CN101678091A

CN101678091A - 冷冻干燥的抗原组合物

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Publication number: CN101678091A
Application number: CN200880017245A
Authority: CN
Inventors: D·I·勒穆瓦纳
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2007-05-24
Filing date: 2008-05-22
Publication date: 2010-03-24
Also published as: US20090035360A1; HRP20121019T1; EA018201B1; JP2010527964A; CA2687632A1; WO2008142133A1; EA200901434A1; EP2148697B1; EP2476431A1; EA201300102A1; EA201300101A1; PT2148697E; KR20110091817A; AU2008252911A1; TW200911304A; EP2148697A1; JP5331105B2; CL2008001491A1; EP2489367A1; KR20100017519A

Abstract

本发明提供了包含抗原和Toll样受体(TLR)9激动剂的冷冻干燥组合物。这种组合物可以与载体重新构建到免疫原性组合物中，用于接种，载体选自由脂质体、无机盐、乳液、聚合物和ISCOMs组成的颗粒载体。本发明提供了用本发明的冷冻干燥组合物来制备免疫原性组合物的方法，本文还提供了其在免疫中的用途。

Description

冷冻干燥的抗原组合物

技术领域

本发明涉及改进的抗原组合物和使用其制备免疫原性组合物的方法。尤其是，本发明涉及包含抗原和Toll样受体(TLR)9激动剂的冷冻干燥组合物。这种组合物可以与载体重新构建到免疫原性组合物中用于接种疫苗，载体选自由脂质体、无机盐、乳液、聚合物和ISCOMs组成的颗粒载体。用本发明的冷冻干燥组合物来制备免疫原性组合物的方法和其在免疫中的用途也是本发明的一部分。

发明背景

佐剂(adjuvant)有时用于提高对任何给定抗原产生的免疫应答。然而，在疫苗或免疫原性组合物中包含佐剂会提高组分制备的复杂性、以及提高疫苗组合物的分布和制剂的复杂性。每个佐剂组分以及抗原组分的制备必须由配方者来考虑。这是尤其真实的，因为例如佐剂组分在溶液中的pH值可能与给定抗原的最佳pH值差别很大，需要小心地控制这些差别，并且设法防止例如组分的沉淀或合乎需要的性质的丧失。抗原在注射用水中的pH值可以是例如大约pH7或稍微高一些，并且当加入佐剂时，pH值可以降到pH6.3。当在此pH值下长期保存时，抗原可能例如是不稳定的。

然后必须以尽可能稳定的形式来配制和分布组分，因为人用药物在它们被批准上市之前必须被较好地表征、必须是稳定的和安全的。为此，对最终的制剂必须进行长期稳定性研究，以保证它符合相关的标准。将在这种长期研究中产生的信息用以支持提交给管理机构，例如FDA(联邦药品管理局-在美国负责批准药物的机关)，以便证明该产品适合于人类使用。

通常使用冻干或冷冻干燥，以提高材料(包括药学材料，例如疫苗中使用的抗原)的稳定性，并由此增加保存期限。

通常，在给予患者之前不久，将冷冻干燥的抗原组合物提供给卫生保健部门，使其与稀释剂(例如注射用水[WFI]，或在有些情况下与液体佐剂制剂)进行重新构建。用这种方法，最终疫苗的各种组分维持在非常接近的时间段被减至最小。

当将抗原冷冻干燥形成冷冻(lyo)块(冷冻干燥的干燥产品)时，必须考虑许多因素。例如，在冷冻干燥形式中应该保持抗原的抗原性/免疫原性。当在冷冻干燥形式时，抗原不能团聚或降解。冷冻块必须成形良好，并且不断裂。最后，当重新组成时，当然抗原必须是能够快速溶解的形式。如果用于重新组成的溶液不是简单的WFI，例如当抗原与液体佐剂重新组成时，那么需要考虑溶液组分对重新组成产品性质的影响。

如所提到的，佐剂已经使用了多年，用于提高对疫苗的抗原成分的免疫应答。尤其有效的佐剂组合是包含3脱酰-单磷酰脂质A(3D-MPL)和皂草苷的佐剂组合(尤其是QS21，从皂树的树皮提取的皂角苷纯化馏份)。可以以水包油乳化液、脂质体制剂等等形式提供这种组合物。

在先前对抗原的临床试验中，例如对疟疾抗原例如RTS，S的试验，提供了冷冻干燥抗原，还提供了单独的液体佐剂的管瓶，液体佐剂例如MPL和QS21的水包油型制剂，或MPL和QS21的脂质体制剂，用于抗原的重新组成。在给予之前不久，将个别组分合并，形成最终的疫苗组合物。

含有未甲基化的CpG二核苷酸(“CpG”)的某些免疫刺激寡核苷酸是TLR9配体，并且当通过系统和粘膜途径给予时，已经将其确定为佐剂(WO 96/02555，EP 468520，Davis等人，J.Immunol，1998，160(2)：870-876；McCluskie and Davis，J.Immunol.，1998，161(9)：4463-6)。CpG是存在于DNA中的胞嘧啶-鸟苷二核苷酸基序的缩写。历史上，人们观察到BCG的DNA片段可以产生抗肿瘤效果。在进一步研究中，证明衍生自BCG基因序列的合成寡核苷酸能够引起免疫刺激效果(体外和体内两者)。这些研究的发起人推断，某些回文序列(包括中心CG基序)携带这种活性。CG基序在免疫刺激中的中心作用后来在出版物(Krieg，Nature 374，p546 1995)中得到了阐明。详细分析表明，CG基序必须在某一序列范围内，而且这种序列在细菌DNA中是常见的，但在脊椎动物的DNA中却很稀少。免疫刺激序列通常是：嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧啶；其中二核苷酸CG基序不是甲基化的，但已知其它未甲基化的CpG序列是免疫刺激的，并且可以在本发明中使用。

还已经表明，当鸟苷变异为7-去氮鸟苷基序时，免疫刺激寡核苷酸可以保持免疫活性(WO 03057822)。

认为这种免疫刺激寡核苷酸在溶液中具有酸性pH值，例如低于pH7，例如6.3、6.1或更低。这可以使它们难以结合进液体疫苗制剂中，因为它们与制剂中的其它组分不相似。正如所讨论的那样，这可以导致沉淀和/或长期稳定性问题。

人们认为，这些免疫刺激寡核苷酸很可能是很有效的佐剂，尤其当与现有的佐剂组合物例如3D-MPL和QS21组合使用时。人们期望，这种佐剂可以在迄今为止很难提供有效疫苗的疾病中使用，例如HIV、癌和可能的疟疾。

可以用许多不同的方式将佐剂包含在疫苗中，必须以不影响本身或抗原组合物的稳定性的方式来包含它们，以及以不会对重新组成疫苗的保健行业造成过度负担的方式包含它们。获得这种结果的最简单方式是将其它组分放到其它管瓶中，以使它们保持分离，直至临到重新组成之前为止，由此使组分可以彼此影响的时间最小化。这意味着抗原和免疫刺激寡核苷酸将各自提供于单独的管瓶中。然后，如果使用其它佐剂组分例如MPL和QS21，可以将这些以液体混合物的形式提供于第三个管瓶中。然而，在以增加数量的管瓶的方式增加组分数量，会引起成本、消耗的提高，且重要的是，增加了组成期间出现差错的可能性。

本发明概述

本发明人发现，当TLR9配体例如CpG免疫刺激寡核苷酸作为佐剂而是免疫原性组合物的一部分时，可以将所述TLR9配体与抗原一起冷冻干燥，这样就可以提供包含抗原和TLR9配体佐剂合并在一个冻干块中的单一管瓶。

本发明因此提供了包含抗原和TLR9激动剂的冷冻干燥组合物。在一个实施方案中，所述TLR9激动剂是免疫刺激寡核苷酸，可能是包含CpG的寡核苷酸。在一方面，所述包含CpG的寡核苷酸包含嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧啶序列。在另一个方面，所述免疫刺激寡核苷酸选自：SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；和SEQ IDNO：5。

虽然不希望受理论所束缚，但人们认为，与简单地向MPL和QS21的液体制剂中加入TLR9相比，将抗原和TLR9激动剂在一起提供，可以提供更稳定的组分。

本发明提供了下列优点：在抗原和TLR9激动剂与WFI进行重新构建的情况下，可以提供仅仅一个管瓶，在其中含有冷冻干燥制剂。此外，在抗原和TRL9激动剂与液体制剂例如液体佐剂制剂进行重新构建的情况下，那么它具有能够仅仅提供两个组分管瓶(而不是三个)的优点。这反过来具有成本效益，同时，一旦重新构建，可提供适合于使用疫苗的产品。

此外，本发明人发现，将CpG与抗原(其在重新构建缓冲液中不会总体上具有正电荷)共同冷冻干燥，当与注射用水或液体佐剂重新构建时，可以提高那些抗原的溶解性。因此，本发明还提供了提高冷冻干燥的抗原在重新构建时的溶解性的方法，其中抗原在重新构建缓冲液中不会具有净正电荷，该方法包括下列步骤：将TLR9激动剂、优选免疫刺激寡核苷酸、且更优选CpG寡核苷酸与抗原共同冷冻干燥。本发明还提供了TLR9激动剂、优选免疫刺激寡核苷酸、且更优选CpG寡核苷酸提高冷冻干燥的非带正电荷的抗原在重新构建时的溶解性的用途。“非带正电荷的”是指蛋白的总电荷不是正电性。蛋白可以包含正负电荷，但蛋白的总电荷是中性或负性。

本发明还提供了制备免疫原性组合物的方法，该方法包括下面的步骤：将本文所描述的冷冻干燥组合物与合适载体进行重新构建。在一个实施方案中，所述载体是脂质体溶液或水包油乳化液。所述载体可以任选包含一或多种免疫刺激剂，免疫刺激剂可以选自TLR4激动剂，TLR4拮抗剂，皂草苷，TLR7激动剂，TLR8激动剂，TLR9激动剂。在一个实施方案中，所述载体包含两种或多种免疫刺激剂，且在一方面，这些可以是3-脱酰MPL和QS21。

