PT1165778E

PT1165778E - Utilizações de polinucleótidos e polipéptidos casb618

Info

Publication number: PT1165778E
Application number: PT00910793T
Authority: PT
Inventors: Claudine Elvire Marie Bruck; Jean-Pol Cassart; Thierry Coche; Carlota Vinals Y De Bassols
Original assignee: Glaxosmithkline Biolog Sa
Priority date: 1999-03-11
Filing date: 2000-03-09
Publication date: 2007-01-31
Also published as: US7470782B2; WO2000053748A2; DK1165778T3; NO20014293D0; HK1044794A1; HUP0200366A2; CN1370231A; HK1044794B; CZ20013268A3; US20060052593A1; IL145047A0; JP2002538787A; CA2366147A1; ES2273670T3; CN100430478C; DE60031383T2; WO2000053748A3; ATE342727T1; KR100674784B1; KR20020008125A

Description

DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÕES DE POLINUCLEÓTIDOS E POLIPÉPTIDOS CASB618" A presente invenção refere-se a utilizações de polinucleótidos, aqui referidos como polinucleótidos CASB618, ou a utilizações de polipéptidos codificados por eles (aqui referidos como polipéptidos CASB618) no fabrico de um medicamento no tratamento de cancro do cólon e em processos para diagnosticar o cancro do cólon. Os polipéptidos e polinucleótidos da presente invenção são imunogénios importantes para imunização profiláctica ou terapêutica contra tumores, porque são expressos especificamente ou em pormenor sobre-expressos em tumores em comparação com células normais e podem ser direccionados por mecanismos imunes específicos para o antigénio, conduzindo à destruição da célula tumoral. Eles podem também ser utilizados para diagnosticar a ocorrência de células tumorais. Além disso, a sua expressão desapropriada, em certas circunstâncias, pode provocar uma indução de respostas imunitárias auto-imunes, desapropriadas, que podem ser corrigidas através de vacinação apropriada, utilizando os mesmos polipéptidos e polinucleótidos. A este respeito, as propriedades biológicas mais importantes são as actividades antigénicas e imunogénicas dos polipéptidos aqui descritos. Um polipéptido aqui descrito pode também exibir, pelo menos, uma outra actividade biológica de um polipéptido CASB618, que poderia qualificá-lo como um alvo para intervenção terapêutica ou profiláctica diferente daquela ligada à sua utilização como um imunoterapêutico. 1 A genómica funcional baseia-se fortemente em tecnologias de seguenciação de ADN de elevado rendimento e nas várias ferramentas de bioinformática para identificar sequências de genes de interesse potencial a partir das muitas bases de dados de biologia molecular agora disponíveis. Podem ser construídas bibliotecas de ADNc, enriquecidas em genes de relevância, para um tecido particular ou situação fisiológica, utilizando estratégias de clonagem subtractiva recentemente desenvolvidas. Além disso, os ADNc encontrados nas bibliotecas de certos tecidos e não de outros podem ser identificados utilizando métodos de rastreio electrónico apropriados. A biologia baseada em genoma ou em genes de elevado rendimento permite novas abordagens para a identificação e clonagem de genes alvo para respostas imunitárias úteis para a prevenção e terapia de vacinas de doenças, tais como um cancro e autoimunidade.

Num primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a utilizações de polipéptidos CASB618. Esses péptidos incluem polipéptidos isolados compreendendo uma sequência de aminoácidos que possui, pelo menos, 70% de identidade, de um modo preferido, pelo menos, 80% de identidade, de um modo mais preferido, pelo menos, 90% de identidade, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, 95% de identidade, de um modo muito preferido, pelo menos, 97-99% de identidade, com a da SEQ ID N°: 2, ao longo do comprimento total da SEQ ID N°: 2. Esses polipéptidos incluem aqueles que compreendem o aminoácido da SEQ ID N°: 2.

Outros péptidos aqui descritos incluem polipéptidos isolados em que a sequência de aminoácidos possui, pelo menos, 70% de identidade, de um modo preferido, pelo menos, 80% de identidade, de um modo mais preferido, pelo menos, 90% de identidade, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, 95% de identidade, de um 2 modo muito preferido, pelo menos, 97-99% de identidade, com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 2, ao longo do comprimento total da SEQ ID N°: 2. Esses polipéptidos incluem o polipéptido da SEQ ID N°: 2.

Outros péptidos aqui descritos incluem polipéptidos isolados codificados por um polinucleótido compreendendo a sequência contida na SEQ ID N°: 1. A invenção também proporciona utilizações de um fragmento imunogénico de um polipéptido CASB618, que é uma porção contígua do polipéptido CASB618 que possui as mesmas propriedades imunogénicas ou semelhantes, ao polipéptido, compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 2. O mesmo é dizer que o fragmento (se necessário quando acoplado a um veículo) é capaz de originar uma resposta imunitária que reconhece o polipéptido CASB618. Esse fragmento imunogénico pode incluir, por exemplo, o polipéptido CASB618 sem uma sequência líder N-terminal, um domínio de transmembrana ou um domínio âncora C-terminal. Num aspecto preferido, o fragmento imunogénico de CASB618 de acordo com a invenção, compreende substancialmente todo o domínio extracelular de um polipéptido que possui, pelo menos, 70% de identidade, de um modo preferido, pelo menos, 80% de identidade, de um modo mais preferido, pelo menos, 90% de identidade, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, 95% de identidade, de um modo muito preferido, pelo menos, 97-99% de identidade, em relação à da SEQ ID N°:2, ao longo de todo o comprimento da SEQ ID N°: 2 .

Os fragmentos peptídicos que incorporam um epitopo de CASB618 compreenderão tipicamente pelo menos 7, de um modo preferido 9 ou 10 aminoácidos contíguos da SEQ ID N°: 2. Epitopos preferidos são apresentados nas SEQ ID N°: 5 a SEQ ID N° : 77. 3

As utilizações de péptidos que incorporam estes epitopos formam um aspecto preferido da presente invenção. Mimotopos que possuem as mesmas caracteristicas que esses epitopos e imunogénios compreendendo esses mimotopos que geram uma resposta imunitária que tem uma reacção cruzada com um epitopo no contexto da molécula de CASB618, também formam parte da presente invenção. A presente invenção inclui, por isso, utilizações de péptidos isolados compreendendo eles próprios epitopos e qualquer um dos seus mimotopos. 0 significado de mimotopo é definido como uma entidade que é suficientemente semelhante ao epitopo CASB618 nativo, de modo a ser capaz de ser reconhecido por anticorpos que reconhecem a molécula nativa; (Gheysen, H.M., et al., 1986, Synthetic peptides as antigens. Wiley, Chichester, Ciba Foundation Symposium 119, pl30-149; Gheysen, H.M., 1986,

Molecular Immunology, 23, 7, 709-715) ; ou são capazes de criar anticorpos, quando acoplados a um veiculo adequado, cujos anticorpos apresentam reacção cruzada com a molécula nativa.

Os mimotopos de péptido dos epitopos acima identificados podem ser concebidos para um objectivo particular através da adição, deleção ou substituição de aminoácidos eleitos. Assim, os péptidos da presente invenção podem ser modificados para os objectivos de facilitar a conjugação com um veiculo de proteína.

Por exemplo, pode ser desejável, para alguns métodos de conjugação química, incluir uma cisteína terminal ao epitopo.

Adicionalmente, pode ser desejável, para péptidos conjugados com um veículo de proteína, incluir um terminal hidrofóbico distai do terminal conjugado do péptido, de modo a que a extremidade livre não conjugada do péptido permaneça associada à superfície da proteína veículo. Isto reduz os graus de liberdade conformacionais do péptido e desse modo aumenta a probabilidade 4 de o péptido ser apresentado numa conformação que mais se assemelha à do péptido como se encontra no contexto da molécula total. Por exemplo, os péptidos podem ser alterados para possuírem uma cisteína N-terminal e uma cauda amidada C-terminal. Alternativamente, a adição ou substituição de uma forma de D-estereoisómero de um ou mais aminoácidos pode ser realizada para criar um derivado benéfico, por exemplo para aumentar a estabilidade do péptido. Os especialistas na técnica compreenderão que esses péptidos modificados, ou mimotopos, podem ser um mimotopo totalmente ou parcialmente não-peptídico, em que os resíduos constituintes não estão necessariamente confinados aos 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente. Adicionalmente, estes podem ser ciclizados através de técnicas conhecidas na matéria para induzir o péptido para uma conformação que se assemelha bastante à sua forma quando a sequência peptídica está no contexto da molécula total. Um método preferido de ciclização de um péptido compreende a adição de um par de resíduos de cisteína para permitir a formação de uma ponte persulfureto.

Além disso, os especialistas na técnica entenderão que o mimotopos ou imunogénios da presente invenção podem ser maiores do que os epitopos acima identificados e como tal podem compreender as sequências aqui reveladas. Consequentemente, os mimotipos da presente invenção podem consistir na adição de extensões do terminal N e/ou C de um número de outros resíduos naturais numa ou em ambas as extremidades. Os mimotopos peptídicos também podem ser sequências retro das sequências naturais, em que a orientação da sequência é invertida; ou alternativamente, as sequências podem ser inteiramente, ou pelo menos em parte, compreendidas por aminoácidos de D-estereoisómero) (sequências invertidas). Também, as sequências podem ser retro-inversas no carácter, em que a orientação da sequência é revertida e os aminoácidos estão na forma de 5 D-estereoisómero. Esses péptidos retro ou retro-inverso possuem a vantagem de serem não-próprios e como tal poderem superar problemas de auto-tolerância no sistema imunitário.

Alternativamente, os mimotopos peptidicos podem ser identificados utilizando anticorpos que são capazes, eles próprios, de se ligarem aos epitopos da presente invenção, utilizando técnicas, tais como tecnologia de apresentação de fagos (documento EP 0552267B1). Esta técnica cria um grande número de sequências peptídicas que mimetizam a estrutura dos péptidos nativos e são, por isso, capazes de se ligarem a anticorpos de péptidos anti-nativos, mas não partilham necessariamente eles próprios homologia de sequências significativa com o péptido nativo. Esta abordagem pode ter vantagens significativas por permitir a possibilidade de identificar um péptido com propriedades imunogénicas aumentadas, ou pode superar quaisquer problemas de tolerância potencial auto-antigénica que podem estar associados à utilização da sequência do péptido nativo. Adicionalmente, esta técnica permite a identificação de um padrão de reconhecimento para cada péptido nativo, em termos das suas propriedades químicas partilhadas entre as sequências de mimotopos reconhecidas. A acoplagem covalente do péptido ao veículo imunogénico pode ser realizada de um modo bem conhecido na técnica. Assim, por exemplo, para acoplamento covalente directo, é possível utilizar uma carbodiimida, glutaraldeído ou éster de (N-[γ-maleimido-butiriloxi]succinimida, utilizando ligandos heterobifuncionais comuns disponíveis comercialmente, tais como CDAP e SPDP (utilizando as instruções dos fabricantes). Após a reacção de acoplamento, o imunogénio pode ser facilmente isolado e purificado por meio de um método de diálise, um método de filtração em gel, um método de fraccionamento, etc. 6

Os tipos de veículos utilizados nos imunogénios da presente invenção serão rapidamente conhecidos pelo especialista na técnica. A função do veículo é a de proporcionar auxílio de citocina de modo a auxiliar a indução de uma resposta imunitária contra o péptido. Uma lista não exaustiva de veículos que podem ser utilizados na presente invenção inclui: Hemocianina de Lapa (KLH), albuminas do soro, tais como albumina do soro bovino (BSA), toxinas bacterianas inactivadas, tais como toxinas do tétano ou da difteria (TT e DT), ou os seus fragmentos recombinantes (por exemplo, Domínio 1 do Fragmento C de TT, ou o domínio de translocação de DT) , ou o derivado da proteína purificada da tuberculina (PPD). Alternativamente, os mimotopos ou epitopos podem ser conjugados directamente a veículos lipossomais, que podem compreender adicionalmente imunogénios capazes de proporcionar auxílio de células T. De um modo preferido, a proporção de mimotopos para veículo está na ordem de 1:1 a 20:1, e de um modo preferido, cada veículo deve comportar entre 3-15 péptidos.

Numa forma de realização da invenção, um veículo preferido é a Proteína D de Haemophilus influenzae (documento EP 0594610B1). A Proteína D é uma proteína de ligação a IgD de Haemophilus influenzae e foi patenteada por Forsgren (documento WO 91/18926, concedida EP 0594610B1). Em algumas circunstâncias, por exemplo em sistemas de expressão de imunogénio recombinante, pode ser desejável utilizar fragmentos de proteína D, por exemplo Proteína D l/3rd (compreendendo os aminoácidos N-terminais 100-110 da proteína D (documento GB 9717953.5)).

Outro método preferido de apresentação dos péptidos aqui descritos está no contexto de uma molécula de fusão recombinante. Por exemplo, o documento EP 0421635B descreve a utilização de partículas antigénicas do núcleo de hepadnavírus quiméricas para apresentar sequências de péptido estranho numa 7 partícula de tipo vírus. Como tal, imunogénios para utilização na presente invenção podem compreender péptidos apresentados em partículas quiméricas consistindo em antigénio do núcleo da hepatite B. Adicionalmente, as proteínas de fusão recombinantes podem compreender os mimotopos da presente invenção e uma proteína veículo, tal como NS1 do vírus influenza. Para qualquer proteína expressa de forma recombinante que forma uma parte da presente invenção, o ácido nucleico que codifica o referido imunogénio também forma um aspecto da presente invenção. Péptidos utilizados na presente invenção podem ser rapidamente sintetizados por processos de fase sólida bem conhecidos na técnica. Sínteses adequadas podem ser realizadas utilizando processos "T-boc" ou "F-moc". Podem ser sintetizados péptidos cíclicos pelo processo de fase sólida empregando o processo bem conhecido "F-moc" e resina de poliamida no equipamento totalmente automatizado. Alternativamente, os especialistas na técnica conhecerão os processos de laboratório necessários para realizar o processo manualmente. Técnicas e processos para síntese de fase sólida são descritos em "Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach" de E. Atherton e R.C. Sheppard, publicado por IRL na Oxford University Press (1989). Alternativamente, os péptidos podem ser produzidos por métodos recombinantes, incluindo expressar moléculas de ácido nucleico codificando os mimotopos numa linha celular bacteriana ou de mamífero, seguido por purificação do mimotopo expresso. Técnicas para a expressão recombinante de péptidos e proteínas bem conhecidos na técnica, e são descritos em Maniatis, T., Fritsch, E.F. e Sambrook et ai., Molecular clonlng, a laboratory manual, 2a Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1989).

