CN1477970A - 疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细菌多糖抗原疫苗领域。具体是，本发明涉及包含肺炎球菌多糖抗原并任选包含Th1诱导型佐剂的疫苗，所述多糖抗原主要是肺炎链球菌的肺炎球菌多糖偶联物抗原，其选自：PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133。

Description

疫苗
发明领域
本发明涉及细菌多糖抗原疫苗，其制备以及这种多糖在医学中的应用。
具体地，本发明涉及包含肺炎球菌多糖抗原并任选包含Th1诱导型佐剂的疫苗，所述多糖抗原通常是肺炎球菌多糖偶联物抗原，与肺炎链球菌蛋白抗原一起配制。
发明背景
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是革兰氏阳性细菌，由其所致的发病率和死亡率相当高(尤其是在年幼和年迈群体中)。该细菌可导致侵袭性疾病如肺炎，菌血症和脑膜炎，以及与菌群定居(colonization)有关的疾病，如急性中耳炎。在美国60岁以上的人中，肺炎球菌性肺炎的发病率估计是每100,000人中约3到8例。有20％的病例可导致菌血症和其它的表现如脑膜炎，即使在抗菌素治疗的情况下其死亡率也接近30％。
肺炎球菌由化学连接的多糖包裹，所述多糖赋予了该细菌的血清型特异性。肺炎球菌有90种已知血清型，而荚膜是决定其毒力的主要物质，因为荚膜不但可以保护细菌的内表面不受补体的影响，而且其本身的免疫原性极弱。多糖是T非依赖性抗原，不能被加工或在MHC分子上呈递，从而不能与T细胞相互作用。然而，它们通过另一机制刺激免疫系统，所述机制涉及B细胞表面受体的交联。
多项试验已显示，抗御侵袭性肺炎疾病的保护作用与荚膜的特异性抗体极为相关，且所述保护是血清型特异性的。
以多糖抗原为基础的疫苗是本领域熟知的。有四种已获批准用于人类，包括伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)的Vi多糖，流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)的PRP多糖，四价脑膜炎球菌疫苗(由血清型A，C，W135和Y构成)，以及23价肺炎球菌疫苗(由对应于血清型1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19A，19F，20，22F，23F，和33的多糖组成，占肺炎球菌血分离物的至少90％)。
后三种疫苗针对在儿童中引起极高发病率和死亡率的呼吸道感染细菌提供对机体的保护作用，然而这些疫苗还没有被批准用于2岁以下的儿童，因为其免疫原性对该年龄组而言不足[Peltola er al.(1984)，N.Engl.J.Med.310：1561-1566]。肺炎链球菌是婴幼儿和年幼儿童中侵袭性细菌疾病和中耳炎的最常见的原因。同样，老年人对肺炎球菌疫苗的应答较弱[Roghmann etal.，(1987)，J.Gerontol.42：265-270]，因此，在该群体中细菌性肺炎的发病率增加[Verghese and Berk，(1983)Medicine(Baltimore)62：271-285]。
已设计出解决婴幼儿中上述免疫原性缺乏的策略，包括将多糖与大的免疫原性蛋白连接，以提供对T细胞的旁路辅助，并诱导针对所偶联的多糖抗原的免疫记忆。目前，正在对肺炎球菌糖蛋白偶联物疫苗在各个年龄组中的安全性，免疫原性和效力进行评估。
已知23价非偶联肺炎球菌疫苗的临床疗效差异较大，从0％到81％不等(Fedson et al.(1994)Arch Intern Med.154；2531-2535)。所述效力似乎与正接受免疫的危险人群相关，如老年人，Hodgkin’s患者，脾切除者，镰刀型细胞病(sickle cell disease)和无丙种球蛋白血症(agammaglobulinemics)患者(Fine et al.(1994)Arch Intem Med.154：2666-2677)，还与疾病的表现有关。23价疫苗没有显示出针对肺炎球菌性肺炎(在某些高危人群如老年人中)和中耳炎疾病的保护作用。
因此需要改进的肺炎球菌疫苗组合物，尤其是那些能更有效地预防或缓解老年人和儿童的肺炎球菌病的疫苗组合物。
本发明即提供这样的改进的疫苗。
发明简述