本发明还提供了制备本发明的冷冻干燥组合物的方法，该方法包括：将一或多种目标抗原、TLR9配体和合适赋形剂混合，并将得到的混合物冷冻干燥。

本发明的详细说明

本发明人发现，TLR9配体例如CpG寡核苷酸可以与使人感兴趣的抗原一起冷冻干燥，不会影响该抗原的抗原性或稳定性。TLR9配体是指可以与TLR9受体相互作用的化合物。Toll样受体(TLR)家庭的成员(首先在果蝇中发现)已经证明是模式(pattern)识别受体，每个成员可以辨别不同的微生物组分并且对其做出反应，以限制/消灭入侵的微生物。病原体相关分子模式(PAMP)与TLRs的结合，可以引起反应性氧和氮中间体的产生，引发前炎症性细胞因子网络，并且将连接快速先天响应与获得性免疫的共同刺激性分子上调。已经知道许多TLR配体可以用作佐剂。已经表明，TLR9可以对寡核苷酸激动剂做出反应。因此，本发明的TLR9配体是免疫刺激寡核苷酸。在本发明的一个实施方案中，这种TLR9配体包含CpG基序。替代性的免疫刺激寡核苷酸可以包括核苷酸的变体。例如，WO0226757和WO03057822公开了对包含CpG的免疫刺激寡核苷酸的C和G部分进行的修饰。

在一个实施方案中，TLR9配体是CpG寡核苷酸。在该实施方案的一方面，CpG寡核苷酸包含两个或多个二核苷酸CpG基序，其被至少三个、可能至少六个或更多个核苷酸所分开。本发明的寡核苷酸典型地是脱氧核苷酸。在一个实施方案中，寡核苷酸中的核苷酸间键合是二硫代磷酸酯键，或可能是硫代磷酸酯键，不过还可以使用磷酸二酯及其它核苷酸间键合，包括具有混合核苷酸间键合的寡核苷酸。制备硫代磷酸寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述在US5,666,153、US5,278,302和WO95/26204中。还包括含有不同的核苷酸间键合的寡核苷酸，例如混合的硫代磷酸磷酸二酯。可以使用能够稳定寡核苷酸的其它核苷酸间键合。

CpG寡核苷酸的例子具有下面的序列。在一个实施方案中，这些序列包含硫代磷酸酯改性的核苷酸间键合。

OLIGO 1(SEQ ID NO：1)：TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)

OLIGO 2(SEQ ID NO：2)：TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)

OLIGO 3(SEQ ID NO：3)：ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG

OLIGO 4(SEQ ID NO：4)：TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)

OLIGO 5(SEQ ID NO：5)：TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)

替代性的CpG寡核苷酸可以包含上面的序列，在其中它们具有不重要的缺失或填加。

在本发明中使用的CpG寡核苷酸可以通过本领域已知的任何方法(例如EP 468520)来合成。这种寡核苷酸可以使用自动合成器来方便地合成。

在本说明书的范围内，术语“抗原”指的是适合于提高特异性免疫应答和适合于包含到疫苗或免疫原性组合物中的免疫原性组分，例如用于包含在HIV-1疫苗、癌疫苗、疟疾疫苗、TB疫苗等等中的抗原。具体抗原详述如下。

在一个实施方案中，抗原具有9.6或更小的等电点。在一个实施方案中，抗原具有9或更小的等电点。在一个实施方案中，抗原具有8.5或更小的等电点。在一个实施方案中，抗原具有8.0或更小的等电点。在一个实施方案中，抗原具有7.5的等电点。在一个实施方案中，抗原具有范围7至8的等电点。

当在缓冲液中重新构建时，蛋白的净电荷取决于蛋白中的正电荷数目相对于负电荷数目，这种电荷当然会根据重新构建缓冲液的pH值来变化，等电点是蛋白的净电荷是中性时的pH值。如果重新构建缓冲液的pH值低于抗原的等电点，蛋白趋向于携带净的正电荷。如果重新构建缓冲液的pH值大于抗原的等电点，蛋白趋向于携带净的负电荷。本发明在冷冻干燥和重新构建符合下列条件的抗原时是尤其有用的：该抗原在预定的重新构建缓冲液中具有可以使蛋白携带净负电荷的等电点。在这种情况(参见实施例3)下，在冷冻干燥组合物中存在CpG就可以增加抗原在重新构建缓冲液中的溶解性。

在一个实施方案中，冷冻干燥的抗原和TLR9激动剂以一个剂量的形式提供在例如一个管瓶中。

在一个实施方案中，冷冻干燥抗原的存在数量应该在重新构建时能够提供10至250μg范围内的抗原浓度。

在一个实施方案中，TRL9激动剂的存在数量应该在重新构建时能够提供10至1000μg范围内例如500μg的浓度。

在本发明的一个实施方案中，与TLR9配体结合在冷冻干燥组合物中的抗原可以是肿瘤抗原。因此，使用本发明的冷冻干燥抗原组合物制备的免疫原性组合物可有效用于癌的免疫治疗。例如，可以用本文所描述的癌抗原、肿瘤抗原或肿瘤排斥抗原来制备冷冻干燥组合物，例如，在前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肾癌、卵巢癌、肝癌和头与颈癌(还有其它的)中表达的那些蛋白。

可以在本发明中使用的癌睾丸抗原包括抗原的MAGE A家族：MAGE-A1，A2，A3，A4，A5，A6，A7，A8，A9，A10，A11和A12；亦称为MAGE-1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12)，MAGE B抗原：MAGE B1，B2，B3和B4，MAGE C抗原：MAGE-C1和MAGE-C2，LAGE 1抗原，LAGE 2抗原(亦称为NY-ESO-1)和GAGE抗原。

在本发明中还可以使用前列腺特异性抗原。可以融合的前列腺特异性抗原的例子包括前列腺的六个跨膜上皮抗原(STEAP)，前列腺特异性抗原(PSA)，前列腺酸性磷酸酶(PAP)，前列腺干细胞抗原(PSCA)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)或被称为前列腺酶的抗原(亦称为P703P)。

在一个实施方案中，前列腺抗原是P501S或其片段。P501S(还称为prostein)是553个氨基酸的蛋白。包含至少20、50或100个连续氨基酸的P501S的免疫原性片段和部分、或包含20-50或50-100个之间的连续氨基酸的片段可以用作本发明的肿瘤相关的抗原或衍生物。在一个实施方案中，肿瘤相关的抗原或衍生物是PS108抗原(公开在WO98/50567中)或前列腺癌相关的蛋白(参见WO99/67384)。在一些实施方案中，片段是全长P501S蛋白的氨基酸51-553、34-553或55-553。这些可以在酵母系统中表达，例如编码这种多肽的DNA序列可以在酵母系统中表达。

在一个实施方案中，抗原可以包含或由WT-1(由Wilm′s肿瘤基因表达)或它的N端片段WT-1F(大约或大致包含氨基酸1-249)组成。WT1是最初发现在儿科肾癌(Wilm′s肿瘤)中被过度表达的蛋白。可以使用的抗原包括作为抗原接近全长的蛋白。在一个实施方案中，抗原可以包含或由WT1-A10蛋白(其是292 AA重组融合蛋白，由WT1序列的12mer截短的tat序列和氨基酸编号2-281组成)组成。

在本发明的一个实施方案中，肿瘤相关的抗原或衍生物是乳癌抗原，例如Her-2/neu，乳腺球蛋白或B305D抗原。

用于本发明的Her-2/neu抗原可以包括整个胞外域(ECD；例如大致包含Her-2/neu的氨基酸序列的氨基酸1-645的序列)或其片段。或者或另外，该构成可以包含至少或整个胞内区域的免疫原性部分：例如Her-2/neu序列的大约C端580氨基酸。

可以用作本发明的肿瘤相关的抗原衍生物的一种构成是ECD的融合蛋白和Her-2/neu的磷酸化区域(PD)(ECD-PD)。可以使用的其它构成是ECD的融合蛋白和Her-2/neu的磷酸化区域的片段(ECD-ΔPD)。所描述的Her-2/neu融合蛋白和构成可以衍生自人、大鼠、小鼠或猿/猴子的Her-2/neu。Her-2/neu的示范性的序列和构成描述在WO00/44899中。

PRAME(亦称DAGE)是可以用作本发明的肿瘤相关的抗原的另一种抗原。还可以使用包含PRAME抗原的本文所描述的融合蛋白。尤其是，本文所描述的PRAME抗原的融合物和本文所描述的蛋白D融合伙伴蛋白或衍生物可以在本发明中使用。

通过一些群组已经表明PRAME抗原可以在黑素瘤和很多种肿瘤(包括肺、肾和头和颈癌)中表达。有趣的是，它看来还可以在40-60％的血癌例如急性淋巴细胞性白血病和急性骨髓性白血病中表达，参见例如Exp Hematol.2000 Dec；28(12)：1413-22。已经在患者中观察到，同没有过度表达该蛋白的患者相比较，PRAME的过度表达似乎与较高的存活率和较低的恶化速度有关。

抗原和其制备描述在美国专利US 5，830,753中。在Annotated HumanGene Database H-Inv DB中的下列登录号项下可以发现PRAME：

U65011.1，BC022008.1，AK129783.1，BC014974.2，CR608334.1，AF025440.1，

CR591755.1，BC039731.1，CR623010.1，CR611321.1，CR618501.1，CR604772.1，

CR456549.1，和CR620272.1。

在一方面，本发明的抗原可以包含PRAME抗原或其免疫原性片段或由其组成。通常，PRAME蛋白具有509个氨基酸，和在一个实施方案中，PRAME的所有509个氨基酸可以包括在抗原中。

结肠直肠抗原也可以用作本发明的肿瘤相关的抗原。可以使用的结肠直肠抗原的例子包括：C1585P(MMP 11)和C1491(E1A EnhancerBinding Protein)，CASB618(如WO00/53748所述)；CASB7439(如WO01/62778所述)；和C1584(Cripto)。

用于本发明范围的其它肿瘤相关的抗原包括：Plu-1 J Biol.Chem274(22)15633-15645，1999，HASH-1，HASH-2，Cripto(Salomon等人Bioessays 199，2161-70，美国专利US5654140)Criptin美国专利US5981215。另外，尤其与癌治疗所用疫苗相应的抗原还包含酪氨酸酶和存活素。

粘蛋白衍生的肽例如Muc1，参见例如US 5744,144、US 5827,666、WO 8805054、US 4,963,484。具体包括的是Muc 1衍生的肽，其包含Muc 1肽的至少一个重复单元，优选至少两个这种重复单元，并且可以通过SM3抗体来对其进行识别(US 6054438)。其它粘蛋白衍生的肽包括得自于Muc 5的肽。