Os polipéptidos ou fragmento imunogénico aqui descrito pode estar na forma da proteína "madura" ou pode ser uma parte de uma proteína maior, tal como um precursor ou uma proteína de fusão. É frequentemente vantajoso incluir uma sequência de aminoácidos adicional que contém sequências secretoras ou líder, pró-sequências, sequências que auxiliam na purificação, tais como resíduos múltiplos de histidina, ou uma sequência adicional para estabilidade durante a produção do recombinante. Além disso, é também considerada a adição de polipéptido exógeno ou cauda lipídica ou sequências polinucleotídicas para aumentar o potencial imunogénico da molécula final.

Num aspecto, a invenção refere-se a utilizações de proteínas de fusão solúveis geneticamente modificadas, compreendendo um polipéptido da presente invenção, ou um seu fragmento, e várias porções das regiões constantes de cadeias pesada ou leve de imunoglobulinas de várias subclasses (IgG, IgM, IgA, IgE) . A parte constante da cadeia pesada de IgG humana é preferida como uma imunoglobulina, particularmente IgGl, onde a fusão ocorre na região da dobra. Numa forma de realização particular, a parte Fc pode ser removida simplesmente pela incorporação de uma sequência de clivagem que pode ser clivada com factor de coagulação do sangue Xa. Além disso, esta invenção refere-se a processos para a preparação destas proteínas de fusão por engenharia genética e à sua utilização para rastreio de fármacos, diagnóstico e terapia. Outro aspecto da invenção também se refere a utilizações de polinucleótidos que codificam essas proteínas de fusão. Exemplos da tecnologia de proteínas de fusão podem ser encontrados nos Pedidos de Patente Internacional N°s. W094/29458 e W094/22914.

As proteínas podem ser conjugadas quimicamente, ou expressas como proteínas de fusão recombinantes permitindo que sejam produzidos níveis incrementados num sistema de expressão em comparação com proteína não fundida. 0 parceiro de fusão pode auxiliar a proporcionar epitopos de "T helper" (parceiro de 9 fusão imunológico) , de um modo preferido, epitopos de "T helper" reconhecidos por humanos, ou auxiliar na expressão de proteina (intensificador de expressão) a rendimentos superiores aos da proteina recombinante nativa. De um modo preferido, o parceiro de fusão será tanto um parceiro de fusão imunológico como um parceiro intensificador de expressão.

Parceiros de fusão incluem proteina D de Haemophilus influenza B e a proteina não estrutural do virus influenza, NS 1 (hemaglutinina). Outro parceiro de fusão imunológico é a proteina conhecida como LYTA. De um modo preferido, é utilizada uma porção C-terminal da molécula. Lyta é derivado de Streptococcus pneumoniae que sintetiza uma amidase de N-acetil-L-alanina, amidase LYTA; (codificada pelo gene lytA {Gene, 43 (1986) página 265-272} uma autolisina que degrada especificamente certas ligações no esqueleto de peptidoglicano. 0 dominio C-terminal da proteina LYTA é responsável pela afinidade para a colina ou para alguns análogos de colina, tais como DEAE. Esta propriedade foi explorada para o desenvolvimento de plasmideos de expressão de C-LYTA de E. coli úteis para a expressão de proteínas de fusão. Foi descrita a purificação de proteínas hibridas contendo o fragmento de C-LYTA no seu terminal amino {Biotechnology: 10, (1992) página 795-798}. É possivel utilizar a porção repetida da molécula Lyta encontrada na extremidade C-terminal começando no residuo 178, por exemplo, residuos 188-305. A presente invenção também inclui utilizações de variantes dos polipéptidos acima mencionados, isto é polipéptidos que variam dos referentes por substituições de aminoácidos conservados, em que um residuo é substituído por outro com características semelhantes. Substituições típicas destas estão entre Ala, Vai, Leu e Ile; entre Ser e Thr; entre os resíduos 10 acidicos Asp e Glu; entre Asn e Gin, e entre os resíduos básicos Lys e Arg, ou resíduos aromáticos Phe e Tyr. São particularmente preferidas variantes em que vários, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 ou 1 aminoácidos são substituídos, removidos, ou adicionados em qualquer combinação.

Os polipéptidos aqui descritos podem ser preparados de qualquer modo adequado. Esses polipéptidos incluem polipéptidos isolados que ocorrem naturalmente, polipéptidos produzidos de forma recombinante, polipéptidos produzidos sinteticamente, ou polipéptidos produzidos por uma combinação desses métodos. Os meios para preparar esses polipéptidos são bem conhecidos na técnica.

Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a utilizações de polinucleótidos CASB618. Esses polinucleótidos incluem polinucleótidos isolados compreendendo uma sequência de nucleótidos codificando um polipéptido que possui, pelo menos, 70% de identidade, de um modo preferido, pelo menos, 80% de identidade, de um modo mais preferido, pelo menos, 90% de identidade, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, 95% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°:2, ao longo de todo o comprimento da SEQ ID N°:2. A este respeito, os polipéptidos que possuem, pelo menos, 97% de identidade são altamente preferidos, enquanto que aqueles com 98-99% de identidade são ainda mais altamente preferidos e aqueles com, pelo menos, 99% de identidade são os mais altamente preferidos. Esses polinucleótidos incluem um polinucleótido compreendendo a sequência de nucleótidos contida na SEQ ID N°:1 codificando o polipéptido da SEQ ID N°:2.

Outros polinucleótidos aqui descritos incluem polinucleótidos isolados compreendendo uma sequência de nucleótidos que possui, pelo menos, 70% de identidade, de um 11 modo preferido, pelo menos, 80% de identidade, de um modo mais preferido, pelo menos, 90% de identidade, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, 95% de identidade com uma sequência de nucleótidos codificando o polipéptido da SEQ ID N°:2, ao longo de toda a região codificante. A este respeito, os polipéptidos que possuem, pelo menos, 97% de identidade são altamente preferidos, enquanto que aqueles com 98-99% de identidade são ainda mais altamente preferidos e aqueles com, pelo menos, 99% de identidade são os mais altamente preferidos.

Outros polinucleótidos aqui descritos incluem polinucleótidos isolados compreendendo uma sequência de nucleótidos que possui, pelo menos, 70% de identidade, de um modo preferido, pelo menos, 80% de identidade, de um modo mais preferido, pelo menos, 90% de identidade, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, 95% de identidade, com a SEQ ID N°:l ao longo de todo o comprimento da SEQ ID N°:l. A este respeito, os polinucleótidos que possuem, pelo menos, 97% de identidade são altamente preferidos, enquanto que aqueles com, pelo menos, 98-99% de identidade são mais altamente preferidos, e aqueles com, pelo menos, 99% de identidade são os mais altamente preferidos. Esses polinucleótidos incluem um polinucleótido compreendendo o polinucleótido da SEQ ID N°: bem como o polinucleótido da SEQ ID N°: 1. O referido polinucleótido pode ser inserido num plasmideo adequado ou vector de microrganismo recombinante e utilizado para imunização (ver, por exemplo, Wolff et. al., Science 247: 1465-1468 (1990); Corr et. al., J. Exp. Med. 184 : 1555-1560 (1996); Doe et. al., Proc. Natl. Acad. Sei. 93: 8578-8583 (1996)). Também são revelados polinucleótidos que são complementares a todos os polinucleótidos acima descritos. A invenção também proporciona a utilização de um fragmento de um polinucleótido CASB618 no fabrico de um medicamento que, 12 quando administrado a um indivíduo possui as mesmas propriedades imunogénicas que o polinucleótido da SEQ ID N° : 1. A invenção também proporciona a utilização de um polinucleótido codificando um fragmento imunológico de um fragmento de um polipéptido CASB618 como aqui definido acima. A sequência de nucleótidos da SEQ ID N°: 1 apresenta homologia com o clone 163_P_10 mapa 15 do cromossoma 15 de Homo sapiens (n° de acesso GB_HTG4:AC009700). A sequência de nucleótidos da SEQ ID N° : 1 é uma sequência de ADNc e compreende uma sequência codificando um polipéptido (nucleótido 259 a 1219) codificando um polipéptido de 320 aminoácidos, o polipéptido da SEQ ID N°:2. A sequência de nucleótidos codificando o polipéptido da SEQ ID N°:2 pode ser idêntica à sequência que codifica o polipéptido contida na SEQ ID N°:l, ou pode ser uma sequência diferente daquela contida na SEQ ID N°:l, que, como resultado da redundância (degenerescência) do código genético, também codifica o polipéptido da SEQ ID N°:2. O polipéptido da SEQ ID N°:2 não está relacionado com nenhuma outra proteína de função conhecida, excepto com a proteína hipotética c06el.3 de 42,1 kd de Caenorbabditis elegans (acesso P34298). É esperado que os polipéptidos e polinucleótidos preferidos para as utilizações da presente invenção possuam, inter alia, funções/propriedades biológicas semelhantes aos seus polipéptidos e polinucleótidos homólogos. Além disso, polipéptidos, fragmentos imunológicos e polinucleótidos preferidos para as utilizações da presente invenção possuem, pelo menos, uma actividade de SEQ ID N°: 1 ou de SEQ ID N°:2, como apropriado. 13 A presente invenção também se refere a utilizações de sequências parciais, ou outras incompletas, de polinucleótidos e de polipéptidos que foram primeiro identificadas antes da determinação das sequências de comprimento total correspondentes de SEQ ID N°: 1 e SEQ ID N°: 2.

Consequentemente, num outro aspecto, a presente invenção proporciona utilizações de um polinucleótido isolado que: (a) compreende uma sequência de nucleótidos que possui, pelo menos, 70% de identidade, de um modo preferido, pelo menos, 80% de identidade, de um modo mais preferido, pelo menos, 90% de identidade, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, 95% de identidade, de um modo muito preferido, pelo menos, 97-99% de identidade, com a da SEQ ID N°: 3, ao longo do comprimento total da SEQ ID N°: 3/ (b) possui uma sequência de nucleótidos que possui, pelo menos, 70% de identidade, de um modo preferido, pelo menos, 80% de identidade, de um modo mais preferido, pelo menos, 90% de identidade, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, 95% de identidade, de um modo muito preferido, pelo menos, 97-99% de identidade, com a da SEQ ID N°:l, ao longo do comprimento total da SEQ ID N°: 3; (c) o polinucleótido da SEQ ID N°: 3. A sequência de nucleótidos da SEQ ID N°:3 é derivada de sequências de EST (Sequência de Etiqueta Expressa) . É reconhecido pelos especialistas na técnica que existirão inevitavelmente alguns erros de leitura da sequência de nucleótidos nas sequências de EST (ver Adams, M.D. et ai.,

Nature 377 (supl) 3, 1995). Consequentemente, a sequência de nucleótidos da SEQ ID N°:3 está, por isso, submetida às mesmas limitações inerentes na precisão da sequência. 14

Os polinucleótidos aqui descritos podem ser obtidos utilizando técnicas de clonagem e de rastreio a partir de uma biblioteca de ADNc derivada de ARNm em células humanas de cancro do cólon, cancro do pulmão, cancro do útero e tecidos fetais (por exemplo, Sambrook et al., Molecular Clonlng: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, N.Y. (1989)). Os polinucleótidos da invenção também podem ser obtidos a partir de fontes naturais, tais como bibliotecas de ADN genómico, ou podem ser sintetizadas utilizando técnicas bem conhecidas e comercialmente disponíveis.

Quando os polinucleótidos aqui descritos são utilizados para a produção recombinante de polipéptidos aqui descritos, o polinucleótido pode incluir a sequência codificante para o polipéptido maduro, por si próprio; ou a sequência codificante para o polipéptido maduro na grelha de leitura com outras sequências codificantes, tais como as que codificam uma sequência líder ou secretora, uma sequência de proteína pré-, ou pró- ou pré-pró, ou outras porções de péptido de fusão. Por exemplo, pode ser codificada uma sequência marcadora que facilita a purificação do polipéptido fundido. Em certas formas de realização preferidas deste aspecto da invenção, a sequência marcadora é um péptido de hexa-histidina, como proporcionado no vector pQE (Qiagen, Inc.) e descrito em Gentz et al., Proc. Natl Acad Sei USA (1989) 86:821-824, ou numa etiqueta HA. O polinucleótido também pode conter sequências 5' e 3' não codificantes, tais como sequências transcritas, não traduzidas, sinais de excisão e poliadenilação, sítios de ligação ribossómica e sequências que estabilizam o ARNm.

Outra forma de realização aqui descrita inclui polinucleótidos que codificam variantes de polipéptido que compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°:2 e em que 15 vários, por exemplo 5 a 10, 1 a 5, 1 a 3, 1 a 2 ou 1 resíduos de aminoácidos são substituídos, removidos ou adicionados, em qualquer combinação.