本发明提供了疫苗组合物，其包括至少一种肺炎链球菌多糖抗原(优选与一种蛋白载体偶联)和选自以下的肺炎链球菌蛋白抗原：多组氨酸三联体(Poly Histidine Triad)家族(Pht；如PhtA，PhtB，PhtD，或PhtE)，Lyt家族(例如LytA，LytB，或LytC)，SpsA，Sp128，Sp130，Sp125，Sp101和Sp133，或其截短物或其免疫功能等效物，任选地，还包括Th1佐剂(诱导明显的Th1型免疫应答的佐剂)。优选肺炎球菌蛋白和Th1佐剂都包括。有利的组合物包括上述本发明的肺炎球菌蛋白相互之间的组合，以及与其它的肺炎球菌蛋白的组合。本发明的组合物尤其适用于对老年肺炎患者的治疗。
肺炎球菌多糖疫苗(偶联型或非偶联型)不能针对老年人群的肺炎起保护作用，而在该群体中该病的发病率非常高。抗御肺炎球菌的关键机制是调理吞噬作用(通过产生抗肺炎球菌多糖抗体而导致体液B细胞/中性粒细胞介导的事件，细菌最终被吞噬)，然而所涉及的调理机制有一部分在老年人中变弱，即PMN(多形核细胞)的超氧化物的产生，其它活性氧物质的产生，PMN的移动，PMN的凋亡，PMN的变形性减弱。在老年人中抗体应答也可能减弱。
与一般认识相反，正常水平的抗荚膜多糖抗体不能有效彻底地清除细菌，因为肺炎球菌可以侵入宿主细胞以躲避免疫系统的该种免疫作用。
令人惊奇的是，本发明人发现在刺激免疫系统的体液免疫(B细胞介导的免疫)的同时刺激免疫系统的细胞免疫(例如T细胞介导的免疫)能产生协同作用(或协作)，它增强肺炎球菌从宿主中被清除。这一发现在一般意义上可指导对肺炎球菌感染的预防(或治疗)，而对基于多糖的疫苗无效的老年人肺炎的预防(或治疗)尤其重要。
在不受任何理论限制的情况下，本发明发现，如果将肺炎球菌多糖(优选与蛋白载体偶联的)与选自如下的肺炎球菌蛋白：PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133(能被加工并呈递在感染的哺乳动物细胞表面的MHCI和MHCII中)一起给药，免疫系统的两种免疫效应可协同。尽管这些肺炎球菌蛋白自身可激发一种或多种由细胞介导的免疫，但本发明人也发现在疫苗制品中存在Th1诱导型佐剂可帮助免疫系统的该种免疫，并且惊讶地发现它还可加强免疫系统的两种免疫之间的协同作用。
发明详述
本发明提供改进的疫苗，尤其是用于预防或缓解老年人(和/或婴幼儿)的肺炎球菌感染疫苗。
在本发明中，年龄在55或55岁以上的患者可视为是老年患者，主要是60岁，更主要是60岁以上的患者。
因此，在本发明的一个实施方案中提供了一种疫苗组合物，其适合老年患者(和/或婴幼儿)应用，该疫苗组合物包含至少一种肺炎链球菌多糖抗原和至少一种选自下组的肺炎链球菌蛋白抗原：PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133。所述疫苗可任选包含Th1佐剂。
在第二个优选实施方案中本发明提供了一种疫苗(适用于预防老年患者的肺炎)，其包含至少一种(2，3，4，5，6，7，8，9或10种)肺炎链球菌多糖抗原和至少一种选自下组的肺炎链球菌蛋白抗原：PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133，优选还包括Th1佐剂。
在以上实施方案中，所述疫苗优选包括本发明的上述肺炎球菌蛋白相互之间的组合，以及与其它肺炎球菌蛋白之间的组合，如下所述。
所述疫苗还可以用于治疗其它高危人群如婴幼儿中的肺炎球菌感染(例如中耳炎)。
本发明的肺炎链球菌多糖抗原
通常本发明的肺炎链球菌疫苗包含多糖抗原(优选与载体蛋白偶联)，其中所述多糖来源于至少四种肺炎球菌血清型。优选，所述四种血清型包括6B，14，19F和23F。更优选，所述组合物中至少包括7种血清型，例如来源于血清型4，6B，9V，14，18C，19F和23F的那些。还更优选所述组合物中包括至少11种血清型，例如在一个实施方案中，所述组合物包括来源于血清型1，3，4，5，6B，7F，9V，14，18C，19F和23F的荚膜多糖(优选与载体蛋白偶联)。在本发明的一个优选实施方案中，至少包括13种多糖抗原(优选与载体蛋白偶联)，但还可以包括另外的多糖抗原，例如23价体(如血清型1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19A，19F，20，22F，23F和33F)也包括在本发明的范围内。
