PL209247B1 - Immunogenna kompozycja, zawierająca ją szczepionka, zastosowanie szczepionki oraz sposób wytwarzania szczepionki - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest immunogenna kompozycja, zawierająca ją szczepionka, zastosowanie szczepionki oraz sposób wytwarzania szczepionki. Kompozycja według wynalazku zawiera kombinację białek PhtD i pneumolizyny Streptococcus pneumoniae, która jest w szczególności użyteczna w zapobieganiu paciorkowcowemu zakażeniu u niemowląt i osób w podeszłym wieku.

Streptococcus pneumoniae jest Gram-dodatnią bakterią odpowiedzialną za znaczną zachorowalność i śmiertelność (zwłaszcza u osób bardzo młodych i w podeszłym wieku), wywołującą inwazyjne choroby, takie jak zapalenie płuc, bakteriemia i zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych oraz choroby związane z kolonizacją, jak ostre zapalenie ucha środkowego. Wskaźnik pneumokokowego zapalenia płuc w USA dla osób powyżej 60 roku życia jest szacowany na 3 do 8 na 100000. W 20% przypadków prowadzi to do bakteriemii i innych objawów, jak zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych ze śmiertelnością bliską 30% nawet przy leczeniu antybiotykami.

Pneumokok posiada otoczkę z chemicznie połączonymi polisacharydami, które nadają swoistość serotypom. Znanych jest 90 serotypów pneumokokowych, a otoczka jest główną determinantą zjadliwości, jako że otoczka nie tylko chroni wewnętrzną powierzchnię bakterii przed układem dopełniacza, ale jest sama słabo immunogenna. Polisacharydy są T-niezależnymi antygenami i nie mogą być poddane obróbce i prezentowane na cząsteczkach MHC w celu oddziaływania z komórkami T. Mogą jednakże pobudzać układ odpornościowy przez alternatywny mechanizm, który dotyczy krzyżowego wiązania receptorów powierzchniowych na komórkach B.

W kilku doś wiadczeniach wykazano, że ochrona przeciwko inwazyjnej chorobie pneumokokowej jest mocniej związana z przeciwciałami swoistymi wobec otoczki i że ochrona jest swoista wobec serotypów.

Streptococcus pneumoniae jest najczęstszą przyczyną inwazyjnej choroby bakteryjnej i zapalenia ucha środkowego u niemowląt i dzieci młodszych. Podobnie ludzie w podeszłym wieku słabo odpowiadają na szczepionki pneumokokowe [Roghmann i wsp., (1987), J. Gerontol. 42:265-270], stąd podwyższona liczba przypadków bakteryjnego zapalenia płuc w tej populacji [Verghese i Berk, (1983) Medicine (Baltimore) 62:271-285].

23-walentna niekoniugowana szczepionka pneumokokowa wykazała dużą różnorodność w skuteczności klinicznej, od 0% do 81% [Fedson i wsp. (1994) Arch Intern Med. 154:2531-2535)]. Skuteczność wydawała się być związana z grupą ryzyka, która była immunizowana, jak osoby w podeszłym wieku, z chorobą Hodgkina, po splenektomii, z anemią sierpowatą i agammaglobulinemiami [Fine i wsp. (1994) Arch Intern Med. 154:2666-2677), a także z objawami choroby. Szczepionka 23-walentna nie wykazywała ochrony wobec pneumokokowego zapalenia płuc (w pewnych grupach wysokiego ryzyka, takich jak osoby w podeszłym wieku) i zapalenia ucha środkowego.

Strategie zaprojektowane w celu ominięcia tego braku immunogenności u niemowląt obejmują wiązanie polisacharydu do większych immunogennych białek, które pomagają biernym komórkom T i które indukują pamięć immunologiczną wobec antygenu polisacharydowego, z którym są skoniugowane.

Dlatego istnieje potrzeba udoskonalenia kompozycji szczepionki pneumokokowej, zwłaszcza tej, która będzie bardziej skuteczna w ochronie i łagodzeniu objawów choroby pneumokokowej (zwłaszcza zapalenia płuc) u osób w podeszłym wieku i dzieci młodszych.

Niniejszy wynalazek dostarcza taką ulepszoną szczepionkę.

Przedmiotem wynalazku jest immunogenna kompozycja obejmująca co najmniej 2 białka S. pneumoniae, przy czym jednym z białek jest PhtD, a drugim białkiem jest pneumolizyna (Ply).

Korzystnie immunogenna kompozycja według wynalazku obejmuje ponadto NR1xR2 lub R1xR2 z CbpA lub PspC. Korzystniej pneumolizyna zawarta w immunogennej kompozycji wedł ug wynalazku jest detoksyfikowana chemicznie albo genetycznie.

W korzystnej postaci wykonania immunogenna kompozycja wedł ug wynalazku dodatkowo obejmuje inny antygen wybrany z grupy składającej się z powierzchniowego antygenu wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg), antygenów wirusa Polio, białek błony zewnętrznej Moraxella catarrhalis, białek nietypowalnego Haemophilus influenzae oraz białek błony zewnętrznej N. meningitidis B. Korzystniej dodatkowym antygenem w kompozycji immunogennej według wynalazku jest białko nietypowalnego Haemophilus influenzae, a najkorzystniej białko D nietypowalnego Haemophilus influenzae.

Również w korzystnej postaci wykonania immunogenna kompozycja według wynalazku dodatkowo obejmuje adiuwant, który korzystniej jest uprzywilejowanym induktorem odpowiedzi typu TH1.

PL 209 247 B1

Przedmiotem wynalazku jest także szczepionka obejmująca immunogenną kompozycję według wynalazku.

W kolejnym aspekcie wynalazek dotyczy zastosowania szczepionki według wynalazku do wytwarzania leku do zapobiegania zapaleniu płuc u pacjentów powyżej 55 roku życia lub do wytwarzania leku do zapobiegania zapaleniu ucha środkowego u niemowląt.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania szczepionki według wynalazku obejmujący etapy: wybierania i izolowania dwóch różnych białek S. pneumoniae oraz mieszania tych białek z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, przy czym białka te stanowią PhtD oraz pneumolizyna (Ply).

Szczegółowy opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dostarcza ulepszoną szczepionkę do zapobiegania lub łagodzenia objawów zakażeń pneumokokowych u osób w podeszłym wieku (np. w zapaleniu płuc) i/lub niemowląt (np. w zapaleniu ucha środkowego) wykorzystującą białko pneumokokowe. W jednym korzystnym wykonaniu szczepionka jest odpowiednia w zapobieganiu i łagodzeniu objawów zakażenia pneumokokowego u osób w podeszłym wieku. Ponieważ większość dorosłych jest eksponowana na Streptococcus pneumoniae, niniejsza szczepionka w zamierzeniu ma zwiększyć upośledzoną odpowiedź odpornościową u dorosłych i osób w podeszłym wieku do poziomu ochronnego przez podanie co najmniej 2 białek pneumokokowych zidentyfikowanych w niniejszym wynalazku. Białka pneumokokowe są podawane pod nieobecność polisacharydów S. pneumoniae.

W kontekście niniejszego wynalazku pacjent jest traktowany jako osoba w podeszłym wieku, jeśli ukończył co najmniej 55 rok życia, typowo powyżej 60 roku życia i bardziej ogólnie powyżej 65 roku życia. Stąd też w jednym z wykonań niniejszy wynalazek dostarcza kompozycję szczepionki obejmującą białka pneumokokowe do zapobiegania zapaleniu płuc u osób w podeszłym wieku.

W innym z wykonań niniejszy wynalazek dostarcza kompozycję szczepionki odpowiednią do stosowania u niemowląt (typowo 0-2 lata), obejmującą 2 lub większą liczbę białek pneumokokowych zidentyfikowanych w niniejszym wynalazku.

Białka pneumokokowe

Białka Streptococcus pneumoniae stosowane w rozwiązaniach według wynalazku są prezentowane powierzchniowo co najmniej w czasie jednej części cyklu życiowego pneumokoka lub są białkami wydzielanymi i uwalnianymi przez pneumokoka.

