MXPA03002264A

MXPA03002264A - Vacuna.

Info

Publication number: MXPA03002264A
Application number: MXPA03002264A
Authority: MX
Inventors: Jan Poolman
Original assignee: Smithkline Beecham Biolog
Priority date: 2000-09-15
Filing date: 2001-09-12
Publication date: 2004-12-03
Also published as: PL361395A1; HUP0301092A2; US20060051361A1; AU2002238193B2; CY1111915T1; ES2551097T3; CN1253205C; CN101502648A; EP2140878A1; US20040081662A1; GB0022742D0; EP1317280B1; KR20030031188A; EP1317280A2; PT1317279E; JP4880184B2; EP2314313B1; ZA200301524B; AU2002220548B2; CA2422002C

Abstract

La presente invencion se refiere al campo de vacunas de antigeno polisacarido bactenano; en particular, la presente invencion se refiere a vacunas que comprenden un antigeno de polisacarido neumococal, tipicamente un antigeno polisacando neumococal conjugado a partir de Sfrepfococcus pneumoniae seleccionado a partir del grupo que consiste de PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp125, Sp101, Sp128, Sp130 y Sp133, y opcionalmente un adyuvante que induce Th1.

Description

VACUNA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a vacunas de antígeno de polisacárido bacterial, su manufactura y el uso de dichos polisacaridos en medicinas. En particular la presente invención se refiere a vacunas que comprenden un antígeno polisacárido neumococal, típicamente un antígeno polisacárido conjugado neumococal, formulado con un antígeno de proteína a partir de Stmptococcus pneumoniae y opcionalmente un adyuvante que induce Th1.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Stmptococcus pneumoniae es una bacteria Gram positiva responsable de una gran morbidez y mortalidad (particularmente en los jóvenes y en los ancianos), ocasionando enfermedades invasivas tales como neumonía, bacteremia y meningitis, y enfermedades asociadas con la colonización, tales como otitis media aguda. La relación de neumonía neumococal en los Estados Unidos para personas mayores de 60 años de edad se estima que es de 3 a 8 por 100,000. En 20% de los casos esto lleva a bacteremia, y a otras manifestaciones tales como meningitis, con una relación de mortalidad cercana al 30 % incluso con tratamiento de antibióticos. El neumococo está encapsulado con un polisacárido asociado químicamente que le confiere especificidad de serotipo. Hay 90 serotipos conocidos de neumococos, y la cápsula es el determinante de virulencia principal para los neumococos, puesto que la cápsula no solamente protege la superficie interna de la bacteria a partir del complemento, sino que por sí misma es escasamente ínmunogónica. Los polisacáridos son antígenos independientes de T, y no pueden ser procesados o presentados sobre moléculas del MHC para interactuar con las células T. Estos pueden, sin embargo, estimular al sistema inmune a través de un mecanismo alternativo el cual implica el entrecruzamiento de los receptores de superficie en las células B. Se demostró en varios experimentos que la protección en contra de las enfermedades invasivas por neumococos se correlaciona más fuertemente con anticuerpo específico para la cápsula, y la protección es especifica del serotipo. Las vacunas basadas en antígeno polisacárido se conocen bien en la técnica. Cuatro que han sido autorizadas para uso en humanos incluyen al polisacárido Vi de Salmonella typhi, el polisacárido PRP a partir de Haemophilus influanzaa, la vacuna meningococal compuesta de los serotipos A, C, W135 e Y, y la vacuna neumococal 23-Valente compuesta de los polisacáridos que corresponden a los serotipos 1 , 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 1 1A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, y 33 (que cuenta para al menos 90% de los aislados sanguíneos neumococales). Las últimas tres vacunas confieren protección en contra de bacterias que ocasionan infecciones respiratorias que resultan en morbidez y mortalidad severa en infantes, incluso estas vacunas aún no han sido autorizadas para uso en niños menores de dos años de edad debido a que son inadecuadamente inmunogénicas en este grupo de edad [Peltola et al. (1984), N. Engl. J. Med. 300 10:1561-1566]. Streptococcus pneumoniae es la causa más común de enfermedades invasivas bacterianas y de otitis media en infantes y niños pequeños. Similarmente, los ancianos montan respuestas deficientes a las vacunas neumococales [Roghamm et al., (1987), J. Gerontol. 42: 265-270], de ahí la incidencia incrementada de neumonía bacteriana en esta población [Verghese y Beck, (1983) Medicine (Baltimore) 62: 271-285]. Las estrategias, que han sido diseñadas para sobreponerse a esta carencia de inmunogenicidad de los infantes, incluye la asociación del polisacárido a proteínas inmunogénicas grandes, las cuales proveen a la célula T auxiliar circunstante y la cual induce memoria inmunológica en contra del antfgeno polisacárido al cual está conjugada. Las vacunas de conjugado de glucoproteína neumococal actualmente están siendo evaluadas para su seguridad, inmunogenicidad y eficiencia en grupos de diversas edades. La vacuna neumococal no conjugada 23-valente ha mostrado una amplia variación en eficiencia clínica, de 0% a 81 % (Fedson et al., (1994) Arch. Intern Med. 154: 2531-2535). La eficiencia parece estar relacionada con el grupo de riesgo que ha sido inmunizado, tales como los ancianos, enfermedad de Hodgkin, esplenectomía, enfermedad de célula falciforme y agammaglobulinómicos (Fine et al., (1994) Arch Intern Med. 154: 2666-2677), y también a la manifestación de la enfermedad. La vacuna 23-valente no demuestra protección en contra de la neumonía neumococal (en ciertos grupos de alto riesgo tales como los ancianos) y enfermedades de otitis media. Por lo tanto hay una necesidad para mejorar las composiciones de vacuna neumococal, particularmente aquellas que serán más efectivas en la prevención o mejoría de enfermedades neumococales (particularmente neumonía) en los ancianos y en niños pequeños. La presente invención provee dicha vacuna mejorada.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION De conformidad con la presente invención se provee una composición de vacuna, que comprende al menos un antígeno de polisacárido de Streptococcus pneumoniae (preferiblemente conjugado a una proteína vehículo) y a un antígeno de proteína de Streptococcus pneumoniae seleccionado a partir del grupo que consiste de: familia de Tríada de Poli Histidina (Pht; por ejemplo PhtA, PhtB, PhtD, o PhtE), familia Lyt (por ejemplo, LytA, LytB, o LytC), SpsA, Sp128, Sp130, Sp125, Sp101 y Sp133, o equivalente truncado o inmunológicamente funcional del mismo, opcionalmente con un adyuvante Th1 (un adyuvante induce una respuesta inmune predominantemente Th1 ). Preferiblemente tanto una proteína neumococal como el adyuvante Th1 están incluidos. Las composiciones ventajosas comprenden combinaciones de las proteínas neumococales anteriormente mencionadas de la invención entre sí y también se describen con otras proteínas neumococales. Las composiciones de la invención son particularmente adecuadas en el tratamiento de neumonía en ancianos. Las vacunas de polisacárido neumococal (conjugado o no) pueden ser capaces de proteger en contra de neumonía en la población anciana para la cual la incidencia de esta enfermedad es muy alta. El mecanismo de defensa clave en contra del neumococo es la opsonofagocitosis (un evento mediado por una célula B humoral/neutrófilos, ocasionado por la producción de anticuerpos en contra del polisacárido neumococal, eventualmente la bacteria se vuelve fagocitada), sin embargo partes de los mecanismos opsónicos implicados están deteriorados en los ancianos, por ejemplo, la producción de superóxido por PMN (células polimorfonucleares), producción de otras especies reactivas de oxígeno, movilización de PMN, apoptosis de PMN, deformación de PMN. Las respuestas del anticuerpo también pueden estar deterioradas en el anciano. Contrariamente al dogma normalmente aceptado, los niveles normales de anticuerpos anti-polisacárldo capsular puede no ser efectivos para eliminar completamente la bacteria, puesto que los neumococos pueden invadir a la células hospederas para evadir esta rama del sistema inmune.

Sorprendentemente, los presentes inventores han encontrado que mediante la estimulación simultáneamente de la rama del sistema inmune mediado por célula (por ejemplo inmunidad mediada por célula T) además de la rama del sistema inmune humoral (mediado por célula B), una sinergia (o cooperación) puede resultar la cual es capaz de mejorar la desaparición de neumococos a partir del hospedero. Este es un descubrimiento que ayudará a la prevención (o tratamiento) de infecciones neumococales en general, pero será particularmente importante para la prevención (o tratamiento) de neumonía en los ancianos en donde las vacunas basadas en polisacárido no muestran eficacia. Sin desear atenerse a ninguna teoría, los presentes inventores han encontrado que ambos brazos del sistema inmune pueden sinergizar de esta manera si un polisacárido neumococal (preferiblemente conjugado a una proteína vehículo) se administra con una proteína neumococal seleccionada a partir del grupo que consiste de: PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp125, Sp101 , Sp128, Sp130 y Sp133 (proteínas que pueden ser procesadas y presentadas en el contexto de MHC clase II y clase I sobre la superficie de la células de mamífero infectadas). A pesar de que una o más de estas proteínas neumococales pueden disparar la inmunidad mediada por célula por sí misma, los inventores también han encontrado que la presencia de un adyuvante que induce Th1 en la formulación de vacuna ayuda a este brazo del sistema inmune, y sorprendentemente mejora adicionalmente la sinergia entre ambos brazos del sistema inmune.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención provee una vacuna mejorada particularmente para la prevención o mejoría de infecciones neumococal de los ancianos (y/o infantes y niños). En el contexto de la invención un paciente se considera un anciano si tiene 55 años o más de edad, típicamente más de 60 años y más generalmente más de 65 años. Por lo tanto en una modalidad de la invención se provee una composición de vacuna, adecuada para uso en el anciano (y/o infantes y niños) que comprende al menos un antígeno de polisacárido de Streptococcus pneumoniae y al menos un antígeno(s) de proteína de Streptococcus pneumoniae seleccionado a partir del grupo que consiste de: PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp125, Sp101 , Sp128, Sp130 y Sp133. La vacuna puede comprender opcionalmente un adyuvante Th1. En una segunda modalidad preferida, la presente invención provee una vacuna (adecuada para la prevención de neumonía en los ancianos) que comprende al menos un (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10) antígeno(s) de polisacárido de Streptococcus pneumoniae y al menos un antígeno de proteína de Streptococcus pneumoniae seleccionado a partir del grupo que consiste de: PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp125, Sp101 , Sp128, Sp130 y Sp133, y, preferiblemente, un adyuvante Th1.

En las modalidades anteriormente mencionadas las vacunas comprenden ventajosamente combinaciones de las proteínas neumococales anteriormente mencionadas de la invención entre si y con otras proteínas neumococales que también se abarcan como se describe a continuación. Se considera que dicha vacuna será útil para tratar infección neumococal (por ejemplo otitis media) en otros grupos de la población de alto riesgo, tales como infantes o niños.

