EA018201B1 - Лиофилизированная антигенная композиция - Google Patents

Abstract

В настоящем изобретении предложены лиофилизированные композиции, содержащие антиген и агонист Толл-подобного рецептора (TLR) 9. Такие композиции можно разводить носителем, выбранным из группы носителей в форме частиц, состоящей из липосом, минеральных солей, эмульсий, полимеров и иммуностимулирующих комплексов (ISCOM), с получением иммуногенных композиций для применения в вакцинации. Здесь также предложены способы изготовления иммуногенных композиций из лиофилизированных композиций по изобретению и их применение в иммунизации.

Description

Настоящее изобретение относится к усовершенствованным антигенным композициям и способам их использования для изготовления иммуногенных композиций. В частности, настоящее изобретение относится к лиофилизированным композициям, содержащим антиген и агонист То11-подобного рецептора (ТЕК) 9. Такие композиции можно разводить носителем, выбранным из группы носителей в форме частиц, состоящей из липосом, минеральных солей, эмульсий, полимеров и иммуностимулирующих комплексов (18СОМ), с получением иммуногенных композиций для применения в вакцинации. Способы изготовления иммуногенных композиций из лиофилизированных композиций по изобретению и их применение в иммунизации также составляют часть настоящего изобретения.

Предшествующий уровень техники

Адъюванты иногда используют для улучшения иммунного ответа, вызванного на любой данный антиген. Однако включение адъювантов в вакцину или иммуногенную композицию увеличивает как сложность приготовления компонентов, так и сложность распределения и включения в препарат вакцинной композиции. Приготовление каждого из адъювантных компонентов, а также антигенного компонента должно быть учтено разработчиками. Это особенно верно, поскольку, например, значение рН адъювантных компонентов может сильно отличаться от оптимального значения рН для данного антигена, и эти отличия необходимо тщательно контролировать и уметь предотвратить, например осаждение или потерю желаемых свойств компонентов. Значение рН антигена в воде для инъекций может, например, составлять примерно рН 7 или несколько выше, и при добавлении адъюванта рН может быть столь низким, как рН 6,3. Антиген может, например, не быть стабильным при хранении в течение длительных периодов при таком значении рН.

Затем компоненты должны быть включены в препарат и распределены в форме, которая является настолько стабильной, насколько возможно, поскольку фармацевтические препараты для применения людьми должны быть хорошо охарактеризованы, стабильны и безопасны, прежде чем они могут быть одобрены для продажи. В связи с этим на конечном препарате должны быть проведены исследования долговременной стабильности, чтобы гарантировать, что он удовлетворяет соответствующим критериям. Информацию, полученную в таких длительных исследованиях, используют для подтверждения представления в нормативно-правовые органы, такие как ΡΌΑ (Федеральное управление по лекарственным средствам - орган, ответственный за одобрение лекарственных средств в США), чтобы показать, что препарат пригоден для применения людьми.

Сублимационную сушку или лиофилизацию используют, как правило, для повышения стабильности и, следовательно, срока хранения вещества, включая фармацевтические вещества, такие как антиген, применяемый в вакцинах.

Часто лиофилизированные антигенные композиции предлагаются специалистам в области здравоохранения для разведения разбавителем (например, водой для инъекций |\МР!| или в некоторых случаях жидким адъювантным препаратом) непосредственно перед введением пациенту. В таком случае период времени, в течение которого различные компоненты конечной вакцины поддерживаются в тесном контакте, сводят к минимуму.

Многие факторы должны быть учтены, когда антигены лиофилизируют с образованием лиофилизированных осадков (сухого продукта в результате лиофилизации). Например, антигенность/иммуногенность антигена должна сохраняться в лиофилизированной форме. Антиген не должен образовывать агрегаты или распадаться, когда он находится в лиофилизированной форме. Лиофилизированный осадок должен быть хорошо сформирован и не должен спадаться. Наконец, антиген должен, конечно, находиться в форме, которая быстро растворяется при разведении. Когда раствор для разведения не представляет собой просто ^Р1, например, когда антиген разводят жидким адъювантом, тогда необходимо учитывать влияние компонентов этого раствора на свойства разведенного продукта.

Как упомянуто, адъюванты применяли в течение многих лет для улучшения иммунного ответа на антигенный компонент вакцины. Особенно сильной адъювантной комбинацией является такая, которая содержит 3-деацилированный монофосфориллипид Α (3Э-МРБ) и сапонин, в частности 0821. где очищенная фракция сапонина экстрагирована из коры Ош11а)а каропайа Мопага. Данная комбинация может быть представлена, например, в виде эмульсии масло-в-воде, препарата липосом или т.п.

В предшествующих клинических испытаниях с антигенами, например с малярийными антигенами, такими как К.Т8,8, предложен лиофилизированный антиген, а также предложен отдельный флакон жидкого адъюванта, например препарата масло-в-воде МРЬ и 0821 или препарата липосом МРЬ и 0821, для разведения антигена. Индивидуальные компоненты объединяют с образованием конечной вакцинной композиции непосредственно перед введением.

Некоторые иммуностимулирующие олигонуклеотиды, содержащие неметилированные СрОдинуклеотиды (СрО), являются лигандами ТЬК.9 и идентифицированы как являющиеся адъювантами при введении как системным путем, так и путем введения в слизистую оболочку (\УО 96/02555, ЕР 468520, Эауй е! а1., 1. 1ттипо1., 1998, 160 (2):870-876; МсС1икк1е апй Пау1к, 1. 1ттипо1., 1998, 161 (9):4463-6). СрО представляет собой аббревиатуру для цитозин-гуанозин-динуклеотидных мотивов, присутствующих в ДНК. Исторически наблюдали, что ДНК-фракция вакцины БЦЖ (ВСО) может проявлять

- 1 018201 противоопухолевый эффект. При дальнейших исследованиях было показано, что синтетические олигонуклеотиды, имеющие происхождение от последовательностей гена ВСС, способны индуцировать иммуностимулирующие эффекты (как ίη νίίτο, так и ίη νίνο). Авторы этих исследований пришли к выводу, что некоторые палиндромные последовательности, включая центральный СС-мотив, являются носителями данной активности. Центральная роль СС-мотива в иммуностимуляции была объяснена позже в публикации Кпсд. №11игс 374, р. 546, 1995. Подробный анализ показал, что СС-мотив должен находиться в окружении определенной последовательности и что такие последовательности распространены в бактериальной ДНК, но редки в ДНК позвоночных. Иммуностимулирующая последовательность часто представляет собой пурин, пурин, С, С, пиримидин, пиримидин; где динуклеотидный СС-мотив не метилирован, но известно, что другие неметилированные СрС-последовательности являются иммуностимулирующими, и их можно применять в настоящем изобретении.

Также показано, что иммуностимулирующий олигонуклеотид может сохранять иммунологическую активность, когда гуанозин мутирован до 7-деазагуанозинового мотива (\νϋ 03057822).

Считают, что эти иммуностимулирующие олигонуклеотиды имеют кислый рН в растворе, например ниже рН 7, такой как 6,3, 6,1 или ниже. Это может затруднить их включение в жидкие вакцинные препараты, поскольку они не имеют сходства с другими компонентами препарата. Как обсуждалось, это может вызвать осаждение и/или проблемы долговременной стабильности.

Считают, что эти иммуностимулирующие олигонуклеотиды, вероятно, являются очень эффективными адъювантами, в частности, при использовании в комбинации с существующими адъювантными комбинациями, такими как 3Ь-МРЬ и 0821. Ожидают, что такие адъюванты применимы при заболеваниях, для которых до сих пор было трудно получить эффективные вакцины, таких как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), рак и, возможно, малярия.

Существует ряд различных путей, при которых адъюванты могут быть включены в вакцины, но они должны быть включены таким путем, который не влияет на стабильность ни их самих, ни антигенной композиции, а также таким путем, который не создаст ненужную нагрузку специалистам в области здравоохранения, разводящим вакцину. Простейшим путем для достижения этого должно быть помещение дополнительных компонентов в дополнительные флаконы, так чтобы держать их отдельно до момента непосредственного разведения, сводя, таким образом, к минимуму время, в течение которого компоненты могут влиять друг на друга. Это означает, что антиген и иммуностимулирующий олигонуклеотид каждый должен быть предложен в отдельном флаконе. Затем, если используют дополнительные адъювантные компоненты, такие как МРЬ и 0821, они могут быть представлены в виде жидкой смеси в третьем флаконе. Однако возрастающее число компонентов при возрастающем числе флаконов приводит к повышенным затратам, отходам и, что важно, к возрастанию возможности ошибок во время разведения.

Краткое изложение сущности изобретения

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что, когда лиганд ТЬК9, такой как иммуностимулирующий олигонуклеотид СрС, составляет часть иммуногенной композиции в качестве адъюванта, указанный лиганд ТЬК9 может быть лиофилизирован вместе с антигеном, так что предложен один флакон, содержащий антиген и лиганд ТЬК9 в качестве адъюванта вместе в виде одного лиофилизированного осадка.

Таким образом, в настоящем изобретении предложена лиофилизированная композиция, содержащая антиген и агонист ТЬК9. Указанный агонист ТЬК9 в одном воплощении представляет собой иммуностимулирующий олигонуклеотид, возможно СрС-содержащий олигонуклеотид. В одном аспекте указанный СрС-содержащий олигонуклеотид включает последовательность пурин, пурин, С, С, пиримидин, пиримидин. В другом аспекте указанный иммуностимулирующий олигонуклеотид выбран из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 1; 8ЕО ГО N0: 2; 8ЕО ГО N0: 3; 8ЕО ГО N0: 4 и 8ЕО ГО N0: 5.

Не желая быть связанными с теорией, считают, что предоставление антигена и агониста ТЬК9 вместе дает компонент, который является более стабильным, чем просто добавление ТЬК9 к жидкому препарату МРЬ и 0821.

Настоящее изобретение обеспечивает преимущество в том, что, когда антиген и агонист ТЬК9 разводят νΡΙ, есть возможность предложения только одного флакона с лиофилизированным препаратом в нем. Кроме того, когда антиген и агонист ТКЬ9 должен быть разведен жидким препаратом, таким как жидкий адъювантный препарат, преимущество состоит в возможности предложения только двух флаконов компонентов (а не трех). Это, в свою очередь, экономически эффективно, обеспечивая при этом препарат, подходящий для применения однократно разведенной вакцины.

Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что совместная лиофилизация СрС с антигенами, которые не будут иметь общий положительный заряд в буфере для разведения, может повысить растворимость этих антигенов при разведении либо водой для инъекций, либо жидким адъювантом. Таким образом, в настоящем изобретении также предложен способ повышения растворимости лиофилизированного антигена при разведении, где антиген не будет иметь суммарный положительный заряд в буфере для разведения, включающий стадию совместной лиофилизации агониста ТЬК9, предпочтительно иммуностимулирующего олигонуклеотида и более предпочтительно СрС-олигонуклеотида, с антигеном. В настоящем изобретении также предложено применение агониста ТЬК9, предпочтительно имму

- 2 018201 ностимулирующего олигонуклеотида и более предпочтительно СрО-олигонуклеотида, для повышения растворимости лиофилизированного, не имеющего положительного заряда антигена при разведении. Под не имеющим положительного заряда подразумевают, что общий заряд белка не является положительным. Белок может содержать как положительные, так и отрицательные заряды, но общий заряд белка является либо нейтральным, либо отрицательным.

В настоящем изобретении также предложен способ изготовления иммуногенной композиции, включающий стадии разведения лиофилизированной композиции, как описано здесь, подходящим носителем. В одном воплощении указанный носитель представляет собой раствор липосом или эмульсию масло-в-воде. Указанный носитель возможно может содержать один или более чем один иммуностимулятор, который может быть выбран из группы, состоящей из агонистов ТЬК.4, антагонистов ТЬК4, сапонинов, агонистов ТЬК7, агонистов ТЬК8, агонистов ТЬК9. В одном воплощении указанный носитель содержит два или более чем два иммуностимулятора, и в одном аспекте они могут представлять собой 3деацилированный МРЬ и 0821.

В настоящем изобретении также предложен способ изготовления лиофилизированной композиции по изобретению, включающий объединение одного или более чем одного желательного антигена, лиганда ТЬК.9 и подходящих эксципиентов и сублимационную сушку полученной смеси.

Подробное описание изобретения

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что лиганды ТЬК9, такие как СрО-олигонуклеотиды, могут быть лиофилизированы с интересующим антигеном, не оказывая влияние на антигенность или стабильность этого антигена. Под лигандом ТЬК9 подразумевают соединение, которое взаимодействует с рецептором ТЬК9.

Показано, что члены семейства То11-подобных рецепторов (ТЬК), впервые открытых у дрозофилы, являются образраспознающими рецепторами, где каждый представитель распознает и отвечает на различные компоненты микроорганизмов, чтобы ограничить/ликвидировать инвазивные микроорганизмы. Связывание ассоциированных с патогенами характерных участков молекулы (РАМР) с ТЬК индуцирует продуцирование реакционноспособных промежуточных соединений кислорода и азота, инициацию сети провоспалительных цитокинов и позитивную регуляцию костимулирующих молекул, связывая быстрый характерный ответ с адаптивным иммунитетом. Известно, что многие лиганды ТЬК полезны в качестве адъювантов. Показано, что ТЬК9 отвечает на олигонуклеотидные агонисты. Следовательно, лиганды ТЬК9 по изобретению являются иммуностимулирующими олигонуклеотидами. В одном воплощении изобретения такие лиганды ТЬК9 содержат СрО-мотив. Альтернативные иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут содержать модификации нуклеотидов. Например, в \УО 0226757 и \УО 03057822 раскрыты модификации С- и О-части СрО-содержащих иммуностимулирующих олигонуклеотидов.

