TW200911304A - Lyophillised antigen composition - Google Patents

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TW200911304A
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Dominique Ingrid Lemoine
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Glaxosmithkline Biolog Sa
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200911304 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於經改良抗原性組合物及使用該等組合物製 備免疫原性組合物之方法。具體而言，本發明係關於包含 抗原及類鐸受體（TLR)9激動劑之冷凍乾燥組合物。可用選 * 自由以下組成之微粒載劑群之載劑將該等組合物重構為用 • 於疫苗接種之免疫原性組合物：脂質體、礦物鹽、乳液、 聚合物及ISCOM。本發明亦包括自本發明冷凍乾燥組合物 〇 製備免疫原性組合物之方法及該等在免疫中之用途。 【先前技術】 有時使用佐劑以改良針對任一給定抗原產生之免疫響 應然而將佐劑引入疫苗或免疫原性組合物會增加製備組 ' 份之複雜性以及分配及調配疫苗組合物之複雜性。調配者 必須考慮每種佐劑組份以及抗原性組份之製備。尤其因為 (例如）在溶液中佐劑組份之PH與給定抗原之最適PH可能差 異極大且必須仔細控制及管理該等差異以防止（例如）沈澱 1 或、且伤期鲨特性之損失，因此更須如此。在注射用水中， 抗原之PH可為（例如）約pH 7或略高且在添加佐劑時pH可低 至PH 6.3。例如，當在此pH下儲存延長時間時抗原可能不 穩定。 因此必須以盡可能穩定之形式調配及分配組份，因為人 用醫藥甚σ 4 ' ’、°σ在其被批准銷售前必須詳細確定其性質且必須 施有=疋性及安全性。由於此原因，必須對最終調配物實 施長期％定性研究以確保其符合相關標準。使用在該等長 131205.doc 200911304 :^中所獲得之f訊來支持向諸如F β A (聯邦藥品管理 =Drugs Authority)_在美國負責批准藥品之部門) 專i官機構提出之申報以顯示產品適用於人類。
通常使料乾或冷耗㈣增強包括諸如疫苗 原等醫藥材料之材料的穩定性且由此延長其儲存壽命。几 經常將冷凌乾燥抗原性組合物提供至衛生保健行業，用 於在即將投與患者之前以稀釋劑（例如注射用水陶]或在 某些情況下為液體佐劑調配物）重構。以此方式可使最終 疫苗中各組份維持彼此緊鄰之時間最小化。 當將抗原冷;東乾燥以形成;東乾餅（冷;東乾燥之乾燥產物） 時必須考慮多個㈣。舉例而言，在冷;東乾燥形式中應維 持抗原之抗隸/免疫隸。在冷;東乾燥形式中抗原不能 凝集或降解。綠餅必須經良好成形以破裂。最後，在 重構時抗原當然必須呈可快速溶解之形式。倘若重構用溶 液並非僅為WFI(例如當用液體佐劑重構抗原時），則需要 考慮溶液組份對所重構產物特性之影響。 如上所述，多年來人們—直使用佐劑來改良對疫苗之抗 原r生.、且伤之免疫響應。尤其有效之佐劑組合係包括％去醯 基化-單磷醯酯A (3D-MPL)及皂苷（尤其QS21，即自智利皂 莢樹（Quillaja saponaria M〇nara)樹皮提取之皂苷之純化部 分）之組合。此組合可以（例如）水包油乳液、脂質體調配 物、或類似形式來提供。 在使用抗原（例如使用諸如RTS，S等瘧疾抗原）之先前臨 床實驗中，提供經冷凍乾燥之抗原且亦提供單獨瓶之液體 131205.doc 200911304 佐劑，例如用於重構抗原之MPL及QS2 1之水包油調配物或 MPL及QS21之脂質體調配物。在即將投與前將單獨組份組 合以形成最終疫苗組合物。 某些含有未甲基化CpG二核苷酸（"CpG")之免疫刺激性寡 核苷酸係TLR9配體且已鑒定為在藉由全身及黏膜途徑投 與時所用佐劑（WO 96/02555、歐洲專利第468520號、 Davis等人，J./wm⑽〇/，1998，160(2):870-876 ; McCluskie 及 Davis，J./wm㈣〇/·，1998，161(9):4463-6)。CpG係存於 DNA中之胞嘧啶-鳥嘌呤核苷二核苷酸基元之縮寫。在歷 史上’曾觀察到BCG之DNA部分可發揮抗腫瘤效應。在進 一步研究中’衍生自BCG基因序列之合成寡核苷酸顯示能 誘導免疫刺激效應（在活體外及活體内均可）。該等研究之 主持者推斷某些回文序列（包括中心CG基元）具有此活性。 CG基元在免疫刺激中之主要作用隨後闡明於Krieg之公開 文獻（Nature 3 74，第546頁，1995)中。詳細分析表明CG基 元必須處於某一序列文本中且該等序列在細菌DNA中常見 但在脊椎動物DNA中罕見。免疫刺激序列通常為：嘌呤、 嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶；其中二核苷酸CG基元未經甲 基化但已知其他未甲基化CpG序列具有免疫刺激性且可 用於本發明中。 亦顯示當鳥嘌吟核苷突變為7_脫氮鳥嘌呤核苷基元時免 疫刺激性募核苷酸可保留免疫活性（W〇 〇3〇57822)。 據認為該等免疫刺激性寡核苷酸在溶液中具有酸性pH， 例如低於pH 7，例如6.3、ό. 1或更低。此可導致難於將其 131205.doc 200911304 納入液體疫苗調配物中，因為其與調配物中之其他組份不 同。如上所述，此可導致沈澱及/或長期穩定性問題。 據認為，該等免㈣激性寡核㈣可㈣極有效佐劑， • 尤其當與諸如扣…扎與QS2i等現存佐劑組合一起使用 '。人們期望該等佐劑可用於諸如贈、癌症及(可能)癔 疾等迄今為止尚難以獲得有效疫苗之疾病。 可以多種不同方式將佐劑引入疫苗中，但其引入方式必 須不能影響其自身或抗原性組合物之穩定性，且亦不會對 〇 健醫師重構疫苗帶來過多麻煩。達成此目的之最簡單方 式係將額外組份置於額外瓶中以使其在即將重構之前始終 保持分離，由此使組份互相影響之時間最小化。此意指各 自在單獨瓶中提供抗原及免疫刺激性寡核苷酸。且若使用 - 諸如MPL及QS21等其他佐劑組份，其可作為存於第三瓶中 之液體混合物來提供。然而，瓶數量增加及其中組份數量 之增加導致成本、廢物增加，且重要的係導致構建期間失 誤的可能性増加。 【發明内容】 本發明人已發現當欲將諸如CPG免疫刺激性寡核苷酸等 TLR9配體作為佐劑引入免疫原性組合物中時該几奶配 體可與抗原一起冷凍乾燥以提供含有共存於一凍乾餅中之 抗原及TLR9配體佐劑之單一瓶。 由此本發明提供包含抗原及TLR9激動劑之冷凍乾燥組 合物。在一實施例中’該TLR9激動劑係免疫刺激性寡核 苷酸，可能為含有募核苷酸之CpG。在一態樣中，該含有 131205.doc 200911304 寡核苷酸之CpG包含嘌呤、嘌呤、c、g、嘧啶、嘧啶序 列。在另一態樣中’該免疫刺激性寡核苷酸係選自由以下 組成之群：SEQ ID NO:l ; SEQ ID NO:2 ; SEQ ID NO:3 ; SEQ ID NO:4 ;及 SEQ ID NO:5。 不期望受理論束缚’據認為與僅將TLR9添加至MPL與 QS21之液體調配物中相比，一起提供抗原與TLR9激動劑 - 可提供更穩定之組份。 本發明具有以下優勢：倘若用WFI重構抗原與TLR9激動 刈，則能提供僅一瓶冷凍乾燥調配物。此外，倘若用諸如 液體佐劑調配物等液體調配物重構抗原與TRL9激動劑， 則有利地僅能提供兩瓶組份（而非三瓶）。此進而具有成本 益處，同時提供當重構後適合用作疫苗之產品。 此外，本發明人已發現CpG與在重構緩衝液中不具有總 正電荷之抗原共冷凍乾燥可增加彼等抗原在用注射用水或 /夜體佐劑重構後之溶解度。由此本發明亦提供當抗原在重 #緩衝液中不具有淨正電荷時增加冷;東乾燥抗原重構後溶 ，解度之方法，其包括將TLR9激動劑（較佳為免疫刺激性寡 核苷酸且更佳為CpG寡核苷酸）與抗原共冷凍乾燥之步驟。 轉明亦提供TLR9激動劑（較佳為免疫刺激性寡核普酸且 更佳為CpG寡核苷酸）在增加經冷凍乾燥不 :重構後溶解度之用途。”不帶正電荷”意指蛋白質之總： 何不為正。蛋白質可含有正電荷及負電荷二者，但蛋白質 之總電荷為中性或為負。 本發明亦提供製備免疫原性組合物之方法，其包括如本 131205.doc 200911304 文所述用適宜載劑重構冷凍乾燥組合物之方法。在—實施 例中’該載劑為脂質體溶液或水包油乳液。該栽劑可視需 要含有一或多種免疫刺激劑’該等免疫刺激劑可係選自由 以下組成之群：TLR4激動劑、TLR4拮抗劑、皂苷、TLR7 激動劑、TLR8激動劑、TLR9激動劑。在一實施例中，該 載劑含有兩種或更多種免疫刺激劑，且在一態樣中該等免 疫刺激劑可為3-去醯基化MPL及QS21。 本發明亦提供製備本發明冷凍乾燥組合物之方法，其包 括將一或多種期望抗原、TLR9配體與適宜賦形劑組合且 )東乾所得混合物。 【實施方式】 本發明者已發現諸如CpG寡核苷酸等TLR9配體可與目標 抗原一起冷凍乾燥而不影響該抗原之抗原性或穩定性。 TLR9配體意指可與TLR9受體交互作用之化合物。 已顯不首先在果蠅屬（Drosophila)中發現之類鐸受體 (TLR)家族之成員係模式識別受體，每個成員識別且響應 不同微生物組份以限制/消滅入侵微生物。病原相關分子 模式（PAMP)與TLR之結合誘導反應性氧氮中間體之產生、 促炎細胞因子網絡之啓動、及與獲得性免疫之快速先天性 響應相關之共刺激分子之增晋烟銘 -, /7 丁心if 1。周即。已知多種TLR配體可 用作佐劑。已顯示TLR9可響應寡核諸激動劑。因此本 發明TLR9配體為免疫刺激性寡核苷酸。在本發明一實施 例中’該等T L R 9配體含右p n r且- it δ有CpG基％。替代性免疫刺激性寡 核普酸可包含對核*酸之修飾。舉例而言，w⑽26757及 131205.doc -10- 200911304 WO03 05 7822揭示對含有免疫刺激性募核苷酸之CpG之C及 G部分之修飾。 在一實施例中，TLR9配體係CpG寡核苷酸。在此實施例 之一態樣中，CpG寡核苷酸含有由至少三個、可能至少六 個或更多個核苷酸隔開之兩個或更多個二核苷酸CpG基 元。本發明寡核苷酸通常為脫氧核苷酸。在一實施例中， 募核苷酸中之核苷酸間鍵結係二硫代磷酸酯鍵或可能為硫 代磷酸酯鍵，但亦可使用磷酸二酯鍵及其他核苷酸間鍵 結，包括具有混合核苷酸間鍵結之寡核苷酸。製造硫代磷 酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯之方法闡述於美國專利第 5,666,153號、美國專利第5,278,302號及贾〇95/26204中。 本發明涵蓋包含不同核苷酸間鍵結（例如混合硫代磷酸酯 磷酸二酯鍵）之寡核苷酸。可使用穩定寡核苷酸之其他核 普酸間鍵結。