Istnieją różne kategorie białek pneumokokowych takie, jak białka posiadające motyw sekwencji sygnałowej typu II LXXC (gdzie X jest dowolnym aminokwasem, np. rodzina z triadą polihistydynową (PhtX)), białka wiążące cholinę (CbpX), białka posiadające motyw sekwencji sygnałowej typu I (np. Sp101), białka mające motyw sekwencji LPXTG (gdzie X jest dowolnym aminokwasem, np. Sp128, Sp130), toksyny (np. Ply) itd. Przykładami w tych kategoriach (lub motywach) są następujące białka lub ich immunologicznie funkcjonalne odpowiedniki.

Niniejszym wskazano, że kompozycja immunogenna może obejmować co najmniej 2 białka wybrane z grupy obejmującej rodzinę z triadą polihistydynową (PhtX), rodzinę białek wiążących cholinę (CbpX), skrócone CbpX, rodzinę LytX, skrócone LytX, białka chimerowe (lub fuzje) CbpX skróconeLytX, skrócone pneumolizynę (Ply), PspA, PsaA, Sp128, Sp 101, Sp130, Sp125 i Sp133. Jednakże jeśli CbpX jest PspC to drugim białkiem nie jest PspA lub PsaA. Korzystnie kompozycja immunogenna może obejmować 2 lub większą liczbę białek wybranych z grupy obejmującej rodzinę z triadą polihistydynową (PhtX), rodzinę białek wiążących cholinę (CbpX), skrócone CbpX, rodzinę LytX, skrócone LytX, białka chimerowe (lub fuzje) CbpX skrócone-LytX skrócone, pneumolizynę (Ply), PspA, PsaA i Sp128. Bardziej korzystnie kompozycja immunogenna moż e obejmować 2 lub wię kszą liczbę biał ek wybranych z grupy obejmującej rodzinę z triadą polihistydynową (PhtX), rodzinę białek wiążących cholinę (CbpX), skrócone CbpX, rodzinę LytX, skrócone LytX, białka chimerowe (lub fuzje) CbpX skrócone-LytX, skrócone pneumolizynę (Ply) i Sp128.

Rodzina Pht (z triadą polihistydynową) obejmuje białka PhtA, PhtB, PhtD i PhtE.

Rodzinę charakteryzuje sekwencja przyłączania lipidów, dwie domeny rozdzielone obszarem bogatym w prolinę i kilka histydynowych triad, zaangażowanych prawdopodobnie w wiązanie metalu lub nukleozydów, lub w aktywność enzymatyczną, (3-5) obszary typu „coiled-coil, konserwowany koniec N i heterologiczny koniec C. Jest obecna we wszystkich szczepach badanych pneumokoków. Homologiczne białka znaleziono także w innych paciorkowcach i Neiseria. Korzystni przedstawiciele rodziny obejmują PhtA, PhtB i PhtD. Bardziej korzystnie obejmują PhtA lub PhtD. Jest zrozumiałe, jednak, że terminy Pht A, B, D i E dotyczą białek posiadających sekwencje ujawnione w pracach cy4

PL 209 247 B1 towanych poniżej, jak również ich naturalnie występujących (i wytworzonych przez człowieka) wariantów, które posiadają sekwencję homologiczną w co najmniej 90% identyczną z białkami odniesienia. Korzystnie jest ona w 95% identyczna i bardziej korzystnie w 97% identyczna.

Odnośnie białek PhtX, PhtA jest ujawnione w WO 98/18930 i określane także jako Sp36. Jak zauważono powyżej, jest to białko z rodziny białek z triadą polihistydynową i posiada motyw sekwencji sygnałowej typu II LXXC.

PhtD jest ujawnione w WO 00/37105 i określane także jako Sp036D. Jak zauważono powyżej, jest to także białko z rodziny białek z triadą polihistydynową i posiada motyw sekwencji sygnałowej typu II LXXC.

PhtB jest ujawnione w WO 00/37105 i określane także jako Sp036B. Innym członkiem rodziny PhtB jest Polipeptyd Degradujący C3 ujawniony w WO 00/17370. Białko to także pochodzi z rodziny białek z triadą polihistydynową i posiada motyw sekwencji sygnałowej typu II LXXC. Korzystnym immunologicznie funkcjonalnym odpowiednikiem jest białko Sp42 ujawnione w WO 98/18930. Ucięte Pht (około 79 kD) jest ujawnione w WO 99/15675, rozpatrywane także jako przedstawiciel rodziny PhtX.

PthE jest ujawnione w WO 00/30299 i określane jako BVH-3.

Biorąc pod uwagę rodzinę białka wiążącego cholinę, przedstawiciele tej rodziny zostali pierwotnie zidentyfikowani jako białka pneumokokowe, które można oczyszczać przez chromatografię powinowactwa do choliny. Wszystkie białka wiążące cholinę są niekowalencyjnie związane z cząstkami fosforylocholiny kwasu teichowego ze ściany komórkowej oraz z kwasem lipoteichowym związanym z bł onami. Strukturalnie posiadają one kilka wspólnych obszarów w cał ej rodzinie, chociaż wł aś ciwa natura białek (sekwencja aminokwasowa, długość itp.) może być różna. Zasadniczo, białka wiążące cholinę obejmują obszar na końcu N (N), obszary konserwowanych powtórzeń (R1 i/lub R2), obszar bogaty w prolinę (P) oraz konserwowany region wiążący cholinę (C) zbudowany z wielu powtórzeń, które obejmują średnio połowę białka. Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin „rodzina białka wiążącego cholinę (Cbp)” dotyczy grupy składającej się z białek wiążących cholinę, jak określono w WO 97/41151, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD i CbpG. CbpA jest ujawnione w WO 97/41151. CbpD i CbpG są ujawnione w WO 00/29434. PspC jest ujawnione w WO 97/09994. PbcA jest ujawnione w WO 98/21337. SpsA jest biał kiem wiążącym cholinę ujawnionym w WO 98/39450.

Korzystnie białka wiążące cholinę są wybrane z grupy składającej się z CbpA, PbcA, SpsA i PspC.

CbpX może być skrócone, przy czym „CbpX określono powyżej, a „skrócone odnosi się do białek CbpX, które straciły 50% lub więcej obszaru wiążącego cholinę (C). Korzystnie w białkach takich brakuje całego obszaru wiążącego cholinę. Bardziej korzystnie takie skrócone białka straciły (i) obszar wiążący cholinę i (ii) także fragment połowy N terminalnej białka, przy czym pozostał co najmniej jeden powtórzony obszar (R1 lub R2). Jeszcze bardziej korzystnie skrócone białko posiada 2 powtórzone obszary (R1 i R2). Przyk ł adami takich korzystnych wykona ń są NR1xR2 i R1xR2 jak zilustrowano w WO 99/51266 lub WO 99/51188, chociaż inne białka wiążące cholinę, które straciły podobny obszar wiążący cholinę, mogą również być rozważane.

Rodzinę białek LytX stanowią białka związane z błonami związane z lizą komórek. Domena na N-końcu obejmuje domenę (domeny) wiążącą cholinę, chociaż rodzina LytX nie posiada wszystkich cech charakterystycznych dla rodziny CbpA, rodziny wspomnianej powyżej, i zatem rodzina LytX jest rozpatrywana jako różna od rodziny CbpX. Dla kontrastu z rodziną CbpX, domena z C-końca zawiera katalityczną domenę rodziny białek LytX. Rodzina obejmuje LytA, B i C. Odnośnie rodziny LytX, LytA jest ujawnione przez Ronda i wsp. Eur J Biochem, 164:621-624 (1987). LytB jest ujawnione w WO 98/18930 i jest także określane jako Sp46. LytC jest także ujawnione w WO 98/18930 i jest także określane jako Sp91. Korzystnym przedstawicielem rodziny jest LytC.

