CZ305324B6 - Imunogenní prostředek, způsob jeho přípravy, vakcína s jeho obsahem a léčivo obsahující pneumokokový polysacharidový antigen v kombinaci s proteinovým antigenem Streptococcus pneumoniae - Google Patents

Abstract

Imunogenní prostředek, který obsahuje alespoň jeden polysacharidový antigen Streptococcus pneumoniae a alespoň jeden proteinový antigen Streptococcus pneumoniae vybraný ze skupiny sestávající z PhtA, PhtD a PhtB, přičemž polysacharidový antigen je prezentován ve formě konjugátu polysacharid-proteinový nosič. Způsob jeho přípravy, který zahrnuje kroky: výběr jednoho nebo více pneumokokových polysacharidových antigenů; výběr jednoho nebo více pneumokokových proteinových antigenů ze skupiny sestávající z PhtA, PhtD a PhtB; a jejich smísení, kde polysacharidový antigen je ve formě konjugátu polysacharid-proteinový nosič. Vakcína s obsahem tohoto imunogenního prostředku. Použití pneumokokového polysacharidového antigenu v kombinaci s proteinovým antigenem Streptococcus pneumoniae a popřípadě Th-1 indukujícím adjuvantem pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení zánětu plic u pacientů starších 55 let, nebo prevenci nebo léčení zánětu středního ucha u kojenců nebo batolat.

Description

Předkládaný vynález se týká imunogenního prostředku, způsobu jeho přípravy, vakcíny sjeho obsahem a léčiva obsahující pneumokokový polysacharidový antigen v kombinaci s proteinovým antigenem Streptococcus pneumoniae. Zejména se vynález týká vakcín obsahujících pneumokokový polysacharidový antigen, typicky pneumokokový polysacharidový konjugovaný antigen, formulovaný s proteinovým antigenem od Streptococcus pneumoniae a případně s Thl-indukujícím adjuvantem.

Dosavadní stav techniky

Streptococcus pneumoniae je Gram-pozitivní bakterie odpovědná za významnou morbiditu a mortalitu (zejména u mladých a starých jedinců), způsobující invazivní onemocnění jako je pneumonie, bakteremie a meningitida, a onemocnění asociovaná s kolonizací, jako je akutní otitis média. Výskyt pneumokokové pneumonie v US pro jedince starší 60 let je 3 až 8 na 100 000. Ve 20% případech tato infekce způsobuje bakteriemii a další manifestace, jako je meningitis, s mortalitou blížící se 30 %, i při antibiotické terapii.

Pneumococcus je enkapsulovaný chemicky vázaným polysacharidem, který určuje serotypovou specificitu. Existuje 90 známých serotypů pneumokoků a kapsula je pro pneumokoky základní determinantou virulence, protože kapsule nejen chrání vnitřní povrch bakterie před komplementem, ale je též slabě imunogenní. Polysacharidy jsou T-independentní antigeny a nemohou být zpracovány nebo prezentovány na MHC molekulách, aby mohly interagovat s T-lymfocyty. Nicméně, mohou stimulovat imunitní systém alternativním mechanismem, který zahrnuje zesítění povrchových receptorů na B-lymfocytech.

V několika experimentech bylo prokázáno, že ochrana proti invazivnímu pneumokokovému onemocnění nejsilněji koreluje s protilátkami specifickými pro kapsulu a že ochrana je specifická pro serotyp.

Vakcíny na bázi polysacharidového antigenu jsou dobře známé v oboru. Mezi čtyři vakcíny, které byly schváleny k použití, patří Vi polysacharid Salmonella typhi, PRP polysacharid Haemophilus influenzae, tetravalentní meningokoková vakcína složená ze serotypů A, C, W135 a Y, a 23valentní pneumokoková vakcína složená z polysacharidů odpovídajících serotypům 1, 2, 3, 4, 5, 5B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 1 IA, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 20, 20F, 23F a 33 (což tvoří alespoň 90 % izolátů pneumokoků z krve).

Poslední tři uvedené vakcíny indukují ochranu před bakteriemi způsobujícími respirační infekce, které mají závažnou morbiditu a mortalitu u kojenců, ale nebyly schváleny pro použití u dětí mladších dvou let, protože jsou v této věkové skupině neadekvátně imunogenní (Peltola et al., 1984, N. Engl. J. Med. 310: 1561 až 1566). Streptococcus pneumoniae je nejčastější příčinou invazivních bakteriálních onemocnění a otitis média u kojenců a mladších dětí. Obdobně, u starých jedinců dochází ke špatné odpovědi na pneumokokové vakcíny [Roghmann et al., (1987), J. Gerontol. 42:265 až 270], což je důvodem zvýšené incidence bakteriální pneumonie v této populaci [Verghese a Berk, (1983) Medicíně (Baltimore) 62:271 až 285].

Strategie, které byly navrženy pro překonání chybějící imunogenicity u dětí, spočívají v navázání polysacharidu na velké imunogenní proteiny, které napomáhají v indukci T-lymfocytů a které indukují imunologickou paměť k polysacharidovému antigenu, se kterým jsou konjugované.

-1 CZ 305324 B6

Vakcíny obsahující konjugovaný pneumokokový glykoprotein jsou v současnosti hodnoceny z hlediska bezpečnosti, imunogenicity a účinnosti v různých věkových skupinách.

23valentní nekonjugovaná pneumokoková vakcína vykazovala různou klinickou účinnost, od 0 do 81 % (Fedson et la. (1994) Arch Intem Med. 154: 2531 až 2535). Zdálo se, že účinnost souvisí s rizikovou skupinou, která je imunizována, jako jsou staří pacienti, pacienti s Hodginovou nemocí, po splenektomii, se srpkovitou anemií a agammaglobu-linemií (Fine et al. (1994) Arch Intem Med. 154:2666 až 2677), a také s manifestací onemocnění. 23valentní vakcína nevykazuje ochranu před pneumokokovou pneumonií (u některých rizikových jedinců, jako jsou staří lidé) a před otitis média.

Proto stále trvá potřeba vylepšené pneumokokové vakcíny, zejména takové, která by byla více účinná v prevenci nebo zmírnění pneumokokových onemocnění (zejména pneumonie) u starých jedinců a malých dětí.

Předkládaný vynález poskytuje takovou zlepšenou vakcínu.

Podstata vynálezu

Prvním aspektem předmětu vynálezu v hlavním provedení i) je imunogenní prostředek, který obsahuje alespoň jeden polysacha-ridový antigen Streptococcus pneumoniae a alespoň jeden proteinový antigen Streptococcus pneumoniae vybraný ze skupiny sestávající z PhtA, PhtD a PhtB, přičemž polysacharidový antigen je prezentován ve formě konjugátu polysacharid-proteinový nosič.

Přednostní provedení tohoto aspektu předmětu vynálezu zahrnují zejména ii) imunogenní prostředek podle provedení i), v němž je proteinový antigenem je PhtD;

iii) imunogenní prostředek podle provedení ii), který dále obsahuje Ply;

iv) imunogenní prostředek podle kteréhokoliv z provedení i) až iii), kde proteinový nosič je vybrán ze skupiny zahrnující: difterický toxoid; tetanický toxoid; CRM197; přílipkový haemokyanin, KLH; proteinový derivát tuberkulinu, PPD; a protein D z H. influenzae;

v) imunogenní prostředek podle kteréhokoliv z provedení i) až iv), kde vakcína obsahuje alespoň čtyři pneumokokové polysacharidové antigeny z různých serotypů;

ví) imunogenní prostředek podle kteréhokoliv z předchozích provedení, který dále obsahuje adjuvans;

vii) imunogenní prostředek podle provedení vi), kde adjuvans zahrnuje sůl hliníku;

viii) imunogenní prostředek podle provedení vi), kde adjuvans je přednostním induktorem TH1 reakce;

ix) imunogenní prostředek podle provedení viii), kde adjuvans zahrnuje alespoň jedno adjuvans z následující skupiny: 3D-MPL, saponinové imunostimulační činidlo nebo imunostimulační CpG oligonukleotid;

x) imunogenní prostředek podle provedení ix), kde adjuvans obsahuje nosič vybraný ze skupiny zahrnující: emulzi olej-ve-vodě, liposomy a sůl hliníku.

Druhým aspektem předmětu vynálezu (provedení vynálezu xi)) je imunogenní prostředek podle kteréhokoliv z předchozích provedení i) až x) pro použití jako léčivo.

Třetím aspektem předmětu vynálezu (provedení vynálezu xi i)) je vakcína, která obsahuje imunogenní prostředek podle provedení i) až x).

-2CZ 305324 B6

Čtvrtým aspektem předmětu vynálezu (provedení vynálezu xiii)) je použití pneumokokového polysacharidového antigenu v kombinaci s proteinovým antigenem Streptococcus pneumoniae vybraným ze skupiny sestávající z PhtA, PhtD a PhtB a popřípadě adjuvantem indukujícím TH1 reakci pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení zánětu plic u pacientů starších 55 let, přičemž polysacharidový antigen je konjugován k proteinovému nosiči.

Pátým aspektem předmětu vynálezu (provedení vynálezu xiv)) je použití pneumokokového polysacharidového antigenu v kombinaci s proteinovým antigenem Streptococcus pneumoniae vybraným ze skupiny sestávající z PhtA, PhtD a PhtB a popřípadě adjuvantem indukujícím TH1 reakci pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení zánětu středního ucha u kojenců nebo batolat, přičemž polysacharidový antigen je konjugován k proteinovému nosiči.

Šestým aspektem předmětu vynálezu (provedení vynálezu xv)) je způsob přípravy imunogenního prostředku podle kteréhokoliv z provedení i) až x), který zahrnuje kroky: výběr jednoho nebo více pneumokokových polysacharidových antigenů;

výběr jednoho nebo více pneumokokových proteinových antigenů ze skupiny sestávající z PhtA, PhtD a PhtB; a smísení uvedeného polysacharidového antigenu a proteinového antigenu s vhodným excipientem;

přičemž polysacharidový antigen je prezentován ve formě konjugátu polysacharid-proteinový nosič.

V dalším popisu je vynález příležitostně objasňován v širším kontextu, než odpovídá rozsahu, který je skutečně předmětem tohoto vynálezu. Výslovně se proto uvádí, že do rozsahu vynálezu spadají jen aspekty explicitně uvedené výše, a jen ty jsou také předmětem připojených patentových nároků. Následující popis má jen ilustrativní význam.

Dále je uveden význam zkratek používaných v podlohách:

MHC - hlavní histokompatibilitní komplex

PRP - polyribosylribitolfosfát

PMN - polymorfonukleámí leukocyty

OMPC - proteinový komplex vnější membrány

CDAP - l-kyan-4-dimethylaminopyridiniumtetrafluorborát

QS21 - Quillaja Saponaria 21

ELISA - enzymový imunosorbentní test

SEC-HPLC - vylučovací chromatografie- vysoce výkonná kapalinová chromatografie SDS - natriumdodecylsulfát pfluidizace - mikrofluidizace.

Předkládaný vynález poskytuje vakcinační prostředek, který obsahuje alespoň jeden polysacharidový antigen Streptococcus pneumoniae (výhodně konjugovaný na proteinový nosič) a proteinový antigen Streptococcus pneumoniae vybraný ze skupiny zahrnující: rodinu poly-histidinové triády (Pht; například PhtA, PhtB, PhtD nebo PhtE), Lyt rodinu (například LytA, LytB nebo LytC), SpsA, Spl28, Spl30, Spl25, SplOl a Spl33, nebo jejich zkrácené nebo imunologicky funkční ekvivalenty, volitelně s Thl adjuvans (nebo s adjuvans indukujícím především Thl imunitní reakci). Výhodně je obsažen jak pneumokokový protein, tak Thl adjuvans. Vynález také popisuje výhodné prostředky obsahující kombinaci výše uvedených pneumokokových proteinů podle předkládaného vynálezu mezi sebou a s dalšími pneumokokovými proteiny. Prostředky podle předkládaného vynálezu jsou zejména vhodné pro léčbu stařecké pneumoniae.