CpG寡核苷酸之實例具有以下序列。在一實施例中，該 等序列含有經硫代磷酸酯修飾之核苷酸間鍵結。 OLIGO 1 (SEQIDNO:l): TCC ATGACGTTC CTG ACGTT(CpG 1826) OLIGO 2 (SEQ ID NO:2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) OLIGO 3 (SEQ ID NO:3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG OLIGO 4 (SEQ ID NO:4): TCG TCG ΊΊΤ TGT CGT ΤΤΓ GTC GTT (CpG 2006) OLIGO 5 (SEQ ID NO:5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) 替代性CpG寡核苷酸可包含上述序列，因為該等序列内 具有不連貫缺失或添加。 用於本發明之CpG寡核苷酸可藉由業内已知之任何方法 131205.doc 200911304 來合成（例如歐洲專利第468520號）。為方便起見該等寡 核苷酸可使用自動合成器來合成。 在本說明書上下文中，術語"抗原"欲意指適合產生特定 免疫響應且適合引入疫苗或免疫原性組合物中之免疫原性 組份，例如用於引AHIV_i疫苗、癌症疫苗、癔疾疫苗、 TB疫苗或諸如此類中之抗原。下文詳細闡述具體抗原。 在一實施例中，抗原之等電點為96或更低。在一實施 例中，抗原之等電點為9或更低。在一實施例中，抗原之 等電點為8_5或更低。在—實施例中，抗原之等電點為8 〇 或更低。在一實施例中，抗原之等電點為7·5。在一實施 例中，抗原之等電點介於7與8之間。 在緩衝液中重構時蛋白質之淨電荷取決於蛋白質中之正 電荷數對負電荷數，當然此電荷可端視重構緩衝液之ρΗ而 變化。等電點係蛋白質淨電荷為中性時2ρΗ。若重構緩衝 液之pH低於抗原之等電點，則蛋白質傾向於具有淨正電 荷。若重構緩衝液之pH高於抗原之等電點，則蛋白質傾向 於具有淨負電荷。當對在既定重構緩衝液中其等電點可使 蛋白質具有淨負電荷之抗原實施冷凍乾燥及重構時，本發 明尤其可用。在該等情況下（見實例3)，冷凍乾燥組合物中 存在CpG可增加抗原在重構緩衝液中之溶解度。 在實施例中，以一劑量提供冷凍乾燥抗原及TLR9激 動劑’例如在一瓶中提供。 在實施例中’冷;東乾燥抗原之存在量在重構時可提供 10至250 pg之抗原滚度。 131205.doc -12· 200911304 在一實施例中，TRL9激動劑之存在量可在重構時可提 供10至1000 pg(例如500 pg)之濃度。 在本發明一實施例中，在冷凍乾燥組合物中與tlR9配 體組合之抗原可為抗腫瘤抗原。因此，使用本發明冷凍乾 燥抗原性組合物製備之免疫原性組合物可用於癌症之免疫 • 治療性治療。舉例而言，冷凍乾燥組合物可用本文所述癌 症抗原'腫瘤抗原或腫瘤排斥抗原來製備，尤其例如在以 下癌症中表現之彼等蛋白質：前列腺癌、乳癌、結腸直腸 癌、肺癌、腎癌、卵巢癌、肝癌及頭頸癌。 可用於本發明中之癌睪丸抗原包括MAGE A抗原家族， 即 MAGE-A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、 A10、All 及 A12(亦稱為 mage]、2、3、4、5、6、7、 8、9、1〇、11、12) ; MAGE B抗原，即MAGE Bl、B2、 B3 及 B4 ; MAGE C 抗原，即 MAGE_CmMAGEC2 ; lage 1抗原；LAGE2抗原（亦稱為ny_es〇_1)&gage抗原。 前列腺特異性抗原亦可用於本發明中。可融合前列腺特 J 異性抗原之實例包括前列腺之六-跨膜上皮抗原（STEAP)、 剛列腺特異性抗原（PSA)、前列腺酸性磷酸酶（pAp)、前列 腺幹細胞抗原（PSCA)、前列腺特異性膜抗原（pSMA)或稱 為前列腺酶之抗原（亦稱為P7〇3p)。 在一實施例中’前列腺抗原為p5〇ls或其片段。 P5〇1S(亦稱為前列腺蛋白（Prostein))係553個胺基酸之蛋白 貝之包含至少20、50、或1〇〇個鄰接胺基酸之免疫 原性片段及部分、或包含2〇·5〇個或5〇1〇〇個鄰接胺基酸之 131205.doc •13· 200911304 片段可用作本發明之腫瘤相關抗原或衍生物。在一實施例 中，腫瘤相關抗原或衍生物係pSl〇8抗原（揭示於 WO9 8/5 0567中）或别列腺癌相關蛋白（參見w〇99/67384)。 在某些實施例中，片段為全長P5〇ls蛋白之第51_553、34_ 5H或55_553胺基酸。該等可於酵母系統中表現，例如編 碼該等多肽之DNA序列可於酵母系統中表現。 在一實施例中，抗原可包含以下物質或由其構成：由維 爾姆斯瘤（Wilm's tumor)基因表現之WT-1、或其包含大致 或大約第1-249胺基酸之N末端片段WT-1F。WT1係最初發 現在小兒腎癌、維爾姆斯瘤中過度表現之蛋白質。可用抗 原匕3戎乎王長蛋白作為抗原。在一實施例中，抗原可包 含WT1-A10蛋白或由其構成，該蛋白係由12瓜以截短之⑻ 序列及WT1序列之第2_281號胺基酸構成的292 AA重組融 合蛋白。 在本發明一實施例中，腫瘤相關抗原或衍生物係乳癌抗 原’例如Her-2/neu、乳腺球蛋白或B305d抗原。 用於本發明之Her-2/neu抗原可包含整個細胞外結構域 (ECD ;例如大約包含Her-2/neu胺基酸序列之第kg胺基 酉义之序列）或其片段。或者或此外，構成物可至少包含Her_ 2/neU序列之免疫原性部分或整個細胞内結構域：例如Her_ 2/neu序列c末端之約580個胺基酸。 可用作本發明腫瘤相關抗原衍生物之一構成物係Her-2/neU之ECD與磷酸化結構域（PD)之融合蛋白（ECD_pD)。 另一可用構成物係Her-2/neu之ECD與磷酸化結構域片段之 131205.doc -14- 200911304 融合蛋白（ECD-APD)。所述Her-2/neu融合蛋白及構成物可 係衍生自人、大鼠、小鼠或猿/狼Her-2/neu。Her-2/neu之 實例性序列及構成物闡述於WOOO/44899中。 PRAME(亦稱為DAGE)係可用作本發明腫瘤相關抗原之 另一抗原。亦可使用本文所述包含PRAME抗原之融合蛋 ·' 白。具體而言，意欲將本文所述PRAME抗原與本文所述 • 蛋白D融合伴侣蛋白或衍生物之融合用於本發明中。 某些群組顯示PRAME抗原表現於黑色素瘤及衆多種腫 f、 瘤中，包括肺癌、腎癌及頭頸癌。有趣地，其似乎亦在 40-60%白血病中表現，例如急性淋巴樣白血病及急性髓樣白 血病，參見（例如）Exp Hematol. 2000年 12 月；28(12):1413-22。在患者中已觀察到，PRAME之過度表現似乎與較不過 度表現該蛋白之彼等更高之存活率及更低之復發率相關。 抗原及其製劑闡述於美國專利第5,830,753號中。PRAME 係以以下登錄號存於注釋人類基因數據庫H-Inv DB中： U6501 1.1、BC022008.1、AK129783.1、BC014974.2、 〇 CR608334.1、AF025440.1、CR591755.1、BC039731.1、 CR623010.1、CR611321.1、CR618501.1、CR604772.1、 CR456549.1 及 CR620272.1。 在一態樣中，本發明抗原可包含PRAME抗原或其免疫 原性片段或由其構成。一般而言，PRAME蛋白具有509個 胺基酸，且在一實施例中可將PRAME之所有509個胺基酸 皆引入抗原中。 結腸直腸抗原亦可用作本發明腫瘤相關抗原。可用結腸 131205.doc -15- 200911304 直腸抗原之實例包括：C1 585P (MMP 11)及C1491 (E1A增 強子結合蛋白）、CASB618(如WOOO/53748中所述）； CASB743 9(如 WO01/62778 中所述）；及 C1584 (Cripto)。
在本發明上下文中其他可用腫瘤相關抗原包括：Plu-1 (J Biol. Chem 274 (22) 15633-15645, 1999)、HASH-1、 HASH-2、Cripto (Salomon 等人，Bioessays 199, 21 61-70’美國專利第5654140號）、（：1^“11(美國專利第5 981 2 1 5號）。此外，與癌症治療中之疫苗尤其相關之抗原亦包 括酷胺酸酶及存活素。 諸如Mucin等黏蛋白衍生肽可參見（例如）美國專利第 5744,144號、美國專利第 5827,666號、WO 8805054、美國 專利第4,963,484號。具體而言涵蓋河此}衍生肽，其包含 至少一個Muc 1肽之重複單元、較佳至少兩個該等重複段 且其係藉由SM3抗體來識別（美國專利第6 〇54 438號）。其 他黏蛋白衍生肽包括來自MUC 5之肽。 其他腫瘤特異性抗原適用於纟發明；令;東乾燥，组合物中且 包括（但不限於）腫瘤特異性神經節苦月旨，例如⑽2及咖 或其與載體蛋白之共輥物；或該抗原可為自體肽激素，例 如全長促性腺激素釋放激素（GnRH，w〇 95/2〇6⑻），其為 10個胺基酸長之短狀，且可用於夕接技产 『用於夕種癌症治療或免疫去勢 中〇 在本發明態樣中 衍生物及免疫原性 用。 ，本發明亦擴展至上述抗原、免疫原性 片段及包含相同組份之融合蛋白之應 131205.doc -16- 200911304 衍生物、片段及融合蛋白 本發明腫瘤相關抗原可以其衍生物或片段而非天然存在 抗原之形式來使用。 本文所用術語”衍生物”係指相對其天然存在形式經修飾 之抗原。衍生物可包括突變，例如點突變。在一實例中， 何生物可改變蛋白質特性，例如藉由改良在原核生物系統 中之表現或藉由去除不期望活性（例如酶活性）來改變。本 發明衍生物與天餘原；^夠相似以保留抗原特性且保持容
許對天然抗原產生免疫響應之能力。可藉由諸如簡八或 流式細胞儀㈣宜免疫學分析方法來量測給定衍生物是否 產生此一免疫響應。 在本發明-實施例中’本發明腫瘤相關抗原之衍生物係 融合蛋白，其包含與異源性融合料蛋白連接之腫瘤相關 抗原。對於腫瘤相關抗原異源性”欲指在自然界不與腫 瘤相關抗原連接之4 t ^ 迓按之蛋白或多肽序列’即其係藉由人類之 忍干預而與腫瘤相關抗原連接。 抗原與異源性融合伴估蛋白可以化學方式偶合或可表現 為重組融合蛋白。在—眚 實施例中，與非融合蛋白相比，太 發明融合蛋白可提萬类祖/ 贫曰相比本 心疋表現糸統中融合蛋白產量。因此融a 伴侣蛋白可有助於提供τ助手抗 別之τ助手抗原決定基 Α ’例如由人類識 疋基（亦即以融合伴侣蛋白 伴侣）。融合伴侣有助於ιν ^ 作免疫融合 現蛋白質（亦即以融合倬 =之產率表 伴侶蛋白用作表現増強子）。在一膏 蛋白可同時用作免疫融合伴但及表現增 131205.doc 200911304 強伴侶。 融合伴估蛋白可（例如）衍生自蛋白D。蛋白d係脂蛋白 (曝露於革蘭氏（Gram)陰性細菌流感嗜血桿菌 influenzae)表面之42 kDa免疫球蛋白〇結合蛋白）。該蛋白 係呈具有18個胺基酸殘基之信號序列之前體來合成’其含 有細菌脂蛋白之共有序列（參見w〇 91/18926)。天然前體 蛋白D蛋白係在分泌期間經加工且裂解信號序列。經加工 蛋白D之Cys(在前體分子中之位置19)變為經加工蛋白之N 〇 末端殘基且同時藉由酯鍵結脂肪酸及醯胺鍵結脂肪酸兩種 共價連接來修飾。因此，與胺基末端半胱胺酸殘基連接之 脂肪酸即用作膜錨著點。 在一實施例中’用於本發明之腫瘤相關抗原衍生物可包 含蛋白D或其衍生物作為融合伴侣蛋白。 本文所述蛋白D或其衍生物可包含（例如）：經加工蛋白D 之第胺基酸或N末端弟三胺基酸或經加工蛋白〇之大約 或大致第一胺基酸或>^末端第三胺基酸。在一實施例中， 蛋白D或其衍生物可包含經加工蛋白〇之第一胺基酸或^^末 知之第100至115胺基酸；或經加工蛋白d之第一胺基酸或 N末端第1 〇9胺基酸。在一實施例中，天然經加工蛋白D之 胺基酸2-Lys及2-Leu可經胺基酸2-Asp及3-pro取代。 在一實施例中’蛋白D或其衍生物另外可包括前體蛋白 D之18或19個胺基酸之信號序列。在一實施例中，衍生自 蛋白〇之融合伴侣蛋白包含前體蛋白D之第20至127胺基 酸。在本發明一實施例中，前體蛋白D融合伴侣蛋白之兩 131205.doc -18- 200911304 個胺基酸21-Lys及22-Leu可經胺基酸21-Asp及22-Pro取 代。 與野生型前體或經加工蛋白D序列相比’本文所述蛋白 D融合伴侣蛋白在胺基酸序列内可額外或另外含有缺失、 取代或插入。在一實施例中，可插入、取代或缺失丨、2、 3、4、5、6、7、8、9或更多個胺基酸。胺基酸可經本文 所述保守取代基取代，或可使用其他胺基酸。