Białka rodziny LytX mogą być skrócone, przy czym ,,LytX” jest określone powyżej, a „białka skrócone odnoszą się do białek LytX, które straciły 50% lub więcej obszaru wiążącego cholinę. Korzystnie białka takie straciły cały obszar wiążący cholinę. Przykład takich skróconych białek można znaleźć w Przykładach niniejszego opisu.

Białka mogą być białkami chimerowymi (lub fuzjami) skrócone CbpX - skrócone LytX. Korzystnie obejmują one NR1xR2 (lub R1xR2) z CbpX i fragment C-końca (Cterm, tzn. który stracił domeny wiążące cholinę) z LytX (np. LytCterm lub Sp91 Cterm). Bardziej korzystnie CbpX jest wybrany z grupy złożonej z CbpA, PbcA, SpsA i PspC. Jeszcze bardziej korzystnie jest to CbpA. Korzystnie LytX stanowi LytC (określany również jako Sp91).

PL 209 247 B1

Białkami mogą być skrócone białka PspA lub PsaA, które straciły domenę wiążącą cholinę (C) i są wyrażane jako fuzja białkowa z LytX. Korzystnie LytX jest LytC.

Pneumolizyna jest wielofunkcyjną toksyną z różnymi aktywnościami, cytolityczną (hemolityczną) i aktywacji dopeł niacza (Rubins i wsp. Am. Respi. Cit Care Med., 153: 1339-1346 (1996)). Toksyna nie jest wydzielana przez pneumokoki, ale jest uwalniana przy lizie pneumokoków pod wpływem autolizyny. Jej działania obejmują np. pobudzanie wytwarzania cytokin zapalnych przez ludzkie monocyty, hamowanie ruchu rzęsek na ludzkim nabłonku dróg oddechowych oraz obniżanie aktywności bakteriobójczej i ruchu neutrofili. Najbardziej oczywistym skutkiem działania pneumolizyny jest udział w lizie krwinek czerwonych, który wymaga wiązania się cholesterolu. Ponieważ jest to toksyna istnieje potrzeba jej detoksykacji (np. nie jest toksyczna dla ludzi, gdy jest dostarczana w dawkowaniu odpowiednim dla ochrony) zanim będzie podawana in vivo. Ekspresja i klonowanie pneumolizyny dzikiego typu lub natywnej jest znane w technice. Zobacz na przykład, Walker i wsp. (Infect Immun, 55:1184-1189 (1987)), Mitchell i wsp. (Biochim Biophys Acta, 1007: 67-72 (1989) i Mitchell i wsp. (NAR, 18: 4010 (1990)). Detoksykację ply można prowadzić środkami chemicznymi np. poddawać działaniu formaliny lub glutaraldehydu lub kombinacji obu. Takie sposoby dla różnych toksyn są dobrze znane specjalistom. Alternatywnie, Ply można detoksykować genetycznie. Tak więc wynalazek obejmuje pochodne białek pneumokokowych, które na przykład mogą być zmutowanymi białkami. Określenie „zmutowane jest użyte tutaj w znaczeniu cząsteczki, która podlega delecji, addycji lub podstawieniu jednego lub większej liczby aminokwasów, przy użyciu dobrze znanych technik mutagenezy ukierunkowanej lub każdego innego klasycznego sposobu. Na przykład, jak opisano powyżej, mutant białka Ply może być tak zmieniony, że jest biologicznie nieaktywny, podczas gdy stale zachowuje swoje immunogenne epitopy, zobacz na przykład WO 90/06951, Berry i wsp. (Infect Immun, 67:981-985 (1999)) i WO 99/03884.

Użyte tutaj określenie „Ply jest rozumiane w odniesieniu do zmutowanej lub detoksykowanej pneumolizyny, odpowiedniej dla zastosowania medycznego (tzn. nie toksycznej).

W odniesieniu do PsaA i PspA, oba białka są znane w technice. Na przykład PsaA i jego transbłonowe warianty z delecjami były opisane przez Berry i Paton, Infect Immun 1996 Grudzień; 64(12): 5255-62. PspA i jego warianty z delecjami transbłonowymi zostały ujawnione na przykład w patencie USA 5804193, WO 92/14488 i WO 99/53940.

Sp128 i Sp130 są ujawnione w WO 00/76540.

Sp125 jest przykładem pneumokokowego białka powierzchniowego z motywem LPXTG kotwiczącym w ścianie komórkowej (gdzie X jest dowolnym aminokwasem). Dowolne białko w tej klasie pneumokokowych białek powierzchniowych z takim motywem uważane jest za przydatne w kontekście niniejszego wynalazku. Samo białko Sp125 jest ujawnione w WO 98/18930 i jest także znane jako ZmpB-metaloproteinaza cynkowa.

Sp101 jest ujawnione w WO 98/06734 (gdzie posiada nr odniesienia y85993) i charakteryzuje się sekwencją sygnałową typu I.

Sp133 jest ujawnione w WO 98/06734 (gdzie posiada nr odniesienia y85992) i charakteryzuje się sekwencją sygnałową typu I.

Białka mogą być również korzystnie łączone. Korzystne kombinacje zawierają, ale nie wyłącznie PhtD + NR1xR2, PhtD + NR1xR2-Sp91Cterm chimerowe lub fuzje białkowe, PhtD + Ply, PhtD + Sp128, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NR1xR2, PhtA + NR1xR2-Sp91Cterm chimerowe lub fuzje białkowe, PhtA + Ply, PhtA + Sp128, PhtA + PsaA, PhtA + PspA, NR1xR2 + LytC, NR1xR2 + PspA, NR1xR2 + PsaA, NR1xR2 + Sp128, R1xR2 + LytC, R1xR2 + PspA, R1xR2 + PsaA, R1xR2 + Sp128, R1xR2 + PhtD, R1xR2 + PhtA. Korzystnie NR1xR2 (lub R1xR2) jest z CbpA lub PspC, bardziej korzystnie z CbpA.

Korzystna kombinacja białek pneumokokowych według wynalazku obejmuje Ply (lub jej skrócony czy immunologicznie funkcjonalny odpowiednik) + PhtD (lub jego skrócony lub immunologicznie funkcjonalny odpowiednik) + NR1xR2 (lub R1xR2). Korzystnie NR1xR2 (lub R1xR2) jest z CbpA lub PspC, bardziej korzystnie jest z CbpA.

Niniejszy wynalazek do białek stosowanych w rozwiązaniach według wynalazku zalicza również „immunologicznie funkcjonalny odpowiednik/odpowiedniki. „Immunologicznie funkcjonalny odpowiednik jest definiowany jako peptyd lub białko obejmujące co najmniej jeden epitop ochronny z białek według wynalazku. Epitopy te są charakterystycznie prezentowane na powierzchni, wysoce konserwowane i mogą wywoływać u gospodarza bakteriobójczą odpowiedź związaną z przeciwciałami lub chronić go przed toksycznymi działaniami. Korzystnie, funkcjonalny odpowiednik ma co najmniej 15,

PL 209 247 B1 a bardziej korzystnie 30 lub większą liczbę cią głych aminokwasów z białka i moż e być wykorzystany pod warunkiem, że jest zdolny do wzbudzenia zasadniczo takiej samej odpowiedzi odpornościowej jak białko natywne. Pozycję potencjalnych epitopów komórek B w sekwencji białka można z łatwością ustalić poprzez identyfikację peptydów, które są jednocześnie prezentowane na powierzchni i antygenowe, wykorzystując kombinację dwóch metod: przewidywanie struktury 2D i przewidywanie wykładnika antygenowego. Przewidywanie struktury 2D można wykonać przy użyciu programu PSIPRED (od David Jones, Brunel Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences. Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, Wielka Brytania). Wykładnik antygenowy można obliczyć w oparciu o metodę Jameson i Wolf (CABIOS 4:181-186 [1988]).