对于老年人的疫苗接种(例如用于预防肺炎)而言，优选在上述11价抗原组合物中，包括血清型8和12F(最优选还包括血清型15和22)以形成15价疫苗，而对于婴幼儿而言(这时主要考虑中耳炎)，优选包括血清型6A和19A以便形成13价疫苗。
尽管上述多糖可以应用其全长天然形式，但应该理解，降低了大小但仍然具备免疫原性的多糖也可以应用(参见例如EP497524和497525)。
为了预防/缓解老年患者(+55岁)的肺炎、婴儿(最大至18个月)和幼儿(通常是18个月到5岁)的中耳炎，本发明的优选实施方案将本发明所述多价肺炎链球菌多糖组合了选自如下的肺炎链球菌蛋白：PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133，或其免疫功能等效物。肺炎球菌蛋白的联合应用还优选如下进行。
本发明的肺炎球菌蛋白
基于本发明的目的，“免疫功能等效物”是指包含本发明所述蛋白的至少一种保护性表位的蛋白的肽。所述表位的特征是暴露于表面，高度保守，且可在宿主中引发杀菌性的抗体应答或可阻止毒性作用。优选，所述功能等效物含有本发明蛋白的至少15个，优选30个或更多个连续的氨基酸。最优选，可使用所述蛋白的片段，有缺失的蛋白如其跨膜缺失变体(即应用所述蛋白的胞外区)，融合体，通过化学方法或遗传学方法脱毒的衍生物等，只要它们能激发基本上与天然蛋白等同的免疫应答。蛋白序列中潜在的B细胞表位的位置可通过两种方法的联合应用鉴定既是表面暴露又具抗原性的肽来确定，所述方法是2D结构预测法和抗原性指数预测法。用PSIPRED程序(来自David Jones，Brunel Bioinformatics Group，Dept.Biological Sciences，Brunel University，Uxbridge UB8 3PH，UK)可进行2D结构预测。抗原性指数可根据Jameson和Wolf描述的方法(CABIOS 4：181-186[1988])进行计算。
本发明的蛋白是以下蛋白，它们都暴露于肺炎球菌的外表面(至少能在肺炎球菌生活周期的某一阶段被宿主免疫系统识别)，或它们都是肺炎球菌所分泌或释放的蛋白。
本发明的肺炎链球菌蛋白优选选自下组：来自多组氨酸三联体家族(Pht)的蛋白，来自Lyt家族的蛋白，胆碱结合蛋白，具有LPXTG基序的蛋白(其中X是任何氨基酸)，具有II型信号序列基序LXXC的蛋白(其中X是任何氨基酸)，和具有I型信号序列基序的蛋白。这些种类(或基序)中的优选实例是如下蛋白(或其截短物或免疫功能等效物)：
Pht(多组氨酸三联体)家族包含蛋白phtA，PhtB，PhtD和PhtE。该家族具有以下特征：脂质化序列(lipidation sequence)，由脯氨酸丰富区和几个组氨酸三联体分隔开的两个区(可能与金属或核苷的结合或酶的活性有关)，(3-5)卷曲螺旋区，保守的N末端和异源的C末端。它存在于已检验的所有肺炎球菌菌株中。其同源蛋白可见于其它链球菌和奈瑟氏球菌属。该家族优选的成员包括PhtA，PhtB和PhtD。更优选，其包括PhtA或PhtD。可以理解，术语PhtA，B，D和E是指具有在以下引用文献中公开的序列的蛋白，以及其天然(和人工制备的)变体，所述变体与参考蛋白有至少90％的序列同源性，优选至少95％相同，最优选至少97％相同。
对于Pht蛋白而言，PhtA公开于WO98/18930，还可称作Sp36。如上所述，其是一种多组氨酸三联体家族的蛋白，且具有II型信号基序LXXC。
PhtD公开于WO 00/37105，也可称作Sp036D。如上所述，它也是多组氨酸三联体家族的一种蛋白，也具有II型信号基序LXXC。
PhtB公开于WO 00/37105，也称作Sp036B。PhtB家族的另一成员是降解C3的多肽，公开于WO 00/17370。该蛋白也是多组氨酸三联体家族成员，具有？型信号基序LXXC。优选的免疫功能等效物是蛋白Sp42，公开于WO98/18930。PhtB截短物(约79kD)公开于WO 99/15675，它也被认为是PhtX家族成员。
PhtE公开于WO00/30299，称作BVH-3。
SpsA是胆碱结合蛋白(Cbp)，公开于WO98/39450。
Lyt家族是膜结合蛋白，与细胞裂解有关。N末端区包含胆碱结合区，而Lyt家族不包含在胆碱结合蛋白家族(Cbp)发现的如下所述所有特征，因此，本发明中，Lyt家族被认为不同于Cbp家族。与Cbp家族不同，C末端区包含Lyt蛋白家族的催化区。该家族包括LytA，B和C。对于Lyt家族而言，LytA公开于Ronda et al.，Eur J Biochem，164：621-624(1987)。LytB公开于WO98/18930，也称作Sp46。LytC也公开于WO98/18930，也称作Sp91。该家族的优选成员是LytC。