在一實施例中，融合伴侶蛋白可包含SEQ ID N〇:l*m 示蛋白D序列或由其構成。在一實施例中，融合伴侣蛋白 可包含圖1中帶下劃線之胺基酸（即SEQ ID N〇:i2之第2〇至 127胺基酸殘基）或由其構成。在一實施例中，用於本發明 中之抗原可為蛋白D_Mage_3，其中MAGE_3抗原係由 MAGE-3之第3至314胺基酸構成且其中蛋白〇融合伴倍蛋 白係由圖1中所示胺基酸序列構成。 在本發明另-實施例中，融合伴侶蛋白可係選自㈣或 LytA或其下述衍生物。 NS1係來自流感病毒之非結構蛋白。在—實施例中，本 發明腫瘤相關抗原衍生物可包含NS1或其衍生物作為融合 伴侣蛋白。NS1或其衍生物可包含其N末端第胺基 酸0 pneumoniae) °
LytA係衍生自肺炎鏈球菌（Strept〇c〇ccus 責與膽鹼或諸如DEAE等某些
LytA蛋白之c末端結構域負 膽驗類似物之親和。在—實施例中，本發明腫瘤相關抗原 衍生物可包含LytA或其衍生物作為融合伴⑮蛋白。_或 131205.doc -19- 200911304 其衍生物可包含LytA分子中在第178殘基起始之存於c末端 之重複部分。在一實施例中，LytA或其衍生物包含c_LytA 之第188-305殘基。 用於本發明之免疫原性多肽通常可為藉由（例如）在諸如 細菌宿主等異源宿主、在酵母或在經培養哺乳動物細胞中 表現產生之重組蛋白。 術語"腫瘤相關抗原衍生物”意指部分或全部地含有腫瘤 相關抗原中天然存在序列或與其具有高度序列一致性（例 〔） 如在至少1 0個胺基酸、例如至少20個胺基酸之一段序列上 致性超過95%)之多肽。衍生物亦包括具有保守取代之序 列。保守取代為人所熟知且在序列比對電腦程序中一般將 其設定為默認評分矩陣。 一般而言，以下群組内之取代為保守取代，但以下群組 之間之取代被認為係非保守取代。群組為： i)天冬胺酸/天冬醯胺/麩胺酸/麩胺醯胺 Π) 絲胺酸/蘇胺酸 ··/ iii)離胺酸/精胺酸 iv) 苯丙胺酸/酪胺酸/色胺酸 v) 白胺酸/異白胺酸/纈胺酸/甲硫胺酸 vi) 甘胺酸/丙胺酸 本發明衍生物亦包括經化學處理之序列，例如經醛（例 如甲醛或戊二醛）處理、羧甲基化、羧醯胺化、乙醯化及 其他常規化學處理。具有經衍生硫醇基之本發明構成物亦 可用於本發明中。具體而言，可使用羧醯胺化或羧甲基化 131205.doc -20- 200911304 硫醇衍生物。 在本發明一實施例中，腫瘤相關抗原衍生物可為本文所 述具有經衍生游離硫醇基之mage抗原。經衍生游離硫醇 基可為羧醯胺或羧甲基化衍生物。 本發明腫瘤相關抗原衍生物可替代地包括包含不止一個 腫瘤相關抗原之構成物。在本發明一實施例中，腫瘤相關 抗原衍生物可包含兩個或更多個腫瘤相關抗原。 本文所用術語”月段"係指含有至少一個抗原決定基（例如 ' CTL抗原決定基）之腫瘤相關抗原或抗原衍生物之片段，其 通常為至少8個胺基酸之肽。長度為至少8個（例如，8_丨〇個 胺基酸或至多20、50、60、70、1〇〇、15〇或200個胺基酸） 之片段均被視為屬於本發明之範圍，但該片段須顯示抗原 性，亦即該片段保留主要抗原決定基（例如，CTL抗原決定 基）且該片段能誘導與天然存在之腫瘤相關抗原交叉反應 之免疫響應。實例性片段之長度可為8_1〇、1〇_2〇、2〇_ 50、50-60、60-70、70-100、100-150、150-200個胺基酸 (包括該等範圍内之任一值）。 在本發明一實施例中，用含有3D-MPL及QS2 1之脂質體 或水包油乳液載劑重構包含Her 2 neu抗原及CpG寡核苷酸 之冷康乾燥組合物。該等經重構調配物可產生體液及細胞 介導之響應二者。 本發明冷凍乾燥組合物可含有與腫瘤支持機制（例如血 管發生、腫瘤侵襲）相關之抗原，例如tie 2、VEGF。 在本發明另一態樣中，本發明冷凍乾燥組合物内之抗原 131205.doc -21 - 200911304 係選自HIV衍生抗原、尤其HIV_U^生抗原之抗原。以下 段落闡述可自HIV-1衍生之抗原。 HIV Tat及Nef蛋白係早期蛋白，亦即，該等蛋白在感染 中於早期不存在結構蛋白時表現。
Nef基因編碼早期辅助HIV蛋白，已顯示該蛋白具有若 干活性。舉例而言，已知Nef蛋白可自細胞表面去除 CD4、HIV受體，但此功能之生物學重要性尚有爭論。另 外，Nef可與τ細胞之信號路徑交互作用並誘發活性狀態， 此進而可促進更有效的基因表現。某些mv分離株在此區 域具有突變或缺失，該等突變或缺失導致其不能編碼功能 蛋白且嚴重影響其體内複製及致病機理。
Gag基因係自全長RNA轉譯以產生前體聚蛋白，該前體 聚蛋白隨後被切割成3-5個衣殼蛋白；基質蛋白pl7、衣殼 蛋白p24及核酸結合蛋白（Fundamental Vir〇1〇gy，仏⑷bn，
Knipe DM and Howley Μ 1996 2· Fields Virology 第 2 卷 1996)。
Gag基因可產生55-千道爾頓（Kd) Gag前體蛋白’亦稱為 p55，其係自未拼接病.mRNA表現。在轉譯期間，卩”之 N末端經肉豆蔻醯化，引起其與細胞膜之細胞質方面之關 聯。膜相關Gag聚蛋白聚集兩份病毒基因組rna拷貝以及 其他病毒與細胞蛋白，以引起病毒粒子自感染細胞表面出 芽。出芽後，在病毒成熟過程中p55係藉由病毒編碼之蛋 白酶（Pol基因之產物）切割為四個命名為MA(基質[pi 7])、 CA(衣％c[p24])、NC(核衣殼[p9])及p6之較小蛋白。 131205.doc -22- 200911304 、P24及P9)以外，所有Gag前
除了 3個主要Gag蛋白（pi 7 體均含有若干其他區域，其_ 存於病毒粒子令。此等 MA多肽係衍生自p55之N_末端肉豆蔻醯化終端。大部分 MA分子保持對病毒粒子脂質雙層内表面之吸附，以穩定 該粒子。MA子集聚集在病毒粒子之較深層内部，其中其 成為護送病毒DNA到達細胞核的複合物之一部分。此等 MA分子有利於病毒基因組之核轉運，因為ma上之親核信 號係藉由細胞核輸入機制來識別。此現象容許Ηιν感染未 分裂細胞’此係逆轉錄病毒之獨特性質。 Ρ24 (CA)蛋白形成病毒粒子之錐形核心。經證明親環素 Α可與導致其納入HIV粒子中的ρ55之ρ24區域交互作用。 Gag與親環素a間之交互作用十分重要，因為環孢素對該 父互作用之破壞可抑制病毒複製。
Gag之NC區域負責特異性地識別HIV之所謂包襄信號。 包裝信號係由四個位於病毒rNA 5,末端附近之莖環結構構 成，且足以介導異源rNA納入mvq病毒粒子中。Nc經由 兩個鋅指基元介導之交互作用與包裝信號結合^ Nc亦促 進逆轉錄。 P6多肽區域可介導p55 Gag與輔助蛋白Vpr間之交互作 用，此可導致Vpr納入於正裝配之病毒粒子中。p6區域亦 含有自感染細胞有效釋放芽病毒粒子所需之所謂晚期結構 131205.doc •23· 200911304 域。
Pol基因編碼三種具有早期感染中病毒所需活性之蛋 白，即逆轉錄酶RT、蛋白酶及將病毒DNA整合於細胞 DNA中所需整合酶蛋白。藉由病毒粒子蛋白酶切割Pol之 主要產物以產生胺基末端RT肽及羧基末端整合酶蛋白，該 ' 胺基末端RT肽具有DNA合成所必需活性（RNA及DNA指導 的DNA聚合酶、核糖核酸酶H)。HIV RT係全長RT (p66)與 缺乏叛基末端RNase Η結構域之切割產物（p5 1)的異源二聚 體。 RT係由逆轉錄病毒基因組編碼的最高度保守蛋白質之 一。RT之兩種主要活性係DNA Pol及核糖核酸酶Η。RT之 DNA Pol活性使用RNA及DNA作為可互換模板，且如同所 有已知DNA聚合酶一樣不能啓動DNA從頭合成，而是需要 預先存在的分子作為引物（RNA)。 當DNA合成進行時，為所有RT蛋白所固有的RNase Η活 性在移除RNA基因組之複製早期具有關鍵作用。其選擇性 地降解來自所有RNA-DNA雜交分子之RNA。在覆蓋Pol三 分之二胺基的Pol内，聚合酶及ribo Η在結構上佔有獨立的 - 非重疊結構域。 ρ66催化亞單元折疊成5個不同亞結構域。該等亞結構域 之胺基末端23使該部分具有RT活性。該等結構域之羧基末 端係RNase Η結構域。 在宿主細胞受感染後，藉由存於感染粒子中之逆轉錄酶 將逆轉錄病毒RNA基因組拷貝至直線型雙鏈DNA中。整合 131205.doc -24- 200911304 酶（參照 Skalka AM '99 Adv, Virus Res 52 271_273)識別病 毒DNA之末端，對其進行修飾且隨同病毒Dna到達宿主染 色體位點以催化整合。宿主DNA中許多位點可為整合目 標。儘管整合酶足以催化活體外整合，但其並非唯一與活 體内病毒DNA相關之蛋白-自感染細胞分離之大蛋白_病毒 DNA複合物指示預先整合複合物。此有利於藉由子代病毒 基因組獲得宿主細胞基因。 整合酶係由3個不同結構域（N末端結構域、催化核心及ε 末端結構域）組成。催化核心結構域可滿足聚核苷酸轉移 化學之所有要求。 因此，可用於本發明之HI V-1衍生抗原可係選自（例 如）Gag(例如’全長Gag)、？17 (Gag之部分）、(以经之 另邛分）、p41、p40、Pol(例如，全長p〇i)、RT (p〇i之部 刀）P5 1 (RT之部分）、整合酶（p〇i之部分）、蛋白酶（？〇1之 口P 刀）、Env 、 gpl20 、 gpl40或gpl60 、 gp41 、 Nef、 Vif、