В одном воплощении лиганды ТЬК9 представляют собой СрО-олигонуклеотиды. В одном аспекте данного воплощения СрО-олигонуклеотид содержит два или более чем два динуклеотидных СрОмотива, разделенных по меньшей мере тремя, возможно по меньшей мере шестью или более нуклеотидами. Олигонуклеотиды по настоящему изобретению обычно представляют собой дезоксинуклеотиды. В одном воплощении межнуклеотидная связь в олигонуклеотиде представляет собой фосфородитиоатную или, возможно, фосфоротиоатную связь, хотя фосфодиэфирные и другие межнуклеотидные связи также могут быть использованы, включая олигонуклеотиды со смешанными межнуклеотидными связями. Способы получения фосфоротиоатных или фосфородитиоатных олигонуклеотидов описаны в И8 5666153, и8 5278302 и \УО 95/26204. Рассмотрен олигонуклеотид, содержащий различные межнуклеотидные связи, например смешанные фосфоротиоатные фосфодиэфиры. Могут быть использованы другие межнуклеотидные связи, которые стабилизируют олигонуклеотид.

Примеры СрО-олигонуклеотидов имеют приведенные ниже последовательности. В одном воплощении эти последовательности содержат модифицированные фосфоротиоатом межнуклеотидные связи.

ОЬЮО 1 (8ЕО ГО N0: 1): ТСС АТО АСО ТТС СТО АСО ТТ (СрО 1826).

ОЬЮО 2 (8ЕО ГО 2): ТСТ ССС АОС ОТО СОС САТ (СрО 1758).

ОЬЮО 3 (81Т) ГО 3): АСС ОАТ ОАС ОТС ОСС ООТ ОАС ООС АСС АСО.

ОЬЮО 4 (8ЕО ГО 4): ТСО ТСО ТТТ ТОТ СОТ ТТТ ОТС ОТТ (СрО 2006).

ОЬЮО 5 (8ЕО ГО 5): ТСС АТО АСО ТТС СТО АТО СТ (СрО 1668).

Альтернативные СрО-олигонуклеотиды могут содержать приведенные выше последовательности, в которых они имеют несущественные делеции или добавления к ним.

СрО-олигонуклеотиды, используемые в настоящем изобретении, могут быть синтезированы любым способом, известным в данной области техники (например, ЕР 468520). Для удобства такие олигонуклеотиды могут быть синтезированы с использованием автоматизированного синтезатора.

В контексте настоящего описания термин антиген предназначен для обозначения иммуногенного компонента, подходящего для индуцирования специфического иммунного ответа и подходящего для включения в вакцину или иммуногенную композицию, например антиген для включения в вакцину против ВИЧ-1, вакцину против рака, малярийную вакцину, ТВ-вакцину или т.п. Подробности о специфичных антигенах приведены ниже.

В одном воплощении антиген имеет изоэлектрическую точку 9,6 или менее. В одном воплощении

- 3 018201 антиген имеет изоэлектрическую точку 9 или менее. В одном воплощении антиген имеет изоэлектрическую точку 8,5 или менее. В одном воплощении антиген имеет изоэлектрическую точку 8,0 или менее. В одном воплощении антиген имеет изоэлектрическую точку 7,5. В одном воплощении антиген имеет изоэлектрическую точку в интервале от 7 до 8.

Суммарный заряд белка при разведении в буфере зависит от количества положительных зарядов против количества отрицательных зарядов в белке, где этот заряд, конечно, будет варьировать в зависимости от рН буфера для разведения. Изоэлектрическая точка представляет собой значение рН, при котором суммарный заряд белка является нейтральным. Если рН буфера для разведения ниже изоэлектрической точки антигена, белок склонен нести суммарный положительный заряд. Если рН буфера для разведения выше изоэлектрической точки антигена, белок склонен нести суммарный отрицательный заряд. Настоящее изобретение особенно полезно при лиофилизации и разведении антигенов, которые имеют такую изоэлектрическую точку, что в предназначенном буфере для разведения белок будет нести суммарный отрицательный заряд. При таких условиях (см. пример 3) присутствие СрС в лиофилизированной композиции может усилить растворимость антигена в буфере для разведения.

В одном воплощении лиофилизированный антиген и агонист ТЬК9 представлены в виде одной дозы, например в одном флаконе.

В одном воплощении лиофилизированный антиген присутствует в количестве, которое обеспечивает концентрацию антигена в интервале от 10 до 250 мкг при разведении.

В одном воплощении агонист ТКЬ9 присутствует в количестве, которое обеспечивает концентрацию в интервале от 10 до 1000 мкг, как, например, 500 мкг, при разведении.

В одном воплощении изобретения антиген, который объединяют в лиофилизированной композиции с лигандом ТЬК.9, может представлять собой противоопухолевый антиген. Следовательно, иммуногенные композиции, изготовленные с использованием лиофилизированной антигенной композиции по изобретению, полезны для иммунотерапевтического лечения злокачественных новообразований. Например, лиофилизированная композиция может быть изготовлена с раковыми антигенами, опухолевыми антигенами или антигенами отторжения опухоли, как описано здесь, такими как белки, экспрессирующиеся, среди прочего, при раке простаты, раке молочной железы, раке прямой и ободочной кишки, раке легкого, раке почки, раке яичника, раке печени и раке головы и шеи.

Антигены рака семенников, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают семейство антигенов МАСЕ А: МАСЕ-А1, А2, А3, А4, А5, А6, А7, А8, А9, А10, А11 и А12, также известных как МАСЕ-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12; антигенов МАСЕ В: МАСЕ В1, В2, В3 и В4; антигенов МАСЕ С: МАСЕ-С1 и МАСЕ-С2; антиген ЬАСЕ 1; антиген ЬАСЕ 2 (также известный как ΝΥЕ8О-1) и антиген САСЕ.

Простатоспецифические антигены могут также быть использованы в настоящем изобретении. Примеры простатоспецифических антигенов, которые могут быть гибридными, включают шеститрансмембранный эпителиальный антиген простаты (8ТЕАР), простатоспецифический антиген (Р8А), простатическую кислую фосфатазу (РАР), простатический антиген стволовых клеток (Р8СА), простатоспецифический мембранный антиген (Р8МА) или антиген, известный как простаза (также известный как Р703Р).

В одном воплощении простатический антиген представляет собой Р5018 или его фрагмент. Р5018, также называемый простеин, представляет собой белок из 553 аминокислот. Иммуногенные фрагменты и участки Р5018, содержащие по меньшей мере 20, 50 или 100 непрерывных аминокислот, или фрагменты, содержащие между 20-50 или 50-100 непрерывных аминокислот, могут быть использованы в качестве опухолеассоциированного антигена или производного по настоящему изобретению. В одном воплощении опухолеассоциированный антиген или производное представляет собой антиген Р8108 (раскрытый в АО98/50567) или белок, ассоциированный с раком простаты (см. АО 99/67384). В некоторых воплощениях фрагменты представляют собой аминокислоты 51-553, 34-553 или 55-553 полноразмерного белка Р5018. Они могут экспрессироваться в дрожжевых системах, например, последовательности ДНК, кодирующие такие полипептиды, могут экспрессироваться в дрожжевых системах.

В одном воплощении антиген может включать АТ-1, экспрессируемый геном опухоли Вильмса, или его Ν-концевой фрагмент АТ-1Е, содержащий примерно или приблизительно аминокислоты 1-249, либо состоять из них. АТ1 представляет собой белок, сверхэкспрессия которого исходно обнаружена при раке почки у детей, опухоли Вильмса. Антиген, который может быть использован, включает почти полноразмерный белок в качестве антигена. В одном воплощении антиген может включать белок АТ1А10, который представляет собой рекомбинантный слитый белок из 292 аминокислот, состоящий из 12мерной укороченной последовательности 1а1 и аминокислот № 2-281 последовательности АТ1, или состоять из него.

В одном воплощении изобретения опухолеассоциированный антиген или производное представляет собой антиген рака молочной железы, например Нег-2/пеи, маммаглобин или антиген Β305Ό.

Антиген Нег-2/пеи для применения в настоящем изобретении может содержать полноразмерный внеклеточный домен (ЕСЭ; например, последовательность, содержащую приблизительно аминокислоты 1-645 аминокислотной последовательности Нег-2/пеи) или его фрагменты. Альтернативно или дополни

- 4 018201 тельно, конструкция может содержать по меньшей мере иммуногенный участок полноразмерного внутриклеточного домена: например, приблизительно 580 С-концевых аминокислот последовательности Нег2/пеи.

Одна из конструкций, которая может быть использована в качестве производного опухолеассоциированного антигена по настоящему изобретению, представляет собой слитый белок из ЕСЭ и домена фосфорилирования (ΡΌ) Нег-2/пеи (ЕСО-РЭ). Еще одна конструкция, которая может быть использована, представляет собой слитый белок из ЕСЭ и фрагмента домена фосфорилирования Нег-2/пеи (ЕСЭ-АРЭ). Слитые белки и конструкции Нег-2/пеи, которые описаны, могут иметь происхождение от Нег-2/пеи человека, крысы, мыши или обезьяны/мартышки. Примерные последовательности и конструкции Нег-2/пеи описаны в АО 00/44899.

РКАМЕ (также известный как ЭАСЕ) представляет собой другой антиген, который может быть использован в качестве опухолеассоциированного антигена по настоящему изобретению. Также могут быть использованы слитые белки, как описано здесь, которые содержат антиген РКАМЕ. В частности, слияния антигена РКАМЕ, как описано здесь, и белка Ό в качестве партнера слияния белка или производного, как описано здесь, рассмотрены для применения в настоящем изобретении.

Несколькими группами показано, что антиген РКАМЕ экспрессируется при меланоме и широком ряде опухолей, включая рак легкого, почки и головы и шеи. Интересно, что также оказалось, что он экспрессируется при 40-60% лейкозов, таких как острый лимфоидный лейкоз и острый миелоидный лейкоз, см., например, Ехр Нета!о1. 2000 Эес; 28 (12): 1413-22. У пациентов наблюдали, что сверхэкспрессия РКАМЕ, как оказалось, ассоциирована с более высокой выживаемостью и более низкими частотами рецидивов по сравнению с теми, у которых нет сверхэкспрессии этого белка.

Антиген и его препарат описаны в патенте США № 5830753. РКАМЕ находится в Аннотированной базе данных генов человека Н-1пу ΌΒ под номерами по каталогу: И65011.1, ВС022008.1, АК129783.1, ВС014974.2, СК608334.1, АЕ025440.1, СК591755.1, ВС039731.1, СК623010.1, СК611321.1, СК618501.1, СК604772.1, СК456549.1 и СК620272.1.

В одном аспекте антиген по настоящему изобретению может включать антиген РКАМЕ или его иммуногенный фрагмент, либо состоять из него. Как правило, белок РКАМЕ имеет 509 аминокислот, и в одном воплощении все 509 аминокислот РКАМЕ могут быть включены в антиген.

Колоректальные антигены могут также быть использованы в качестве опухолеассоциированных антигенов по настоящему изобретению. Примеры колоректальных антигенов, которые могут быть использованы, включают: С1585Р (ММР 11) и С1491 (белок, связывающий энхансер Е1А), СА8В618 (как описано в АО 00/53748); СА8В7439 (как описано в АО 01/62778) и С1584 (Сир1о).

Другие опухолеассоциированные антигены, полезные в контексте настоящего изобретения, включают: Р1и-1, 1. Вю1. Сйеш. 274 (22), 15633-15645, 1999, НА8Н-1, НА8Н-2, Спрю (8а1отоп е! а1. Вюе88ау8 199, 21 61-70, патент США 5654140), Спрйп. патент США 5981215. Кроме того, антигены, особенно релевантные для вакцин при терапии рака, также включают тирозиназу и сурвивин.

Пептиды, имеющие происхождение от муцина, такие как Мис1, см., например, ϋδ 5744144, И8 5827666, АО 8805054, ϋδ 4963484. Конкретно рассмотрены пептиды, имеющие происхождение от Мис1, которые содержат по меньшей мере одну повторяющуюся единицу пептида Мис1, предпочтительно по меньшей мере два таких повтора, и которые распознаются антителом 8М3 (ϋδ 6054438). Другие пептиды, имеющие происхождение от муцина, включают пептид из Мис5.

Другие опухолеспецифические антигены подходят для применения в лиофилизированной композиции по настоящему изобретению и включают, но не ограничены ими, опухолеспецифические ганглиозиды, такие как СМ2 и СМ3, или их конъюгаты с белками-носителями; либо указанный антиген может представлять собой аутологичный пептидный гормон, такой как полноразмерный рилизинг-фактор гормона гонадотропина (СпКН, АО 95/20600), короткий пептид длиной 10 аминокислот, полезный в лечении многих видов рака или при иммунокастрации.

Изобретение также распространяется на применение вышеописанных антигенов, иммуногенных производных и иммуногенных фрагментов, а также слитых белков, содержащих их, в аспектах настоящего изобретения.

Производные, фрагменты и слитые белки

Опухолеассоциированные антигены по настоящему изобретению могут быть использованы в форме их производных или фрагментов, а не встречающегося в природе антигена.

Термин производное, как он использован здесь, относится к антигену, который модифицирован относительно его встречающейся в природе формы. Производное может включать мутацию, например точечную мутацию. В одном примере производное может изменять свойства белка, например, благодаря улучшению экспрессии в прокариотических системах или благодаря удалению нежелательной активности, например ферментативной активности. Производные по настоящему изобретению в достаточной степени подобны нативным антигенам в сохранении антигенных свойств и сохранении способности обеспечивать иммунный ответ, который должен быть вызван против природного антигена. Вызывает ли данное производное такой иммунный ответ, можно измерить с помощью подходящего иммунологического анализа, такого как твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЬКА) или проточная цитометрия.

- 5 018201

В одном воплощении настоящего изобретения производное опухолеассоциированного антигена по настоящему изобретению представляет собой слитый белок, содержащий опухолеассоциированный антиген, связанный с гетерологичным белком-партнером слияния. Под термином гетерологичный в отношении опухолеассоциированного антигена подразумевают белок или полипептидную последовательность, которые не будут связываться с опухолеассоциированным антигеном в природе, т.е. они связываются с опухолеассоциированным антигеном в результате намеренного вмешательства человека.