Niniejszy wynalazek posiada przewagę nad polisacharydowymi szczepionkami wobec S. pneumoniae, ponieważ wielorakie kompozycje białkowe (immunogenne) S. pneumoniae mogą nadawać większą krzyżową ochronę mimo licznych serotypów, mogą bardziej hamować przyleganie i tworzenie kolonii oraz mogą potencjalnie wpływać na produkcję przeciwciał, które mogą neutralizować toksyczne/enzymatyczne czynności patogenu. Ponadto dodatkowe antygeny powierzchniowe wpływają na dalszą stymulację opsonofagocytozy.

Niniejszy wynalazek rozważa również kombinację szczepionek, które chronią przeciw różnym patogenom. Wiele pediatrycznych szczepionek jest obecnie dostępnych jako szczepionki kombinowane, aby w ten sposób ograniczyć liczbę iniekcji, które dzieci muszą otrzymać. Zatem w pediatrycznych szczepionkach inne antygeny z innych patogenów mogą być formułowane ze szczepionkami według wynalazku. Na przykład szczepionki według wynalazku mogą być przygotowane z (lub podawane osobno, ale w tym samym czasie) dobrze znaną triwalentną kombinowaną szczepionką obejmującą toksoid błoniczy (DT), toksoid tężcowy (TT) i komponenty krztuścowe [typowo pozbawiony toksyczności toksoid krztuścowy (PT) i włóknista hemaglutynina (FHA) z dowolną pertaktyną (PRN) i/lub aglutyniną 1+2], na przykład handlowa szczepionka INFANRX-DTPa™ (SmithKlineBeecham Biologicals), zawierająca antygeny DT, TT, PT, FHA i PRN, lub ze składnikami całej komórki krztuścowej, na przykład handlowy Tritarix firmy SmithKlineBeecham Biologicals. Kombinowana szczepionka może również obejmować inny antygen, taki jak powierzchniowy antygen wirusa zapalenia wątroby typu B (HbsAg), antygeny wirusa Polio, antygeny (na przykład inaktywowany triwalentny wirus Polio - IPV), białka błony zewnętrznej Moraxella catarrhalis, białka nietypowalnych H. influenzae, białka błony zewnętrznej N. meningitidis B.

Przykłady korzystnych antygenów białkowych Moraxella catarrhalis, które mogą być zawarte w kombinowanej szczepionce (zwłaszcza w zapobieganiu zapaleniu ucha ś rodkowego) to: OMP106 [WO 97/41731 (Antex) i WO 96/34960 (PMC)];OMP21; LbpA i/lub LbpB [WO 98/55606 (PMCP]; TbpA i/lub TbpB [WO 97/13785 i WO 97/32980 (PMC)]; CopB (Helminen ME i wsp. (1993) Infect. Immun. 61: 2003-2010]; UspA1 i/lub UspA2 [WO 93/03761 (University of Texas)]; OmpCD; HasR (PCT/EP99/03824; PilQ (PCT/EP99/03823); OMP85 (PCT/EP00/01468); lipo06 (GB 9917977.2); lipo10 (GB 9918208.1); lipo11 (GB 9918302.2); lipo18 (GB 9918038.2); P6 (PCT/EP99/03038); D15 (PCT/EP99/03822); Omp1A1 (PCT/EP99/06781); Hly3 (PCT/EP99/03257) i OmpE. Przykłady antygenów nietypowalnych Haemophilus influenzae, które mogą być zawarte w kombinacji szczepionki (zwłaszcza w zapobieganiu zapaleniu ucha środkowego) obejmują: białko fimbrynowe [(US 5766608 Ohio State Research Foundation)] i fuzje obejmujące jego peptydy [na przykład fuzje peptydu LB1(f); US 5843464 (OSU) lub WO 99/64067]: OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [EP 281673 (State University of New York)]; TbpA i/lub TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmw1; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12641); białko D (EP 594610); P2 i P5 (WO 94/26304).

W innym wykonaniu, róż ne antygeny przytoczone powyż ej mogą być zawarte w immunogennej kompozycji według wynalazku jako antygeny występujące na powierzchni pęcherzyków (bąbelków, ang. bleb) błony zewnętrznej bakterii, od których pochodzą.

Inne rozważane kombinacje to pneumokokowe białko według wynalazku w kombinacji z antygenami wirusowymi, na przykład z wirusem grypy (atenuowanym, rozszczepionym lub podzielonym na jednostki [na przykład powierzchniowe glikoproteiny neuraminidaza (NA) i hemaglutynina (HA). Zobacz na przykład Chaloupka I. i wsp., Eur, Journal Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1996, 15: 121-127], RSV (np. antygeny F i Glub fuzje F/G, zobacz np. Schmidt A. C. i wsp., J Virol, Maj 2001, str. 4594-4603), PIV3 (np. białka HN i F, zobacz powyżej Schmidt i wsp.), Varicella (np. atenuowana, glikoproteiny I-V, itd.) oraz każdy (lub wszystkie) komponent/y MMR (odra, świnka, różyczka).

PL 209 247 B1

Polisacharydowe antygeny według wynalazku

Możliwa jest również kombinacja szczepionek z 2 lub większą liczbą białek S. pneumoniae w kombinacji z polisacharydami innymi niż te z S. pneumoniae. Takie polisacharydy mogą być izolowane na przykład z H. influenzae, H. influenzae typu B (Hib), grup A, C, W, Y N. meningitidis, paciorkowców innych niż S. pneumoniae (np. paciorkowce grupy B, S. pyogenes, itd.), z gronkowców (np. S. aureus, S. epidermidis), E. coli, Enterococcus (np. E. faecalis i E. faecium), itd. Korzystnie polisacharydy pochodzą od H. influenzae typu B (Hib) i/lub N. meningitidis grup A, C, W135 i/lub Y.

Jak wspomniano powyżej, problemem związanym z polisacharydowym podejściem do szczepionki jest fakt, że polisacharydy są per se słabymi immunogenami. Aby ominąć ten problem, polisacharydy mogą być koniugowane z białkami nośnikowymi, które pomagają biernym komórkom T. Korzystne jest zatem, aby wykorzystywane polisacharydy były połączone z takimi białkami nośnikowymi. Przykłady takich nośników stosowanych obecnie powszechnie do wytwarzania immunogenów polisacharydowych obejmują toksoidy błoniczy i tężcowy (odpowiednio DT, DT CRM197, inne mutanty DT np. w pozycji Glu-148, itd. [zobacz np. US 4,709,017, WO 93/25210, WO 95/33481, itd.] i TT (i fragment C TT)) hemocjaninę skałoczepu (KLH), OMPC z N. meningitidis oraz oczyszczoną białkową pochodną tuberkuliny (PPD).

Innym nośnikiem dla kompozycji immunogennych (lub szczepionek) jest białko D z Haemophilus influenzae (EP 594610-B) lub jego fragmenty. Fragmenty odpowiednie do stosowania obejmują epitopy komórek T pomocniczych. W szczególności fragment białka D korzystnie będzie zawierał 1/3 N-końca z białka.

Polisacharydy można wiązać z białkiem nośnikowym znaną metodą (przykładowo, podaną przez Likhite, w patencie USA nr 4372945 i Armor i wsp., w patencie USA 4474757). Korzystnie, przeprowadzana jest koniugacja CDAP (WO 95/08348). Aby podwyższyć immunogenność, polisacharydy można sortować (depolimeryzować), łączyć z adiutantem, liofilizować lub koniugować z różnymi białkami nośnikowymi.

Adiuwanty TH1

Szczepionki według niniejszego wynalazku są korzystnie łączone z adiuwantem.

Stosowne adiuwanty obejmują sole glinu, takie jak żel wodorotlenku glinu (alum) lub fosforan glinu, lecz także sole wapnia, magnezu, żelaza lub cynku lub mogą być to nierozpuszczalne zawiesiny acylowanej tyrozyny lub acylowanych cukrów, kationowo lub anionowo derywatyzowane polisacharydy lub polifosfazeny.

