれ、異なる血清型のストレプトコッカス・ニューモニエ由来の莢膜多糖体にコンジュゲートされたタンパク質担体を含み、ここで、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型は、１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆであり、ここで、タンパク質担体は、ＣＲＭ197又は破傷風トキソイドであり、ここで、莢膜多糖体のうちの２つは、破傷風トキソイドにコンジュゲートされ、残りの莢膜多糖体は、ＣＲＭ197にコンジュゲートされ、ここで、破傷風トキソイドにコンジュゲートされる２つの莢膜多糖体は、血清型１、３及び５からなる群から選択される。幾つかの実施形態において、血清型１及び５由来の莢膜多糖体は、破傷風トキソイドにコンジュゲートされ、残りの血清型由来の莢膜多糖体は、ＣＲＭ197にコンジュゲートされる。別の実施形態において、血清型１及び３由来の莢膜多糖体は、破傷風トキソイドにコンジュゲートされ、残りの莢膜多糖体は、ＣＲＭ197にコンジュゲートされる。更に別の実施形態において、血清型３及び５由来の莢膜多糖体は、破傷風トキソイドにコンジュゲートされ、残りの莢膜多糖体は、ＣＲＭ197にコンジュゲートされる。
薬学的に許容可能な賦形剤：本開示において有用な薬学的に許容可能な賦形剤は、従来型である。Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)は、ワクチンを含む１つ以上の治療用組成物の医薬送達に適した組成物及び製剤、並びに更なる薬剤について記載している。適切な医薬賦形剤として、例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。概して、賦形剤の性質は、用いられる特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、緩衝液、水性デキストロース、グリセロール等の薬学的にかつ生理学的に許容可能な流体を含む注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤又はカプセル形態）に関して、従来型無毒性固体賦形剤として、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、又は硫酸マグネシウムを挙げることができる。生物学的に中性の担体の他に、投与される医薬組成物は、少量の、湿潤剤又は乳化剤、界面活性剤、防腐剤及びｐＨ緩衝剤等の無毒性補助物質、例えば酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレートを含有することができる。
予防上有効な量：本明細書中で規定する場合、「予防上有効な量」又は「予防上有効な用量」という用語は、ストレプトコッカス・ニューモニエによる感染によって引き起こされる１つ以上の症状の発生を遅延して、及び／又はそれらの頻度及び／又は重篤性を低減するのに十分な免疫応答を誘導するのに必要とされる量又は用量を指す。
予防：「予防」という用語は、本明細書中で使用する場合、特定の疾患、障害又は状態（例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエによる感染）の疾患徴候の回避、それらの発生の遅延、及び／又はそれらの１つ以上の症状の頻度及び／又は重篤性の低減を指す。幾つかの実施形態において、予防は、特定の疾患、障害又は状態の１つ以上の症状の発症、頻度及び／又は強度の統計学的に有意な減少が、その疾患、障害又は状態にかかりやすい集団において観察される場合に、作用物質が、その疾患、障害又は状態に対する予防をもたらすとみなされるように集団ベースで評価される。
対象：本明細書中で使用する場合、「対象」という用語は、マウス、ウサギ、及びヒトを含む任意の哺乳動物を意味する。或る特定の実施形態において、対象は、成体、青年又は乳幼児である。幾つかの実施形態において、「個体」又は「患者」という用語が使用され、「対象」と区別なく使用可能であると意図される。
詳細な説明
開示する実施形態（複数の場合もある）及び実施例の下記の説明は、事実上、単なる例示的なものであり、本発明、その用途、又は使用を限定すると意図されるものではない。
本出願は、新たな改善された混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物及び該組成物を含むワクチンを提供する。タンパク質担体であるＣＲＭ197は、これまで単一担体の肺炎球菌コンジュゲートワクチンで使用されてきたのに対して、本出願は、混合担体の肺炎球菌コンジュゲートワクチンにおけるＣＲＭ197の使用について初めて記載する。
上述するように、異なる莢膜多糖体コンジュゲートの免疫原性は、肺炎球菌血清型及び使用する担体タンパク質に応じて多様であり得る。血清型３が、破傷風トキソイドではなくジフテリアトキソイドにコンジュゲートされた場合に、より免疫原性が高かったというこれまでの教示［２、６］はあるが、本出願は、血清型３の、混合担体ワクチンの一部としての破傷風トキソイドへの首尾よいコンジュゲーションについて記載する。本出願はまた、混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物において破傷風トキソイドにコンジュケートされた血清型３に対する抗体応答が、血清型３が単一担体の１３価肺炎球菌コンジュゲート組成物（ＰＲＥＶＮＡＲ１３）においてＣＲＭ197にコンジュゲートされた場合よりも約４倍高かったという予期せぬ発見を開示している。
さらに、予期せぬ発見は、血清型３に限定されず、混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物において破傷風トキソイドにコンジュゲートされた他の血清型に関しても観察された。実施例において示すように、残りの血清型がＣＲＭ197にコンジュゲートされた、混合担体の肺炎球菌コンジュゲート組成物における破傷風トキソイドへの血清型１及び３、１及び５、又は３及び５のコンジュゲーション（それぞれ、ＰＶＣ１６－１３ＴＴ、ＰＶＣ１６－１５ＴＴ、及びＰＶＣ１６－３５ＴＴ）は、以下の表において概要するように、単一担体の肺炎球菌コンジュゲート組成物（ＰＲＥＶＮＡＲ１３）においてＣＲＭ197にコンジュゲートされた同じ血清型に対する抗体応答（ＩｇＧ応答又はＭＯＰＡ力価）と比較した場合に、破傷風トキソイドにコンジュゲートされた血清型に対して、有意に増強された抗体応答を一貫して誘導した。
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本出願において記載する混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物はまた、世界市場で現在入手可能な３つの肺炎球菌コンジュゲートワクチン：ＰＲＥＶＮＡＲ（国によっては、Ｐｒｅｖｅｎａｒと呼ばれる）、ＳＹＮＦＬＯＲＩＸ及びＰＲＥＶＮＡＲ１３の適用外の肺炎球菌血清型を含む。現在適用外の肺炎球菌血清型によって引き起こされる疾患は、抗菌耐性の発現、免疫不全患者数の増加、及び免疫力（immune pressure）の欠如に幾分起因して上昇傾向にある。例えば、現在入手可能な肺炎球菌コンジュゲートワクチンはいずれも、血清型１２Ｆを含まない。さらに、現在入手用可能な肺炎球菌コンジュゲートワクチンはいずれも、血清型２２Ｆ及び３３Ｆを含まない。本開示は、混合担体の肺炎球菌コンジュゲートワクチンへの血清型１２Ｆ、２２Ｆ及び３３Ｆの首尾よい導入を実証している。
混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物及び該組成物を作製する方法
１つの態様において、本開示は、１６個の異なる肺炎球菌莢膜多糖体－タンパク質コンジュゲートを含み、肺炎球菌莢膜多糖体－タンパク質コンジュゲートはそれぞれ、異なる血清型のストレプトコッカス・ニューモニエ由来の莢膜多糖体にコンジュゲートされたタンパク質担体を含み、該ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型は、１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆであり、該タンパク質担体は、ＣＲＭ197又は破傷風トキソイドであり、該莢膜多糖体のうちの２つは、破傷風トキソイドにコンジュゲートされ、残りの莢膜多糖体は、ＣＲＭ197にコンジュゲートされ、破傷風トキソイドにコンジュゲートされる該２つの莢膜多糖体は、血清型１、３及び５からなる群から選択される、混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物を提供する。
幾つかの実施形態において、血清型１及び５由来の莢膜多糖体は、破傷風トキソイドにコンジュゲートされ、残りの血清型由来の莢膜多糖体は、ＣＲＭ197にコンジュゲートされる。別の実施形態において、血清型１及び３由来の莢膜多糖体は、破傷風トキソイドにコンジュゲートされ、残りの莢膜多糖体は、ＣＲＭ197にコンジュゲートされる。更に別の実施形態において、血清型３及び５由来の莢膜多糖体は、破傷風トキソイドにコンジュゲートされ、残りの莢膜多糖体は、ＣＲＭ197にコンジュゲートされる。
多糖体－タンパク質コンジュゲートワクチンにおいて、担体タンパク質は、主に多糖体抗原に対する免疫応答（例えば、抗体応答）を増強するのを助長するために、多糖体抗原にコンジュゲートされる。担体タンパク質は、ほとんど又は全く免疫原性を有さない無毒性のタンパク質であることが好ましい。担体タンパク質は、以下で更に詳細に論述するように、標準的なコンジュゲーション法を使用した、肺炎球菌多糖体とのコンジュゲーションに適するものであるべきである。混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物において使用する担体タンパク質は、破傷風トキソイド（ＴＴ）及びＣＲＭ197であり、それらはそれぞれ、肺炎球菌コンジュゲートワクチンの設計において使用されているが、同じ混合担体ワクチンでは使用されていない。