Антиген и гетерологичный белок-партнер слияния могут быть конъюгированы химическим путем либо могут экспрессироваться в виде рекомбинантных слитых белков. В одном воплощении слитый белок по настоящему изобретению может обеспечить получение повышенных уровней слитого белка, продуцируемого в экспрессионной системе, по сравнению с неслитым белком. Таким образом, белокпартнер слияния может способствовать обеспечению Т-хелперных эпитопов, например Т-хелперных эпитопов, распознаваемых человеком (т.е. белок-партнер слияния действует как иммунологический партнер слияния). Партнер слияния может способствовать экспрессии белка при более высоких выходах, чем нативного рекомбинантного белка (т.е. белок-партнер слияния действует как усилитель экспрессии). В одном воплощении белок-партнер слияния может действовать и как иммунологический партнер слияния, и как партнер, усиливающий экспрессию.

Белки-партнеры слияния могут иметь происхождение, например, от белка Ό. Белок Ό представляет собой липопротеин (белок 42 кДа, связывающий иммуноглобулин Ό, экспонированный на поверхности грамотрицательной бактерии НаешорШик тПиепхае). Этот белок синтезируется в виде предшественника с сигнальной последовательностью из 18 аминокислотных остатков, содержащей консенсуспоследовательность для бактериального липопротеина (см. АО 91/18926). Нативный белокпредшественник белка Ό подвергается процессингу во время секреции, и сигнальная последовательность отщепляется. Цистеин (Сук) процессированного белка Ό (в положении 19 в молекуле предшественника) становится Ν-концевым остатком процессированного белка и параллельно модифицируется путем ковалентного присоединения жирных кислот, как связанных сложноэфирной связью, так и связанных амидной связью. Жирные кислоты, связанные с амино-концевым остатком цистеина, затем функционируют в качестве мембранного якоря.

В одном воплощении производное опухолеассоциированного антигена для применения в настоящем изобретении может включать белок Ό или его производное в качестве белка-партнера слияния.

Белок Ό или его производное, как описано здесь, может содержать, например, первую или Νконцевую треть процессированного белка Ό или приблизительно или примерно первую или Ν-концевую треть процессированного белка Ό. В одном воплощении белок Ό или его производное может включать первые или Ν-концевые 100-115 аминокислот процессированного белка Ό; либо первые или Ν-концевые 109 аминокислот процессированного белка Ό. В одном воплощении аминокислоты 2-Ьук и 3-Ьеи нативного процессированного белка Ό могут быть заменены аминокислотами 2-Акр и 3-Рго.

В одном воплощении белок Ό или его производное может дополнительно включать 18- или 19аминокислотную сигнальную последовательность белка-предшественника Ό. В одном воплощении белок-партнер слияния, происходящий из белка Ό, содержит аминокислоты 20-127 белка-предшественника Ό или состоит из них. В одном воплощении настоящего изобретения две аминокислоты 21-Ьук и 22-Ьеи белка-предшественника Ό, который является белком-партнером слияния, могут быть заменены аминокислотами 21-Акр и 22-Рго.

Белок-партнер слияния, представляющий собой белок Ό, как описано здесь, может дополнительно или альтернативно содержать делеции, замены или вставки в пределах аминокислотной последовательности по сравнению с предшественником дикого типа или процессированной последовательностью белка Ό. В одном воплощении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более аминокислот могут быть вставлены, заменены или делетированы. Аминокислоты могут быть заменены консервативными заменами, как определено здесь, либо могут быть использованы другие аминокислоты.

В одном воплощении белок-партнер слияния может содержать последовательность белка Ό, как показано в 8Εβ ΙΌ ΝΟ: 1, или состоять из нее. В одном воплощении белок-партнер слияния может содержать аминокислоты, подчеркнутые на фиг. 1, т.е. аминокислотные остатки 20-127 включительно из 8Εβ ΙΌ ΝΟ: 12, или состоять из них. В одном воплощении антиген для применения в настоящем изобретении может представлять собой белок-Э-МАСЕ-3, в котором антиген МАСЕ-3 состоит из аминокислот 3-314 МАСЕ-3, и в котором белок-партнер слияния, представляющий собой белок Ό, состоит из аминокислотной последовательности, показанной на фиг. 1.

В другом воплощении настоящего изобретения белки-партнеры слияния могут быть выбраны из Ν81 или Ьу1А, либо их производных, как описано ниже.

Ν81 представляет собой неструктурный белок из вируса гриппа. В одном воплощении производное опухолеассоциированного антигена по настоящему изобретению может включать Ν81 или его производное в качестве белка-партнера слияния. Ν81 или его производное может содержать его Ν-концевые аминокислоты 1-81.

Ьу1А выделен из 81гер1ососеик рпеишошае. С-концевой домен белка Ьу1А ответственен за сродство к холину или к некоторым аналогам холина, таким как ЭЕАЕ. В одном воплощении производное опухо

- 6 018201 леассоциированного антигена по настоящему изобретению может включать Ьу!А или его производное в качестве белка-партнера слияния. Ьу!А или его производное может включать повторяющийся участок молекулы Ьу1А, находящийся на С-конце, начиная с остатка 178. В одном воплощении Ьу1А или его производное содержит остатки 188-305 С-Ьу1А.

Иммуногенные полипептиды для применения в настоящем изобретении обычно представляют собой рекомбинантные белки, продуцируемые, например, путем экспрессии в гетерологичном хозяине, таком как бактериальный хозяин, в дрожжах или культивируемых клетках млекопитающих.

Термин производное опухолеассоциированного антигена означает полипептид, который частично или полностью содержит последовательности, которые встречаются в природе в опухолеассоциированном антигене или которые обладают высокой степенью идентичности последовательности с ними (например, более чем 95% идентичности последовательности на отрезке по меньшей мере из 10 аминокислот, например по меньшей мере 20 аминокислот). Производные также включают последовательности, имеющие консервативные замены. Консервативные замены хорошо известны и в общем представлены в виде матриц замен по умолчанию в компьютерных программах выравнивания последовательностей.

В общем смысле замены в пределах приведенных ниже групп представляют собой консервативные замены, а замены между приведенными ниже группами считают неконсервативными. Эти группы представляют собой:

1) аспартат/аспарагин/глутамат/глутамин;

2) серин/треонин;

3) лизин/аргинин;

4) фенилаланин/тирозин/триптофан;

5) лейцин/изолейцин/валин/метионин;

6) глицин/аланин.

Производные по настоящему изобретению могут также включать химически обработанные последовательности, такие как обработанные альдегидом (таким как формальдегид или глутаральдегид), карбоксиметилированием, карбоксиамидированием, ацилированием и другими рутинными химическими обработками. Конструкции по настоящему изобретению, имеющие дериватизированные остатки свободного тиола, могут быть также использованы в настоящем изобретении. В частности, могут быть использованы карбоксиамидированные или карбоксиметилированные тиоловые производные.

В одном воплощении настоящего изобретения производное опухолеассоциированного антигена может представлять собой антиген МАСЕ, как описано здесь, имеющий дериватизированные остатки свободного тиола. Эти дериватизированные остатки свободного тиола могут представлять собой карбоксамидные или карбоксиметилированные производные.

Производное опухолеассоциированного антигена по настоящему изобретению может альтернативно включать конструкцию, содержащую более чем один опухолеассоциированный антиген. В одном воплощении настоящего изобретения производное опухолеассоциированного антигена может включать два или более чем два опухолеассоциированных антигена.

Термин фрагмент, как он использован здесь, относится к фрагментам опухолеассоциированного антигена или производного этого антигена, которые содержат по меньшей мере один эпитоп, например СТЬ эпитоп, как правило, пептид по меньшей мере из 8 аминокислот. Фрагменты по меньшей мере из 8, например 8-10 аминокислот или вплоть до 20, 50, 60, 70, 100, 150 или 200 аминокислот в длину считают включенными в объем изобретения настолько, насколько этот фрагмент проявляет антигенность, т.е. основные эпитопы (например СТЬ эпитопы) сохранены этим фрагментом, и этот фрагмент способен к индукции иммунного ответа, который перекрестно реагирует с природным опухолеассоциированным антигеном. Примерные фрагменты могут составлять 8-10, 10-20, 20-50, 50-60, 60-70, 70-100, 100-150, 150-200 аминокислотных остатков в длину (включая любое значение в этих интервалах).

В одном воплощении изобретения лиофилизированную композицию, содержащую антиген Нег 2 пей и СрС-олигонуклеотид, разводят носителем, представляющим собой эмульсию липосом или масло-вводе, содержащую 3Ό-ΜΡΕ и 0821. Такие разведенные препараты продуцируют как гуморальный, так и клеточно-опосредованный иммунный ответ.

Лиофилизированные композиции по изобретению могут содержать антигены, ассоциированные с механизмами поддержания опухоли (например, ангиогенезом, опухолевой инвазией), например, Не 2, УЕСЕ (фактор роста эндотелия сосудов).

В другом аспекте изобретения антиген в лиофилизированной композиции по изобретению представляет собой антиген, выбранный из антигенов, происходящих из ВИЧ, в частности антигенов, происходящих из ВИЧ-1. В приведенных ниже абзацах описаны антигены, которые могут иметь происхождение из ВИЧ-1.

Белки Та! и №Г ВИЧ представляют собой ранние белки, т.е. они экспрессируются на ранней стадии инфекции и в отсутствие структурного белка.

Ген №Г кодирует ранний вспомогательный белок ВИЧ, который, как показано, обладает несколькими активностями. Например, известно, что белок №Г вызывает удаление СЭ4. рецептора ВИЧ, с клеточной поверхности, хотя биологическое значение этой функции является спорным. Кроме того, №Г

- 7 018201 взаимодействует с биохимическим путем передачи сигнала Т-клетками и индуцирует активное состояние, которое, в свою очередь, может стимулировать более эффективную экспрессию гена. Некоторые изоляты ВИЧ имеют мутации или делеции в этой области, в результате которых они не кодируют функциональный белок, и их репликация и патогенез ίη νίνο сильно нарушены.

Ген Сад транслируется с полноразмерной РНК с образованием полипротеина-предшественника, который впоследствии расщепляется на 3-5 капсидных белков; матриксный белок р17, капсидный белок р24 и белок, связывающий нуклеиновую кислоту (БипбатеШа1 Упо1оду, Р1е1б8 ΒΝ, Кшре ΌΜ апб НоМеу Μ, 1996, 2. Г1е1б8 У1го1оду, νοί. 2, 1996).

Ген Сад образует белок-предшественник Сад, 55 килодальтон (кД), также называемый р55, который экспрессируется с несплайсированной вирусной мРНК. В процессе трансляции Ν-конец р55 подвергается миристоилированию, запускающему его связывание с цитоплазматической стороной клеточных мембран. Связанный с мембраной полипротеин Сад рекрутирует две копии вирусной геномной РНК наряду с другими вирусными и клеточными белками, которые запускают активную репликацию вирусной частицы в результате проникновения в клетку с поверхности инфицированной клетки. После этой активной репликации р55 расщепляется протеазой, кодируемой вирусом (продуктом гена Ро1), в процессе созревания вируса в четыре белка меньшего размера, обозначенные МА (матриксный[р17]), СА (капсидный[р24]), NС (нуклеокапсидный [р9]) и р6.

В дополнение к 3 основным белкам Сад (р17, р24 и р9) все предшественники Сад содержат несколько других областей, которые отщепляются и остаются в вирионе в виде пептидов различных размеров. Эти белки играют различные роли, например белок р2 играет предполагаемую роль в регуляции активности протеазы и вносит вклад в правильный тайминг протеолитического процессинга.

Полипептид МА происходит из Ν-концевого миристоилированного конца р55. Большинство молекул МА остается присоединенным к внутренней поверхности липидного бислоя вириона, стабилизируя частицу. Подгруппа МА рекрутируется внутрь более глубоких слоев вириона, где она становится частью комплекса, который сопровождает вирусную ДНК в ядро. Эти молекулы МА способствуют ядерному транспорту вирусного генома, поскольку сигнал ядерной локализации на МА распознается клеточным механизмом ядерного транспорта. Этот феномен дает возможность ВИЧ инфицировать неделящиеся клетки, что является необычным свойством для ретровируса.

Белок р24 (СА) образует конический кор вирусной частицы. Продемонстрировано, что циклофиллин А взаимодействует с областью р24 р55, что приводит к его включению в частицы ВИЧ. Взаимодействие между Сад и циклофиллином А существенно, поскольку прерывание этого взаимодействия циклоспорином ингибирует вирусную репликацию.

Область NС Сад ответственна за специфичное распознавание так называемого сигнала упаковки ВИЧ. Сигнал упаковки состоит из четырех структур типа стебель-петля, локализованных вблизи 5'конца вирусной РНК, и достаточен для того, чтобы опосредовать включение гетерологичной РНК в вирионы ВИЧ-1. NС связывается с сигналом упаковки посредством взаимодействий, опосредованных двумя мотивами типа цинковые пальцы. NС также способствует обратной транскрипции.

Область полипептида р6 опосредует взаимодействия между р55 Сад и вспомогательным белком Ург, приводя к включению Ург в собирающиеся вирионы. Область р6 также содержит так называемый поздний домен, который требуется для эффективного высвобождения активно реплицирующихся вирионов из инфицированной клетки.

Ген Ро1 кодирует три белка, обладающих активностями, необходимыми вирусу на ранней стадии инфекции, обратную транскриптазу КТ, протеазу и белок интегразу, необходимый для интеграции вирусной ДНК в клеточную ДНК. Первичный продукт Ро1 расщепляется протеазой вириона с образованием амино-концевого пептида КТ, который содержит активности, необходимые для синтеза ДНК (РНК- и ДНК-направленную ДНК полимеразу, рибонуклеазу Н), и карбокси-концевого белка интегразы. КТ ВИЧ представляет собой гетеродимер полноразмерной КТ (р66) и продукта расщепления (р51), у которого отсутствует карбокси-концевой домен РНКазы Н.

КТ представляет собой один из наиболее высоко консервативных белков, кодируемых ретровирусным геномом. Двумя основными активностями КТ являются ДНК Ро1 и рибонуклеаза Н. ДНК Ро1 активность КТ использует ДНК и РНК в качестве матриц взаимозаменяемо и, подобно всем известным ДНКполимеразам, неспособна инициировать синтез ДНК бе ηονο, а требует уже существующей молекулы, которая служит в качестве праймера (РНК).