Pneumokokové polysacharidové vakcíny (konjugované či nikoliv) nemusí být schopné chránit před pneumonií u staré populace, ve které je incidence tohoto onemocnění velmi vysoká. Klíčo-3 CZ 305324 B6 vým obranným mechanismem proti pneumokokům je opsonofagocytosa (humánní B-lymfocyty/neutrofily zprostředkovaný děj způsobený produkcí protilátek proti pneumokokovému polysacharidu, při které je bakterie eventuálně fagocytována), některé složky opsonizačních mechanismů jsou však ve stáří narušeny, například produkce superoxidu PMN (polymorfonukleámími buňkami), produkce jiných reaktivních druhů kyslíku, mobilizace PMN, apoptosa PMN, deformabilita PMN. Ve stáří může být též narušena proti látková odpověď.

Oproti běžně akceptovanému dogmatu nemusí být normální hladiny protilátek proti polysacharidu kapsuly účinné v kompletní eliminaci bakterií, protože pneumokoky mohou pronikat do hostitelských buněk a tak mohou uniknout této složce imunitního systému.

Překvapivě předkladatelé vynálezu zjistili, že simultánní stimulací buněčné složky imunitního systému (například T-lymfocyty zprostředkované imunity) společně s humorální složkou imunitního systému (zprostředkovanou B-lymfocyty), je možno dosáhnou synergie (kooperace), která může zesílit eliminaci pneumokoků z hostitele. Toto je objev, který napomůže prevenci (nebo léčbě) pneumokokové infekce obecně, ale který je zejména důležitý pro prevenci (nebo léčbu) pneumonie u starších jedinců, u kterých vakcíny na bázi polysacharidů nevykazují účinnost.

Bez vazby na jakoukoliv konkrétní teorii vynálezci zjistili, že obě složky imunitního systému mohou působit synergně tehdy, když je pneumokokový polysacharid (výhodně konjugovaný na proteinový nosič) podán s pneumokokovým proteinem vybraným ze skupiny zahrnující: PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, LytA, LytB, LytC, SpsA, Spl28, Spl30, Spl25, SplOl a Spl33 (což jsou proteiny, které mohou být zpracovány a prezentovány v kontextu MHC třídy II a I na povrchu infikovaných savčích buněk). Vynálezci také zjistili, že ačkoliv může jeden nebo více těchto pneumokokových proteinů spouštět buněčnou imunitu sám o sobě, napomáhá přítomnost Thl indukujícího adjuvans ve vakcíně této složce imunitního systému a překvapivě dále zesiluje synergii mezi oběma složkami imunitního systému.

Popis předkládaného vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje vylepšenou vakcínu pro prevenci nebo zmírnění pneumokokové infekce u starších jedinců (a/nebo kojenců a batolat).

V předkládaném vynálezu je pacient považován za starého jedince, pokud je mu více než 55 let, obvykle více než 60 let, typicky více než 65 let.

V jednom provedení tedy vynález poskytuje vakcinační prostředek, vhodný pro použití u starých jedinců (a/nebo kojenců a batolat), který obsahuje alespoň jeden polysacharidový antigen Streptococcus pneumoniae a alespoň jeden proteinový antigen Streptococcus pneumoniae vybraný ze skupiny zahrnující: PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl30 a Spl33. Vakcína může volitelně obsahovat Thl adjuvans.

V jiném provedení vynález poskytuje vakcínu (vhodný pro prevenci pneumoniae u starých jedinců), která obsahuje alespoň jeden (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 nebo 10) polysacharidový antigen Streptococcus pneumoniae a alespoň jeden proteinový antigen Streptococcus pneumoniae vybraný ze skupiny zahrnující: PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spi 30 a Spi33, a výhodně Thl adjuvans.

Výše uvedená provedení vakcín výhodně obsahujících vzájemné kombinace pneumokokových proteinů podle předkládaného vynálezu a kombinace s jinými pneumokokovými proteiny spadají též do rozsahu předkládaného vynálezu.

Předpokládá se, že taková vakcína bude také použitelná pro léčbu pneumokokových infekcí (například otitis média) v jiných rizikových skupinách populace, jako jsou kojenci nebo batolata.

-4CZ 305324 B6

Polysacharidové antigeny Streptococcus pneumoniae podle předkládaného vynálezu

Typicky bude vakcína proti Streptococcus pneumoniae podle předkládaného vynálezu obsahovat polysacharidové antigeny (výhodně konjugované na proteinový nosič), kde polysacharidy jsou odvozeny od alespoň čtyř serotypů pneumokoka. Výhodně jsou těmito čtyřmi serotypy 6B, 14, 19F a 23F. Výhodněji je v přípravku obsaženo alespoň 7 serotypů, například ty polysacharidy, kteréjsou získány od serotypů 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F a 23F. Ještě výhodněji je v přípravku obsaženo alespoň 11 serotypů, například ty polysacharidy, kteréjsou získány od serotypů 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F a 23F (kteréjsou výhodně konjugovány na proteinový nosič). Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu je obsaženo alespoň 13 polysacharidových antigenů (kteréjsou výhodně konjugovány na proteinový nosič), ačkoliv další polysacharidové antigeny, například 23valentní (jako jsou serotypy 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F a 33F) také spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

Pro vakcinaci ve stáří (například pro prevenci pneumoniae) je výhodné do 1 lvalentního antigenního prostředku zahrnout serotypy 8 a 12F (a nejlépe též 15 až 22), takže vznikne 15-valentní vakcína, zatímco pro vakcinaci kojenců nebo batolat (kde se jedná o otitis média) je výhodné zahrnout serotypy 6A a 19A, za zisku 13valentní vakcíny.

Ačkoliv mohou být polysacharidy popsané výše použity v úplné, nativní formě, mohou být použity též polysacharidy s redukovanou velikostí, které jsou stále ještě imunogenní (viz např. EP 497 524 a EP 497 525).

Pro prevenci nebo zmírnění pneumonie u starých jedinců (+55 let) a otitis média u kojenců (do 18 měsíců) a batolat (obvykle 18 měsíců až 5 let), je výhodným provedením vynálezu kombinování multivalentní polysacharid Streptococcus pneumoniae podle předkládaného vynálezu a protein Streptococcus pneumoniae vybraný ze skupiny zahrnující: PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl30 a Spl33, ajejich imunologicky funkční ekvivalenty. Kombinace pneumokokových proteinů může být také použita, jak je popsáno dále. Pneumokokové proteiny podle předkládaného vynálezu „Imunologicky funkční ekvivalent“ je definován v předkládaném jako peptid nebo protein obsahující alespoň jeden protektivní epitop z proteinu podle předkládaného vynálezu. Takové epitopy jsou obvykle vystaveny na povrchu, jsou vysoce konzervovány a mohou vyvolat baktericidní protilátkovou reakci u hostitele nebo mohou zabránit toxickým účinkům. Výhodně může být použit funkční ekvivalent obsahující alespoň 15 a výhodně 30 nebo více sousedících aminokyselin z proteinu podle předkládaného vynálezu. Nejvýhodněji jsou použity fragmenty, deleční varianty proteinu, jako například transmembránové deleční varianty (tj. použije se extracelulámí doména proteinu), fúze, chemicky nebo geneticky detoxifikované deriváty a podobně, za podmínky, že tyto ekvivalenty jsou schopné vyvolat v podstatě stejnou imunologickou reakci jako přirozený protein. Pozice potenciálních B-lymfocytových epitopů v proteinové sekvenci může být snadno určena pomocí identifikace peptidů, které jsou jak vystavené na povrchu, tak antigenní, kde toto určení lze provést za použití kombinace dvou metod: 2D-strukturální predikce a predikce antigenního indexu. Predikce 2D-struktury může být provedena za použití PSIPRED programu (od David Jones, Brunel Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, UK). Antigenní index může být vypočítán způsobem podle Jamesova a Wolfa (CABIOS 4:181 až 186 [1988]).

Proteiny podle předkládaného vynálezu jsou následující proteiny, kteréjsou všechny exponovány na vnějším povrchu pneumokoka (a tak mohou být rozpoznávány imunitním systémem hostitele během alespoň části životního cyklu pneumokoka) nebo se jedná o proteiny, kteréjsou secemovány nebo uvolňovány pneumokokem.

-5CZ 305324 B6

Protein Streptococcus pneumoniae podle předkládaného vynálezu je vybrán ze skupiny zahrnující: proteiny z rodiny polyhistidinové triády (Pht), proteiny z Lyt rodiny, proteiny vážící cholin, proteiny mající LPXTG motiv (kde X je jakákoliv aminokyselina), proteiny mající motiv signální sekvence typu II LXXV (kde X je jakákoliv aminokyselina) a proteiny mající motiv signální sekvence typu I. Výhodnými příklady v těchto kategoriích (nebo motivech) jsou následující proteiny nebo jejich imunologicky funkční ekvivalenty.

Pht (Póly Histidinová Triáda) rodina obsahuje proteiny PhtA, PhtB, PhtD a PhtE. Rodina je charakterizována lipidační sekvencí, dvěma doménami separovanými regionem bohatým na prolin a několika histidinovými triádami, které se snad účastní na vazbě kovů nebo nukleostidů nebo na enzymatické aktivitě, (3-5) stočenými regiony, a konzervovaným N-koncem a heterogenním Ckoncem. Tato rodina je přítomná u všech testovaných kmenů pneumokoků. Homologní proteiny byly také zjištěny v jiných Streptokokách a Neisseriích. Mezi výhodné členy rodiny patří PhtA, PhtB a PhtD. Výhodněji obsahuje rodina PhtA nebo PhtD. Je třeba si uvědomit, že termíny PhtA, B, D a E označují proteiny mající sekvence popsané ve výše uvedených citacích, stejně jako jejich přirozené (a uměle vyrobené) varianty, které mají sekvenci z alespoň 90 % identickou jako uvedené proteiny. Výhodně je sekvence alespoň z 95 % identická a nejlépe je alespoň z 97 % identická.

S ohledem na PhtX proteiny je PhtA popsán ve WO 98/18 930, a je též označován jako Sp36. Jak bylo uvedeno výše, jedná se o protein z rodiny polyhistidinové triády a obsahuje typ II signálního motivu LXXC.

PhtD je popsán ve WO 00/37 105, a je též označován jako SpO36D. Jak bylo uvedeno výše, jedná se také o protein z rodiny polyhistidinové triády a obsahuje typ II signálního motivu LXXC.

PhtBje popsán ve WO 00/37 105, a je též označován jako SpO36B. Jiným členem PhtB rodiny je C3-degradující polypeptid, jak je popsán ve WO 00/17 370. Tento protein patří též do rodiny polyhistidinové triády a obsahuje typ II LXXC signálního motivu. Výhodný imunologicky funkční ekvivalent je protein Sp42 popsaný ve WO 98/18 930. Zkrácená forma PhtB (přibližně 79kD) je popsána ve WO 99/15 675 a je též považována za člena PhtX rodiny.

PhtE je popsán ve WO 00/30 299 a je označován jako BVH-3.

SpsA je vazebný protein pro cholin popsaný ve WO 98/39450.

Lyt rodina jsou proteiny asociované s membránou asociované s buněčnou lýzou. N-koncová doména obsahuje vazebnou doménu pro cholin, ale Lyt rodina nemá všechny vlastnosti uvedené u rodiny vazebných proteinů pro cholin (Cbp) rodiny a tak je pro předkládaný vynález Lyt rodina považována za rodinou odlišnou od Cbp rodiny. Na rozdíl od Cbp rodiny C—koncová doména obsahuje katalytickou doménu rodiny Lyt proteinu. Rodina zahrnuje LytA, B a C. S ohledem na Lyt X rodinu je LytA popsán v Ronda et al., Eur J Biochem, 164:621 až 624 (1987). LytB je popsán ve WO 98/18 930, a je též označován jako Sp91. Výhodným členem této rodiny je LytC.

Jiným výhodným provedením jsou Lyt zkrácené formy, kde „Lyt“ je definován výše a „zkrácené formy“ označují Lyt proteiny bez 50 % nebo více vazebného regionu pro cholin. Výhodně takové proteiny neobsahují celý vazebný region pro cholin.

Spi25 je příkladem povrchového proteinu pneumokoka s LPXTG motivem zakotveným v buněčné stěně (kde X je jakákoliv aminokyselina). Bylo zjištěno, že jakýkoliv protein s touto třídou pneumokokového povrchového proteinu s tímto motivem je užitečný v předkládaném vynálezu a proto se považuje za další protein podle předkládaného vynálezu. Spl25 sám je popsán ve WO 98/18 930, a je také znám jako ZmpB - zinková metaloproteinasa.