Vpr、Vpu、Rev、Tat及其免疫原性衍生物及其免疫原性片 段，尤其係Env、Gag、Nef及Pol及其免疫原性衍生物及其 免疫原性片段’包括P17、p24、RT及整合酶。HIV疫苗可 包括多肽及/或編碼對應多個不同HIV抗原（例如，2種或3 種或4種或更多種可選自以上列表之mv抗原）之多肽的聚 核苷酸。若干不同抗原可（例如）包含於單一融合蛋白中。 可採用一種以上第一免疫原性多肽及/或一種以上第二免 疫原性多肽，每個該等免疫原性多肽皆係HIV抗原或一種 以上抗原之融合體。 131205.doc •25· 200911304 舉例而言，抗原可包括Gag或其免疫原性衍生物或免疫 原性片段’其融合至RT或其免疫原性衍生物或免疫原性片 段、融合至Nef或其免疫原性衍生物或免疫原性片段，其 中該融合蛋白之Gag部分存在於多肽之5，末端。 了用於本發明之Gag序列可能不包括Gag p6多肽編碼序 列。可用於本發明之Gag序列的特定實例包括pl7及/或p24 編碼序列。 T序列了 3有實質上可滅活任一逆轉錄酶活性之突變 (參見 W003/025003)。 RT基因係HIV基因組中較大p0/基因的組份。應理解’ 用於本發明中之R T序列可存在於Ρ ο 1上下文中或至少對應 於RT之Pol片段中。該等ρ〇ι片段保留p〇1之主要CTL抗原決 定基。在一具體實例中，僅作為p51或RT2p66片段包含 RT。 本發明融合蛋白或組合物的尺丁組份視需要包括突變以 去除在原核表現系統中用作内部起始位點之位點。 視需要，截短可用於本發明之Nef序列以去除編碼]^末端 區域之序列’即，去除3〇個至85個胺基酸，例如，去除6〇 個至85個胺基酸，具體而言，去除N末端65個胺基酸（在本 文中後一截短稱作trNef)。或者或另外，可對Nef進行修飾 以去除肉豆蔻醯基化位點。舉例而言，可藉由缺失或取代 來去除Gly 2肉豆寇酸基化位點。或者或另外，可對Nef進 行修飾以藉由缺失或取代一個或兩個白胺酸來改變Leu 174及Leu 175之二白胺酸基元。二白胺酸基元在CD4減量 131205.doc -26- 200911304 調卽中之重要性闡述於（例如）Bresnahan P.A.等人（1998)
Current Biology, 8(22): 1235-8 中。
Env抗原可以其全長（作為gpi6〇)或截短（作為gpi40或更 短）（視需要具有適宜突變以破壞介於gp 12〇與gp41間之切割 位點基元）形式存在。Env抗原亦可以其天然加工形式（作 為gpl20及gp41)存在。可單獨使用或作為組合一起使用 gpl60之此兩種衍生物。上述Env抗原可進一步展現缺失 (具體而言係可變環缺失）及截短。亦可使用Env片段。 例示性gpl20序列示於SEQ ID NO:6中。例示性gpl40序 列示於SEQ ID NO:7中。 用於本發明冷凍乾燥組合物中之免疫原性多肽可包括 Gag、Pol、Env及Nef，其中存在此等天然抗原之至少 75%、或至少90%或至少95%(例如，96%)之CTL抗原決定 基。 在包括如上文所定義之pl7/p24 Gag、p66 RT及截短Nef 之免疫原性多肽之冷凍乾燥組合物中，適宜地存在天然 Gag、Pol及Nef抗原之96% CTL抗原決定基。 本發明一實施例提供TLR9配體及以Gag、RT、Nef之順 序含有pl7、p24 Gag、p66 RT、截短Nef(缺乏編碼末端胺 基酸1-85之核苷酸-ntrNef”）之免疫原性多肽。 用於本發明冷凍乾燥組合物之具體聚核苷酸構成物及對 應多肽抗原包括： 1. pl7，p24(密碼子經優化）Gag-p66 RT(密碼子經優化）-截 短 N e f ; 131205.doc 27- 200911304 2. 截短Nef-P66 RT(密碼子經優化）_pl7，p24(密碼子經優 化）Gag ; 3. 截短Nef p 1 7，p24(後碼子經優化）Gag_p66 RT(密碼子 經優化）； 4. p66 RT(密碼子經優化）_pl7，p24(密碼子經優化）(}叩_截 " 短 Nef; - 5· P66 RT(密碼子經優化）_截短Nef_pl7，p24(密碼子經優 化）Gag ; 6. P17，p24(密碼子經優化）Gag-截短Nef-P66 RT(密碼子 經優化）。 實例性融合體係Gag、RT及Nef之融合體，具體而言係以 Gag-RT-Nef之順序融合（參見例如SEq m 1^〇:8或把卩ι〇 N0.9)。另一實例性融合體係p 1 7、p24、rt與Nef之融合 體，具體而言係以p24-RT-Nef-pl7之順序融合。此融合體 稱為F4且闡述於W〇2〇〇6/〇13106中。F4係可存於本發明冷 凍乾燥組合物中之HIV抗原之較佳實例。F4之核苷酸序列 I 展示於SEQ ID NO:1〇中，其中p24序列為粗體，Nef序列帶 下s1丨線’且方框為藉由遺傳構建引入之核脊酸。之胺基 酸序列展示於SEQIDNO:ll中，其中： P24序列：第1-232胺基酸（粗體） RT序列：第235-795胺基酸 Nef序列：第798-1002胺基酸 P17序列：第1005-1 136胺基酸 方框：藉由遺傳構建引入之胺基酸 131205.doc •28- 200911304 κ(離胺酸）：代替色胺酸（w)。引入突變以去除酶活性。 在另一實施例中，冷凍乾燥組合物含有Gag、RT、整合 酶及Nef ’具體而言順序為Gag_RT_整合酶·Nef(參見例如 SEQ ID ΝΟ:1 1)。 在其他實施例中，HIV抗原可為包含Nef或其免疫原性 " 衍生物或其免疫原性片段及Pl7 Gag及/或P24 Gag或其免疫 ' 原性衍生物或其免疫原性片段之融合多肽，其中當P17及 p24 Gag兩者均存在時二者之間存在至少一種HIV抗原或免 〇 疫原性片段。 舉例而言，適宜地，Nef係全長Nef。 舉例而言，適宜地，PH Gag及P24 Gag分別為全長pl7 及 p24 〇 在一實施例中，冷凍乾燥組合物含有包括pl7及p24 Qag 二者或其免疫原性片段之免疫原性多肽。在此構成物中， p24 Gag組份及ΡΠ Gag組份藉由至少一種其他出¥抗原或 t疫原性片段(例如’ Nef及/或RT或其免疫原性衍生物或 • 其免疫原性片段）分開。關於進一步詳述可參見 W02006/013106。 ^ 在包括p24及RT之融合蛋白中，在播士、此山 T 隹攝成物中ρ24較佳在 RT之剞’因為當抗原在大腸桿菌中單猶矣：f目 γ早獨表現時，可觀察到 ρ24之表現優於RT。 用於本發明冷凍乾燥組合物之某些構成物包括： 1 · p24-RT-Nef-p 1 7 2. p24-RT*-Nef-pl7 131205.doc -29- 200911304 3. p24-p51RT-Nef-pl7 4· p24-p51RT*-Nef-pl7 5. pl7-p51RT-Nef 6. pl7-p51RT*-Nef 7. Nef-pl7 8. 具有連接子之Nef-pl7 9. pl7-Nef l〇_具有連接子之pl7-Nef *代表RT甲硫胺酸592突變為離胺酸 在另一態樣中’本發明提供含有HIV抗原之融合蛋白之 冷凉乾燥組合物，該融合蛋白包括至少四個Hiv抗原或免 疫原性片段’其中該四個抗原或片段係Nef、p〇i及Gag或 係衍生自Nef、Pol及Gag。Gag較佳係作為藉由融合體中至 少一種其他抗原分開之兩種單獨組份存在。Nef較佳係全 長Nef。p〇i較佳係p66或p51RT。Gag較佳係pl7及p24
Gag。在本發明此態樣中，融合體之抗原組份的其他較佳 特徵及特性係如本文所述。 本發明此態樣之較佳實施例係上文已列舉之四組份融合 體： 1. p24-RT-Nef-p 17 2. p24-RT*-Nef-pl7 3. p24-p51RT-Nef-pl7 4. p24-p5 1 RT*-Nef-p 1 7 用於本發明冷凍乾燥組合物中之免疫原性多肽可具有存於 131205.doc •30· 200911304 對應於諸如Gag、RT及Nef等特定抗原之序列間之連接子 序列。此等連接子序列之長度可為（例如）至多2〇個胺基 酉文。在具體實例中’該等連接子序列可具有1個至丨〇個胺 基I、或1個至6個胺基酸，例如，4_6個胺基酸。 此等適宜HIV抗原之其他描述可參見w〇〇3/025003。 用於本發明中之HIV抗原可係衍生自任一 HIV亞型，例 如，亞型A、亞型Β或亞型C。舉例而言，HIV抗原可係衍 生自亞型Α或Β，尤其亞型β。 在本發明一具體實施例中，冷凍乾燥組合物含有不止一 種免疫原性多肽。在本發明一態樣中，第一免疫原性多肽 係包括Gag及/或p〇i及/或Nef或任一該等之片段或衍生物之 多肽（例如，P24-RT-Nef-P17)。在本發明此實施例之一具 體態樣中’第二免疫原性多肽係包括Gap及/或Ρ〇ι及/或Nef 或任一該等之片段或衍生物之多肽（例如，Gag_RT-Nef或 Gag-RT-整合酶-Nef)。 因此’在一具體實施例中’包括Gap及/或p〇i及/或Nef或 任一該等之片段或衍生物之多肽（例如，p24_RT_Nef_pl7) 係第一免疫原性多肽且包括Gap及/或Pol及/或Nef或任一該 等之片段或衍生物之多肽（例如’ Gag-RT-Nef或Gag-RT-整 合酶-Nef)係第二免疫原性多肽。 在本發明另一具體實施例中’第一免疫原性多肽係Env 或其片段或衍生物，例如’ gpl 20、gpl40或gpi 6〇(尤其 gp 120)。在本發明一具體實施例中’第二免疫原性多肽係 包括Gag及/或Pol及/或Nef或任一該等之片段或衍生物之多 131205.doc -31 - 200911304 肽（例如，p24-RT-Nef-pl7)。 因此，在一具體實施例中，Env或其片段或衍生物（例 如’ gpl20、gpl40或gpl60(尤其是gpl2〇))係第一免疫原性 夕肽且包括Gag及/或Pol及/或Nef或任一該等之片段或衍生 物之多肽（例如，P24-RT-Nef-P17)係第二免疫原性多肽。 在本發明之另一具體實施例中，第一免疫原性多肽係包 括Gag及/或Po丨及/或Nef或任一該等之片段或衍生物之多肽 (例如，p24-RT-Nef-pl7)。在本發明一具體實施例中，第 二免疫原性多肽係Env或其片段或衍生物，例如，gpl2〇、 gpl40或 gpi60(尤其 gpl2〇)。 因此’在—具體實施例中，包括Gag及/或p〇l及/或Nef或 任一 δ亥等之片段或衍生物之多肽（例如，p24_RT_Nef_pi7) 係第一免疫原性多肽且Env或其片段或衍生物（例如， gP120、gpl4〇4gpl6〇(尤其gpl2〇))係第二免疫原性多肽。 冷凍乾燥組合物可含有一種抗原，或可含有不止一種抗 原。 在本發明一態樣中，TLR9配體係用於改良不帶正電荷 之抗原之溶解度。本發明者已發現，Cpg與帶負電荷的抗 原八同冷凉乾燥尤其可改良其在重構後之溶解度。倘若 TLR9配體為免疫刺激性寡核苷酸，則抗原可為具有淨負 電何之分子。倘若此配體係與具有淨負電荷之抗原共同冷 凍乾燥，則在冷凍乾燥組合物重構後TLR9配體可能與抗 原父互作用，此可能導致抗原沈澱。此係不期望情況，但 I’、％此員技術者可藉由將冷柬乾燥賦形劑引入組合物中來 131205.doc -32· 200911304 避免此情況，已知在該箸，芦 丁兮楚 隹忒寺隋况下該荨賦形劑可提高溶解 度，例如L-精胺酸。 TLR9配體及一或多錄；ρ- ；5 义夕種抗原與適宜賦形劑組合以 冷澡乾燥之取終主體調配物。最佳地，賦形劑可含有冷康 保護劑、，以防止蛋白質在冷陳乾燥早期變性，且含有^