ＣＲＭ197は、野生型ジフテリア毒素の免疫原性特性を保持するジフテリア毒素の無毒性変異体（即ち、トキソイド）である。ＣＲＭ197は、構造遺伝子において単一塩基で野生型ジフテリア毒素と異なり、それが、グルタミン酸からグリシンへの単一アミノ酸置換を生じる。ＣＲＭ197は通常、カザミノ酸及び酵母抽出物ベースの培地上で成長させたコリネバクテリウム・ジフテリア（Corynebacterium diphtheria）株Ｃ７（β１９７）の培養物から単離される。ＣＲＭ197は、限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿、及びイオン交換クロマトグラフィーにより精製され得る。あるいは、ＣＲＭ197は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす米国特許第５，６１４，３８２号に従って、組換えにより作製することができる。ＣＲＭ197は、肺炎球菌コンジュゲートワクチンの設計において使用されているが、混合担体ワクチンの一部としては使用されていない。
破傷風トキソイドは、クロストリジウム・テタニ（Clostridium tetani）によって引き起こされる破傷風（又は牙関緊急）に対する大規模な免疫付与用に、世界規模で作製及び使用されている。破傷風トキソイドはまた、単独で、並びにジフテリア及び／又は百日咳ワクチンと組み合わせて使用される。親タンパク質である破傷風毒素は、一般的にクロストリジウム・テタニの培養物において得られる。破傷風毒素は、約１５０ｋＤａのタンパク質であり、スルフィド結合で連結される２つのサブユニット（約１００ｋＤａ及び約５０ｋＤａ）からなる。毒素は通常、ホルムアルデヒドで解毒されて、硫酸アンモニウム沈殿（例えば、［７］、［８］を参照）又は例えば国際公開第１９９６／０２５４２５号に開示されるようなクロマトグラフィー技法等の既知の方法を使用して、培養物濾液から精製することができる。破傷風毒素はまた、組換え遺伝子手段によって不活性化させてもよい。
破傷風トキソイドはまた、肺炎球菌コンジュゲートワクチンを含む他のワクチンにおいて、担体タンパク質として使用されてきた。しかし、破傷風トキソイドは、ＣＲＭ197と組み合わせた混合担体の肺炎球菌コンジュゲートワクチンにおいては一切使用されていない。また、当該技術分野では、血清型３が、破傷風トキソイドと比較した場合、ジフテリアトキソイドにコンジュゲートされた場合により免疫原性が高いことが示されたので、混合担体の肺炎球菌コンジュゲートワクチンにおいて、血清型３を破傷風トキソイドにコンジュゲートすることから遠ざけることが教示されている［２、６］。
血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆ由来の莢膜多糖体を含む、本明細書中に記載する組成物及びワクチンにおいて使用される肺炎球菌莢膜多糖体は、例えば、いずれもそれらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす国際公開第２００６／１１０３８１号、国際公開第２００８／１１８７５２号、国際公開第２００６／１１０３５２号、及び米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号、同第２００６／０２２８３８１号、同第２００７／０１８４０７１号、同第２００７／０１８４０７２号、同第２００７／０２３１３４０号、同第２００８／０１０２４９８及び同第２００８／０２８６８３８号に開示されるものを含む、当業者に既知の標準的な技法を含む任意の利用可能な技法を使用して、ストレプトコッカス・ニューモニエから作製され得る。例えば、肺炎球菌莢膜多糖体血清型はそれぞれ、培養培地（例えば、大豆ベースの培地）中で成長させてもよい。細胞を溶解させて、個々の多糖体を、遠心分離、沈殿、限外濾過及び／又はカラムクロマトグラフィーにより溶解産物から精製してもよい。さらに、肺炎球菌莢膜多糖体は、合成プロトコルを使用して産生することができる。
ストレプトコッカス・ニューモニエの莢膜多糖体は、最大８つの糖残基を含有し得る反復オリゴ糖単位を含む。莢膜多糖体抗原は、完全長多糖体であってもよく、又は莢膜多糖体抗原は、サイズが低減されてもよい（例えば、単一オリゴ糖単位、又は反復オリゴ糖単位の自然長よりも短い糖鎖）。莢膜多糖体のサイズは、酸加水分解処理、過酸化水素処理、高圧ホモジナイザーによるサイジング、任意選択で続くオリゴ糖断片を生成するための過酸化水素処理、又は顕微溶液化（microfluidization）等の当該技術分野で既知の各種方法によって低減され得る。
血清型それぞれの肺炎球菌コンジュゲートは、各血清型の莢膜多糖体を、担体タンパク質にコンジュゲートすることによって作製され得る。異なる肺炎球菌コンジュゲートを、単回投薬製剤を含む組成物へと配合してもよい。
多糖体－タンパク質コンジュゲートを作製するために、各肺炎球菌血清型から作製される莢膜多糖体を、莢膜多糖体が担体タンパク質と反応し得るように化学的に活性化させてもよい。活性化されると、莢膜多糖体はそれぞれ、担体タンパク質に個別にコンジュゲートされて、複合糖質を形成し得る。多糖体の化学的活性化、及び続く担体タンパク質へのコンジュゲーションは、従来法によって達成され得る。例えば、莢膜多糖体の末端にある近接した水酸基は、例えばそれらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす米国特許第４，３６５，１７０号、同第４，６７３，５７４号及び同第４，９０２，５０６号に開示されるように、過ヨウ素酸塩（過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム、又は過ヨウ素酸を含む）等の酸化剤によって、アルデヒド基に酸化することができる。多糖体はまた、１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）で活性化して、シアン酸エステルを形成してもよい。続いて、活性化された多糖体は、直接、又はスペーサー若しくはリンカー基を介して、担体タンパク質上のアミノ基へカップリングされる。
例えば、スペーサーは、マレイミドで活性化された担体タンパク質（例えば、Ｎ－［ｙ－マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）を使用して）又はハロアセチル化された担体タンパク質（例えば、ヨードアセトイミド、ブロモ酢酸Ｎ－スクシンイミジル（ＳＢＡ；ＳＩＢ）、（４－ヨードアセチル）アミノ安息香酸Ｎ－スクシンイミジル（ＳＩＡＢ）、（４－ヨードアセチル）アミノ安息香酸スルホスクシンイミジル（スルホ－ＳＩＡＢ）、ヨード酢酸Ｎ－スクシンイミジル（ＳＩＡ）又は３－［ブロモアセトアミド］プロピオン酸スクシンイミジル（ＳＢＡＰ）を使用して）との反応後に得られるチオエーテル結合を介して担体にカップリングすることができるチオール化された多糖体を付与するシスタミン又はシステアミンであり得る。好ましくは、シアン酸エステル（任意選択で、ＣＯＡＰ化学によって作製される）は、ヘキサンジアミン又はアジピン酸ジヒドラジド（ＡＯＨ）とカップリングされて、アミノで誘導体化された糖類は、カルボジイミド（例えば、ＥＯＡＣ又はＥＯＣ）化学を使用して、タンパク質担体上のカルボキシル基を介して担体タンパク質にコンジュゲートされる。かかるコンジュゲートは、例えば、国際公開第９３／１５７６０号、国際公開第９５／０８３４８号及び国際公開第９６／１２９０９４号に記載されている。
活性化された莢膜多糖体及び担体タンパク質のコンジュゲーションは、例えば、いずれもそれらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号、同第２００７／０２３１３４０号、同第２００７／０１８４０７１号及び同第２００７／０１８４０７２号、国際公開第２００６／１１０３８１号、国際公開第２００８／０７９６５３号、及び国際公開第２００８／１４３７０９号に記載されるように、例えば、還元的アミノ化によって達成され得る。例えば、活性化された莢膜多糖体及び担体タンパク質は、還元剤と反応させて、コンジュゲートを形成してもよい。適切な還元剤として、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ボラン－ピリジン、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、又は水素化ホウ素交換樹脂等の水素化ホウ素が挙げられる。還元反応の最後に、未反応のアルデヒド基が、コンジュゲート中に残存し得る。未反応のアルデヒド基は、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ4）等の適切なキャッピング剤を使用してキャッピングされ得る。或る実施形態において、還元反応は、水性溶媒中で行われる。別の実施形態において、反応は、非プロトン性溶媒中で行われる。或る実施形態において、還元反応は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）中又はＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶媒中で行われる。
活性化された莢膜多糖体は、担体タンパク質に直接的に、又は二官能性リンカー等のスペーサー若しくはリンカーの使用により間接的にコンジュゲートされ得る。リンカーは、任意選択で、例えば、１つの反応性アミノ基及び１つの反応性カルボン酸基、２つの反応性アミノ基又は２つの反応性カルボン酸基を有する、ヘテロ二官能性又はホモ二官能性である。
コンジュゲーションに関する他の適切な技法は、例えば国際公開第９８／４２７２１号に記載されるように、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ－ニトロ安息香酸、Ｎ－ヒドロスクシンイミド、Ｓ－ＮＨＳ、ＥＯＣ、ＴＳＴＵを使用する。コンジュゲーションは、糖類の遊離水酸基と、１，１’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）との反応（Bethell et al. (1979) J. Biol. Chem. 254:2572-2574、Hearn et al. (1981) J. Chromatogr. 218:509-518を参照されたい）、続くカルバメート結合を形成するタンパク質との反応によって形成され得るカルボニルリンカーが関与し得る。これは、アノマー末端の、第一級水酸基への還元、第一級水酸基の任意選択の保護／脱保護、ＣＤＩカルバメート中間体を形成する第一級水酸基とＣＤＩとの反応、及びＣＤＩカルバメート中間体と、タンパク質上のアミノ基とのカップリングを包含し得る。