-6CZ 305324 B6

Spi01 je popsán ve WO 98/06 734 (kde má označení #y85993). Je charakterizován signální sekvencí typu I.

Spi33 je popsán ve WO 98/06 734 (kde má označení #y85992). Je také charakterizován signální sekvencí typu I.

Spl28 a Spl30 jsou popsány ve WO 00/76 540.

Proteiny použitelné v předkládaném vynálezu jsou výhodně vybrány ze skupiny zahrnující PhtD a PhtA, nebo kombinace těchto proteinů.

Výhodné kombinace jednoho nebo více pneumokokových proteinů podle předkládaného vynálezu s j inými pneumokokovými proteiny

Ve vakcíně podle předkládaného vynálezu může být každý z výše uvedených proteinů podle předkládaného vynálezu (výhodně buď PhtD, nebo PhtA nebo oba) kombinován s jedním nebo více pneumokokovými proteiny z následujícího seznamu: pneumolysin (též označovaný jako Pyl; výhodně detoxifikovaný chemickým zpracováním nebo mutací) (WO 96/05 859, WO 90/06 951, WO 99/03 884); PsaA a varianty s transmembránovou delecí (Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec;64(12):5255 až 62. PspA a varianty s transmembránovou delecí (US 5 804 193, WO 92/14 488 a WO 99/53 940), PspC a varianty s transmembránovou delecí (WO 97/09 994, WO 99/53 940), proteiny rodiny vazebných proteinů pro cholin (Cbp) (například CbpA a jeho varianty s transmembránovou delecí) WO 97/41 151, WO 99/51 266), glyceraldehyd-3-fosfát-dehydrogenasa (Infect. Immunol. 1996, 64/3544), Hsp70 (WO 96/40 928), PcpA (Sanchez-Beato et al., FEMS Microbiol. Lett. 1998, 164: 207 až 14), M-like protein (SB patentová přihláška EP 0 837 130) a adhesin 18627 (SB patentová přihláška EP 0 834 568). Předkládaný vynález také zahrnuje imunologicky funkční ekvivalenty nebo zkrácené formy těchto proteinů (jak byly definovány výše).

Členové rodiny vazebných proteinů pro cholin byly původně identifikovány jako pneumokokové proteiny, které mohou být přečištěny cholinovou-afinitní chromatografií. Všechny vazebné proteiny pro cholin jsou nekovalentně navázány na fosforylcholinové skupiny kyseliny teichoové buněčné stěny a kyseliny lipoteichoové asociované s buněčnou membránou. Strukturálně obsahují několik regionů společných celé rodině, ačkoliv se celkový přesný charakter proteinů může lišit (v aminokyselinové sekvenci, délce atd.). Obecně vazebné proteiny pro cholin obsahují Nterminální region (N), konzervované repetitivní regiony (Rl a/nebo R2), a region bohatý na prolin (F) a konzervovaný vazebný region pro cholin (C), tvořený mnoha repetitivními úseky, který tvoří přibližně jednu polovinu proteinu. Termín „rodina vazebných proteinů pro cholin (Cbp)“ označuje skupinu zahrnující vazebné proteiny pro cholin, jak jsou definovány ve WO 97/41 151, PbcA, SpsA, PspC, CpbA, CbpD a CbpG. CbpA je popsán v WO 97/41 151. CbpD a CbpG jsou popsány ve WO 00/29 434. PspC je popsán v WO 97/09 994. PbcA je popsán ve WO 98/21 337. Výhodně jsou vazebné proteiny pro cholin vybrané ze skupiny zahrnující CbpA, PbcA, SpsA a PspC.

Když je použit Cpb protein, tak může být použita Cbp zkrácená forma, kde „Cbp“ je definován výše a „zkrácená forma“ označuje Cbp protein, kterému chybí 50 % nebo více vazebního regionu pro cholin (C). Výhodně takovým proteinům chybí celý vazebný region pro cholin. Výhodněji u takových zkrácených forem chybí (i) vazebný region pro cholin a (ii) a část N-koncové poloviny proteinu, za zachování alespoň jednoho repetitivního regionu (Rl nebo R2). Ještě výhodněji obsahuje zkrácená forma 2 repetitivní regiony (Rl a R2). Příklady takových výhodných provedení jsou NRlxR2 a RlxR2, jak jsou popsány ve WO 99/51 266 nebo WO 99/51 188, ale i další vazebné proteiny pro cholin bez podobného vazebného regionu spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

-7CZ 305324 B6

Chimérické proteiny (nebo fúze) Cbp zkrácená forma-Lyt zkrácená forma mohou být také použity ve vakcíně podle předkládaného vynálezu. Výhodně tyto formy obsahují NRlxR2 (nebo RlxR2) Cbp a C-koncovou část (C-term. tj. bez vazebných domén pro cholin) Lyt (např. LytCCterm nebo Sp91Cterm). Výhodněji je Cbp vybraný ze skupiny zahrnující CbpA, PbcA, SpsA a PspC. Ještě výhodněji se jedná o CbpA. Výhodně je LytX LytC (též označovaný jako Sp91).

Jiným provedením předkládaného vynálezu je PspA nebo PsaA zkrácená forma bez vazebné domény pro cholin (C) a exprimovaná jako fúzní protein s LytX. Výhodně je Lyt proteinem LytC.

Výhodné kombinace pneumokokových proteinů podle předkládaného vynálezu

Výhodně je kombinace proteinů podle předkládaného vynálezu vybrána ze 2 nebo více (3 nebo 4) různých kategorií, jako jsou proteiny mající motiv signální sekvence typu II LXXC (kde X je jakákoliv aminokyselina, např., z rodiny polyhistidinové triády (PhtX)), rodiny proteinů vážících cholin (CpbX), proteinů majících motiv signální sekvence typu I (např., Spi01), proteinů majících LPXTG motiv (kde X je jakákoliv aminokyselina, např., Spl28, Spl30), toxinů (např. Ply), atd. Výhodnými příklady v těchto kategoriích (nebo motivech) jsou proteiny uvedené výše nebo jejich imunologicky funkční ekvivalenty. Toxin + Pht, toxin + Cbp, Pht + Cpb a toxin + Pht + Cpb jsou výhodnými kombinacemi.

Mezi výhodné kombinace patří, například, PhtD + NRlxR2, Phtd + NRlxR2-Sp91 Cterm chimérické nebo fúzní proteiny, PhtD + Ply, PhtD + Spi28, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NRlxR2, PhtA + NR 1 xR2-Sp91 Cterm chimérické nebo fúzní proteiny, PhtA + Ply, PhtA + Spi28, PhtA + PsaA, PhtA + PspA, NRlxR2 + LytC, NRlxR2 + PspA, NRlxR2 + PsaA, NRlxR2 + Spl28, RlxR2 + LytC, RlxR2 + PspA, RlxR2 + PsaA, RlxR2 + Spl28, RlxR2 + PhtD, RlxR2 + PhtA. Výhodně je NRlxR2 (nebo RlxR2) z CbpA nebo PspC. Výhodněji je z CbpA.

Zejména výhodná kombinace pneumokokových proteinů obsahuje Ply (nebo jeho zkrácenou formu nebo imunologicky funkční ekvivalent) + PthD (nebo jeho zkrácenou formu nebo imunologicky funkční ekvivalent) + NRlxR2 (nebo RlxR2). Výhodně je NRlxR2 (nebo RlxR2) z CbpA nebo PspC. Výhodněji je z CbpA.

Bez vazby na jakoukoliv konkrétní teorii se zjistilo, že přípravek obsahující pneumokokový protein (nebo jakoukoliv kombinaci popsanou výše) podle předkládaného vynálezu může indukovat T-lymfocyty zprostředkovanou imunitní reakci proti pneumokokového onemocnění - která je zejména žádoucí při obraně před pneumonií - kde tato reakce kooperuje s protilátkovou složkou imunitního systému s cílem inhibovat invazi pneumokoků a stimulovat opsonofagocytosu. Další výhoda související s použitím proteinového antigenů spočívá v prezentaci dalších antigenů pro proces opsonofagocytosy.

V dalším provedení tedy vynález poskytuje vakcínu proti Streptococcus pneumoniae tvořenou vakcínou obsahující konjugovaný pneumokokový polysacharid, který je tvořen polysacharidovými antigeny získanými z alespoň čtyř serotypů, lépe alespoň sedmi serotypů, nejlépe alespoň jedenácti serotypů, a alespoň jeden, ale lépe 2, 3 nebo 4 proteiny Streptococcus pneumoniae vybrané ze skupiny zahrnující: PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl30 a Spl33 (nebo kombinace pneumokokových proteinů popsané výše). Výhodně je jedním proteinem PhtA (nebo jeho imunologicky funkční ekvivalent). Nejlépe je jedním proteinem PhtD (nebo jeho imunologicky funkční ekvivalent).

Jak bylo uvedeno výše, problém spojený s polysacharidovým přístupem k vakcinací spočívá v tom, že polysacharidy sami o sobě jsou slabými imunogeny. Pro překonání tohoto problému mohou být polysacharidy konjugovány na proteinové nosiče, které jsou pomocnými stimulanty T-lymfocytů. Proto je výhodné, aby byly polysacharidy použité v předkládaném vynálezu navá-8CZ 305324 B6 zané na takové proteinové nosiče. Příklady takových nosičů, které jsou v současnosti běžně používané pro produkci polysacharidových imunogenů jsou difterický a tetanický toxoid (DT, DT CM197, jiné DT mutanty a TT, v příslušném pořadí), přílipkový haemokyanin (KLH), OMPC z N. meningitidis, a přečištěný proteinový derivát Tuberculinu (PPD).

Výhodným nosičem pro imunogenní prostředky na bázi pneumokokových polysacharidů (nebo pro vakcíny) je protein D zHaemophilus influenzae (EP 594 610-B), nebo jeho fragmenty. Fragmenty vhodné pro použití jsou fragmenty obsahující T-helper epitopy. Konkrétně, fragment proteinu D bude výhodně obsahovat N-koncovou 1/3 proteinu. Protein D je překvapivě použitelný jako nosič ve vakcínách, ve kterých jsou konjugovány různé pneumokokové polysacharidové antigeny. Pokud se stejný nosič používá pro každý polysacharid, tak je pravděpodobné, že dojde k epitopové supresi. Překvapivě předkladatelé vynálezu zjistili, že protein D je vhodný pro minimalizaci takové epitopové suprese v kombinovaných vakcínách. Jeden nebo více pneumokokových polysacharidů v kombinaci může být výhodně konjugován na protein D a výhodně jsou všechny antigeny konjugovány v takové kombinované vakcíně na protein D.

Dalším výhodným nosičem pro pneumokokový polysacharid je pneumokokový protein samotný (jak je definován v oddíle „pneumokokové proteiny podle předkládaného vynálezu“).

Polysacharid může být navázán na proteinový nosič jakoukoliv známou metodou (například Likhite, Patent US 4 372 945 a Armor et al., Patent US 4 474 757). Výhodně je provedena CDAP konjugace (WO 95/08 348).

Výhodně je poměr proteimpolysacharid (hmotnost:hmotnost) konjugátu 0,3:1 až 1:1, lépe 0,6:1 až 0,8:1 a nejlépe přibližně 0,7:1.

Vakcíny podle předkládaného vynálezu obsahují výhodně adjuvans. Mezi vhodná adjuvans patří soli hliníku, jako je gelový hydroxid hlinitý (kamenec) nebo fosforečnan hlinitý, ale mohou také obsahovat vápník, hořčík, železo nebo zinek, nebo obsahovat nerozpustnou suspenzí acylovaného tyrosinu, nebo acylovaných sacharidů, kationtově nebo aniontově derivatizovaných polysacharidů, nebo polyfosfazenů.

Je výhodné, aby vybrané adjuvans bylo přednostním induktorem odpovědi TH1 typu, aby se posílila buněčná složka imunitní reakce.

TH1 adjuvans podle předkládaného vynálezu

Vysoké koncentrace cytokinů Thl-typu upřednostňují indukci buněčné imunitní reakce na daný antigen, zatímco vysoké koncentrace cytokinů Th2-typu vedou přednostně k indukci protilátkové imunitní reakce na antigen.