其它肿瘤特异性抗原适合于在本发明的冷冻干燥组合物中使用，并且包括但不局限于：肿瘤特异性神经节糖苷，例如GM2和GM3或其与载体蛋白的共轭物；或所述抗原可以是自身肽激素，例如全长促性腺激素释放因子(GnRH，WO 95/20600)，短的10个氨基酸长度的肽，用于治疗许多癌，或用于免疫去势。

在本发明的方面中，本发明还延伸至上述抗原、免疫原性衍生物和免疫原性片段和包含其的融合蛋白的用途。

衍生物、片段和融合蛋白

可以以衍生物或其片段(而不是天然存在的抗原)形式使用本发明的肿瘤相关的抗原。

本文使用的术语“衍生物”是指相对于其抗原的天然存在形式进行改性的抗原。衍生物可以包括突变，例如点突变。在一个实例中，衍生物可以改变蛋白的性质，例如通过在原核系统中提高表达，或通过除去不合需要的活性，例如酶活性。本发明的衍生物与天然抗原十分类似，从而保持了抗原的性质，并且保持能够提高针对天然抗原的免疫应答。不管所给定衍生物是否能够提高免疫应答，这种免疫应答都可以用适合的免疫试验来测定，例如ELISA或流式细胞术。

在本发明的一个实施方案中，本发明的肿瘤相关抗原的衍生物是包含与异源融合伙伴蛋白相联接的肿瘤相关抗原的融合蛋白。有关与肿瘤相关抗原的“异源”，是用来描述一种蛋白或多肽序列，其实际上不会与肿瘤相关的抗原连接，即通过故意的人为干预与肿瘤相关抗原连接。

抗原和异源融合伙伴蛋白在化学上可以是共轭物，或可以表示为重组融合蛋白。在一个实施方案中，相比于非融合蛋白，本发明的融合蛋白可以使表达系统中所产生的融合蛋白的水平提高。由此，融合伙伴蛋白可以帮助提供T辅助表位，例如，人能够识别的T辅助表位(即，融合伙伴蛋白充当免疫融合伙伴)。与天然重组蛋白质相比，融合伙伴可以有助于高产率地表达蛋白(即，融合伙伴蛋白充当表达增强剂)。在一个实施方案中，融合伙伴蛋白可以充当免疫融合伙伴和表达增强伙伴二者。

融合伙伴蛋白可以例如源自于蛋白D。蛋白D是一种脂蛋白(暴露在革兰氏阴性细菌流感嗜血杆菌表面上的42kDa免疫球蛋白D结合蛋白)。以具有18个氨基酸残基信号序列(包含对于细菌脂蛋白的交感序列)的前体物形式合成该蛋白(参见WO 91/18926)。天然前体蛋白D蛋白是在分泌和信号序列断裂期间加工的。加工的蛋白D的Cys(在前体物分子中的19位)变成所加工蛋白的N末端残基，并且伴随有通过酯连接的和酰胺连接的脂肪酸两者的共价连接所造成的改性。然后，与氨基-端部半胱氨酸残基连接的脂肪酸起到膜固着点的作用。

在一个实施方案中，用于本发明的肿瘤相关的抗原衍生物可以包含蛋白D或其衍生物作为融合伙伴蛋白。

本文所描述的蛋白D或其衍生物可以包含例如：加工蛋白D的第一个或N端第三个，或加工蛋白D的近似地或大约第一个或N端。在一个实施方案中，蛋白D或其衍生物可以包含加工蛋白D的第一个或N端第100至115个氨基酸；或加工蛋白D的第一个或N端第109个氨基酸。在一个实施方案中，天然的加工蛋白D氨基酸2-Lys和2-Leu可以用氨基酸2-Asp和3-Pro代替。

在一个实施方案中，蛋白D或其衍生物可以进一步包括前体蛋白D的第18或19个氨基酸信号序列。在一个实施方案中，衍生自蛋白D的融合伙伴蛋白包含前体蛋白D的氨基酸20至127或由其组成。在本发明的一个实施方案中，前体蛋白D融合伙伴蛋白的两个氨基酸21-Lys和22-Leu可以用氨基酸21-Asp和22-Pro代替。

当与野生型前体物或加工蛋白D序列相比时，本文所描述的蛋白D融合伙伴蛋白可以在氨基酸序列之内另外替代性地包括缺失、取代或嵌入。在一个实施方案中，可以嵌入、取代或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个氨基酸。氨基酸可以用本文所定义的保守性置换来替代，或可以使用其它氨基酸。

在一个实施方案中，融合伙伴蛋白可以包含如SEQ ID NO：1所示的蛋白D序列或由其组成。在一个实施方案中，融合伙伴蛋白可以包含图1中带下划线的氨基酸或由其组成，即SEQ ID NO：12的氨基酸残基20至127。在一个实施方案中，用于本发明的抗原可以是蛋白-D-MAGE-3，其中MAGE-3抗原由MAGE-3的氨基酸3至314组成，且其中蛋白D融合伙伴蛋白由示于图1中的氨基酸序列组成。

在本发明的另一个实施方案中，融合伙伴蛋白可以选自如下所述的NS1或LytA或它们的衍生物。

NS1是得自于流感病毒的非结构蛋白。在一个实施方案中，本发明的肿瘤相关的抗原衍生物可以包含NS1或其衍生物作为融合伙伴蛋白。NS1或其衍生物可以包含其N端1至81氨基酸。

LytA源自于肺炎链球菌。LytA蛋白的C端区域负责与胆碱或与一些胆碱类似物例如DEAE的亲合性。在一个实施方案中，本发明的肿瘤相关的抗原衍生物可以包含LytA或其衍生物作为融合伙伴蛋白。LytA或其衍生物可以包含LytA分子的重复部分，LytA分子可在起始于残基178的C末端中发现。在一个实施方案中，LytA或其衍生物包含C-LytA的残基188-305。

用于本发明的免疫原性多肽典型地是重组蛋白，其是例如通过在异源宿主例如在细菌宿主中、在酵母或在培养的哺乳动物细胞中表达而产生的。

术语“肿瘤相关抗原衍生物”是指多肽，其部分地或完全包含天然出现在肿瘤相关抗原中的序列，或其携带与其高度的序列同一性(例如，超过至少10例如至少20个氨基酸的伸长时，具有95％以上的同一性)。衍生物还包括具有保守置换的序列。保守置换是众所周知的，并且在顺序排列计算机程序中通常建立成默认计分阵列。

一般地说，在下面的组之内的替换是保守置换，但认为在下面的组之间的替换是非保守置换。基团是：

i)天冬氨酸/天冬酰胺/谷氨酸/谷氨酰胺

ii)丝氨酸/苏氨酸

iii)赖氨酸/精氨酸

iv)苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸

v)亮氨酸/异亮氨酸/缬氨酸/甲硫氨酸

vi)甘氨酸/丙氨酸

本发明的衍生物还可以包括化学处理的序列，例如用醛(例如甲醛或戊二醛)处理，羧甲基化，羧酰胺化，乙酰化及其它常规化学处理。在本发明中，还可以使用具有衍生化的游离硫醇残基的本发明的构成。尤其是可以使用羧酰胺化的或羧甲基化的硫醇衍生物。

在本发明的一个实施方案中，肿瘤相关抗原衍生物可以是本文所描述的、具有衍生化的游离硫醇残基的MAGE抗原。衍生化的游离硫醇残基可以是羧酰胺或羧甲基化的衍生物。

本发明的肿瘤相关抗原衍生物也可以包括含有一个以上肿瘤相关抗原的构成。在本发明的一个实施方案中，肿瘤相关抗原衍生物可以包括两种或多种肿瘤相关抗原。

本文使用的术语“片段”是指包含至少一个表位的肿瘤相关抗原或抗原的衍生物的片段，例如CTL表位，典型地是至少8个氨基酸的肽。认为长度至少为8个例如8-10个氨基酸或最高达20、50、60、70、100、150或200个氨基酸的片段属于本发明范围，只要该片段具有抗原性即可，就是说，通过该片段保持主要表位(例如CTL表位)，并且该片段能够引起与天然存在的肿瘤相关抗原进行交叉反应的免疫应答。示范性的片段可以是8-10、10-20、20-50、50-60、60-70、70-100、100-150、150-200个氨基酸残基长度(包括这些范围内的任何值)。

在本发明的一个实施方案中，将包含Her 2 neu抗原和CpG寡核苷酸的冷冻干燥组合物与包含3D-MPL和QS21的脂质体或水包油乳化液载体重新构建。这种重新构建制剂可产生体液和细胞介导的响应二者。

本发明的冷冻干燥组合物可以包含与肿瘤支持机理(例如血管生成，肿瘤侵入)相关的抗原，例如tie 2、VEGF。

在本发明的另一个方面，本发明的冷冻干燥组合物中的抗原是选自HIV衍生的抗原的抗原，尤其是HIV-1衍生的抗原。下面的段落描述了可以衍生自HIV-1的抗原。

HIV Tat和Nef蛋白是早期蛋白，即它们在感染初期和在没有结构蛋白质的情况下表达。

Nef基因编码早期辅助HIV蛋白(已经表明其具有一些活性)。例如，已经知道Nef蛋白可以导致CD4(HIV受体)从细胞表面除去，虽然这种功能的生物学重要性还在进行争论。另外，Nef与T细胞的信号途径相互作用，并且引起激活态，随后可以促进更有效的基因表达。一些HIV独立型在该区域中具有突变或缺失，导致它们不能编码功能蛋白，并且在它们的复制和体内发病原理过程中受到严重损害。

Gag基因是由全长RNA转译的，得到前体多蛋白，其随后断裂为3-5个衣壳蛋白；基质蛋白质p17，衣壳蛋白p24和核酸结合蛋白(Fundamental Virology，Fields BN，Knipe DM and Howley M 1996 2.Fields Virology vol 2 1996)。

Gag基因产生55千道尔顿(Kd)Gag前体蛋白，还称为p55，其是由未拼接病毒mRNA来表达的。在转译期间，p55的N端被豆蔻酰化，引发其与细胞膜的胞质方面进行结合。膜结合的Gag多蛋白与其它病毒和细胞蛋白(其引发受感染细胞表面的病毒颗粒的芽殖)一起补充病毒基因组RNA的两个复制品。芽殖之后，在病毒成熟为四个较小蛋白(称为MA(基质[p17])，CA(衣壳[p24])，NC(核衣壳[p9])和p6)的过程期间，通过病毒编码的蛋白酶(Pol基因的产物)将p55断裂。