肺炎球菌コンジュゲートワクチンに関する多糖体対担体タンパク質の比は通常、０．３（ｗ／ｗ）～３．０（ｗ／ｗ）の範囲であるが、血清型によって多様であり得る。比は、存在するタンパク質及び多糖体の量の独立した測定によって、又は当該技術分野で既知の比の直接的な測定を行う方法のいずれかによって決定することができる。方法として、1Ｈ ＮＭＲ分光法又はコンジュゲートのサイズ分布にわたって糖類／タンパク質の比をプロファイリングすることができる二重モニタリング（例えば、総材料及びタンパク質含有量に関してそれぞれ屈折率及びＵＶ）を用いたＳＥＣ－ＨＰＬＣ－ＵＶ／ＲＩの使用及びＳＥＣ－ＨＰＬＣ－ＭＡＬＬＳ又はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳが挙げられる。
このようにして得られた多糖体－タンパク質コンジュゲートは、様々な方法によって精製及び富化され得る。これらの方法として、濃縮／ダイアフィルトレーション、カラムクロマトグラフィー、及び深層濾過が挙げられる。精製した多糖体－タンパク質コンジュゲートを組み合わせて、混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物を配合して、それをワクチンとして使用することができる。
ワクチン組成物の配合は、当該技術分野で認識されている方法を使用して遂行することができる。ワクチン組成物は、その意図される投与経路に適合するように配合される。個々の肺炎球菌莢膜多糖体－タンパク質コンジュゲートは、生理学的に許容可能なビヒクルと一緒に配合されて、組成物を作製することができる。かかるビヒクルの例として、水、平衡生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）及びデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態において、混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物は、アジュバントを更に含む。アジュバントは、抗原が吸着される鉱物（ミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム等のアルミニウム塩）の懸濁液、又は抗原溶液が鉱油中で乳化される油中水型エマルジョン（例えば、フロイント不完全アジュバント）、また場合によっては抗原性を更に増強するために死菌マイコバクテリア（mycobacteria）を含む油中水型エマルジョン（フロイント完全アジュバント）を含み得る。免疫賦活性オリゴヌクレオチド（ＣｐＧモチーフを含むもの等）もまた、アジュバントとして使用することができる（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号、同第６，２０７，６４６号、同第６，２１４，８０６号、同第６，２１８，３７１号、同第６，２３９，１１６号、同第６，３３９，０６８号、同第６，４０６，７０５号、及び同第６，４２９，１９９号を参照）。アジュバントはまた、脂質及び共刺激性分子等の生物学的分子を含む。例示的な生物学的アジュバントとして、ＡＳ０４［９］、ＩＬ－２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、Ｇ－ＣＳＦ、ＬＦＡ－３、ＣＤ７２、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＯＸ－４０Ｌ及び４１ ＢＢＬが挙げられる。
幾つかの実施形態において、アジュバントは、アルミニウムベースのアジュバントである。
特定の実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、及び水酸化アルミニウムからなる群から選択される。
特定の実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。
幾つかの実施形態において、組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニエの感染に対するワクチンとして使用するためのものである。
予防上の方法及び使用
１つの態様において、本開示は、混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物と薬学的に許容可能な賦形剤とを含むワクチンを提供する。幾つかの実施形態において、薬学的に許容可能な賦形剤は、少なくとも、コハク酸塩緩衝液等の緩衝液、塩化ナトリウム等の塩、及び／又はポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ポリソルベート８０）等の界面活性剤を含む。幾つかの実施形態において、血清型１及び５由来の莢膜多糖体は、破傷風トキソイドにコンジュゲートされ、血清型３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆ由来の莢膜多糖体は、ＣＲＭ197にコンジュゲートされる。別の実施形態において、血清型１及び３由来の莢膜多糖体は、破傷風トキソイドにコンジュゲートされ、血清型４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆ由来の莢膜多糖体は、ＣＲＭ197にコンジュゲートされる。更に別の実施形態において、血清型３及び５由来の莢膜多糖体は、破傷風トキソイドにコンジュゲートされ、血清型１、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆ由来の莢膜多糖体は、ＣＲＭ197にコンジュゲートされる。
幾つかの実施形態において、ワクチンは、ストレプトコッカス・ニューモニエ感染によって引き起こされる疾患に対するヒト対象における防御免疫応答を誘発する。
更なる態様によれば、本開示は、ストレプトコッカス・ニューモニエ感染又は疾患を予防する方法であって、ヒト対象に、予防上有効な量の混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物又は該組成物を含むワクチンを投与することを含む、方法を提供する。混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物又は該組成物を含むワクチンは、以下で更に詳細に記載するように、例えば全身経路又は粘膜経路を含む任意の経路によって投与され得る。
或る特定の実施形態において、ヒト対象は、高齢対象であり、疾患は、肺炎又は侵襲性肺炎球菌感染症（ＩＰＤ）である。或る特定の実施形態において、高齢対象は、少なくとも５０歳である。他の実施形態において、高齢対象は、少なくとも５５歳である。更に他の実施形態において、高齢対象は、少なくとも６０歳である。
他の実施形態において、ヒト対象は、乳幼児であり、疾患は、肺炎、侵襲性肺炎球菌感染症（ＩＰＤ）、又は急性中耳炎（ＡＯＭ）である。或る特定の実施形態において、乳幼児は、０歳～２歳である。他の実施形態において、乳幼児は、２ヵ月～１５ヵ月である。
更に別の実施形態において、ヒト対象は、６週齢～１７歳であり、疾患は、肺炎、侵襲性肺炎球菌感染症（ＩＰＤ）又は急性中耳炎（ＡＯＭ）である。或る特定の実施形態において、ヒト対象は、６週齢～５歳である。他の実施形態において、ヒト対象は、５歳～１７歳である。
各ワクチン用量におけるコンジュゲートの量又は混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物の予防上の有効量は、著しい有害作用を伴わずに予防を誘導する量として選択され得る。かかる量は、肺炎球菌血清型に応じて多様であり得る。概して、各用量は、多糖体約０．１μｇ～約１００μｇ、具体的には約０．１μｇ～１０μｇ、より具体的には約１μｇ～約５μｇを含み得る。特定のワクチンに関する構成成分の最適な量は、対象における適切な免疫応答の観察を含む標準的な研究によって確認することができる。例えば、ヒト対象のワクチン接種に関する量は、動物試験の結果を外挿することによって決定することができる。さらに、用量は、経験的に決定することができる。
幾つかの実施形態において、ワクチン又は混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物は、各莢膜多糖体約１μｇ～約５μｇ、ＴＴ約１μｇ～約２５μｇ、ＣＲＭ197約２０μｇ～約７５μｇ、及び任意選択で、元素アルミニウムアジュバント約０．１ｍｇ～約０．５ｍｇを含有するように配合された単回０．５ｍｌ用量であり得る。幾つかの実施形態において、ワクチン又は混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物は、血清型６Ｂを除く各莢膜多糖体約２μｇ～約２．５μｇ、血清型６Ｂの莢膜多糖体約４μｇ～約５μｇ、ＴＴ約５μｇ～約１５μｇ、ＣＲＭ197約３０μｇ～約６０μｇ、及び任意選択で、元素アルミニウムアジュバント約０．１ｍｇ～約０．２ｍｇを含有するように配合された単回０．５ｍｌ用量であり得る。或る特定の実施形態において、混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物又は該組成物を含むワクチンは、賦形剤として塩化ナトリウム及びコハク酸ナトリウム緩衝液を更に含む。
幾つかの実施形態において、混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物は、血清型１及び３の肺炎球菌莢膜多糖体がそれぞれ、ＴＴにコンジュゲートされ、肺炎球菌莢膜多糖体血清型４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆが、ＣＲＭ197にコンジュゲートされる液体製剤へと配合され得る。０．５ｍＬ用量はそれぞれ、約４．４μｇの６Ｂを除く各多糖体 約２．２μｇ、ＴＴ担体タンパク質（血清型１及び３のみに関して） 約１０μｇ～約１５μｇ及びＣＲＭ197担体タンパク質 約４０μｇ～約５０μｇ、アジュバントとしての元素アルミニウム ０．１２５ｍｇ（リン酸アルミニウム０．５ｍｇ）、並びに賦形剤としての塩化ナトリウム及びコハク酸ナトリウム緩衝液を含有する液体へと配合され得る。