Je důležité si uvědomit, že odlišení imunitní reakce Thl a Th2 typu není absolutní. Ve skutečnosti se u jedinců bude rozvíjet imunitní reakce, kteráje převažujícím způsobem typu Thl nebo Th2. Nicméně, často je výhodné rozdělovat rodiny cytokinů tak, jak je popsáno na myších CD4 + ve T-lymfocytámím klonech v Mosmann a Coffman (Mosmann, T. R. a Coffinan, R. L. (1989) Thl and TH2 cells: different pattems of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p 145 až 173). Tradičně jsou reakce Thl-typu asociované s produkcí IFN-γ a IL-2 cytokinů T-lymfocyty. Další cytokiny často přímo asociované s indukcí imunitní reakce Thl-typu nejsou produkovány T-lymfocyty, jako je IL—12. Naopak, reakce Th2-typu jsou asociované se sekrecí IL—4, IL-5, IL-6, IL—10. Vhodné adjuvantní systémy, které podporují hlavně reakce Thl typu, jsou: Monofosforyl lipid A nebo a jeho deriváty, zejména 3de-O-acylovaný monofosforyl lipid A (3D-MPL) (pro jeho přípravu viz GB 2 220 211 A); kombinace monofosforyl—lipidu A, výhodně 3—de—O—acylovaného monofosforyl—lipidu A, a soli hliníku (například fosforečnanu hlinitého nebo hydroxidu hlinitého) nebo emulze olej ve vodě. V takových kombinacích jsou antigen a 3D-MPL obsaženy ve stejné struktuře, což umožňuje

-9CZ 305324 B6 účinné dodání antigenních a imunostimulačních signálů. Studie prokázaly, že 3D-MPL je schopen dále zesilovat imunogenicitu antigenů adsorbovaného na kamenec [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689 454 Bl],

Posílený systém je například kombinace monofosforyl lipidu A a saponinového derivátu, zejména kombinace QS21 a 3D-MPL, jakje popsána ve WO 94/00 153, nebo méně reaktogenní prostředek, kde je QS21 utlumen cholesterolem a který je popsán ve WO 96/33 739.

Zejména účinný adjuvantní prostředek obsahující QS21, 3D-MPL a tokoferol v emulzi olej ve vodě je popsán ve WO 95/17 210, a tento prostředek je výhodným prostředkem.

Výhodně vakcína dále obsahuje saponin, výhodněji QS21. Prostředek může dále obsahovat emulsi olej ve vodě a tokoferol (WO 95/17 210).

Předkládaný vynález také poskytuje způsob pro přípravu vakcinačního prostředku, který zahrnuje smísení proteinu podle předkládaného vynálezu s farmaceuticky přijatelnou přísadou, jako je 3DMPL.

Nemethylované CpG obsahující oligonukleotidy (WO 96/02 555) jsou také přednostními induktory TH1 reakce ajsou použitelné v předkládaném vynálezu.

Zejména výhodný prostředek podle předkládaného vynálezu obsahuje jeden nebo více konjugovaných pneumokokových polysacharidů, jeden nebo více pneumokokových proteinů podle předkládaného vynálezu a Thl adjuvans. Bez vazby na jakoukoliv teorii může být indukce buněčné reakce pneumokokovým proteinem (jakje popsán výše) a kooperace mezi oběma složkami imunitního systému dosaženo při použití takových Thl adjuvans, což vede k zisku vakcíny účinné proti pneumokokovým onemocněním obecně, a zejména proti pneumokokové pneumonii u starých jedinců.

V dalším aspektu vynález poskytuje imunogen nebo vakcínu, jak je zde popsána, pro použití v medicíně.

Jedním provedením předkládaného vynálezu je způsob pro prevenci nebo zmírnění pneumonie u starých jedinců (+55 let), při kterém je podáno uvedenému starému pacientovi bezpečné a účinné množství vakcíny obsahující polysacharidový antigen Streptococcus pneumoniae a pneumokokový protein vybraný ze skupiny zahrnující: PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, Spi 01, Spl28, Spi 30 a Spi33, a volitelně Thl adjuvans.

Jiným provedením předkládaného vynálezu je způsob pro prevenci nebo zmírnění pneumonie u otitis média u kojenců (do 18 měsíců) nebo batolat (obvykle 18 měsíců až 5 let), při kterém je podáno uvedenému kojenci nebo batoleti bezpečné a účinné množství vakcíny obsahující polysacharidový antigen Streptococcus pneumoniae a pneumokokový protein vybraný ze skupiny zahrnující: PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, Spi01, Spl28, Spl30 a Spi33, a volitelně Thl adjuvans.

Výhodně je ve způsobech podle předkládaného vynálezu popsaných výše polysacharidový antigen přítomen jako konjugát polysacharidu a proteinu.

Příprava vakcín podle předkládaného vynálezu

Vakcinační prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro chránění nebo léčbu savců (výhodně lidí) vnímavých k infekci, pomocí podání uvedené vakcíny systémovým nebo slizničním způsobem. Toto podání může být formou intramuskulámí, intraperitoneální, intradermální nebo podkožní; nebo prostřednictvím sliznice, jak je tomu u orálního/alimentámího podání a podání do respiračního, genitourinárního traktu. Intranasální podání vakcín pro léčbu

- 10CZ 305324 B6 pneumonie nebo otitis média je výhodné (protože může být zabráněno nasofaryngeálnímu přenášení pneumokoků, což zmírní infekci vjejím nejčastějším stadiu). Ačkoliv může být vakcína podle předkládaného vynálezu podána v jedné dávce, mohou být její složky podány také současně nebo v různou dobu (například, pokud je ve vakcíně obsažen polysacharid, může být podán samostatně ve stejnou dobu nebo 1 až 2 týdny po podání kombinace bakteriálních proteinů) za účelem optimální koordinace imunitní reakce. Kromě jediného způsobu podání mohou být použity dva různé způsoby podání. Například, virové antigeny mohou být podány ID (intradermálně), zatímco bakteriální proteiny mohou být podány IM (intramuskulámě) nebi IN (intranasálně). Pokud jsou přítomné polysacharidy, tak mohou být podány IM (nebo ID) a bakteriální proteiny mohou být podávány IN (nebo ID). Dále, vakcíny podle předkládaného vynálezu mohou být podány IM pro první dávku a IN pro dosycování dávky.

Množství konjugovaného antigenu v každé dávce vakcíny je vybráno jako množství, které indukuje imunoprotektivní reakci bez významnějších nežádoucích účinků typických u vakcín. Takové množství se velmi liší podle toho, jaký imunogen je použit a jak je prezentován. Každá dávka bude obecně obsahovat 0,1 až 100 pg polysacharidů, výhodně 0,1 až 50 pg je výhodná dávka.

Obsah proteinových antigenů ve vakcíně je obvykle v rozmezí 1 až 100 pg, výhodně 5 až 50 pg a nejlépe 5 až 25 pg.

Optimální množství složek pro každou konkrétní vakcínu může být zjištěno za použití standardních studií využívajících pozorování vhodných imunitních reakcí u jedinců. Po iniciální vakcinaci může být jedinci podána jedna nebo více dosycovacích imunizací, které jsou podány v adekvátní dobu.

Příprava vakcín je obecně popsána ve Vaccine Design („Thesubunit and adjuvans approach“ (ed. Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenům Press New York). Enkapsulace v liposomech je popsána ve Fullerton, Patent US 4 235 877.

Ačkoliv mohou být vakcíny podle předkládaného vynálezu podány jakýmkoliv způsobem, je podání popsaných vakcín do kůže (ID) jedním z provedení předkládaného vynálezu. Lidská kůže je tvořena vnější „rohovitou“ pokožkou, která se nazývá stratům comeum, pod kterou leží epidermis. Pod epidermis je vrstva označovaná jako dermis a pod touto vrstvou je podkožní tkáň. Výzkumníci prokázali, že injekce vakcíny do kůže, konkrétně do dermis, stimuluje imunitní reakci, která může být také asociována s mnoha dalšími výhodami. Intradermální vakcinace vakcínami podle předkládaného vynálezu tvoří výhodný rys předkládaného vynálezu.

Běžná technika intradermální vakcinace, „mantoux technika“ obsahuje kroky desinfekce kůže, a potom napnutí kůže jednou rukou zavedení tenké jehly (26 až 31 gauge) v úhlu 10 až 15°. Jakmile se hrana jehly zavede, tak se tělo jehly sníží a posunuje se dále, což se projeví zvedáním kůže při mírném tlaku. Potom se velmi pomalu injikuje kapalina, která tvoří puchýř na kůži a potom se jehla vyjme.

Nověji byly popsány prostředky, které jsou specificky určené pro podání kapaliny do nebo skrz kůži, jako jsou například prostředky popsané ve WO 99/34 850 a EP 1 092 444, a také tryskové injekční prostředky popsané například ve WO 01/13 977; US 5 480 381, US 5 599 302,

US 5 334 144, US 5 993 412, US 5 649 912, US 5 569 189, US 5 704 911, US 5 383 851,

US 5 893 397, US 5 466 220, US 5 339 163, US 5 312 335, US 503 627, US 5 064 413,

US 5 520 639, US 4 596 556, US 4 790 824, US 4 941 880, US 4 940 460, WO 97/37 705 a WO

97/13 537. Mezi alternativní metody intradermálního podání vakcíny patří použití běžných injekčních stříkaček a jehel, nebo použití zařízení pro balistické podání solidních vakcín (WO 99/27 961), nebo použití transdermálních náplastí (WO 97/48 440; WO 98/28 037); nebo aplikace na povrch kůže (transdermální nebo transkutánní podání) (WO 98/20 734; WO 98/28 037).

- 11 CZ 305324 B6

Když jsou vakcíny podle předkládaného vynálezu podávány do kůže, nebo přesněji do dermis, tak jsou vakcíny připraveny v malém objemu kapaliny, konkrétně v objemu mezi přibližně 0,05 a 0,2 ml.

Obsah antigenů v kožních nebo intradermálních vakcínách podle předkládaného vynálezu může být podobný jako v běžných intramuskulárních vakcínách. Nicméně, charakteristikou kožních nebo intradermálních vakcín je to, že mohou být tvořeny „nízkou dávkou“. Proto jsou proteinové antigeny v „nízkodávkových“ vakcínách výhodně přítomny v dávce pouze 0,1 až 10 pg, výhodně 0,1 až 5 pg na dávku; a pokud je přítomen polysacharid konjugovaný s antigenem, tak je polysacharid přítomen v dávce 0,01 až 1 pg, výhodně 0,01 až 0,5 pg polysacharidu na dávku.

Termín „intradermální podání“, jak je zde použit, označuje podání vakcíny do regionu dermis v kůži. Nicméně, vakcína nemůže být lokalizována výlučně v dermis. Dermis je vrstva kůže lokalizovaná mezi přibližně 1,0 a přibližně 2,0 mm od povrchu lidské kůže, ale existují určité variace mezi jedinci a různými částmi těla. Obecně se předpokládá, že bude dosaženo dermis, pokud se pronikne 1,5 mm pod povrch kůže. Dermis je umístěna mezi stratům corneum a epidermis na povrchu a podkožní vrstvou směrem dolů. Podle způsobu podání může být vakcína nakonec lokalizována primárně nebo pouze v dermis, nebo může být nakonec umístěna v epidermis a dermis.

Předkládaný vynález také zahrnuje kombinované vakcíny, které poskytují ochranu před různými patogeny. Mnoho pediatrických vakcín se v současnosti podává ve formě kombinovaných vakcín, aby se redukoval počet injekcí, které dítě musí dostat. Tak mohou být pediatrické vakcíny obsahující antigeny z jiných patogenů formulovány s vakcínami podle předkládaného vynálezu. Například mohou být vakcíny podle předkládaného vynálezu formulovány s (nebo podávány samostatně, ale ve stejnou dobu) dobře známou „trivalentní“ kombinovanou vakcínou obsahující Diththerický toxoid (DT), tetanický toxoid (TT), pertussovou složku [typicky detoxifikovaný Pertssický toxoid (Pl) a filamentosní haemugglutinin (FHA) volitelně s pertactinem (PRN) a/nebo agglitomome, 1+2], například s prodávanou vakcínou INFANRIXDTPa™ (SmithKline Beacham Biologicals), která obsahuje DT, TT, PT, FHA a PRN antigeny, nebo s pertusovou složkou tvořenou celými buňkami, jako je například vakcína prodávaná SmithKline Beecham Biologicals s.a. jako Tritanrix™. Kombinovaná vakcína může také obsahovat další antigen, jako je povrchový antigen viru hepatitidy B (HBsAg), antigeny Polio viru (například inaktivovaný trivalentní polio virus - IPV), proteiny vnější membrány Moraxella catarrhalis, non-typické proteiny Haemophilus influenzae, proteiny vnější membrány N. meningitidis B.