除了3个主要Gag蛋白(p17、p24和p9)之外，所有Gag前体物还包含一些其它区域，其被断裂，并以各种大小的肽的形式保留在病毒体中。这些蛋白具有不同的作用，例如，p2蛋白具有在调节蛋白酶活性方面具有推荐的作用，并且可以有助于蛋白酶解加工的正确时间。

MA多肽源自于p55的N端(豆蔻酰化的端部)。大部分MA分子保持与病毒体脂双层的内表面的连接，从而使颗粒稳定。MA的亚型被补充(recruite)到病毒体的更深一层的内部，在其中，它变成护送(escort)病毒DNA至核心的复合物的一部分。这些MA分子可促进病毒基因组的核转运，这是因为MA上的亲核(karyophilic)信号是通过细胞核引入机构来辨别的。这种现象使HIV感染未分裂细胞，这是逆转录病毒的特殊性质。

p24(CA)蛋白形成病毒颗粒的锥形核。已经证明亲环素A可与p55的p24区域相互作用，导致其结合到HIV颗粒中。在Gag和亲环素A之间的相互作用是必要的，这是因为通过环孢灵来破环这种相互作用可抑制病毒复制。

Gag的NC区域负责具体辨别所谓的HIV的包装信号。包装信号由四个位于接近病毒RNA的5′端的茎环结构组成，并且足以介导异源RNA结合到HIV-1病毒体中。通过两个锌指(zinc-finger)基序介导的相互作用，NC与包装信号结合。NC还促进逆转录。

p6多肽区域介导p55 Gag和辅助蛋白Vpr之间的相互作用，导致Vpr结合到组装病毒体中。p6区域还包含所谓的晚(late)域，从受感染细胞中有效释放芽殖病毒体需要这种晚域。

Pol基因编码具有感染初期的病毒所需要活性的三个蛋白，即病毒DNA积累到细胞DNA中所需要的逆转录酶RT、蛋白酶和整合酶蛋白。Pol的初产物被病毒体蛋白酶断裂，得到氨基末端RT肽，其具有DNA合成(RNA和DNA引导的DNA聚合酶、核糖核酸酶H)和羧基端整合酶蛋白所必需的活性。HIV RT是全长RT(p66)和分裂产物(p51)(缺少羧基端RN酶H区域)的杂二聚体。

RT是通过逆转录病毒基因组编码的大部分高度保守的蛋白之一。RT的两个主要活性是DNA Pol和核糖核酸酶H。RT的DNA Pol活性可互换地使用RNA和DNA作为模板，并且象所有已知的DNA聚合酶一样，其不能从头(de novo)引发DNA合成，需要预先存在分子作为引物(RNA)。

在所有RT蛋白中固有的核糖核酸酶H活性，在进行DNA合成时消除RNA基因组的复制初期起到必要的作用。它从所有的RNA-DNA杂交体分子中选择性地降解RNA。在覆盖Pol的氨基三分之二之内的Pol中，聚合酶和核糖核酸酶H结构上占据分开的、不相重叠的区域。

p66催化亚单位折叠成5个独特的子域。这些的氨基末端23包含具有RT活性的部分。这些的羧基端是RN酶H区域。

宿主细胞感染之后，逆转录病毒RNA基因组通过逆转录酶(其存在于感染颗粒中)复制到直链双股DNA中。整合酶(在Skalka AM′99 Advin Virus Res 52 271-273中进行综述)识别病毒DNA的端部，修饰它们，并伴随病毒DNA进入到宿主染色体的位点中，进行催化整合。宿主DNA中的许多位点可以是整合的靶向。虽然整合酶足以体外催化整合，但它不是与体内病毒DNA相关的唯一蛋白-从受感染细胞中分离的大蛋白-病毒DNA复合物已经代表了预先整合复合物。这可以通过子代病毒基因组来促进宿主细胞基因的采集。

整合酶由3个独特的区域组成，N端区域、催化核心和C端区域。催化核心区域包括多核苷酸(polynucleotidyl)转移化学的所有要求。

由此，用于本发明的HIV-1衍生的抗原可以选自例如Gag(例如全长Gag)，p17(Gag的一部分)，p24(Gag的另一部分)，p41，p40，Pol(例如全长Pol)，RT(Pol的一部分)，p51(RT的一部分)，整合酶(Pol的一部分)，蛋白酶(Pol的一部分)，Env，gp120，gp140或gp160，gp41，Nef，Vif，Vpr，Vpu，Rev，Tat和其免疫原性衍生物和其免疫原性片段，尤其是，包含p17、p24、RT和整合酶的Env、Gag、Nef和Pol和其免疫原性衍生物和其免疫原性片段。HIV疫苗可以包含多肽和/或多核苷酸(其将相当于许多不同HIV抗原的多肽编码，例如选自上述列表的2或3或4或更多种HIV抗原)。一些不同的抗原可以例如包括在单一融合蛋白中。可以使用一个以上的第一个免疫原性多肽和/或一个以上的第二个免疫原性多肽(其每个是HIV抗原或一个以上抗原的融合物)。

例如，抗原可以包含Gag或其免疫原性衍生物或免疫原性片段，与RT或其免疫原性衍生物或其免疫原性片段融合，与Nef或其免疫原性衍生物或其免疫原性片段融合，其中融合蛋白的Gag部分存在于多肽的5′端上。

按照本发明使用Gag序列可以排除Gag p6多肽编码序列。用于本发明的Gag序列的具体例子包括p17和/或p24编码序列。

RT序列可以包括突变，以便使任何逆转录酶活性基本上失活(参见WO03/025003)。

RT基因是在HIV基因组中较大pol基因的组分。可以理解，按照本发明使用的RT序列可以存在于Pol的范围内，或至少与RT对应的Pol的片段内。Pol的这种片段保持了Pol的主要CTL表位。在一个具体实例中，RT仅仅作为RT的p51或p66片段被包括在内。

按照本发明的融合蛋白或组合物的RT组分任选包含突变，以便消除在原核表达系统中充当内部起动位点的位点。

任选地，将用于本发明的Nef序列截短，以消除编码N端区域的序列，即，除去30至85的氨基酸，例如60至85的氨基酸，尤其是N端65氨基酸(后面的截短本文指的是trNef)。或者或另外，可以将Nef改性，以消除十四烷基化位点。例如，可以通过缺失或置换来消除Gly 2十四烷基化位点。或者或另外，可以将Nef改性，通过一种或两者亮氨酸的缺失或置换，改变Leu 174和Leu 175的双亮氨酸基序。双亮氨酸基序在CD4下调方面的重要性描述在例如下列中：Bresnahan P.A.等人(1998)Current Biology，8(22)：1235-8。

Env抗原可以以gp160形式存在于它的全长中，或截短的gp140形式，或更短的形式(任选具有合适的突变，以破坏gp120和gp41之间的裂解位点基序)。Env抗原还可以以gp120和gp41形式存在于它的天然存在的加工形式中。gp160的这两个衍生物可以单独使用或以组合形式一起使用。上述Env抗原可以进一步显示缺失(尤其是可变环)和截短。也可以使用Env的片段。

示范性的gp120序列示于SEQ ID No 6中。示范性的gp140序列示于SEQ ID No 7中。

在按照本发明的冷冻干燥组合物中使用的免疫原性多肽可以包含Gag、Pol、Env和Nef，在其中，存在这些天然抗原的CTL表位至少75％、或至少90％或至少95％，例如96％。

在包含免疫原性多肽(其包含上述的p17/p24 Gag、p66 RT和截短的Nef)的冻干组合物中，适合地存在96％的天然Gag、Pol和Nef抗原的CTL表位。

本发明的一个实施方案提供了冷冻干燥组合物，其包含TLR9配体和免疫原性多肽，该免疫原性多肽以Gag、RT、Nef的顺序包含p17、p24 Gag、p66 RT、截短的Nef(缺少(devoid)编码端部氨基-酸1-85-“trNef”的核苷酸)。

在按照本发明的冷冻干燥组合物中使用的特定多核苷酸构成和对应的多肽抗原包括：

1.p17，p24(密码子优化)Gag-p66 RT(密码子优化)-截短的Nef；

2.截短的Nef-p66 RT(密码子(codon)优化)-p17，p24(密码子优化)Gag；

3.截短的Nef-p17，p24(密码子优化)Gag-p66 RT(密码子优化)；

4.p66 RT(密码子优化)-p17，p24(密码子优化)Gag-截短的Nef；

5.p66 RT(密码子优化)-截短的Nef-p17，p24(密码子优化)Gag；

6.p17，p24(密码子优化)Gag-截短的Nef-p66 RT(密码子优化)。

示范性的融合是Gag、RT和Nef的融合，尤其是以Gag-RT-Nef的顺序(参见例如SEQ ID No 8或SEQ ID NO：9)。另一个示范性的融合是p17、p24、RT和Nef的融合，尤其是以p24-RT-Nef-p17的顺序。这种融合被称作F4，并且描述在WO2006/013106中。F4是HIV抗原的优选例子，其可以在本发明的冷冻干燥组合物中得到。在SEQ ID NO：10中给出了F4的核苷酸序列，其中p24序列是粗体，Nef序列带下划线，方框是遗传结构所引入的核苷酸。在SEQ ID NO：11中给出了F4的氨基酸序列，其中：

P24序列：氨基酸1-232(粗体)

RT序列：氨基酸235-795

Nef序列：氨基酸798-1002

P17序列：氨基酸1005-1136

方框：遗传结构引入的氨基酸

K(赖氨酸)：代替色氨酸(W)。引入突变，以除去酶活性

在另一个实施方案中，冷冻干燥组合物包含Gag、RT、整合酶和Nef，特别是以Gag-RT-整合酶-Nef的顺序(参见例如SEQ ID No 11)。

在其它实施方案中，HIV抗原可以是融合多肽，该融合多肽包含Nef或其免疫原性衍生物或其免疫原性片段，和p17 Gag和/或p24 Gag或其免疫原性衍生物或其免疫原性片段，其中，当p17和p24 Gag两者都存在时，在它们之间至少有一个HIV抗原或免疫原性片段。