保護劑以防止蛋白質在乾烨輩 L 貞隹乾煉期間失活。可使用兩種不 或可使用具有兩種特性之一種分子，例如雙酷。視需 ’亦可添加诸如甘露糖醇或甘胺酸等晶體膨脹劑。亦可 添加諸如聚山梨醇西t十下 一醇知或Tween®等非離子型表面活性劑以 幫助防止蛋白質凝集。賦 終主體之pH。 括㈣鹽，以修飾最 適宜賦形劑包相 w % . 種.糖類，例如蔗糖、海藻糖、 棉子糖及麥芽糖糊精 ” 户牙—糖、麥芽四糖、來 糖或麥芽六糖；多元醇 ^ 醇例如甘露糖醇或山梨醇；喂人 物，例如葡聚糖、臂卜卡# ’ t合 (PVP) · 人 G)、或聚乙烯基吡咯啶_ C； 酸’例如甘胺酸、丙胺酸或精胺酸。 亦可將賦形劑組合以使得 』一 J W便用兩種或更多種f例 如二種或四種）賦形劑。 （例 ,,L ^ ^ b的、、且&包括：糖與葡聚糖， 例如庶糖與葡聚播十、各# & ^ __與糖類；糖與pv ""與咖，例如 减 v, 、 p 例如庶糖與pvp ;糖盥胺其 馱，例如甘胺酸與蔗糖；，、土 她斗、# & 裡糖組合，例如蔗糖與葡萄 糖、或庶糖與棉子糖； 葡萄 十玆地也 興夕凡酵，例如蔗糖與山华醇 或庶糖與甘露糖醇；多元 、山耒私 胺酸。 -胺基I，例如甘露糖醇與甘 131205.doc -33- 200911304 亦可將諸如聚山梨醇酯或Tween@等表面活性劑添加至 任一賦形劑組合中。 為开> 成可用於疫苗接種之免疫原性組合物，用醫藥上可 接爻之稀釋劑重構含有抗原及TLR9配體之冷凍乾燥組合 物。在本發明較佳態樣中，該稀釋劑應為顆粒性稀釋劑， ' 例如金屬鹽顆粒溶液'或脂質體'或水包油乳液。 • 在一實施例中，稀釋劑含有其他免疫刺激劑。此意指除 存於冷凍乾燥組合物中之TLR9配體之外’最終經重構之 f 5 免疫原性組合物可含有其他免疫刺激劑。 已知存在多種已知免疫刺激劑可單獨或以組合方式用作 佐劑。不需要預先曝露，先天或天然免疫系統即可識別衆 多種病原體。負責先天免疫之主要細胞（單核細胞/巨噬細 胞及嗜中性粒細胞）可吞噬微生物病原體且引發先天性、 炎症性、及特異性免疫響應。 脂多糖（LPS)係排他性存於革蘭氏陰性細菌外膜外葉中 之主要表面分子。已顯示LPS可為TLR4配體。Lps阻礙血 ’ 清補體及吞噬細胞對細菌之破壞，且參與定殖黏附。Lps 係結構上相關之複合物分子群，其大小為約1〇,〇〇〇道爾頓 且係由三個共價鍵結區域組成： (i) 外部區域之〇-特異性多糖鏈（〇-抗原） (ii) 中心區域之核心募糖 (iii) 脂A-用作疏水錨之最内部區域，其包含具有長鍵 脂肪酸之葡糖胺雙醣單元。 已顯示LPS之生物活性（例如致死毒性、致熱原性及佐劑 131205.doc •34- 200911304 /舌性）係與脂A部分相關。相反，免疫原性係與〇_特異性多 糖組份（〇«抗原）相關。人們早已瞭解Lps及脂A二者之強佐 劑效應，但該等分子之強毒性卻妨礙其在疫苗調配物中之 應用。因此人們付出大量努力以在維持Lps或脂A之佐劑 活性的同時降低其毒性。 明尼蘇達沙門氏菌（Salmonella minnesota)突變體R595係 在1966年自親本（光滑）菌株之培養物中分離獲得⑺以⑷匕 等人，1966 Ann. N. Υ· Acad. Sci_ 133:349_374)。藉由一
組噬菌體根據所選菌落對溶菌之易感性對其進行筛選，且 僅選擇表現較窄敏感性範圍（僅對一種或兩種噬菌體敏感） 之彼等菌落來實施進一步研究。此努力導致深色粗糙突變 菌株之分離，其在LPS生物合成中具有缺陷且被稱為明尼 蘇達沙門氏菌R595。 與其他LPS相比，藉由突變明尼蘇達沙門氏菌R595產生 之彼等具有相對簡單之結構。 (1)其不含有〇-特異性區域-此特徵係自野生型光滑 表型變為突變體粗糙表型之主要原因且導致毒力 喪失 (ii) 核心區域極短-此特徵提高菌株對各種化學物質之 易感性 (iii) 脂A部分經至多7個脂肪酸高度醯化。 4，-單填醯A (MPL)可藉由酸水解自革蘭氏陰性細菌之 深色粗糙突變菌株提取之Lps來獲得，其可在保留Lps佐 劑特性之同時表現降低至小於千分之—之毒性（如藉由雞 131205.doc -35- 200911304 胚蛋中之致死劑量來量測）（J〇hnson等人，1987汉… Infect. Dis· 9增刊：S512-S516)。通常在中等強度無機酸 溶液（例如0.1 M HC1)中使LPS回流約30分鐘之時間。此處 理導致在第1位點去磷酸化及在第6,位點脫羧而產生河1^。 3-0-去酿基化單磷SiSI A (3D-MPL)可藉由溫和鹼水解 MPL來獲得，其具有進一步降低之毒性同時亦可維持佐劑 活性’參見美國專利第 4,912,094 號（Ribi Immunochemieals)。 驗水解通常係在有機溶劑（例如氯仿/曱醇混合物）中藉由用 弱鹼水溶液（例如pH 1 0.5之0.5 Μ碳酸鈉）飽和來實施。 關於製備3D-MPL之其他資訊可參見（例如）美國專利第 4,912,094號及 WO02/078637 (Corixa公司）。 已顯示某些非TLR配體分子具有佐劑活性。皂樹皂普係 自智利4莢樹之樹皮提取之三萜糖苷之混合物。粗皂普已 廣泛用作獸醫佐劑。Quil_A係皂樹皂苷材料之部分純化水 性提取物。QS21係Quil AiHpk純化非毒性部分且其製造 方法揭示於（作為QA21)美國專利第5,057,540號中。 在本發明一態樣中，稀釋劑含有另外一種免疫刺激劑。 在本發明另一態樣中，稀釋劑含有不止一種其他免疫刺激 劑。该等免疫刺激劑可為TLR4配體、皂苦、TLR7配體、 TLR8配體或TLR9配體。在本發明一實施例中，另一免疫 刺激劑為TLR4配體，例如本文所述3D_mpl。在本發明另 實她例中’另一免疫刺激劑為本文所述QS21。在本發明 另一實施例中’稀釋劑含有qS2丨及3D_mpl。在此實施例 悲樣中’稀釋劑為含有qS2 1及3D_mpl之水包油乳液。 131205.doc 36· 200911304 在此實施例另一態樣中，稀釋劑為含有QS21及3D-MPL之 脂質體溶液。 現在將參照以下非限制性實例進一步闡述本發明。 實例 實例1 : CpG寡核苷酸及作為抗原之CPC-P501S之凍乾 ' 所用抗原為CPC-P501S。此抗原係以圖表方式展示於圖 1中，其中展示TM2至TM12之區段代表P501S抗原；左側 之橢圓形代表CPC融合伴侣且His尾顯示於右側。 (抗原係使用酸酒酵母（S. cerevisiae)中所示His標籤來製 造，且然後使用 Tris (5 mM pH 7.5)與 Tween80 (0.3%)之緩 衝液使其濃度達到700 pg/ml。 為製備最終主體，將蔗糖（35%)添加至注射用水中以達 _ 成6.3%之終濃度。然後添加Tris (1 M pH 8.8)，之後添加
Tween 80 (25°/。）以達成0.2%之終濃度。在室溫下將此混合 物磁力攪拌5分鐘。添加CPC-P501S且在室溫下將混合物 磁力攪拌4分鐘。然後添加SEQ ID NO:4之CpG寡核苷酸， 11 且在室溫下將所得混合物磁力攪拌15分鐘以獲得最終主 體。如下所述分析組合物： 最终主體 (500 μΐ) 最終容器(500 μΐ) 人類劑量 餅 ^625 μΐ AS01B 重構後 CPC-P501 125 pg 100 pg CpG 625 pg 500 Tris 50 mM 40 mM Tween 80 0.50% 0.40% 蔗糖 6.3% 5.0% pH 9.1 +/-0.1 7.4+/-0.1 最終主體 (500 μΐ) 最終容器(500 μΐ) 人類劑量 餅 Μ625 μΐ AS01B 重構後 CPC-P501 25 pg 20 pg CpG 625 μβ 500 μΕ Tris 50 mM 40 mM Tween 80 0.20% 0.16% 蔗糖 6.3% 5.0% pH 9.1 +/-0.1 7.4 +/- 0.1 131205.doc -37- 200911304 將0.5 ml組合物填充至玻璃瓶中，對其實施如圖2所示之 冷凍乾燥循環。 在37°C下於TO、1週、2週、3週、及4週時藉由目測觀察 及直徑量測對三瓶組合物實施觀測餅特徵（見圖3)。在相同 時間點及溫度下使用熱重法（TG)或卡爾-費希爾法（Karl Fischer) (KF)來量測殘留含水量。如下文所示，在最多兩 週内餅係穩定的。 凍乾餅 穩定時間 視覺外觀 餅直徑(mm) 濕度含量(％ wH20/w餅） KF TG T0 OK 12.6±0.1 0.3% (在4°C下保持1.5個月） 0.8% (在4°C下保持5個月） 1 週 37°c OK nd 0.59% nd 2 週 37°C 收縮+ 9.8±0.8 nd 1.4% 3 週 37°C 收縮++ 7.7±1.0 nd 1.2% 4 週 37t 收縮++ 8.7+1.5 不可量測 1.3% KF :卡爾-費希爾法 TG :熱重法 nd :未實施 OK :未出現凝集或降解 規格：3%(熱重法） 在37°C下儲存（為促進穩定性分析）之最終容器中之濕度 隨時間流逝而升高。在37°C下保持1個月後，餅含有1.3% H20且收縮。在此實驗中，由於吸濕性粉末自塞子吸收水 分，此事實導致濕度升高。用新型塞子替代該等塞子可幫 助預防此收縮。 然後用注射用水或用以下載劑液體重構餅··佐劑系統 A(如W02005/1 12991中所述製備之脂質體佐劑）、佐劑系統 131205.doc -38- 200911304 E(如W02005H 12991中所述製備之水包油乳液佐劑η _ 系統F(如W02005/1 12991中所述製備之水包油乳液佐劑）/ 使用注射用水、佐劑系統E或佐劑系統？時未觀察到蛋白 質凝集或降解。使用佐劑系統A時觀察到程度之凝集 及降解。可推斷此係由於pH降低至低於cpc_p5〇is之等電 ' 點所致。使THs賦形劑之濃度升高至50 mM可解決該問
題，且之後使用佐劑系統A時觀察不到凝集。亦發現凍乾 餅中CpG之存在(即抗原與CpG寡核苷酸共冷凍乾燥)有助 〇 於在用佐劑系統A重構時防止抗原凝集。使用佐劑系統A 來重構具有及不具有C p G之;東乾餅之比較顯示在共冷凍乾 燥後凝集降低（數據未顯示）。 亦研九佐劑系統A中具有脂質體大小的賦形劑之影響， 且發現單獨存於一小瓶佐劑系統A中之脂質體與在含有抗 原、CpG、Tris及TWeen之;東乾餅重構後存於一小瓶佐劑系 統A中之脂質體的大小沒有差異。因此吾等可推冑，康乾 餅之組份不影響佐劑系統（圖y。 ί l R7 最後，研究調配物之抗原性，且發現對於淋巴組織增生 及細胞内細胞因子（ΙΡΝγ)產生而言，cpc_p5〇is之液體調 配物與lyo調配物之間沒有差異（數據未顯示）。因此吾等可 推斷，與CpG共冷凍乾燥不影響抗原之免疫原性。 實例2 : CpG募核苷酸及作為抗原之Mage3之凍乾 所用抗原為與MAGE-3連接之部分蛋白〇蛋白，其進而 與H1S尾連接以便於純化pD-Mage3_His(參見圖5 : seq出 NO:13)。 131205.doc 39- 200911304 經純化主體抗原係用大腸桿菌（E. coli)中之His標籤來製 造，且然後使用 NaH2P04.2H20/K2HP04.2H20 (2 mM)與 丁％661180(約0.2°/。乂^(理論值））之緩衝液（1)117.5)使其濃度 達到 75 0 pg/ml ° 為製備最終主體，將蔗糖（30%)添加至注射用水中以達 成3.15°/c)之終濃度。然後添加NaH2P04.2H20/K2HP04.2H20 (100 mM pH 7.5)以達成5 mM之P04終濃度，其中考慮存於 抗原緩衝液中之墙酸鹽。亦添加Tween 80 (3%)以達成 0.1 5%之終濃度，其中應考慮存於抗原緩衝液中之Tween。 在室溫下將此混合物磁力攪拌5至15分鐘。