幾つかの実施形態において、混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物は、血清型１及び５の肺炎球菌莢膜多糖体がそれぞれ、ＴＴにコンジュゲートされ、肺炎球菌莢膜多糖体血清型３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆが、ＣＲＭ197にコンジュゲートされる液体製剤へと配合され得る。０．５ｍＬ用量はそれぞれ、約４．４μｇの６Ｂを除く各糖類 約２．２μｇ、ＴＴ担体タンパク質（血清型１及び５のみに関して） 約５μｇ～約１０μｇ及びＣＲＭ197担体タンパク質 約４０μｇ～約５０μｇ、アジュバントである元素アルミニウム ０．１２５ｍｇ（リン酸アルミニウム０．５ｍｇ）、並びに賦形剤としての塩化ナトリウム及びコハク酸ナトリウム緩衝液を含有する液体へと配合され得る。
幾つかの実施形態において、混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物は、血清型３及び５の肺炎球菌莢膜多糖体がそれぞれ、ＴＴにコンジュゲートされ、肺炎球菌莢膜多糖体血清型１、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆが、ＣＲＭ197にコンジュゲートされる液体製剤へと配合され得る。０．５ｍＬ用量はそれぞれ、約４．４μｇの６Ｂを除く各糖類 約２．２μｇ、ＴＴ担体タンパク質（血清型３及び５のみに関して） 約１０μｇ～約１５μｇ及びＣＲＭ197担体タンパク質 約４０μｇ～約５０μｇ、アジュバントである元素アルミニウム 約０．１２５ｍｇ（リン酸アルミニウム０．５ｍｇ）、並びに賦形剤としての塩化ナトリウム及びコハク酸ナトリウム緩衝液を含有する液体へと配合され得る。
幾つかの実施形態において、液体製剤は、防腐剤を用いずに単回用量シリンジへ充填され得る。振盪後、液体製剤は、筋内投与の準備が整った均質な白色懸濁液であるワクチンとなる。
混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物は、単回注射で、又は一連の免疫付与の一部として投与することができる。例えば、混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物は、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、若しくは６ヵ月間隔又はそれらの組合せ等の適切に空けられた間隔で、２回、３回、４回、又はそれ以上の回数で投与することができる。幾つかの実施形態において、混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物は、例えば、約２ヵ月齢、３ヵ月齢、４ヵ月齢、及び１２ヵ月齢～１５ヵ月齢；約３ヵ月齢、４ヵ月齢、５ヵ月齢、及び１２ヵ月齢～１５ヵ月齢；又は約２ヵ月齢、４ヵ月齢、６ヵ月齢、及び１２ヵ月齢～１５ヵ月齢を含む、生後の最初の１５ヵ月以内で４回、乳幼児に投与される。この最初の用量は、早ければ６週齢で投与することができる。別の実施形態において、混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物は、例えば約２ヵ月齢、４ヵ月齢、及び１１ヵ月齢～１２ヵ月齢を含む、生後の最初の１５ヵ月以内で３回、乳幼児に投与される。
混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物はまた、ストレプトコッカス・ニューモニエ由来の１つ以上のタンパク質を含み得る。含むのに適したストレプトコッカス・ニューモニエタンパク質の例として、国際公開第０２／０８３８５５号において同定されるもの、及び国際公開第０２／０５３７６１号に記載されるものが挙げられる。
混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物は、非経口、経皮、又は経粘膜、鼻腔内、筋内、腹腔内、皮内、静脈内、又は皮下経路等の当業者に既知の１つ以上の投与経路を介して、対象に投与することができ、それに応じて配合することができる。混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物は、その意図される投与経路に適合するように配合され得る。
幾つかの実施形態において、混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物は、筋内、腹腔内、皮下、静脈内、動脈内、若しくは経皮注射又は呼吸器粘膜注射によって、液体製剤として投与することができる。混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物は、液体形態で、又は凍結乾燥形態で配合され得る。幾つかの実施形態において、注射可能な組成物は、従来の形態で、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして、注射前の液体中の溶解若しくは懸濁に適した固体形態として、又はエマルジョンとして作製される。幾つかの実施形態において、注射溶液及び懸濁液は、滅菌粉末又は顆粒から作製される。これらの経路による投与用の医薬品の配合及び製造における概論は、例えば、引用することにより本明細書の一部をなすRemington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995に見出され得る。目下のところ、経口若しくは鼻腔スプレー又はエアロゾル経路（例えば、吸入による）は、治療薬を肺及び呼吸器系に直接送達するのに最も一般的に使用される。幾つかの実施形態において、混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物は、定量投与量の組成物を送達するデバイスを使用して投与される。本明細書中に記載する皮内医薬組成物を送達する際の使用に適したデバイスとして、米国特許第４，８８６，４９９号、米国特許第５，１９０，５２１号、米国特許第５，３２８，４８３号、米国特許第５，５２７，２８８号、米国特許第４，２７０，５３７号、米国特許第５，０１５，２３５号、米国特許第５，１４１，４９６号、米国特許第５，４１７，６６２号（引用することによりそれらの全てが本明細書の一部をなす）に記載されるもの等のショートニードルデバイスが挙げられる。皮内組成物はまた、引用することにより本明細書の一部をなす国際公開第１９９９／３４８５０号に記載されるもの及びそれらの機能性等価体等の、皮膚への針の有効な侵入長を制限するデバイスによって投与され得る。また、液体ジェット式注射器により、又は角質層を貫通して、真皮に達するジェットを生じる針により、液体ワクチンを真皮へ送達するジェット式注射デバイスも適している。ジェット式注射デバイスは、例えば、米国特許第５，４８０，３８１号、米国特許第５，５９９，３０２号、米国特許第５，３３４，１４４号、米国特許第５，９９３，４１２号、米国特許第５，６４９，９１２号、米国特許第５，５６９，１８９号、米国特許第５，７０４，９１１号、米国特許第５，３８３，８５１号、米国特許第５，８９３，３９７号、米国特許第５，４６６，２２０号、米国特許第５，３３９，１６３号、米国特許第５，３１２，３３５号、米国特許第５，５０３，６２７号、米国特許第５，０６４，４１３号、米国特許第５，５２０，６３９号、米国特許第４，５９６，５５６号、米国特許第4，７９０，８２４号、米国特許第４，９４１，８８０号、米国特許第４，９４０，４６０号、国際公開第１９９７／３７７０５号及び国際公開第１９９７／１３５３７号（引用することによりそれらの全てが本明細書の一部をなす）に記載されている。また、圧縮ガスを使用して、粉末形態のワクチンを、皮膚の外層を通って真皮へと加速させるバリスティック粉末／粒子送達デバイスも適切である。さらに、従来型のシリンジは、皮内投与の古典的なマントゥー法において使用され得る。
非経口投与用の調製物として、滅菌水性又は非水性の溶液、懸濁液及びエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の油、及びオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。油の例として、植物油又は動物油、落花生油、大豆油、オリーブ油、ヒマワリ油、肝油、魚油（marine oil）等の合成油、及び牛乳又は卵から得られる脂質が挙げられる。水性担体として、水、生理食塩水及び緩衝媒質を含むアルコール性／水性の溶液、エマルジョン又は懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルとして、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、又は固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとして、流体及び栄養補液、電解質補液（リンゲルのデキストロースに基づくもの等）等が挙げられる。例えば、抗菌薬、酸化防止剤、キレート剤及び不活性ガス等の防腐剤及び他の添加剤もまた、存在し得る。
混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物は、単位用量バイアル、複数回用量バイアル、又はプレフィルドシリンジの形態で配合され得る。液体製剤用の薬学的に許容可能な担体として、水性若しくは非水性の溶媒、懸濁液、エマルジョン又は油が挙げられる。組成物は、等張性、高張性又は低張性であり得る。しかしながら、注入又は注射用の組成物は、基本的に等張性であることが望ましい。したがって、等張性又は高張性は、組成物の保管に好適であり得る。組成物が高張性である場合、組成物は、投与前に等張性へと希釈することができる。等張化剤は、塩等のイオン性等張化剤又は炭水化物等の非イオン性等張化剤であり得る。イオン性等張化剤として、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、及び塩化マグネシウムが挙げられるが、これらに限定されない。非イオン性等張化剤として、ソルビトール及びグリセロールが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、少なくとも１つの薬学的に許容可能な緩衝液が含まれる。例えば、組成物が、注入又は注射用である場合、ｐＨ４～ｐＨ１０、例えばｐＨ５～ｐＨ９、又はｐＨ６～ｐＨ８で緩衝能を有する緩衝液中で配合されることが好適である。緩衝液は、米国薬局方（ＵＳＰ）に適したものから選択され得る。例えば、緩衝液は、酢酸、安息香酸、グルコン酸、グリセリン酸及び乳酸等の一塩基酸；アコニット酸、アジピン酸、アスコルビン酸、炭酸、グルタミン酸、リンゴ酸、コハク酸及び酒石酸等の二塩基酸；クエン酸及びリン酸等の多塩基酸；並びにアンモニア、ジエタノールアミン、グリシン、トリエタノールアミン、及びＴＲＩＳ等の塩基からなる群から選択することができる。