Polinucleótidos que são idênticos ou suficientemente idênticos a uma sequência de nucleótidos contida na SEQ ID N°:l, podem ser utilizados como sondas de hibridação para ADNc ou ADN genómico ou como iniciadores para uma reacção de amplificação de ácido nucleico (PCR), para isolar clones de ADNc de comprimento total e genómicos codificando polipéptidos da presente invenção e para isolar clones de ADNc e genómicos de outros genes (incluindo genes codificando parálogos de fontes humanas e ortólogos e parálogos de outras espécies diferentes de humano) que possuem uma semelhança de sequência elevada com SEQ ID N°: 1. Tipicamente, estas sequências de nucleótidos são 70% idênticas, de um modo preferido 80% idênticas, de um modo mais preferido 90% idênticas, de um modo muito preferido 95% idênticas às do referente. As sondas ou iniciadores compreenderão normalmente pelo menos 15 nucleótidos, de um modo preferido, pelo menos 30 nucleótidos e podem possuir, pelo menos, 50 nucleótidos. Sondas particularmente preferidas possuirão entre 30 e 50 nucleótidos. Iniciadores particularmente preferidos possuirão entre 20 e 25 nucleótidos. Em particular, polipéptidos ou polinucleótidos derivados de sequências com origem em animal homólogo poderiam ser utilizadas como imunogénios para obter uma resposta imunitária de reacção cruzada com o gene humano.

Um polinucleótido codificando um polipéptido aqui descrito incluindo homólogos de espécies diferentes de humano, pode ser obtido por um processo que compreende os passos de rastreio de uma biblioteca apropriada em condições de hibridação restringentes com uma sonda marcada possuindo a sequência da SEQ ID NO: 1 ou um seu fragmento; e isolar ADNc de comprimento total e clones genómicos contendo a referida sequência 16 polinucleotídica. Essas técnicas de hibridação são bem conhecidas dos especialistas na técnica. Condições de hibridação restringentes preferidas incluem incubação durante a noite, a 42 °C numa solução compreendendo: formamida a 50%, 5xSSC (NaCl a 150 mM, citrato trissódico a 15 mM) , fosfato de sódio a 50 mM (pH 7,6), solução de Denhardt a 5x, sulfato de dextrano a 10%, e 20 micrograma/mL de ADN de esperma de salmão desnaturado, quebrado; seguido por lavagem dos filtros em SSC a 0,lx a cerca de 65 °C. Assim, a presente invenção também inclui a utilização de polinucleótidos obteníveis por rastreio de uma biblioteca apropriada em condições de hibridação restringentes com uma sonda marcada possuindo a sequência de SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID N°:4 ou um seu fragmento. O especialista na técnica entenderá que, em muitos casos, uma sequência de ADNc isolado estará incompleta, na medida em que a região codificante para o polipéptido é curta na extremidade 5' do ADNc.

Existem vários métodos disponíveis e bem conhecidas dos especialistas na técnica para obter ADNcs de comprimento total, ou estender ADNcs curtos, por exemplo, aqueles que se baseiam no método de Amplificação Rápida de extremidades de ADNc (RACE) (ver, por exemplo, Frohman et al., PNAS USA 85, 8998-9002, 1988). Modificações recentes da técnica, exemplificadas pela tecnologia Marathon™ (Clontech Laboratories Inc.) por exemplo, simplificaram significativamente a pesquisa de ADNcs mais compridos. Na tecnologia Marathon™, os ADNc foram preparados a partir de ARNm extraído de um tecido escolhido e uma sequência "adaptadora" ligada a cada extremidade. É então realizada amplificação de ácido nucleico (PCR) para amplificar a extremidade 5' "desaparecida" do ADNc utilizando uma combinação de iniciadores oligonucleotídicos específicos para o gene e específicos para o adaptador. A reacção de PCR é então repetida 17 utilizando iniciadores "internos", isto é, iniciadores concebidos para emparelhar dentro do produto amplificado (tipicamente um iniciador especifico para o adaptador que emparelha ainda a 3' na sequência adaptadora e um iniciador especifico para o gene que emparelha ainda a 5' na sequência do gene conhecida). Os produtos desta reacção podem ser então analisados por sequenciação de ADN e um ADNc de comprimento total construído quer unindo o produto directamente ao ADNc existente para produzir uma sequência completa, ou realizando uma PCR separada de comprimento total utilizando a nova informação de sequência para conceber o iniciador 5'.

Os polipéptidos recombinantes aqui descritos podem ser preparados por processos bem conhecidos na técnica a partir de células hospedeiras geneticamente modificadas compreendendo sistemas de expressão.

Para produção recombinante, as células hospedeiras podem ser geneticamente modificadas para incorporar sistemas de expressão ou porções destes para os polinucleótidos aqui descritos. A introdução de polinucleótidos nas células hospedeiras pode ser realizada por métodos descritos em muitos manuais de laboratório convencionais, tais como Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) e Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Tais métodos preferidos incluem, por exemplo, transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada com DEAE-dextrano, transvecção, micro-injecção, transfecção mediada por lipidos catiónicos, electroporação, transdução, aplicação de raspagem, introdução por balística ou infecção.

De um modo preferido, as proteínas aqui descritas são co-expressas com tiorredoxina em trans (TIT). A co-expressão de 18 tiorredoxina em trans versus em cis é preferida para manter o antigénio isento de tiorredoxina sem a necessidade de protease. A co-expressão da tiorredoxina possui também um impacto significativo no rendimento da purificação da proteína, na solubilidade e qualidade da proteína purificada.

Exemplos representativos de hospedeiros apropriados incluem células bacterianas, tais como células de Streptococci, Staphylococci, E. coli, Streptomyces e Bacillus subtilis; células de fungos, tais como células de levedura e células de Aspergillus; células de insecto, tais como células de Drosophila S2 e Spodoptera Sf9; células animais, tais como células CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK 293 e células de melanoma de Bowes; e células vegetais.

Pode ser utilizada uma grande variedade de sistemas de expressão, por exemplo, sistemas cromossómicos, epissómicos e derivados de vírus, e. g., vectores derivados de plasmídeos bacterianos, bacteriófago, transposões, epissomas de levedura, elementos de inserção, elementos cromossómicos de levedura, vírus, tais como baculovírus, papovavírus, tais como SV40, vírus vaccinia, adenovírus, vírus da varíola avícola, vírus da pseudo-raiva e retrovírus, e vectores derivados de combinações destes, tais como os derivados de elementos genéticos de plasmídeo e bacteriófago, tais como cosmídeos e fagemídeos. Os sistemas de expressão podem conter regiões de controlo que regulam, assim como engendram a expressão. Geralmente, pode ser utilizado qualquer sistema ou vector que é capaz de manter, propagar ou expressar um polinucleótido para produzir um polipéptido num hospedeiro. A sequência de nucleótidos apropriada pode ser inserida num sistema de expressão através de qualquer uma de uma variedade de técnicas bem conhecidas e de rotina, tais como, por exemplo, aquelas apresentadas em Sambrook et al., Molecular 19

Cloning, A Laboratory Manual (supra). Podem ser incorporados sinais de secreção apropriados no polipéptido desejado para permitir a secreção da proteína traduzida para o lúmen do retículo endoplásmico, o espaço periplásmico ou o ambiente extracelular. Estes sinais podem ser endógenos para o polipéptido ou podem ser sinais heterólogos. 0 sistema de expressão pode também ser um microrganismo recombinante vivo, tal como um vírus ou bactéria. 0 gene de interesse pode ser inserido no genoma de um vírus ou bactéria recombinante vivo. A inoculação e infecção in vivo com este vector vivo conduzirá à expressão in vivo do antigénio, e à indução de respostas imunitárias. Vírus e bactérias utilizados para este objectivo são por exemplo: poxvírus (e. g.; vaccinia, varíola das aves, varíola de canários), alfavírus (vírus

Sindbis, Vírus da Floresta de Semliki, Vírus da Encefalite Equina Venezuelana), adenovírus, vírus adeno-associados, picomavírus (poliovírus, rinovírus), herpesvírus (vírus zoster da varicela, etc.), Listeria, Salmonella, Shigella, BCG. Estes vírus e bactérias podem ser virulentos ou atenuados de várias maneiras, de modo a obter vacinas vivas. Essas vacinas vivas também formam parte da invenção.

Os polipéptidos aqui descritos podem ser recuperados e purificados a partir de culturas de células recombinantes através de métodos bem conhecidos, incluindo sulfato de amónio ou precipitação com etanol, extracção ácida, cromatografia de permuta aniónica ou catiónica, cromatografia em fosfocelulose, cromatografia de interacção hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia em hidroxilapatite e cromatografia em lectina. De um modo muito preferido é empregue cromatografia de afinidade de ião metálico (IMAC) para purificação. Podem ser empregues técnicas bem conhecidas para remoldar proteínas, para 20 regenerar conformação activa quando o polipéptido é desnaturado durante síntese intracelular, isolamento e, ou purificação.

Outro aspecto importante da invenção refere-se a um método para o fabrico de um medicamento para induzir, reforçar ou modular uma resposta imunológica num mamífero que compreende inocular o mamífero com um fragmento para o polipéptido ou polinucleótido total aqui descrito, adequado para produzir anticorpo e/ou resposta imunitária de células T para profilaxia ou para tratamento terapêutico de cancro e doença autoimune e estados relacionados. Ainda outro aspecto da invenção refere-se a um método para o fabrico de um medicamento para induzir, reforçar ou modular resposta imunológica num mamífero que compreende distribuir um polipéptido aqui descrito através de um vector ou célula, dirigindo a expressão de um polinucleótido e codificando o polipéptido in vivo de modo a induzir uma tal resposta imunológica para produzir respostas imunitárias para profilaxia ou tratamento de doenças do referido mamífero.

Outro aspecto da invenção refere-se à utilização de uma formulação imunológica/vacina (composição) que, quando introduzida num mamífero hospedeiro induz, reforça ou modula uma resposta imunológica nesse mamífero para um polipéptido da presente invenção, em que a composição compreende um polipéptido ou polinucleótido da invenção ou um seu fragmento imunológico como aqui definido anteriormente. A formulação de vacina pode ainda compreender um veículo adequado. Dado que um polipéptido pode ser degradado no estômago é, de um modo preferido, administrado parentericamente (por exemplo, injecção subcutânea, intramuscular, intravenosa, ou intradérmica). Formulações adequadas para administração parentérica incluem soluções de injecção estéreis aquosas e não aquosas, que podem conter anti-oxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam a formulação isotónica com o sangue do recipiente; e 21 suspensões aquosas e não aquosas estéreis que podem incluir agentes de suspensão ou agentes espessantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou de multi-dose, por exemplo, ampolas e frasquinhos selados e podem ser armazenadas num estado liofilizado, requerendo apenas a adição do veiculo liquido estéril imediatamente antes da utilização.

Um aspecto adicional da invenção refere-se à indução in vitro de respostas imunitárias a um fragmento ou ao polipéptido ou polinucleótido inteiro aqui revelado ou uma molécula compreendendo o referido polipéptido ou polinucleótido, utilizando células do sistema imunitário de um mamifero, e reinfusão dessas células imunitárias activadas do mamifero para o tratamento da doença. A activação das células do sistema imunitário é alcançada por incubação in vitro com o polipéptido ou polinucleótido inteiro, aqui descrito ou uma molécula compreendendo o polipéptido ou polinucleótido, aqui descrito na presença ou ausência de várias moléculas imunomoduladoras. Outro aspecto da invenção refere-se à imunização de um mamifero através da administração de células apresentando antigénios modificadas por aplicação in vitro com parte ou a totalidade do polipéptido aqui revelado ou uma molécula compreendendo o polipéptido aqui descrito e administrado in vivo de um modo imunogénico. Alternativamente, as células apresentando antigénio podem ser transfectadas in vitro com um vector contendo um fragmento ou o polinucleótido inteiro aqui descrito, ou uma molécula compreendendo o polinucleótido aqui descrito, tal como expressar o polipéptido correspondente, e administrar in vivo de um modo imunogénico. A formulação de vacina da invenção também pode incluir sistemas adjuvantes para aumentar a imunogenicidade da 22 formulação. De um modo preferido, o sistema adjuvante origina, de um modo preferido, uma resposta do tipo TH1.

Uma resposta imunitária pode ser distinguida de um modo geral em duas categorias extremas, sendo respostas imunitárias humoral ou mediada por células (tradicionalmente caracterizada por mecanismos de protecção efectores de anticorpos ou celulares, respectivamente). Estas categorias de resposta foram denominadas respostas do tipo TH1 (resposta mediada por células), e respostas imunitárias de tipo TH2 (resposta humoral).

Respostas imunitárias de tipo TH1 extremas podem ser caracterizadas pela criação de linfócitos T citotóxicos de haplotipo restrito, específicos para o antigénio, e respostas de células "natural killer". Em murganhos, as respostas de tipo TH1 são frequentemente caracterizadas pela criação de anticorpos do sub-tipo IgG2a, enquanto que no ser humano estas correspondem a anticorpos de tipo IgGl. As respostas imunitárias de tipo TH2 são caracterizadas pela criação de uma vasta gama de isotipos de imunoglobulina, incluindo, em murganhos, IgGl, IgA e IgM.

Pode ser considerado que a força motriz por trás do desenvolvimento destes dois tipos de respostas imunitárias são citocinas. Níveis elevados de citocinas de tipo TH1 tendem a favorecer a indução de respostas imunitárias mediadas por células ao dado antigénio, enquanto que níveis elevados de citocinas de tipo TH2 tendem a favorecer a indução de respostas imunitárias humorais ao antigénio. A distinção de respostas imunitárias de tipo TH e TH2 não é absoluta. Na realidade, um indivíduo suportará uma resposta imunitária que é descrita como sendo predominantemente TH1, ou predominantemente TH2. Todavia, é frequentemente conveniente 23 considerar as famílias de citocinas em termos das descritas em células CD4+ve de murideo por Mosmann e Coffman (Mosmann, T.R. e Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, pl45-173). Tradicionalmente, as respostas de tipo TH1 estão associadas à produção das citocinas INF-γ e IL-2 pelos linfócitos T. Outras citocinas frequentemente associadas directamente à indução das respostas imunitárias de tipo TH1 não são produzidas por células T, tais como IL-12. Em contraste, as respostas de tipo TH2 estão associadas à secreção de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13. É conhecido que certos adjuvantes de vacina são particularmente adequados à estimulação de respostas de citocina quer de tipo TH1 ou TH2. Tradicionalmente, os melhores indicadores do equilíbrio TH1:TH2 da resposta imunitária após uma vacinação ou infecção, inclui a medição directa da produção de citocinas TH1 ou TH2 por linfócitos T in vitro após re-estimulação com antigénio e/ou a medição da proporção IgGl:IgG2a de respostas de anticorpo especificas para o antigénio.