Активность РНКазы Н, присущая всем белкам КТ, при ранней репликации играет незаменимую роль по удалению РНК-генома в процессе синтеза ДНК. Она селективно разрушает РНК из всех гибридных молекул РНК-ДНК. Структурно полимераза и РНКаза Н занимают отдельные, неперекрывающиеся домены в пределах Ро1, охватывающие две трети с амино-конца Ро1.

Каталитическая субъединица р66 уложена в 5 отдельных субдоменов. Амино-концевые 23 аминокислоты из них имеют участок с активностью КТ. Карбокси-концевые аминокислоты от них представляют собой домен РНКазы Н.

После инфицирования клетки-хозяина ретровирусный РНК-геном копируется в линейную двунитевую ДНК обратной транскриптазой, которая присутствует в инфицирующей частице. Интеграза (обзор

- 8 018201 сделан 8ка1ка АМ '99 Αάν ίη У1ги§ Век 52, 271-273) распознает концы вирусной ДНК, обрезает их и сопровождает вирусную ДНК к сайту хромосомы хозяина для катализа интеграции. Многие сайты в ДНК хозяина могут быть мишенями интеграции. Хотя интеграза достаточна для катализа интеграции ίη νίΐτο, она является не единственным белком, связанным с ДНК ίη νίνο; большой комплекс белок-вирусная ДНК, выделенный из инфицированных клеток, обозначен как прединтеграционный комплекс. Это способствует приобретению генов клетки-хозяина потомством вирусных геномов.

Интеграза состоит из 3 отдельных доменов: Ν-концевого домена, каталитического кора и Сконцевого домена. Каталитический коровый домен содержит все необходимое для химии полинуклеотидильного переноса.

Антигены, происходящие из ВИЧ-1, для применения в изобретении могут быть, таким образом, выбраны, например, из Сад (например, полноразмерного Сад), р17 (участка Сад), р24 (другого участка Сад), р41, р40, Ро1 (например, полноразмерного Ρο1), ВТ (участка Ρο1), р51 (участка ВТ), интегразы (участка Ρο1), протеазы (участка Ρο1), Εην, др120, др140 или др160, др41, №£, У1Р, Ург, Ури, Βον, Та1, а также их иммуногенных производных и их иммуногенных фрагментов, в частности, Εην, Сад, ΝοΓ и Ρο1 и их иммуногенных производных и их иммуногенных фрагментов, включая р17, р24, ВТ и интегразу. ВИЧвакцины могут содержать полипептиды и/или полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, соответствующие множественным различным антигенам ВИЧ, например, 2 или 3 либо 4 или более антигенов ВИЧ, которые могут быть выбраны из приведенного выше перечня. Несколько различных антигенов могут, например, быть включены в единый слитый белок. Более чем один первый иммуногенный полипептид и/или более чем один второй иммуногенный полипептид, каждый из которых представляет собой антиген ВИЧ, либо слияние более чем одного антигена могут быть использованы.

Например, антиген может включать Сад или его иммуногенное производное или иммуногенный фрагмент, слитый с ВТ или его иммуногенным производным или иммуногенным фрагментом, слитым с №£ или его иммуногенным производным или иммуногенным фрагментом, где участок Сад слитого белка присутствует на 5'-конце полипептида.

Последовательность Сад, применяемая в соответствии с изобретением, может исключать последовательность, кодирующую полипептид р6 Сад. Конкретный пример последовательности Сад для применения в изобретении включает кодирующие последовательности р17 и/или р24.

Последовательность ВТ может содержать мутацию, для того чтобы, по существу, инактивировать какую-либо активность обратной транскриптазы (см. \УО 03/025003).

Г ен ВТ представляет собой компонент гена ро1 большего размера в геноме ВИЧ. Следует понимать, что последовательность ВТ, применяемая в соответствии с изобретением, может присутствовать в контексте Ρο1 или фрагмента Ρο1, соответствующего по меньшей мере ВТ. Такие фрагменты Ρο1 сохраняют основные СТЬ эпитопы Ρο1. В одном конкретном примере ВТ включает по меньшей мере только фрагмент р51 или только фрагмент р66 ВТ.

Компонент ВТ слитого белка или композиции согласно изобретению возможно содержит мутацию для удаления сайта, который служит в качестве внутреннего сайта инициации в прокариотических экспрессионных системах.

Возможно последовательность ΝοΓ для применения в изобретении укорочена для удаления последовательности, кодирующей Ν-концевую область, т.е. удаления от 30 до 85 аминокислот, например от 60 до 85 аминокислот, в частности Ν-концевых 65 аминокислот (на последнее укорочение здесь ссылаются как на ΙγΝοΓ). Альтернативно или дополнительно, ΝοΓ может быть модифицирована для удаления сайта миристоилирования. Например, сайт миристоилирования С1у 2 может быть удален путем делеции или замены. Альтернативно или дополнительно, №£ может быть модифицирована для изменения дилейцинового мотива Ьеи 174 и Ьеи 175 путем делеции или замены одного или обоих лейцинов. Важность дилейцинового мотива в негативной регуляции ί.Ό4 описана, например, в ΒΐΌκηηΙιηη Ρ.Α. е1 а1. (1998), СиггеШ Вю1оду, 8 (22): 1235-8.

Антиген Εην может присутствовать в его полноразмерном виде как др160, либо в укороченном виде как др140 или короче (возможно с подходящей мутацией для разрушения мотива сайта расщепления между др120 и др41). Антиген Εην может также присутствовать в его встречающейся в природе процессированной форме в виде др120 и др41. Эти два производных др160 могут быть использованы индивидуально или вместе в виде комбинации. Вышеупомянутые антигены Εην могут дополнительно проявлять делеции (в частности, вариабельных петель) и укорочения. Фрагменты Εην также могут быть использованы.

Примерная последовательность др120 показана в 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 6. Примерная последовательность др140 показана в 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 7.

Иммуногенные полипептиды для применения в лиофилизированной композиции согласно изобретению могут включать Сад, Ρο1, Εην и ΝοΓ, где присутствует по меньшей мере 75%, либо по меньшей мере 90%, либо по меньшей мере 95%, например 96%, СТЬ эпитопов этих нативных антигенов.

В лиофилизированных композициях, содержащих иммуногенные полипептиды, которые включают р17/р24 Сад, р66 ВТ и укороченный ΝοΓ, как определено выше, подходящим образом присутствует 96% СТЬ эпитопов нативных антигенов Сад, Ρο1 и ΝοΓ.

- 9 018201

В одном воплощении изобретения предложена лиофилизированная композиция, содержащая лиганд ТЬВ9 и иммуногенный полипептид, содержащий р17, р24 Сад, р66 ВТ, укороченный ΝοΓ (без нуклеотидов, кодирующих концевые аминокислоты 1-85 - ϊγΝθΓ) в порядке Сад, ВТ, ΝθΓ.

Конкретные полинуклеотидные конструкции и соответствующие полипептидные антигены для применения в лиофилизированных композициях согласно изобретению включают:

1) р17, р24 (оптимизированный по кодонам)Сад - р66 ВТ (оптимизированный по кодонам) - укороченный ΝθΓ;

2) укороченный ΝθΓ - р66 ВТ (оптимизированный по кодонам) - р17, р24 (оптимизированный по кодонам) Сад;

3) укороченный ΝθΓ - р17, р24 (оптимизированный по кодонам) Сад - р66 ВТ (оптимизированный по кодонам);

4) р66 ВТ (оптимизированный по кодонам) - р17, р24 (оптимизированный по кодонам) Сад - укороченный ΝθΓ;

5) р66 ВТ (оптимизированный по кодонам) - укороченный ΝθΓ - р17, р24 (оптимизированный по кодонам) Сад;

6) р17, р24 (оптимизированный по кодонам) Сад - укороченный ΝθΓ - р66 ВТ (оптимизированный по кодонам).

Примерный слитый белок представляет собой слияние Сад, ВТ и ΝθΓ, в частности в порядке СадВТ-ΝθΓ (см., например, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 8 или 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 9). Другой примерный слитый белок представляет собой слияние р17, р24, ВТ и ΝθΓ, в частности в порядке ρ24-ВТ-NеΓ-ρ17. Этот слитый белок назван Р4 и описан в \УО 2006/013106. Р4 является предпочтительным примером антигена ВИЧ, который может находиться в лиофилизированной композиции по изобретению. Нуклеотидная последовательность Р4 приведена в 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 10, где последовательность р24 выделена жирным шрифтом, последовательность ΝθΓ подчеркнута, а прямоугольники представляют собой нуклеотиды, введенные генетическим конструированием. Аминокислотная последовательность Р4 приведена в 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 11, где последовательность Р24: аминокислоты 1-232 (жирным шрифтом);

последовательность ВТ: аминокислоты 235-795;

последовательность ΝθΓ: аминокислоты 798-1002;

последовательность Р17: аминокислоты 1005-1136; прямоугольники: аминокислоты, введенные генетическим конструированием;

К (Лизин): вместо триптофана (V). Мутация введена для удаления активности фермента.

В другом воплощении лиофилизированная композиция содержит Сад, ВТ, интегразу и ΝθΓ, в частности в порядке Сад-ВТ-интергаза-ΝθΓ (см., например, ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ: 11).

В других воплощениях антиген ВИЧ может представлять собой слитый полипептид, который содержит ΝθΓ, или его иммуногенное производное, или его иммуногенный фрагмент и р17 Сад и/или р24 Сад, или их иммуногенные производные, или их иммуногенные фрагменты, где, когда присутствуют оба р17 и р24 Сад, между ними находится по меньшей мере один ВИЧ или его иммуногенный фрагмент.

Например, ΝθΓ подходящим образом представляет собой полноразмерный ΝθΓ.

Например, р17 Сад и р24 Сад подходящим образом представляют собой полноразмерные р17 и р24, соответственно.

В одном воплощении лиофилизированная композиция содержит иммуногенный полипептид, включающий оба р17 и р24 Сад или их иммуногенные фрагменты. В такой конструкции компонент р24 Сад и компонент р17 Сад разделены по меньшей мере одним дополнительным антигеном ВИЧ или его иммуногенным фрагментом, таким как ΝθΓ и/или ВТ или их иммуногенные производные или их иммуногенные фрагменты. Дополнительные подробности см. в νΟ 2006/013106.

В слитых белках, которые содержат р24 и ВТ, может быть предпочтительным, чтобы р24 предшествовал ВТ в конструкции, поскольку, когда антигены экспрессируются отдельно в Е.со1г, наблюдают лучшую экспрессию р24, чем ВТ.

Некоторые конструкции для применения в лиофилизированных композициях согласно изобретению, включают приведенные ниже:

1. р24-ВТ-NеΓ-р17;

2. р24-ВТ*-NеΓ-р17;

3. р24-р51ВТ-№Р-р17;

4. р24-р51ВТ*-№Р-р17;

5. р17-р51ВТ-Ке£;

6. р17-р51ВТ*-NеΓ;

7. №Р-р17;

8. №Р-р17 с линкером;

9. р17-№Е

10. р17-NеΓ с линкером.

* представляет собой мутацию ВТ метионин₅₉₂ на лизин.

В другом аспекте в настоящем изобретении предложена лиофилизированная композиция, содержа

- 10 018201 щая слитый белок антигенов ВИЧ, содержащий по меньшей мере четыре антигена ВИЧ или их иммуногенных фрагмента, где эти четыре антигена или фрагмента представляют собой №Г, Ро1 и Сад или их производные. Предпочтительно Сад присутствует в виде двух отдельных компонентов, которые разделены по меньшей мере одним другим антигеном в слитом белке. Предпочтительно №Г представляет собой полноразмерный №Г. Предпочтительно Ро1 представляет собой р66 или ρ51ΒΤ. Предпочтительно Сад представляет собой р17 и р24 Сад. Другие предпочтительные признаки и свойства антигенных компонентов слитого белка в данном аспекте изобретения являются такими, как описано ниже.

Предпочтительными воплощениями данного аспекта являются четырехкомпонентные слияния, как уже перечислено выше.

1. ρ24-ΚΤ-№Γ-ρ17;

2. ρ24-ΒΤ*-№Γ-ρ17;

3. ρ24-ρ51ΒΤ-Νβί-ρ17;

4. ρ24-ρ51ΒΤ*-№Γ-ρ17.

Иммуногенные полипептиды, применяемые в лиофилизированной композиции по настоящему изобретению, могут иметь линкерные последовательности, присутствующие между последовательностями, соответствующими конкретным антигенам, таким как Сад, ВТ и ΝοΓ. Такие линкерные последовательности могут составлять, например, вплоть до 20 аминокислот в длину. В конкретном примере они могут составлять от 1 до 10 аминокислот или от 1 до 6 аминокислот, например 4-6 аминокислот.

Дополнительное описание таких подходящих антигенов ВИЧ можно найти в νθ 03/025003.

Антигены ВИЧ для применения в настоящем изобретении могут иметь происхождение от любой филогенетической ветви ВИЧ, например филогенетической ветви А, филогенетической ветви В или филогенетической ветви С. Например, антигены ВИЧ могут иметь происхождение от филогенетической ветви А или В, в частности В.

В одном конкретном воплощении изобретения лиофилизированная композиция содержит более чем один иммуногенный полипептид. В одном аспекте данного воплощения первый иммуногенный полипептид представляет собой полипептид, включающий Сад и/или Ро1 и/или №Г или фрагмент или производное любого из них (например, ρ24-ΒΤ-№Γ-ρ17). В одном конкретном аспекте данного воплощения изобретения второй иммуногенный полипептид представляет собой полипептид, включающий Сад и/или Ро1 и/или ΝοΓ или фрагмент или производное любого из них (например, Сад-ΒΤ-ΝβΓ или Сад-ΒΤинтеграза-ЫеГ).

Таким образом, в одном конкретном воплощении полипептид, включающий Саρ и/или Ро1 и/или №Г или фрагмент или производное любого из них (например, ρ24-ΒΤ-№Γ-ρ17), представляет собой первый иммуногенный полипептид, а полипептид, включающий Сад и/или Ро1 и/или №Г или фрагмент или производное любого из них (например, Сад-КЛ-№Г или Сад-ВΤ-интеграза-NеΓ), представляет собой второй иммуногенный полипептид.