Korzystnie adiuwant jest wybrany jako uprzywilejowany induktor odpowiedzi typu TH1. Wysokie poziomy cytokin typu Th1 przyczyniają się do indukcji komórkowej odpowiedzi odpornościowej na dany antygen, podczas gdy wysokie poziomy cytokin typu Th2 przyczyniają się do indukcji humoralnej odpowiedzi odpornościowej na dany antygen.

Ważne jest, aby pamiętać, że rozróżnienie odpowiedzi odpornościowej Th1 i Th2 nie jest całkowite. W rzeczywistości osobnik będzie utrzymywał odpowiedź odpornościową, która jest opisana jako głównie Th1 lub głównie Th2. Chociaż, często wygodnie jest rozpatrywać rodziny cytokin w znaczeniu opisanym dla mysich klonów komórek T CD4 +ve przez Mosmann i Coffman (Mosmann, T.R. i Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Revievw of Immunology, 7, str. 145-173). Tradycyjnie, odpowiedzi typu

Th1 są związane z wytwarzaniem przez limfocyty T INF-γ i cytokin IL-2. Inne cytokiny, takie jak IL-12, często bezpośrednio związane z indukcją odpowiedzi odpornościowych typu Th1 nie są wytwarzane przez komórki T. Dla kontrastu odpowiedzi typu Th2 są związane z wydzielaniem IL-4, IL-5, IL-6, IL-10. Odpowiednie układy adiuwanta, które pobudzają głównie odpowiedź Th1 obejmują: monofosforylolipid A lub jego pochodną, w szczególności 3-de-O-acylowany monofosforylolipid A (3D-MPL) (jego wytwarzanie, patrz GB 2220211 A) oraz kombinację monofosforylolipidu A, w szczególności 3-de-O-acylowanego monofosforylolipidu A wraz z solą glinu (przykładowo fosforanu glinu lub wodorotlenku glinu) lub emulsją olej w wodzie. W takich kombinacjach, antygen i 3D-MPL znajdują się w tych samych określonych strukturach, co pozwala na skuteczniejsze dostarczanie sygnałów antygenowych i immunostymulujących. Badania wykazały, że 3D-MPL jest dodatkowo zdolny do wzmacniania immunogenności antygenu zaadsorbowanego na alumie [Thoelen i wsp. Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454-B1].

Układ wzmacniający wymaga kombinacji monofosforylolipidu A i pochodnej saponinowej, w szczególności kombinacji QS21 i 3D-MPL jak ujawniono w WO 94/00153 lub kompozycji mniej reaktywnej, przy czym QS21 jest wyciszany cholesterolem, jak ujawniono w WO 96/33739.

PL 209 247 B1

Szczególnie silny preparat adiuwanta obejmujący QS21, 3D-MPL i tokoferolu w emulsji olej w wodzie opisano w WO 95/17210 i jest on korzystnym preparatem.

Korzystnie szczepionka dodatkowo obejmuje saponinę, bardziej korzystnie QS21. Preparat może także obejmować emulsję olej w wodzie i tokoferol (WO 95/17210).

Niniejszy wynalazek dostarcza także sposobu wytwarzania preparatu szczepionki obejmującego mieszanie białka według niniejszego wynalazku z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką, taką jak 3D-MPL.

Korzystnymi induktorami odpowiedzi TH1 są także oligonukleotydy zawierające niemetylowane CpG (WO 96/02555) i są odpowiednie do stosowania w niniejszym wynalazku.

W dalszym aspekcie niniejszego wynalazku dostarczana jest szczepionka jak tu opisano do stosowania w medycynie. Niniejszym opisano sposób zapobiegania lub łagodzenia objawów zapalenia płuc u ludzi w podeszłym wieku, obejmujący podawanie bezpiecznej i skutecznej ilości szczepionki według wynalazku i dowolnego adiuwanta Th1, wyżej wymienionym pacjentom w podeszłym wieku, oraz sposób zapobiegania i łagodzenia objawów zapalenia ucha środkowego u niemowląt (do 24 miesiąca życia) lub dzieci młodszych (typowo od 24 miesięcy do 5 lat), obejmujący podawanie bezpiecznej i skutecznej ilości szczepionki obejmującej białka Streptococcus pneumoniae według wynalazku i dowolnego adiuwanta Th1, tym niemowl ę tom i dzieciom m ł odszym.

Preparaty szczepionki

Preparaty szczepionki według niniejszego wynalazku mogą być stosowane do ochrony lub leczenia ssaków (korzystnie ludzi) podatnych na zakażenie, za pomocą podawania wyżej opisanej szczepionki drogą układową lub śluzówkową. Podawanie takie może obejmować iniekcje drogą domięśniową, dootrzewnową, śródskórną lub podskórną; lub podawanie na śluzówki jamy ustnej/przewodu pokarmowego oraz układu oddechowego i moczowo-płciowego. Donosowe podawanie szczepionek w leczeniu zapalenia płuc lub zapaleniu ucha środkowego jest bardziej korzystne (ponieważ zapobieganie nosogardłowemu nosicielstwu pneumokoków może być bardziej efektywne, osłabiając w ten sposób zakażenie na jego najwcześniejszym etapie). Chociaż szczepionka według wynalazku może być podawana w jednej dawce, jej składniki mogą również być podawane razem w tym samym czasie lub w różnym czasie (na przykład polisacharydy pneumokokowe mogą być podawane osobno w tym samym czasie lub 1-2 tygodnie po podaniu białka bakteryjnego, będącego składnikiem szczepionki dla optymalnej koordynacji odpowiedzi odpornościowych, odnoszącej się do każdego z nich). Oprócz pojedynczej drogi podania, mogą być wykorzystywane 2 różne drogi podania. Na przykład każdy z wirusowych antygenów może być podawany ID (śródskórnie), podczas gdy białka bakteryjne mogą być podawane IM (domięśniowo) lub IN (donosowo). Jeśli polisacharydy są obecne, można je podawać IM (lub ID), a białka bakteryjne mogą być podawane IN (lub ID). Dodatkowo, szczepionki według wynalazku mogą być podawane IM w pierwszych dawkach i IN w dawkach przypominających.

Ilość koniugowanego antygenu w każdej dawce szczepionki jest wybierana na podstawie ilości indukującej odpowiedź immunoochronną bez znaczących objawów niepożądanych w typowych szczepionkach. Taka ilość jest różna zależnie od swoistego immunogenu, który jest użyty i od sposobu, w jaki jest on prezentowany. Zawartość antygenów białkowych w szczepionce będzie typowo w zakresie 1-100 μg, korzystnie 5-50 μg, najbardziej typowo 5-25 μg. Jeśli polisacharydy są włączone, ogólnie oczekuje się, że każda dawka będzie zawierać 0,1-100 μg polisacharydu, korzystnie 0,1-50 μg, korzystniej 0,1-10 μg, z czego 1-5 μg jest najbardziej korzystnym zakresem.

Optymalna ilość składników dla danej szczepionki może być sprawdzona w standardowych badaniach związanych z obserwacjami odpowiednich odpowiedzi odpornościowych u badanych osobników. Po początkowym szczepieniu osobniki mogą otrzymać jedną lub kilka przypominających szczepień, odpowiednio rozłożonych w czasie. Typowo szczepionka będzie obejmować antygen (białka), adiuwant i zaróbki lub farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Wytwarzanie szczepionki jest ogólnie opisane w Vaccine Design („The subunit and adjuvant approach (wyd. Powell M.F. & Newmann M.J.) (1995) Plenum Press New York). Zamykanie wewnątrz liposomów jest opisane przez Fullertona, patent USA 4235877.

Chociaż szczepionki według niniejszego wynalazku mogą być podawane każdą drogą, śródskórne (ID) podawanie opisanych szczepionek stanowi jedno z wykonań według niniejszego wynalazku. Skóra ludzka obejmuje zewnętrzny rogowy naskórek, nazywany warstwą rogową naskórka, która przykrywa naskórek. Pod tym naskórkiem jest warstwa nazywana skórą właściwą, która przykrywa z kolei tkanki podskórne. Naukowcy wykazali, że taka śródskórna iniekcja szczepionki, zwłaszcza

PL 209 247 B1 w warstwę skóry właściwej, pobudza odpowiedź odpornościową, która również może być związana z licznymi dodatkowymi korzyś ciami. Szczepienie śródskórne opisanymi tutaj szczepionkami stanowi korzystną cechę niniejszego wynalazku.