Deste modo, um adjuvante de tipo TH1 é aquele que estimula, de um modo preferido, populações de células T isoladas para produzir niveis elevados de citocinas de tipo TH1 quando re-estimuladas com antigénio in vitro e promove o desenvolvimento de linfócitos T CD8+ citotóxicos e respostas de imunoglobulina especifica para o antigénio, associadas ao isotipo de tipo TF1.

Adjuvantes que são capazes de estimulação preferida da resposta de células TH1 são descritos no Pedido de Patente Internacional N° WO 94/00153 e WO 95/17209. 24 Ο 3 des-O-acilado de monofosforilo lípido A (3D-MPL) é um desses adjuvantes. Este é conhecido a partir do documento GB 2220211 (Ribi). Quimicamente é uma mistura de 3 des-O-acilado de monofosforilo lipido A com 4, 5 ou 6 cadeias aciladas e é produzido por Ribi Immunochem, Montana. Uma forma preferida de 3 Des-O-acilado de monofosforilo lipido A é revelada na Patente Europeia 0689454B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA) .

De um modo preferido, as partículas de 3D-MPL são suficientemente pequenas para serem esterilizadas por filtração através de uma membrana de 0,22 micron (Patente Europeia número 0689454). O 3D-MPL estará presente no intervalo de 10 pg-100 pg, de um modo preferido 25-50 pg por dose, em que o antigénio estará tipicamente presente num intervalo de 2-50 pg por dose.

Outro adjuvante preferido compreende QS21, uma fracção purificada por Hplc derivada da casca de Quillaja Saponaria Molina. Opcionalmente, esta pode ser misturada com o 3 Des-O-acilado de monofosforilo lípido A (3D-MPL), opcionalmente juntamente com um veículo. O método de produção de QS21 é revelado na Patente US N° 5057540.

Formulações de adjuvante não reactogénico contendo QS21 foram descritas anteriormente (documento WO 96/33739) . Essas formulações compreendendo QS21 e colesterol demonstraram ser adjuvantes de estimulação de TH1 com sucesso, quando formulados juntamente com um antigénio.

Outros adjuvantes que são estimuladores prefereridos de resposta de células TH1 incluem oligonucleótidos imunomoduladores, por exemplo sequências CpG não metiladas, como revelado no documento WO 96/02555. 25

Combinações de diferentes adjuvantes estimuladores de TH1, tais como aquelas aqui mencionadas acima, estão também contempladas como proporcionando um adjuvante que é um estimulador preferencial de resposta de células TH1. Por exemplo, o QS21 pode ser formulado juntamente com 3D-MPL. A proporção de QS21:3D-MPL será tipicamente da ordem de 1:10 a 10:1; de um modo preferido 1:5 a 5:1 e frequentemente substancialmente 1:1. O intervalo preferido para sinergia óptima é de 2,5:1 a 1:1 de 3D-MPL:QS21.

De um modo preferido, um veiculo está também presente na composição de vacina de acordo com a invenção. O veiculo pode ser uma emulsão óleo em água, ou um sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio ou hidróxido de aluminio.

Uma emulsão óleo-em-água preferida compreende um óleo metabolizável, tal como esqualeno, alfa tocoferol e Tween 80. Num aspecto particularmente preferido, os antigénios na composição de vacina de acordo com a invenção são combinados com QS21 e 3D-MPL numa tal emulsão. Adicionalmente, a emulsão óleo em água pode conter span 85 e/ou lecitina e/ou tricaprilina.

Tipicamente, para administração humana, QS21 e 3D-MPL estarão presentes numa vacina no intervalo de 1 pg-200 pg, tal como 10-100 pg, de um modo preferido 10 pg-50 pg por dose. Tipicamente, o óleo em água compreende desde 2 a 10% de esqualeno, de 2 a 10% de alfa tocoferol e desde 0,3 a 3% de tween 80. De um modo preferido, a proporção de esqualeno: alfa tocoferol é igual a, ou inferior a 1, dado que isto provoca uma emulsão mais estável o Span 85 pode também estar presente a um nível de 1%. Em alguns casos pode ser mais vantajoso que as vacinas da presente invenção contenham ainda um estabilizador. 26

Emulsões óleo em água não-tóxicas contêm, de um modo preferido, um óleo não tóxico, e. g. esqualano ou esqualeno, um emulsificador, e. g. Tween 80, num veiculo aquoso. O veiculo aquoso pode ser, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato.

Uma formulação de adjuvante particularmente potente envolvendo QS21,3D-MPL e tocoferol numa emulsão óleo em água é descrita no documento WO 95/17210. A presente invenção também proporciona a utilização de uma composição de vacina polivalente compreendendo uma vacina formulação da invenção em combinação com outros antigénios, em particular antigénios úteis para o fabrico de um medicamento para o tratamento de cancros, doenças autoimunes e estados relacionados. Uma tal composição de vacina polivalente pode incluir um adjuvante de indução de TH-1, como aqui descrito anteriormente.

Esta invenção também se refere à utilização de polinucleótidos, na forma de iniciadores derivados dos polinucleótidos da presente invenção, e de polipéptidos, na forma de anticorpos e reagentes específicos para o polipéptido da presente invenção, como reagentes de diagnóstico. A identificação de marcadores genéticos ou bioquímicos no sangue ou tecidos que permitirão a detecção de alterações muito precoces ao longo da via da carcinogénese irá auxiliar a determinar o melhor tratamento para o doente. Podem ser utilizados substitutos de marcadores tumorais, tais como expressão de polinucleótido, para diagnosticar formas diferentes e estados de cancro. A identificação dos níveis de expressão dos polinucleótidos da invenção será útil tanto para calcular o estado do distúrbio cancerígeno como para classificar a natureza 27 do tecido canceroso. 0 processo de cálculo do estado monitoriza o avanço do cancro e é determinada a presença ou ausência de tecido maligno nas áreas sujeitas a biopsia. Os polinucleótidos da invenção podem auxiliar para perfeccionar o processo de cálculo através da identificação de marcadores para a agressividade de um cancro, por exemplo, a presença em diferentes áreas do corpo. A classificação do cancro descreve o quanto relacionado um tumor se parece com tecido normal do seu mesmo tipo e é avaliado pela sua morfologia celular e outros marcadores de diferenciação. Os polinucleótidos aqui descritos podem ser úteis na determinação do grau do tumor na medida em que podem auxiliar na determinação do estado de diferenciação das células de um tumor.

Os ensaios de diagnóstico oferecem um processo para diagnosticar ou determinar uma susceptibilidade a cancros, doença autoimune e estados relacionados através do diagnóstico por métodos compreendendo determinar, a partir de uma amostra derivada de um sujeito, um nível diminuído ou aumentado de polipéptido ou ARNm de uma anormalidade. Este método de diagnóstico é conhecido como expressão diferencial. A expressão de um gene particular é comparada entre um tecido doente e um tecido normal. A diferença entre o gene relacionado com o polinucleótido, ARNm, ou proteína nos dois tecidos é comparada, por exemplo, em peso molecular, sequência de aminoácidos ou sequência de nucleótidos, ou abundância relativa, indica uma alteração no gene, ou um gene que a regula, no tecido do humano que era suspeito de estar doente. A expressão diminuída ou aumentada pode ser medida ao nível do ARN. 0 ARN poliA é primeiro isolado a partir dos dois tecidos e a detecção do ARNm codificado por um gene correspondente a um polinucleótido expressado de um modo diferencial aqui descrito pode ser realizada através de, por exemplo, hibridação in situ 28 em secções de tecidos, transcriptase reversa-PCR, utilizando transferências de Northern contendo ARNm poli A+, ou qualquer outro método de detecção de ARN directo ou indirecto. Uma expressão aumentada ou diminuída de um dado ARN num tecido doente, comparado com um tecido normal sugere que o transcripto e/ou a proteína expressada tem um papel na doença. Assim, a detecção de um nível superior ou inferior de ARNm correspondente a SEQ ID N°: 1 ou 3 em relação ao nível normal é indicativo da presença de cancro no doente.

Os níveis de expressão de ARNm numa amostra podem ser determinados através da criação de uma biblioteca de marcadores de sequências expressas (ESTs) da amostra. A representação relativa de ESTs na biblioteca pode ser utilizada para avaliar a representação relativa do transcripto do gene na amostra de partida. A análise de EST do teste pode ser então comparada com a análise de EST de uma amostra de referência para determinar os níveis de expressão relativa do polinucleótido de interesse.

Podem ser realizadas outras análises de ARNm utilizando a metodologia de análises de expressão de gene em série (SAGE) (Velculescu et. al. Science (1995) 270:484), metodologia de apresentação diferencial (Por exemplo, documento US 5776683) ou análise de hibridação que se baseia na especificidade das interacções de nucleótidos.

Alternativamente, a comparação pode ser feita ao nível da proteína. Os tamanhos da proteína nos dois tecidos podem ser comparados utilizando anticorpos para detectar polipéptidos em transferências de Western de extractos de proteína dos dois tecidos. Os níveis de expressão e a localização subcelular também podem ser detectados imunologicamente utilizando anticorpos para a proteína correspondente. Outras técnicas de ensaio que podem ser utilizadas para determinar níveis de uma 29 proteína, tais como um polipéptido da presente invenção, numa amostra derivada de um hospedeiro são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Um nível aumentado ou diminuído da expressão do polipéptido no tecido doente comparado com o nível de expressão da mesma proteína no tecido normal indica que a proteína expressada pode estar envolvida na doença.

Nos ensaios da presente invenção, o diagnóstico pode ser determinado pela detecção dos níveis de expressão do produto do gene codificado por pelo menos uma sequência apresentada em SEQ ID N°s: 1 ou 3. Uma comparação dos níveis de ARNm ou proteína num tecido doente versus normal pode também ser utilizada para seguir a progressão ou regressão de uma doença.

Um grande número de sequências polinucleotídicas numa amostra pode ser ensaiado utilizando polinucleótidos em "array". Estes podem ser utilizados para examinar a expressão diferencial de genes e para determinar a função do gene. Por exemplo, podem ser utilizados "arrays" das sequências polinucleotídicas SEQ ID N°: 1 ou 3 para determinar se qualquer um dos polinucleótidos são expressos de um modo diferencial entre uma célula normal e cancerosa. Numa forma de realização da invenção, um "array" de sondas de oligonucleótidos compreendendo a sequência de nucleótidos SEQ ID N°: 1 ou 3, ou seus fragmentos, pode ser construído para conduzir o rastreio eficiente de e. g., mutações genéticas. Os métodos da tecnologia de "array" são bem conhecidos e possuem aplicabilidade geral e podem ser utilizados para abordar uma variedade de questões em genética molecular, incluindo expressão genética, ligação genética, e variabilidade genética (ver, por exemplo: M. Chee et al., Science, Vol 274, pp 610-613 (1996)) . "Diagnóstico", como aqui utilizado inclui a determinação da susceptibilidade de um sujeito a doenças, determinação se um indivíduo possui presentemente a doença, e também o prognóstico de um indivíduo afectado pela doença. 30

As sequências de nucleótidos aqui descritas são também valiosas para a localização cromossómica. A sequência é especificamente diriqida para, e pode hibridar com, uma localização particular de um cromossoma humano individual. 0 mapeamento de sequências relevantes para cromossomas de acordo com a presente invenção é um primeiro passo importante na correlação destas sequências com a doença associada ao qene.

Assim que uma sequência tenha sido mapeada numa localização cromossómica precisa, a posição fisica da sequência no cromossoma pode ser correlacionada com resultados do mapa genético. Esses resultados encontram-se em, por exemplo, V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponível na internet através de Johns Hopkins University Welch Medicai Library). A relação entre genes e doenças que foram mapeadas para a mesma região cromossómica são então identificadas através da análise de ligação (co-herança de genes fisicamente adjacentes). As diferenças na sequência de ADNc ou genómico entre indivíduos afectados e não afectados também podem ser determinadas.

Os polipéptidos aqui descritos ou os seus fragmentos ou os seus análogos, ou células que os expressam, também põem ser utilizados como imunogénios para produzir anticorpos imunoespecíficos para os polipéptidos da presente invenção. 0 termo "imunoespecífico" significa que os anticorpos possuem substancialmente maior afinidade para os polipéptidos da invenção do que a sua afinidade para outros polipéptidos relatados ma técnica anterior. É também descrito um anticorpo imunoespecífico para um polipéptido aqui descrito, ou um seu fragmento imunológico como aqui definido anteriormente. De um modo preferido, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. 31

Anticorpos gerados contra polipéptidos aqui revelados podem ser obtidos administrando os polipéptidos ou fragmentos contendo epitopos, análogos ou células a um animal, de um modo preferido, um animal não humano, utilizando protocolos de rotina. Para a preparação de anticorpos monoclonais, qualquer técnica que proporcione anticorpos produzidos por culturas continuas de linhas celulares pode ser utilizada. Exemplos incluem a técnica de hibridomas (Kohler, G. e Milstein, C., Nature (1975) 256:495- 497), técnica de trioma, técnica de hibridoma de célula B humana (Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4:72) e técnica de hibridoma de EBV (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985). Técnicas para a produção de anticorpos de cadeia única, tais como as descritas na Patente U.S. N°. 4946778, também podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia única para os polipéptidos desta invenção.

Os anticorpos acima descritos podem ser empregues para isolar ou para identificar clones que expressam o polipéptido ou para purificar os polipéptidos por cromatografia de afinidade. 0 anticorpo da invenção também pode ser empregue para prevenir ou tratar lesões cancro, particularmente cancro do ovário e do cólon, doença autoimune e estados relacionados.