В другом конкретном воплощении изобретения первый иммуногенный полипептид представляет собой Εην или его фрагмент или производное, например, дρ120, дρ140 или дρ160 (в частности, дρ120). В одном конкретном воплощении изобретения второй иммуногенный полипептид представляет собой полипептид, включающий Сад и/или Ро1 и/или №Г или фрагмент или производное любого из них (например, ρ24-ΒΤ-№Γ-ρ17).

Таким образом, в одном конкретном воплощении Εην или его фрагмент или производное, например дρ120, дρ140 или дρ160 (в частности, дρ120) представляет собой первый иммуногенный полипептид, а полипептид, включающий Сад и/или Ро1 и/или №Г или фрагмент или производное любого из них (например, ρ24-ΒΤ-№Γ-ρ17), представляет собой второй иммуногенный полипептид.

В другом конкретном воплощении изобретения первый иммуногенный полипептид представляет собой полипептид, включающий Сад и/или Ро1 и/или №Г или фрагмент или производное любого из них (например, ρ24-ΒΤ-№Γ-ρ17). В одном конкретном воплощении изобретения второй иммуногенный полипептид представляет собой Εην или его фрагмент или производное, например дρ120, дρ140 или дρ160 (в частности, дρ120).

Таким образом, в одном конкретном воплощении полипептид, включающий Сад и/или Ро1 и/или №Г или фрагмент или производное любого из них (например, ρ24-ΒΤ-№Γ-ρ17), представляет собой первый иммуногенный полипептид, а Εην или его фрагмент или производное, например дρ120, дρ140 или дρ160 (в частности, дρ120), представляет собой второй иммуногенный полипептид.

Лиофилизированная композиция может содержать один антиген или может содержать более чем один антиген.

В одном аспекте изобретения лиганд ΤΕΒ9 используют для улучшения растворимости антигенов, которые не являются положительно заряженными. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что, в частности, с антигенами, которые заряжены отрицательно, совместная лиофилизация Сρд может улучшить их растворимость при разведении. Когда лиганд ΤΕΒ9 является иммуностимулирующим олигонуклеотидом, антиген представляет собой молекулу с суммарным отрицательным зарядом. Когда этот лиганд лиофилизируют совместно с антигеном с суммарным положительным зарядом, существует возможность, что лиганд ΤΕΒ9 будет взаимодействовать с антигеном при разведении лиофилизированной ком

- 11 018201 позиции, возможно, вызывая осаждение антигена. Это нежелательно, но специалист в данной области техники может избежать этого путем включения вместе с композицией для лиофилизации эксципиентов, которые известны как повышающие растворимость в таких ситуациях, такие как, например, Ь-аргинин.

Лиганд ТЬК9 и один или более чем один антиген объединяют с подходящими эксципиентами с образованием конечной массы препарата, который должен быть лиофилизирован. Оптимально эксципиенты будут содержать криозащитный агент для защиты белка от денатурации на ранних стадиях лиофилизации и защитный агент лиофилизации для предотвращения инактивации белка в процессе сушки. Могут быть использованы две различные молекулы, либо может быть использована одна молекула, которая обладает обоими свойствами, такая как дисахарид. Возможно, также можно добавлять кристаллический наполнитель, такой как маннит или глицин. Неионное поверхностно-активное вещество, такое как полисорбат или Тгееп®, может также быть добавлено, чтобы способствовать предотвращению агрегации белка. Эксципиенты могут также включать буферные соли для изменения рН конечной массы препарата.

Подходящие эксципиенты включают следующие: сахара, такие как сахароза, трегалоза, рафиноза, и мальтодекстрины, такие как мальтотриоза, мальтотетраоза, мальтопентаоза или мальтогексаоза; полиолы, такие как маннит или сорбит; полимеры, такие как декстран, полиэтиленгликоль (ПЭГ) или поливинилпирролидон (ПВП); аминокислоты, такие как глицин, аланин или аргинин.

Эксципиенты можно также объединять, так чтобы два или более чем два, например три или четыре эксципиента можно было использовать вместе. Возможные комбинации включают сахар и декстран, например сахарозу и декстран или трегалозу и декстран; сахар и ПЭГ, например ПЭГ 8000 и сахариды; сахар и ПВП, например сахарозу и ПВП; сахар и аминокислоты, например глицин и сахарозу; два сахара вместе, например сахарозу и глюкозу или сахарозу и рафинозу; сахарозу и полиолы, например сахарозу и сорбит или сахарозу и маннит; полиолы и аминокислоты, такие как маннит и глицин.

Поверхностно-активные вещества, такие как полисорбат или Т\\ееп®. могут быть добавлены к любой комбинации эксципиентов.

В целях образования иммуногенной композиции, которая может быть использована для вакцинации, лиофилизированную композицию, содержащую антиген и лиганд ТЬК9, разводят фармацевтически приемлемым разбавителем. Предпочтительный аспект изобретения состоит в том, что такой разбавитель должен представлять собой разбавитель в форме частиц, например раствор частиц соли металла или липосом, либо эмульсию масло-в-воде.

В одном воплощении разбавитель содержит дополнительные иммуностимуляторы. Это означает, что конечная разведенная иммуногенная композиция содержит другие иммуностимуляторы в дополнение к лиганду ТЬК9, находящемуся в лиофилизированной композиции.

Существует ряд известных иммуностимуляторов, которые известны как адъюванты либо отдельно, либо в комбинации. Врожденная или природная иммунная система распознает широкий спектр патогенов без необходимости в предварительном воздействии. Основные клетки, ответственные за врожденный иммунитет, моноциты/макрофаги и нейтрофилы, фагоцитируют патогены микроорганизмов и запускают врожденный, воспалительный и специфический иммунные ответы.

Липополисахариды (ЛПС) являются основной поверхностной молекулой внешней поверхности наружной мембраны грамотрицательных бактерий и встречаются исключительно в нем. Показано, что ЛПС являются лигандами ТЬК4. ЛПС затрудняют разрушение бактерий сывороточными комплементами и фагоцитарными клетками и вовлечены в адгезию для колонизации. ЛПС представляют собой группу структурно родственных комплексных молекул размером приблизительно 10000 Дальтон (Да) и состоят из трех ковалентно сшитых участков:

(1) О-специфичная олигосахаридная цепь (О-антиген) в наружном участке;

(2) коровый олигосахаридный центральный участок;

(3) липид А - самый дальний внутренний участок, который служит в качестве гидрофобного якоря, он содержит дисахаридные звенья глюкозамина, которые несут длинноцепочечные жирные кислоты.

Показано, что биологические активности ЛПС, такие как летальная токсичность, пирогенность и адъювантные свойства, связаны с группировкой липида А. Напротив, иммуногенность ассоциирована с О-специфичным полисахаридным компонентом (О-антигеном). Давно известно, что как ЛПС, так и липид А обладают сильными адъювантными эффектами, но высокая токсичность этих молекул исключила их применение в вакцинных препаратах. Следовательно, предприняты значительные усилия в направлении снижения токсичности ЛПС и липида А при сохранении их адъювантных свойств.

Мутант 8а1топе11а ш1пие8О1а К595 был выделен в 1966 году из культуры исходного (8шоо1й) штамма (Бибегб/ е! а1. 1966, Апп. N. Υ. Асаб. 8с1. 133: 349-374). Был проведен скрининг отобранных колоний на их чувствительность к лизису панелью фагов, и только те колонии, которые проявляли узкий диапазон чувствительности (чувствительные только к одному или двум фагам), были отобраны для дальнейшего исследования. Эти усилия привели к выделению мутантного штамма беер гоидй, который является дефектным по биосинтезу ЛПС, и он был назван 8. Ш1ипе8о1а К595.

По сравнению с другими ЛПС, продуцируемые мутантом 8. тшпеюШ К595, имеют относительно простую структуру.

- 12 018201 (1) они не содержат О-специфичный участок - характерный признак, ответственный за сдвиг от фенотипа дикого типа втоо111 к мутантному фенотипу гоидй, и приводит в результате к потере вирулентности;

(2) коровый участок очень короткий - этот характерный признак повышает чувствительность штамма к ряду химических веществ;

(3) группировка липида А в высокой степени ацилирована жирными кислотами в количестве вплоть до 7.

4'-Монофосфориллипид А (МРЬ), который может быть получен кислотным гидролизом ЛПС, экстрагированного из мутантного штамма беер гоидй грамотрицательных бактерий, сохраняет адъювантные свойства ЛПС, демонстрируя при этом токсичность, которая снижена более чем в 1000 раз (как измерено на основании летальной дозы на эмбрионах куриных яиц) (Лойпвоп с1 а1., 1987, Рсу. 1пГсс1. Όιβ. 9 8ирр1: 8512-8516). ЛПС обычно кипятят с обратным холодильником в растворах минеральных кислот средней силы (например, 0,1 М НС1) в течение периода приблизительно 30 мин. Этот процесс приводит в результате к дефосфорилированию в положении 1 и декарбогидрированию в положении 6' с получением МРЬ.

3-О-деацилированный монофосфориллипид А (3Э-МРЬ), который может быть получен путем мягкого щелочного гидролиза МРЬ, обладает еще более сниженной токсичностью, при этом, опять же, сохраняя адъювантные свойства, см. И8 4912094 (К1Ы 1ттипос11ет1са1в). Щелочной гидролиз обычно проводят в органическом растворителе, таком как смесь хлороформ/метанол, путем насыщения водным раствором слабого основания, таким как 0,5 М карбонат натрия, при рН 10,5.

Дополнительная информация по получению 3Э-МРЬ имеется, например, в И8 4912094 и \УО 02/078637 (Сойха Согрогайои).

Показано, что некоторые молекулы, которые не являются лигандами ТЬВ, обладают адъювантной активностью. Сапонины килайи (ОиП1а|а) представляют собой смесь тритерпеновых гликозидов, экстрагированных из коры дерева Ош11а)а вароиала. Неочищенные сапонины широко применяли в качестве ветеринарных адъювантов. Οιιίΐ-Λ представляет собой частично очищенный водный экстракт вещества сапонинов килайи. 0821 представляет собой очищенную высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) нетоксичную фракцию Οιιίΐ А, и этот способ ее получения (как ΟΛ21) раскрыт в патенте США № 5057540.

В одном аспекте изобретения разбавитель содержит один дополнительный иммуностимулятор. В другом аспекте изобретения разбавитель содержит более чем один дополнительный иммуностимулятор. Такие иммуностимуляторы могут представлять собой лиганды ТЬВ4, сапонины, лиганды ТЬК.7, лиганды ТЬК.8 или лиганды ТЬК.9. В одном воплощении изобретения дополнительный иммуностимулятор представляет собой лиганд ТЬВ4, такой как 3О-МРЬ, как описано здесь. В еще одном воплощении изобретения дополнительный иммуностимулятор представляет собой 0821. как описано здесь. В еще одном воплощении изобретения разбавитель содержит 0821 и 3О-МРЬ. В одном аспекте данного воплощения разбавитель представляет собой эмульсию масло-в-воде, содержащую 0821 и 3О-МРЬ. В другом аспекте данного воплощения разбавитель представляет собой раствор липосом, содержащий 0821 и 3О-МРЬ.

Далее изобретение будет описано дополнительно со ссылкой на приведенные ниже не ограничивающие примеры.

Примеры

Пример 1. Сублимационная сушка СрО-олигонуклеотида и СРС-Р5018 в качестве антигена

Используемый антиген представлял собой СРС-Р5018. Этот антиген показан на фиг. 1 в виде диаграммы, на которой часть, показывающая ТМ2-ТМ12, представляет собой антиген Р5018; овальные формы на левой стороне представляют собой партнеры слияния СРС, а гистидиновый (Н1в) хвост показан на правой стороне.

Антиген продуцировали, как показано, с Н1в-хвостом в 8. сегеу1В1ае, а затем доводили до концентрации 700 мкг/мл, используя буфер Трис (5 мМ, рН 7,5) и Твин 80 (0,3%).

Для получения конечной массы препарата сахарозу (35%) добавляли в воду для инъекций до достижения конечной концентрации 6,3%. Затем добавляли Трис (1 М, рН 8,8), а затем Твин 80 (25%) до достижения конечной концентрации 0,2%. Эту смесь перемешивали магнитной мешалкой в течение 5 минт при комнатной температуре. Добавляли СРС-Р5018 и смесь перемешивали магнитной мешалкой в течение 4 мин при комнатной температуре. Затем добавляли СрО-олигонуклеотид с 8ЕО ГО N0: 4 и полученную в результате смесь перемешивали магнитной мешалкой в течение 15 минут при комнатной температуре с получением конечной массы препарата. Композицию анализировали следующим образом:

- 13 018201

	Конечная масса препарата (500 мкл)	Конечный контейнер (500 мкл) Доза для человека
Осадки		После разведения 625 мкл А301В
СРС-Р501	125 мкг	100 мкг
СрС	625 мкг	500 мкг
Трис	50 мМ	40 мМ
Твин 80	0,50 %	0,40 %
Сахароза	6.3%	5,0%
рН	9,1+/-0,1	7,4+/-0,1

	Конечная масса препарата (500 мкл)	Конечный контейнер (500 мкл) Доза для человека
Осадки		После разведения 625 мкл А501Θ
СРС-Р501	25 мкг	20 мкг
СрС	625 мкг	500 мкг
Трис	50 мМ	40 мМ
Твин 80	0,20%	0,16%
Сахароза	6,3%	5,0%
РН	9,1+/-0,1	7,4+/-0,1

0,5 мл композиции заполняли в стеклянный флакон, который подвергали циклу лиофилизации, как показано на фиг. 2.

Характеристику осадка проводили путем визуального осмотра и измерения диаметра при Т0, через 1 неделю, 2 недели, 3 недели и 4 недели при 37°С на трех флаконах композиции (см. фиг. 3). Остаточное содержание влаги измеряли в те же моменты времени и при той же температуре, используя термогравиметрический анализ (ТГ) или анализ по Карлу Фишеру (КФ). Как видно ниже, осадки были стабильны в течение времени вплоть до 2 недель.