Antíqenos de polisacárido de Streptococcus pneumoniae de la invención Típicamente la vacuna de Streptococcus pneumoniae de la presente invención comprenderá antígenos de polisacárido (preferiblemente conjugado a una proteína vehículo), en donde los polisacáridos se derivan a partir de al menos cuatro serotipos de neumococos. Preferiblemente los cuatro serotipos incluyen 6B, 14, 19F y 23F. Más preferiblemente, al menos 7 serotipos están incluidos en la composición, por ejemplo aquellos derivados a partir de los serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, y 23F. Más preferiblemente aún, al menos 11 serotipos están incluidos en la composición, por ejemplo la composición en una modalidad incluye polisacáridos capsulares derivados a partir de los serotipos 1 , 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F (preferiblemente conjugados a una proteína vehículo). En una modalidad preferida de la invención al menos 13 antígenos de polisacárido (preferiblemente conjugados a una proteína vehículo) están incluidos, aunque antígenos polisacáridos adicionales, por ejemplo 23-valente (tales como los serotipos 1 , 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 14B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F), también están contemplados por la invención. La vacunación para ancianos (por ejemplo para la prevención de neumonía) es ventajosa para incluir a los serotipos 8 y 12F (y más preferiblemente 15 y 22 también) a la composición de antígeno 1 1-valente descrita anteriormente para formar una vacuna 15-valente, ya sea para los serotipos 6A y 19A para infantes o para niños (en donde la otitis media es de gran importancia) que se incluyen de manera ventajosa para formar una vacuna 13-valente. Aunque los polisacáridos anteriormente mencionados pueden ser utilizados en su forma nativa, de longitud total, debe entenderse que los polisacáridos de tamaño reducido también pueden ser utilizados los cuales aún son inmunogénicos (véase por ejemplo EP 497524 y 497525). Para la prevención/mejoría de la neumonía en la población anciana (+ de 55 años de edad) y la otitis media en los Infantes (de hasta 18 meses de edad) y niños (típicamente de 18 meses a cinco años de edad), una modalidad preferida de la invención es combinar un polisacárido multivalente de Streptococcus pneumoniae como se describe en la presente invención con una proteína de Streptococcus pneumoniae seleccionada a partir del grupo que consiste de: PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp125, Sp101 , Sp128, Sp130 y Sp133, o equivalentes inmunológicamente funcionales de los mismos. Una combinación de proteínas neumococales también puede ser utilizada de manera ventajosa como se describe a continuación.

Proteínas neumococales de la invención Para los propósitos de esta invención, "equivalente inmunológicamente funcional" se define como un péptido de proteína que comprende al menos un epítope protector a partir de las proteínas de la invención. Dichos epítopes característicamente están expuestos en la superficie, están altamente conservados, y pueden producir una respuesta de anticuerpo bactericida en un hospedero o prevenir efectos tóxicos. Preferiblemente, el equivalente funcional tiene al menos 15 y preferiblemente 30 o más aminoácidos contiguos a partir de la proteína de la invención. Más preferiblemente, fragmentos, deleciones de la proteína, tales como variantes transmembranaies de deleción de las mismas (por ejemplo el uso del dominio extracelular de las proteínas), fusiones, derivados químicamente o genéticamente detoxificados y similares pueden ser utilizados con la condición de que sean capaces de generar substancialmente la misma respuesta inmune que la proteína nativa. La posición de los epítopes potenciales de célula B en una secuencia de proteína puede determinarse fácilmente mediante la identificación de póptidos que están expuestos tanto en la superficie y que son antigénicos, utilizando una combinación de dos métodos: predicción de estructura 2D y predicción del índice antigónico. La predicción de estructura 2D puede realizarse utilizando el programa PSIPRED (a partir de David Jones, Brunel Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, RU). El índice antigénico puede ser calculado con base en el método descrito por Jameson y Wolf (CABIOS 4: 181-186

[1988]). Las proteínas de la invención son las siguientes proteínas, todas las cuales están expuestas en la superficie extema de los neumococos (capaces de ser reconocidas por un sistema inmune del hospedero durante al menos una parte del ciclo de vida de los neumococos), o son proteínas las cuales son secretadas o liberadas por los neumococos. La proteína de Streptococcus pneumoniae de la invención preferiblemente se selecciona a partir del grupo que consiste de: una proteína a partir de la tríada de polihistidina (Pht), una proteína a partir de la familia Lyt, una proteína de unión a colina, proteínas que tienen un motivo LPXTG (en donde X es cualesquiera aminoácidos), proteínas que tienen un motivo secuencia Señal Tipo II de LXXC (en donde X es cualesquiera aminoácidos), y proteínas que tienen un motivo de secuencia Señal Tipo I. Los ejemplos preferidos dentro de estas categorías (o motivos) son las siguientes proteínas (o equivalentes truncados o inmunológicamente funcional de las mismas). La familia Pht (Tríada de Poli Histidina) comprende proteínas PhtA, PhtB, PhtD, y PhtE. La familia está caracterizada por una secuencia de lipidación, dos dominios separados por una región rica en prolina y varias tríadas de histidina, posiblemente implicadas en la unión a metal o a nucleósido o a la actividad enzimática, regiones enrolladas en espiral (3-5), un N-terminal conservado y un C-terminal heterogéneo. Este está presente en todas las cepas de neumococos evaluadas. Las proteínas homólogas también han sido encontradas en otros estreptococos y Neisseria. Los miembros preferidos de la familia comprenden PhtA, PhtB y PhtD. Más preferiblemente, ésta comprende PhtA o PhtD. Se entiende, sin embargo, que los términos Pht A, B, D, y E se refieren a proteínas que tienen secuencias descritas en las citas a continuación así como a variantes de las mismas que ocurren de manera natural (y elaboradas por el hombre) que tienen una homología de secuencia que es al menos 90% idéntica a las proteínas de referencia. Preferiblemente ésta es al menos 95% Idéntica y más preferiblemente ésta es 97% idéntica. Con respecto a las proteínas Pht, PhtA se describe en WO 98/18930, y también se refiere como Sp36. Como se mencionó anteriormente, esta es una proteína a partir de la familia tríada de polihistidina y tiene el motivo señal tipo II de LXXC. PhtD se describe en WO 00/37105, y también está referida como Sp036D. Como se mencionó anteriormente, esta también es una proteína a partir de la familia tríada de polihistidina y tiene el motivo señal tipo II LXXC. PhtB se describe en WO 00/37105, y también se refiere como Sp036B. Otro miembro de la familia PhtB es el polipóptido degradador C3, como se describe en WO 00/17370. Esta proteína también es a partir de la familia tríada de polihistidina y tiene el motivo señal tipo II LXXC. Un equivalente inmunológicamente funcional en la proteína Sp42 descrita en WO 98/18930. Un truncado de PhtB (de aproximadamente 79 kD) se describe en WO 99/15675 el cual también se considera un miembro de la familia PhtX. PhtE se describe en WO 00/30299 y se refiere como BVH-3. SpsÁ es una protelna de unión a colina (Cbp) descrita en WO 98/39450. La familia Lyt son proteínas asociadas a la membrana asociadas con la lisis celular. El dominio N-terminal comprende un dominio(s) de unión a colina, sin embargo la familia Lyt no tiene todas las características encontradas en la familia de proteína de unión a colina (Cbp) mencionada a continuación y por lo tanto para la presente invención, la familia Lyt se considera distinta a partir de la familia Cbp. En contraste con la familia Cbp, el dominio C-terminal contiene el dominio catalítico de la familia de proteína Lyt. La familia comprende LytA, B y C. Con respecto a la familia Lyt, LytA se describe en Ronda et al., Eur. J Biochem, 164: 621-624 (1987). LytB se describe en WO 98/18930, y también se refiere como Sp46. LytC también se describe en WO 98/18930, y también se refiere como Sp91. Un miembro preferido de esa familia es LytC. Otra modalidad preferida son los truncados de la familia Lyt en donde "Lyt" se definió anteriormente y "truncado" se refiere a las proteínas que carecen de 50% o más de la región de unión a colina. Preferiblemente dichas proteínas carecen de toda la región de unión a colina. Sp125 es un ejemplo de una proteína neumococal de superficie con el motivo de Anclaje a Pared Celular de LPXTG (en donde X es cualquier aminoácido). Se ha encontrado que cualquier proteína dentro de esta clase de proteínas neumococales de superficie con este motivo es útil dentro del contexto de esta invención, y por lo tanto se considera una proteína adicional de la invención. Sp125 por sí misma se describe en WO 98/18930, y también se conoce como ZmpB- una metaloproteinasa de zinc. Sp101 se describe en WO 98/06734 (en donde ésta tiene el # de referencia y 85993). Está caracterizada por una secuencia señal Tipo I. Sp133 se describe en WO 98/06734 (en donde ésta tiene el # de referencia y 85992). También está caracterizada por una secuencia señal Tipo I. Sp128 y Sp130 se describen en WO 00/76540. Las proteínas utilizadas en la presente invención preferiblemente se seleccionan a partir del grupo PhtD y PhtA, o una combinación de ambas proteínas.