Příklady výhodných proteinových antigenů Moraxella catarrhalis, které mohou být obsaženy v kombinované vakcíně (zejména pro prevenci otitis media) jsou: OMP [WO 97/41 731 (Antex) & WO 96/34 960 (PMC)]; OPM21; LbpA a/nebo LbpB [WO98/55 606 (PMC)]; TpA a/nebo TphB [WO 97/13 785 & WO 97/32 980 (PMC)]; CopB Welminen Me, et al. (1983) Infect. Immun. 61:2003-2010]; UspAl a/nebo UspA2 [WO 93/03 761 (University of Texas)]; OmpCD; HasR (PCT/EP99/03824); PilQ (PCT/EP99/03283); LipolO (GB 9 918 208.1); lipoll (GB 9 918 302.|2); lipol8 (GB 9 918 038.2); P6 (PCT/EP99/03038); D15 (PCT/EP99/03822); OmplAl (PCT/EP99/06781); Hly3 (PCT/EP99/03257); a OmpE. Příklady netypických antigenů Haemophilus influenzae, které mohou být obsaženy v kombinované vakcíně (zejména pro prevenci otitis media) jsou: Fibrinový protein [(US 5 766 608 - Ohio State Research Foundation)] a fúze obsahující peptidy odvozené od tohoto proteinu (například LB1 (f) fúzní peptidy; US 5 843 464 (OSU) nebo WO 99/64 067]; OMP26 [WO 97/01 638 (Cortesc)]; P6 [HP 281673 (State University of New York)]; TbpA a/nebo ThpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmwl; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12 641); protein D (EP 594 610); P2; a P5 (WO 94/26 304).

Dalšími zahrnutými kombinacemi jsou proteiny S. Pneumoniae podle předkládaného vynálezu v kombinaci s virovými antigeny, například od chřipkového viru (atenuované, rozdělené nebo jednotkové) [např. povrchové glykoproteiny neuraminidasa (NA) a haemaglutinin (HA). Viz např., Chaloupka I. et al, Eur. Journal Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1996, 15: 121 až 127], RSV

- 12CZ 305324 B6 (např. F a G antigeny nebo F/G fúze, viz např. Schmidt A. C. et al, J Virol, May 2001, p, 4594 až 4603), PIV3 (např. HN a F proteiny, viz Schmidt et al., výše), Varicella (např., atenuované, glykoproteiny I-V, atd.), a jakékoliv (nebo všechny) složky MMR (spalničky, zarděnky, příušnice).

Výhodná pediatrická kombinovaná vakcína podle předkládaného vynálezu pro léčbu nebo prevenci otitis média obsahuje: jeden nebo více polysacharidových antigenů Streptococcus pneumoniae (výhodně konjugovaných na protein D) a jeden nebo více pneumokokových proteinů vybraných ze skupiny zahrnující: PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOÍ, Spl28, Spl30 a Spi 33 (a jejich funkční ekvivalenty), a jeden nebo více povrchových antigenů od Moraxella catarrhalis a/nebo netypizovaného Haemophilus Influenzae. Protein D může být výhodně použit jako proteinový nosič pro pneumokokové polysacharidy pro překonání potíží se supresí epitopů (jak byly popsány výše) a proto, že je sám imunogenem schopným produkovat B-lymfocyty zprostředkovanou ochranu proti netypizovatelnému H. influenzae (ntHi). Antigeny Moraxella catarrhalis a netypizovaného Haemophilus influenzae mohou být obsaženy ve vakcíně v podjednotkové formě, nebo mohou být přidány jako antigeny přítomné na povrchu vnější membrány vesikul vyrobených z bakterií.

Výhodně jsou antigenní prostředky (a vakcíny), které obsahují polysacharidy popsané výše, lyofilizovány do doby použití, kdy jsou rekonstituovány za použití ředidla. Výhodněji jsou lyofilizovány za přítomností 3D-MPL a jsou rekonstituovány za použití salinického roztoku. Alternativně mohou být protein a polysacharid skladovány samostatně ve vakcinačním kitu (kde jsou jedna nebo obě složky lyofilizovány) a tyto složky jsou rekonstituovány a smíseny před použitím, nebo jsou podány pacientovi samostatně. Thl adjuvans (výhodně 3D-MPL) může být přítomno v obou složkách.

Lyofilizace vakcín je dobře známá v oboru. Obvykle se kapalná vakcína suší vymražením za přítomnosti činidla zabraňujících tvorbě sraženin, jak je například sacharid, např. sacharosa nebo laktosa (která je přítomná v počáteční koncentraci 10 až 200 mg/ml). Lyofilizace má obvykle několik kroků, například začíná cyklus při -69 °C, postupně se teplota upraví na -24 °C během 3 hodin, potom se tato teplota udržuje po dobu 18 hodin, potom se postupně upraví na -16 °C a během 1 hodin, potom se tato teplota udržuje po dobu 6 hodin, a potom se během 3 hodin upraví na +34 °C a nakonec se tato teplota udržuje po dobu 9 hodin.

Lyofilizace přípravku vede k zisku stabilnějšího přípravku (například je bráněno rozkladu polysacharidových antigenů. Tento proces je také překvapivě odpovědný za vyšší titry protilátek proti pneumokokovým polysacharidům. Toto bylo zjištěno zejména pro PS 6B konjugáty. Dalším aspektem vynálezu je tedy lyofilizovaný antigenní prostředek obsahující PS 6B konjugát a 3DMPL adjuvans (výhodně bez adjuvans na bázi hliníku) a pneumokokový protein vybraný ze skupiny zahrnující: PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, Spi01, Spl28, Spl30 a Spi33.

Příklady uskutečnění vynálezu

Tyto příklady ilustrují, ale nijak neomezují předkládaný vynález.

Příklad 1. Kapsulámí polysacharid Streptococcus pneumoniae lvalentní testovaná vakcína obsahovala kapsulámí polysacharidy serotypů 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F a 23F, které byly připraveny způsobem popsaným v EP 72 513. Každý polysacharid byl aktivován a derivatizován za použití CDAP chemických činidel (WO95/08 348) a byl konjugován na proteinový nosič. Všechny polysacharidy byly konjugovány vjejich nativní formě, s výjimkou serotypů 3 (který byl zmenšen za účelem snížení viskozity).

- 13 CZ 305324 B6

Proteinový nosič:

Vybraným proteinovým nosičem je rekombinantní protein D (PD) z netypizovatelného H. influenzae, který byl exprimovaný v E. coli.

Exprese proteinu D

Protein D Haemophilus influenzae

Genetické konstrukty pro expresi proteinu D

Výchozí materiály

DNA kóduj ící protein D

Protein D je vysoce konzervovaný mezi H. influenzae všech serotypů a netypizovatelnými kmeny. Vektor pHIC348 obsahující DNA sekvenci kódující celý gen pro protein D byl získán od Dr. A. Forsgrena, Department of Medical Microbiology, University of Lund, Malmo General Hospital, Malmo, Sweden. DNA sekvence proteinu D byla publikována v Janson et al. (1991), Infect. Immunol. 59: 119 až 125.

Expresní vektor pMGl

Expresní vektor pMGl je derivátem pBR.322 (Gross et al., 1985), do kterého byly zavedeny kontrolní elementy pro transkripci a translaci cizorodých insertovaných genů z bakteriofágu lambda (Schtzman et al., 1983). Kromě toho byl gen pro resistenci na ampicilin zaměněn za gen pro resistenci na kanamycin.

Kmen AR58 E. coli

Kmen AR58 E. coli byl připraven transdukcí N99 Pl fágem předem kultivovaným na SA500 derivátu (galE::TN10, lambdaKil cI857 ΔΗ1). H99 a SA500 jsou kmeny K12 E. coli získané z laboratoře Dr. Martina Rosenberga v National Institute of Health.

Exprese vektoru pMG 1

Pro redukci proteinu D se DNA kódující protein klonovala do expresního vektoru pMGl. Tento plasmid využívá signály z DNA fágu lambda pro řízení transkripce a translace insertovaných cizích genů. Vektor obsahuje promotor PL, operátor OL a dvě užitná místa (NutL a NutR) pro odstranění efektů transkripční polarity, když je poskytnut N protein (Gross et al., 1985). Vektory obsahující PL promotor se vložily do E. coli lysogenní hostitelské buňky pro stabilizování plasmidové DNA. Lysogenní hostitelské kmeny obsahují replikace-defektní DNA fágu lambda integrovanou do genomu (Shatzman et al., 1983). Chromosomální DNA fágu lambda řídí syntézu cl represorového proteinu, který se váže na OL represor vektoru a brání vazbě RNA polymerasy na PL promotor a tak transkripci insertovaného genu. cl gen expresního kmene AR58 obsahuje teplotně-sensitivní mutant, takže transkripce řízená PL může být regulována teplotním posunem, tj. zvýšení kultivační teploty inaktivuje represor a je iniciována syntéza cizího proteinu. Tento systém umožňuje řízenou syntézu cizích proteinů, zejména těch, které mohou být toxické pro buňky (Shimataka and Rosenberg, 1981).

AR58 lysogenní kmen E. coli použitý pro produkci proteinu D jako nosiče je derivátem standardního NIH E.coli K12 kmenu N99 (F su galK2, lacZ thr ). Obsahuje defektní lysogenní fág lambda (galE::TN10, lambdaKiFcI857 ΔΗ1). Kil fenotyp brání vypnutí syntézy makromolekul u hostitele. 0857 mutace způsobuje teplotně-sensitivní lézi v cl represoru. ΔΗ1 delece odstraňuje pravý operon fágu lambda a lokusy bio, uvr3 a chlA hostitele. Kmen AR58 byl připraven

- 14CZ 305324 B6 transdukcí N99 Pl fágem předem kultivovaným na SA500 derivátu (galE::TN10, lambdaKil“ c!857 ΔΗ1). Vložení defektního lysogenu do N99 se selektuje pomocí tetracyklinu díky přítomnosti TN10 transposonu kódujícího resistenci na tetracyklin v sousedství galE genu.

Konstrukce vektoru pMGMDPPrD

Vektor pMGl, který obsahuje gen kódující nestrukturální protein SI viru chřipky (pMGNSI) se použil pro konstrukci pMGMDPPrD. Gen proteinu D se amplikoval PCR z vektoru pHIC348 (Janson et al., 1991) s PCR primery obsahujícími Ncol a Xbal restrikční místa na 5' a 3' koncích, v příslušném pořadí. Ncol/Xbal fragment se potom vložil do pMGNSI mezi Ncol a Xbal, za vzniku fúzního proteinu obsahujícího N-koncových 81 aminokyselin proteinu NS1 a potom PD protein. Tento vektor se označil jako pMGNSI PrD.

Podle konstruktu popsaného výše se připravil konečný konstrukt pro expresi proteinu D. BamHI/BamHI fragment se odstranil z pMGNSIPrD. Tato hydrolýza DNA odstranila NS1 kódující region, kromě prvních tří N-koncových zbytků. Po religování vektoru se získal gen kódující fúzní protein s následující N-terminální aminokyselinovou sekvencí:

-------MDP SSHSSNMANT—

NS1 Protein D

Protein D neobsahoval vedoucí peptid nebo N-terminální cystein, na který se normálně váží lipidové řetězce. Protein není proto ani vylučován do periplasmy, ani lipidován a zůstává v cytoplasmě v solubilní formě.

Konečný konstrukt pMG-MDPPrD se vložil do AR58 hostitelského kmene pomocí teplotního šoku při 37 °C. Bakterie obsahující plasmid se selektovaly za přítomnosti kanamycinu. Přítomnost DNA insertu kódujícího protein D se prokázala trávením izolované plasmidové DNA vybranými endonukleasami. Rekombinantní kmen E. coli se označil jako ECD4.