Outro aspecto da invenção refere-se a um método para o fabrico de um medicamento para induzir ou modular uma resposta imunológica num mamifero, que compreende inocular o mamifero com um polipéptido da presente invenção, adequado para produzir anticorpo e/ou resposta imunitária de células T para proteger ou melhorar os sintomas ou progressão da doença. Ainda outro aspecto da invenção refere-se a um método para o fabrico de um medicamento para induzir ou modular resposta imunológica num mamifero que compreende, distribuir um polipéptido aqui descrito 32 através de um vector dirigindo a expressão do polinucleótido e codificando para o polipéptido in vivo de modo a induzir uma tal resposta imunológica para produzir anticorpo para proteger o referido animal de doenças.

Será entendido que a presente invenção proporciona por isso utilizações para o fabrico de um medicamento para tratar estados anormais, tais como, por exemplo, cancro do cólon, relacionado gue com a presença de, ou com excesso de, ou uma sob-expressão de actividade do polipéptido CASB618. 0 polipéptido agui descrito pode ser utilizado para identificar receptores ligados à membrana ou solúveis, se existirem, através de técnicas de ligação ao receptor convencionais, conhecidas na técnica. Também podem ser utilizados métodos de rastreio bem conhecidos para identificar agonistas e antagonistas do polipéptido agui descrito gue compete com a ligação do polipéptido aqui descrito aos seus receptores, se existirem.

Será rapidamente entendido pelo especialista na técnica que um polipéptido aqui descrito também pode ser utilizado num método para a concepção baseada na estrutura de um agonista, antagonista ou inibidor do polipéptido, através de: (a) determinar em primeiro lugar a estrutura tridimensional do polipéptido; (b) deduzir a estrutura tridimensional para o(s) sitio(s) prováveis reactivos ou de ligação de um agonista, antagonista ou inibidor, (c) sintetizar compostos candidatos que se prevê que se liguem a ou reajam com o sitio de ligação ou reactivo deduzido; e 33 (d) testar se os compostos candidatos são na verdade agonistas, antagonistas ou inibidores. A terapia génica também pode ser empregue para realizar a produção endógena do polipéptido CASB618 pelas células relevantes no indivíduo. Para uma visão geral da terapia génica, ver o Capitulo 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, (e referências ai citadas) em Human Molecular Genetics, T Strachan e A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996). A preparação de vacina está descrita de um modo geral em Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 61 Vacine Design - the subunit and adjuvant approach, editado por Powell e Newman, Plenum Press, 1995. New Trends and Developments in Vacines, editado por Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, E.U.A. 1978. A encapsulação nos lipossomas é descrita, por exemplo, por Fullerton, Patente U.S. 4235877. A conjugação de proteínas em macromoléculas é revelada, por exemplo, por Likhite, patente U.S. 4372945 e por Armor et al., Patente U.S. 4474757. A quantidade de proteína em cada dose de vacina é seleccionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotectora sem efeitos colaterais adversos significativos, em vacinas típicas. Essa quantidade irá variar dependendo de qual imunogénio específico é empregue. Geralmente, é esperado que cada dose compreenda 1-1000 pg de proteína, de um modo preferido, 2-100 pg, de um modo muito preferido, 4-40 pg. Uma quantidade óptima para uma vacina particular pode ser determinada através de estudos convencionais envolvendo a observação de títulos do anticorpo e outras respostas em 34 indivíduos. Após uma vacinação inicial, os indivíduos podem receber um reforço dentro de cerca de 4 semanas. "Isolado" significa alterado "pela mão do homem" a partir do seu estado natural. Se uma composição ou substância "isolada" ocorre na natureza, foi alterada ou removida do seu ambiente original, ou ambos. Por exemplo, um polinucleótido ou um polipéptido presente naturalmente num animal vivo não está "isolado", mas o mesmo polinucleótido ou polipéptido separado dos materiais coexistentes do seu estado natural está "isolado", como o termo é agui empregue. "Polinucleótido" refere-se geralmente a qualquer polirribonucleótido ou polidesoxirribonucleótido, que pode ser ARN ou ADN modificado ou ARN ou ADN modificado incluindo regiões de cadeia simples e de cadeia dupla. "Variante" refere-se a um polinucleótido ou polipéptido que difere de um polinucleótido ou polipéptido de referência, mas retém propriedades essenciais. Uma variante típica de um polinucleótido difere na sequência de nucleótidos de outro, polinucleótido de referência. Alterações na sequência de nucleótidos da variante podem alterar ou não a sequência de aminoácidos de um polipéptido codificado pelo polinucleótido de referência. As alterações de nucleótidos podem resultar em substituições, adições, deleções, fusões e truncagens de aminoácidos no polipéptido codificado pela sequência de referência, como discutido abaixo. Uma variante típica de um polipéptido difere na sequência de aminoácidos de outro, polipéptido de referência. Geralmente, as diferenças estão limitadas de modo a que, as sequências do polipéptido de referência e da variante sejam globalmente muito semelhantes e, em muitas regiões, idênticas. Uma variante e polipéptido de referência podem diferir na sequência de aminoácidos por uma ou 35 mais substituições, adições, deleções em qualquer combinação. Um resíduo de aminoácidos substituído ou inserido pode ser ou não um codificado pelo código genético. Uma variante de um polinucleótido ou polipéptido pode ser um que ocorra naturalmente, tal como uma variante alélica, ou pode ser uma variante que não se conhece que ocorra naturalmente. Variantes de polinucleótidos e polipéptidos que não ocorrem naturalmente podem ser preparados por técnicas de mutagénese ou por síntese directa. "Identidade", como é conhecido na técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências de polipéptido ou duas ou mais sequências polinucleotídicas, como determinado por comparação das sequências. Na técnica, "identidade" também significa o grau de relação de sequências entre sequências de polipéptido ou polinucleótido, consoante o caso, como determinado pelo emparelhamento entre porções dessas sequências. "Identidade" e "semelhança" podem ser rapidamente calculadas através de métodos conhecidos, incluindo, mas não limitados aos descritos em (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nova Iorque, 1988/ Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nova Iorque, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., e Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nova Jersey, 1994/ Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987/ e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nova Iorque, 1991; e Carillo, H., e Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988). Métodos preferidos para determinar a identidade são concebidos para produzir o emparelhamento mais vasto entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade e a semelhança são codificadas em programas de computador publicamente disponíveis. Métodos de programa de computador 36 preferidos para determinar a identidade e semelhança entre duas sequências incluem, mas não estão limitados ao conjunto de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, e FASTA (Altschul, S.F. et al.f J. Molec. Biol. 215:403-410 (1990). O programa BLAST X está disponível publicamente na NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). O bem conhecido algoritmo Smith Waterman também pode ser utilizado para determinar a identidade. O algoritmo preferido utilizado é FASTA. Os parâmetros preferidos para comparação de sequências de polipéptido ou polinucleótido utilizando este algoritmo inclui o seguinte:

Penalização de Intervalo: 12

Penalização da extensão do intervalo: 4

Tamanho da palavra: 2, max 6

Parâmetros preferidos para a comparação da sequência de polipéptido com outros métodos incluem os seguintes: 1) Algoritmo: Needleman e Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970) 2) Matriz de comparação: BLOSSUM62 de Hentikoff e Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 89:10915- 10919 (1992) Penalização de Intervalo: 12

Penalização da extensão do intervalo: 4

Um programa útil com estes parâmetros está disponível publicamente como o programa "gap" do Genetics Computer Group, Madison WI. Os parâmetros acima mencionados são os parâmetros 37 por defeito para comparações de polipéptido (juntamente sem penalização para os intervalos da extremidade).

Parâmetros preferidos para a comparação de polinucleótidos incluem os seguintes: 1) Algoritmo: Needleman e Wunsch, J. Mol Biol. 48:443-453 (1970)

Comparação de matriz: emparelhamentos = +10, desemparelhamento = 0 Penalização do Intervalo: 50 Penalização da extensão do intervalo: 3

Um programa útil com estes parâmetros está disponível ao público como o programa "gap" do Genetics Computer Group, Madison WI. Os parâmetros acima mencionados são os parâmetros por defeito para as comparações de polinucleótidos. A título de exemplo, uma sequência de polinucleótidos aqui descrita pode ser idêntica à sequência de referência de SEQ ID NO: 1, que deve ser 100% idêntica, ou pode incluir até um certo número inteiro de alterações de nucleótidos em comparação com a sequência de referência. Essas alterações são seleccionadas a partir do grupo consistindo em, pelo menos, uma deleção, substituição, incluindo transição e transversão, ou inserção de nucleótido e em que as referidas alterações podem ocorrer nas posições do terminal 5' ou 3' da sequência de nucleótidos de referência ou em qualquer posição entre essas posições terminais, intercaladas quer individualmente entre os nucleótidos na sequência de referência ou num ou mais grupos contíguos na sequência de referência. O número de alterações de nucleótidos é determinado multiplicando o número total de nucleótidos em SEQ ID N°: 1 pelo inteiro definindo a percentagem 38 de identidade (dividida por 100) e subtraindo esse produto do referido número total de nucleótidos em SEQ ID N°:1 ou: n„ ^ x„ - (x„ · y) , em que nn é o número de alterações de nucleótidos, xn é o número total de nucleótidos em SEQ ID N°:l, e y é, por exemplo 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, 0,90 para 90%, 0,95 para 95%, etc., e em que qualquer produto não inteiro de xn e y é arredondado para baixo até ao inteiro mais próximo antes de o subtrair de xn. Alterações de uma sequência de polinucleótidos codificando o polipéptido de SEQ ID N°: 2 pode criar mutações sem sentido, com sentido ou de desvio de grelha nesta sequência codificante e desse modo alteram o polipéptido codificado pelo polinucleótido após essas alterações.

De modo semelhante, uma sequência de polipéptido aqui descrita pode ser idêntica à sequência de referência de SEQ ID N°:2, isto é ser 100% idêntica, ou pode incluir até um certo número inteiro de alterações de aminoácido em comparação com a sequência de referência, de modo a que a % de identidade seja inferior a 100%. Essas alterações são seleccionadas a partir do grupo consistindo em, pelo menos, uma deleção, substituição, incluindo substituição conservada e não conservada ou inserção, e em que as referidas alterações podem ocorrer nas posições dos terminais amino ou carboxilo da sequência de polipéptido de referência ou em qualquer posição entre essas posições terminais, intercaladas quer individualmente entre os aminoácidos na sequência de referência ou num ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência. O número de alterações de aminoácidos para uma dada % de identidade é determinado, multiplicando o número total de aminoácidos em SEQ ID N°:2 pela percentagem numérica da respectiva percentagem de 39 identidade (dividida por 100) e depois subtraindo esse produto do referido número total de aminoácidos em SEQ ID N°:2 ou: na ^ Xa - (Xa · y) , em que na é o número de alterações de aminoácido, xa é o número total de aminoácidos em SEQ ID N°:2, e y é, por exemplo, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, etc., e em que qualquer produto não inteiro de xa e y é arredondado para baixo até ao inteiro mais próximo antes de o subtrair de xa. "Homólogo" é um termo genérico utilizado na técnica para indicar uma sequência de polinucleótido ou polipéptido possuindo um grau elevado de relação de sequência com a sequência de um sujeito. Essa relação pode ser quantificada determinando o grau de identidade e/ou semelhança entre as sequências a serem comparadas como aqui descrito anteriormente. Caindo dentro deste termo genérico estão os termos "ortólogo", significando um polinucleótido ou polipéptido que é o equivalente funcional de um polinucleótido ou polipéptido noutra espécie e "parálogo" significando uma sequência funcionalmente semelhante quando considerada dentro da mesma espécie.

LEGENDAS DAS FIGURAS

Figura 1 A Figura 1 apresenta os niveis de expressão de CASB168 em emparelhamentos de amostras de cólon normal e tumoral. Os valores são apresentados num nivel de actina equivalente. N refere-se ao cólon normal, T refere-se ao tumor do cólon. 40

Figura 2 A Figura 2A, 2B, 2C e 2D apresentam os resultados de PCR em tempo real da expressão de CASB618 em tecidos normais.

As abreviaturas significam:

Figura 2A: Co: cólon; Ce: cerviz; Bra: cérebro; Bo_Ma: medula óssea; BI: bexiga; Ao: aorta; Ad_GI: glândula supra-renal

Figura 2B: Ov: ovário; Oe: esófago; Ly_No: nódulo linfático; Lu: pulmão; Li: figado; Ki:rim; II: ílio; He:coração; Fa_Tu: trompas de Falópio

Figura 2C: Sp: baço; Sm_In: intestino delgado; Sk_Mu: músculo esquelético; Sk: pele; Re: recto; Pr: próstata; PI: placenta; Pa_Thy: glândula da paratiróide

Figura 2D: Tr: traqueia; Thy: tiróide; Te: testículos; St: estômago; Spl: baço

Figura 3 A Figura 3 apresenta um gel de SDS-PAGE (12,5%) do extracto de AR120/pRIT15081 de E. coli, com ou sem indução com ácido nalidixico; revelado com anticorpo monoclonal anti-NS 1. 41 A pista 1 é o Marcador de peso molecular, a pista 2 apresenta AR120/pRIT15081 de E. coli 3 h sem indução; a pista 3 apresenta a AR120/pRIT15081 de E. coli 3 h induzida; a pista 4 apresenta a AR120/pRIT15081 de E. coli 4 h 30 sem indução; a pista 5 apresenta a AR120/pRIT15081 de E. coli 4 h 30 induzida.

Figura 4 A Figura 4 apresenta géis de SDS-PAGE de CASB618 purificado.