Combinación ventajosa de una o más proteínas neumococales de la invención con otras proteínas neumococales En la vacuna de la invención, cada una de las proteínas de la invención anteriormente mencionada (preferiblemente ya sea PhtD o PhtA o ambas) puede combinarse de manera benéfica con una o más proteínas neumococales a partir de la siguiente lista: neumolisina (también referida como Ply; preferiblemente detoxificada mediante tratamiento químico o mutación) [WO 96/05859, WO 90/06951 , WO 99/03884], PsaA y variantes transmembranales de deleción de las mismas (Berry y Patón, Infect Immun 1996 Dec; 64 (12): 5255-62), PspA y variantes transmembranales de deleción de las mismas (EUA 5804193, WO 92/14488, WO 99/53940), PspC y variantes transmembranales de deleción de las mismas (WO 97/09994, WO 99/53940), un miembro de la familia de proteína de unión a colina (Cbp) [por ejemplo CbpA y variantes transmembranales de deleción de las mismas (WO 97/41 151 ; WO 99/51266)], Gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (Infect. Immun. 1996 64: 3544), HSP70 (WO 96/40928), PcpA (Sanchez-Beato et al. FEMS icrobiol Lett 1998, 164: 207-14), protelna semejante a M (Solicitud de Patente SB No. EP 0837130), y adhesina 18627 (Solicitud de Patente de SB No. EP 0834568). La presente invención también abarca equivalentes inmunológicamente funcionales o truncados de dichas proteínas (como se definió anteriormente). Con respecto a la familia de la Proteína de Unión a Colina, los miembros de esa familia se identificaron originalmente como proteínas neumococales que pudieron ser purificadas mediante cromatografía de afinidad a colina. Todas las proteínas de unión a colina no se unen de manera covalente a porciones de fosforilcolina del ácido teichóico de la pared celular y al ácido lipoteichóico asociado a membrana. Estructuralmente, éstas tienen varias regiones en común a lo largo de toda la familia, aunque el número exacto de las proteínas (secuencia de aminoácidos, longitud, etc.) puede variar. En general, la proteína de unión a colina comprende una región N terminal (N), regiones repetidas conservadas (R1 y/o R2), una región rica en prolina (P) y una región conservada de unión a colina (C), elaborada de múltiples repetidos, que comprenden aproximadamente una mitad de la proteína. Como se utiliza en esta solicitud, el término "familia de Proteína de Unión a Colina (Cbp)" se selecciona a partir del grupo que consiste de Proteínas de Unión a Colina como se identifican en WO 97/41 151 , PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD, y CbpG. CbpA se describe en WO 97/41151. CbpD y CbpG se describen en WO 00/29434. PspC se describe en WO 97/09994. PcbA se describe en WO 98/21337. Preferiblemente las Proteínas de Unión a Colina se selecciona a partir del grupo que consiste de CbpA, PbcA, SpsA y PspC. Si una Cbp es la proteína adicional utilizada, ésta puede ser un truncado de Cbp en donde "Cbp" se definió anteriormente y "truncado" se refiere a proteínas que carecen del 50% o más de la región de unión a Colina (C). Preferiblemente dichas proteínas carecen de toda la región de unión a colina. Más preferiblemente, dichos truncados de proteínas carecen de (i) la región de unión a colina y (ii) también de una porción de la mitad N-terminal de la proteína, que aún así retiene al menos una región repetida (R1 o R2). Más preferiblemente aún, el truncado tiene 2 regiones repetidas (R1 y R2). Los ejemplos de dichas modalidades preferidas son NR1xNr2 y R1xR2 como se ilustran en WO 99/51266 o WO 99/51 188, sin embargo, otras proteínas de unión a colina que carecen de una región similar de unión a colina también están contempladas dentro del alcance de esta invención.

Las proteínas quiméricas (o fusiones) truncado de Cbp -truncado de Lyt también pueden ser utilizadas en la vacuna de la invención. Preferiblemente éstas comprenden NR1xR2 (o R1xR2) de Cbp y la porción C terminal (Cterm, por ejemplo, que carece de los dominios de unión a colina) de Lyt (por ejemplo, LytCCterm o Sp91 Cterm). Más preferiblemente Cbp se selecciona a partir del grupo que consiste de CbpA, PbcA, SpsA y PspC. Más preferiblemente aún, ésta es CbpA. Preferiblemente, Lyt es LytC (también referida como Sp91 ). Un truncado de PspA o de PsaA que carece del dominio de unión a colina (C) y que se expresa como una proteína de fusión con Lyt también puede ser utilizado. Preferiblemente, Lyt es LytC.

Combinaciones preferidas de proteínas neumococales para los propósitos de esta invención Preferiblemente la combinación de proteínas de la invención se selecciona a partir de 2 o más (3 o 4) categorías diferentes tales como proteínas que tienen un motivo de secuencia Señal Tipo II de LXXC (en donde X es cualquier aminoácido, por ejemplo, la familia tríada de polihistidina (Pht)), proteína de unión a colina (Cbp), proteínas que tienen un motivo secuencia Señal Tipo I (por ejemplo, Sp101 ), proteínas que tienen un motivo LPXTG (en donde X es cualquier aminoácido, por ejemplo, Sp128, Sp130), toxinas (por ejemplo, Ply), etc. Los ejemplos preferidos dentro de estas categorías (o motivos) son las proteínas mencionadas anteriormente, o equivalentes inmunológicamente funcionales de las mismas. Toxina + Pht, toxina + Cbp, Pht + Cbp, y toxina + Pht + Cbp son combinaciones de categorías preferidas. Las combinaciones benéficas preferidas incluyen, pero no se limitan a, PhtD + NR1xR2, proteínas quiméricas o de fusión PhtD + NR1xR2-Sp91Cterm, PhtD + Ply, PhtD + Sp128, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NR1xR2, proteínas quiméricas o de fusión PhtA + NR1 R2-Sp91 Cterm, PhtA + Ply, PhtA + Sp128, PhtA + PsaA, PhtA + PspA, NR1xR2 + LytC, NR1xR2 + PspA, NR1xR2 + PsaA, NR1xR2 + Sp128, R1xR2 + LytC, R1xR2 + PspA, R1xR2 + PsaA, R1xR2 + Sp128, R1xR2 + PthD, R1xR2 + PthA. Preferiblemente, NR1xR2 (o R1xR2) es a partir de CbpA o PspC. Más preferiblemente éste es de a partir de CbpA. Una combinación particularmente preferida de proteínas neumococales comprende Ply (o un equivalente truncado o inmunológicamente funcional de las mismas) + PthD (o un equivalente truncado o inmunológicamente funcional de la misma) + NR1xR2 (o R1xR2). Preferiblemente, NR1xR2 (o R1xR2) es a partir de CbpA o PspC. Más preferiblemente éste es a partir de CbpA. Sin atenerse a ninguna teoría, dentro de la composición, la proteína neumococal (o combinaciones descritas anteriormente) de la invención puede ayudar a inducir una respuesta mediada por célula T en contra de la enfermedad neumococal -particularmente requerida para la protección en contra de la neumonía - la cual coopera con la rama humoral del sistema inmune para inhibir la invasión por neumococos, y para estimular la opsonofagocitosis. Una ventaja adicional para incluir al antlgeno de proteína es la presentación de antígenos adicionales para el proceso de opsonofagocitosis. Por consiguiente, en una modalidad de la invención se provee una vacuna de Streptococcus pneumoniae que comprende una vacuna conjugada de polisacárido de neumococo que comprende antígenos de polisacárido derivados a partir de al menos cuatro serotipos, preferiblemente al menos siete serotipos, más preferiblemente al menos once serotipos, y al menos uno, pero preferiblemente 2, 3, ó 4, proteínas de Streptococcus pneumoniae seleccionadas a partir del grupo que consiste de: PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp125, Sp101 , Sp128, Sp130 y Sp133 (o una combinación de protelna neumococal como se describió anteriormente). Preferiblemente una de las proteínas es PthA (o un equivalente inmunológicamente funcional de la misma). Más preferiblemente una de las proteínas es PthD (o un equivalente inmunológicamente funcional de la misma). Como se mencionó anteriormente, un problema asociado con el método de polisacárido a la vacunación, es el hecho de que los polisacáridos per se son escasamente inmunógenos. Para superar esto, los polisacáridos pueden conjugarse a proteínas vehículo, las cuales proveen ayuda de célula T circunstante. Se prefiere, por lo tanto, que los polisacáridos utilizados en la invención estén asociados a dicha proteína vehículo. Los ejemplos de dichos vehículos que son actualmente utilizados de manera común para la producción de inmunógenos de polisacáridos incluyen los toxoides de difteria y del tétanos (DT, DT CR 197 y TT respectivamente), Hemocianina de la Lapa Keyhole (KLH), OMPC a partir de N. meningitidis, y la proteína purificada derivada de Tuberculina (PPD). Un vehículo preferido para las composiciones inmunogénicas basadas en polisacárido neumococal (o vacunas) es la proteína D a partir de Haemophilus influenzae (EP 594610-B), o fragmentos de la misma. Los fragmentos adecuados para uso incluyen los fragmentos que abarcan los epítopes auxiliares T. En particular un fragmento de proteína D preferiblemente contendrá 1/3 del N-terminal de la protelna. Una proteína D vehículo es sorprendentemente útil como un vehículo en las vacunas en donde múltiples antígenos de polisacárido neumococal están conjugados. La supresión del epítope ocurre usualmente de manera probable si el mismo vehículo se utiliza para cada polisacárido. De manera sorprendente, los presentes inventores han encontrado que la proteína D es particularmente adecuada para minimizar dichos efectos de supresión epitópica en vacunas de combinación. Uno o más polisacáridos neumococales en una combinación pueden conjugarse de manera ventajosa en la proteína D, y preferiblemente todos los antígenos están conjugados en la proteína D dentro de dicha vacuna de combinación. Un vehículo adicionalmente preferido para el polisacárido neumococal es la proteína neumococal misma (como se definió anteriormente en la sección "proteínas neumococales de la invención").

El polisacárido puede estar asociado a la proteína vehículo mediante cualquier método conocido (por ejemplo, por Likhite, Patente de E.U.A. 4, 372, 945 y por Armor et al., Patente de E.U.A. 4, 474, 757). Preferiblemente, se lleva a cabo la conjugación CDAP (WO 95/08348). Preferiblemente la relación proteína: polisacárido (peso: peso) de los conjugados es de 0.3:1 a 1 :1 , más preferiblemente 0.6:1 a 0.8:1 , y más preferiblemente de aproximadamente 0.7:1 . Las vacunas de la presente invención preferiblemente están asociadas a adyuvantes. Los adyuvantes adecuados incluyen una sal de aluminio tal como gel de hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio, pero también puede ser una sal de calcio, magnesio, hierro o zinc, o puede ser una suspensión insoluble de tirosina acilatada, o azúcares acilatados, polisacáridos derivados catiónicamente o amónicamente, o polifosfazenos. Se prefiere que el adyuvante se seleccione a partir de un inductor preferencial de un tipo de respuesta TH1 para ayudar a la rama de la respuesta inmune mediada por célula.

Adyuvantes TH1 de la invención Altos niveles de citoquinas tipo Th1 tienen a favorecer la inducción de las respuestas inmunes mediadas por la célula a un antígeno dado, mientras que elevados niveles de citoquinas tipo Th2 tienen a favorecer la inducción de las respuestas inmunes humorales al antígeno.