例如，Nef合适地是全长Nef。

例如，p17 Gag和p24 Gag合适地分别是全长p17和p24。

在一个实施方案中，冷冻干燥组合物包含免疫原性多肽，该多肽包含p17和p24 Gag或其免疫原性片段。在这种构成中，p24 Gag组分和p17 Gag组分被至少一个其它的HIV抗原或免疫原性片段所分离，例如Nef和/或RT或其免疫原性衍生物或其免疫原性片段。更多细节参见WO2006/013106。

在包含p24和RT的融合蛋白中，优选，在构成中，p24在RT前面，因为当在大肠杆菌中单独表达抗原时，可以观察到，p24能够比RT更好地得到表达。

在按照本发明的冷冻干燥组合物中使用的一些构成包括下列：

1.p24-RT-Nef-p17

2.p24-RT^＊-Nef-p17

3.p24-p51RT-Nef-p17

4.p24-p51RT^＊-Nef-p17

5.p17-p51RT-Nef

6.p17-p51RT^＊-Nef

7.Nef-p17

8.Nef-p17带有连接基

9.p17-Nef

10.p17-Nef带有连接基

^*代表RT甲硫氨酸₅₉₂突变为赖氨酸

在另一个方面，本发明提供了包含HIV抗原的融合蛋白的冷冻干燥组合物，HIV抗原包括至少四个HIV抗原或免疫原性片段，其中该四个抗原或片段是Nef、Pol和Gag或源自于Nef、Pol和Gag。优选，Gag以两个单独组分的形式存在，在融合物中，两个单独组分被至少一个其它抗原所分离。优选，Nef是全长Nef。优选，Pol是p66或p51RT。优选，Gag是p17和p24 Gag。在本发明的这方面，融合物的抗原组分的其它优选特征和性质如本文所描述。

本发明该方面的优选实施方案是上面已经列出的四个组分融合物：

1.p24-RT-Nef-p17

2.p24-RT^＊-Nef-p17

3.p24-p51RT-Nef-p17

4.p24-p51RT^＊-Nef-p17

在本发明的冷冻干燥组合物内使用的免疫原性多肽可以具有连接基序列，其存在于相当于具体抗原例如Gag、RT和Nef的序列之间。这种连接基序列可以例如至多20个氨基酸长度。在具体实施例中，它们可以是1至10个氨基酸，或1至6个氨基酸，例如4-6个氨基酸。

这种合适HIV抗原的进一步说明可以在WO03/025003中得到。

用于本发明的HIV抗原可以衍生自任何HIV进化枝，例如进化枝A、进化枝B或进化枝C。例如，HIV抗原可以衍生自进化枝A或B，特别是B。

在本发明的一个具体实施方案中，冷冻干燥组合物包含一个以上免疫原性多肽。在该实施方案的一方面，第一个免疫原性多肽是包含Gag和/或Pol和/或Nef或它们之中任一项的片段或衍生物的多肽(例如p24-RT-Nef-p17)。在本发明的该实施方案的一个具体方面，第二个免疫原性多肽是包含Gag和/或Pol和/或Nef或它们之中任一项的片段或衍生物的多肽(例如Gag-RT-Nef或Gag-RT-整合酶-Nef)。

由此，在一个具体实施方案中，包含Gag和/或Pol和/或Nef或它们之中任一项的片段或衍生物的多肽(例如p24-RT-Nef-p17)是第一个免疫原性多肽，和包含Gap和/或Pol和/或Nef或它们之中任一项的片段或衍生物的多肽(例如Gag-RT-Nef或Gag-RT-整合酶-Nef)是第二个免疫原性多肽。

在本发明的另一个具体实施方案中，第一个免疫原性多肽是Env或其片段或衍生物，例如gp120、gp140或gp160(特别是gp120)。在本发明的一个具体实施方案中，第二个免疫原性多肽是包含Gag和/或Pol和/或Nef或它们之中任一项的片段或衍生物的多肽(例如p24-RT-Nef-p17)。

由此，在一个具体实施方案中，Env或其片段或衍生物例如gp120、gp140或gp160(特别是gp120)是第一个免疫原性多肽，和包含Gag和/或Pol和/或Nef或它们之中任一项的片段或衍生物的多肽(例如p24-RT-Nef-p17)是第二个免疫原性多肽。

在本发明的另一个具体实施方案中，第一个免疫原性多肽是包含Gag和/或Pol和/或Nef或它们之中任一项的片段或衍生物的多肽(例如p24-RT-Nef-p17)。在本发明的一个具体实施方案中，第二个免疫原性多肽是Env或其片段或衍生物，例如gp120、gp140或gp160(特别是gp120)。

由此，在一个具体实施方案中，包含Gag和/或Pol和/或Nef或它们之中任一项的片段或衍生物的多肽(例如p24-RT-Nef-p17)是第一个免疫原性多肽，且Env或其片段或衍生物例如gp120、gp140或gp160(特别是gp120)是第二个免疫原性多肽。

冷冻干燥组合物可以包含一个抗原，或可以包含一个以上抗原。

在本发明的一方面，TLR9配体用于提高非带正电荷抗原的溶解性。本发明人已经发现，尤其是对于带负电荷的抗原，Cpg的共同冷冻干燥可以提高它们在重新构建时的溶解性。在TLR9配体是免疫刺激寡核苷酸的情况下，抗原是带有净负电荷的分子。在这种配体与带有净正电荷的抗原共同冷冻干燥的情况下，当将冷冻干燥组合物重新构建时，TLR9配体有可能与抗原相互作用，可能导致抗原的沉淀。这是不合乎需要的，但通过使组合物包含已知在这种情况下可提高溶解性的冷冻干燥赋形剂(佐剂)例如L-精氨酸，本领域技术人员可以避免这种现象发生。

将TLR9配体和一或多种抗原与合适赋形剂混合，形成可以冷冻干燥的最终的本体制剂。最好的是，赋形剂包含防冻剂(cryoprotectant)，以便在冷冻干燥初期阶段期间保护蛋白不变性，和包含冻干保护剂(lyoprotectant)，以便在干燥期间防止蛋白失活。可以使用两种不同的分子，或可以使用具有两种性能的一种分子，例如二糖。任选地，还可以加入结晶性的扩充剂，例如甘露糖醇或甘氨酸。还可以加入非离子型表面活性剂例如聚山梨酸酯或

以帮助防止蛋白的团聚。赋形剂还可以包括缓冲盐，以改变最终本体的pH值。

合适赋形剂包括下列：糖，例如蔗糖，海藻糖，棉子糖和麦芽糖糊精例如麦芽三糖，麦芽四糖，麦芽五糖或麦芽六糖；多元醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇；聚合物，例如葡聚糖(dextran)，聚乙二醇(PEG)，或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；氨基酸，例如甘氨酸，丙氨酸或精氨酸。

还可以将赋形剂进行结合，这样就可以一起使用两种或多种例如三或四种赋形剂。合适的组合包括：糖和葡聚糖，例如蔗糖和葡聚糖或海藻糖和葡聚糖；糖和PEG，例如PEG8000和糖；糖和PVP，例如蔗糖和PVP；糖和氨基酸，例如甘氨酸和蔗糖；两种糖一起，例如蔗糖和葡糖或蔗糖和棉子糖；蔗糖和多元醇，例如蔗糖和山梨糖醇或蔗糖和甘露糖醇；多元醇和氨基酸，例如甘露糖醇和甘氨酸。

表面活性剂例如聚山梨酸酯或

可以加入到赋形剂的任何组合中。

为了形成可以用于接种的免疫原性组合物，需要将包含抗原和TLR9配体的冷冻干燥组合物与可药用稀释剂进行重新构建。本发明的优选方面是，这种稀释剂应该是颗粒稀释剂，例如金属盐颗粒的溶液，或脂质体，或水包油乳化液。

在一个实施方案中，稀释剂进一步包含免疫刺激剂。这意味着，除了在冷冻干燥组合物中得到的TLR9配体之外，最终的重新构建免疫原性组合物还包含其它免疫刺激剂。

有许多已知的单独或组合形式的免疫刺激剂(已知其是佐剂)。不需要预先接触，先天或天生的免疫系统就可以识别很宽的病原体谱。负责先天免疫的主要细胞(单核白细胞/巨噬细胞和嗜中性白细胞)可以吞噬微生物致病体，并且引发先天的、炎症性的和特异性的免疫反应。

脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌的外膜的外小叶的主要的表面分子，并且仅仅出现在革兰氏阴性细菌的外膜的外小叶中。已经证明LPS是TLR4配体。通过血清补充和吞噬细胞，LPS妨碍细菌的破坏，并且涉及到集群现象的吸附性。LPS是一组结构上相关的复合分子(规格大致是10,000道尔顿)，并且由三个共价连接的区域组成：

(i)O-特异性多糖链(O抗原)，在外区

(ii)核心寡糖中心区域

(iii)脂质A-在最内部区域，其充当疏水锚，它包含携带长链脂肪酸的葡糖胺二糖单元。

LPS的生物学活性，例如致命毒性、致热原性和佐剂性，已经证明其与脂质A部分相关。相反，免疫原性与O-特异性多糖组分(O抗原)有关。长久以来，LPS和脂质A两者的强烈佐剂效果是已知的，但这些分子的高毒性妨碍了它们在疫苗制剂中的使用。因此，朝着降低LPS或脂质A的毒性、同时保持它们的佐剂性的目标而进行了大量的工作。

在1966年，从母体(光滑(smooth))株的培养物中分离出沙门氏菌minnesota突变株R595(Luderitz等人1966Ann.N.Y.Acad.Sci.133：349-374)。根据被一组噬菌体(phages)溶解的敏感性，对所选择的菌落进行筛选，并且只选择那些表明窄灵敏范围(仅仅对一或两种噬菌体敏感)的菌落用于进一步研究。这种工作导致较粗制的(deep rough)突变株(其在LPS生物合成中是有缺陷的)的分离，并且称为S.minnesotaR595。

与其它LPS相比，通过突变株S.minnesota R595产生的那些LPS具有相对简单的结构。

(i)它们不包含O-特异性区域：这种特征导致从野型光滑表型变为突变株粗糙表型，并且导致毒性的丧失

(ii)中心区域很短：该特征可以提高菌株对各种化学制剂的敏感性

(iii)脂质A部分是高度酰化的，带有至多7个脂肪酸。

4′-单磷酰脂质A(MPL)(其可以通过LPS的酸水解来获得，LPS是从革兰氏阴性细菌的深度粗糙的突变株提取的)保持了LPS的佐剂性能，同时证明毒性降低达1000以上的系数(在鸡胚蛋中用致死剂量测定)(Johnson等人1987 Rev.Infect.Dis.9 Suppl：S512-S516)。一般将LPS在中等强度的无机酸溶液(例如0.1M HCl)中回流大约30分钟。这种过程导致1位的脱磷酸、和6′位的脱糖基化(decarbohydration)，得到MPL。