另一优选实施方案是Lyt家族截短物，其中“Lyt”如上定义，“截短物”是指缺失胆碱结合区的50％或更多部分的蛋白。优选这类蛋白缺失整个胆碱结合区。
Sp125是肺炎球菌表面蛋白的一个实例，具有细胞壁锚定基序LPXTG(其中X是任何氨基酸)。已发现，这类肺炎球菌表面蛋白中具有该基序的任何蛋白在本发明中是有用的，从而被认为是本发明的另一蛋白。Sp125本身公开于WO 98/18930，也称作ZmpB，即一种锌金属蛋白酶。
Sp101公开于WO 98/06734(其参考名称为#y85993)。其特征在于I型信号序列。
Sp133公开于WO 98/06734(其参考名称为#y85993)。其特征也是I型信号序列。
Sp128和Sp130公开于WO 00/76540。
本发明所使用的蛋白优选选自PhtD和PhtA，或者是这两种蛋白的组合。
本度明的一种或多种肺炎球菌蛋白与其它肺炎球菌蛋白的有利组合
在本发明的疫苗中，还优选将本发明上述蛋白中的每一种蛋白(优选PhtD和/或PhtA)与来自下组的一种或多种肺炎球菌蛋白组合：肺炎球菌溶血素(也称为Ply；优选通过化学处理或突变而脱毒)[WO96/05859，WO90/06951，WO99/03 884]，PsaA和其跨膜缺失变体(Berry and Paton，InfectImmun 1996 Dec；64(12)：5255-62)，PspA和其跨膜缺失变体(US 5804193，WO92/14488，WO99/53940)，PspC和其跨膜缺失变体(WO97/09994，WO99/53940)，胆碱结合蛋白(Cbp)家族成员[例如CbpA和其跨膜缺失变体(WO97/41151；WO99/51266)]，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Infect.Immun.199664：3544)，HSP70(WO96/40928)，PcpA(Sanchez-Beato et al.FEMS MicrobiolLett 1998，164：207-14)，M样蛋白(SB专利申请号EP0837130)，和粘附素18627(SB专利申请号EP0834568)。本发明还包含上述蛋白的免疫功能等效物或截短物(如上定义)。
关于胆碱结合蛋白家族，该家族的成员最初被鉴定为可通过胆碱亲和层析纯化的肺炎球菌蛋白。所有胆碱结合蛋白都是非共价结合于细胞壁磷壁酸和膜结合型脂磷壁酸的磷脂酰胆碱部分。在结构上，有数个区域在整个家族所有成员中是共有的，但这些蛋白的实际特性(氨基酸序列，长度等等)是不同的。通常，胆碱结合蛋白家族包含N末端区(N)，保守重复区(R1和/或R2)，脯氨酸丰富区(P)和保守的胆碱结合区(C)，这些区域多倍重复，约构成该蛋白的一半。正如本申请中所用的，术语“胆碱结合蛋白家族(Cbp)”选自在WO97/41151中鉴定的下组胆碱结合蛋白：PbcA，SpsA，PspC，CbpA，CbpD，和CbpG。CbpA公开于WO/41151，CbpD和CbpG公开于WO00/29434。PspC公开于WO97/09994。PbcA公开于WO98/21337。优选胆碱结合蛋白选自：CbpA，PbcA，SpsA和PspC。
如果Cbp是上文所述的另一种蛋白，那么它可以是Cbp截短物，其中“Cbp”如上定义，“截短物”是指缺失胆碱结合区(C)的50％或更多的蛋白。优选这类蛋白缺失整个胆碱结合区。更优选，这类蛋白截短物缺失(i)胆碱结合区和(ii)该蛋白的N末端一半的一部分，但仍保留至少一个重复区(R1或R2)。还更优选，所述截短物具有2个重复区(R1和R2)。这类优选实施方案的实例是NR1xR2和R1xR2，描述于WO99/51266或WO99/51188，但缺失类似胆碱结合区的其它胆碱结合蛋白也包括在本发明的范围内。
Cbp截短物-Lyt截短物嵌合蛋白(或融合体)也可用于本发明的疫苗中。优选其包括Cbp的NR1xR2(或R1xR2)和Lyt的C末端区(Cterm，即缺失了胆碱结合区)(例如，LytCCterm或Sp91Ctem)。更优选Cbp选自CbpA，PbcA，SpsA或PspC。还更优选，其是CbpA。优选Lyt是LytC(也可称作Sp91)。