添加PD-Mage3-His (750 pg/ml)且在室溫下將混合物磁力攪拌5-15分鐘。 然後添加Seq ID NO:4之CpG寡核苷酸，且在室溫下將所得 混合物磁力攪拌1 5分鐘（+/- 5分鐘）以獲得最終主體。用 NaOH (0,05 Μ或 0.5 M)或 HC1 (0.03 Μ或 0.3 M)將 pH調節至 pH 7.5 +/- 0.1。 如下所述分析組合物： N0 名稱 成份 組份 Src CC 東乾前 重量 Ό.5 ml ^ 每HD(用 稀釋劑j 濃度 ).625 ml fc構後） 重量 (0.5 ml 中) 1 PD-Mage3- His NaH2P04.2H20-K2HP〇4.3H20 2 mM/Tween 80約0.2〇/〇 w/w(理論值）pH 7.5 750 mg/ml 375 μ g 600 pg/ml 300 μ g 2 CpG 1250 pg/ml 625 μ g 1000 pg/ml 500 μ g 3 蔗糖 3.15% w/v 15.75 mg 2.52% w/v 12.6 mg 4 Tween 80 1 0.15% w/v 0.12% w/v 5 P04 1 5 mM 4 mM 6 WFI ad 0.5 ml 7 PH 7.5+/-0.1 將0.5 ml該組合物填充至玻璃瓶中，對其實施如圖6中所 131205.doc -40- 200911304 示之冷凍乾燥循環。 在於37 C下將餅儲存7至9天後分析軾形劑及凍乾循環對 餅組合物之影響。 餅外觀及殘留濕度 餅外觀 ~ 無破裂(T0) 無收縮(T7d37°c) 殘留濕度 - 0.59% (T8d 37°C) 可觀察到在7天時餅未出現任何破裂，且經過8天之應力 穩定性測試未發生改變。 在37 C下儲存7至9天之餅之殘留濕度保持低於3%之要 求。 在37°C下儲存7至9天後直徑未擴展。 然後用佐劑系統A(如W02005/1 12991中所述製備之脂質 體佐劑）重構餅。未觀察到蛋白質凝集或降解，由此證實 抗原可與CpG共冷凍乾燥而不影響其可被重構之能力。 研究調配物之抗原性。發現在用佐劑系統A重構後，在 24小時後，抗原性隨時間降低。據認為此係由重構後之酸 性PH (6_2 +/- (M)所致。當發現可藉由提高pH來抑制抗原 性降低時，證實了此觀m，抗原性仍然在—定程度 上隨時間流逝而降低。因此測試調配物來觀察此降低是否 對體内效力測試有影響。將人類劑量稀釋至3m、"職 W〇th後給予小氣組，如圖7中所示每組1()只小鼠。在第28 天對小鼠實施取血。 TO、4 h及24 h係用佐劑系統A重構餅之後之時間。如在 圖7中可見，對效力無影響。 131205.doc 200911304 實例3 ··重構後CpG對抗原溶解度之影嬖。 1 · WT1係表初發現在小兒腎癌、維爾姆斯瘤中過度表現 之蛋白質。用於本案中之候選抗原使用幾乎全長蛋白質作 為抗原。WT1-A10蛋白係在大腸桿菌中表現之292 AA重組 融合蛋白，其係由12 mer截短之tat序列（前導序列）及WT1 序列之第2-281號胺基酸組成。單獨冷凍乾燥後，若用佐 劑系統A重構，則此抗原沈澱，因為其等電點（5 85至7 5) 接近佐劑系統A之pH (6.1)且佐劑系統A中存在氯化鈉。 製備WT1-A10之兩種調配物。經重構劑量含有4〇〇 yg/ml WT1-A10抗原、1〇% 蔗糖、1〇〇 Tris、及 0.2% Tween 8〇 ’其中增加或減去840 pg/ml CpG。 用500 μ1佐劑系統A重構兩種調配物。離心所得液體且 且對未離心液體（NC) '上清液（SN)及沈澱物（Ρ)實施西方 點潰分析。結果示於圖8中。 如在圖8中可見，在CpG存在下，沈澱物中缺少抗原可 證實重構後抗原之溶解度有所提高。在其中凍乾餅不含 CpG之經重構冷凍乾燥組合物之沈澱物中可觀察到沈澱抗 原。此可證實’在不帶正電荷之抗原情況下，CpG之共冷 /東乾燥可改良重構後抗原之溶解度。
2. PRAME 製備PRAME之兩種調配物。經重構劑量含有1 〇〇〇 pg/mi PRAME抗原、3.15%蔗糖、5 mM硼酸鹽、150 nM氣化 納’其中增加或減去840 jig/mi CpG。用500 μΐ佐劑系統A 重構兩種調配物。離心所得液體且且對未離心液體（NC)、 131205.doc -42- 200911304 上清液(SN)及沈澱物(P)實施西方點潰分析。結果展示於圖 9中，其中NC=未離心，SN=上清液且？=沈澱物。 如在圖9中可見，在CpG存在下，沈澱物中缺少抗原可 α實重構後抗原之溶解度有所提高。在其中凍乾餅不含 CpG之經重構冷凍乾燥組合物之沈澱物中可觀察到沈澱抗 原。此進一步證實，在不帶正電荷之抗原情況下，CpG之 共冷康乾燥改良重構後抗原之溶解度。 【圖式簡單說明】 圖1係CPC-P501S之示意圖。 圖2係用於CpG寡核苷酸及作為抗原之CPC-P501S之冷凍 乾無循環。 圖3係在TO、1週、2週、3週及4週時於37。(：下藉由目測 觀察及直徑量測對三瓶組合物實施之餅表徵。 圖4繪示賦形劑對佐劑a大小之影響。 圖5係Mage-3抗原之整體構成。 圖6係用於CpG寡核苦酸及作為抗原之]viage-3之冷康乾 無循環。 圖7係用佐劑系統A重構之PD-Mage-3之體内效力測試結 果。 圖8係對WT1 - A10(增加或減去CpG)之經重構調配物之未 離心液體（NC)、上清液（SN)及沈澱物（P)實施的西方點潰 分析。 圖9係對PRAME(增加或減去CpG)之經重構調配物之未離心 液體（NC)、上清液（SN)及沈澱物（P)實施的西方點潰分析。 131205.doc •43- 200911304 Q c E c s ID NO: 1
ATG ACG TTC CTG ACG TT SEQ ID Ni〇：2 TCT CCC AGC GTG CGC CAT SEQ ID N)0:3 ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG SEQ ID NO;4 TCG TCG TTT TGT CGT ΤΤΪ GTC GTT SEQ ID NO:5 TGC ATG ACG TTC CTG ATG CT SEQ ID NO:6
MKVKETRKNY QHLWRWGTHL LGMLMICSAA EQLWVTVYYG VFVWKEATTT 5Q LFCASDAKAY DTEVHNVWAT HACVPTDPNP QEVVLGNVTE YFHMWKNNMV 100 DQHHEDIISL WDQSLKPCVK LTPLCVTLDC DDVNTTNSTT TTSNGWTGEI 150 RKGEIKNCSF NITTSIRDKV QKEYALFYNL DVVPIDDDNA TTKNKTTRNF 200 RLIHCNSSVM TQACPKV5FE ΡΓΡΙΗΥΟΑΡΑ GFAILKCNNK TFDGKGLCTH 250 VSTVQCTHGI RPVVSTQLLL NGSLAEEEVV IRSDN^ONT KTIIVQLNES 300 VAINCTBPNN NTRKGIHIGP GRAFYAARKI IGDIRQAHCl·! LSRAQWHNTL 350 KQIVIKLREH FGHKTIKFNO SSGGDPEIVR HS^NCGGEFF YCDTTQLFHS 400
TWNGTEGNNT EGNSTITLPC RIKQIINMWQ EVGKiiMYAPP IGGQIRCSSN 4SO ITGLLLTRDG GTEGNGTEHE TEIFRPGGGD MRDNWRSELY KYKVVKVEPL 500 GVAPTRAKRR VVQR 514
SEQ ID NO;7 1 MRVNEIQRNC 51 LFCASDAKAY 101 DQMHEDIISL 151 CSFNMTTELR 201 CPKVTFEPIP 251 VSTQLLLNGS 301 KSYRIGPGQT 351 TIIFTNSSGG 401 NGTITLPCR1 451 KNSAWETFRP 501 RAVGIGAVFL 551 AQQQLLKLTV 601 NSSWSNKSYD 651 LALDK.WAMLW
QHLLRWGIMI STEKHNVmT WDQSLKPCVQ DKKQQVYSLF IHYCAPAGPA LAEREVRIRS FYMOIVGDI DLEITTHS.FH KQIIRMWQRV GGGDI.RDNWR GFLGAA.GSTM WGIKQLQARV DIWQNMTWLQ NWFDISKWLW
LGMIIICSTA HACVPTDPNP LTPLCVTLNC YRLDIEKrNS ILKCNDTEFN ΒΗΙΆΝΝΑΚΝΪ RQAHCNVSRT CGGEFFYCNT GQAMYAPPIE SELVKyKVVK GAASITLTVQ LAVERYLRDQ WDKEISNYTD Y IRS
DNLWVTVYYG QEIPLDNVTE SNARVNATFN SNNNSEYRLV GTGPCKNVST IVQFASWKI DWMNTLRLVA SGLFNSTWTT GVmCESNIT IEPLGVAPTR ARQLLSGIVQ QLLGIWGCSG IIYSLIEESQ
VPVWRDAETT EFNMWK 臟W STEDREGMKN NCNTSAITQA VQCTHGIKPV HCIRPNMNTR MQLRKYFSNK NNMQESNDTS GLILTRDGGN AKRRVVERE：K QQSMLLRAIE KLICTTNVPW NQQEKNEQDL SEQ ID NO;8 1 51 101 151 201 251 301 351 401
MGARASVLSG LETSEGCRQI LDK1EEEQNK TLNAWVKVVE LKETINEEAA TNNPPIPVGE YKTLRAEQAS QGVGGPGHKA EICTEMEKEG
GELDRWEKIR LGQLQPSLQT SKKKAQQAAA EKAFSPEVIP E^DEVHPVHA IYKRWIILGL QEVKNHKTET RVLMGPISPI KISKIGPENP
LRPGGKKKYK GSEELRSLYN DTGHSNQVSQ MFSALSEGAT GPIAPGQHRE NKIVRMYSPT LLVQNANPCC ETVPVKLKPG YHTPVFAIKK
LKK1VWASRE TVATI^CVHQ NYP1VQNIQG PQDLNTMLNT PRGSDIAGTT SILDIRQGPK KTILKALG PA HDGPKVKQWP KDSTKWRKLV
LERF'AVMPGL RIEIKDTKEA QMVHQAISPR VGGHQAAMQH STLQEQIGWH EPFRDYVDRF ATLEEMMTAC LTEEKIKALV DFEELMKRTQ -44- 131205,doc 200911304