Konwencjonalna technika iniekcji śródskórnej, „procedura mantoux, obejmuje etapy czyszczenia skóry, następnie naciągania jej jedną ręką i umieszczania końca wąskiej igły (rozmiar 26-31) zwróconej do góry pod kątem 10-15°. Kiedy skos igły zostaje umieszczony, światło igły jest opuszczane i dalej wysuwane naprzód podczas gdy dostarczany lekki nacisk podnosi ją ponad skórę . Pł yn jest następnie wstrzykiwany bardzo powoli i w ten sposób tworzy pęcherzyk lub wypukłość na powierzchni skóry, następnie powoli wycofuje się igłę.

Ostatnio zostały opisane przyrządy, które są zaprojektowane specyficznie do podawania środków płynnych do lub przez skórę, na przykład przyrządy opisane w WO 99/34850 i EP 1092444, również przyrządy wstrzykujące opisane na przykład w WO 01/13977; patent USA 5480381, patent USA 5599302, patent USA 5334144, patent USA 5993412, patent USA 5649912, patent USA 5569189, patent USA 5704911, patent USA 5383851, patent USA 5893397, patent USA 5466220, patent USA 5339163, patent USA 5312335, patent USA 5503627, patent USA 5064413, patent USA 5520,639, patent USA 4596556, patent USA 4790824, patent USA 4941880, patent USA 4940460, WO 97/37705 i WO 97/13537. Alternatywne metody podawania śródskórnego preparatów szczepionki mogą obejmować konwencjonalne strzykawki i igły lub przyrządy zaprojektowane do balistycznego dostarczania stałych szczepionek (WO 99/27961), lub plastry przezskórne (WO 97/48440; WO 98/28037); lub stosowane na powierzchni skóry (śródskórne lub przezskórne podawanie WO 98/20734; WO 98/28037).

Gdy szczepionki według niniejszego wynalazku są podawane doskórnie lub bardziej specyficznie do warstwy skóry właściwej, szczepionka znajduje się w małej objętości płynu, pomiędzy około 0,05 ml i 0,2 ml.

Zawartość antygenów w skórnych lub śródskórnych szczepionkach według niniejszego wynalazku może być podobna do konwencjonalnych dawek ustalonych dla domięśniowych szczepionek.

Zatem antygeny białkowe obecne w szczepionkach śródskórnych mogą być w zakresie 1-100 μg, korzystniej 5-50 μg. Ponadto jeśli jest obecny koniugowany antygen polisacharydowy, jego ilość w każdej dawce szczepionki, powinna obejmować generalnie 0,1-100 μg polisacharydu, korzystnie 0,1-50 μg, korzystniej 0,1-10 μg i może zawierać się pomiędzy 1 i 5 μg. Jednakże cechą szczepionek skórnych lub śródskórnych, jest to że mogą być wytwarzane „w niskiej dawce. Zatem antygeny białkowe w szczepionkach „o niskiej dawce są korzystnie obecne w tak małej ilości jak 0,1 do 10 μg, korzystnie 0,1 do 5 μg na dawkę, a koniugowane antygeny polisacharydowe, jeśli są obecne, mogą mieścić się w zakresie 0,01-1 μg, korzystniej pomiędzy 0,01 a 0,5 μg polisacharydu na dawkę.

Użyty tu termin „śródskórne podawanie oznacza podawanie szczepionki w obszar skóry właściwej. Jednakże szczepionka nie musi być koniecznie podawana wybiórczo do warstwy skóry właściwej. Skóra właściwa jest warstwą w skórze zlokalizowaną pomiędzy około 1,0 i 2,0 mm od powierzchni skóry ludzkiej, ale istnieje pewna różnorodność pomiędzy osobnikami i pomiędzy różnymi częściami ciała. Ogólnie można się spodziewać, że osiągnie się warstwę skóry właściwej na wysokości 1,5 mm poniżej powierzchni skóry. Skóra właściwa jest zlokalizowana pomiędzy warstwą rogową naskórka i naskórkiem na powierzchni a warstwą podskórną poniżej. Zależnie od sposobu podawania szczepionka może być ostatecznie umieszczona jedynie lub przede wszystkim w skórze właściwej lub może być ostatecznie dystrybuowana w naskórku i w skórze właściwej.

Szczepionka może zawierać DNA kodujący jedno lub większą liczbę białek S. pneumoniae, tak że białko jest wytwarzane in situ. DNA może być obecny w dowolnym z różnorodnych układów dostarczania, znanych specjalistom, w tym układów ekspresji kwasów nukleinowych, układów ekspresji bakteryjnych i wirusowych. Liczne techniki dostarczania genów są dobrze znane w technice, jak te opisane przez Rolland (Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, 1998) i w cytowanym tam piśmiennictwie. Odpowiednie układy ekspresji kwasu nukleinowego zawierają konieczne do ekspresji u pacjenta sekwencje DNA (takie jak odpowiedni promotor i sygnał końcowy). Kiedy układ ekspresji jest zrekombinowanym żywym organizmem, takim jak wirus lub bakteria, gen będący przedmiotem zainteresowania może być wstawiony do genomu żywego zrekombinowanego wirusa lub bakterii. Inokulacja i zakażenie in vivo takim żywym wektorem prowadzi do ekspresji antygenu in vivo i indukcji odpowiedzi odpornościowych. Wirusy i bakterie wykorzystywane w tym celu to przykładowo: wirusy ospy (np. wirusy krowianki, ospy drobiu, ospy kanarków), alfawirusy (wirus Sindbis, Semliki Forest, wenezuelskiego końskiego zapalenia mózgu (ang. Venezuelian Equine Encephalitis)), adenowirusy,

PL 209 247 B1 wirusy towarzyszące adenowirusom, picornawirusy (wirus polio, rhino), wirusy opryszczki (wirus Varicella zoster itd.), Listeria, Salmonella, Shigella, Neisseria, BCG. Te wirusy i bakterie mogą być zjadliwe lub atenuowane różnymi sposobami w celu uzyskania żywych szczepionek.

W kolejnym aspekcie niniejszego wynalazku dostarczany jest sposób wytwarzania preparatu szczepionki jak tu opisano, który sposób obejmuje mieszanie kombinacji białek według wynalazku.

Korzystnie kompozycje antygenowe (i szczepionki), które zawierają polisacharydy opisane tutaj wcześniej, są w postaci liofilizowanej do czasu, w którym będą użyte, kiedy to są na poczekaniu odtwarzane w rozpuszczalniku. Bardziej korzystnie są one liofilizowane w obecności 3D-MPL i są na poczekaniu odtwarzane w roztworze soli fizjologicznej.

Liofilizacja szczepionek jest dobrze znana w dziedzinie. Typowo ciekła szczepionka jest osuszana w formie zamrożonej w obecności czynników zapobiegających zbrylaniu na przykład cukrów, takich jak sacharoza lub laktoza (obecne w początkowym stężeniu 10-200 mg/ml). Typowo liofilizacja składa się z serii etapów, na przykład cykl rozpoczyna się w 69°C, stopniowo temperatura jest obniżana do -24°C w ciągu 3 godzin, następnie utrzymywana przez 18 godzin, następnie stopniowo podwyższana do -16°C w ciągu 1 godziny, następnie temperatura ta jest utrzymywana przez 6 godzin, następnie stopniowo podwyższana do +34°C w ciągu 3 godzin i ostatecznie utrzymywana przez 9 godzin.