Es importante recordar que la distinción de la respuesta inmune tipo Th1 y Th2 no es absoluta. En realidad un individuo mantendrá una respuesta inmune que se describe como que es predominantemente Th1 o predominantemente Th2. Sin embargo, frecuentemente es conveniente considerar las familias de citoquinas en términos de lo descrito en las clonas de célula T CD4 +ve de murino por Mosmann y Coffman (Mosmann, T. R. y Coffman, R. L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p 145-173). Tradicionalmente, las respuestas tipo Th1 están asociadas con la producción de las citoquinas INF-? e IL-2 por linfocitos T. Otras citoquinas frecuentemente están asociadas de manera directa con la inducción de las respuestas inmunes tipo Th1 que no se producen por las células T, tal como IL-2. En contraste, las respuestas tipo Th2 están asociadas con la secreción de II-4, IL-5, IL-6, IL-10. Los sistemas adyuvantes adecuados que promueven una respuesta predominantemente de Th1 incluyen: Monofosforil llpido A o un derivado del mismo, particularmente 3-de-O-acilado monofosforil Ifpido A (3D-MPL) (para esta preparación véase GB 2220211 A); y una combinación de monofosforil lípido A, preferiblemente 3-de-O-acllado monofosforil llpido A, junto con ya sea una sal de aluminio (por ejemplo fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio) o una emulsión de aceite-en-agua. En dichas combinaciones, el antlgeno y el 3D-MPL están contenidos en las mismas estructuras particuladas, permitiendo una administración más eficiente de las señales antigónicas e inmunoestimulantes. Los estudios han mostrado que 3D-MPL es capaz de mejorar adicionalmente la inmunogenicidad de un antígeno adsorbido a alumbre [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16: 708-14; EP 689454-B1]. Un sistema mejorado implica la combinación de un monofosforil Kpido A y un derivado de saponina, particularmente la combinación de QS21 y 3D- PL como se describe en WO 94/00 153, o una composición que produce menos reacción en donde la QS21 se elimina con colesterol como se describe en WO 96/33739. Una formulación adyuvante particularmente potente que implica a QS21 , 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en WO 95/17210, y es una formulación preferida. Preferiblemente la vacuna comprende adicionalmente una saponina, más preferiblemente QS21. La formulación también puede comprender una emulsión de aceite en agua y tocoferol (WO 95/17210). La presente invención también provee un método para producir una formulación de vacuna que comprende mezclar una protelna de la presente invención junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como 3D-MPL. Los oligonucleótidos no metilados que contienen CpG (WO 96/02555) también son inductores preferenciales de una respuesta TH1 y son adecuados para uso en la presente invención. Las composiciones particularmente preferidas de la invención comprenden uno o más polisacáridos neumococales conjugados, una o más proteínas neumococales de la invención y un adyuvante Th1. Sin atenerse a ninguna teoría, la inducción de una respuesta mediada por celular por medio de una proteína neumococal (como se describió anteriormente) y la cooperación entre ambos brazos del sistema inmune puede auxiliarse utilizando dicho adyuvante Th-1 , resultando en una vacuna particularmente efectiva en contra de la enfermedad neumococal en general, y, de manera importante, en contra de la neumonía neumococal en los ancianos. En un aspecto adicional de la presente invención, se provee un inmunógeno o vacuna como se describe aquí para uso en medicina. En una modalidad hay un método para prevenir o mejorar la neumonía en un humano anciano (+55 años de edad) que comprende la administración de una cantidad segura y efectiva de una vacuna, como se describe en la presente invención, que comprende un antígeno de polisacárido de Streptococcus pneumoniae y una proteína neumococal seleccionada a partir del grupo que consiste de: PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp125, Sp101 , Sp128, Sp130 y Sp133, y opcionalmente un adyuvante Th1 , a dicho paciente anciano. En una modalidad adicional, se provee un método para prevenir o mejorar la otitis media en infantes (hasta 18 meses de edad) o niños (típicamente de 18 meses a 5 años de edad), que comprende la administración de una cantidad segura y efectiva de una vacuna que comprende un antígeno de polisacárido de Streptococcus pneumoniae y un antígeno de proteína de Streptococcus pneumoniae seleccionado a partir del grupo que consiste de: PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp125, Sp101 , Sp128, Sp130 y Sp133, y opcionalmente un adyuvante Th1 , a dicho infante o niño. Preferiblemente en los métodos de la invención, como se describió anteriormente, el antígeno polisacárido está presente como un conjugado de proteína polisacárido.

Preparaciones de vacuna para la invención Las preparaciones de vacuna de la presente invención pueden ser utilizadas para proteger o tratar a un mamífero susceptible a la infección, por medio de la administración de dicha vacuna vía una ruta sistémica o mucosal. Estas administraciones pueden incluir inyección vía las rutas intramuscular, intraperitoneal, intradermal o subcutánea; o vía administración mucosal a los tractos oral/alimentario, respiratorio, genitourinario. Se prefiere la administración intranasal de vacunas para el tratamiento de neumonía o de otitis media (un transporte nasofaríngeo de neumococos puede ser prevenido de manera más efectiva, por lo tanto atenuado la infección en sus primeras etapas). Aunque la vacuna de la invención puede ser administrada como una sola dosis, los componentes de la misma también pueden ser coadministrados juntos al mismo tiempo o en tiempos diferentes (por ejemplo los polisacáridos neumococales podrían ser administrados separadamente al mismo tiempo o 1-2 semanas después de la administración del componente de proteína bacteriana de la vacuna para una coordinación óptima de las respuestas inmunes entre sí). Para la co-administración, el adyuvante Th1 opcional puede estar presente en cualesquiera o en todas las administraciones diferentes, sin embargo se prefiere que se presente en combinación con el componente de proteína bacteriana de la vacuna. Además de una sola ruta de administración, se pueden utilizar 2 rutas diferentes de administración. Por ejemplo, cualesquiera antígenos virales pueden ser administrados ID (intradermal), mientras que las proteínas bacterianas pueden ser administradas IM (intramuscular) o IN (intranasal). Los polisacáridos pueden ser administrados IM (o ID) y las proteínas bacterianas pueden ser administradas IN (o ID). Además, las vacunas de la invención pueden ser administradas IM para dosis de cebado e IN para dosis de refuerzo. La cantidad de antlgeno conjugado en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta ¡nmunoprotectora sin efectos laterales significativos, adversos en las vacunas típicas. Dicha cantidad variará dependiendo de qué inmunógeno específico se emplea y cómo se presenta. Generalmente, se espera que cada dosis comprenderá 0.1-100 µg de polisacárido, preferiblemente 0.1-50 µg, preferiblemente 0.1-10 µg, de los cuales 1 a 5 es el intervalo más preferible. El contenido de antígenos de proteína en la vacuna típicamente estará en el intervalo 1-100 µg, preferiblemente 5-50 µg, más típicamente en el intervalo 5-25 µg. Cantidades óptimas de los componentes para una vacuna particular pueden ser comprobados por estudios estándares que implican observación de las respuestas inmunes apropiadas en los sujetos. Siguiendo a una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo adecuadamente espaciadas. La preparación de vacuna generalmente se describe en Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). La encapsulación dentro de liposomas se describe por Fullerton, Patente de E.U.A. 4, 235, 877. A pesar de que las vacunas de la presente invención pueden ser administradas por cualquier ruta, la administración de las vacunas descritas dentro de la piel (ID) forma una modalidad de la presente invención. La piel humana comprende una cutícula "dura" externa, denominada el estrato córneo, la cual se sobrepone a la epidermis. Por debajo de esta epidermis está una capa denominada la dermis, la cual a su vez se sobrepone al tejido subcutáneo. Los investigadores han mostrado que la inyección de una vacuna dentro de la piel, y en particular en la dermis, estimula una respuesta inmune, la cual también puede estar asociada con varias ventajas adicionales. La vacunación intradermal con las vacunas descritas aquí forma una característica preferida de la presente invención. La técnica convencional de inyección intradermal, el "procedimiento mantoux", comprende pasos de limpieza de la piel, y luego estiramiento con una mano, y con el bisel de una aguja de calibre estrecho (calibre 26-31 ) mirando hacia arriba, la aguja se Inserta en un ángulo de entre 10-15 °. Una vez que el bisel de la aguja está insertado, la punta de la aguja se baja y se avanza adicional mente mientras que se provee una ligera presión para elevarlo bajo la piel. El líquido se inyecta entonces muy lentamente por lo tanto formando una ampolla o protuberancia en la superficie de la piel, seguido por el retiro lento de la aguja. Más recientemente, han sido descritos los dispositivos que han sido diseñados específicamente para administrar agentes líquidos dentro de o a través de la piel, por ejemplo los dispositivos descritos en WO 99/34850 y EP 1092444, también el dispositivo para inyección a chorro descrito por ejemplo en WO 01/13977; EUA 5, 480,381 , EUA 5, 599,302, EUA 5, 334, 144, EUA 5, 993, 412, EUA 5, 649, 912, EUA 5, 569, 189, EUA 5, 704, 911 , EUA 5, 383, 851 , EUA 5, 893, 397, EUA 5, 466, 220, EUA 5, 339, 163, EUA 5, 312, 335, EUA 5, 503, 627, EUA 5, 064, 413, EUA 5, 520, 639, EUA 4, 596, 556, EUA 4, 790, 824, EUA 4, 941 , 880, EUA 4, 940, 460, WO 97/37705 y WO 97/13537. Los métodos alternativos de administración intradermal de las preparaciones de vacuna pueden incluir jeringas y agujas convencionales, o dispositivo diseñados para administración balística de vacunas sólidas (WO 99/27961 ), o parches transdermales (WO 97/48440; WO 98/28037); o aplicadas a la superficie de la piel (administración transdermal o transcutánea WO 98/20734; WO 98/28037). Cuando las vacunas de la presente invención se van a administrar a la piel, o más específicamente dentro de la dermis, la vacuna está en un volumen pequeño de líquido, particularmente un volumen de entre aproximadamente 0.05 mi y 0.2 mi.

El contenido de antígenos en las vacunas para la piel o intradermales de la presente invención puede ser similar a las dosis convencionales como se encuentra en las vacunas intramusculares (véase a continuación). Sin embargo, es una característica de las vacunas para la piel o intradermales que las formulaciones puedan ser de "dosis baja". Por consiguiente, los antígenos de proteína en las vacunas de "dosis baja" preferiblemente están presentes en tan poco como 0.1 a 10 preferiblemente 0.1 a 5 µ? por dosis; y los antígenos de polisacárido (preferiblemente conjugados) pueden estar presentes en el intervalo de 0.01-1 y preferiblemente entre 0.01 a 0.5 9 de polisacárido por dosis. Como se utiliza en la presente invención, el término "administración intradermal" significa administración de la vacuna a la región de la dermis en la piel. Sin embargo, la vacuna no necesariamente estará localizada exclusivamente en la dermis. La dermis es la capa en la piel localizada entre aproximadamente 1.0 y aproximadamente 2.0 mm a partir de la superficie en la piel de humano, pero hay una cierta cantidad de variación entre los individuos y en diferentes partes del cuerpo. En general, se puede esperar alcanzar la dermis al localizarse a 1.5 mm por debajo de la superficie de la piel. La dermis se localiza entre el estrato córneo y la epidermis en la superficie y la capa subcutánea por debajo de ésta. Dependiendo del modo de administración, la vacuna puede localizarse finalmente solamente o principalmente dentro de la dermis, o puede ser distribuida finalmente dentro de la epidermis y la dermis.