As pista 1 e 8 apresentam o Marcador de peso molecular; a pista 2 apresenta o sedimento das células lisadas; a pista 3 apresenta as 3 proteínas purificadas antes da diálise; a pista 4 apresenta a proteína dialisada purificada; a pista 6 apresenta a proteína dialisada purificada em 0,22 pm.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Análise de RT-PCR em tempo real A RT-PCR em tempo real (U. Gibson. 1996. Genome Research: 6996) é utilizada para comparar a abundância de transcriptos de ARNm do antigénio candidato em emparelhamentos de tecidos de cólon tumoral e normal de múltiplos doentes. Adicionalmente, os níveis de ARNm do gene candidato num painel de tecidos normais são avaliados por esta abordagem. 42 0 ARN total do cólon normal e tumoral é extraído de biopsias congeladas rapidamente utilizando o reagente TriPure (Boehringer). 0 ARN total de tecidos normais é adquirido da InVitrogen, ou é extraído de biopsias congeladas rapidamente utilizando o reagente TriPure. 0 ARNm poli-A+ é purificado a partir de ARN total após tratamento com ADNase utilizando esferas magnéticas de oligo-dT (Dynal). A quantificação do ARN total é realizada por espectrofluorimetria (VersaFluor, BioRad) utilizando corante SybrII (Molecular Probes). Os iniciadores para a amplificação de PCR em tempo real são concebidos com o programa de computador Perkin-Elmer Primer Express, utilizando as opções por defeito para as condições de amplificação de TaqMan.

As reacções de tempo real são reunidas de acordo com protocolos de PCR convencionais utilizando 2 ng de ARNm purificado para cada reacção. É adicionado corante SybrI (Molecular Probes) a uma diluição final de 1/75000 para detecção em tempo real. A amplificação (40 ciclos) e a detecção em tempo real são realizadas num sistema Perkin-Elmer Biosystems PE7700 utilizando condições do instrumento convencionais. Os valores de Ct são calculados utilizando o programa informático PE7700

Sequence Detector. São obtidos dois valores de Ct para cada amostra de doente: o tumor Ct (CtT) e o cólon normal emparelhado

Ct (CtN) . Os valores de Ct obtidos através de PCR em tempo real estão relacionados de modo log-linear com o número de cópias do molde alvo. Como a eficiência da amplificação por PCR nas condições experimentais predominantes está próxima da eficiência de amplificação teórica, 2<ctN~ctT) é uma estimativa dos níveis de transcripto relativos nos dois tecidos (i. e. vezes de ARNm sobre-expresso no tumor) . As reacções de PCR em tempo real são realizadas em biopsias de 23 doentes. Algumas amostras de doentes foram medidas duas vezes. O nível de sobre-expressão do 43 ARNm é calculado como descrito para cada doente. O nível médio de sobre-expressão de ARNm para o antigénio candidato e a proporção de doentes que sobre-expressam o antigénio candidato é então calculado a partir deste conjunto de resultados. Os valores individuais são padronizados em relação à actina na mesma amostra (proporção) e são apresentados na figura 1. Um valor de 1 corresponde, assim, ao mesmo nível de expressão de actina. Os resultados são apresentados numa escala logarítmica.

Também foram testadas um total de 81 amostras de tecido normal, representando 28 tecidos diferentes, pelo mesmo processo. Os valores de Ct para o antigénio candidato foram comparados com os da actina obtidos com a mesma amostra de tecido. Os valores padronizados são apresentados nas figuras 2A-D.

Resultados de PCR em tempo real em amostra de cólon canceroso/normal

Sumário

Doentes sobre-expressando CASB618 em tumores do cólon (%) Nivel médio de sobre-expressão em tumores do cólon (vezes) 18/23 (78%) 125

Conclusão: CASB619 é sobre-expresso numa proporção elevada de tumores em relação ao cólon adjacente normal. É apenas expresso de forma marginal pelos outros tecidos, em particular uma amostra da próstata. 44

Exemplo 2

"Microarrays" de ADN São utilizados "micro-arrays" para examinar os perfis de expressão de ARNm de grandes conjuntos de genes em amostras múltiplas. Esta informação é utilizada para complementar os dados obtidos por PCR em tempo real e proporciona uma medida independente dos niveis de expressão de gene em tumores e tecidos normais.

Exemplos de tecnologias correntes para a produção de "microarrays" de ADN incluem 1) Os "arrays" "GeneChip" Affymetrix, em que os oligonucleótidos são sintetizados na superfície do chip por sintese química de fase sólida, utilizando um processo fotolitográfico 2) Tecnologia de marcação de ADN em que volumes pequenos de uma solução de ADN são depositados roboticamente e depois imobilizados na superfície de uma fase sólida (e. g. vidro) . Em ambos os casos, os chips são hibridados com ADNc ou ARNc que foi extraído do tecido de interesse (e. g. tecido normal, tumor, etc...) e marcado com radioactividade ou com uma molécula repórter fluorescente. 0 material marcado é hibridado com o chip e a quantidade de sonda ligada a cada sequência no chip é determinada utilizando um digitalizador especializado. A experiência pode ser estabelecida com um único repórter fluorescente (ou radioactividade) ou, alternativamente, pode ser realizada utilizando dois repórteres fluorescentes. Neste ultimo caso, cada uma das duas amostras é marcada com uma das moléculas repórter. As duas amostras marcadas são então hibridados competitivamente com as sequências do chip de ADN. A proporção dos dois sinais fluorescentes é determinada para cada sequência 45

no chip. A proporção é utilizada para calcular a abundância relativa no transcripto nas duas amostras. Estão disponíveis protocolos detalhados de várias fontes incluindo "DNA

Microarrays: A practical approach. Schena M. Oxford University Press 1999" e na World Wide Web (http://cmgm.stanford.edu/pbrown/protocols/index.html), http://arrayit.com/DNA-Microarray-Protocols/) e distribuidores especializados (e. g., Affymetrix).

Exemplo 3 Perfis de EST

Uma abordagem complementar para a caracterização experimental da expressão de antigénio em tecido é explorar as bases de dados de "Marcadores de Sequências Expressas" (ESTs). Os ESTs são fragmentos de ADNc preparados a partir de uma colecção de ARNm extraído a partir de um tecido ou linha celular particular. Essas bases de dados proporcionam presentemente uma quantidade massiva de ESTs (IO6) de várias centenas de bibliotecas de ADNc de tecido, incluindo tecidos tumorais de vários tipos e estados de doença. Através de ferramentas informáticas (Blast) é realizada uma pesquisa de comparação da sequência de CASB616, de modo a ter um conhecimento mais profundo na expressão do tecido.

Distribuição de CASB618 em EST

Acesso a DbEST ATG lib ID Categoria de Descrição NCBI:113567 8821 NCI_CGAP_Co3 TC NCBI:1224225 937 NCI_CGAP_Co2 TC 46

NCBI:1271870 988 NCI_CGAP Col2 TC NCBI:1316079 889 NCI_CGAP_Thyl TA NCBI:2035497 1079 NCI_CGAP_Co8 TC (continuação) NCBI:2048268 1079 NCI_CGAP_Co 8 TC NCBI:2054603 1079 NCI_CGAP Co8 TC NCBI:2081390 1079 NCI_CGAP Co8 TC LNCBI:2129969 1079 NCI_CGAP Co8 TC NCBI:2489139 1728 Soares Dieckgraefe Dc NCBI:2489206 1728 Soares Dieckgraefe Dc NCBI:2600163 882 NCI_CGAP Co3 TC NCBI:2641414 882 NCI_CGAP_Co3 TC NCBI:2831741 937 NCI_CGAP_Co2 TC NCBI:2914582 910 NCI_CGAP Pr22 NP NCBI:3111692 1728 Soares Dieckgraefe Dc NCBI:3112040 1728 Soares Dieckgraefe Dc NCBI:3043263 1460 NCI_CGAP_Panl Tep NCBI:3119272 1728 Soares Dieckgraefe Dc INCBI:3138950 882 NCI_CGAP Co3 TC NCBI:3181303 1728 Soares Dieckgraefe Dc NCBI:2908798 882 NCI_CGAP Co3 TC NCBI:2909226 937 NCI_CGAP Co2 TC TC: tumor do cólon; Dc: cólon doente; NP; próstata normal; Tep: tumor epitelial; Ta: tumor de outro tipo A proporção elevada de ESTs de cancro do cólon sugere, assim, claramente uma sobre-expressão deste gene no cancro do cólon. Adicionalmente, outros tumores (pâncreas, tiróide) também podem expressar o gene.

Exemplo 4

Análise de transferência de Northern-Southern 47

Quantidades limitadas de ADNc misturados de tumor e cólon emparelhado normal são amplificados através de PCR Advantage (ver acima). O ARN mensageiro de múltiplos tecidos normais é também amplificado utilizando o mesmo processo. 0 ADNc amplificado (1 pg) é indivíduo a electroforese num gel de agarose a 1,2% e transferido para uma membrana de nylon. A membrana é hibridada (AlkPhos Direct System) com uma sonda preparada utilizando um fragmento do ADNc TAA candidato. A informação da análise de Northern-Southern proporciona informação no tamanho da transcrição, presença de variantes de excisão e abundância de transcriptos em tecidos tumorais e normais.

Exemplo 5

Análise de Transferência de Northern

As transferências de Northern são produzidas de acordo com protocolos convencionais utilizando 1 pg de ARNm poli A+. As sondas radioactivas são preparadas utilizando o sistema Ready-to-Go (Pharmacia).

Exemplo 6

Identificação da sequência de ADNc de comprimento total

As bibliotecas de ADNc de tumor do cólon são construídas utilizando o sistema Lambda Zap II (Stratagene) de 5 pg de ARNm poliA+. 0 protocolo fornecido é seguido, com a excepção de ser utilizado SuperscriptII (Life Technologies) para o passo da transcrição reversa. São construídas bibliotecas iniciadas com 48 oligo-dT e iniciadas aleatoriamente. Cerca de 1,5 x 106 fagos independentes são plaqueados para cada rastreio da biblioteca. As placas fágicas são transferidas para filtros de nylon e hibridadas utilizando uma sonda de ADNc marcada com AlkPhos Direct. Os fagos positivos são detectados por quimioluminescência. Os fagos positivos são excisados da placa de agar, eluidos em 500 pL de tampão SM e confirmados por PCR especifica para o gene. Os fagos eluidos são convertidos em bacteriófago M13 de cadeia simples por excisão in vivo. O bacteriófago é então convertido em ADN plasmidico de cadeia dupla por infecção de E. coli. As bactérias infectadas são plaqueadas e submetidas a uma segunda ronda de rastreio com a sonda de ADNc. O ADN plasmidico é purificado a partir de clones bacterianos positivos e sequenciados em ambas as cadeias.

Quando o gene de comprimento total não pode ser obtido directamente da biblioteca de ADNc, a sequência em falta é isolada utilizando a tecnologia RACE (Marathon Kit, ClonTech). Esta abordagem baseia-se em realizar a transcrição reversa do ARNm em ADNc de cadeia dupla, ligando ligandos às extremidades do ADNc e amplificando a extremidade desejada do ADNc utilizando um iniciador especifico para o gene e um dos oligonucleótidos ligandos. Os produtos da PCR de Marathon são clonados num plasmideo (pCRII-TOPO, InVitrogen) e sequenciados. A sequência obtida (SEQ ID N°:l) possui uma grelha de leitura aberta putativa de 259 aminoácidos (SEQ ID N°:2). A sequência de proteínas deduzida foi submetida a algoritmos de previsão para localização celular (PSORT: http://psort.nibb-ac.jp/ e TopPred: http://www.biokemi.su.se/~server/toppred2/ toppred_source.html). Prevê-se que tenha 4 a 5 segmentos de transmembrana; apenas um dos 2 métodos utilizados prevê a sequência de sinal. Existe um motivo potencial de fecho de leucina sobrepondo um dos segmentos de transmembrana previstos. 49

Existem 3 sitios de N-glicosilação potenciais. A localização sub-celular não é clara, sendo a membrana plasmática a mais provável.

Exemplo 7: 7.1 Expressão e purificação de antigénios específicos para o tumor A expressão em hospedeiros microbianos, ou alternativamente, transcrição/tradução in vitro, é utilizada para produzir o antigénio da invenção para objectivos de vacina e para produzir fragmentos de proteina ou proteina total para purificação rápida e criação de anticorpos necessários para caracterização da proteina expressada naturalmente por transferência de western, imuno-histoquimica ou para acompanhar a purificação.

As proteínas recombinantes podem ser expressas em dois hospedeiros microbianos, E. coli e em levedura (tais como Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris). Isto permite a selecção do sistema de expressão com as melhores caracteristicas para a produção deste antigénio particular. Em geral, o antigénio recombinante será expresso em E. coli e a proteina reagente expressa em levedura. A estratégia de expressão envolve primeiro a concepção da estrutura primária do antigénio recombinante. Em geral um parceiro de fusão de expressão (EFP) é colocado na extremidade N terminal para melhorar os niveis de expressão que também podem incluir uma região útil para modular as propriedades imunogénicas do antigénio, um parceiro de fusão imune (IFP). Adicionalmente, um parceiro de fusão de afinidade (AFP) útil para facilitar purificação posterior é incluído na extremidade C-terminal. 50

Quando as estirpes recombinantes estão disponíveis, o produto recombinante é caracterizado pela avaliação do nível de expressão e da previsão de solubilidade adicional da proteína por análise do comportamento no extracto bruto.

Após o crescimento em meio de cultura apropriado e indução da expressão de proteína recombinante, os extractos totais são analisados por SDS-PAGE. As proteínas recombinantes são visualizadas em géis e identificadas por análise de transferência de Western utilizando anticorpos específicos.

Uma avaliação comparativa das diferentes versões do antigénio expresso irá permitir a selecção do candidato mais promissor que deve ser utilizado para posterior purificação e avaliação imunológica.