Kompozycje immunogenne i szczepionki według wynalazku mogą być oceniane na wielu modelach zwierzęcych lub z ludzką surowicą. Następujące modele zwierzęce, jako ilustracja, mogą być wykorzystane do oceny zakażenia pneumokokowego. Mysz C3H/HeJ (w wieku 6-8 tygodni) może być immunizowana s.c. 15 μg białka z adiuwantem i z 50 μΐ CFA, następnie 3-4 tygodnie później dostaje dawkę przypominającą, 15 μg białka z IFA. Dla pokazania biernej i czynnej ochrony przed zakażeniem układowym, surowica odpornościowa lub białka są podawane myszy dootrzewnowo przed prowokacją iniekcją dootrzewnową z 15 do 90 LD50 dla pneumokoków w 8-10 tygodniu. Dodatkowo białka mogą być badane w nosogardzieli myszy, na modelu kolonizacji (Wu i wsp., Microbial Pathogenesis 1997; 23:127-137).

Dodatkowo oprócz myszy, na kolonizację i zakażenie wywoływane przez S. pneumoniae są wrażliwe szczurze niemowlęta. W badaniach nad bierną ochroną, podanie szczurzym niemowlętom w wieku 2-5 dni, mysiej surowicy odpornościowej (100 μl i.p. lub 10 μg i.n.) można wykonać przed prowokacją z donosowym podaniem S. pneumoniae (10 gl). Kolonizacja może być określona poprzez posiew popłuczyn z nosa (zakrapiano 20-40 gl, pobierano 10 gl).

Korzystne oddziaływania pomiędzy komponentami białkowymi kombinacji szczepionki mogą być demonstrowane przez podawanie dawki każdego białka w szczepionce, która w monowalentnej szczepionce będzie podprogowa (sub-ochronna). Podwyższona skuteczność ochrony kombinacji szczepionki w porównaniu z monowalentnymi szczepionkami może być przypisywana korzystnemu współdziałaniu pomiędzy komponentami.

Niniejszy wynalazek jest ilustrowany towarzyszącymi przykładami. Przykłady są przeprowadzane przy użyciu standardowych technik, które są dobrze znane i rutynowo stosowane przez specjalistów, z wyjątkiem tych, które opisano szczegółowo. Przykłady ilustrują, ale nie ograniczają wynalazku.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1

Tworzenie i ekspresja antygenów

NR1xR2

CbpA jest powierzchniowo prezentowanym 75kDa białkiem składającym się z kilku domen. Domena N-końca obejmuje 2 wysoce konserwowane powtórzenia (R1 i R2) a domena C-końca obejmuje 10 tandemowych, bezpośrednio powtórzonych sekwencji 20 aminokwasów. Przygotowano skrócone CbpA do wytwarzania NR1XR2, tj. białka bez domeny wiążącej cholinę.

Gen NR1XR2 amplifikowano, przez PCR, na matrycy DNA uzyskanego ze szczepu S. pneumoniae serotypu 4 (patrz np. WO97/41157 lub WO99/51266). PCR przeprowadzano przy użyciu zestawia Expand High Fidelity PCR System lub Hi-Fi (Roche). Składa się on z mieszaniny zawierającej polimerazę Taq oraz polimerazę o właściwościach korektorskich. Dzięki jej nieodłącznej aktywności egzonukleazy o właściwościach korektorskich 3'-5', zastosowanie Hi-Fi daje 3-krotny wzrost wierności syntezy DNA w porównaniu do polimerazy Taq.

Fragmenty PCR sklonowano w wektorze pGEM-T z zestawu pGEM-T Vector systems (Promega). Etap ten jest wymagany do ułatwienia trawienia enzymem restrykcyjnym fragmentu PCR przeznaczonego do przyszłej ligacji. Wektor pGEM-T jest dostarczany w formie liniowej i zawiera fragmenPL 209 247 B1 ty zwisające T na końcach 3'. Zwisające końce ułatwiają wprowadzanie produktów PCR, wytworzonych za pomocą termostabilnych polimeraz, które dodają pojedynczą deoksyadenozynę w sposób niezależny od matrycy na końcach 3' zamplifikowanego fragmentu.

Fragmenty i wektory oczyszczono po trawieniu enzymatycznym (trawienia Ndel i Xbal) według artykułu Benore-Parsons i wsp. (Nucleic Acids Research. 23, 4926-4927,1995). Plasterki agarozy całkowicie liofilizowano w ciągu 3-4 godzin. Do zliofilizowanego żelu dodano roztwór 1:1 etanol-TE. Próbkę mieszano delikatnie przez 1 godzinę, agarozę zgnieciono i usunięto całkowicie poprzez wirowanie. DNA odzyskiwano z roztworu wymywającego przez strącanie etanolem.

DNA kodujący NR1xR2 klonowano w wektorze obejmującym długi promotor L z faga λ. Białko będące przedmiotem zainteresowania można indukować podniesieniem temperatury, kiedy jest obecne w szczepie E. coli AR 58 lub kwasem nalidyksowym w szczepie E. coli AR 120.

Wstępną hodowlę uzyskiwano przez całonocną inkubację w 30°C. Tę wstępną hodowlę rozcieńczano około 40 razy w całkowitej objętości 20 ml i umieszczano w 30°C do uzyskania OD 0,4-0.6. Następnie przeprowadzano indukcję przez podniesienie temperatury do 42°C. Próbki pobierano w róż nych punktach czasu. Jeden ml hodowli wirowano 5 min. przy 7000 obr./min. Supernatant hodowli przechowywano w -20°C, a osad (całkowity ekstrakt) zawieszano w 500 μΐ buforu do próbek (analiza typu Western blot lub SDS-PAGE) lub w 500 μl buforu lizującego i inkubowano 30 min. w 37°C (ELISA). Skład buforu lizującego to: 0,1% SDS, 0,1% dezoksycholan, 0,015 M cytrynian sodu.

Próbki rozdzielano w SDS-PAGE. naniesione na 4-20% żel (Novex, Invitrogen). Migrację prowadzono przy 200 V. Wykonano barwienie błękitem Coomasie. W celu przeprowadzenia Western blotu, próbki nakładano na 4-20% żel (Novex, Invitrogen). Migrację prowadzono przy 200 V. Żel transferowano na nitrocelulozę, a prążki były wywoływane poliklonalnymi przeciwciałami króliczymi a-NR1XR2 (pierwsze przeciwciało) i przeciwciałem króliczym α połączonym z fosfatazą alkaliczną (drugie przeciwciało).

W analizie SDS-PAGE obserwowano prążek o wielkości około 55 kDa. Klon 28B2 wybrano na podstawie analizy SDS-PAGE i przenoszono do fermentacji. Klon ten zsekwencjonowano, a jego sekwencję potwierdzono (39 aminokwasów (tzn. po sekwencji sygnałowej) do 446=406 aminokwasów).

Badano również rozpuszczalność NR1XR2 po lizie bakterii indukowanych całą noc i następnie zwirowanych. Przeprowadzono analizę SDS-PAGE i testy ELISA. NR1XR2 występował głównie (>95%) we frakcji rozpuszczalnej.

R1xR2, PhtD, Sp91, (N)R1xR2-Sp91 [domena końca CJ i Ply.

Geny te również zostały sklonowane, zsekwencjonowane i poddane ekspresji w podobny sposób jak NR1xR2. R1xR2 zawiera aminokwasy 177 do 443 z CbpA (z S. pneumoniae serotypu 4N), PhtD zawiera 21 aminokwasów (tzn. po sekwencji sygnałowej) aż do końca (aminokwas 839

S. pneumoniae serotypu 4N), Sp91 rozpoczyna się aminokwasem 20 (VAA) do końca. Dla białek fuzyjnych, R1xR2-Sp91 Cterm obejmuje aminokwasy 177-446 z CbpA i 271 aminokwasów aż do kodonu stop translacji; NR1xR2-Sp91Cterm obejmuje aminokwasy 39-446 z CbpA i 271 aminokwasów do kodonu stop translacji. W obu fuzjach białkowych znaleziono 2 dodatkowe aminokwasy (GS) pomiędzy sekwencjami (N)R1xR2 i Sp91Cterm. Do wszystkich konstruktów wprowadzono na początku 5' genu ATG, w celu umożliwienia transkrypcji i translacji, co oznacza, że istnieje dodatkowa metionina na końcu N przed każdą wspomnianą powyżej sekwencją.