3-O-脱酰单磷酰脂质A(3D-MPL)(其可以通过MPL的温和碱水解来获得)具有进一步降低的毒性，同时又保持了佐剂性，参见US4,912,094(Ribi Immunochemicals)。碱水解一般在有机溶剂中进行，例如在氯仿/甲醇的混合物中，通过用弱碱水溶液进行饱和，例如0.5M碳酸钠(pH10.5)。

制备3D-MPL的进一步的资料可以在例如US4,912,094和WO02/078637(Corixa Corporation)中得到。

已经表明，一些不是TLR配体的分子具有佐剂活性。皂甙(Quillajasaponins)是三萜烯糖苷的混合物，从皂树皮中提取的。粗品皂甙(saponins)已经广泛地用作兽用佐剂。Quil-A是部分纯化的皂甙(Quillaja saponins)物质的水提取物。QS21是Quil A的Hplc纯化的无毒片段，并且它的制备方法公开(作为QA21形式)在美国专利US5,057,540中。

在本发明的一方面，稀释剂包含一种其它的免疫刺激剂。在本发明的另一个方面，稀释剂包含一种以上其它的免疫刺激剂。这种免疫刺激剂可以是TLR4配体、皂甙(saponins)、TLR7配体、TLR8配体或TLR9配体。在本发明的一个实施方案中，其它免疫刺激剂是TLR4配体，例如本文所描述的3D-MPL。在本发明的进一步实施方案中，其它免疫刺激剂是本文所描述的QS21。在本发明的还进一步实施方案中，稀释剂包含QS21和3D-MPL。在该实施方案的一方面，稀释剂是包含QS21和3D-MPL的水包油乳化液。在该实施方案的另一个方面，稀释剂是包含QS21和3D-MPL的脂质体溶液。

现在参考下列非限制性实施例来进一步描述本发明。

实施例

实施例1：CpG寡核苷酸和作为抗原的CPC-P501S的冷冻干燥

使用的抗原是CPC-P501S。该抗原用图解法示于图1中，其中，表明TM2至TM12的部分代表P501S抗原；左边的椭圆形代表CPC融合伙伴，His尾部展示在右边。

用酿酒酵母中所示的His标签制备抗原，然后使用Tris(5mM pH7.5)和Tween80(0.3％)的缓冲液使其浓度为700μg/ml。

为了制备最终的本体，将蔗糖(35％)加入到注射用水中，并达到6.3％的最终浓度。然后加入Tris(1M pH8.8)，而后加入Tween 80(25％)，以达到0.2％的最后浓度。将该混合物在室温下磁力搅拌5分钟。加入CPC-P501S，并在室温下将该混合物磁力搅拌4分钟。然后加入SEQ IDNo：4的CpG寡聚体，并在室温下将得到的混合物磁力搅拌15分钟，得到最终的本体。该组合物分析如下：

	最终本体(500μl)	最终容器(500μl)人剂量
	最终本体(500μl)	最终容器(500μl)人剂量	饼块		用625μlAS01B重新构建之后
CPC-P501	125μg	100μg	饼块		用625μlAS01B重新构建之后
CPC-P501	125μg	100μg	CpG	625μg	500μg
Tris	50mM	40mM	CpG	625μg	500μg
Tris	50mM	40mM	Tween 80	0.50％	0.40％
蔗糖	6.3％	5.0％	Tween 80	0.50％	0.40％
蔗糖	6.3％	5.0％	pH	9.1+/-0.1	7.4+/-0.1

	最终本体(500μl)	最终容器(500μl)人剂量
	最终本体(500μl)	最终容器(500μl)人剂量	饼块		用625μlAS01B重新构建之后
CPC-P501	25μg	20μg	饼块		用625μlAS01B重新构建之后
CPC-P501	25μg	20μg	CpG	625μg	500μg
Tris	50mM	40mM	CpG	625μg	500μg
Tris	50mM	40mM	Tween 80	0.20％	0.16％
蔗糖	6.3％	5.0％	Tween 80	0.20％	0.16％
蔗糖	6.3％	5.0％	pH	9.1+/-0.1	7.4+/-0.1

将0.5ml组合物填充到玻璃管瓶中，对其完成冷冻干燥循环，如图2所示。

在37℃，对三个管瓶的组合物通过肉眼观察进行饼块表征，并在T0、1周、2周、3周和4周进行直径测定(参见图3)。在相同时点和温度下，使用热重法(TG)或Karl Fischer(KF)测定残余含湿量。如下面所示，饼块可稳定高达两周。

冷冻干燥的饼块

KF：卡尔费希尔法

TG：热重法

nd：未做

OK：既不聚集也不降解

Specs：3％(热重法)

在37℃保存期间(为了加快稳定性分析)，将最终容器中的湿度提高。在37℃，1个月之后，饼块包含1.3％水，并且收缩。在该实验中，湿度增加是由于吸湿性的粉末从塞子吸收水。用新型塞子来替换该塞子，可以有助于防止这种收缩。

然后将饼块与注射用水或与下面的载液重新构建：佐剂系统A(按照WO2005/112991中所列出的方法制备的脂质体佐剂)，佐剂系统E(按照WO2005/112991中所列出的方法制备的水包油乳化液佐剂)或佐剂系统F(按照WO2005/112991中所列出的方法制备的水包油乳化液佐剂)。

用注射用水、佐剂系统E或佐剂系统F，没有看到蛋白聚集或降解现象。用佐剂系统A，看到一些聚集和降解。推断这种现象是由于低于CPC-P501S的等电点下pH值降低。使Tris赋形剂的浓度增加至50mM，可以解决该问题，然后用佐剂系统A就不会看到聚集现象。还发现，当与佐剂系统A重新构建时，在冻干(lyo)饼块中存在CpG(即共同冷冻干燥的抗原和CpG寡核苷酸)可有助于防止抗原的聚集。在有和没有CpG条件下使用佐剂系统A，将冻干(lyo)饼块的重新构建进行比较，显示了在共同冷冻干燥之后聚集降低(数据未显示)。

还研究了赋形剂对佐剂系统A中脂质体大小的影响，人们发现，在单独佐剂系统A的管瓶中得到的脂质体、和在包含抗原、CpG、Tris与Tween的冻干(lyo)饼块重新构建之后的佐剂系统A的管瓶中得到的脂质体之间的大小没有差别。因此，我们可以断定，冻干(lyo)饼块的组分不影响佐剂系统(图4)

最后，研究了制剂的抗原性，人们发现，就淋巴组织增生和胞内细胞素(IFNγ)产物而言，在液体与CPC-P501S的冻干(lyo)制剂之间没有差别(数据未显示)。因此，我们可以断定，抗原的免疫原性不受与CpG的共同冷冻干燥所影响。

实施例2：CpG寡核苷酸和作为抗原的Mage-3的冷冻干燥

使用的抗原是与MAGE-3连接的蛋白D蛋白的一部分，其接着与His尾部连接，从而便于PD-Mage3-His的纯化(参见图5：SEQ ID NO：13)。

在大肠杆菌中，用His标签制备纯化的本体抗原，然后使用NaH₂PO₄.2H₂O/K2HPO₄.2H₂O(2mM)和Tween80(大约0.2％v/v(理论))的缓冲液(pH7.5)，使其浓度变为750μg/ml。

为了制备最终的本体，将蔗糖(30％)加入到注射用水中，得到3.15％的最终浓度。然后加入NaH₂PO₄.2H₂O/K₂HPO₄.2H₂O(100mm，pH7.5)，得到5mM的最终PO₄浓度，将抗原缓冲液中的磷酸盐考虑进去。还加入Tween 80(3％)，得到0.15％的最后浓度，将抗原缓冲液中的Tween算进去。将该混合物在室温下磁力搅拌5至15分钟。加入PD-Mage3-His(750μg/ml)，并在室温下将混合物磁力搅拌5-15分钟。然后加入SEQ ID No：4的CpG寡聚物，并在室温下将得到的混合物磁力搅拌15分钟(+/-5分钟)，得到最终的本体。用NaOH(0.05M或0.5M)或HCl(0.03M或0.3M)将pH值调节至pH7.5+/-0.1。

该组合物分析如下：

将0.5ml这种组合物填充到玻璃管瓶中，对其完成冷冻干燥循环，如图6所示。

将饼块在37℃储存7至9天之后，分析赋形剂和冷冻-干燥循环对饼块组合物的影响。

饼块外观和残余湿度

饼块外观	没有破裂(T0)	没有收缩(T7天37℃)
饼块外观	没有破裂(T0)	没有收缩(T7天37℃)	残余湿度	-	0.59％(T8天37℃)

能够看出，在第7天，饼块不存在任何破裂现象，并且到第8天，应力稳定性没有改变。

在37℃保存7至9天的饼块的残余湿度低于3％的标准。

在37℃储存7至9天之后，直径没有变化。

然后将饼块与佐剂系统A(按照WO2005/112991所列出的方法制备的脂质体佐剂)进行重新构建。没有看到蛋白聚集或降解现象，由此证明，抗原可以与CpG共同冷冻干燥，不会影响它的重新构建能力。

研究了制剂的抗原性。人们发现，在佐剂系统A中重新构建之后，24小时之后，抗原性随时间的增加而降低。人们认为，这是由于重新构建之后得到的酸性pH值(6.2+/-0.1)造成的。当发现抗原性的降低可以通过提高pH值而减小时，可以证明这个结论。然而，随着时间的推移，抗原性还是有一些降低。因此，将该制剂进行试验，以便看看是否这种降低会对体内效能试验有影响。将人剂量的3/10、1/10和1/30的稀释物给予几组小鼠，每组10个小鼠，如图7所示。将小鼠在第28天进行放血。