混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物は、界面活性剤を含んでもよい。界面活性剤の例として、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（一般的に、Ｔｗｅｅｎと称される）、特に、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、ブチレンオキシド（ＢＯ）の共重合体（ＤＯＷＦＡＸ等）；エトキシ（オキシ－１，２－エタンジイル）基の種々の反復を伴うオクトキシノール、特にオクトキシノール－９（Ｔｒｉｔｏｎ－１００）；エチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０／ＮＰ－４０）；レシチン等のリン脂質；ＴＥＲＧＩＴＯＬ ＮＰシリーズ等のノニルフェノールエトキシレート；ラウリル、セチル、ステアリル、オレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤）、特にトリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）；ＳＰＡＮとして知られているソルビタンエーテル、特にソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）及びソルビタンモノラウレートが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｔｗｅｅｎ ８０／Ｓｐａｎ ８５等の界面活性剤の混合物を使用することができる。Ｔｗｅｅｎ ８０等のポリオキシエチレンソルビタンエステル及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００等のオクトキシノールの組合せもまた適切である。Ｌａｕｒｅｔｈ ９及びＴｗｅｅｎ及び／又はオクトキシノールの組合せもまた好適である。好ましくは、含まれるポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ ８０等）の量は、０．０１％（ｗ／ｖ）～１％（ｗ／ｖ）、０．０１％（ｗ／ｖ）～０．１％（ｗ／ｖ）、０．０１％（ｗ／ｖ）～０．０５％（ｗ／ｖ）、又は約０．０２％であってもよく、含まれるオクチルフェノキシポリオキシエタノール又はノニルフェノキシポリオキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００等）の量は、０．００１％（ｗ／ｖ）～０．１％（ｗ／ｖ）、特に０．００５％～０．０２％であってもよく、含まれるポリオキシエチレンエーテル（Ｌａｕｒｅｔｈ ９等）の量は、０．１％（ｗ／ｖ）～２０％（ｗ／ｖ）、場合によっては０．１％～１０％、特に０．１％～１％又は約０．５％であってもよい。
幾つかの実施形態において、混合担体の１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物は、放出制御系により送達されてもよい。例えば、静脈内注入、経皮膚パッチ、リポソーム、又は他の経路を投与に使用することができる。１つの態様において、ミクロスフェア等の巨大分子又はインプラントを使用することができる。
上述の開示は、本発明を一般的に記載している。より完全な理解は、下記の特定の実施例を参照することによって得ることができる。これらの実施例は、単に説明の目的で記載されており、本発明の範囲を限定するものと意図されない。
実施例１．Ｓ．ニューモニエ莢膜多糖体の作製
Ｓ．ニューモニエの培養及び莢膜多糖体の精製は、当業者に既知であるように実施した。Ｓ．ニューモニエ血清型は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）から入手した（血清型１：ＡＴＣＣ番号６３０１、血清型３：ＡＴＣＣ番号６３０３、血清型４：ＡＴＣＣ番号６３０４；血清型５：ＡＴＣＣ番号６３０５；血清型６Ａ：ＡＴＣＣ番号６３０６；血清型６Ｂ：ＡＴＣＣ番号６３２６；血清型７Ｆ：ＡＴＣＣ番号１０３５１；血清型９Ｖ：ＡＴＣＣ番号１０３６８；血清型１２Ｆ：ＡＴＣＣ番号６３１２；血清型１４：ＡＴＣＣ番号６３１４；血清型１８Ｃ：ＡＴＣＣ番号１０３５６；血清型１９Ａ：ＡＴＣＣ番号１０３５７；血清型１９Ｆ：ＡＴＣＣ番号６３１９；血清型２２Ｆ：ＡＴＣＣ番号６３２２；血清型２３Ｆ：ＡＴＣＣ番号６３２３；血清型３３Ｆ：ＡＴＣＣ番号１０３７０）。Ｓ．ニューモニエは、莢膜及び非運動性、グラム陽性のランセット型双球菌、及び血液寒天培地におけるアルファ溶血を特徴とした。血清型は、特異的な抗血清を使用して膨化試験によって同定された（米国特許第５，８４７，１１２号）。
細胞バンクの作製
株を増殖させて、動物起源の構成成分を除去するために、数世代の種ストックを生成した（世代Ｆ１、Ｆ２、及びＦ３）。２つの更なる世代の種ストックを生産した。第１の更なる世代は、Ｆ３バイアルから培養し、続く世代は、第１の更なる世代のバイアルから培養した。種バイアルは、凍結保存料として合成グリセロールを用いて凍結保管した（－７０℃未満）。細胞バンク作製に関して、培養物は全て、大豆ベースの培地中で成長させた。凍結に先立って、細胞を遠心分離によって濃縮して、使用済みの培地を除去して、細胞ペレットを、凍結保存料（合成グリセロール等）を含有する新鮮な培地中に再懸濁させた。
培養及び収集
研究中の細胞バンク由来の培養物を、大豆ベースの培地を含有する種ボトルに接種して、培養した。標的光学密度（吸光度）に到達した後、種ボトルを使用して、大豆ベースの培地を含有する発酵槽に接種した。光学密度値が一定に維持され始めたら、培養を終結させた。培養を終結した後、デオキシコール酸ナトリウムを培養物に添加して、細胞を溶解させた。得られた発酵槽の内容物を冷却して、タンパク質沈殿を誘導した。続いて、混合物を遠心分離して、沈殿したタンパク質及び細胞残屑を除去した。
精製
遠心分離から得られた溶液を、デプスフィルターに通して濾過して、遠心分離で沈殿されなかったタンパク質及び細胞残屑を除去した。濾液を、１００ｋＤａのＭＷ膜上で濃縮して、１０倍容量の２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて、濃縮液をダイアフィルトレーションして、試料を得た。試料を濾過して、上清を収集し、そこから、多糖体を沈殿及び濾過した。濾液を、３０ｋＤａの膜上で濃縮して、約１０倍容量の三重蒸留水を使用して、濃縮液をダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションを実施した後、残存した溶液を、０．２μｍのフィルターに通して濾過した。インプロセス管理試験を濾液に対して実施した（外観、残存タンパク質、残存核酸、エンドトキシン、分子量、及び多糖体の総量）。濃縮液を滅菌濾過して、－２０℃で保管した。
実施例２．Ｓ．ニューモニエ莢膜多糖体及び担体タンパク質のコンジュゲートの作製
異なる血清型の多糖体を、下記の異なる経路で活性化した後、担体タンパク質であるＣＲＭ197又はＴＴにコンジュゲートした。具体的には、コンジュゲートは、全ての血清型の莢膜多糖体それぞれを、ＣＲＭ197にコンジュゲートすることによって、また血清型１、３及び５の莢膜多糖体それぞれを、ＴＴにコンジュゲートすることによって作製した。活性化プロセスは、各莢膜多糖体のサイズを標的分子量へ低減すること、化学的活性化及び限外濾過による緩衝液交換を含む。コンジュゲートを、限外濾過を使用して精製し、最終的に０．２μｍのフィルターに通して濾過した。ｐＨ、温度、濃度、及び時間等のプロセスパラメーターは下記の通りであった。
（１）活性化プロセス
工程１：加水分解
還元的アミノ化は、ポリマーをコンジュゲートする既知の方法であり、還元的アミノ化において、タンパク質の第一級アミン（－ＮＨ2）基と糖類のアルデヒドとの間で、アミド結合が形成される。しかしながら、Ｓ．ニューモニエ多糖体は、いかなるアルデヒド基も有さないため、アルデヒド基を肺炎球菌莢膜多糖体に付加する。単糖類のジオール構造は、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ4）によって酸化されて、アルデヒド基を形成することができる。血清型１、３、４、６Ａ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、２２Ｆ、及び３３Ｆ由来の莢膜多糖体を、下記の通りに前処理した。
血清型１の場合、水酸化ナトリウム（最終塩基濃度０．０５Ｍで）を莢膜多糖体の溶液に添加して、溶液を５０℃±２℃でインキュベートした。次に、溶液を、約２１℃～約２５℃の範囲の温度に冷却して、最終ｐＨが６．０±０．１になるように、塩酸をそこに添加して、それによって加水分解を停止させた。
血清型３の場合、塩酸（最終酸濃度０．０１Ｍで）を莢膜多糖体の溶液に添加して、溶液を６０℃±２℃でインキュベートした。次に、溶液を、約２１℃～約２５℃の範囲の温度に冷却して、最終ｐＨが６．０±０．１になるように、０．１Ｍリン酸ナトリウムをそこに添加して、それによって加水分解を停止させた。
血清型４の場合、塩酸（最終酸濃度０．１Ｍで）を莢膜多糖体の溶液に添加して、溶液を４５℃±２℃でインキュベートした。次に、溶液を、約２１℃～約２５℃の範囲の温度に冷却して、最終ｐＨが６．０±０．１になるように、１Ｍリン酸ナトリウムをそこに添加して、それによって加水分解を停止させた。