451 DrWEVQLGIP HPACtLKKKKS VWLDVGDAY FvSVPLDEDFR KYTAFTIPSI 501 NNETPGIRYQ YNVLPQG^KG SPAIFQSSMT KILEPFRKQN PDIV1YQYMD 551 DLYVGSDLEI GQHKTKIEEL RQHLLRWGLT TPDKKHQKEP PFLKMGYELH 60 i. PDKWTVQPIV LPEKDSWTVN DIQKLVGKLM WA$QIY?GIK VRQLCKLLRG 651 TKALTEVIPL TEEAELELAE tNrREILKE?VH GVYYDPSKDL IAEIQKQGQG W1 QNTYQIYQBP FK^LKTCKYA RMRGAHTNDV KQLTEAVQKT TTESIVIWGK 751. TPKFKLPIQK ETWETWHTEY ViQATWIPEWE FVNTPPLVKL WYQL£K£PIV 801 GAETFYVDGA ANRETKLGKA GYVTNRGRQK VVTLTDTTNQ KTELQAIVLA 851 LQDSGLEVNI VTDSQYALGI IQAQPDQSES ELVNQIIEQL IKKEKVYLAW 901 VPAHKG1GGH EQVDKLVSAG IRKVLHVGrp VTPQVPLRPM TYKAAVDLSH 951 rl.KEKGGI.EG LIHSQRRQDI LDLWIYHTQG YFPDWQHYTP GPGVRYPLTF 1001 GWCYKLVPVE PDKVVEEANKG ENTSLL-HPVS LHGMDDPERE VLEWRPDSRL 10S1 AFHHVARELH PEYFKNC SEQ ID NO:9
atggt-tatcgtgcagaacatccaggg9caaatggtacatcaggccatatcacctagaact.ttaaatgca1:ggg taaaagtagtagaagagaaggctttcagcceagaAgtaatacccatgttt.tGagcattaLtcagaaggsgccac cccacaagatttaaacaccatgctaaacacagtggggggacat;caagcagccatgcaaatgttaaaagagacc atcaatgaggaagctgcagaatgggatagagtacatccagtgcatgcagggcctattgcaccaggccagatga gagaaccaaggggaagtgacatagcaggaactact;agtacccttcaggaacaaataggatggatgaGaaataa tcoacctatcccagtaggagaaati'tt.at.aaaagatggataatcctgggattaaataaaatagtaagaatgtat agccctaccagcattct9gacataagacaaggaccaaaagaacctttt.agagact:at:gta9racc^gttct^ata aaaotctaagagccgagcaagcttcacaggaggt^aaaaattggatgacag&aaccttgttgrgt^ccaaaatgc gaacccagafcfcgtuaagactattttaaaagcalrtgggaccagcggctacactagaagaaatgatgacagcatgt cagggagtaggaggacccggccataaggcaagagt.ttt.g|cataT^ggccccatt3gccei:a ttgagaccatgi： cagtaaaattaaagccaggaatggatggGccaaaagttaaacaatggccattqacagaagaaaaaataaaagc attagta^aaatttgtacagagar^gaaaaggaaciggaaaatttcaaaaattgggcctgaaaat: ccatacaar actccag^acccgccacaaagaaaaaagacagtactaaatggagaaaatt agtagatttcagaqaact r aaLa agagaactcaagact tctggga^gt r.caactaggaataccacatcccqcagggtt3aaaaagaaaaaat cagr aacagtactggatgtgggt gacqcatatttttcagttcccttagatgaaqacttciiggaaa t ^tactqcattx. accaiaLCdagtataaacaatgsgaeaccagggattagatetcagtacaatgtgctcccacag'ggstqqaaag gatcsccegcaatat tcedaagtagcatgacaaaaaitcttagagcct tttsgaaaacsa吞acccagscatagt: t.7stctatcaatacat gg：atgatt t gtatgtaGgatctgacttagaaatag9gcagcatagaacaaaaaf.aqdq gcigcLgaaacaacatctgttgaggtggggacttaccacaccagacaaaaa-aeatcagaaagaacctccat tec ttaaaatgggttatgaactccatcctgataaatggacagtacagcctatagtqctgccagaaaaagacagcrq gactgtcaatgacatacagaagt tagtgggqaaattgaattgggcaagtcaaacttacccagggar taaagta aggcaattatgtaaaetccttagaiggaa^ccaaagcact^acagaagtaatacc.accaacsgaagaagdgagc taqasctqgcagaa^acagaqaqattctsaaagaaccaqtacatgqegtqtattatgacccatcaaaa^actt aatagcagaaataca'9a.agcaggggcaaggccaatggacatatcaaatitatcaagagcc«it t taaaaatctq aaaacaggaaaatatqcaagaatgagggcitgcccacactaatgatgtaaaacaatcaacagaggcagtgcaaa aaataaccacagaaagcatagtaatatggggaaagactcctaaatttaaactqcccatacaaaaggaaacatg ggaaacatggtggacagagtaCtggcaagccacctggattcctgagtgggagtt tgctaataoccctcctt.ta •g t g a a 盈 t: t a t g: g t a c c a g 11 a g a g a a 3 g a a c c c 31 a g t a g g a g c a. g a a a c c 11 c t a t g t s g a t g g g g c a. g c t a 3cegggegactddatt<2igg<a.a^1sgc13ggat3t：gttac:ca3.tagagg13Bg6ca^ia3^gttgtc3ccct33c:t：.ga cacaac^aatcagaagactgagttiaciaagcii在tttatct这 tgcVttgca^gsttcg'ggattaga这 gtaaacata gtaacagactcacaatatgcattaggaatcat tcaagcacaaccagat caaagtgaatcagagttagtcaatc aaataatagagcagttaataaaaaaggaaaaggtctatctggcatgggtaccagc^cacaaaggaattqgagg aaa t gaacaagt agat aaattagtcagtgctggaat caggaaagtqcta[gctatQi)qgtggcaa9t9Qr.;.c-adaa aa’caqtqt^qtt qqatqg.ectact.gtaagggadaqaai:qaqacqaqctgaqc：c：aqcaqcaqataggqtqq.gaca -caacatctc^ac]ac.ct99aaaaacat9ga9Caatcacaaqtaqcaatacaxj〇agctaccaatqctqct.r.gtqc 广 1~ j j r t 3 q a a q c a c a a q a q q a q q~ a q q a q q t q g g 11.1 卞 c c a q t c a c a c e t c a q q t a c cttt^ucxr, aaz^ac^ 1 ^ .n^cagct：gt；dqatcttagcc^ctttciaaaaqaaaaqqaq.qqactqg[a4gggq_tggii:（（ 一人j二 tgat.ctqtqq'atctac-cac.acacaaqqctacttccctqaVtqqcaqaac^^( ^ ^ , aq<jgccaq<?q<gtcaqatat:ccact.Qacctt.t：qgatggt:gccacaagctaqtaccacii: t g a g c c a£a t a a a £ t. .3 aaaqaq qccaa taaacjQagagaacaccaqcttqttacaccctgcgagccc gcatgqaatqq at .gacccta a^a qaqaaqtqttaqaqtqqaqgi：t"tqacaqccqcctagcattccatcacgtggcccgaqagctqc.atcciqaqta cttcaaqaactqclaggcctlatgggtgcqaoagcgtcagta-t: taagcgggogagaattagatcgatgggaaaaa attcggttaaggccagggcjgaaag.aaaaaatataaaitaaaaeac.atagtatgggciiagcaggg«gcT：.agaac qartcqcagttaatcctQqcctottagaaacarcagaaggctgtagacaaatactc^ggacagctacaaccauc 45- 131205.doc 200911304 ccttcaqacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattg-gtgcatcaaaqg atagagataaaagacaccaaggaagictttagacaagatatgaggaagagcaaaacaaaagt aagaaaasagcac a 91：: a a g a g c a. 9 c t g a- c a. c a g g a c a. c a g c a a t c a g g t c a q c c a a a a 11. a c t a a
SEQ ID NO:ID l^lVQNXQG^VHeAXSPRTI^AWVKVVEEKAF； Qm^TMJ^TVGGHQAAMQ^KETIHEEAAEWDRVH
SPEVIPMFSALSEGATP VHPVHAGPIAPGQMREP