也可应用PspA或缺失了胆碱结合区(C)并表达为与Lyt的融合蛋白的PsaA截短物。优选，Lyt是LytC。
用于本发明目的的肺炎球菌蛋白的优选组合
优选本发明蛋白的组合选自2种或多种(3或4种)不同种类，如具有？型信号序列基序LXXC的蛋白(其中X是任何氨基酸，例如，多组氨酸三联体家族(Pht))，胆碱结合蛋白家族(Cbp)，具有I型信号序列基序的蛋白(例如，Sp101)，具有LPXTG基序的蛋白(其中X是任何氨基酸，例如，Sp128，Sp130)，毒素(例如，Ply)，等等。在这些种类(或基序)中优选的实例是以上所提到的蛋白，或其免疫功能等效物。毒素+Pht，毒素+Cbp，Pht+Cbp，和毒素+Pht+Cbp是优选的种类组合。
优选的有利的组合包括，但不限于PhtD+NR1xR2，PhtD+NR1xR2-Sp91Cterm嵌合蛋白或融合蛋白，PhtD+Ply，PhtD+Sp128，PhtD+PsaA，PhtD+PspA，PhtA+NR1xR2，PhtA+NR1xR2-Sp91Cterm嵌合蛋白或融合蛋白，PhtA+Ply，PhtA+Sp128，PhtA+PsaA，PhtA+PspA，NR1xR2+LytC，NR1xR2+PspA，NR1xR2+PsaA，NR1xR2+Sp128，R1xR2+LytC，R1xR2+PspA，R1xR2+PsaA，R1xR2+Sp128，R1xR2+PhtD，R1xR2+PhtA。优选，NR1xR2(或R1xR2)来自CbpA或PspC，更优选它来自CbpA。
肺炎球菌蛋白的尤其优选组合包括Ply(或其截短物或免疫功能等效物)+PhtD(或其截短物或免疫功能等效物)+NR1xR2(或R1xR2)。优选NR1xR2(或R1xR2)来自CbpA或PspC，更优选它来自CbpA。
不希望受任何理论的限制，在组合物中，本发明的肺炎球菌蛋白(或上述组合)可帮助诱导抗御肺炎球菌疾病，尤其是抗御肺炎所需的T细胞介导的应答，该应答与免疫系统的体液免疫协同作用，抑制肺炎球菌的侵袭，所述蛋白还可帮助刺激调理吞噬作用。将蛋白抗原包括在内的另一优点是呈递其它抗原以便进行调理吞噬。
因此，在本发明的一个实施方案中提供了肺炎链球菌疫苗，其包括肺炎球菌多糖偶联疫苗，该偶联疫苗包括来自至少4种血清型的多糖抗原，优选至少7种血清型，更优选至少11种血清型，还包括至少一种，优选2，3或4种选自下组的肺炎链球菌蛋白：PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133(或如上所述的肺炎球菌蛋白组合)。优选所述蛋白中的一种蛋白是PhtA(或其免疫功能等效物)。更优选所述蛋白中的一种蛋白是PhtD(或其免疫功能等效物)。
如上所述，与接种多糖的方法有关的问题是多糖本身免疫原性弱。为克服这一问题，可将多糖与蛋白载体偶联，所述载体可对T细胞提供旁路辅助。所以，优选本发明所用的多糖与这样的蛋白载体偶联。目前常用来制备多糖免疫原的这类载体的实例包括白喉类毒素和破伤风类毒素(分别为DT，DT CRM197和TT)，匙孔血蓝蛋白(KLH)，来自脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)的OMPC，以及结核菌素的纯蛋白衍生物(PPD)。
基于肺炎球菌多糖的免疫原性组合物(或疫苗)的优选载体是来自流感嗜血菌的蛋白D(EP594610-B)，或其片段。适合应用的片段包括包含T辅助细胞的表位的那些片段。具体地，蛋白D片段优选包含所述蛋白的N末端1/3。令人惊奇的是蛋白D载体可作为载体用在偶联了多价肺炎球菌多糖抗原的疫苗中。如果每种多糖都用同样的载体，通常可能会发生表位的抑制。令人惊奇的是，本发明者发现在组合疫苗中蛋白D尤其适合减小这种表位抑制作用。在组合中一种或多种肺炎球菌多糖可有利地偶联到蛋白D上，且优选所有抗原在这种组合疫苗中都偶联到蛋白D上。
用于肺炎球菌多糖的另一种优选载体是肺炎球菌蛋白本身(如上在“本发明的肺炎球菌蛋白”章节中定义的)。
所述多糖可通过任何已知方法与载体蛋白偶联(例如，通过Likhite，美国专利号4,372,945和Armor et al.，美国专利号4,474,757)。优选可进行CDAP偶联(WO95/08348)。
优选，所述偶联物的蛋白：多糖的比例(重量∶重量)是0.3∶1到1∶1，更优选0.6∶1到0.8∶1，且最优选约0.7∶1。