Exprese proteinu D byla pod kontrolou lambda P_L promotoru/O_L operátoru. Hostitelský kmen AR58 obsahuje teplotně sensitivní cl gen v genomu, který blokuje expresi z lambda Pl při nízké teplotě vazbou na O_L. Když je teplota zvýšena, cl se uvolní z O_L a protein D se exprimuje. Na konci fermentace jsou buňky koncentrovány a zmraženy.

Extrakce ze získaných buněk a přečištění proteinu D se provedlo následujícím způsobem. Zmrazená buněčná peleta se rozmrazila a resuspendovala se v roztoku pro rozrušení buněk (citrátový pufr pH 6,0) na konečné OD₆₅₀ = 60. Tato suspenze se zpracovala dvakrát ve vysokotlakém homogenizačním zařízení při P = 1000 barů (100 MPa). Homogenizát buněčné kultury se pročistil odstředěním a buněčná drť se odstranila filtrací. V první stupni přečištění se přefiltrovaný lyzát aplikoval do kationtové iontoměničové chromatografické kolony (SP Sepharose Fast Flow). PD se váže na gelovou matrici prostřednictvím iontových interakcí a eluuje se postupným zvyšováním iontové síly elučního pufru.

Ve druhém stupni přečištění se nečistoty zachycují na aniontoměničové matrici (Q Sepharose Fast Flow). PD se naváže na gel a může být odebírán z výtokové frakce.

V obou stupních chromatografie na koloně se odběr frakcí sleduje pomocí OD. Výplach z aniontoměničové chromatografické kolony obsahující přečištěný protein D se zahustí ultrafiltrací.

Ultrafiltrát obsahující protein D se nakonec nechá projít membránou vel. 0,2 pm.

- 15CZ 305324 B6

Chemická činidla

Aktivační a kondenzační chemická činidla

Aktivační a kondenzační podmínky jsou specifické pro každý polysacharid. Tyto podmínky jsou uvedeny v tabulce 1. Nativní polysacharid (s výjimkou PS3) se rozpustil v NaCl 2M nebo ve vodě pro injekce. Optimální koncentrace polysacharidu se hodnotila pro všechny serotypy.

Ze zásobního roztoku o koncentraci 100 mg/ml v acetonitrilu se CDAP (CDAP/PS poměr 0,75 mg/mg PS) přidal k roztoku polysacharidu. O 1,5 minuty později se přidal 0,2 M triethylamin, pro specifické aktivační pH. Aktivace polysacharidu se provedla při tomto pH během 2 minut při 25 °C. Protein D (jehož množství závisí na počátečním poměru PS/PD) se přidal k aktivovanému polysacharidu a kondenzační reakce se provedla při specifickém pH během 1 hodiny. Reakce se potom utlumila glycinem během 30 minut při 25 °C a přes noc při 4 °C.

Konjugáty se přečistily gelovou filtrací za použití Sephacryl 500 HR gelové filtrační kolony uvedené do rovnováhy 0,2 M NaCl.

Určil se obsah karbohydrátu a proteinu v eluovaných frakcích. Konjugáty se kombinovaly a sterilně se přefiltrovaly na 0,22 pm sterilizační membráně. Určily se poměry PS/protein v konjugovaných přípravcích.

Charakterizace

Každý konjugát se charakterizoval a splňoval specifikace popsané v tabulce 2. Obsah polysacharidu (pg/ml) se měřil Resorcinolovým testem a obsah proteinu (pg/ml) se měřil Lowryho testem. Konečný poměr PS/PD (hmotn./hmotn.) se určil podle poměru koncentrací.

Residuální obsah DMAP (ng/pg PS):

Aktivace polysacharidu CDAP vkládá kyanatanovou skupinu do polysacharidu a uvolňuje DMAP (4-dimethyIaminopyridin). Zbytkový obsah DMAP se určil specifickým testem vyvíjeným v SB.

Obsah volného polysacharidu (%):

Obsah volného polysacharidu v konjugátu při 4 °C nebo skladovaném po dobu 7 dnů při 37 °C se určil na supematantu získaném po inkubaci s α-PD protilátkami a nasyceným síranem amonným, po které se provedlo odstředění.

aPS/a-PS ELISA se použila pro kvantifikaci volného polysacharidu v supematantu. Nepřítomnost konjugátu se také kontrolovala α-PS/a-PS ELISA. Redukce množství volného polysacharidu vedla k zisku lepší konjugované vakcíny.

Antigenicita

Antigenicita stejných konjugátů se analyzovala v sandwichovém ELISA, ve kterém zachycovací protilátkou byla α-PS a detekční protilátkou byla a-PD.

Obsah volného proteinu (%):

Koncentrace „volného“ zbytkového proteinu D se určila za použití metody se zpracováním vzorku pomocí SDS. Konjugát se zahříval po dobu 10 minut při 100 °C za přítomnosti SDS 0,1% a injikoval se do SEC-HPLC gelové filtrační kolony (TSK 3000 - PWXL). Protože je protein D

- 16CZ 305324 B6 dimer, existuje riziko nadhodnocení koncentrace „volného“ proteinu D v důsledku disociace struktury působením SDS.

Molekulová velikost (K_av):

Molekulová velikost se určila na SEC-HPLC gelové filtrační koloně (TSK 3000 - PWXL).

Stabilita:

io Stabilita se měřila na HPLC gelové filtrační koloně (TSK 3000 - PWXL). Pro konjugáty přechovávané při 4 °C a skladované po dobu 7 dnů při 37 °C.

Charakterizace 11 valentního přípravku je uvedena v tabulce 2.

Proteinové konjugáty mohou být adsorbovány na fosforečnan hlinitý a mohou být uskladněny za vzniku konečné vakcíny.

Závěr:

Byly připraveny imunogenní konjugáty, které jsou složkami slibné vakcíny. Optimalizované CDAP podmínky pro nejlepší kvalitu konečného konjugovaného pneumokokového polysacharidu byly zajištěny pro každou z 11 valencí.

Tabulka 1: Specifické aktivační/kondenzační/utlumovací podmínky pro konjugáty PS Streptococcus pneumoniae-protein D

Serotyp	1	3 (pfluid)	4	5	6B	7F
Konc. PS (mg/ml)	2,0	3,0	2,0	7,5	5,4	3,0
Rozpouštění PS	NaCl 2M	NaCl 2M	H2O	h2o	NaCl 2M	NaCl 2M
Koncentrace PD (mg/ml)	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
Iniciální poměr PS/PD (hmot./hmot.)	1/1	1/1	1/1	1/1	1/1	1/1
Koncentrace CDAP (mg/mg PS)	0,75	0,75	0,75	0,75	0,75	0,75
PHa=pHc=pHq	9,0/9,0/9,0	9,0/9,0/9,0	9,0/9,0/9,0	9,0/9,0/9,0	9,5/9,5/9,0	9,0/9,0/9,0

- 17CZ 305324 B6

Serotyp	9V	14	18C	19F	23F
Konc. PS (mg/ml)	2,5	2,5	2,0	4,0	3,3
Rozpouštění PS	NaCl 2M	NaCl 2M	H2O	NaCl 2M	NaCl 2M
Koncentrace PD (mg/ml)	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
Iniciálrií poměr PS/PD (hmot./hmot.)	1/0,75	1/0,75	1/1	1/0,5	1/1
Koncentrace CDAP (mg/mg PS)	0,75	0,75	0,75	0,75	0,75
PHa=pHc=pHq	8,5/8,5/9,0	9,0/9,0/9,0	9,0/9,0/9,0	10/9,5/9,0	9,0/9,0/9,0

- 18CZ 305324 B6

Tabulka 2: Specifikace 11-valentní pneumokokové PS-PD vakcíny (první čísla kódu šarže a

-P o

U <u co

Ή fO β

o ε

rC

C

N

D23PDJ212

Tt r~; © 1—4

0

CN 1-4

0,9

0,12

bez posunu

X

CN

3

0

O

OJ

CN

&

Q cu

CN X

cn

t/3 O cu

9PD

Τζ

CM

posun

x Q

©

0

CN

0,3

θ'

N 4> X

Dl

0

© 1......t

θ''

©”

in

5

ΓΜ

β

m

(Zl

CM

CM

0

bez post

H-j Q ΡΠ

X 00

cu X

8PD

CM X

©

Q

o r—<

CN

CM

CM

o

o3 »—1 CA

Q

© t—H

CM

0,2

♦—4 o

00

3

02

β

CM

g

CM

3

CN

l·—,

M 0 CU

1—j Q CU

,86

CM

co 0 CU

4PD

00 uo

c-

Q

O r-H

t-

CN r—«i

0

©

bez

5

©

<1

m

0,3

1—4 O

N O X)

X

CM

cn

S3

CM

3

CM

g

CM

>—

»—

w 0 cu

Q CU

O o

CZ3 O CU

PD

O

cn

cn

CN

N <U X

o Q

t <

<1

0,6

T—4 θ'

N (U X>

O Q

©

<1

cn θ'

0,6

r—4 ©

t--

in

CM

3

CM

3

CM

g

CM

c

>—>

3

·—»

cn O CU

Q cu

Ό

00

pos

PD

00 vn

T*-<

bez

bez

o Q

O t—<

1—<

00

0,2

co

DO

0

T-M

00

1 ( ©”

1—4 θ'

N= 0' 0

CZ)

x=>

CO

CU

© 0

cu

T*“4

00

1—4

00

V

X

V

=L

z—X

'ob

x©

ob

in

β

ŽN

un

β

o J3

β 2

»—< v ζ~“ν X©

10 © v

w O

β X

V (e?

•Z) ©' V

4-( cú

©\

z~X

^5

3

r z

z—X

0 s r®.

X5 O Cd <z>

a a • r—< ¢)

tzi cu 00 =L

ctí to

O

X «$ CZJ >>

§

(Z) CU 00 i

CQ X-Z 4—» CA

fi • w

O cu

O P cu

“m c

0 X » »—

β

o CU

0 »1 cu

ob β

0 X

<υ 4-»

0

0

3

<υ

O

0

cu

3

O

45

X!

cu

>

o

X

X

>

g

.cu 00

Jž o

X _β O

'C0 > O

.CU (Z!

N> 0

j| 0

'C0 O

CS

cu

>

>

Q

3

03 4-»

CU

>

>

Q

3

5

4-1 oj

4-« ><U

Í3

Í3

Í3

<υ

» r4

>0

ig

i3

Í3

X <u

ε

<Zi

CO

<ZJ

——H

-G

ε

co

t/i

cz>

-O

£

o

40

X

X

O

03

X

X

X

0

OS

cu

O

0

0

(Z)

(U

0

0

0

- 19CZ 305324 B6

Příklad 2: Příznivý dopad přidání jednoho nebo více pneumokokových proteinů podle předkládaného vynálezu +/- 3D-MPL na protektivní účinnost PD-konjugované 1 lvalentní polysacharidové vakcíny proti pneumokokové kolonizaci plic u myší.

Imunologické odečty

ELISA stanovení sérových IgG specifických pro pneumokokový protein

Maxisorp Nunc imunoplotny se potáhly během 2 hodin při 37 °C 100 pg/jamku 2pg/ml proteinem naředěným v PBS. Plotny se promyly 3krát NaCl 0,9% Tween-20 0,05% pufrem. Potom se přidala sériová 2-násobná ředění (v PBS/Tween 20, 0,05%, 100 μΐ na jamku) anti-proteinového referenčního séra jako standard (od 670 ng/ml IgG) a vzorky séra (od ředění 1/10) se inkubovaly po dobu 30 minut při 20 °C za třepání. Po promytí, jak bylo popsáno výše, se kozí protilátka proti myším IgG konjugovaná s peroxidasou (Jackson) naředěná 5000x v PBS/Tween 20 0,05% inkubovala (100 pg/jamku) po dobu 20 °C za třepání. Po promytí se plotny inkubovaly po dobu 15 minut při teplotě místnosti se 100 μΐ/jamku detekčního pufru (OPDA 0,4 mg/ml a H₂O 0,05 % vlOOmM citrátového pufru, pH 4,5). Detekce se ukončila přidáním IN HC1 v dávce 50 pg/jamku. Optické density se odečítaly při 490 a 620 nm za použití Emax čtečky ploten (Molecular Devices). Titr protilátky se vypočetl pomocí 4 parametrické matematické metody za použití SofitmaxPro softwaru.