P r z y k ł a d 2

Serologia

Używając surowic z badań klinicznych, w testach ELISA mierzono odpowiedź związaną z przeciwciałami, która naturalnie rozwija się na białka S. pneumoniae.

2.1. Procedura doświadczalna

Próbki surowicy

- Pary surowic od niemowląt zbierane, kiedy były odpowiednio w wieku 2-4 miesięcy i 6-12 miesięcy (N=20, badania DTPa HBV).

- Surowice od około 20 letnich dorosłych (N=50).

- Surowice od dorosłych > 65 roku życia (N=140).

Procedury ELISA

Immuno-płytki opłaszczano 1 μg/ml każdego białka i pozostawiano na noc w 4°C. Seryjne podwójne rozcieńczenia surowic (rozpoczynając od rozcieńczenia 1/10) inkubowano następnie przez 1 godz. wytrząsając w temperaturze pokojowej (TP). Odczyt immunologiczny prowadzono wykorzystując połączone z peroksydazą anty-ludzkie monoklonalne przeciwciało IgG (Strateck, HP6043) roz12

PL 209 247 B1 cieńczone 400-krotnie i inkubowano wytrząsając przez 30 min. w TP. Po wywołaniu, średnie wartości mian obliczano za pomocą SoftMaxPro. Surowice z mianem > 10 uważano za dodatnie. W celu obliczenia średniej geometrycznej miano równe 5 (połowa wartości odcięcia) przypisywano arbitralnie surowicom ujemnym.

Stężenia IgG wyrażane w μg/ml ustalono przez porównanie gęstości optycznej (OD) próbki z krzywej OD chromatograficznie oczyszczonego IgG (Jackson), wychwyconego na płytce przez poliklonalne anty-ludzkie IgG przeciwciała kozie i wywoływano dzięki takim samym wyznakowanym peroksydazą przeciwciałom jak wyżej.

2.2. Wyniki

2.2.1.Serologia białek paciorkowcowych u niemowląt

Najwyższe miano przeciwciał i współczynniki seropozytywności mierzone w surowicach u niemowląt pomiędzy 2 a 4 miesiącem życia, otrzymywano dla PhtD, PsaA, Sp128, NR1xR2 i w mniejszym stopniu dla Sp91 i Ply. Nie wykryto odpowiedzi lub była ona bardzo słaba dla Sp101 i Sp130. Sp46 i PhtA nie były badane (problem dostępności materiału).

Odpowiedzi związane z przeciwciałami ogólnie były niższe w surowicach tych samych osób kiedy miały 6-12 miesięcy, co sugeruje, że wysokie miana były głównie związane z biernym transferem matczynych przeciwciał.

Jednakże u pewnych niemowląt odpowiedź immunologiczna na niektóre białka wzrosła wraz z wiekiem, prawdopodobnie w następstwie naturalnej ekspozycji na pneumokoki. Antygenem wyraźnie odpowiedzialnym głównie za tę serokonwersję było białko PsaA. Zależnie od osobnika przedstawiono również wzrost poziomów przeciwciał wobec PhtD, NR1xR2, Sp128, Sp91 i Ply. Obserwowano jedynie marginalne różnice w odpowiedzi humoralnej na Sp101 i Sp130. (Patrz Fig. 1 i 2)

2.2.2.Serologia białek paciorkowcowych u młodych dorosłych

Zgodnie ze średnimi geometrycznymi mian, najbardziej immunogennymi białkami w ocenianej populacji młodych dorosłych są PhtD, PhtA i NR1xR2, następnie Sp128, Ply i Sp91. Wszyscy osobnicy mieli wykrywalne poziomy przeciwciał wobec tych białek. Słabsze odpowiedzi mierzono dla Sp46, a zwłaszcza dla Sp130 i Sp101. PsaA nie było badane (zbyt mało dostępnej surowicy). (Patrz Fig. 3 i 4)

2.2.3. Serologia białek paciorkowcowych u starszych dorosłych

U starszych ludzi w porównaniu z młodymi dorosłymi występowało wyraźne obniżenie poziomu przeciwciał wobec białek paciorkowcowych. U starszych osobników najlepszym immunogenem jest PhtD, następnie Sp128, NR1xR2, Sp91, Ply i PsaA. Tylko marginalne odpowiedzi mierzono dla Sp101 i Sp130. Sp46 i PhtA nie były badane (problem dostępności materiału). (Patrz Fig. 5 i 6)

T a b e l a 1. Średnie stężenia geometryczne IgG (GMC) u starszych osób, wyrażane w ąg/ml

Białko	IgG (GMC, ąg/ml)
PhtD	19
NR1xR2	3,5
Sp91	2,5
Ply	2,3

Wszystkie publikacje, w tym lecz nie jedynie patenty i zgłoszenia patentowe, cytowane w tym opisie są tu wprowadzane na drodze odniesienia, tak jakby każda pojedyncza publikacja była specyficznie i indywidualnie wskazana do wprowadzenia na drodze odniesienia jako przytoczona w całości.

Chociaż korzystne wykonania według wynalazku są zilustrowane przez powyższe, należy rozumieć, że wynalazek nie jest ograniczany do precyzyjnych instrukcji ujawnionych tutaj i że prawo do wszystkich modyfikacji mieszczących się w zakresie podanych zastrzeżeń patentowych jest zastrzegane.

Claims (12)

1. Immunogenna kompozycja obejmująca co najmniej 2 białka S. pneumoniae, znamienna tym, że jednym z białek jest PhtD, a drugim białkiem jest pneumolizyna (Ply).

PL 209 247 B1

2. Immunogenna kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje ponadto NR1xR2 lub R1xR2 z CbpA lub PspC.

3. Immunogenna kompozycja według jednego z zastrz. 1-2, znamienna tym, ż e pneumolizyna jest detoksyfikowana chemicznie.

4. Immunogenna kompozycja według jednego z zastrz. 1-2, znamienna tym, ż e pneumolizyna jest detoksyfikowana genetycznie.

5. Immunogenna kompozycja wed ług jednego z zastrz. 1-4, znamienna tym, że dodatkowo obejmuje inny antygen wybrany z grupy składającej się z powierzchniowego antygenu wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg), antygenów wirusa Polio, białek błony zewnętrznej Moraxella catarrhalis, białek nietypowalnego Haemophilus influenzae oraz białek błony zewnętrznej N. meningitidis B.

6. Immunogenna kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, ż e dodatkowym antygenem jest białko nietypowalnego Haemophilus influenzae.

7. Immunogenna kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, ż e dodatkowym antygenem jest białko D nietypowalnego Haemophilus influenzae.

8. Immunogenna kompozycja wed ług jednego z zastrz. 1-7, znamienna tym, że dodatkowo obejmuje adiuwant.

9. Immunogenna kompozycja wedł ug zastrz. 8, znamienna tym, ż e adiuwant jest uprzywilejowanym induktorem odpowiedzi typu TH1.

10. Szczepionka, znamienna tym, że obejmuje immunogenna kompozycję określoną w jednym z zastrz. 1-9.

11. Zastosowanie szczepionki określonej w zastrz. 10 do wytwarzania leku do zapobiegania zapaleniu płuc u pacjentów powyżej 55 roku życia.

12. Zastosowanie szczepionki określonej w zastrz. 10 do wytwarzania leku do zapobiegania zapaleniu ucha środkowego u niemowląt.

11. Sposób wytwarzania szczepionki określonej w zastrz. 10, znamienny tym, że obejmuje etapy: wybierania i izolowania dwóch różnych białek S. pneumoniae oraz mieszania tych białek z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, przy czym białka te stanowią PhtD oraz pneumolizyna (Ply).