Expressão em E. coli ARI20 A construção seguinte foi concebida e realizada: o gene CASB618 comportando deleções do terminal N e terminal C (Δ 1-74; Δ 247-320 aa) foi clonada no vector pMG81 (ou pL longo), com a adição de um IFP (sequência de ADN de NSl codificando os aminoácidos N-terminais 1 a 81 da proteína NSl do vírus influenza) no terminal N e uma cauda de histidina C-terminal (SEQ ID N°:4) NSl- Met Thr Met C 61-8 75 246

Thr Ser Gly 6xHIS O plasmídeo obtido é denominado pRIT 15081. É utilizada a célula hospedeira indutível por ácido nalidíxico E. coli AR 120. 51 A indução de culturas de E. coli de três litros em meio LB + canamicina foi obtida adicionando ácido nalidixico para uma concentração final de 60 ng/mL. As culturas foram incubadas 4 h 30 a 37 °C. O sedimento obtido após centrifugação das culturas induzidas foi ressuspenso em 60 mL de tampão PBS. As células foram subsequentemente lisadas utilizando uma prensa francesa. O lisado foi então centrifugado durante 20 minutos a 16000 g. a proteina expressa foi detectada no sedimento (figura 3) . O esquema de purificação segue uma abordagem clássica baseada na presença de uma cauda de afinidade de His na proteina recombinante. Numa experiência típica, as células rebentadas são filtradas e os extractos acelulares aplicados numa Cromatografia de Afinidade de Ião Metálico (IMAC; Ni++NTA de Qiagen) que reterá especificamente a proteína recombinante. As proteínas retidas são eluídas por gradiente de Imidazole a 0-500 mM (possivelmente na presença de um detergente) num tampão fosfato. O esquema de purificação é detalhado abaixo.

Solubilização do sedimento em GuHCl a 6 M IMAC: Qiagen ΝΤΑ NI++

Tampão de equilíbrio: NaH2P04 100 mM pH 8

Tris 10 mM

NaCl 150 mM

GuHCl 6 M

Amostra: sedimento em GuHCl a 6 M 52 pH 6,3

Tampão de lavagem:

NaH2P04 100 mM Tris 10 mM

ureia 8 M

Tampão de eluição: NaH2P04 100 mM pH 4,5

Tris 10 mM

Imidazole 500 mM ureia 8 M d

Proteína eluída em imidazole a 500 mM + ureia a 8 M _5_

DIÁLISE - PBS pH 7,5 + sarcosil a 2% + ureia a 6 Μ 1 h " ureia a 4 Μ 1 h " ureia a 2 Μ 1 h " ureia a 0 M durante a noite a 4 °C JJ.

Congelar, filtração a 0,22 μχη

Uma estimativa da concentração final (1 mg/mL) é obtida por um ensaio de proteína de Lowry no produto purificado final (ver figura 4).

Transcrição/tradução in vitro O produto do gene CASB618 foi caracterizado por transcrição/tradução acoplada in vitro. A sequência codificante de comprimento total do clone CASB618 foi clonada no vector SP72

(Promega), um vector que permite a transcrição in vitro. A 53 expressão in vitro utilizando lisado de reticulócito acoplado a T7 de TNT (Promega n° de cat. L4611) com incorporação de metionina S35 apresenta um produto de 35 Kd, que é reduzido a 30 Kd na presença de membranas microssomais pancreáticas caninas (Promega n° cat. Y4041). Este resultado sugere processar o péptido de sinal de acordo com a previsão do péptido de sinal de 47 aminoácidos e sugere que a proteina in vivo é ancorada à membrana ou é secretada. Para estas experiências, foram seguidos os protocolos recomendados pela Promega. 7.2 Produção de anticorpo e imuno-histoquimica

Podem ser utilizadas pequenas quantidades de proteina relativamente purificada para gerar ferramentas imunológicas de modo a a) detectar a expressão por imuno-histoquimica em secções de tecido normal ou canceroso; b) detectar a expressão e acompanhar a proteína durante o processo de purificação (ELISA/Transferência de western); ou c) caracterizar/quantificar a proteína purificada (ELISA). 7.2.1 Anticorpos monoclonais:

Imunização (I.M.), 3 proteina, São imunizados 2-3 coelhos, intramuscularmente vezes em intervalos de 3 semanas com 100 pg de 54 formulada no adjuvante 3D-MPL/QS21. Três semanas após cada imunização é recolhida uma amostra de sangue e o título do anticorpo é estimado no soro por ELISA utilizando a proteína como antigénio de revestimento seguindo um protocolo convencional.

ELISA

Microplacas de 96 poços (maxisorb Nunc) são revestidas com 5 pg de proteína durante a noite a 4 °C. Após 1 hora de saturação a 37 °C com PBS NCS a 1%, é adicionada uma diluição em série do soro de coelho durante 1 h 30 a 37 °C (começando a 1/10). Após 3 lavagens em PBS Tween, é adicionado anti-soro biotinilado anti-coelho (Amersham) (1/5000) . As placas são lavadas e é adicionada estreptavidina acoplada a peroxidase (1/5000) durante 30 min a 37 °C. Após lavagem, é adicionado 50 pL TMB (BioRad) durante 7 min e a reacção é então parada com H2S04 a 0,2 Μ. A DO pode ser medida a 450 nm e as diluições de ponto médio são calculadas por SoftmaxPro. 7.2.2 Anticorpos Monoclonais. Imunização São imunizados 5 murganhos BALB/c 3 vezes a intervalos de 3 semanas com 5 pg de proteína purificada. As sangrias foram realizadas 14 dias após II e 1 semana após 3. Os soros são testados por Elisa na proteína purificada utilizada como antigénio revestido. Com base nestes resultados (diluição de ponto médio > 10000) um murganho é seleccionado para fusão 55

Fusão/Selecção em HAT

As células do baço são fundidas com o mieloma SP2/0 de acordo com um protocolo convencional utilizando PEG a 40% e DMSO a 5%. As células são então semeadas em placas de 96 poços a 2,5x104-105 células/poço e os clones resistentes serão seleccionados em meio HAT. O sobrenadante destes hibridomas será testado quanto ao seu conteúdo em anticorpos específicos e quando positivos, será submetido a 2 ciclos de diluição limitada. Após 2 rondas de rastreio, 3 hibridomas serão seleccionados para a produção de liquido ascitico. 7.2.3 Imuno-histoquimica

Quando há anticorpos disponíveis, a imunocoloração é realizada em secções de tecido normal ou canceroso, de modo a determinar: • o nível de expressão do antigénio da invenção em tecido canceroso em relação ao normal ou • a proporção de cancro de um certo tipo expressando o antigénio • se outros tipos de cancro também expressam o antigénio • a proporção de células que expressam o antigénio num tecido canceroso 56

Preparação da amostra de tecido

Após dissecação, a amostra de tecido é montada num disco de cortiça em composto OCT e rapidamente congelado em isopentano previamente super-arrefecido em azoto liquido (-160 °C). O bloco será então conservado a -70 °C até ser utilizado. Serão preparadas secções de 7-10 pm numa câmara de criostato (-20, -30 °C).

Coloração

Secções de tecido são secas durante 5 min à temperatura ambiente (TA), fixadas em acetona durante 10 min à TA, novamente secas, e saturadas com PBS BSA a 0,5% soro a 5%. Após 30 min à TA é realizada quer uma coloração directa quer indirecta, utilizando anticorpos específicos para o antigénio. Uma coloração directa conduz a uma melhor especificidade, mas uma coloração menos intensa, enquanto que uma coloração indirecta conduz a uma coloração mais intensa mas menos específica. 7.3 Análise de respostas imunitárias celulares humanas ao antigénio da invenção A relevância imunológica do antigénio da invenção pode ser avaliada por iniciação in vitro de células T humanas. Todas as linhas de linfócitos de células T e células dendríticas são derivadas de PBMCs (células mononucleares do sangue periférico) de dadores saudáveis (sub-tipo HLA-A2 preferido). Um modelo de murganho transgénico HLA-A2.1/Kb é também utilizado para o rastreio de péptidos HLA-A2.1. 57

As linhas de células T CD8+ específicas para o antigénio, recentemente descobertas são criadas e mantidas por estimulação semanal in vitro. A actividade lítica e a produção de γ-IFN das linhas CD8 em resposta ao antigénio ou péptidos derivados de antigénio são testadas utilizando processos convencionais. São utilizadas duas estratégias para originar as linhas de células T CD8+: uma abordagem baseada no péptido e uma abordagem baseada no gene inteiro. Ambas as abordagens requerem o ADNc de comprimento total do antigénio recentemente descoberto na grelha de leitura correcta para ser ou clonado num sistema de distribuição apropriado ou para ser utilizado para prever uma sequência de péptidos de ligação a HLA.

Abordagem à base do péptido

As sequências de péptido de ligação a HLA Classe II são previstas quer utilizando o algoritmo de Parker (Parker, K.C., M.A. Bednarek, e J.E: Coligan. 1994. Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains. J. Immunol. 152:163 e http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla bind/) ou o método de Rammensee 1995 (Rammensee, Friede, Stevanovic: MHC ligands and peptide motifs. Landes Bioscience 1997, e http://134.2.96.221/scripts/hlaserver.dll/home.htm). Os péptidos podem ser rastreados no modelo de murganho transgénico HLA-A2.1/Kb (Vitiello et al.) . A sequência utilizada para realizar a previsão é EPHB2v, como é idêntica a EPHB2 com uma extensão de sequência C-terminal adicional. a) Epitopos previstos que se ligam ao alelo HLA_A0201: a.l) nonâmeros HLA-A 0201 58

Posição 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Rammen ver classificação Classificação de Parker0 SEQ ID N° 262 F L G G A V V S L 31 226,014 5 24 L L I V I L V F L 30 459,398 6 253 T L A T G V L C L 29 7 203 P L Y G G L A L L 28 8 149 G L P D P V L Y L 28 1107,961 9 100 G L L V G L E G I 28 10 53 W L V R V L L S L 27 226,014 11 62 F I G A E I V A V 26 101,181 12 260 C L F L G G A V V 25 105,510 13 196 V L L S T P A P L 25 134,369 14 60 S L F I G A E I V 25 15 210 L L T T G A F A L 24 210,633 16 104 G L E G I N I T L 24 17 34 L A A S F L L I L 24 18 222 F A L A S I S S V 23 19 216 F A L F G V F A L 23 20 192 L L S N V L L S T 23 21 138 Y A A E T A N A L 23 22 33 A L A A S F L L I 23 23 31 F L A L A A S F L 23 540,469 24 21 S V P L L I V I L 23 25 174 H L A G H Y A S A 22 26 112 L T G T P V H Q L 22 27 97 A R V G L L V G L 22 28 91 S A A R V T A R V 22 29 73 S A E W F V G T V 22 30 27 V I L V F L A L A 22 31 308 A A L P D L K C I 21 32 299 I L G D P L H K Q 21 33 (continuação) 59

Posição 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Rammen ver classificação Classificação de Parker0 SEQ ID N° 258 V L C L F L G G A 21 34 217 A L F G V F A L A 21 35 207 G L A L L T T G A 21 36 40 L I L P G I R G H 21 37 16 H A A G F S V P L 21 38 312 D L K C I T T N L 20 39 234 P L R L G S S A L 20 40 209 A L L T T G A F A 20 101,099 41 26 I V I L V F L A L 20 42 17 A A G F S V P L L 20 43 154 V L Y L A E K F T 222,964 44 244 T Q Y G A A F W W 719,848 45 185 W V A F C F W L L 122,527 46 ° Estimativa do meio tempo c .e dissociação de um molécula contendo esta sub-sequência a.2)Decâmeros de HLA A02 01

Posição Sequência Clasificação de Rammensee* Classificação de Parker0 SEQ ID N°: 33 ALAASFLLIL 29 47 223 ALASISSVPL 26 48 111 TLTGTPVHQL 26 49 209 ALLTTGAFAL 25 458,437 50 23 PLLIVILVFL 25 51 272 YVRPSALRTL 24 52 261 LFLGGAVVSL 24 53 (continuação) 60

Posição Sequência Clasificação de Rammensee* Classificação de Parker0 SEQ ID N°: 226 SISSVPLCPL 24 54 58 LLSLFIGAEI 24 55 191 WLLSNVLLST 23 291,716 56 61 LFIGAEIVAV 23 57 31 FLALAASFLL 23 569,949 58 16 HAAGFSVPLL 23 59 269 SLQYVRPSAL 22 60 258 VLCLFLGGAV 22 61 252 VLTATGVLCL 22 62 101 LLVGLEGINI 22 63 25 LIVILVFLAL 22 64 24 LLIVILVFLA 22 112,664 65 298 LILGDPLHKQ 21 66 183 TLWVAFCFWL 21 21493,266 67 149 GLPDPVLYLA 21 68 145 ALEKGLPDPV 21 69 96 TARVGLLVGL 21 70 72 FSAEWFVGTV 21 71 175 LAGHYASATL 20 72 148 KGLPDPVLYL 20 73 104 GLEGINITLT 20 74 52 FWLVRVLLSL 20 75 21 SVPLLIVILV 20 76 69 AVHFSAEWFV 251,039 77 ° Estimativa do meio tempo de dissociação de um molécula contendo esta sub-sequência

Resumidamente, os murganhos transgénicos são imunizados com péptidos HLA-A2 adjuvantados, aqueles incapazes de induzir uma 61 resposta CD8 (como definido por uma lise eficiente de células do baço autólogas pulsadas com péptido) serão ainda analisados no sistema humano. Células dendriticas humanas (cultivadas de acordo com Romani et al.) serão pulsadas com péptidos e utilizadas para estimular células T separadas de CD8 (por Facs). Após várias estimulações semanais, as linhas de CD8 serão primeiro testadas em BLCL autólogas pulsadas com péptido (linhas celulares transformadas com EBV-B). Para verificar o processamento in vivo apropriado, as linhas de CD8 serão testadas em células tumorais transfectadas com ADNc (células tumorais LnCaP, Skov3 ou CAMA transfectadas com HLA-A2).

Abordagem baseada no gene total

As linhas de células T CD8+ serão iniciadas e estimuladas quer com células dendriticas transfectadas com disparador de genes, fibroblastos transfectados com B7.1 transduzidas retroviralmente, ou células dendriticas infectadas com virus da variola recombinante (Kim et al.) ou adenovirus (Butterfield et al.). As células infectadas por virus são muito eficientes para apresentar péptidos antigénicos, uma vez que o antigénio é expresso a um nivel elevado, mas só pode ser utilizado uma vez para evitar o sobre-crescimento das linhas de células T virais.

Após estimulações alternadas, as linhas CD8+ são testadas em células tumorais transfectadas com cDIVA como indicado acima. A especificidade e identidade do péptido é determinada para confirmar a validação imunológica.