Test opsonofagocytosy

Cílem tohoto testu je reprodukovatelné měření opsonizační kapacity testovaných vzorků séra proti Streptococcus pneumoniae serotypů 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F nebo 23F, za použití způsobu upraveného z publikované standardizované metody CDC (Steiner et al., Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 4: 415: 1997).

Tento test napodobuje in vitro podmínky, kteréjsou in vivo primárním mechanismem eliminující invadující Streptococcus pneumoniae, po které následuje fagocytosa a potom usmrcení mikroorganismů. „Fagocytosa“ je proces, při kterém buňky pohltí materiál a uzavřou ho ve vakuole (fagosomu) v cytoplasmě. Pneumokoky jsou usmrceny tehdy, když jsou fagocytovány zdravými savčími fagocyty. „Opsonizace“ je proces, který usnadňuje fagocytosu deponováním opsoninů, například protilátek a komplementu, na antigen.

V literatuře je popsáno mnoho opsonofagocytámích testů. Standardizované metoda CDC byla testována v mnoha laboratořích (Steiner et al., ICAAC, Sept. 16 až 20, 2000, Toronto). Tento test byl potom upraven v SB, protože poskytuje základ pro srovnání pro jiné laboratoře, používá činidla a kontroly, která jsou obecně dostupná, a vyjadřuje výsledky jako titr (ředění) séra, které usnadňují zabíjení 50 % životaschopných pneumokoků, což je jednotka, která je běžně používaná pro tento typ testu. Kromě toho bylo prokázáno, že tento upravený test může generovat výsledky, které dobře korespondují s 4 dalšími laboratořemi (Steiner et al., ICAAC, Sept. 16 až 20, 2000, Toronto).

Fagocytující buňkou použitou v tomto testu je buněčná linie HL60, která pochází od jedinců s promyelocytámí leukémií a která byla imortalizována Collinsem et al. V roce 1977 (Nátuře 270: 347 až 9). Tato buněčná linie se skládá z nediferencovaných hematopoetických buněk, které jsou tvořeny z 85 % blasty a promyelocyty, z 6 myelocyty a z 9 % diferencovanými buňkami. Polární sloučeniny mohou indukovat diferenciaci buněk do alespoň dvou různých linií. N,Ndimethylformamid indukuje diferenciaci granulocytů, což vede ke vzniku buněk podobných polymorfonukleámím buňkám (44 % myelocytů a metamyelocytů a 53 % segmentovaných a tyčkových PMN).

-20CZ 305324 B6

Ve verzi 2 tohoto testu se testované sérum inaktivuje teplem a připraví se 2násobná sériová ředění od % v 96 jamkových mikroplotnách v HBSS médiu obsahujícím 0,3% BSA. Konečný objem naředěného séra v každé jamce je 25 μΐ.

Čtyři objemy HL60 buněk v koncentraci 10⁷ buněk/ml (5 nebo 6 dnů po diferenciaci dimethylformamidem), 2 objemy bakterií Streptococcus pneumoniae (ve vhodném ředění) a 1 objem komplementu od králičích mláďat se smísí bezprostředně před použitím, a 25 μΐ směsi se přidají do každé jamky 96 jamkové mikroplotny obsahující naředěné sérum. Pro serotypy 1 a 6B se množství komplementu zvýší na konečnou koncentraci 12,5 %, čímž se získá verze 3 testu.

Po dvou hodinách inkubace při 37 °C za třepání se plotna umístí na led pro ukončení opsonofagocytámí reakce.

Hodnocení se provede určením jednotek tvořících kolonie (CFU) v každé jamce pomocí inkubace přes noc při 37 °C. „Opsonizační titr“ (OT) se definuje jako převrácená hodnota ředění séra, které je schopné redukovat alespoň o 50 % počet bakterií Streptococcus pneumoniae vjamkách (tj. 50 % usmrcování). % usmrcování se vypočte podle následujícího vzorce:

% usmrcování = (průměr CFU v kontrolních jamkách - CFU vzorku) / průměr CFU v kontrolních jamkách x 100

Pneumokoková intranasální infekce OF1 myší týdnů staré samice OF1 myší se intranasálně infikovaly v anestezii 510⁵ CFU na myši adaptované Streptococcus pneumoniae serotypů 2, 4 nebo 6B. Plíce se odebraly za 6 hodin po infikování a homogenizovaly se (Ultramax, 24000 rpm, 4 °C) v Todd Hewith Broth (THB, Gibco) médiu. Sériová lOnásobná ředění plicních homogenizátů se umístila při teplotě 37 °C do Petriho misek obsahujících THB agar doplněný kvasinkovým extraktem. Infekce plic pneumokoky se určila jako počet CFU/myš a vyjádřila se jako logaritmicky vážený průměr. Detekční limit byl 2,14 log CFU/myš.

Příklad 2A: Efekt 3D-MPL adjuvans na imunitní reakci proti proteinu

V tomto příkladu jsme hodnotily vliv 3D-MPL adjuvans na imunitní reakci proti proteinu podle předkládaného vynálezu.

Skupiny 10 samic Balb/c myší stáří 6 týdnů se intramuskulámě imunizovaly, ve dny 0, 14 a 21, 1 pg proteinu obsaženým v A: A1PO4 100 pg; nebo Β: A1PO4 100 pg + 5 pg 3D-MPL (3-de-Oacylovaný monofosforyl lipid A, od Ribi Immunochem). IgG se měřil ELISA po podání třetího séra.

Pro libovolný antigen byla nej lepší imunitní reakce indukována u zvířat vakcinovaných přípravky obsahujícími 3D-MPL.

Příklad 2B: Příznivý vliv přidání proteinu podle předkládaného vynálezu +/- 3D-MPL adjuvans na protektivní účinnost PD-konjugované llvalentní polysacharidové vakcíny na kolonizaci plic pneumokoky u OF1 myší, které byly intranasálně infikovány serotypem 2, 4 nebo 6B.

V tomto příkladu jsme hodnotili proíylaktickou účinnost vakcíny obsahující 1 lvalentní konjugát polysacharid-protein D, protein podle předkládaného vynálezu a A1PO4 + 3D-MPL adjuvans, ve srovnání s klasickým přípravkem obsahujícím A1PO4 adsorbovaný llvalentní konjugát protein D-polysacharid.

-21 CZ 305324 B6

Skupina 12 samic OF1 myší stáří 4 týdny se imunizovaly podkožně ve dny 0 a 14 přípravkem obsahujícím A: 50 pg A1PO4; B: 0,1 pg PS/serotyp PD-konjugovaná 1-valentní polysacharidová vakcína + 50 pg A1PO4; nebo C: 0,1 pg PS/seroptyp PD-konjugovaná 1-valentní polysacharidová vakcína + 10 pg proteinu podle předkládaného vynálezu + 50 pg A1PO4 + 5 pg 3D-MPL (od Ribi Immunochem). Infekce byla provedena v den 21 Jak bylo popsáno výše.

Jak bylo v tomto testu prokázáno, je významné ochrany dosaženo při použití 11-valentní polysacharidové konjugované vakcíny doplněné proteinem podle předkládaného vynálezu a obsahující A1PO4 + 3D—MPL adjuvans. Naopak, žádná signifikantní ochrana nebyla pozorována u zvířat imunizovaných 11-valentním polysacharidovým konjugátem/AlPO4 přípravkem. Tento výsledek ukazuje, že přidání proteinu podle předkládaného vynálezu a 3DMPL adjuvans zesiluje účinnost 1 lvalentní polysacharidové konjugované vakcíny proti pneumonii.

Příklad 2C: Imunologická korelace ochrany zjištěné v příkladu 2B

Pro určení imunologických korelátů ochrany dosažené v příkladu 2B 1 lvalentní polysacharidovou konjugovanou vakcínou doplněnou proteinem podle předkládaného vynálezu a 3D-MPL se měřily serologické protilátkové reakce na polysacharid 2, 4 nebo 6B a protein podle předkládaného vynálezu před infikováním.

Titry protilátek se potom srovnávaly s počtem kolonií bakterií v plících příslušných zvířat určeným 6 hodin po infekci. R² se vypočetl za použití Log/Log lineární regrese.

Vypočtený R² může ukázat absenci korelace mezi protilátkovou imunitní reakcí a ochranou před oběma antigeny. Titry anti-6B (nebo 2 nebo 4) protilátek se statisticky významně nelišily ve skupinách imunizovaných 1 lvalentní konjugovanou vakcínou nebo stejnou vakcínou doplněnou proteinem podle předkládaného vynálezu a 3D-MPL. Proto není zlepšení ochrany pozorované pro přípravek C způsobeno pouze vyšší protilátkovou reakcí na polysacharid 6B (nebo 2 nebo 4).

Dohromady tyto výsledky naznačují, že ochrana není způsobena pouze protilátkovou imunitní reakcí, ale také buněčnou imunitní reakcí indukovanou proteinovým antigenem (výhodně za přítomnosti 3D-MPL). Toto dále podporuje přidání proteinového antigenu a účinného adjuvans k pneumokokové polysacharidové vakcíně, tak, aby bylo dosaženo spolupráce obou složek imunitní reakce pro dosažení optimální ochrany.

Příklad 3: Kooperace obou složek imunitního systému u myší aktivně imunizovaných proteinem podle předkládaného vynálezu a pasivně imunizovaných protilátkami proti pneumokokovému PS

Příklad 3: Určení koncentrace pasivně podávaných protilátek proti 6B-polysacharidu (anti-PS) chránících proti pneumonii

Způsob:

Vakcinační skupiny: Čtyři skupiny po 16 myších byly pasivně imunizovány (i.p.) v den -1 100 μΐ neředěného krysího anti-polysacharidového séra, kdy každá skupina byla imunizovaná způsobem popsaným dále (celkem 64 myší).

-22 CZ 305324 B6

Skupina	Specificita	Koncentrace Ig v antiséru
G1	a-PS-6B	5 pg/ml
G2	a-PS-6B	2 μg/ml
G3	a-PS-6B	0,75 pg/ml
G4	Kontrola	0 gg/ml

Zvířata: 64 samců CD-I myší od Charles River, Canada, o hmotnosti přibližně 35 g (stáří přibližně 10 týdnů).

Anestezie: Myši byly anestezovány isofluoranem (3%) plus 02 (1 1/min).

Organismus: Streptococcus pneumoniae NI387 (serotyp 6) byl získán z ploten obsahujících tryptikasový sójový agar (TSA) doplněný 5% koňskou krví, které byly suspendovány v 6 ml PBS. io Bezprostředně před infikováním se 1 ml bakteriální suspenze naředil na 9 ml za použití roztaveného živného agaru (BBL) a ponechal se při 41 °C. Myším se aplikovalo přibližně 6,01ogl0 cfu/myš v objemu 50 μΐ.

Infekce: V den 0 se myši anestezovaly způsobem popsaným výše a infikovaly se Streptococcus 15 pneumoniae N1387 (50 μΐ chladné bakteriální suspenze) pomocí intrabronchiální instilace cestou nechirurgické intratracheální intubace. Tento způsob byl popsán ve Woodnut and Berry (Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43: 29 (1999)).

Vzorky: V den 3 po infekci se 8 myší/skupinu utratilo nadměrnou dávkou CO₂ a odebraly se 20 plíce, které se homogenizovaly v 1 ml PBS. V PBS se připravila 10-násobná sériová ředění, za účelem spočítání počtu životaschopných bakterií. Vzorky se naočkovaly (20 μΐ) trojmo na TSA plotny doplněné 5% koňskou krví a inkubovaly se přes noc při 37 °C před tím, než se vyhodnocovaly. Další skupina myší se usmrtila v den 7 a vzorky se připravily stejným způsobem.

Výsledky:

Konc.· IgG (μ^/ιηΐ)	Počet bakterií (loglO cfu/plíce) v den po
v krysím séru	infekci
	3	8
5	6,7 ± 0,7 (1/7)	7,2 ± 0,7 (5/8)
2	6,5 ± 0,7 (1/7)	6,9 ± 1,8 (4/7)
0,75	7,7 ± 0,5 (5/8)	4,8 ± 1,4 (2/8)
0	6,7 ± 1,5 (3/6)	6,3 ± 1,5 (3/9)

Čísla v závorkách jsou počty zvířat, která skonala před odběrem vzorku.