本发明的疫苗优选是含有佐剂的。适当的佐剂包括铝盐如氢氧化铝胶(明矾)或磷酸铝，但也可以是钙盐，镁盐，铁盐或锌盐，或可以是不溶性的酰化酪氨酸悬浮物，或酰化的糖，多糖的阳离子或阴离子衍生物或聚磷腈。
优选所述佐剂是TH1型应答的优先诱导剂，以帮助细胞介导的免疫应答。
本发明的TH1佐剂
高水平的Th1型细胞因子针对给定抗原更倾向于诱导细胞介导的免疫应答，而高水平的Th2型细胞因子倾向于诱导针对该抗原的体液免疫应答。
重要的是记住Th1型和Th2型免疫应答之间的不同并不是绝对的。实际上，个体的免疫应答可以以Th1为主，或以Th2为主。但通常为方便起见以Mosmann和Coffman针对鼠CD4+T细胞克隆的描述来判断细胞因子家族(Mosmann，T.R.and Coffman，R.L.(1989)Th1 and TH2 cells：differentpatterns of lymphocine secretion lead to different functional properties.AnnualReview of Immunology，7，p145-173)。通常，Th1型应答与T淋巴细胞产生INF-γ和IL-2细胞因子有关。一般情况下直接同Th1型免疫应答的诱导有关的其它细胞因子不是由T细胞产生的，如IL-12。相反，Th2型应答与IL-4，IL-5，IL-6，IL-10的分泌有关。促进显著的Th1应答的适当佐剂系统包括：单磷脂酰脂质A或其衍生物，特别是3-脱氧酰化单磷脂酰脂质A(3D-MPL)(其制备参见GB2220211A)；以及单磷脂酰脂质A，优选3-脱氧酰化单磷脂酰脂质A，与铝盐(例如磷酸铝或氢氧化铝)的组合，或者与水包油乳剂组合。在所述组合中，抗原和3D-MPL共同包含在同一微粒结构中，使抗原信号和免疫刺激性信号的传输更为有效。研究显示，3D-MPL能进一步提高吸附了明矾的抗原的免疫原性[Thoelen et al.Vaccine(1998)16：708-14；EP689454-B1]。
一个提高系统涉及单磷脂酰脂质A与皂苷(saponin)衍生物的组合，尤其是QS21和3D-MPL的组合，其公开于WO94/00153，或者涉及一种低反应性的组合物，其中QS21用胆固醇淬灭，见WO96/33739。
一种特别强效的佐剂制品涉及在水包油乳剂中含有QS21，3D-MPL和生育酚(tocopherol)，描述于WO95/17210，该种制剂是优选的制剂。
优选，疫苗还包含皂苷，更优选QS21。所述制剂还可包含水包油乳剂和生育酚(WO95/17210)。
本发明还提供一种制备疫苗制剂的方法，该方法包含将本发明的蛋白与可药用赋形剂，如3D-MPL混合。
包含非甲基化CpG的寡核苷酸(WO96/02555)也是TH1应答的优先诱导剂，适合用于本发明。
本发明特别优选的组合物包含一种或多种偶联的肺炎球菌多糖，一种或多种本发明的肺炎球菌蛋白和Th1佐剂。不希望受任何理论的限制，肺炎球菌蛋白对细胞介导的应答的诱导(如上所述)和免疫系统两种免疫之间的协作可采用上述Th1佐剂进行辅助，从而产生抗御一般性肺炎球菌疾病，更重要的是抗御老年患者肺炎球菌性肺炎的特别有效的疫苗。
本发明另一方面提供了如本文所述的用于医学的免疫原或疫苗。
在一个实施方案中，本发明提供了一种预防或缓解老年人(+55岁)肺炎的方法，该方法包含对所述老年患者给药安全和有效的量的疫苗(如本文所述)，所述疫苗包含肺炎链球菌多糖抗原和选自下组的肺炎球菌蛋白，还任选包含Th1佐剂：PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133。
在另一实施方案中，本发明提供了一种预防或缓解婴儿(最大至18月)或幼儿(通常是18个月到5岁)的中耳炎的方法，其包含对所述婴儿或幼儿给药安全和有效的量的疫苗，所述疫苗包含肺炎链球菌多糖抗原和选自下组的肺炎链球菌蛋白，还任选包含Th1佐剂：PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133。
优选在本发明上述方法中，所述多糖抗原以多糖蛋白偶联物的形式存在。
本发明疫苗的制备