Referências 62

Vitiello et al. (L. Sherman) , J. Exp. Med. , J. Exp.

Med 1991, 173:1007-1015.

Romani et al., J. Exp. Med., 1994, 180:83-93.

Kim et al., J. Immunother., 1997, 20:276-286. Butterfield et al., J. Immunol., 1998, 161:5607-5613.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Vinals-Bassols, Carlotta Bruck, Claudine Cassart, Jean-Pol Coche, Thierry <120> Novos compostos <130> BC45225 <160> 77 <170> FastSEQ para o Windows Versão 3.0 <210> 1 <211> 1441 <212> ADN <213> Humano <4 0 0> 1 63 aaagtaacgg ctacagacag tgagááatag fcttcgotcgc cggctagaaa aactctgtcç 60 gtaecaaccc cagagcgttg agagcagecc acctcc&cgc ttccttaacg gagaggtgca 120 ggactcagac ttcaccagcc cactcggt.cc cagccttgta cgcaaagaga cgccaaggsc 180 gcgctctccc gcgtccagge agccecaget tgctggcttg cctgcccgcc tgcgtgcagc 240 aetsggccgg cgtgcagcat gaccctgtgg aacggCftac tgccttttta cccccagccc 300 cggcatgçcg caggcttcag çgtcccactg ctcatcgtta. ttctagtgtt tttggctcta 360 gcageaagcfe tcçtgçtçat cttgccgggg atccgtqgçç actcgcgctg gtttiggttg 420 gtgagagttc ttctcagtct gttcataggc gcagaaattg tggctgtgca cttsagtgca 400 gaatggttcg tgggtacagt gaacaeeaac acatcctaca aagccttcag cgcagcgcgc S40 gttacagccc gtgxcggtct gctcgtgggc ctggagggca ttaatattac actcacaggg 600 accccisgtgc. atcagctgaâ cgagaecett gactacaacg agcagttcac ctggcgtctg 660 aaagagaafct acgecgcgga gtacgcgaac çcactggaga aggggctgcc ggacccagtg 720 ctctacctgg cggagaagtt cacaccgagt agcccttgcg gcctgtacca ccagtaccac 780 cfcggcgggac accacgcctc ggccacgcta tgggtggcgt tctgcttetg gctcctctcc 840 ascgtgctgc tetccacgcc ggccccgctc fcacggaggcc tggcactgct gsccaccgga 900 gccttcgcgc tctteggggt çtfcçgccttg gcctccatct ctagcgtgcc getctgcccg 960

Stccgcctag getçctcegc gctcaccact cagtaeggcg ecgccttctg ggtcacçetg 1020 gsaaccggcg tectgtgcct cttcctcgga agggccgtgg tgagtctcca gtatgttcgg ioso cecagcgetc ttegcaecct tctggaeeâa agcgccaagg actgcagcca ggagagaggg 1140 $gctcac»fi.c ttatcctegg çgaeçeaçtg çacaagcagg ccgetctsçç agacttaaaa 1200 tgtatcacsa ctaacctgtg «gggggaeçc aatgtggact cctfe«eecgg ettgggaçat 12«0 çgeaggccgg gaagcagtgc ecgccaggcC tgggcçagga gagctccagg aagggcactg 1320 agcgctgetg gcgcgaggcc tcggacatcc gcaggcacca gggaaagtct cetggggcga 1380 tetgtaaafea aacctttttt fccttttgttt tttaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440 a 1441 <210> 2 <211> 3201

<212> PRT <213> Humano <400> 2 64

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Ma Ala Giy Phe Ser Vai pro Léu Leu Ile Vai He Leu Vai Phe Leu 20 25 30 Ala Leu Ala Ala Ser Phe Leu Leu XÍe Leu Pro Gly Ile Arg Gly Mís 35 40 45 Ser Arg Trp Phe Trp Leu Vai Arg Vai Leu Leu Ser Leu Phe lie Gly 50 55 60 Ai a Giu lie vai Ala vai Ria Phe Ser Ala Glu Trp Phe Vai Giy Thr 65 70 75 80 Vai Asn Thr Asn Thr Ser Tyr Lys Ala Phe Ser Ala Ala Arg val Thr 85 90 95 Ala Arg Vai Gly Leu Leu Vai Gly Leu Giu Gly l i e Asn Ile Thr Leu 100 10S uo thr Gly Thr Pro vai Mia Gin Leu Asn Glu Thr Ile Asp Tyr A sn Glu 115 120- 125 Gin Phe Thr Trp Arg Leu Lys Glu Asn Tyr Ala Ala Glu Tyr Ala Asn 130 133 140 Ala Leu Glu Lys Gly Leu Pro Asp Pro Vai Leu Tyr Leu Ala Gla Lys H5 150 L5S 160 Phe Thr Pro Ser Ser Pro Cys Gly Leu Tyr Ris Gin Tyr Kis Leu Ale 165 170 175 Gly Ris Tyr Ala Ser Ala Thr Leu Trp Vai Ala Phe Cys Phe Trp Leu ISO 185 190 Leu Ser àsn Vai Leu Leu Ser Thr Pro Ala Pro Leu Tyr Gly Gly Leu 195 200 205 Ala Leu Leu Thr Thr Giy Ala Phe Ala Leu Phe Gly Vai Phe Ala Leu 210 215 220 • Ala Ser Ile Ser Ser Vai Pro Leu cys Pro Leu Arg Leu Gly Ser Ser 225 230 235 240 Ala Leu Thr Thr Gin Tyr Gly Ala Ala Phe Trp Vai Thr Leu Ala Thr 245 250 255 Gly Vai Leu Cys Leu Phe Leu Gly Gly Ala Vai Vai Ser Leu- Gin Tyr 260 265 270 Vai Arg Pro Ser Ala Leu Arg Thr Leu Leu Asp Gin Ser Ala Lys Asp 275 2S0 285 Cys Ser Gin Glu Arg Giy Gly Ser Pro Leu Ile Leu Gly A$p Pro Leu 250 233 300 Ris Lys Gin Ala Ala Leu Pro Asp Leu Lys Cys Ile Thr Thr Asn Leu 305 310 315 320 <210> 3 <211> 498 <212> ADN <213> Humano 65 <4Ο0> 3 ctetageçtg ccgctctgcc cgcteecgee taggctcctc cgcgctcacc actcegteeg ftgegeegcct tctgggteac «etggcaacc ggcgtcctgt. gcctcttcet cggaggggcc 120 gtggtgagte tceagtatg*, Ecggcccsgc gctcttcgca ce*ttctggâ c*cãa.s.qcgcc ^ âaggactgca gccaggagag agggggetçâ cctcttatcc tcçgcgaccc aetgcsesag 240 saggccgctc teecafsctt aaaatgtate aççactaacc tgtg&ggggg açccaatctg 300 gactccttcc ccgccfctggg auatçgeagg coçegaagca gtççeegeca ggcctgggcc 360 ãfgãgãgese eaggsagggc: «cfcgagcgct getggcgcga ggcctcggac atccgcaggc 420 accagggaaa gtctcctgçg gcgatctgta aataaacott tttttctttt çttttttaaa 40ή aaaaaataaa agtcgacc ‘ , 4¾ ?Í3 <210> 4 <211> 262 <212> PRT <213> Humano <400> 4 6 6 mt Asp Pr© Asn Thr Vai Ser Ser Ph» Sln Vai Áap Cys ph© Leu Trp l 5 10 15 HiS Vsl Arg Lys Arg Vsi Asp Gin Slu Leu Gly Asp AJLâ Pr o phe 20 25 30 Leu As» Arg Leu Arg Arg ASp €*lh Lys Ser Leu Arg Gly Axg Gly Ser 35 40 43 Thr Leu Giv Leu Asp U# Glu thr Ala Thr Arg Ala Gly Lys Gin Ile 50 55 €0 Vai Glu Ar g tu Leu Lys GXií Giu Ser Asp Giu Ala Leu Lys «et Thr 55 70 75 SÓ «et Giu Tro Ph® Vai Gly Thr vai Asn Thr Asb Thr Ser Tyr Lys Ala §5 m 95 Ser Ala Ais Arg Vai Thr Ala Arg Vai Gly Leu Leu Vai Gly Leu 100 105 110 Glu Gly llê Asn lie Thr Leu Thr Gly Thr Pr o Vai His ÇlB Leu Asn 11S 120 125 Glu Thr He Asp Tyr Asd Giu Glu Phe Thr Trp Arg Leu Lys Giu Ag o 130 iâs 140 Tyr Ala Ala Giu Tyr Ala Asn ÃLa Leu Giu Lys Gly Leu Pr» Asp Pr© 145 ISO 155 ISO Vai Leu Tyr Leu Ala Sltt Lys Phè Thr Pro Ser Ser pró Cys Gly Leu IS5 no 175 Tyr HiS Glíi Tyr His Leu Ala Gly His Tyr AJLs. ser Ala Thr Leu Trp 180 105 ISO vai Ale Phe Cys Phe Trp Leu Leu Ser Agn Vai Leu Leu Ser Thr Pr© 19,5 200 205 Ala Pro Leu Tyr Gly Gly Leu Ala Léu Leu Thr Thr Gly Ala Phe Ala 210 215 220 Leu Phe Gly Vai Phe A.la Leu Ala Ser Ile Ser Ser Vai fro Leu Cys 225 230 235 240 Piro Leu Arg Leu Gly Ser Ser Ala Leu Thr Thr Gin Tyr Thr Ser Gly 245 250 255 tiis His Hie His His His 2G0 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Humano <400> 5

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Lisboa, 18 de Dezembro de 2006 90

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Vacina compreendendo uma quantidade eficaz de células apresentadoras de antigénio, modificado por aplicação in vitro de um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que possui, pelo menos, 70% de identidade com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°:2 ao longo de todo o comprimento de SEQ ID N°:2, ou modificada geneticamente in vitro para expressar o referido polipéptido, e um veiculo farmaceuticamente eficaz.
2. Vacina compreendendo uma quantidade eficaz de células apresentadoras de antigénio, modificado por aplicação in vitro de um fragmento imunogénico de um polipéptido, compreendendo o referido polipéptido uma sequência de aminoácidos que possui, pelo menos, 70% de identidade com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°:2 ao longo de todo o comprimento de SEQ ID N°:2, e em que o referido fragmento imunogénico é capaz de produzir uma resposta imunitária que reconhece SEQ ID N°:2, ou modificado geneticamente in vitro para expressar o referido fragmento imunogénico, e um veiculo farmaceuticamente eficaz.
3. Utilização de um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que possui, pelo menos, 70% de identidade com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°:2 ao longo de todo o comprimento de SEQ ID N°:2, na preparação de um medicamento para o tratamento de cancro do cólon.
4. Utilização de um fragmento imunogénico de um polipéptido, compreendendo o referido polipéptido uma sequência de aminoácidos que possui, pelo menos, 70% de identidade com a 1 sequência de aminoácidos SEQ ID N°:2 ao longo de todo o comprimento de SEQ ID N°:2, e em que o referido fragmento imunogénico é capaz de produzir uma resposta imunitária que reconhece SEQ ID N°:2, na preparação e um medicamento para o tratamento de cancro do cólon.
5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, em que o referido polipéptido é parte de uma proteina de fusão maior.
6. Utilização de acordo com a reivindicação 4, em que o referido polipéptido é quimicamente conjugado com uma proteina veiculo.
7. Utilização de um polinucleótido compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido que possui, pelo menos, 70% de identidade com a sequência de SEQ ID N°:2 ao longo de todo o comprimento de SEQ ID N°:2, ou uma sequência de nucleótidos complementar ao referido polinucleótido, na preparação de um medicamento para o tratamento de cancro do cólon.
8. Utilização de um polinucleótido que compreende uma sequência de nucleótidos que possui, pelo menos, 70% de identidade com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 1 ao longo de todo o comprimento de SEQ ID N°:l, ou um nucleótido complementar ao referido polinucleótido, na preparação de um medicamento para o tratamento de cancro do cólon.
9. Utilização de uma célula imunitária na preparação de um medicamento para o tratamento de cancro do cólon, em que a referida célula imunitária é incubada in vitro com um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que 2 possui, pelo menos, 70% de identidade com a sequência de SEQ ID N°:2 ao longo de todo o comprimento de SEQ ID N°:2, ou um polinucleótido, compreendendo o referido polinucleótido uma sequência de nucleótidos que possui, pelo menos, 70% de identidade com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 1 ao longo de todo o comprimento de SEQ ID N°:1.
10. Utilização de uma célula imunitária na preparação de um medicamento para o tratamento de cancro do cólon, em que a referida célula imunitária é incubada in vitro com um fragmento imunogénico de um polipéptido, compreendendo o referido polipéptido uma sequência de aminoácidos que possui, pelo menos, 70% de identidade com a sequência de SEQ ID N°:2 ao longo de todo o comprimento de SEQ ID N°:2, e em que o referido fragmento imunogénico é capaz de produzir uma resposta imunitária que reconhece SEQ ID N°:2.
11. Processo para diagnóstico de cancro do cólon num indivíduo compreendendo a análise da presença ou quantidade de um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que possui, pelo menos, 70% de identidade com a sequência de SEQ ID N°:2 ao longo de todo o comprimento de SEQ ID N°:2 numa amostra derivada do referido indivíduo.
12. Processo para diagnosticar cancro do cólon num indivíduo compreendendo a análise da presença ou quantidade de um polinucleótido que compreende uma sequência de nucleótidos que possui, pelo menos, 70% de identidade com a sequência de SEQ ID N°: 1 ao longo de todo o comprimento de SEQ ID N°:l; ou um nucleótido complementar ao referido polinucleótido numa amostra derivada do referido indivíduo.
13 Utilização de um anticorpo imunoespecífico para um polipéptido ou um fragmento imunológico do referido 3 polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que possui, pelo menos, 70% de identidade com a sequência de SEQ ID N°:2 ao longo de todo o comprimento de SEQ ID N°:2, na preparação de um medicamento para o tratamento de cancro do cólon. Lisboa, 18 de Dezembro de 2006 1/7 4