La presente invención también contempla vacunas de combinación las cuales proveen protección en contra de un intervalo de diferentes patógenos. Muchas vacunas pediátricas actualmente se dan como vacunas de combinación para reducir el número de inyecciones que recibe el niño. Por lo tanto para las vacunas pediátricas, se pueden formular otros antígenos a partir de otros patógenos con las vacunas de la invención. Por ejemplo, las vacunas de la invención pueden ser formuladas con (o separadamente administradas pero al mismo tiempo) la vacuna de combinación "trivalente" bien conocida que comprende toxoide de difteria (DT), toxoide de tétanos (TT), y componentes de pertussis [típicamente toxoide de Pertussis detoxificado (PT), y hemaglutinina filamentosa (FHA) con pertactina opcional (PRN) y/o aglutinina 1 +2], por ejemplo la vacuna comercial INFANRIX-DTPa™ (SmithKIineBeecham Biologicals) la cual contiene antígenos de DT, TT, PT, FHA y PRN, o con un componente de pertussis de célula completa por ejemplo como el comercializado por SmithKIineBeecham Biologicals s.a., como Tritanrix™. La vacuna combinada también puede comprender otro antígeno, tal como antígeno de superficie de Hepatitis B (HBsAg), antígenos de virus de Polio (por ejemplo virus de polio trivalente inactivado - IPV), proteínas de la membrana externa de Moraxella catarrhalis, proteínas no-tipificadas de Haemophilus influenzae, proteínas de la membrana externa de N. meningitidis B. Los ejemplos de antígenos preferidos de proteína de Moraxella catarrhalis que pueden ser incluidos en una vacuna de combinación (especialmente para la prevención de otitis media) son: OMP106 [WO 97/41731 (Antex) y WO 96/34960 (PMC)]; OMP21 ; LbpA y/o LbpB [WO 98/55606 (PMC)]; TbpA y/o TbpB [WO 97/13785 y WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME, et al. (1993) Infecí. Immun. 61 : 2003-2010]; UspAI y/o UspA2 [WO 93/03761 (Universidad de Texas)]; OmpCD; HasR (PCT/EP 99/03824); PilQ (PCT/EP 99/03823); OMP85 (PCT/EP00/01468); Lipo06 (GB 9917977. 2); Iipo10 (GB 991828.1 ); lipo1 1 (GB 9918302.2); lipo18 (GB 9918038.2); P6 (PCT/EP99/03038); D15 (PCT/EP99/03822); Omp1A1 (PCT/EP99/06781 ); Hly3 (PCT/EP99/03257); y OmpE. Los ejemplos de antígenos no-tipificados de Haemophilus influenzae que pueden ser incluidos en una vacuna de combinación (especialmente para la prevención de otitis media) incluyen: protelna Fimbrina [(EUA 5766608 - Ohío State Research Foundation -Fundación para Investigación del Estado de Ohio)] y las fusiones que comprenden póptidos de la misma [por ejemplo, fusiones del péptido LB1 (f); EUA 5843464 (OSU) o WO 99/64067]; OMP26 [WO 97/01638 (Cortees)]; P6 [EP 281673 (Universidad Estatal de Nueva York)]; TbpA y/o TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmwl; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12641 ); protelna D (EP 594610); P2; y P5 (WO 94/26304). Otras combinaciones contempladas son la PS neumococal y la proteína de la invención en combinación con antígenos virales, por ejemplo, a partir de la influenza (fragmento atenuado o subunidad [por ejemplo, glucoproteínas de superficie tipo neuraminidasa (NA) y hemaglutinina (HA). Véase, por ejemplo, Chaloupka I. et al, Eur. Journal Clin. Microbiol. Infecí. Dis. 1996, 15: 121 -127], RSV (por ejemplo, antígenos F y G o fusiones F/G, véase, por ejemplo, Schmidt A. C. et al, J Virol, mayo 2001 , p 4594-4603), PIV3 (por ejemplo, proteínas HN y F, véase Schmidt et al. anteriormente mencionado), Varicela (por ejemplo, glucoprotelnas l-V atenuadas, etc.), y cualquier (o todos) componente(s) de MMR (sarampión, parotiditis, rubéola). Una vacuna de combinación pediátrica preferida contemplada por la presente invención a partir el tratamiento o prevención global de la otitis media comprende: uno o más antígeno(s) de polisacárldo de Streptococcus pneumoniae (preferiblemente conjugado a proteína D), o una o más proteínas neumococales seleccionadas a partir del grupo que consiste de: PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp125, Sp101 , Sp128, Sp130 y Sp133 (o un equivalente inmunológicamente funcional de las mismas), y uno o más antígenos expuestos en la superficie a partir de Moraxella catarrhalis y/o Haemophilus influenzae no-tipificada. La proteína D puede ser utilizada ventajosamente como una protelna vehículo para los polisacáridos neumococales para superar los problemas de supresión del epítope (como se mencionó anteriormente), y debido a que ésta misma es un inmunógeno capaz de producir protección mediada por célula B en contra de H. influenzae no tipificada (ntHi). Los antígenos de Moraxella catarrhalis y de Haemophilus influenzae no tipificados pueden ser incluidos en la vacuna en una forma de sub-unidad, o pueden ser añadidos como antígenos presentes sobre la superficie de las vesículas de la membrana externa (ampollas) elaboradas a partir de las bacterias.

Preferiblemente las composiciones antigénicas (y vacunas) descritas anteriormente en la presente invención son liofilizadas hasta que están listas para ser utilizadas, punto en el cual son reconstituidas extemporáneamente con diluyente. Más preferiblemente éstas son liofilizadas en la presencia de 3D-MPL, y son reconstituidas extemporáneamente con solución salina. Alternativamente, la proteína y polisacárido pueden ser almacenados separadamente en un equipo para vacunación (ya sea uno o ambos componentes estando liofilizados), los componentes siendo reconstituidos y ya sea mezclados antes de su uso o administrados separadamente al paciente. Un adyuvante Th1 (preferiblemente 3D-MPL) puede estar presente ya sea en uno o en ambos componentes. La liofilización de las vacunas se conoce bien en la técnica. Típicamente la vacuna líquida se seca mediante congelación en la presencia de un agente anti-formador de plasta por ejemplo azúcares tales como sacarosa o lactosa (presentes a una concentración inicial de 10-200 mg/mL). La liofilización ocurre típicamente durante una serie de pasos, por ejemplo un ciclo inicial a -69°C, gradualmente se ajusta a -24°C durante 3 horas, luego se retiene esta temperatura por 18 horas, y luego gradualmente se ajusta a -16°C durante 1 hora, luego se retiene esta temperatura por 6 horas, y luego gradualmente se ajusta a + 34 °C durante 3 horas, y finalmente se retiene esta temperatura durante 9 horas. La liofilización de las composiciones resulta en una composición más estable (por ejemplo previene la degradación de los antígenos de polisacárido). El proceso también es sorprendentemente responsable de un mayor título de anticuerpos en contra de los polisacáridos neumococales. Esto se ha mostrado que es particularmente significativo para los conjugados PS 6B. Otro aspecto de la invención por lo tanto es una composición antigénica liofilizada que comprende un conjugado PS 6B con un adyuvante 3D-MPL (preferiblemente carente de adyuvantes basados en aluminio) y una proteína neumococal selecciona a partir del grupo que consiste de: PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp125, Sp101 , Sp128, Sp130 y Sp133.

EJEMPLOS Los ejemplos ¡lustran, pero no limitan la invención.

EJEMPLO 1 Polisacárido capsular de S. pneumoniae La vacuna candidato 1 1-valente incluye los serotipos de polisacárido capsulares 1 , 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F los cuales se elaboraron esencialmente como se describió en EP 72513. Cada polisacárido se activa y se deriva utilizando química de CDAP (WO 95/08348) y se conjuga a la protelna vehículo. Todos los polisacáridos están conjugados en su forma nativa, excepto para el serotipo 3 (el cual fue de tamaño reducido para disminuir su viscosidad).

Protelna vehículo La proteína vehículo seleccionada es la proteína D recombinante (PD) a partir de Haemophilus influenzae no-tipificada, expresada en E. coli.

Expresión de la proteína D Proteína D de Haemophilus influenzae Construcción genética de la proteína D de expresión Materiales iniciales ADN que codifica la proteína D La proteína D está altamente conservada entre todos los serotipos y cepas no tipificadas de Haemophilus influenzae. El vector pHIC348 contiene la secuencia de ADN que codifica el gen completo de la proteína D como ha sido obtenido a partir del Dr. A. Forsgren, Departamento de Microbiología Módica, Universidad de Lund, Hospital General Malmó, MalmfJ, Suecia. La secuencia de ADN de la proteína D ha sido publicada por Janson et al. (1991 ) Infecí. Immun. 59: 1 19-125.

El vector de expresión pMG1 El vector de expresión pMgl es un derivado de pBR322 (Gross et al., 1985) en el cual se introdujeron los elementos control derivados del bacteriófago ? para la transcripción y traducción de genes insertados externos (Shatzman et al., 1983). Además, el gen de resistencia a Ampicilina se intercambió con el gen de resistencia a Canamicina.

La cepa AR58 de E. coli La cepa AR58 de E. coli se generó mediante la transduccíón de N99 con una solución de almacenamiento del fago P1 que se creció previamente en un derivado de SA500 (galE::TN10, lambdaKil- cl857 ??1 ). N99 y SA500 son cepas de E. coli K12 derivadas a partir del laboratorio del Dr. Martin Rosenberg en el National Institute of Health (Instituto Nacional de Salud).

El vector de expresión pMG1 Para la producción de la proteína D, el ADN que codifica la proteína ha sido clonado dentro del vector de expresión pMG1. Este plásmido utiliza señales a partir del ADN del fago lambda para dirigir la transcripción y traducción de los genes externos insertados. El vector contiene al promotor PL, al operador OL y dos sitios de utilización (NutL y NutR) para mitigar los efectos de polaridad transcripcional cuando se provee la proteína N (Gross et al., 1985). Los vectores que contienen el promotor PL, se introducen dentro de un hospedero lisogénico de E. coli para estabilizar el ADN plasmídico. Las cepas hospederas lisogénicas contienen ADN del fago lambda con defecto en la replicación integrado dentro del genoma (Shatzman et al., 1983). El ADN del fago lambda cromosomal dirige la síntesis de la proteína represora el la cual se une al represor OL del vector y previene la unión de la ARN polimerasa al promotor PL y por lo tanto previene la transcripción del gen insertado. El gen el de la cepa de expresión Ar58 contiene un muíante sensible a la temperatura de manera que la transcripción dirigida por PL puede ser regulada mediante un cambio de temperatura, por ejemplo, un incremento en la temperatura de cultivo inactiva al represor y se inicia la síntesis de la proteína externa. Este sistema de expresión permite la síntesis controlada de proteínas externas especialmente de aquellas que pueden ser tóxicas a la célula (Shimata y Rosenberg, 1981 ).

La cepa AR58 de E. coli La cepa lisogónica AR58 de E coli utilizada para la producción de la proteína D vehículo es un derivado de la cepa estándar NIH de E. coli K12 N99 (F- su- galK2, lacZ- thr-). Esta contiene un fago lambda lisogénico defectuoso (galE::TN10, lambdaKil- cl857 ??1). El fenotipo Kil- previene la detención de la síntesis macromolecular del hospedero. La mutación cl857 confiere una lesión sensible a temperatura del represor el. La deleción ??1 remueve el operón derecho del fago lambda y los loci bio, uvr3, y chIA de los hospederos. La cepa AR58 se generó mediante la transducción de N99 con una solución de almacenamiento del fago P1 crecido previamente en un derivado de SA500 (galE::TN10, lambdaKil- cl857 ??1 ). La introducción del lisógeno defectivo dentro de N99 se seleccionó con tetraciclina en virtud de la presencia de un transposón TN10 que codifica para la resistencia a tetraciclina en el gen galE adyacente.