Лиофилизированный осадок.

Стабильность во времени	Визуальный аспект	Диаметр осадка (мм)	Содержание влаги (масс.% Н2О/масса осадка)
			КФ	ТГ
то	ок	12,610,1	0,3% (1,5 месяца при 4°С)	0,8% (5 месяцев при 4°С)
1 неделя 37’С	ок	нд	0,59%	нд
2 неделя 37°С	Ретракция +	9,810,8	нд	1,4%
3 недели 37*С	Ретракция ++	7,711,0	нд	1,2%
4 недели 37°С	Ретракция ++	8,711,5	неизмеримо	1,3%

КФ: метод Карла Фишера.

ТГ: Термогравиметрический метод. нд: не делали.

ОК: нет ни агрегации, ни разрушения. Спецификация: 3% (термогравиметрический метод).

Влажность в конечном контейнере, который хранят при 37°С (для ускорения анализа на стабильность), возрастает со временем. Через 1 месяц при 37°С осадки содержат 1,3% Н₂О и подвергаются ретракции. В данном эксперименте возрастание влажности является следствием того факта, что гигроскопичный порошок абсорбирует воду из пробок. Замена пробок новыми типами пробок может способствовать предотвращению такой ретракции.

Затем осадки разводили либо водой для инъекций, либо следующими жидкими носителями: адъювантная система А (липосомный адъювант, приготовленный, как описано в \УО 2005/112991), адъювантная система Е (адъювант в виде эмульсии масло-в-воде, приготовленный, как описано в \УО 2005/112991) или адъювантная система Е (адъювант в виде эмульсии масло-в-воде, приготовленный, как описано в \УО 2005/112991).

Никакой агрегации или разрушения белка не наблюдали с водой для инъекций, адъювантной системой Е или адъювантной системой Е. Некоторую агрегацию и разрушение наблюдали с адъювантной системой А. Был сделан вывод, что это является следствием снижения рН ниже изоэлектрической точки СРС-Р5018. Повышение концентрации эксципиента Трис до 50 мМ решало эту проблему, и затем никакой агрегации не наблюдали с адъювантной системой А. Было также обнаружено, что присутствие СрО в лиофилизированном осадке (т.е. совместная лиофилизация антигена и СрО-олигонуклеотида) способствовало предотвращению агрегации антигена при восстановлении адъювантной системой А. Сравнение разведения лиофилизированных осадков с СрО и без него с использованием адъювантной системы А показало сниженную агрегацию после совместной лиофилизации (данные не показаны).

Влияние эксципиентов на размер липосом в адъювантной системе А было также исследовано и было обнаружено отсутствие различия в размере между липосомами, находящимися во флаконе с адъювантной системой А отдельно, и липосомами, находящимися во флаконе с адъювантной системой А после восстановления лиофилизированного осадка, содержащего антиген, СрО, Трис и Твин. Следовательно, авторы изобретения смогли сделать вывод, что компоненты лиофилизированного осадка не влияют на адъювантную систему (фиг. 4).

Наконец, была исследована антигенность препарата, и было обнаружено, что в отношении лимфо

- 14 018201 пролиферации и продуцирования внутриклеточного цитокина (интерферона-λ, ИФНл) отсутствовало различие между жидким и лиофилизированным препаратом СРС-Р5018 (данные не показаны). Таким образом, авторы изобретения смогли сделать вывод, что на иммуногенность антигена не влияет совместная лиофилизация с СрС.

Пример 2. Сублимационная сушка СрС-олигонуклеотида и Маде-3 в качестве антигена.

Используемый антиген представлял собой часть белка Ό, связанного с МАСЕ-3, который, в свою очередь, был связан с Ηίδ-хвостом для облегчения очистки РЭ-Маде3-Н|5 (см. фиг. 5: 8Еф ΙΌ N0: 13).

Очищенную массу антигена продуцировали с Ηίδ-хвостом в Е.со11, а затем доводили до концентрации 750 мкг/мл, используя буфер NаН₂Ρ0₄·2Н₂0/Κ₂НΡ0₄·2Н₂0 (2 мМ) и Твин 80 приблизительно при 0,2% об./об. (теоретически), рН 7,5.

Для получения конечной массы препарата сахарозу (30%) добавляли в воду для инъекций до получения конечной концентрации 3,15%. Затем добавляли NаН₂Ρ0₄·2Н₂0/Κ₂НΡ0₄·2Н₂0 (100 мМ, рН 7,5) до получения конечной концентрации РО₄ 5 мМ, учитывая фосфат, находящийся в буфере для антигена. Также добавляли Твин 80 (3%) до получения конечной концентрации 0,15%, учитывая Твин, находящийся в буфере для антигена. Эту смесь перемешивали магнитной мешалкой в течение периода времени от 5 до 15 минут при комнатной температуре. Добавляли РО-Маде3-Н|5 (750 мкг/мл) и смесь перемешивали магнитной мешалкой в течение 5-15 мин при комнатной температуре. Затем добавляли СрСолигонуклеотид с 8Еф ΙΌ N0: 4 и полученную в результате смесь перемешивали магнитной мешалкой в течение 15 минут (±5 мин) при комнатной температуре с получением конечной массы препарата. Доводили рН до рН 7,5±0,1, используя №10Н 0,05 М или 0,5 М, либо НС1 0,03 М или 0,3 М.

Композицию анализировали следующим образом.

№	Ингредиенты	Перед лиофилизацией	На Ηϋ (после разведения 0,625 мл разбавителя)
	Название	Компонент	Згс	СС	Масса (на 0,5 мп)		Концентрация	Масса (на 0,5 мл)
1	РЦ-МадеЗН!з	Ν3Η2ΡΟ4.2Η2ΟК2НРО4.ЗН2О 2 мМ/Твин 80 -0,2% об./об. теорет., рН 7,5		750 мкг/мл	375 мкг		600 мкг/мл	300 мкг
2	СрС			ίίδΰ мкг/мл	625 мкг		1000 мкг/мл	500 мкг
3	Сахароза			3,15% масс./об.	15,75 мг		2,52% масс./об.	12,6 мг
4	Твин 80		1	0,15% масс/об.			0,12% масс./об.
5	Р04		1	5мМ			4 мМ
6	ννπ					до 0,5 мл
7	РН					7,5±0,1

0,5 мл этой композиции заполняли в стеклянный флакон, который подвергали циклу лиофилизации, показанному на фиг. 6.

Влияние эксципиентов и цикла сублимационной сушки на состав осадка анализировали через 7-9 суток хранения осадка при 37°С.

Состояние осадка и остаточная влажность.

Состояние осадка	Нет спадения (ТО)	Нет ретракции (Т7 сут. 37'С)
Остаточная влажность		0,59% (Т8 сут. 37’С)

Видно, что осадки не проявляют какого-либо спадения через 7 суток и не меняются на протяжении 8 суток по их стабильности в стрессовой среде.

Остаточная влажность осадков, которые хранят в течение 7-9 суток при 37°С, остается ниже спецификации 3%.

Никакого изменения в диаметре не наблюдали после хранения в течение 7-9 суток при 37°С.

Затем осадки разводили адъювантной системой А (липосомный адъювант, приготовленный как описано в ν0 2005/112991). Никакой агрегации или разрушения белка не наблюдали, подтвердив, таким образом, что антиген можно лиофилизировать совместно с СрС без влияния на его способность к разведению.

Была исследована антигенность препарата. Было обнаружено, что после разведения в адъювантной системе А имело место снижение антигенности со временем после 24 ч. Посчитали, что это являлось следствием кислого рН (6,2±0,1), обнаруженного после разведения. Это подтвердили, когда обнаружили, что падение антигенности было уменьшено при повышении рН. Однако все же имело место некоторое снижение антигенности со временем. Таким образом, эти препараты были протестированы для проверки того, влияет ли это снижение на испытание эффективности ίη νίνο. Разведения 3/10, 1/10 и 1/30 дозы для человека давали группам мышей, 10 мышей на группу, как показано на фиг. 7. У мышей брали кровь на 28 сутки.

- 15 018201

Т0, 4 ч и 24 ч представляют собой периоды времени после разведения осадка адъювантной системой А. Как видно из фиг. 7, никакого влияния на эффективность не было.

Пример 3. Влияние СрО на растворимость антигена после разведения.

1. ^Т1 представляет собой белок, сверхэкспрессия которого впервые обнаружена при раке почки у детей, опухоли Вильмса. В антигене-кандидате, применяемом в настоящем случае, используют почти полноразмерный белок в качестве антигена. Белок \УТ1-А10 представляет собой рекомбинантный слитый белок из 292 аминокислот, экспрессируемый в Е.сой, состоящий из 12-мерной укороченной последовательности 1а1 (лидерной последовательности) и аминокислот 2-281 последовательности \УТ1. После лиофилизации одного этого антигена он осаждается при разведении адъювантной системой А из-за его изоэлектрической точки (5,85-7,5), которая находится близко к рН адъювантной системы А (6,1), и присутствия хлорида натрия в адъювантной системе А.

Готовили два препарата \УТ1-А10. Доза разведенного препарата содержала 400 мкг/мл антигена \УТ1-А10, 10% сахарозу, 100 мМ Трис и 0,2% Твин 80 плюс или минус 840 мкг/мл СрО.

Оба препарата разводили 500 мкл адъювантной системы А. Полученную в результате жидкость центрифугировали и проводили Вестерн-блоттинг на нецентрифугированной жидкости (ИС), супернатанте (8Ν) и осадке (Р). Результаты показаны на фиг. 8.

Как видно из фиг. 8, в присутствии СрО растворимость антигена после разведения улучшается, о чем свидетельствует отсутствие антигена в осадке. Осажденный антиген можно обнаружить в осадке разведенной лиофилизированной композиции, когда лиофилизированный осадок не содержал СрО. Это свидетельствует о том, что в случае антигена, который не является положительно заряженным, совместная лиофилизация с СрО улучшает растворимость антигена при разведении.

2. РЕАМЕ.

Готовили два препарата РЕАМЕ. Доза разведенного препарата содержала 1000 мкг/мл антигена РЕАМЕ, 3,15% сахарозу, 5 мМ борат, 150 нМ хлорид натрия плюс или минус 840 мкг/мл СрО. Оба препарата разводили 500 мкл адъювантной системы А. Полученную в результате жидкость центрифугировали и проводили Вестерн-блоттинг на не центрифугированной жидкости (ИС), супернатанте (8Ν) и осадке (Р). Результаты показаны на фиг. 9, где ИС означает нецентрифугированную жидкость, 8Ν означает супернатант и Р означает осадок.

Как видно из фиг. 9, в присутствии СрО растворимость антигена после разведения улучшается, о чем свидетельствует отсутствие антигена в осадке. Осажденный антиген можно обнаружить в осадке разведенной лиофилизированной композиции, когда лиофилизированный осадок не содержал СрО. Это дополнительно свидетельствует о том, что в случае антигена, который не является положительно заряженным, совместная лиофилизация с СрО улучшает растворимость антигена при разведении.