RGSDXAGTTSTX-QEQIGWhmiH 沖 IPVGE lYKRWllLGLNKIVRMySPTS IIJ> XRQGPKEPFRD YTOHFYKTX^AEQASQI^KNWMTE tLLVQNANPDCK TILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARVI^GPI SPIETVSVKLKFG MDGPKYKQWPL丁EEKIKALVSICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAJKK KDST KWKKLV D fRELIsIKRTQDFWE VQLGI PH PAGLKKKKS VTV L DVGDA Y FSVPLDEDPRKYTAFTIPSIHN£TPGIRYQVNVLP〇GWKGS PAIFQSSHT KXLEPFRKQHPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQiiRTKIEELR-QHLLKWGLT tpdkkhqkeppflkmgyelhpdkwtvqpivlpekdswtvndiqklvgkln WASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAF^REILKEPVH GVYYDPSKDLIAEI〇K〇G〇G〇^TVQI；YQ£PFKNLKTGKYARMKGAHT^DV KQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKrKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWE FVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETFYVDGAANRETKLGKAGYVTNRGRQK VVTLTDTTNQKTELQAI*iLALQD3GLEVNIVTDSQYALGIIQAQFDQS£S ELVNQlIBQLIKKEKVYLAWyPAHKGIGGNEQVDKLVSAGIRKVQMGGK !/^SKSSVVG'WPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHG.A.ITSSNTAATNAA CAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPHTYKAAVD1SHFLKEKGGLEGLXHSQ RB.QDXLDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVE eankgbntsllhpvslhgmddperevlewrfdsrlafhhvarelhpeyfk
MC|R?|mGARA.SVLSGG£LDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAV ^pgll^tsegcrqilgqlqpslqtgseelrslyntvatlycvhqrieikd TKEALDKIEF-HQ^KSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY 5Q 100 ISO 200 250 300 350 AOQ 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 2000 1050noa 1136 SEQ NO:li 1 MAARASILSG GKLDAHEKIR LRPGGKKKYR LKHLVWASRE LDRFAUvPSl.
501 5S1 601 651 7D1 / 5' SOI 8bl 901 951 1001 1051 1101 1 1 r." 1 :201 .12^1 1301 1351 1^01
LETTEGCQQI MNQLQPAVKT GTEEIKSLFN TVATLYCVHQ RIDVKDTKEA LDK1EEIQNK SKQKTQQAAA DTGDSSKVSQ NYPTIQNAQG QMIHQNLS^R TLNAWVKVIE EKAFSPEVXP MPSALSEGAT PQDLNVMLNI VGGHQAAMQM LKDTINEEAA EWDRLHFVQA GPIPPGQIRE PRGSDIAGTT STPQEQLQWM TGNPPIPVGN IYKRWIILGL NKIVRMYSPV SILDIKQGPK EPfRDYVDRF FKALRAEQAT QDVKCWHTET LLVQNANFDC K3ILKALGSG ,%TLEEHMTAC QGVGGPGHKA RVLA£AHSQA QQTNIMMQRG NFRGQKRIKC FNCGKEGHLA RN'CRAPRKKG CWKCGKEGHQ HKDCTEKQm FLGKIWPSSK GRPGNFP〇SR PBPTAPPAEL FGHGEG1ASL PKOEQKDREQ VPPLVSLKSL FGNDPLSQGS FI3FIETVPV TLKPGMDGPK VKQWPLTEEK IKALTEiCTE MEKEGKISKI GPENPYMTPI FAIKKKDSTK mKLVOTRth NKRTQDB-JEV QLGIPHPAGL KKKKSVtVLD VGDAYFSVPL DENFBKYTAF TIPSTNNETP QyRYQYWVLP
QGWKGSPAIF QSSMTKIl.EP FRSKNPEIIl YQYMAALYVG SDLEXGQHRT KIESLHAHLL SWGFTTPDKK HQK£PPFLWH GYELHPDKWT VQPIMLPDKE SWTVN-OXOKL VGKLMWASQI YAG1KVKQLC RLLEGAKALT DIVTLTEEAE LELAENREIL KDPVHGVYYD PSKDLVftEIQ KOGQDQWTYQ IVQEPFKNLK fGKYARKRSA HTNDVRQLAE VVQKVPvMESI Vl^GKTPKFK LPIOKETWEI* WWHDYMQATW IPEWEH/NTP PLVKLViYQLE KDPILGAETF YVDGAA.NRET KLGKAGWTO RGRQKWSLT 0TTMQKTELH AILLALQDSG SEVNIVTDSQ YALGIIQAQP DRSESELVMQ IIEKLIGKDK 1YLSWVPAHK GIGGHEQVDK LVSSGIRKVI, FLDGIDKAQS DHERYHSNWR THASDFNLPP IVAKEIVASC： DKCQLKGEAM HGQVDCSPGI WQIACTHLEG KVILVAVHVA SGVIEAEVIP AETGQETAYF LLKLAGRVi^V KVVHTANGSN FTSAAVKAAC WWAHIQQEFG IPYWPQSOGV VASMNKELKK IIGQVRDQAS HLKTAVQMAV PIHNFKKKGG IGGYSAGERI IDI1ATDIQT KELQKQITKI QNFRVYYRDS RDPTWKGPAK LLWKGSGAVV IQDNSDIKVV PRRKAKILRD YGKQMAGDDC VAGKQDEDRS MGGKWSKGSI VGWPEIRERM RRAPAAAPGV' GAVSQDLDKH GAITSSNINN
PSCVWLEAQE EEEVGFPVR? QVPLRPMTYK GAFDL3HFLK EKGGLDGLIY 131205.doc • 46 - 200911304
1451 SRKRQEILDL WYHTQGYr? DWQNYTPGPG VRYFLTFGWC FKLVPMEPDE 15-01 VEKATEGEMN SLLHPICQHG MDDEEREVLI WKFDSRLALK HRAQELHPEP
1551 YKDC SEQ ID NO;12
蛋白質 D 一 H 流 ⑴ NK^KTLfiLSLtA/U；VLAGCSSHSStvMANTC^K$DK1 3 1 AKRGA5；GYLPEH
5Π TI^：SK-ftLA.F^QQADYL£Q.DLAHTK.DGRU',VIHDHFLDGtTUV,A.KRr^HRH U〇U ΚΚΙΚ^ΥΥΥΐ OFTU^I 麵;gT c
47- 131205.doc

Claims (1)

  1. 200911304 十、申請專利範圍： 1. 一種冷珠乾燥組合物，其包含一或多種抗原及TLR9激動 劑。 2. 如請求項1之組合物，其中該TLR9激動劑係免疫刺激性 寡核苷酸。 3. 如請求項2之組合物，其中該免疫刺激性募核苷酸係含 有CpG之寡核苷酸。 4. 如請求項3之組合物，其中該免疫刺激性寡核苷酸包含 ζ ,, 嘌呤、嘌吟、C、G、嘴咬、嘴咬序列。 5. 如請求項2至4中任一項之組合物，其中該免疫刺激性寡 核苷酸係選自包含以下之群： TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (SEQ ID NO: 1)； TCT CCC AGC GTG CGC CAT (SEQ ID NO:2); ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG (SEQ ID NO：3)； TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (SEQ ID NO:4)； TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (SEQ ID NO:5)。 Ci 6.如請求項2至4中任一項之組合物，其中該免疫刺激性寡 核苷酸含有至少兩個由至少3個核苷酸隔開之未甲基化 CG重複段。 7.如請求項6之組合物，其中該免疫刺激性寡核苷酸含有 至少兩個由6個核苷酸隔開之未甲基化CG重複段。 8 _如請求項1至4中任一項之組合物，其中該（等）抗原係不 帶正電荷之抗原。 9.如請求項1至4中任一項之組合物，其中該等抗原之一或 131205.doc 200911304 多種係腫瘤相關抗原。 10·如請求項9之組合物’其中該抗原係選自由以下組成之 群：MAGE-3、CPC-P501S、WT-1。 11 ·如請求項1至4中任一項之組合物，其中該等抗原中至少 一種係HIV-1衍生抗原。 12. 如請求項丨丨之組合物，其中該等抗原之一係F4。 13. 如請求項11之組合物，其中該等抗原係ρ4及卯12〇。 14. 種製備如請求項1至12中任一項之冷凍乾燥組合物之 方法，其包含以下步驟：將該期望抗原及TLR9配體與適 且賦形劑混合，及由所得調配物進行施冷凍乾燥循環。 15. —種製備免疫原性組合物之方法，其包含用適宜載劑重 構如請求項1至12中任一項之冷凍乾燥組合物之步驟。 16. 如請求項14之方法，其中該載劑係選自包含以下之群之 微粒載劑：礦物鹽、乳液、聚合物、脂質體、说⑽。 17. 如凊求項15之方法，其中該載劑係脂質體溶液或水包油 乳液。
    18·如請求項14至16中任一項之方法 一或多種免疫刺激劑。 其中該載劑另外包含 19.如請求項17之方法’其中該一或多種免疫刺激劑係選 由以下組成之群：TLR4激動劑、TLR4拮抗劑、息苦 TLR7激動劑、TLR8激動劑、TLR9激動劑。 3 -去醒基化 20·如請求項18之方法 MPL。 其中該TLR 4拮抗劑係 21.如請求項18之方法，其中該皂苷sQS2i。 131205.doc 200911304 22. 如請求項1 7之方法，其中該載劑包含兩種免疫刺激劑。 23. 如請求項21之方法，其中該等免疫刺激劑係3-去醯基化 MPL及QS21 。 f 131205.doc
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