本发明的疫苗制品可通过全身或粘膜途径给药来保护或治疗易受感染的哺乳动物。这些给药方式包括肌肉内注射，腹膜内注射，皮内或皮下途径；或通过粘膜给药到口腔/消化道，呼吸道，生殖道。用于治疗肺炎或中耳炎的疫苗的鼻内给药是优选的(因为可以更有效预防鼻咽部携带肺炎球菌，因此在最早期便可减轻感染)。尽管本发明的疫苗可以单剂给药，但其成分也可同时联合给药，或在不同时间联合给药(例如，为了使免疫应答之间能更好地协调，肺炎球菌多糖抗原可以在疫苗的细菌蛋白成分给药的同时或1-2周后分别给药)。在联合给药时，任何一次或每一次给药时都可以有备选的Th1佐剂，但优选其与疫苗的细菌蛋白成分进行组合。除了单一给药途径以外，还可以应用2条不同的给药途径。例如，任何病毒抗原都可以通过皮内给药(ID)，而细菌蛋白可通过肌肉内给药(IM)或鼻内给药(IN)。多糖可以肌肉内给药(或皮内给药)，细菌蛋白可以鼻内给药(或皮内给药)。另外，本发明的疫苗可以肌肉内给药进行初次免疫，鼻内给药进行加强免疫。
每剂典型疫苗中偶联的抗原的量应能诱导出免疫保护性应答，而没有明显的副作用。该量将根据所使用的特异性免疫原和给药途径的不同而变化。通常，每剂应包含多糖0.1-100μg，优选0.1-50μg，优选0.1-10μg，最优选1-5μg。
疫苗中蛋白抗原的含量通常在1-100μg的范围内，优选5-50μg，通常最优选5-25μg。
对具体的疫苗来说，各成分的最佳的量可通过标准研究确定，所述研究涉及观察受试者的相应免疫应答。第一次接种后，以充足的时间间隔对受试者进行一次或多次的加强免疫。
疫苗制品通常描述于Vaccine Design(“The subunit and adjuvantapproach”(eds Powell M.F.and Newman M.J.)(1995)Pleun Press New York)。Fullerton描述了用脂质体进行胶囊化(美国专利号4235877)。
尽管本发明的疫苗可通过任何途径给药，但所描述的疫苗进行皮内(ID)给药构成了本发明的一个实施方案。人皮肤包含外部“角质”表皮层，称为角质层，它覆盖了表皮。此表皮下是真皮层，真皮层覆盖了皮下组织。研究者发现皮内注射疫苗，特别是真皮内注射疫苗可刺激免疫应答，还伴随其他多种优点。此处所述的皮内接种疫苗构成了本发明的一个优选特征。
皮内注射的常规技术“芒图试验(mantoux procedure)”包括以下步骤：清洁皮肤，展开一只手，然后使小号针头(26-31号)的斜面朝上，以10-15度的角度将针插入。一旦针的斜面插入后，针筒下降，进一步推进的同时略施压力使其在皮下抬起。然后将液体非常缓慢地注入，在皮肤表面形成包或隆起，然后缓慢将针退出。
近来，皮内或穿皮给与液体制剂的特定装置已被公开，例如：该装置公开于WO 99/34850和EP 1092444，喷射注射装置公开于WO 01/13977，US5,480,381，US 5,599,302，US 5,334,144，US 5,993,412，US 5,649,912，US5,569,189，US 5,704,911，US 5,383,851，US 5,893,397，US 5,466,220，US5,339,163，US 5,3 12,335，US 5,503,627，US 5,064,413，US 5,520,639，US4,596,556，US 4,790,824，US 4,941,880，US 4,940,460，WO 97/37705和WO97/13537。该疫苗制剂的真皮内给药替代方法包括常规注射器和针，或固体疫苗的弹道式给药装置(WO 99/27961)，或经皮贴剂(WO 97/48440；WO98/28037)；或皮肤表面给药(经皮给药WO 98/20734；WO 98/28037)。
当本发明的疫苗是给至皮肤时，更具体地说是真皮时，给与小量液体疫苗，具体约为0.05ml-0.2ml。
本发明皮肤或皮内疫苗中抗原含量可以类似于肌肉内疫苗常规的剂量(如上所述)。但所述皮肤或皮内疫苗为“小剂量”制剂。因此在此“小剂量”疫苗中每剂含有的蛋白抗原量优选为0.1-10μg，优选每剂含有蛋白抗原0.1-5μg；且每剂含有的多糖(优选偶联型)抗原的量为0.01-1μg，优选0.01-0.5μg。
此处所用的术语“皮内给药”是指将疫苗给至皮肤的真皮区域，但疫苗不一定仅存在于真皮内。真皮层是距离人体皮肤表面约1.0mm-约2.0mm的皮肤层，但个体之间和同一个体的不同部位之间存在差异。一般地，预计距离皮肤表面1.5mm的深度达到真皮层。真皮上面为角质层和表皮，下面为皮下层。根据给药模式的不同，可以使该疫苗最终仅存在于或主要存在于真皮内，或最终分布于表皮和真皮。