血清型６Ａの場合、氷酢酸（最終酸濃度０．１Ｍで）を莢膜多糖体の溶液に添加して、溶液を６０℃±２℃でインキュベートした。次に、溶液を、約２１℃～約２５℃の範囲の温度に冷却して、最終ｐＨが６．０±０．１になるように、１Ｍ水酸化ナトリウムをそこに添加した。
血清型１２Ｆの場合、塩酸（最終酸濃度０．０１Ｍで）を莢膜多糖体の溶液に添加して、溶液を７０℃±２℃でインキュベートした。次に、溶液を、約２１℃～約２５℃の範囲の温度に冷却して、溶液の最終ｐＨが６．０±０．１になるように、０．１Ｍリン酸ナトリウムをそこに添加して、それによって加水分解を停止させた。
血清型１４及び１８Ｃの場合、氷酢酸（最終酸濃度０．２Ｍで）を莢膜多糖体の溶液に添加して、溶液を約９１℃～９６℃でインキュベートした。次に、溶液を、約２１℃～約２５℃の範囲の温度に冷却して、溶液の最終ｐＨが６．０±０．１になるように、１Ｍリン酸ナトリウムをそこに添加した。
血清型２２Ｆ及び３３Ｆの場合、塩酸（最終酸濃度０．０１Ｍで）を莢膜多糖体の溶液に添加して、溶液を６０℃±２℃でインキュベートした。次に、溶液を、約２１℃～約２５℃の範囲の温度に冷却して、最終ｐＨが６．０±０．１になるように、０．１Ｍリン酸ナトリウムをそこに添加して、それによって加水分解を停止させた。
得られた莢膜多糖体をそれぞれ、最終濃度が約１．０ｍｇ／ｍＬ～約２．０ｍｇ／ｍＬになるように、注射用水（ＷＦＩ）、酢酸ナトリウム、及びリン酸ナトリウム中に希釈した。
工程２：過ヨウ素酸塩反応
各肺炎球菌糖類活性化に対してモル当量の過ヨウ素酸ナトリウムを、総糖類含有量を使用して決定した。完璧に混合して、酸化反応を、１、７Ｆ及び１９Ｆを除く全ての血清型に関して２１℃～２５℃で１６時間～２０時間進行させ、１、７Ｆ及び１９Ｆに関しては、温度は、１０℃以下にした。コンジュゲーションプロセス中、適切なレベルでアルデヒド濃度を維持することによって、コンジュゲートの一貫した、かつ安定な生産が行われる。アルデヒドの生産度は、生産されるアルデヒドの濃度と、糖類の濃度との間の比によって決定され、この度合いは、表２及び表３に示すように、各血清型に関して設定される酸化度（Ｄｏ）に関連する。
Figure 0007001686000002
Figure 0007001686000003
工程３：限外濾過
酸化した糖類を濃縮して、１００ｋＤａ ＭＷＣＯ限外濾過膜（血清型１に関しては３０ｋＤａの限外濾過膜及び血清型１８Ｃに関しては５ｋＤａの限外濾過膜）上で、ＷＦＩを用いてダイアフィルトレーションした。血清型１に関しては０．９％塩化ナトリウム溶液、血清型７Ｆ及び２３Ｆに関しては０．０１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）、並びに血液型１９Ｆに関しては０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を使用して、ダイアフィルトレーションを実施した。透過液を廃棄して、残余分を、０．２μｍのフィルターに通して濾過した。
工程４：凍結乾燥
担体タンパク質にコンジュゲートされる血清型３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆ、及び３３Ｆの莢膜多糖体に関して、水性溶媒を使用することによって、多糖体及び担体タンパク質の混合溶液を、スクロースを添加せずに作製して、凍結乾燥させた後、－２５℃±５℃で保管した。
担体タンパク質にコンジュゲートされる血清型１及び１８Ｃの莢膜多糖体に関して、水性溶媒を使用することによって、多糖体及び担体タンパク質を、スクロースを添加せずに独立して作製して、凍結乾燥させた後、－２５℃±５℃で保管した。
担体タンパク質にコンジュゲートされる血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１９Ａ、１９Ｆ、及び２３Ｆの莢膜多糖体に関して、ＤＭＳＯ溶媒を使用することによって、最終スクロース濃度５％±３％に達する既定量のスクロースを、活性化した糖類に添加して、試料を、独立して作製して、凍結乾燥させた後、－２５℃±５℃で保管した。
血清型１２Ｆの莢膜多糖体に関して、最終スクロース濃度１０％±５％に達する既定量のスクロースを、活性化した糖類に添加して、試料を、ガラス瓶に充填して、凍結乾燥させた後、－２５℃±５℃で保管した。
（２）コンジュゲーションプロセス
水性コンジュゲーションは、血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、１８Ｃ、２２Ｆ、及び３３Ｆに関して行われ、ＤＭＳＯコンジュゲーションは、血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１２Ｆ、１９Ａ、１９Ｆ、及び２３Ｆに関して行われた。莢膜多糖体はそれぞれ、０．２～２：１の比で、担体タンパク質にコンジュゲートされた。
工程１：溶解
水性コンジュゲーション
血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、１８Ｃ、２２Ｆ、及び３３Ｆに関して、凍結乾燥した試料を、解凍して、室温で平衡化した。凍結乾燥した試料は、各血清型に関して設定された比で、２３℃±２℃で、リン酸ナトリウム緩衝液溶液を使用することによって、反応濃度に再構成させた。
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）コンジュゲーション
血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１２Ｆ、１９Ａ、１９Ｆ、及び２３Ｆに関して、凍結乾燥した試料を解凍して、室温で平衡化して、ＤＭＳＯ中に再構成させた。
工程２：コンジュゲーション反応
水性コンジュゲーション
ＣＲＭ197にコンジュゲートされる血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、１８Ｃ、２２Ｆ、及び３３Ｆに関して、コンジュゲーション反応は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）を、糖類１モルにつき１．０モル～１．４モルのシアノ水素化ホウ素ナトリウムになるように添加することによって開始した。しかしながら、血清型１及び３に関しては、反応は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液を、糖類１モルにつき０．５モルのシアノ水素化ホウ素ナトリウムになるように添加することによって開始した。
ＴＴにコンジュゲートされる血清型１、３及び５に関して、コンジュゲーション反応は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）を、糖類１モルにつき１．０モル～１．４モルのシアノ水素化ホウ素ナトリウムになるように添加することによって開始したが、但し、糖類１モルにつき０．５モルのシアノ水素化ホウ素ナトリウムになるように添加する血清型１を除く。
反応混合物は、２３℃～３７℃で、４４時間～１０６時間インキュベートした。反応温度及び時間は、血清型によって調節した。次に、温度を２３℃±２℃に低減して、塩化ナトリウム０．９％を反応器に添加した。水素化ホウ素ナトリウム溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）を、糖類１モルにつき１．８モル当量～２．２モル当量の水素化ホウ素ナトリウムを達成するように添加した。混合物は、２３℃±２℃で、３時間～６時間インキュベートした。この手順により、糖類上に存在する任意の未反応アルデヒドが低減された。続いて、混合物を塩化ナトリウム０．９％で希釈して、希釈したコンジュゲーション混合物を、０．８μｍ又は０．４５μｍのプレフィルターを使用して濾過した。
ＤＭＳＯコンジュゲーション
血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１２Ｆ、１９Ａ、１９Ｆ、及び２３Ｆの莢膜多糖体に関して、コンジュゲーション反応は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）を、活性化した糖類１モルにつき０．８モル当量～１．２モル当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウムの比になるように添加することによって開始した。ＷＦＩを、標的濃度１％（ｖ／ｖ）になるように反応混合物に添加して、混合物を、２３℃±２℃で１２時間～２６時間インキュベートした。１００ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素ナトリウム溶液（通常、活性化した糖類１モルにつき１．８モル当量～２．２モル当量の水素化ホウ素ナトリウム）及びＷＦＩ（標的５％ｖ／ｖ）を反応物に添加して、混合物を、２３℃±２℃で３時間～６時間インキュベートした。この手順により、糖類上に存在する任意の未反応アルデヒドが低減された。続いて、反応混合物を塩化ナトリウム０．９％で希釈して、希釈したコンジュゲーション混合物を、０．８μｍ又は０．４５μｍのプレフィルターを使用して濾過した。
工程３：限外濾過
希釈したコンジュゲート混合物を濃縮して、最低１５倍容量の０．９％塩化ナトリウム又は緩衝液を用いて、１００ｋＤａのＭＷＣＯ限外濾過フィルター又は３００ｋＤａのＭＷＣＯ限外濾過フィルター上でダイアフィルトレーションした。また、プロセスで使用する緩衝液のタイプ及びｐＨは、血清型それぞれに応じて多様であった。
工程４：滅菌濾過
限外濾過後の残余分を滅菌濾過して（０．２μｍ）、インプロセス管理（外観、遊離タンパク質、遊離糖類、分子サイズ分布、滅菌性、糖類含有量、タンパク質含有量、ｐＨ、エンドトキシン、残留シアン化物、残留ＤＭＳＯ、糖類アイデンティティ（identity：同一性）、ＴＴアイデンティティ、及びＣＲＭ197アイデンティティ）を、濾過したコンジュゲートに対して実施した。最終濃縮液を冷蔵して、２℃～８℃で保管した。
実施例３．多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの配合