- 16 018201

ЗЕО Ю N0:1

ТСС АТС АСС ТТС СТС АСС ТТ

ЗЕО Ю N0:2

ТСТ ССС АСС СТС ССС САТ

ЗЕО 10 N0:3

АСС САТ САС СТС ССС ССТ САС ССС АСС АСС

ЗЕО Ю N0:4

ТСС ТСС ТТТ ТСТ ССТ ТТТ СТС СТТ

ЗЕО Ю N0:5

ТСС АТС АСС ТТС СТС АТС СТ

ЗЕО 10 N0:6

ΜΚνΚΕΤΡ.ΚΜΥ ОНЬККИСТИЬ ЬСМЕМЮЗАА ЕОЬНУТУУУС УРУИКЕАТТТ50

ЬГСАЗОАКАУ ОТЕУНМУНАТ НАСУРТОРЫР ОЕУУЪСИУТЕ ΥΓΝΜΝΚΝΝΜν100

ООМНЕОИЗЬ ИООЗЬКРСУК ЪТРЪСУТЮС ЗВУНТТМЗТТ ТТЗЫСНТСЕ!150

ККСЕ1КЫС5Г ΝΙΤΤΒΙΚϋΚν 0ΚΕΥΑ1ΡΎΝ1 ОУУРЮООЫА ΤΤΚΝΚΤΤΚΝΕ200

КЫНСЫЗЗУМ ТОАСРКУЗГЕ Р1Р1НУСАРА ΟΓΑΙΙ,ΚΟΝΝΚ ТЕОСКСЕСТИ250

У5ТУ0СТНС1 КРУУЗТОЬЬЬ ЫСЗЬАЕЕЕУУ ΙΕ30ΝΕΜ0ΝΤ КТИУОЪИЕЗ300 νΑΤΝΟΤΗΡΝΝ ΝΤΡΚΟΙΗΐσΡ СКАГУААКК! ТСОТВОАНСИ Ι.3ΚΆ0ΗΝΝΤΕ350

К01У1К1КЕН ΕΟΝΚΤΙΚΓΝΟ ЗЗСС0РЕ1УК НЗГИСССЕГГ УСОТТОЪЕЫЗ400

ΤΗΝΟΤΕΟΝΝΤ ЕСИЗТ1ТЬРС ΒΙΚϋΙΙΝΜΗΟ ЕУЗКАМУАРР 1СС01ВСЗЗЫ450

1ТСЫЬТКОС СТЕСЫСТЕЫЕ ТЕ1ГВРССС0 ΜΚϋΝΗΚ3ΕΕΥ КУКУУКУЕРЬ500

СУАРТКАККК ννοκ514

ЗЕО 10 N0:7

МКУМЕЮКЫС 0НЫКИС1М1 1СМ111СЗТА ОЫЬИУТУУУС УРУИНИАЕТТ

ЕГСАЗОАКАУ ЗТЕКННУИАТ ΗΑΟνΡΤΟΡΝΡ ΟΕΙΡΙΌΝνΤΕ ЕГММИКМИМУ

101 ООМНЕЭИЗЬ ИООЗЬКРСУО ЬТРЪСУТЬНС ЗИАЯУНАТЕН ЗТЕОНЕСМКЫ

151 СЗГЫМТТЕЬК ОККООУУЗЬГ ΥΗΙιϋΙΕΚΙΝΒ 3ΝΝΝ3ΕΥΚ1>ν ИСЫТЗАГТОА

201 СРКУТЕЕР1Р 1НУСАРАСГА ΙΕΚΟΝΟΤΕΓΝ СТСРСКЫУЗТ У0СТНС1КРУ

251 УЗТОЬЬЬЫСЗ ЕАЕАЕУК1НЗ ΕΝΙΑΝΝΑΚΝΙ 1У0ГАЗРУК1 ΝΟΙΚΡΝΝΝΤΚ

301 КЗУНЮРСОТ ΓΥΑΤΟίνΟϋΙ РОАНСНУЗКТ ОИИЫТЬКЬУА Ν01.ΚΚΥΕ3ΝΚ

351 ТИЕТЫЗЗСС ΟβΕΙΤΤΗ3ΕΝ СССЕЕЕУСНТ 3ΟΕΕΝ3ΤΝΤΤ ΝΝΜ0Ε3ΝΟΤ3

401 ЫСТ1ТЬРСН1 К0ИНМИ0КУ ΕΟΑΜΥΑΡΡΙΕ СУ1НСЕЗЫ1Т СЬТЬТКОССИ

451 ΝΝ3ΑΝΕΤΓΒΡ СССМКОИИК ЗЕЕУКУКУУК 1ЕРЪСУАРТН АКНВУУЕВЕК

501 РАУС1САУРЬ 6ЕЕСААСЗТМ САА31ТЕТУ0 АКООЬЗС1УО ООЗЫЬЬКАГЕ

551 АОООЫКЬТУ НС1КОЬОАРУ ЬАУЕКУЕКРО 0ЫС1ИССЗС ΚΙΙΟΤΤΝνΡΝ

601 Ν33Ν3ΝΚ3Υϋ ОхИОНМТИЕО ΝϋΚΕΙΒΝΥΤϋ 11УЗЫЕЕЗО Ν00ΕΚΝΕ001

651 ЬЛЮКНАНЕИ ΝΗΓ0Ι3ΚΝΙ,Η ΥΪΚδ

ЗЕО Ю N0:8

МСАКАЗУЬЗС СЕЮКИЕК1К ЬКРССКККУК ЬКШУИАЗКЕ ЬЕКЕАУИРСЬ 51 1ЕТЗЕССК01 ЬСОЬОРЗЮТ СЗЕЕЬВЗЪУМ ТУАТЬУСУНО ΗΙΕΙΚϋΤΚΕΑ 101 ЬОКТЕЕЕОИК 3ΚΚΚΑ00ΑΑΑ ОТСНЗЫОУЗО ΝΥΡίνβΝΙΟΟ ОМУНОА13РН 151 ТЕЫАИУКУУЕ ЕКАГЗРЕУ1Р МЕЗАЬЗЕСАТ РС'ОЬМТМЬИТ УССНОААМОМ 201 ΕΚΕΤΙΝΕΕΑΑ, ЕИОНУНРУНА СР1АРС0МНЕ ΡΡ.650Ι Α6ΊΤ ЗТЬОЕОЮИМ 251 ΤΝΝΡΡГРУЗЕ ТУКВИНЬСО ΝΚΐνΒΜΥ3ΡΤ 3Ι1ΌΙΗ0αΡΚ ΕΡΓΚΟΥνϋΚΡ 301 ΪΚΤ1ΚΑΕ0Α3 ОЕУКЫИМТЕТ ΙΙΛ'ΟΝΑΝΡϋΟ КТ11ЖАЕСРА АТЕЕЕММТАС 351 ОЗУССРОНКА НУЫ4СР13Р1 ЕТУРУКЪКРС МОСРКУКОИР ЬТЕЕК1КАЕУ 401 Е1СТЕМЕКЕС ΚΙ5ΚΙ0ΡΕΝΡ ΥΝΤΡνΓΑΙΚΚ КОЗТКНККЬУ ОГКЕЬЫККТО

- 17 018201

51

501

551

601

651

701

751

801

851

901

951

1001

1051

ОЕИЕУОЬ61Р ΝΝΕΤΡΟΙΗΥζ) ОЬТУСЗОЬЕ1 ΡϋΚΗΤνΟΡίν ТКАЬТЕУХРЬ ΟΜΤΥΟΙΥΰΕΡ ГРКЕКЬРГОК бАЕТГУУЕКА ЬаОЗСЬЕУЫ! УРАНКСЮСЫ ЕЬКЕКСбЬЕС; БИСУКЬУРУЕ АЕННУАКЕЬН

НРАСЪККККЗ ΥΝνίΡοοΗκα ΕβΗΕΤΚΙΕΕΙι ЬРЕКОЗИТУИ ТЕЕАЕЬЕЬАЕ ГКШКТСКУА ΕΤΜΕΤΗΗΤΕΥ АЫЕЕТКЬЙКА УТОЗОУАЬС1 ЕОУОКЬУЗАС ЫК30КН0О1 РОКУЕЕАВК& ΡΕΥΕΚΝ0

УТУЮУСОАУ 5ΡΑΙΕ0Ξ3ΜΤ ЕОНЫЕИСЬТ МОКБУОКЬН ΝΕΕϋΚΕΡνΗ ΚΜΗΟΑΗΤΝϋν КОАТИIРЕКЕ суутыеоеок ЮАОР&ЗЗЕЗ 1ЕКУ1МУСГР ьоьыг/нтос; ЕЫТЗЫНРУЗ

ЕЗУРЮЕОЕН КИЕРЕККОЫ ΤΡϋΚΚΗΟΚΕΡ ΗΑ30ΐγραικ 3νΥΥΟΡ5ΚΕ1 КОЬТЕАУОК! ГУКТРРЪУКЬ ννΤΙΤΟΤΤΝΟ ЕГЛПОИЕОЬ УТРОУРЬЕРМ ΥΕΡΟΗΟΝΥΤΡ ΙΗΟΜΒΟΡΕΚΞ

ΚΥΤΑΓΤΙΡ5Ι ΡΡίνΐΥΟΥΜϋ РЕЕКМСУЕЬН УЕОЬСКЬЬЕС ΐΑΕίοκοοοσ ТТЕ51У1НОК ΗΥΟΙ,ΕΚΕΡίν КТЕЫЭАТГЬА ΙΚΚΕΚνΥΙΛΗ ТУКААУВЬЗН ορανκγριτρ УЬЕИВЕОЗКЪ

ЗЕО Ю N0:9 аЕддЪЕаЕсдЪдсадаасаЕссаддддсаааЕддЬаеаЕсаддссаЕаЬсассЕадаасЕЫаааЬдсаЕддд ЕаааадбадЬадаададааддсЕЫеадсссадаадЕааЪасесаЬдВЕЕЕсадсаЕкаЬсадааддадссас сссасаадаЫЬаааеассаЬдсЪааасасадЕддддддасаЕааадсадссаЪдсааа^дСЬаааададасс аЬсааЪдаддаадсЕдсадааЪдддаЬададЕасаЬссадЪдса'ЬдсадддссЬаЬЪдсассаддссадаЬда дадаассааддддаад£даса£адсаддаасЕасЪад^,ЬасссЁЬсаддаасаааЪаддаЪдда(дасаааЬаа ЕссассЕаЪсссадЪаддадаааНЕаЪаааадаЕддаЬаабссЪдддаЪЕаааЬааааеадЪаадааЬдЕаЕ адсссЪассадсаЬЬсЬддасаЪаадасааддассаааадаассЬиЬададасЪа'ЪдЬадассддЬЬсЬаЪа ааасЪаЪаададасдадсаадсЫсасаддаддЪааааааЪЬддаЬдасадааассЬ^дЬеддессааааедс даасссадаИдЪаадасЪаЪЫЛаааадсаЫдддасаадсддсЪасасЕадаадаааЪдаЪдасадсаЪдг садддадЬаддаддасссддссаЬааддсаададЫ;Ы:д|саЕаЕд|ддссссаЕЕадсссЕаЕЕдадасЕдЕдЕ садЕааааСЕааадссаддааЕддаЕддсссаааадЕЕааасааЬддссаЬЕдасадаадааааааЕаааадс аЕЕадЕадаааЕЕЕдЬасададаЕддааааддаадддааааЕ1ЕсаааааЕЕдддссЕ.дааааЕссаЕасаа(: асЕссадЕаЕСЕдссаЕааадаааааадасадЕасЕаааЬддадааааЕЕадЕадаЕЕЕсададаасЕЕааЬа ададаасЕсаадасЕ ЕсЕдддаадЕЕсааЕЕаддааЕассасаЕсссдсадддЬЕаааааадааааааЕсадЕ аасадЕасЕддаЕдЕдддЕдаЕдсаЕаЕЕеЕЕсадЕЕсссСЕадаЕдаадасПЕсаддаааСаЕасЕдсаЕЕ»: ассаЕассЕадЕаЕааасааЬдадасассадддаЕЕадаЕаЕсадЕасааЕдЕдеСЕссасадддаЕддааад даЕсассадсааЬаЕЕссааадЕадсаЕдасаааааЁс'ЕЪададссЪССЕадаааасааааЕссадасаЬадЬ ЕаЕсЕаЕсааЕасаЬддаЕдаЕСЕдЕаЕдГаддаЕсЕдасЕЕадаааЕадддсадсаЬадаасаааааЕадад дадсЕдадасаасаСсСдСЕдаддСддддасЕЕассасассадасаааааасаСсадааадаассЕссаГЕсс (ЛааааСддди1аедаасесса£сссда(:ааасддасадиасадссЬа1ад1.дс£дс:садааааадасадсСд дас! дЕсааЕдасаЕасадаадЬ ЕадЕддддаааЕЕдааЕЕдддсаадЬсадаЫЬасссадддаЕЬааадЕа аддсаа(ЕаЕдЕааасЕссЕ1:ададдаассааадсасСаасадаад1аа(:ассасЕаасадаадаадсададс ЕадаасЕддсадаааасадададаЕЕсЕаааадаассадЕасаЕддадЕдЕаЫаСдасссаЕсаааадасЕЕ ааЕадсадаааЕасадаадсаддддсааддссааЬддасаЕаЕсаааЕЕЕаЕсаададссаЕСЕаааааЕсЕд аааасаддааааЕаСдсаадааЕдаддддЬдсссасасЕааЕдаЬдЕаааасааЬЬаасададдсадЬдсааа аааЕаассасадааадсаЕадкааЕаЕддддааадасЕссЕаааЕЕЕааасЕдсссаЕасааааддааасаЕд ддааасаЕддЕддасададЕаЕЕддсаадссассЕддаЕЕссЕдадЕдддадЕЕЕдЫааЕассссессЕЕСа дЕдаааСЕаЕддЕассадЬЕададааадаасссаЬадЕаддадсадааассЬЬсЕаЕдЕадаЕддддсадсЕа асадддадасЕаааЕЕаддаааадсаддаЕаЕдЕЕасЕааЕададдаадасааааадСЕдЬсасссЕаасЕда сасаасаааЕсадаадасЕдадЕЕасаадсааЕЕЕаЕсЕадсЕЕЕдсаддаЕ1сдддаЕЕадаадЕааасаЕа дсаасадасЕсасааЕаЕдсаЕЕаддааЕсаЕЕсаадсасаассада^сааадЕдааЕсададгСадЬсааЬс аааЕааЕададсадЕЕааЕааааааддааааддЕсЕаЕсЕддсаЕдддьассадсасасаааддааЬЕддадд аааЕдаасаадЬадаЕаааЕЕадЕсадЬдсЕддааЕсаддааадЕдсЕа|дсЕаЕд|ддЕддсаадЕддЕсаааа адЕадЕдЕддСЕддаСддссЕасЕдЬаадддааадааЕдадасдадсЕдадссадсадсадаЕддддЕдддад садсаСсЕсдадассЕддааааасаЕддадсааЬсасаадЬадсааЕасадсадсЕассааЕдсЕдсЕЕдЕдс седдсЕадаадсасаададдаддаддаддЬдддЕЕЕЕссадЕсасассЕсаддЕассЫЬаадассааС дас! ЬасааддсадсЬдЕадаесЬЕадссасЕЬЬЕЕаааадааааддддддасЬддаадддсЕааЕЕсасЕсссаас даадасаадаЕаЕссЕЕдабсЕдЕддаЕсЕассасаеасааддсЕасЬЕсссЕдаЬЕддсадаасЕасасасс адддссаддддЕсадаЬаЕссасЕдассЕЕЕддаЕддЕдсЕасаадсСадЕассадЬЕдадссадаЕааддЕа даададдссааЕаааддададаасассадсеедеЕасасссСдЕдадссЕдсаеддааЬддаЬдасссЬдада дадаадЕдЕСададСддаддЕЕЕдасадссдссЬадсаЕЕЕсаЕсасдЕддсссдададсЕдсаессддадьа сЕЕсаадаасСдфддссдаЕдддЕдсдададсдЕеадеаСЕаадсдддддадааЕЬадаЕсдаЬдддааааа аЕЕсддЫааддссадддддааадааааааЕаЕаааЕЕаааасаЕаЕадЬаЬдддсаадсадддадсЕадаас даЕЕсдсадЬЕааЕссЕддссЕдЕЕадааасаЕсадааддсЕдЕадасаааЬасЬдддасадсЬасаассаЕс

- 18 018201 ссеьсадасаддабсадаадаасИ'ЬадаесаеьаЬаНаа'басад'ЬадсаасссИсбабьдСдУдсаСсааадд абададабаааадасассааддаадсСНЬадасаадагададдаададсаааасаааадСаадаааааадсас адсаадсадсадсбдасасаддасасадсааСсаддбсадссааааееасгаа