T0、4h和24h是饼块与佐剂系统A重新构建之后的时间。如图7所示，对效能没有影响。

实施例3：CpG对重新构建之后抗原溶解性的影响

1.WT1是最初发现在儿科肾癌(Wilm′s肿瘤)中过度表达的蛋白。在目前情况下，可以使用的候选抗原使用了接近全长的蛋白作为抗原。WT1-A10蛋白是在大肠杆菌中表达的292 AA重组融合蛋白，由12mer截短的tat序列(前导序列)和WT1序列的氨基酸数目2-281组成。将这种抗原单独冷冻干燥之后，如果与佐剂系统A重新构建，由于它的等电点(5.85至7.5)接近佐剂系统A的pH值(6.1)并且在佐剂系统A中存在氯化钠，这种抗原沉淀。

制备WT1-A10的两个制剂。重新构建剂量包含400μg/ml WT1-A10抗原、10％蔗糖、100mM Tris和0.2％ Tween 80，加上或减去840μg/mlCpG。

将两个制剂与500μl佐剂系统A进行重新构建。将得到的液体离心，对未离心液体(NC)、上清液(SN)和球粒(P)进行Western印迹(blot)。结果示于图8中。

正如在图8中所看到的那样，在CpG的存在下，重新构建之后的抗原的溶解性提高，这可以由沉淀球粒中缺乏抗原而得到证明。可以在重新构建冷冻干燥组合物(其中冻干(lyo)饼块不包含CpG)的球粒中看到沉淀的抗原。这证明，在非带正电荷的抗原的情况下，CpG的共同冷冻干燥可以在重新构建时提高抗原的溶解性。

2.PRAME

制备PRAME的两个制剂。重新构建剂量包含1000μg/ml PRAME抗原、3.15％蔗糖、5mM硼酸盐、150nM氯化钠，加上或减去840μg/mlCpG。将两个制剂与500μl佐剂系统A进行重新构建。将得到的液体离心，对未离心液体(NC)、上清液(SN)和球粒(P)进行Western印迹。结果示于图9中，其中NC＝未离心，SN＝上清液，P＝球粒

正如在图9中所看到的那样，在CpG的存在下，重新构建之后的抗原的溶解性提高，这可以由沉淀球粒中缺乏抗原而得到证明。可以在重新构建冷冻干燥组合物(其中冻干(lyo)饼块不包含CpG)的球粒中看到沉淀的抗原。这进一步证明，在非带正电荷的抗原的情况下，CpG的共同冷冻干燥可以在重新构建时提高抗原的溶解性。

SEQ ID NO：1

TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT

SEQ ID NO：2

TCT CCC AGC GTG CGC CAT

SEQ ID NO：3

ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG

SEQ ID NO：4

TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT

SEQ ID NO：5

TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT

SEQ ID NO：6

MKVKETRKNY QHLWRWGTML LGMLMICSAA EQLWVTVYYG VPVWKEATTT 50

LFCASDAKAY DTEVHNVWAT HACVPTDPNP QEVVLGNVTE YFNMWKNNMV 100

DQMHEDIISL WDQSLKPCVK LTPLCVTLDC DDVNTTNSTT TTSNGWTGEI 150

RKGEIKNCSF NITTSIRDKV QKEYALFYNL DVVPIDDDNA TTKNKTTRNF 200

RLIHCNSSVM TQACPKVSFE PIPIHYCAPA GFAILKCNNK TFDGKGLCTN 250

VSTVQCTHGI RPVVSTQLLL NGSLAEEEVV IRSDNFMDNT KTIIVQLNES 300

VAINCTRPNN NTRKGIHIGP GRAFYAARKI IGDIRQAHCN LSRAQWNNTL 350

KQIVIKLREH FGNKTIKFNQ SSGGDPEIVR HSFNCGGEFF YCDTTQLFNS 400

TWNGTEGNNT EGNSTITLPC RIKQIINMWQ EVGKAMYAPP IGGQIRCSSN 450

ITGLLLTRDG GTEGNGTENE TEIFRPGGGD MRDNWRSELY KYKVVKVEPL 500

GVAPTRAKRR VVQR 514

SEQ ID NO：7

1 MRVMEIQRNC QHLLRWGIMI LGMIIICSTA DNLWVTVYYG VPVWRDAETT

51 LFCASDAKAY STEKHNVWAT HACVPTDPNP QEIPLDNVTE EFNMWKNNMV

101 DQMHEDIISL WDQSLKPCVQ LTPLCVTLNC SNARVNATFN STEDREGMKN

151 CSFNMTTELR DKKQQVYSLF YRLDIEKINS SNNNSEYRLV NCNTSAITQA

201 CPKVTFEPIP IHYCAPAGFA ILKCNDTEFN GTGPCKNVST VQCTHGIKPV

251 VSTQLLLNGS LAEREVRIRS ENIANNAKNI IVQFASPVKI NCIRPNNNTR

301 KSYRIGPGQT FYATDIVGDI RQAHCNVSRT DWNNTLRLVA NQLRKYFSNK

351 TIIFTNSSGG DLEITTHSFN CGGEFFYCNT SGLFNSTWTT NNMQESNDTS

401 NGTITLPCRI KQIIRMWQRV GQAMYAPPIE GVIRCESNIT GLILTRDGGN

451 NNSANETFRP GGGDIRDNWR SELYKYKVVK IEPLGVAPTR AKRRVVEREK

501 RAVGIGAVFL GFLGAAGSTM GAASITLTVQ ARQLLSGIVQ QQSNLLRAIE

551 AQQQLLKLTV WGIKQLQARV LAVERYLRDQ QLLGIWGCSG KLICTTNVPW

601 NSSWSNKSYD DIWQNMTWLQ WDKEISNYTD IIYSLIEESQ NQQEKNEQDL

651 LALDKWANLW NWFDISKWLW YIRS

SEQ ID NO：8

1 MGARASVLSG GELDRWEKIR LRPGGKKKYK LKHIVWASRE LERFAVNPGL

51 LETSEGCRQI LGQLQPSLQT GSEELRSLYN TVATLYCVHQ RIEIKDTKEA

101 LDKIEEEQNK SKKKAQQAAA DTGHSNQVSQ NYPIVQNIQG QMVHQAISPR

151 TLNAWVKVVE EKAFSPEVIP MFSALSEGAT PQDLNTMLNT VGGHQAAMQM

201 LKETINEEAA EWDRVHPVHA GPIAPGQMRE PRGSDIAGTT STLQEQIGWM

251 TNNPPIPVGE IYKRWIILGL NKIVPMYSPT SILDIRQGPK EPFRDYVDRF

301 YKTLRAEQAS QEVKNWMTET LLVQNANPDC KTILKALGPA ATLEEMMTAC

351 QGVGGPGHKA RVLMGPISPI ETVPVKLKPG MDGPKVKQWP LTEEKIKALV

401 EICTEMEKEG KISKIGPENP YNTPVFAIKK KDSTKWRKLV DFRELNKRTQ

451 DFWEVQLGIP HPAGLKKKKS VTVLDVGDAY FSVPLDEDFR KYTAFTIPSI

501 NNETPGIRYQ YNVLPQGWKG SPAIFQSSMT KILEPFRKQN PDIVIYQYMD

551 DLYVGSDLEI GQHRTKIEEL RQHLLRWGLT TPDKKHQKEP PFLKMGYELH

601 PDKWTVQPIV LPEKDSWTVN DIQKLVGKLN WASQIYPGIK VRQLCKLLRG

651 TKALTEVIPL TEEAELELAE NREILKEPVH GVYYDPSKDL IAEIQKQGQG

701 QWTYQIYQEP FKNLKTGKYA RMRGAHTNDV KQLTEAVQKI TTESIVIWGK

751 TPKFKLPIQK ETWETWWTEY WQATWIPEWE FVNTPPLVKL WYQLEKEPIV

801 GAETFYVDGA ANRETKLGKA GYVTNRGRQK VVTLTDTTNQ KTELQAIYLA

851 LQDSGLEVNI VTDSQYALGI IQAQPDQSES ELVNQIIEQL IKKEKVYLAW

901 VPAHKGIGGN EQVDKLVSAG IRKVLMVGFP VTPQVPLRPM TYKAAVDLSH

951 FLKEKGGLEG LIHSQRRQDI LDLWIYHTQG YFPDWQNYTP GPGVRYPLTF

1001 GWCYKLVPVE PDKVEEANKG ENTSLLHPVS LHGMDDPERE VLEWRFDSRL

1051 AFHHVARELH PEYFKNC

SEQID NO：9

atggttatcgtgcagaacatccaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctagaactttaaatgcatggg

taaaagtagtagaagagaaggctttcagcccagaagtaatacccatgttttcagcattatcagaaggagccac

cccacaagatttaaacaccatgctaaacacagtggggggacatcaagcagccatgcaaatgttaaaagagacc

atcaatgaggaagctgcagaatgggatagagtacatccagtgcatgcagggcctattgcaccaggccagatga

gagaaccaaggggaagtgacatagcaggaactactagtacccttcaggaacaaataggatggatgacaaataa

tccacctatcccagtaggagaaatttataaaagatggataatcctgggattaaataaaatagtaagaatgtat

agccctaccagcattctggacataagacaaggaccaaaagaaccttttagagactatgtagaccggttctata

aaactctaagagccgagcaagcttcacaggaggtaaaaaattggatgacagaaaccttgttggtccaaaatgc

gaacccagattgtaagactattttaaaagcattgggaccagcggctacactagaagaaatgatgacagcatgt

cagggagtaggaggacccggccataaggcaagagttttg

ggccccattagccctattgagactgtgt

cagtaaaattaaagccaggaatggatggcccaaaagttaaacaatggccattgacagaagaaaaaataaaagc

attagtagaaatttgtacagagatggaaaaggaagggaaaatttcaaaaattgggcctgaaaatccatacaat

actccagtatttgccataaagaaaaaagacagtactaaatggagaaaattagtagatttcagagaacttaata

agagaactcaagacttctgggaagttcaattaggaataccacatcccgcagggttaaaaaagaaaaaatcagt

aacagtactggatgtgggtgatgcatatttttcagttcccttagatgaagacttcaggaaatatactgcattt

accatacctagtataaacaatgagacaccagggattagatatcagtacaatgtgcttccacagggatggaaag

gatcaccagcaatattccaaagtagcatgacaaaaatcttagagccttttagaaaacaaaatccagacatagt

tatctatcaatacatggatgatttgtatgtaggatctgacttagaaatagggcagcatagaacaaaaatagag

gagctgagacaacatctgttgaggtggggacttaccacaccagacaaaaaacatcagaaagaacctccattcc

ttaaaatgggttatgaactccatcctgataaatggacagtacagcctatagtgctgccagaaaaagacagctg

gactgtcaatgacatacagaagttagtggggaaattgaattgggcaagtcagatttacccagggattaaagta

aggcaattatgtaaactccttagaggaaccaaagcactaacagaagtaataccactaacagaagaagcagagc

tagaactggcagaaaacagagagattctaaaagaaccagtacatggagtgtattatgacccatcaaaagactt

aatagcagaaatacagaagcaggggcaaggccaatggacatatcaaatttatcaagagccatttaaaaatctg

aaaacaggaaaatatgcaagaatgaggggtgcccacactaatgatgtaaaacaattaacagaggcagtgcaaa

aaataaccacagaaagcatagtaatatggggaaagactcctaaatttaaactgcccatacaaaaggaaacatg

ggaaacatggtggacagagtattggcaagccacctggattcctgagtgggagtttgttaatacccctccttta

gtgaaattatggtaccagttagagaaagaacccatagtaggagcagaaaccttctatgtagatggggcagcta

acagggagactaaattaggaaaagcaggatatgttactaatagaggaagacaaaaagttgtcaccctaactga

cacaacaaatcagaagactgagttacaagcaatttatctagctttgcaggattcgggattagaagtaaacata

gtaacagactcacaatatgcattaggaatcattcaagcacaaccagatcaaagtgaatcagagttagtcaatc

aaataatagagcagttaataaaaaaggaaaaggtctatctggcatgggtaccagcacacaaaggaattggagg

aaatgaacaagtagataaattagtcagtgctggaatcaggaaagtgcta

ggtggcaagtggtcaaaa

agtagtgtggttggatggcctactgtaagggaaagaatgagacgagctgagccagcagcagatggggtgggag

cagcatctcgagacctggaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgc

ctggctagaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgact

tacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaac

gaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattggcagaactacacacc

agggccaggggtcagatatccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggta

gaagaggccaataaaggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgaga

gagaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccggagta

cttcaagaactgc

atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaa

attcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaac

gattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatc

ccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaagg

atagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcac

agcaagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattactaa

SEQ ID NO：10

MVIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATP 50

QDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREP 100

RGSDIAGTTSTLQEQIGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTS 150

ILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCK 200

TILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARVL

GPISPIETVSVKLKPG 250

MDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKK 300

KDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAY 350

FSVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMT 400

KILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLT 450

TPDKKHQKEPPFL

MGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLN 500

WASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVH 550

GVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMRGAHTNDV 600

KQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWE 650

FVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETFYVDGAANRETKLGKAGYVTNRGRQK 700

VVTLTDTTNQKTELQAIYLALQDSGLEVNIVTDSQYALGIIQAQPDQSES 750

ELVNQIIEQLIKKEKVYLAWVPAHKGIGGNEQVDKLVSAGIRKV

MGGK 800

WSKSSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNAA 850

CAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQ 900

RRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVE 950

EANKGENTSLLHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFK 1000

NC

MGARASVLSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAV 1050

NPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKD 1100

TKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY 1136

SEQ ID NO：11

1 MAARASILSG GKLDAWEKIR LRPGGKKKYR LKHLVWASRE LDRFALNPSL

51 LETTEGCQQI MNQLQPAVKT GTEEIKSLFN TVATLYCVHQ RIDVKDTKEA

101 LDKIEEIQNK SKQKTQQAAA DTGDSSKVSQ NYPIIQNAQG QMIHQNLSPR

151 TLNAWVKVIE EKAFSPEVIP MFSALSEGAT PQDLNVMLNI VGGHQAAMQM

201 LKDTINEEAA EWDRLHPVQA GPIPPGQIRE PRGSDIAGTT STPQEQLQWM

251 TGNPPIPVGN IYKRWIILGL NKIVRMYSPV SILDIKQGPK EPFRDYVDRF

301 FKALRAEQAT QDVKGWMTET LLVQNANPDC KSILKALGSG ATLEEMMTAC

351 QGVGGPGHKA RVLAEAMSQA QQTNIMMQRG NFRGQKRIKC FNCGKEGHLA

401 RNCRAPRKKG CWKCGKEGHQ MKDCTERQAN FLGKIWPSSK GRPGNFPQSR

451 PEPTAPPAEL FGMGEGIASL PKQEQKDREQ VPPLVSLKSL FGNDPLSQGS

501 PISPIETVPV TLKPGMDGPK VKQWPLTEEK IKALTEICTE MEKEGKISKI

551 GPENPYNTPI FAIKKKDSTK WRKLVDFREL NKRTQDFWEV QLGIPHPAGL

601 KKKKSVTVLD VGDAYFSVPL DENFRKYTAF TIPSTNNETP GVRYQYNVLP

651 QGWKGSPAIF QSSMTKILEP FRSKNPEIII YQYMAALYVG SDLEIGQHRT

701 KIEELRAHLL SWGFTTPDKK HQKEPPFLWM GYELHPDKWT VQPIMLPDKE

751 SWTVNDIQKL VGKLNWASQI YAGIKVKQLC RLLRGAKALT DIVTLTEEAE

801 LELAENREIL KDPVHGVYYD PSKDLVAEIQ KQGQDQWTYQ IYQEPFKNLK

851 TGKYARKRSA HTNDVRQLAE VVQKVAMESI VIWGKTPKFK LPIQKETWET

901 WWMDYWQATW IPEWEFVNTP PLVKLWYQLE KDPILGAETF YVDGAANRET

951 KLGKAGYVTD RGRQKVVSLT ETTNQKTELH AILLALQDSG SEVNIVTDSQ

1001 YALGIIQAQP DRSESELVNQ IIEKLIGKDK IYLSWVPAHK GIGGNEQVDK

1051 LVSSGIRKVL FLDGIDKAQE DHERYHSNWR TMASDFNLPP IVAKEIVASC

1101 DKCQLKGEAM HGQVDCSPGI WQLACTHLEG KVILVAVHVA SGYIEAEVIP

1151 AETGQETAYF LLKLAGRWPV KVVHTANGSN FTSAAVKAAC WWANIQQEFG

1201 IPYNPQSQGV VASMNKELKK IIGQVRDQAE HLKTAVQMAV FIHNFKRKGG

1251 IGGYSAGERI IDIIATDIQT KELQKQITKI QNFRVYYRDS RDPIWKGPAK

1301 LLWKGEGAVV IQDNSDIKVV PRRKAKILRD YGKQMAGDDC VAGRQDEDRS

1351 MGGKWSKGSI VGWPEIRERM RRAPAAAPGV GAVSQDLDKH GAITSSNINN

1401 PSCVWLEAQE EEEVGFPVRP QVPLRPMTYK GAFDLSHFLK EKGGLDGLIY

1451 SRKRQEILDL WVYHTQGYFP DWQNYTPGPG VRYPLTFGWC FKLVPMEPDE

1501 VEKATEGENN SLLHPICQHG MDDEEREVLI WKFDSRLALK HRAQELHPEF

1551 YKDC

SEQ ID NO：12

蛋白D_H流感 (1)MKLKTLALSLLAAGVLAGCSSHSSNMANTQMKSDKIIIAHRGASGYLPEH

51)TLESKALAFAQQADYLEQDLAMTKDGRLVVIHDHFLDGLTDVAKKFPHRH(101)RKDGRYYVIDFTLKEIQSLEMTENFET

Claims

1.冷冻干燥组合物，其包含一种或多种抗原和TLR9激动剂。

2.按照权利要求1的组合物，其中所述TLR9激动剂是免疫刺激寡核苷酸。

3.按照权利要求2的组合物，其中所述免疫刺激寡核苷酸是包含CpG的寡核苷酸。

4.按照权利要求3的组合物，其中所述免疫刺激寡核苷酸包含嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧啶序列。

5.权利要求2至4所要求的组合物，其中所述免疫刺激寡核苷酸选自包含下列的组：

TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(SEQ ID NO：1)；

TCT CCC AGC GTG CGC CAT(SEQ ID NO：2)；

ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG(SEQ ID NO：3)；

TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(SEQ ID NO：4)；

TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(SEQ ID NO：5)。

6.按照权利要求2至4的任一项的组合物，其中免疫刺激寡核苷酸包含至少两个未甲基化的CG重复单元，其至少被3个核苷酸分离。

7.按照权利要求6的组合物，其中免疫刺激寡核苷酸包含至少两个未甲基化的CG重复单元，其被6个核苷酸分离。

8.按照权利要求1至8的任一项的组合物，其中所述抗原不是带正电荷的抗原。

9.按照权利要求1至8的任一项的组合物，其中一种或多种所述抗原是肿瘤相关的抗原。

10.按照权利要求9的组合物，其中所述抗原选自：MAGE-3、CPC-P501S、WT-1。

11.按照权利要求1至8的任一项的组合物，其中至少一种所述抗原是HIV-1衍生的抗原。

12.按照权利要求11的组合物，其中一种所述抗原是F4。

13.按照权利要求11或12的组合物，其中所述抗原是F4和gp120。

14.按照权利要求1至12的任一项的冷冻干燥组合物的制备方法，其包括下面的步骤：将目标抗原和TLR9配体与合适赋形剂混合，并且对得到的制剂进行冷冻干燥循环。

15.制备免疫原性组合物的方法，其包括下面的步骤：将权利要求1至12的任一项的冷冻干燥组合物与合适载体进行重新构建。

16.按照权利要求14的方法，其中所述载体是选自包含下述的组的颗粒：无机盐，乳液，聚合物，脂质体，ISCOMs。

17.按照权利要求15的方法，其中所述载体是脂质体溶液或水包油乳化液。

18.按照权利要求14至16的任一项的方法，其中所述载体进一步包含一或多种免疫刺激剂。

19.按照权利要求17的方法，其中上述一或多种免疫刺激剂选自TLR4激动剂，TLR4拮抗剂，皂草苷，TLR7激动剂，TLR8激动剂，TLR9激动剂。

20.按照权利要求18的方法，其中所述TLR 4拮抗剂是3-脱酰化的MPL。

21.按照权利要求18或19的方法，其中所述皂草苷是QS21。

22.按照权利要求17的方法，其中所述载体包含两种免疫刺激剂。

23.按照权利要求21的方法，其中所述免疫刺激剂是3-脱酰化的MPL和QS21。