実施例２から得られる最終的なバルク濃縮液の望ましい容量は、バッチ容量及びバルク糖類濃度に基づいて算出した。０．８５％塩化ナトリウム（生理食塩水）、ポリソルベート８０、及びコハク酸塩緩衝液を、予めラベルをした配合容器に添加した後、バルク濃縮液を添加した。次に、調製物を完全に混合して、０．２μｍの膜に通して滅菌濾過した。配合したバルクを、バルクリン酸アルミニウムの添加中及び後に、穏やかに混合した。ｐＨを確認して、必要に応じて調節した。配合したバルク生成物を、２℃～８℃で保管した。下記の４つのタイプの多価肺炎球菌コンジュゲートワクチン製剤を作製して、それぞれ、ＰＣＶ１６－ＣＲＭ１９７、ＰＣＶ１６－１３ＴＴ、ＰＣＶ１６－１５ＴＴ、及びＰＣＶ１６－３５ＴＴと名付けた。
ＰＣＶ１６－ＣＲＭ１９７は、１６個の血清型（血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆ）の多糖体それぞれを、ＣＲＭ197にコンジュゲートすることによって作製される多糖体－コンジュゲートを含んでおり、
ＰＣＶ１６－１３ＴＴは、血清型１及び３の多糖体それぞれをＴＴに、また血清型４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆの多糖体それぞれをＣＲＭ197にコンジュゲートすることによって作製される多糖体－コンジュゲートを含んでおり、
ＰＣＶ１６－１５ＴＴは、血清型１及び５の多糖体それぞれをＴＴに、また血清型３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆの多糖体それぞれをＣＲＭ197にコンジュゲートすることによって作製される多糖体－コンジュゲートを含んでおり、
ＰＣＶ１６－３５ＴＴは、血清型３及び５の多糖体それぞれをＴＴに、また血清型１、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆの多糖体それぞれをＣＲＭ197にコンジュゲートすることによって作製される多糖体－コンジュゲートを含んでいた。
得られたＰＣＶ１６－１３ＴＴ及びＰＣＶ１６－３５ＴＴワクチン組成物には、総計０．５ｍｌ用量中に、４．４μｇの血清型６Ｂを除く各糖類 ２．２μｇ、ＴＴ（血清型１及び３に関して） １０μｇ～１５μｇ及びＣＲＭ197 ４０μｇ～５０μｇ、アジュバントである元素アルミニウム ０．１２５ｍｇ（リン酸アルミニウム０．５ｍｇ）、塩化ナトリウム ４．２５ｍｇ、コハク酸塩緩衝液溶液 約２９５μｇ、及びポリソルベート８０ 約１００μｇが含まれた。総用量０．５ｍＬ中のＰＣＶ１６－１５ＴＴ組成物には、ＴＴ ５μｇ～１０μｇ及びＣＲＭ197 ４０μｇ～５０μｇが含まれ、それぞれ、他の構成成分及びそれらの含有量は、ＰＣＶ１６－１３ＴＴ及びＰＣＶ１６－３５ＴＴの他の構成成分及びそれらの含有量と同一であった。
実施例４．多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの免疫原性
混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンである実施例３で作製したＰＣＶ１６－ＣＲＭ１９７、ＰＣＶ１６－１３ＴＴ、ＰＣＶ１６－１５ＴＴ、及びＰＣＶ１６－３５ＴＴを、ウサギにおいて免疫原性応答を誘導する能力に関して検査した。これらの免疫原性効果は、血清ＩｇＧ濃度に関しては抗原特異的ＥＬＩＳＡによって、また抗体機能に関してはオプソニン作用アッセイ（opsonophagocytic assay）（ＯＰＡ）によって特性化した。計画的なヒト臨床用量よりも５％高い用量の製剤中の各多糖体（各多糖体 ２．３１μｇ、但し、４．６２μｇの６Ｂは除く）又はヒト用量（各多糖体 ２．２μｇ、但し、４．４μｇの６Ｂは除く）で、０週及び３週にニュージーランドホワイトウサギの筋内に免疫付与した。免疫付与後の３週毎に、血清を試料採取した。濃度はともに、同じ結果を示した。
ＰＣＶ１６－ＣＲＭ１９７、ＰＣＶ１６－１３ＴＴ、ＰＣＶ１６－１５ＴＴ、及びＰＣＶ１６－３５ＴＴ組成物に関する血清型特異的な免疫反応は、ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ及び機能性抗体を測定する補体媒介性ＭＯＰＡによって評価した。
４－１．ＰＣＶ１６－ＣＲＭ１９７
血清型特異的なＩｇＧ濃度測定
各血清型に関する莢膜多糖体（ＰｎＰ）を、９６ウェルプレート上で、０．５μｇ／ウェル～１μｇ／ウェルでコーティングした。等価量の血清を、各対象から試料採取して、群毎にプールした。血清プールを、Ｔｗｅｅｎ２０及びＣＷＰＳ ５μｇ／ｍＬを含む抗体希釈緩衝液にて２．５倍で段階希釈して、続いて、室温で３０分間反応させた。プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄した後、前吸着させて、希釈した血清５０μｌを、コーティングしたウェルプレートに添加して、続いて室温で２時間～１８時間インキュベートした。ウェルプレートを同じ方法で洗浄した後、ヤギ抗ウサギＩｇＧ－アルカリホスファターゼコンジュゲートを各ウェルに添加して、続いて室温で２時間インキュベートした。プレートを上述するように洗浄して、基質として１ｍｇ／ｍＬのｐ－ニトロフェニルアミン緩衝液を各ウェルに添加して、続いて室温で２時間反応させた。３Ｍ ＮａＯＨ ５０μｌを添加することによって、反応をクエンチして、４０５ｎｍ及び６９０ｎｍでの吸光度を測定した。比較例として、市販の１３価ワクチン（ＰＲＥＶＮＡＲ１３）を同じ手順に付した。結果を表４に示す。
Figure 0007001686000004
ＰＣＶ１６－ＣＲＭ１９７は、１６個全ての血清型に関して、良好なレベルの血清型特異的なＩｇＧ濃度をもたらすことがわかった。ＰＣＶ１６－ＣＲＭ１９７に関して、ＰＣＶ１６－ＣＲＭ１９７及びＰＲＥＶＮＡＲ１３に共通する血清型は、ＰＲＥＶＮＡＲ１３の血清型特異的なＩｇＧ濃度に等しいか、又はそれよりも高い血清型特異的なＩｇＧ濃度を示し、また、新たに加えられた血清型１２Ｆ、２２Ｆ、及び３３Ｆそれぞれも、良好なレベルの血清型特異的なＩｇＧ濃度を示した。
機能性免疫原性試験（ＭＯＰＡ）
抗体機能は、ＭＯＰＡアッセイにおいて血清を検査することによって評価した。－７０℃以下で保管したＳ．ニューモニエＭＯＰＡ株を、各株の濃度が、約５００００ＣＦＵ／ｍＬになるように、相当する最終希釈倍数に希釈した。等価量の血清を各対象から試料採取して、群毎にプールして、血清２０μｌがＵ底プレート中に残るように２倍で段階希釈した。試料を希釈した後、各血清型に関して作製された株１０μｌを、希釈した試料と混合して、混合物を室温で３０分間反応させて、その結果、Ｓ．ニューモニエ及び抗体は良好に混合された。予め分化させたＨＬ－６０細胞及び補体の混合物を添加して、ＣＯ2インキュベーター（３７℃）中で４５分間反応させた。温度を低減させて、食作用を停止させて、反応溶液１０μｌを、３０分～６０分間予め乾燥させた寒天プレート上にスポッティングして、続いて、乾燥するまで２０分間、プレート上に吸収させた。２５ｍｇ／ｍＬのＴＴＣストック溶液を、作製したオーバーレイ寒天に添加して、そこに、相当する株に適した抗体を添加した。混合物を完全に混合した後、混合物 約２５ｍＬをプレート上に添加して、約３０分間硬化させた。完全に硬化したプレートを、ＣＯ2インキュベーター（３７℃）中で１２時間～１８時間インキュベートして、続いてコロニーを計数した。ＭＯＰＡ力価は、５０％死滅が観察される希釈率として表した。比較例として、市販の１３価ワクチン（ＰＲＥＶＮＡＲ１３）を同じ手順に付した。結果を表５に示す。
Figure 0007001686000005
全ての血清型が、ＰＣＶ１６－ＣＲＭ１９７において、優れたレベルの機能性免疫原性を示した。ＰＣＶ１６－ＣＲＭ１９７に関して、ＰＣＶ１６－ＣＲＭ１９７及びＰＲＥＶＮＡＲ１３に共通する血清型は、ＰＲＥＶＮＡＲ１３の機能性免疫原性に等しいか、又はそれよりも良好な機能性免疫原性を示し、新たに加えられた血清型１２Ｆ、２２Ｆ、及び３３Ｆもまた、高レベルの機能性免疫原性を示した。
４－２．ＰＣＶ１６－１３ＴＴ
血清型特異的なＩｇＧ濃度及び機能性免疫原性力価を、４－１と同じように測定したが、但し、ＰＣＶ１６－１３ＴＴを、ＰＣＶ１６－ＣＲＭ197に代わって使用し、結果を下記の通りに示す。
血清型特異的なＩｇＧ濃度測定
Figure 0007001686000006
血清型１及び３の莢膜多糖体が、ＴＴにコンジュゲートされた場合、それらは、血清型がＣＲＭ197にコンジュゲートされた場合に得られる血清型特異的なＩｇＧと比較して、著しく増加したレベルの血清型特異的なＩｇＧを示した。また、ＣＲＭ197にコンジュゲートされた血清型１２Ｆ、２２Ｆ、及び３３Ｆの莢膜多糖体はそれぞれ、十分なレベルの血清型特異的なＩｇＧ濃度を示し、血清型４、６Ｂ、７Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、及び１９Ｆは、ＰＲＥＶＮＡＲ１３よりも高レベルの血清型特異的なＩｇＧ濃度を示した。
機能性免疫原性試験（ＭＯＰＡ）
Figure 0007001686000007
血清型１及び３の莢膜多糖体が、ＴＴにコンジュゲートされた場合、機能性免疫原性は、それらがＣＲＭ197にコンジュゲートされた場合に得られる機能性免疫原性と比較して改善された。また、ＣＲＭ197にコンジュゲートされた血清型１２Ｆ、２２Ｆ、及び３３Ｆの莢膜多糖体はそれぞれ、優れた機能性免疫原性を示し、血清型４、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１９Ａ、及び１９Ｆの莢膜多糖体はそれぞれ、ＰＲＥＶＮＡＲ１３よりも良好な機能性免疫原性を示した。
４－３．ＰＣＶ１６－１５ＴＴ
血清型特異的なＩｇＧ濃度及び機能性免疫原性力価を、４－１と同じように測定したが、但し、ＰＣＶ１６－１５ＴＴを、ＰＣＶ１６－ＣＲＭ197に代わって使用し、結果を下記の通りに示す。
血清型特異的なＩｇＧ濃度測定
Figure 0007001686000008