ЗЕО 10 N0:10

МУ1У0Н1СС0МУНСА13РНТ1ЛАНУКУУЕЁКАГЗРЕУ1РМЕЗА1.3ЕСЛТР ΟΟΕΝΙΗΕΜΤνββΗΟΜΜαΜΕΚΒΤΙΝΕΕΑΑΕΗΟΗνΗΡνΗΑβΡΙΑΡβΟΜΚΕΡ Κ63ΟΙΜΐΤΤ3ΤΙ>0Ε0ΙΟΗΜΤΗΝΡΡΙΡνεΕ1ΪΚΚ>ΠΙΙ>&1ΝΚΐνΒΜΥ8ΡΤ3 1Ш1НЗСИСЕРГЕЮХ7В11Е?К1ЫШ20АЗдаУКНЯМТЕ11ХУОН»1Р1ХЖ Т1ИСАЬСРАЛТ1Л:И®»ТАС0СУСе₽СШИЖИ@ЗР15₽1ЕТУЗУКЬКРа МОСРКУК0ИРЬТЕЕК1КАЬУЕ1€ТЕМЕКЕСК13К1СРЕ№УКТРУЕА1КК ΚΟεΤΚΗΗΚΙ,νΟΓΒΕΙ,ΝΚΒΤΟΟΓΗΕνΟΙ,ΟΙΡΗΡΑΟΙ,ΚΚΚΚΞντνΕΟνΟΟΑΥ ГЗУРЮЕ ΟΓΚΚΥΤΑΓΤI РЗ 1НМЕТРСI ΚΥΟΪΝνΕΡΟΟΗΚΟΞΡΑΙ РОЗ ЗИТ ΚΙΕΕΡ ΡΕΚΟΝΡΟIVIУОУМООЬУ753 О ЕЕ 1СОНЕТК1ЕЕЬРОНЪЬР.И5ЬТ ТР0ККН0КЕРРГЬ|МСУЕЪНР0КНТУ0Р1УЬРЕК05НТУМ010КЬУ5КЬК НА301УРС1КУК0ЬСКЬЬНСТКАЬТЕУ1РЬТЕЕАЕЬЕЬАЕННЕ1Ы<ЕРУН СУУУОР5КОЫАЕ10К06050ИТ¥01 ΥαΕΡΓΚΝΕΚΤεΚΥΑΒΜΕΟΑΗΤΝΟν К0ЫЕА70КIТТЕЗIVIН5КТ РКГК1ΡΙΟΚΕΤΗΕΤΗΜΤΕΥΗΟΑΓΜΙ РЕНЕ РУНТРРЬУКЬНУОЬЕКЕРХУСАЕТГУУОеААНКЕТКЬвКАСУУТМКСКОК ТУТЬТОТТЫОКТЕЬОА IУЬАЬООЗСЪЕ’Л!IУТОЗО ΥΑ15ΙПАЗ ΡΌ03Ε 3 ЕЬта<Э11ЕОШККЕКУУЬАНУРАНКО166ΝΕ0νϋΚΙ№ Α5Ι

ΗΞ КЗ 3775И РТ νΚΕΚΜΚΗΑΕ РААБС УСААЗ К Ш ЕКНС АIТ 3 5ΝΤ ΑΑΓΝ АА САНЬЕАОЕЕЕЕУСГРУТРОУРШРМТУКААУОЪЗНГЬКЕКССЬЕ(ЗЪ1НЗО ΕΕΏΟΙЬОЬНIΪΗΤΟΟΥΕΡΟΗΟΝΪΤ РСРСУВУ РЪТРСЯСУКЪУРУЕРОКУЕ ЕАЫКСЕНТЗЬЬНРУЗЕНСМООРЕКЕУЬЕНВЕОЗАЬАРННУАКЕЬНРЕУГК НС^МСАКАЗУЬ336ЕЬ0ЕИЕК1КЬКРС6КККУКЬКН1™аЗНЕЬЕКГАУ ΝΡ01ΕΕΊ ЗЕ6СВ01ЬЗСЦ10РЗ ЬОТСЗ ΕΕΕΚ3 Ь УЫТУАТ Ь‘ГС7Н0В.1 ΕΙΚΟ ΤΚΕ АЬЕКI ΕΕΞ0ΝΚ3ΚΚΚΑ00ΑΑΑϋΤ3Η3Ν0 7301«

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

950 1000 1050 1100 1136

5Е0 10

101

151

201

251

301

351 -О 01 451 501 551

601

651 ?01

751

801

851

901

951 1001 1051 1101 1151 1201 1251 1301 1351 1401

N0:11

МААКА31Ъ5а ЪЕТТЕЗСООГ 1ДЭКГЕЕ10ИК ΤΕ·ΝΑΗνκνΐΕ ΙιΚϋΤΙΗΕΕΑΑ ΤΟΝΡΡΙΡνΘΝ ЕКАЬНАЕОАТ оетебРснкА ΚΝΟΗΑΡΒΚΚΕ РЕРТАРРАЕЬ ΡΙΞΡΙΕΤνΡν ΕΡΕΝΡΥΝΤΡΙ ККККЗУТУЬО ОСИКСЗРА1Р К1ЕЕЬЕАНЬЬ знттаоюкь 1ЕЬАЕЖЕ1Ъ ΤΕΚΥΑΚΚΚδΑ ИЯМОУИОАТИ КЫЗКАСУУТО УАЬСИОАОР ЬУ5331РКУЬ ОКСОЬКСЕАМ ΑΕΤΕΟΕΤΑΥΓ ΙΡΪΝΡ0300ν Ι36Υ3Α0ΕΗΙ ЬЬНКСЕСАУУ МССКИЗКЕ31 Р5СУН0ЕА0Е

СКЬОАИЕК1К ΜΝΟΙ,βΡΆνΚΤ ЗКОКТаОААА ΕΚΑΓΒΡΕνίΡ ЕИОКЬНРУОА 1УканпьС1, ООУКСИМТЕТ ΚνΐΑΕΑΗ30Α снксекЕснц РСМСЕС1АЗЬ ТЬКРСМОСРК ΓΑΙΚΚΚΟ3ΤΚ усюаугзуре О35МТК1ЬЕР 5ИСРТТР0КК νσΚΕΝΗΑ30Ι ΚΟΡνΗΘνΥΪΟ ΗΤΝΟνΚΟΕΑΕ ΙΡΕΗΕΡνΝΤΡ ЕСЕОКУУЗЬТ □ВЗЕЗЕЬУИО ГЬОСГГЖАОЕ нсоуосзрс1 ЕЬКЬАСННРУ УАЗММКЕЪКК ιοιιατοιοτ Ι0ϋΝ30ΙΚνν УСНРЕ1КЕНМ ЕЕЕУСРРУКР

ЬВРССКККУК 6ТЕЕГК30ГЫ ПТСОЗЗКУЗО МЕЗАЪЗЕСАТ ΟΡΙΡΡΟΟΙΚΕ ΝΚΐνΚΜΥ3Ρν ΕΙ№ΝΑΝΡΟΟ ООТМ1ММОКС МКОСТЕКОАЫ ΡΚ0Ε0Κ0ΚΕ2 УКОИРЬТЁЕК НККЬУОРНЕЬ ОΕΝРЕКУТАГ ΓΚ3ΚΝΡΕΙΙΙ НОКЕРРГЬНМ ΥΑΟΙΚνΚΟΕΟ РЗКОЬУАЕН) ννΟΚνΑΜΕΒΙ РЬУКЬЫУОЬЕ ΕΤΤΝΟΚΤΕΕΗ ИЕкыокок ΟΗΕΗΥΗ5ΝΗΚ НОЬАСТНЬЕС ΚννΗΤΑΝΟ3Ν ΙΙΟΟνΚϋΟΑΕ ΚΕΕΟΚΟΙΤΚΙ ВКР.К АКИНО ΗΚΑΡΑΑΑΡΟν ΟνΡΙΗΡΜΤΪΚ

ЕКНЬУИАЗНЕ ТУАТЬУСУНО ΝΥΡΙΙΟΝΑΟσ ΡΟϋΙΝνΜΕΝΙ РЕС301АСТТ 3ΙΙΌΙΚ05ΡΚ КЗХЬКАЬСЗС ИЕКС<ЗКН1КС Ρ06ΚΙΗΡ53Κ УРРЬУЗЬКЗ! 1КАЕТЕ1СТЕ ΝΚΕΤΟϋΓΗΕν ΤΙΡ3ΤΝΝΕΤΡ ΪΟΪΜΑΑΕΥνα СУЕЬНРОКИТ ВЬЬКСАКАЬТ КОЗОООитУй νΐΗΟΚΤΡΚΕΚ КОР1БСАЕТР АГЬЬАИЮЗС 1УЬЗНУРАНК ΤΜΑΒϋΓΝΕΡΡ КУЮ7А7Н7А ГТЗААУКААС НЬКТАУОМАУ 0ΝΕΕνΥΥΗϋ3 УСВДМАСООС САУ30О1.ОКН САГОЬЗНРЬК

ЬОКРАЬНРЗЬ ΕΣβνΚΟΤΚΕΑ ΟΜΙΗΟΝΕ5ΡΚ νασΗΟΑΑΜΟΜ ЗТР0Е012ИМ ΕΡΓΡΟΥνΟΚΕ АТЬЕЕММТАС РЫССКЕОНЬА СВРСЫРРОЗК ГСИОРЪЗОСЗ МЕКЕСК13К1 0ЬС1РНРАСЬ σνΚΥΟΥΝνΕΡ 30ЬЕ1С0НКТ νΟΡΙΜΪ,ΡϋΚΕ О1УТЬТЕЕАЕ ΙΥΟΕΡΕΚΝΏΚ 1ΡΙΟΚΕΤΗΕΤ ΥνΟΟΑΑΝΒΕΤ ΞΕνΝΐνΤΟ3Ο ΕΙΟΟΝΕΟνϋΚ 1УАКЕ1УА5С εσγίΕΆΕνίρ ΗΜΑΝΙΟΟΕΓΟ ρΐΗΝΓκκκαο КОР1ИКСРАК УАСНСОЕОКЗ ΟΑΙΤ53ΝΙΝΝ ЕКСОЬООЫУ

1451

1501

1551

5ΗΚΗ0ΕΙьОЬ νΕΚΑΤΕβΕΝΝ УКОС

НУ'/НТОСУРР зглнргсднс

ΟΗΟΝΥΤΡΕΡΕ УРУРЬТЕСНС ЕКЬУРМЕРОЕ ΜΟϋΕΕΚΕνίΙ НКГОЗКЬАЬК ННАОЕЬНРЕГ

ЗЕО Ю

N0:12 (1) ΜΚίΚΤ1Α18ΕΙΛΑ0νΐΑ0Ο33Η85ΗΜΑΝΤ0ΜΚ3ΡΚΙΙΙΑΗΚΰΑ33ϊ1ΡΕΗ

Белок ΐη£1οβηζ£β

51) ГЬЕЗКАЬАЕ'АСОАРУЬЕОРЬАМТКРСВЬУУТНРШГЬРСЬТРУАККЕ'РНЙЯ (101) ВКРСВУУУ1РГТЬКЕ103ЬЕМТЕИГЕТ

Claims (15)

1. Лиофилизированная композиция для лечения рака, содержащая один или более чем один антиген, который не является положительно заряженным, и СрС-содержащий иммуностимулирующий олигонуклеотид, где указанный один или более чем один антиген представляет собой антиген ЭДТ-1 (белок опухоли Вильмса) или его производное или фрагмент, где указанное производное в достаточной степени подобно нативным антигенам в сохранении антигенных свойств и сохранении способности обеспечивать иммунный ответ, который должен быть вызван против ЭДТ-1, и где указанный фрагмент имеет по меньшей мере 8 аминокислот в длину и способен индуцировать иммунный ответ, который перекрестно реагирует с природным ЭДТ-1.

2. Композиция по п.1, где указанный иммуностимулирующий олигонуклеотид содержит последовательность: пурин, пурин, С, С, пиримидин, пиримидин.

3. Композиция по п.1 или 2, где указанный иммуностимулирующий олигонуклеотид выбран из группы, включающей

ТСС АТС АСС ТТС СТС АСС ТТ (8Ες ГО ΝΟ: 1);

ТСТ ССС АСС СТС ССС САТ (8Ες ГО ΝΟ: 2);

АСС САТ САС СТС ССС ССТ САС ССС АСС АСС (8Ες ГО ΝΟ: 3);

ТСС ТСС ТТТ ТСТ ССТ ТТТ СТС СТТ (8Ες ГО ΝΟ: 4);

ТСС АТС АСС ТТС СТС АТС СТ (8Ες ГО ΝΟ: 5).

4. Композиция по п.1 или 2, где иммуностимулирующий олигонуклеотид содержит по меньшей мере два неметилированных повтора СС, разделенных по меньшей мере 3 нуклеотидами.

5. Композиция по п.4, где иммуностимулирующий олигонуклеотид содержит по меньшей мере два неметилированных повтора СС, разделенных 6 нуклеотидами.

6. Способ изготовления лиофилизированной композиции по любому из пп.1-5, включающий стадии смешивания желаемого антигена и иммуностимулирующего олигонуклеотида с подходящими эксципиентами и осуществления цикла лиофилизации полученного препарата.

7. Способ изготовления иммуногенной композиции, включающий стадии разведения лиофилизированной композиции по любому из пп.1-5 подходящим носителем.

8. Способ по п.7, где указанный носитель представляет собой носитель в форме частиц, выбранный из группы, включающей минеральные соли, эмульсии, полимеры, липосомы, иммуностимулирующие комплексы (I8СΟΜ).

9. Способ по п.7, где указанный носитель представляет собой раствор липосом или эмульсию масло-в-воде.

10. Способ по любому из пп.7-9, где указанный носитель дополнительно содержит один или более чем один иммуностимулятор.

11. Способ по п.10, где указанный один или более чем один иммуностимулятор выбран из группы, состоящей из агонистов То11-подобного рецептора (ТЬК4), антагонистов ТЬК4, сапонинов, агонистов ΊΕΙ<7- агонистов ТРИ8_ агонистов ТРР9.

12. Способ по п.11, где указанный антагонист ТЬК4 представляет собой 3-деацилированный монофосфориллипид А (ΜΡΕ).

13. Способ по п.11, где указанный сапонин представляет собой р821.

14. Способ по п.10, где указанный носитель содержит два иммуностимулятора.

15. Способ по п.14, где указанные иммуностимуляторы представляют собой 3-деацилированный ΜΡΕ и ς821.