Construcción del vector pMG DPPrD El vector pMG1 el cual contiene el gen que codifica la proteína S1 no estructural del virus de Influenza (pMGNSI) se utilizó para construir a pMGMDPPrD. El gen de la proteína D se amplificó mediante PCR a partir del vector pHIC348 (Janson et al. 1991 ) con los iniciadores de PCR que contenían los sitios de restricción para Ncol y Xbal en los extremos 5' y 3', respectivamente. El fragmento Ncol/Xbal introdujo entonces dentro de pMGNSI entre Ncol y Xbal creando entonces una proteína de fusión que contenía los 81 aminoácidos N-terminales de la protelna NS1 seguidos por la proteína PD. Este vector se marcó como pMGNSI PrD. Basándose en la construcción descrita anteriormente se generó la construcción final para la proteína D de expresión. Un fragmento BamHI/BamHI se removió partir de pMGNSI PrD. Esta hidrólisis del ADN remueve la región codificante de NS1 , excepto por los primeros tres residuos N-terminales. Después de la re-ligación del vector se ha generado un gen que codifica una proteína de fusión con la siguiente secuencia de aminoácidos N-terminales: MDP SSHSSNMANT NS1 Proteína D La proteína D no contiene un péptido líder o la cisteína N-terminal a los cuales las cadenas lipídicas normalmente están unidas. La proteína por lo tanto no es ni excretada hacia el periplasma ni enviada hacia los lípidos y permanece en el citoplasma en una forma soluble. La construcción final pMG-MDPPrD se introdujo dentro de la cepa hospedera AR58 mediante choque calórico a 37°C. Los plásmidos que contienen la bacteria se seleccionaron en la presencia de canamicina. La presencia del Inserto de ADN que codifica la proteína D se demostró mediante la digestión del ADN aislado del plásmido con endonucleasas seleccionadas. La cepa recombinante de E. coli se refiere como ECD4. La expresión de la proteína D está bajo el control del promotor lambda Pi./operador 0L. La cepa hospedera Ar58 contiene un gen el sensible a la temperatura en el genoma que bloquea la expresión a partir del P|_ lambda a una baja temperatura mediante la unión a Ou. Una vez que la temperatura se eleva, el se libera a partir del 0L y la proteína D se expresa. Al término de la fermentación, las células se concentran y se congelan. La extracción a partir de células cosechadas y la purificación de la proteína D se llevó a cabo como sigue. El concentrado de cultivo de células congeladas se descongeló y se resuspendió en una solución para rompimiento de células (regulador de pH de citrato a pH 6.0) a una DOeso = 60. La suspensión se pasa dos veces a través de un homogeneizador a alta presión a P = 1000 bar. El homogeneizado del cultivo celular se clarifica mediante centrifugación y los desechos celulares se remueve por filtración. En el primer paso de purificación el lisado filtrado se aplica a una columna de cromatografía de intercambio catiónico (SP Sefarosa de Flujo Rápido). PD se une a la matriz del gel mediante interacción iónica y se eluye mediante un paso que incrementa la fuerza iónica del regulador de pH para elución. En un segundo paso de purificación las impurezas se retienen sobre una matriz de intercambio aniónico (Q Sefarosa de Flujo Rápido). PD no se une al gel y puede ser recolectada en el flujo que pasa través de la columna. En ambos pasos de cromatografía de columna la recolección de la fracción se monitorea mediante DO. El flujo a través de la columna de la cromatografía en columna de Intercambio aniónico que contiene la proteína D purificada se concentra mediante ultrafiltración. La fracción retenida por ultrafiltración que contiene a la proteína D se pasa finalmente a través de una membrana de 0.2 µ?t?.

Química Activación y acoplamiento químico Las condiciones de activación y acoplamiento son específicas para cada polisacárido. Estas se dan en el cuadro 1. El polisacárido nativo (excepto para PS3) se disolvió en NaCI 2M o en agua para inyección. La concentración óptima del polisacárido se evaluó para todos los serotipos.

A partir de una solución de almacenamiento de 100 mg/ml en acetonitrilo, se añadió CDAP (relación CDAP/PS 0.75 mg/mg de PS) a la solución de polisacárido. 1.5 minutos después, se añadió trietilamina 0.2 M para obtener el pH de activación específica. La activación del polisacárido se llevó a cabo a este pH durante 2 minutos a 25°C. La proteína D (la cantidad depende de la relación inicial PS/PD) se añadió al polisacárido activado y se llevó a cabo la reacción de acoplamiento al pH específico por 1 hora. La reacción se detuvo posteriormente con glicina por 30 minutos a 25°C y se incubó durante toda la noche a 4°C. Los conjugados se purificaron mediante filtración en gel utilizando una columna para filtración en gel de Sefacril 500 HR equilibrada con NaCI 0.2 M. Se determinó el contenido de carbohidrato y de protefna de las fracciones eluldas. Los conjugados se agruparon y se filtraron de manera estéril en una membrana esterilizante de 0.22 µ?t?. Se determinaron las relaciones PS/Proteína en las preparaciones de conjugados.

Caracterización: Cada conjugado se caracterizó y alcanzó las especificaciones descritas en el cuadro 2. El contenido de polisacárido ^g/ml) se midió mediante la prueba de Resorcinol y el contenido de proteína ^g/ml) mediante la prueba de Lowry. La relación final PS/PD (p/p) se determinó mediante la relación de las concentraciones.

Contenido residual de DMAP (ng/µa de PS): La activación del polisacárido con CDAP introduce un grupo cianato en el polisacárido y se libera DMAP (4-dimetilamino-piridina). El contenido residual de DMAP se determinó mediante un ensayo específico desarrollado en SB.

Contenido de polisacárido libre (%): El contenido de polisacárido libre de los conjugados mantenidos a 4°C o almacenados 7 días a 37°C se determinó en el sobrenadante obtenido después de la incubación con anticuerpos a-PD y sulfato de amonio saturado, seguido por una centrifugación. Un ELISA a-PS/ -PS se utilizó para la cuantificación de los polisacáridos libres en el sobrenadante. La ausencia de conjugado también se controló mediante un ELISA a-PD/a-PS. La reducción de la cantidad del polisacárido libre resulta en una vacuna conjugada mejorada.

Antigenicldad: La antigenicidad en los mismos conjugados se analizó en un ELISA tipo intercalado en donde los anticuerpos de captura y detección fueron a-PS y a-PD, respectivamente.

Contenido de proteína libre (%): El nivel de proteína D residual "libre" se determinó mediante el uso de un método con tratamiento con SDS de la muestra. El conjugado se calentó durante 10 minutos a 100°C en presencia de SDS al 0.1 % y se inyectó en una columna para filtración en gel de SEC-HPLC (TSK 3000-PWXL). Puesto que la proteína D es un dímero, hay un riesgo de sobreestimación del nivel de proteína D "libre" debido a la disociación de la estructura con SDS.

Tamaño molecular (Kav): El tamaño molecular se llevó a cabo en una columna para filtración en gel SEC-HPLC (TSK 3000-PWXL).

Estabilidad: La estabilidad se midió en una columna para filtración en gel de HPLC-SEC (TSK 6000-PWXL) para los conjugados mantenidos a 4°C y almacenados por 7 días a 37°C. La caracterización 1 1-valente se da en la tabla 2. Los conjugados de proteína pueden ser adsorbidos sobre el fosfato de aluminio y agrupados para formar la vacuna final.

Conclusión: Los conjugados inmunogónicos han sido producidos, los cuales han mostrado ser componentes de una vacuna prometedora. Las condiciones optimizadas del CDAP para el mejor producto con calidad final de polisacárido neumococal conjugado se descubrió para cada una de las 1 1 valencias.

CUADRO 1 Activación específica/acoplamiento/condlciones de eliminación de los CUADRO 2 Especificaciones de la vacuna PS-PD neumococal 11 -valente (los primeros números del código del lote indican el serotipo) EJEMPLO 2 Impacto benéfico de la adición de una o más de las proteínas neumococales de la Invención +/+ 3D-MPL sobre la efectividad protectora de la vacuna de pollsacárido 11-valent9 conjugado a PD en contra de la colonización de pulmón por neumococos en ratones Lecturas inmunolóqicas ELISA de la dosis del suero IgG específico de la proteína neumococal Las inmunoplacas Nunc Maxisorp se revistieron por 2 horas a 37°C con 100 µg pozo de 2 µg/ml de proteína diluida en PBS. Las placas se lavaron 3 veces con regulador de pH de NaCI 0.9% - Tween 20 al 0.05%. Luego, se añadieron diluciones seriales duplicadas (en PBS/Tween-20 al 0.05%, 100 µ? por pozo) de un suero anti-proteína de referencia como una curva estándar (iniciando a 670 ng/ml de IgG) y las muestras de suero (iniciando a una dilución 1/10) se incubaron por 30 minutos a 20°C bajo agitación. Después de lavar como se describió previamente, IgG de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa (Jakson) diluida 5000x en PBS/Tween-20 al 0.05% se incubó (100 µ?/????) por 30 minutos a 20°C bajo agitación. Después de lavar, las placas se incubaron por 15 minutos a temperatura ambiente con 100 µ?/???? de regulador de pH para revelación (OPDA 0.4 mg/ml y H202 al 0.05% en regulador de pH de citrato 100 mM pH 4.5). La revelación se detuvo mediante la adición de 50 µ?/???? de HCL 1 N. Las densidades ópticas se leyeron a 490 y 620 nm mediante el uso del inmunolector Emax (Molecular Devices). El titulo de anticuerpos se calculó por el método matemático paramótrico 4 utilizando el software SoftMaxPro.

Ensayo de Opsonofaqocitosis El propósito de este ensayo es medir de manera reproducible la capacidad de opsonización de las muestras de suero prueba en contra de los serotipos 1 , 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F o 23F de Stmptococcus penumoniae utilizando un método adaptado a partir del método estándar publicado del CDC (Steiner et al. Clinical and Diagnostic Laboratory lmmunology 4: 415. 1997). Este ensayo reproduce in vitro lo que ocurre in vivo como el mecanismo primario para eliminar a Stmptococcus pneumoniae o neumococos invasores. Esto es, la opsonización de los neumococos seguida por fagocitosis y luego eliminación. La "fagocitosis" es el proceso por medio del cual las células engloban el material y lo contienen dentro de una vacuola (fagosoma) en el citoplasma. Los neumococos son eliminados cuando son fagocitados por fagocitos de mamífero saludables. La "opsonización" es el proceso por medio del cual se facilita la fagocitosis mediante la depositación de opsoninas, por ejemplo anticuerpo y complemento, en el antígeno.