Závěr: Obecně, nebyl pozorován statisticky významný rozdíl v počtu bakterií izolovaných z jakékoliv léčené skupiny. Toto naznačuje, že nebylo dosaženo žádné měřitelné ochrany při použití protilátky proti polysacharidu k koncentraci do 5 pg/ml, včetně.

-23 CZ 305324 B6

Tento výsledek je podobný výsledku dosaženému v některých lidských klinických studiích, to znamená výsledku, že protilátka proti polysacharidů je nedostatečná pro ochranu před pneumokokovou pneumonií v některých populacích.

Příklad 3B: Stanovení ochrany před pneumonií dosažené aktivním podáním proteinu podle předkládaného vynálezu s nebo bez adjuvans, a synergie se sub-optimální anti-PS protilátkou Způsob:

Zvířata: 128 samců CD-I myší od Charles River, Canada, o hmotnosti přibližně 20 g v 6 týdnech a 38 g v 10 týdnech (stáří přibližně 10 týdnů v době imunizace, 10 týdnů v době infekce).

Imunizace: 6 skupin po 16 myších se imunizovalo podkožní injekcí v dny -22 a -14 100 μΐ vakcíny, jak je podrobně popsána dále (celkem 128 myší). 3D-MPL se získal od Ribi/Corixa.

V den -1 se konkrétní skupiny (viz následující tabulka 1) pasivně imunizovaly (i.p. 100 μΐ) myší protilátkou proti polysacharidů v koncentraci 4,26 pg/ml (4 ml 5 pg/ml + 1,3 ml 2 pg/ml).

Skupina	Inj ikovaný obj em aktivní složky	Vakcína podaná ve dny -22, -14 (dávka v pg)	Inj ikovaný obj em pasivní složky	Pasivní IgG (den - 1)
1-1	100 μΐ s.c.	Protein/AlP04 (10/50)		Ne
1-2	100 pl s.c.	Protein/MPL/AlP04 (10/5/50)		Ne
1-3	100 μΐ s.c.	Protein/AlP04 (10/50)	100 pl i.p.	a-PS
1-4	100 pl s.c.	Protein/MPL/AlP04 (10/5/50)	100 pl i.p.	a-PS
1-5	100 pl s.c.	Protein/AlP04 (10/50)	100 μΐ i.p.	a-PS
1-6	100 μΐ s.c.	Protein/AlP04 (10/50)		Ne

Infekce: V den 0 se myši anestezovaly isofluranem (3%) plus 02 (1 1/min). Bakteriální inokulum se získalo odběrem kultivovaných Streptococcus pneumoniae NI387 (serotyp 6) z ploten obsahujících tryptikasový sójový agar (TSA) doplněný 5% koňskou krví, které byly suspendovány v 6 ml PBS. 10-násobné ředění (1 ml + 9 ml) se připravilo v roztaveném živném agaru (41 °C). Myši se infikovaly pomocí intrabronchiální instilace cestou nechirurgické intratracheální intubace a dávka byla přibližně 6,0 loglO cfu/myš v objemu 50 pl. Tento způsob byl popsán ve Woodnut and Berry (Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43: 29 (1999)).

Vzorky: 72 hodin po infekci se 8 myší/skupinu utratilo nadměrnou dávkou CO₂ a odebraly se plíce, které se homogenizovaly v 1 ml PBS. V PBS se připravila lOnásobná sériová ředění, za úče-24CZ 305324 B6 lem spočítání počtu životaschopných bakterií. Vzorky se naočkovaly (20 μΐ) trojmo na TSA plotny doplněné 5% koňskou krví a inkubovaly se přes noc při 37 °C před tím, než se vyhodnocovaly. Další skupina myší se usmrtila v den 7 a vzorky se připravily stejným způsobem.

Analýza dat: Získaným výsledkem pro srovnání léčby je počet bakterií v plících v den 3 a 7 po infekci. Výsledky mohou být vyjádřeny jako skupinové průměry se standardními odchylkami. Statistická analýza může být provedena za použití Student-t testu, ve kterém je hodnota p < 0,05 považována za statisticky významnou.

Jak bylo uvedeno výše, protilátka proti polysacharidu samotná (skupina 1-5) neposkytuje ochranu před růstem pneumokoků v plících. Pneumokokový protein s AIPO4 adjuvans (skupina 1-1) také neposkytuje ochranu, ale účinkuje lépe než protein kombinovaný s 3D-MPL (skupina 1-2).

Nej významnější ochrana byla pozorována ve skupinách s polysacharidovým i proteinem, zejména ve skupině, které byly podány všechny tři složky, protein, 3D-MPL a pasivně podaná protilátka proti polysacharidu (skupina 1—4). Tento závěr je podporován též stupněm mortality. Skupiny 1-3 a zejména 1-4 mají méně úmrtí ve srovnání s dalšími skupinami.

Závěr:

Protože byl pokus proveden s pasivně imunizovanými zvířaty, nemůže být synergní efekt aktivní imunizace proteinem (+/- MPL) způsoben zvýšením koncentrace protilátek proti polysacharidovému antigenů.

Významná ochrana před pneumokokovou pneumonii byla pozorována ve skupinách imunizovaných proteinem i pasivně podanou protilátkou proti polysacharidu, zejména tehdy, pokud byl přítomen též 3D-MPL, což ukazuje na synergii této kombinace.

Pokud je imunizace proti polysacharidu provedena aktivně (výhodně konjugovaným polysacharidem), tak je tento efekt ještě výraznější, v důsledku efektu paměti B-lymfocytů, a konstantní hladiny anti-PS protilátky během pokusu budou přispívat ke kooperaci imunitní reakce.

Příklad 4: Způsob pro stanovení synergie korelováním ochrany

Základním mechanismem ochrany, které lidský organismus využívá pro eliminaci infekčního pneumokoka, je protilátkami zprostředkovaná opsonofagocytosa (Bruyn et al., Clin. Infect. Dis. 14: 251 (1992)). Ačkoliv bylo vyvinuto několik ELISA metod pro měření koncentrace protilátek ke kapsulámímu polysacharidu jako korelátu ochrany, je zřejmé, že test opsonofagocytosy in vitro je lepším korelátem ochrany (Musher et al., J. Infect. Dis. 182: 158 (2000)).

Pneumokokové proteiny podle předkládaného vynálezu poskytují ochranu před pneumokokovou infekcí mechanismy, které jsou odlišné od protilátkami zprostředkované opsonofagocytosy.

V příkladu 2 aktivní imunizace konjugátem a proteinem vykazovala synergní účinky, které nemohly být vysvětleny rozdíly v koncentraci protilátek, protože koncentrace byly stejné v obou skupinách. Proto musí mít residuální ochrana, která byla pozorována, příčinu v synergním účinku, Obdobně, protože je protilátka přidávána pasivně, může být stejného výsledku dosaženo v příkladu 3.

V mnoha případech jsou pneumokokové proteiny podle předkládaného vynálezu asociované s povrchem a předpokládá se, že budou mít nějakou opsonizační aktivitu sami o sobě. V tomto případě je možné odlišit mechanismus ochrany kvantitativním měřením opsonizační kapacity anti-pneumokokového proteinu, což může být použito pro hodnocení relativního příspěvku opsonizační aktivity k dalším synergním mechanismům ochrany.

-25CZ 305324 B6

V myším modelu kolonizace plic může být relativní ochrana každou vakcínou hodnocena podle eliminace bakterií z plic. Alternativně může být účinnost vakcíny hodnocena z průběhu onemocnění, jak se obvykle určuje pro vakcíny.

% ochrany = (CFU/kontrolní plíce - CFU(vakcinovaná plíce)/ (CFU/kontrolní plíce) % účinnosti = (kontroly - vakcinováníj/kontroly

Pro stanovení podílu ochrany nebo účinnosti, který je v důsledku synergního účinku, je třeba určit, jakou účinnost lze očekávat podle opsonizačních titrů.

Ve výše uvedeném příkladu 3 je % ochrany dosažené kombinací způsobeno synergií mezi složkami protein/protilátka, protože ani protein, ani protilátka proti polysacharidu samotné nedosahují takové ochrany.

Je možné zhodnotit velikost příspěvek synergního účinku k ochraně podle relativní opsonizační aktivity. Když je opsonizační aktivita dosažená protilátkou proti kapsulámímu polysacharidu X, a opsonizační aktivita dosažená protilátkou proti pneumokokovému proteinu Y, tak je celková opsonizační aktivita X + Y a relativní podíl opsonizační aktivity proteinu je Y/X + Y. Toto se srovná s relativní protektivní účinností vakcíny, kde anti-polysacharidová část vakcíny poskytuje protektivní účinnost A% a protektivní účinnost vakcíny obsahující polysacharid plus protein je B%. Další účinnost, která nenáleží opsonizační aktivitě, se potom označí jako residuální protektivní aktivita (synergní) = B%-A%-B%*(Y/X+Y).

Tento příklad není omezen na hodnocení účinků synergie. Pokud budou identifikovány další koreláty ochrany, tak mohou být použity pro hodnocení synergního účinku.

Všechny publikace, včetně patentů a patentových přihlášek, citované v předkládaném vynálezu, jsou zde uvedeny ve své úplnosti jako odkazy.

Claims (15)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Imunogenní prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden polysacharidový antigen Streptococcus pneumoniae a alespoň jeden proteinový antigen Streptococcus pneumoniae vybraný ze skupiny sestávající z PhtA, PhtD a PhtB, přičemž polysacharidový antigen je prezentován ve formě konjugátu polysacharid—proteinový nosič.
2. 2. Imunogenní prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že proteinovým antigenem je PhtD.
3. 3. Imunogenní prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že dále obsahuje Ply.
4. 4. Imunogenní prostředek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že proteinový nosič je vybrán ze skupiny zahrnující: difterický toxoid; tetanický toxoid; CRM197; přílipkový haemokyanin, KLH; proteinový derivát tuberkulinu, PPD; a protein D z H. influenzae.
5. 5. Imunogenní prostředek podle kteréhokoliv z nároků laž4, vyznačující se tím, že vakcína obsahuje alespoň čtyři pneumokokové polysacharidové antigeny z různých serotypů.

   -26CZ 305324 B6
6. 6. Imunogenní prostředek podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že dále obsahuje adjuvans.
7. 7. Imunogenní prostředek podle nároku 6, vyznačující se tím, že adjuvans zahrnuje sůl hliníku.
8. 8. Imunogenní prostředek podle nároku 6, vyznačující se tím, že adjuvans je přednostním induktorem ΤΗ 1 reakce.
9. 9. Imunogenní prostředek podle nároku 8, vyznačující se tím, že adjuvans zahrnuje alespoň jedno adjuvans z následující skupiny: 3D-MPL, saponinové imunostimulační činidlo nebo imunostimulační CpG oligonukleotid.
10. 10. Imunogenní prostředek podle nároku 9, vyznačující se tím, že adjuvans obsahuje nosič vybraný ze skupiny zahrnující: emulzi olej-ve-vodě, liposomy a sůl hliníku.
11. 11. Imunogenní prostředek podle kteréhokoliv z předchozích nároků pro použití jako léčivo.
12. 12. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje imunogenní prostředek podle nároků 1 až 10.
13. 13. Použití pneumokokového polysacharidového antigenů v kombinaci s proteinovým antigenem Streptococcus pneumoniae vybraným ze skupiny sestávající z PhtA, PhtD a PhtB a popřípadě adjuvantem indukujícím TH1 reakci pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení zánětu plic u pacientů starších 55 let, přičemž polysacharidový antigen je konjugován k proteinovému nosiči.
14. 14. Použití pneumokokového polysacharidového antigenů v kombinaci s proteinovým antigenem Streptococcus pneumoniae vybraným ze skupiny sestávající z PhtA, PhtD a PhtB a popřípadě adjuvantem indukujícím TH1 reakci pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení zánětu středního ucha u kojenců nebo batolat, přičemž polysacharidový antigen je konjugován k proteinovému nosiči.
15. 15. Způsob přípravy imunogenního prostředku podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

    výběr jednoho nebo více pneumokokových polysacharidových antigenů;

    výběr jednoho nebo více pneumokokových proteinových antigenů ze skupiny sestávající z PhtA, PhtD a PhtB; a smísení uvedeného polysacharidového antigenů a proteinového antigenů s vhodným excipientem;

    přičemž polysacharidový antigen je prezentován ve formě konjugátu polysacharid-proteinový nosič.

    Konec dokumentu