血清型１及び５の莢膜多糖体が、ＴＴにコンジュゲートされた場合、血清型特異的なＩｇＧ濃度は、それらがＣＲＭ197にコンジュゲートされた場合に得られる血清型特異的なＩｇＧ濃度と比較して、著しく増加された。また、ＣＲＭ197にコンジュゲートされた血清型１２Ｆ、２２Ｆ、及び３３Ｆの莢膜多糖体はそれぞれ、高レベルの血清型特異的なＩｇＧ濃度を示し、血清型３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、及び１９Ｆの莢膜多糖体はそれぞれ、ＰＲＥＶＮＡＲ１３よりも高レベルの血清型特異的なＩｇＧ濃度を示した。
機能性免疫原性試験（ＭＯＰＡ）
Figure 0007001686000009
血清型１及び５の莢膜多糖体が、ＴＴにコンジュゲートされた場合、機能性免疫原性は、それらがＣＲＭ197にコンジュゲートされた場合に得られる機能性免疫原性と比較して改善された。また、ＣＲＭ197にコンジュゲートされた血清型１２Ｆ、２２Ｆ、及び３３Ｆの莢膜多糖体はそれぞれ、優れた機能性免疫原性を示し、血清型３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、及び１９Ｆの莢膜多糖体はそれぞれ、ＰＲＥＶＮＡＲ１３よりも高レベルの機能性免疫原性を示した。
４－４．ＰＣＶ１６－３５ＴＴ
血清型特異的なＩｇＧ濃度及び機能性免疫原性力価を、４－１と同じように測定したが、但し、ＰＣＶ１６－３５ＴＴを、ＰＣＶ１６－ＣＲＭ197に代わって使用し、結果を下記の通りに示す。
血清型特異的なＩｇＧ濃度測定
Figure 0007001686000010
血清型３及び５の莢膜多糖体が、ＴＴにコンジュゲートされた場合、血清型特異的なＩｇＧ濃度は、それらがＣＲＭ197にコンジュゲートされた場合に得られる血清型特異的なＩｇＧ濃度と比較して、著しく増加された。また、ＣＲＭ197にコンジュゲートされた血清型１２Ｆ、２２Ｆ、及び３３Ｆの莢膜多糖体はそれぞれ、良好な血清型特異的なＩｇＧ濃度を有し、血清型１、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、及び１９Ｆの莢膜多糖体はそれぞれ、ＰＲＥＶＮＡＲ１３よりも高レベルの血清型特異的なＩｇＧ濃度を示した。
機能性免疫原性試験（ＭＯＰＡ）
Figure 0007001686000011
血清型３及び５が、ＴＴにコンジュゲートされた場合、機能性免疫原性は、それらがＣＲＭ197にコンジュゲートされた場合に得られる機能性免疫原性と比較して改善された。また、ＣＲＭ197にコンジュゲートされた血清型１２Ｆ、２２Ｆ、及び３３Ｆの莢膜多糖体はそれぞれ、優れた機能性免疫原性を示し、血清型１、４、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ及び１９Ｆの莢膜多糖体はそれぞれ、ＰＲＥＶＮＡＲ１３よりも高レベルの機能性免疫原性を示した。
これらの結果は、混合担体の１６価肺炎球菌莢膜多糖体コンジュゲート組成物が、単一担体の肺炎球菌莢膜多糖体コンジュゲートワクチンであるＰＲＥＶＮＡＲ１３に等しいか、又はそれよりも良好な免疫原性を誘導することを示す。これらの結果はまた、予期せぬことに、混合担体組成物において破傷風トキソイドにコンジュゲートされた血清型１、３及び／又は５に対する抗体応答が、単一担体のＰＲＥＶＮＡＲ１３ワクチンにおいてＣＲＭ197にコンジュゲートされた同じ血清型に対する抗体応答と比較した場合に、著しく増強されたことを示す。さらに、これらの結果は、混合担体の１６価肺炎球菌莢膜多糖体コンジュゲート組成物が、加えられた血清型１２Ｆ、２２Ｆ、及び３３Ｆに対する抗体応答を首尾よく誘導し、現在市場に出回っている肺炎球菌莢膜多糖体コンジュゲートワクチンよりも広範囲の血清型防御をもたらすことを示している。
１つ以上の例示的な実施形態を、本明細書において記載してきたが、形態及び詳細における様々な変更が、添付の特許請求の範囲によって規定されるような本発明の概念の趣旨及び範囲を逸脱することなく、それらの実施形態において成され得ることは、当業者に理解されよう。
参照文献
下記の参照文献は、本出願において引用され、当該技術分野に関する一般的な情報を提供し、本出願で論述するアッセイ及び他の詳細を提供する。下記の参照文献は、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
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Claims (17)

  1. １６個の異なる肺炎球菌莢膜多糖体－タンパク質コンジュゲートを含み、
    肺炎球菌莢膜多糖体－タンパク質コンジュゲートはそれぞれ、異なる血清型のストレプトコッカス・ニューモニエ由来の莢膜多糖体にコンジュゲートされたタンパク質担体を含み、
    該ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型は、１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆであり、
    該タンパク質担体は、ＣＲＭ197又は破傷風トキソイドであり、
    該莢膜多糖体のうちの２つは、破傷風トキソイドにコンジュゲートされ、残りの莢膜多糖体は、ＣＲＭ197にコンジュゲートされ、
    破傷風トキソイドにコンジュゲートされる該２つの莢膜多糖体は、血清型１、３及び５からなる群から選択される、混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物。
  2. 血清型１及び５由来の前記莢膜多糖体は、破傷風トキソイドにコンジュゲートされ、血清型３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆ由来の前記莢膜多糖体は、ＣＲＭ197にコンジュゲートされる、請求項１に記載の混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物。
  3. 血清型１及び３由来の前記莢膜多糖体は、破傷風トキソイドにコンジュゲートされ、血清型４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆ由来の前記莢膜多糖体は、ＣＲＭ197にコンジュゲートされる、請求項１に記載の混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物。
  4. 血清型３及び５由来の前記莢膜多糖体は、破傷風トキソイドにコンジュゲートされ、血清型１、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆ由来の前記莢膜多糖体は、ＣＲＭ197にコンジュゲートされる、請求項１に記載の混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物。
  5. アジュバントを更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物。
  6. 前記アジュバントは、アルミニウムベースのアジュバントである、請求項５に記載の混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物。
  7. 前記アジュバントは、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、及び水酸化アルミニウムからなる群から選択される、請求項６に記載の混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物。
  8. 前記アジュバントは、リン酸アルミニウムである、請求項７に記載の混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物。
  9. 対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ感染又は疾患に対する予防のための、請求項１～８のいずれか一項に記載の混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物。
  10. 請求項１～８のいずれか一項に記載の混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物と薬学的に許容可能な賦形剤とを含むワクチン。
  11. 対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ感染又は疾患の予防のための、請求項１０に記載のワクチン。
  12. 前記対象は、少なくとも５０歳のヒトであり、前記疾患は、肺炎又は侵襲性肺炎球菌感染症（ＩＰＤ）である、請求項９に記載の混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物又は請求項１１に記載のワクチン。
  13. 前記対象は、少なくとも６週齢のヒトであり、前記疾患は、肺炎、侵襲性肺炎球菌感染症（ＩＰＤ）、又は急性中耳炎（ＡＯＭ）である、請求項９に記載の混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物又は請求項１１に記載のワクチン。
  14. 前記対象は、６週齢から５歳、２ヵ月齢から１５ヵ月齢、又は６歳から１７歳である、請求項１３に記載の混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物又はワクチン。
  15. 前記対象はヒトである、請求項９に記載の混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物又は請求項１１に記載のワクチン。
  16. 前記混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物又は前記ワクチンは、筋内注射によって投与される、請求項９に記載の混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物又は請求項１１に記載のワクチン。
  17. 前記混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物又は前記ワクチンは、一連の免疫付与の一部として投与される、請求項９に記載の混合担体の多価肺炎球菌コンジュゲート組成物又は請求項１１に記載のワクチン。
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