Han habido numerosos ensayos opsonofagoclticos reportados en la literatura. El método estandarizado del CDC se evaluó en una instalación de laboratorio múltiple (Steiner et al., ICAAC, septiembre 16-20, 2000, Toronto). Este último ensayo se adaptó a SB puesto que provee una base para la comparación con otros laboratorios, utiliza reactivos y controles que generalmente están disponibles, y expresa los resultados como el título (dilución) del suero capaz de facilitar la eliminación de 50% de los neumococos viables, una unidad que comúnmente se utiliza para este tipo de ensayos. De hecho, se ha mostrado que el ensayo adaptado puede generar resultados que se corresponden bastante bien con los otros cuatro laboratorios (Steiner et al., ICAAC, septiembre 16-20, 2000, Toronto). La célula fagocítica utilizada en el ensayo es la línea celular HL60, la cual se origina a partir de un individuo con leucemia polimielocítica y se estableció como una línea celular continua por Collins et al. en 1977 (Nature 270: 347-9). Esta línea celular está compuesta de células hematopoiéticas no diferenciadas, es decir 85% de células tipo blastos y polimielocitos, 6% de mielocitos y 9% de células diferenciadas. Los compuestos polares pueden inducir la diferenciación de las células hacia al menos dos linajes diferentes. ?,?-dimetilformamida induce la diferenciación granulocítica la cual produce células similares a células polimorfonucleares (44% de mielocitos y metamielocitos y 53% de PMNs bandeados y segmentados).

En la versión A2 del ensayo, el suero a ser evaluado se inactiva mediante calor y se elaboran 8 diluciones seriales dobles iniciando a 1/4 en microplacas de 96 pozos en medio HBSS que contiene 0.3% de BSA. El volumen final del suero diluido en cada pozo es de 25 µ?. Cuatro volúmenes de células HL60 a 107 células/ml (5 ó 6 días después de la diferenciación con dimetilformamida), dos volúmenes de bacterias S. pneumoniae (a la dilución apropiada) y 1 volumen de complemento de cría de conejo se mezclan justo antes de su uso, y se añaden 25 µ? de la mezcla a cada pozo de la microplaca de 96 pozos que contiene el suero diluido. Para los serotipos 1 , y 6B, la cantidad de complemento se incrementó hasta 12.5% de la concentración final, dando la versión A3 del ensayo. Después de dos horas de incubación a 37°C bajo agitación orbital, la placa se coloca sobre hielo con el objeto de detener la reacción de opsonofagocitosis. Se realiza un estimado de las unidades formadoras de colonias (CFU) en cada pozo mediante la incubación durante toda la noche a 37°C. El "titulo opsónico" (OT) se definió como la dilución reciproca del suero capaz de reducir al menos 50% del número de bacterias de S. pneumoniae en los pozos (es decir, eliminación de 50%). El % de eliminación se calculó mediante la siguiente fórmula: % de eliminación = (media de CFU de los pozos control - muestra de CFU)/medio de CFU de los pozos control x 100 Prueba intranasal neumococal en ratones OF1 Ratonas OF1 de siete semanas de edad se inocularon ¡ntranasalmente bajo anestesia con 5.105 CFU de serotipo 2, 4 o 6B de S. pneumoniae adaptado para ratón. Los pulmones se removieron a las 6 horas después de la prueba y se homogeneizaron (Ultramax, 24000 rpm, 4°C) en medio de caldo de Todd Hewith (THB, Gibco). Diluciones seriales de 10 veces de los homogeneizados del pulmón se sembraron durante toda la noche a 37°C sobre cajas de Petri que contenían agar THB suplementado con extracto de levadura. La infección pulmonar neumococal se determinó como el número de CFU/ratón, expresado como un promedio de peso logarítmico. El límite de detección es 2.14 log de CFU/ratón.

EJEMPLO 2A Efecto del adyuvante 3D-MPL sobre la respuesta Inmune antl-proteína En el presente ejemplo, los inventores pudieron evaluar el impacto del uso del adyuvante 3D-MPL sobre la respuesta inmune a la proteína de la Invención.

Grupos de 10 ratonas Balb/c de 6 semanas de edad se inmunizaron intramuscularmente a los días 0, 14 y 21 con 1 µg de la proteína contenida ya sea en A: AIP04 100 µ?; o B: AIP04 100 µ9 + 5 µ9 de 3D-MPL (3 de-O-acetilado monofosforil lípido A, abastecido por Ribi Immunochem). El ELISA a IgG se midió en suero post-lll. Cualquiera que haya sido el antígeno, se pueden mostrar que las mejores respuestas inmunes se indujeron en animales vacunados con formulaciones suplementadas con 3D-MPL.

EJEMPLO 2B Impacto benéfico de la adición de una proteína de la Invención +/- adyuvante 3D-MPL sobre la efectividad protectora de la vacuna de pollsacárldo 11-valente conjugado a PD en contra de la colonización neumococal del pulmón en ratones OF1 probados intranasalmente con serotlpo 2. 4 o 6B.

En el presente ejemplo, los inventores pudieron evaluar la eficiencia profiláctica de una vacuna que contiene el conjugado polisacárido 11 -valente/proteína D, una proteína de la invención y adyuvantes AIP04 + 3D-MPL, en comparación con la formulación de conjugado polisacárido 11-valente adsorbido con AIP04 - proteína D. Grupos de 12 ratonas OF1 de cuatro semanas de edad se inmunizaron subcutáneamente a los días 0 y 14 con formulaciones que contienen A: 50 µ9 de AIP04; B: 0.1 µ de PS/serot¡po de vacuna de polisacárido 1 1-valente conjugado con PD + 10 µg de la proteína de la invención + 50 µg de AIP04 + 5 µg de 3D-MPL (abastecido por Ribi Immunochem). La prueba se realizó al día 21 como se describió anteriormente. Como se puede observar mediante este método, se confiere una protección significativa por la vacuna de polisacárido conjugado 11 -valente con la proteína de la invención y con adyuvantes tipo AIP04 + MPL. Por el contrario, no se observó protección significativa en los animales inmunizados con la formulación del polisacárido conjugado 1 1 -valente / AIP04. Este resultado puede probar que la adición de la proteína de la invención y del adyuvante 3D-MPL mejora la efectividad de la vacuna del polisacárido conjugado 1 1-valente en contra de la neumonía.

EJEMPLO 2C La respuesta inmune se correlaciona con la protección mostrada en el ejemplo 2B Con el objeto de establecer que la respuesta inmune se correlaciona con la protección conferida en el ejemplo 2B, por la vacuna de polisacárido conjugado 1 1 -valente suplementada con una proteína de la invención y 3D-MPL, se puede medir la pre-prueba de las respuestas del anticuerpo serológico al polisacárido 2, 4 ó 6B, y la protefna de la invención puede ser medida como se describió anteriormente. Los títulos del anticuerpo se comparan entonces con los números de colonias de bacterias medidas en los pulmones de los animales correspondientes recolectados a las 6 horas después de la prueba. La R2 se calcula sobre regresiones lineales Log/Log. La R2 calculada puede mostrar la ausencia de correlación entre las respuestas inmunes humorales y la protección para ambos antígenos. Los títulos de anticuerpo anti-6B (o2 ó 4) no son significativamente diferentes en los grupos inmunizados con la vacuna conjugada 1 1-valente o con la misma vacuna suplementada con la proteína de la invención y 3D-MPL. Por lo tanto, la mejoría en protección observada con la formulación C no se debe solamente a una mayor respuesta del anticuerpo al polisacárido 6B (o 2 ó 4). Tomándolos juntos, estos resultados pueden sugerir que la protección no se media por la respuesta inmune humoral sola, sino que más bien también mediante una inmunidad mediada por células inducida por el antígeno de proteína (preferiblemente en la presencia de 3D-MPL). Esto puede dar un apoyo adicional a la adición del antígeno(s) de la proteína y adyuvante(s) potente en la vacuna de polisacárido neumococal conjugado, de manera que coordine ambos brazos del sistema inmune para una protección óptima.

EJEMPLO 3 Cooperación de ambos brazos del sistema Inmune en los ratones inmunizados activamente con una proteína de la Invención e Inmunizados pasivamente con anticuerpos en contra de PS neumococal EJEMPLO 3A Hallazgo de la concentración del anticuerpo antl-pollsacárldo-6B (anti- PS) administrado pasivamente que protege en contra de la neumonía Método Grupos de vacuna: Cuatro grupos de 16 ratones se inmunizaron pasivamente (i.p.) al día -1 con 100 µ? de antisuero anti-polisacárido de rata no diluido de conformidad con los grupos detallados a continuación. (Total de 64 ratones) Animales: 64 ratones CD-1 a partir de Charles River, Canadá, que pesan aproximadamente 35g (aproximadamente de 10 semanas de edad). Anestesia: Los ratones se anestesiaron con isoflurano (3%) más 02 (1 Uminuto).

Organismo: S. pneumoniae N1387 (serotipo 6) se cosechó a partir de placas de agar con tripticasa de soya (TSA) suplementado con 5% de sangre de caballo suspendido en 6 mi de PBS. Inmediatamente después de la infección, 1 mi de la suspensión bacteriana se diluyó hacia 9 mi de agar con nutrientes fundido en frío (BBL) y se mantuvieron a 41 °C. Los ratones recibieron aproximadamente 6.0 Iog10 cfu/ratón en un volumen de 50 ul. Infección: Al día 0 los ratones se anestesiaron como se describió anteriormente y se infectaron con S. peumoniae N1387 (50 µ? de suspensión bacteriana enfriada) mediante instilación intra-bronquial vía una intubación intratraqueal no quirúrgica. Este método se describió por Woodnut y Berry (Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43: 29 (1999)). Muestras: Al día 3 post infección, 8 ratones/grupo se sacrificaron mediante una sobredosis de CO2 y los pulmones se retiraron y se homogeneizaron en 1 mi de PBS. Diluciones seriales de diez veces se prepararon en PBS para enumerar los números de bacterias viables. Las muestras se inocularon (20 µ?) en triplicado sobre las placas TSA suplementadas con 5% de sangre de caballo y se incubaron durante toda la noche a 37°C antes de su evaluación. Las series adicionales de ratones se sacrificaron al día 7 y se muestrearon como se mencionó anteriormente.

Resultados: Figuras en paréntesis son números de animales que murieron antes del tiempo de muestreado. Conclusiones: En general, no hubo diferencia significativa en los números de bacterias aisladas a partir de cualesquiera de los grupos de tratamiento. Esto indica que se alcanzó una protección no medible por el anticuerpo anti-polisacárido a las concentraciones de hasta y que incluyen 5 µg/ml. Esto es similar a lo que se observó en algunos ensayos clínicos en humanos, es decir, el anticuerpo anti-polisacárido es insuficiente para proteger en contra de la neumonía neumococal en algunas poblaciones.

EJEMPLO 3B Determinación de la protección a partir de la neumonía provista por la administración activa de una proteína de la invención con o sin adyuvante, y sinergia con anticuerpo anti-PS sub-óptlmo M todo Animales: 128 ratones CD-1 (de 6 semanas de edad en el momento de la inmunización, 10 semanas de edad en el momento de la infección) a partir de Charles River, St. Constant, Quebec, Canadá. Los animales pesaron aproximadamente 20 gm a las 6 semanas y 38 gm a las 10 semanas. Inmunizaciones: Seis grupos de 16 ratones se inmunizaron mediante inyección subcutánea a los días -22 y -14 con 100 ul de la vacuna como se describió anteriormente. (Un total de 128 ratones). 3D-MPL se obtuvo a partir de Ribi/Corlxa. Al día -1 , se inmunizaron grupos específicos (véase cuadro a continuación) (i.p. 100 µ?) pasivamente con una concentración de 4.26 g/ml (4 mi de 5 µg/ml + 1.3 mi de 2 µg/ml) de anticuerpo anti-polisacárido de ratón.

Infección: Al día 0, los ratones se anestesiaron (3% de ¡soflurano más 1 L/min de 02). El ¡nóculo bacteriano se preparó mediante la cosecha en crecimiento de S. pneumoniae N1387 (serotipo 6) a partir de placas de agar de tripticasa de soya (TSA) y suplementadas con 5% de sangre de caballo y suspendidas en 6 mi de PBS. Una dilución de diez veces (1 mi más 9 mi) se preparó en agar de nutrientes fundido en frío (mantenido a 41 °C) inmediatamente antes de la infección. Los ratones se infectaron mediante instilación intra-bronquial vía intubación intra-traqueal y recibieron aproximadamente 6.0 Iog10 cfu/ratón en un volumen de 50 µ?. Este método se describió por Woodnut y Berry (Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43: 29 (1999)). Muestras: A las 72 horas post infección, 8 ratones/grupo se sacrificaron mediante sobredosis de CO2 y los pulmones se retiraron y se homogeneizaron en 1 mi de PBS. Diluciones seriales de diez veces se prepararon en PBS para enumerar los números de bacterias viables. Las muestras se inocularon (20 µ?) en triplicado sobre las placas TSA suplementadas con 5% de sangre de caballo y se incubaron durante toda la noche a 37°C antes de su evaluación. Las series adicionales de ratones se sacrificaron al día 8 post-infección y se muestrearon como se mencionó anteriormente.

Análisis de datos La medición resultante para comparación del tratamiento es el número de bacterias en los pulmones a los 3 y 7 días post-infección. Los resultados pueden ser presentados como medias de los grupos con desviaciones estándares. El análisis estadístico debe llevarse a cabo utilizando la prueba t de Student en donde un valor P de <0.05 se considera significativo. Como se demostró anteriormente, el anticuerpo anti-polisacáridos solo (grupo 1-5) puede mostrarse que no provee protección en contra del crecimiento de neumococos en el pulmón. La proteína neumococal con adyuvante AIP04 (grupo 1-1 ) puede no conseguir protección tampoco, pero tendrá un mejor grado cuando la proteína P se combina con 3D-MPL (grupo 1-2). La protección más significativa puede observarse en los grupos tanto con anticuerpo anti-polisacáridos como con proteína, particularmente del grupo que tiene los tres elementos, Proteína, 3D-MPL y anticuerpo anti-polisacáridos administrado pasivamente (grupo 1 -4). Esta conclusión también puede apoyarse por la tasa de mortalidad. Los grupos 1 -3 y, particularmente, 1-4 tendrán menos muertes en comparación con los otros grupos.

Conclusión: Puesto que el experimento se realizó con animales pasivamente inmunizados, el efecto sinergístico de los también inmunizados activamente con protelna (+/- MPL) no puede deberse a un incremento en el nivel de los anticuerpos en contra del antígeno polisacárido. La protección significativa en contra de la neumonía neumococal también puede observarse en grupos inmunizados tanto con la proteína más anticuerpo anti-polisacárido administrado pasivamente, particularmente si también está presente 3D-MPL, indicando la sinergia de esta combinación. Si la inmunización con anti-polisacárido se lleva a cabo activamente (preferiblemente con polisacárido conjugado), este efecto será incluso más marcado, puesto que el efecto de la célula B de memoria, y los niveles constantes de anticuerpo anti-PS a lo largo del experimento contribuirán a la cooperación de la respuesta inmune.

EJEMPLO 4 Método para determinar sinergia mediante correlación de protección El mecanismo principal de la protección que el cuerpo humano utiliza para eliminar neumococos infecciosos es la opsonofagocitosis mediada por anticuerpo (Bruyn et al., Clin. Infecí. Dis. 14: 251 (1992)). Mientras que varios métodos de ELISA han sido desarrollados para medir la concentración del anticuerpo al polisacárido capsular como una correlación de protección, ha sido evidente que el ensayo de opsonofagocitosis ¡n vitro es una mejor correlación de la protección (Musher et al., J. Infecí. Dis. 182: 158 (2000)). Las proteínas neumococales de la invención proveen protección en contra de infección neumococal mediante mecanismos que son diferentes a partir de la opsonofagocitosis mediada por anticuerpo. En el ejemplo 2, la inmunización activa tanto con conjugado como con proteína puede mostrar un efecto sinérgico, el cual no puede ser explicado por las diferencias en la concentración del anticuerpo puesto que éstas son las mismas en ambos grupos. Por lo tanto, la protección residual que puede observarse debe venir a partir de un efecto sinergístico. De manera similar, puesto que el anticuerpo se añade pasivamente, se puede alcanzar la misma conclusión en el ejemplo 3. En muchos casos, las proteínas neumococales de la invención son proteínas asociadas a superficie, y se espera que provean alguna actividad opsónica por sí mismas. En este caso, es posible distinguir el mecanismo de protección vía una medición cuantitativa de la capacidad opsonizante del anticuerpo anti-proteína neumococal, el cual puede ser utilizado para estimar la contribución relativa de actividad opsónica a otros mecanismos sinergeicos de protección. En el modelo de colonización de pulmón de ratón, la protección relativa de cada vacuna puede ser estimada a partir de la eliminación de bacterias a partir de los pulmones. O alternativamente, la eficiencia de la vacuna puede ser estimada a partir de las relaciones de los casos, como normalmente se determina para las vacunas. % de protección = (CFU/control en pulmón - CFU/vacuna en pulmón)/(CFU/control de pulmón) % de eficiencia = (casos control -casos de vacuna)/(casos control) Para determinar la porción de la protección o eficiencia que se origina a partir del efecto sinergístico, es un asunto de determinar qué porción de la eficiencia podría ser esperada basándose la relación de los títulos opsónicos. En el ejemplo 3, el % de protección por la combinación se debe a la sinergia entre los componentes de proteína/anticuerpo puesto que ni la protetna ni el anticuerpo anti-polisacárido pueden proveer solos una gran protección por si mismos. Es posible estimar la cantidad de protección del efecto sinórgico con base en la actividad opsónica relativa. Si la actividad opsónica provista por un anticuerpo anti-polisacárido capsular es X, y la actividad opsónica provista por el anticuerpo anti-proteína neumococal es Y, entonces la actividad opsónica total puede mostrarse que es X + Y, y la porción relativa del actividad opsónica de la proteína podría ser Y/X+Y. Esto se compara con la eficiencia protectora relativa de una vacuna, en donde la porción anti-polisacárido de la vacuna provee un eficiencia protectora de A%, y la eficiencia protectora de la vacuna del polisacárido más proteína es B%. La eficiencia adicional que no puede ser contada por actividad opsónica se estima entonces como la actividad protectora residual (sinergia) = B% - A% -B%* (Y/X+Y) Este ejemplo no se pretende que limite los modos para estimar el efecto de la sinergia. Una vez que otras correlaciones de protección han sido identificadas, éstas podrían ser utilizadas para estimar este efecto sinergístico. Todas las publicaciones, incluyendo pero no limitadas a las patentes y solicitudes de patente, citadas en esta especificación se incorporan aquí como referencia como si cada publicación individual estuviera indicada específica e individualmente a ser incorporada como referencia aquí como si se estableciera completamente.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Una composición inmunogénica que comprende al menos un antígeno polisacárido de Streptococcus pneumoniae y al menos un antígeno de proteína de Streptococcus pneumoniae seleccionada a partir del grupo que consiste de: PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp125, Sp101 , Sp128, Sp130 y Sp133, o equivalente inmunológicamente funcional de las mismas.

2. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el antígeno de polisacárido está presente en la forma de un conjugado de polisacárido -protelna vehículo.

3. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque la proteína vehículo se selecciona a partir del grupo que consiste de: toxoides de difteria, toxoide de tétanos, CRM197, hemocianina de lapa Keyhole (KLH), proteína derivada de tuberculina (PPD), y proteína D a partir de H. influenzae.

4. - La composición inmunogénica de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada además porque la vacuna comprende al menos cuatro antígenos de polisacárido neumococal a partir de diferentes serotipos.

5. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque comprende adicionalmente un adyuvante.

6. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque el adyuvante comprende una sal de aluminio.

7. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque el adyuvante es un inductor preferencial de una respuesta Th1.

8.- La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque el adyuvante comprende al menos uno de los siguientes: 3D- PL, una saponina inmunoestimulante, o un oligonucleótido CpG inmunoestimulante.

9. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque el adyuvante comprende un vehículo seleccionado a partir del grupo que consiste de: una emulsión aceite en agua, liposomas, y una sal de aluminio.

10. - La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para uso como un medicamento.

11.- Una vacuna que comprende la composición inmunogénica de conformidad con las reivindicaciones 1-9.

12.- El uso de un antígeno de polisacárido neumococal en combinación con un antígeno de proteína de Stmptococcus pneumoniae seleccionado a partir del grupo que consiste de PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp125, Sp101 , Sp128, Sp130 y Sp133, y opcionalmente un adyuvante inductor de Th1 , en la elaboración de medicamento para la prevención o tratamiento de neumonía en pacientes mayores de 55 años de edad.

13. - El uso de un antígeno de polisacárido neumococal en combinación con un antígeno de proteína de Streptococcus pneumoniae seleccionado a partir del grupo que consiste de PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp125, Sp101 , Sp128, Sp130 y Sp133, y opcionalmente un adyuvante inductor de Th1 , en la elaboración de medicamento para la prevención o tratamiento de otitis media en infantes o niños.

14. - Un método para elaborar una composición inmunogénica como se reclama aquí, que comprende los pasos de: seleccionar uno o más anttgeno(s) de polisacárido neumococal; seleccionar uno o más antígeno(s) de proteína neumococal a partir del grupo que consiste de PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp125, Sp101 , Sp128, Sp130 y Sp133; y mezclar dichos antlgenos de polisacárido y de proteína con un excipiente adecuado.