本发明也涉及组合型疫苗，所述疫苗可提供抗御不同病原体的保护作用。目前，许多儿科疫苗以组合疫苗的形式提供以降低儿童注射的次数。因此，来源于其他病原体的其他抗原也可以与本发明的疫苗配制成儿科疫苗。例如，本发明的疫苗可与以下物质一起配制(或同一时间分别给药)：公知的“三价”组合疫苗，包含白喉类毒素(DT)，破伤风类毒素(TT)，和百日咳成分[通常是脱毒的百日咳类毒素(PT)，丝状血凝素(FHA)和备选的pertactin(PRN)和/或凝集素1+2]，例如，包含DT，TT，PT，PHA和PRN抗原的市售疫苗INFANRIX-DTPaTM(SmithKlineBeecham Biologicals)，或百目咳完整细胞成分，如Smithkline Beecham Biologicals出售的TritanrixTM。所述组合疫苗也可以包含其它抗原，如乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)，脊髓灰质炎病毒抗原(例如灭活的三价脊髓灰质炎病毒-IPV)，粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)外膜蛋白，不能确定型别的(non-typeable)流感嗜血菌的蛋白，脑膜炎奈瑟氏球菌B的外膜蛋白。
可以包含在组合疫苗中的优选粘膜炎莫拉氏菌蛋白抗原的实例(尤其对于预防中耳炎)是：OMP106[WO97/417319(Antex)和WO96/34960(PMC)]；OMP21；LbpA和/或LbpB[WO98/55606(pmc)]；TbpA和/或TbpB[WO97/13785和WO97/32980(PMC)]；CopB[Helminen ME，et al.(1993)Infect.Immun.61：2003-2010]；UspA1和/或UspA2[WO93/03761(得克萨斯大学)]；OmpCD；HasR(PCT/EP99/03824)；PilQ(PCT/EP99/03823)；OMP85(PCT/EP00/01468)；lipo06(GB9917977.2)；lipo10(GB9918208.1)；lipo11(GB9918302.2)；lipo18(GB9918038.2)；P6(PCT/EP99/03038)；D15(PCT/EP99/03822)；OmplA1(PCT/EP99/06781)；Hly3(PCT/EP99/03257)；和OmpE。可以包含在组合疫苗中的不能确定型别的流感嗜血菌的抗原实例(尤其用来预防中耳炎)包括：丝束蛋白[(US5766608 Ohio State ResearchFoundation)]和包含来该蛋白的肽的融合体[例如LB1(f)肽融合体；US5843464(OSU)或WO99/64067]；OMP26[WO97/01638(Cortecs)]；P6[EP281673(State University of NeW York)]；TbpA和/或TbpB；Hia；Hsf；Hin47；Hif；Hmw1；Hmw2；Hmw3；Hmw4；Hap；D15(WO94/12641)；蛋白D(EP594610)；P2；和P5(WO94/26304)。
其它组合是肺炎球菌PS和本发明蛋白与病毒抗原的组合，所述病毒抗原例如来自流感病毒(减毒型，解体型(split)或其亚单位)[例如，表面糖蛋白神经氨酸酶(NA)和血凝素(HA)。参见，例如Chaloupka I.et al.，Eur. JoumalClin.Microbiol.Infect.Dis.1996，15：121-127]，RSV(例如F和G抗原或F/G融合体，参见例如，Schmidt A.C.et al，J.Virol，May 2001，p4594-4603)，PIV3(例如，HN和F蛋白，参见Schmidt et al.同上)，水痘病毒(Varicella)(例如减毒型，糖蛋白I-V，等)，和MMR(麻疹病毒，腮腺炎病毒，风疹病毒)的任何(或全部)成分。
本发明用于全球治疗或预防中耳炎的优选的儿科组合疫苗包括：一种或多种肺炎链球菌多糖抗原(优选与蛋白D偶联的)，一种或多种选自下组的肺炎球菌蛋白：PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133(或其免疫功能等效物)，和一种或多种表面暴露的抗原，其来源于粘膜炎莫拉氏菌和/或不能确定型别的流感嗜血菌。蛋白D优选用作肺炎球菌多糖的蛋白载体，以克服表位抑制问题(如上所述)，并且该蛋白本身也是免疫原，能产生B细胞介导的抗御不定型流感嗜血菌(ntHi)的保护作用。粘膜炎莫拉氏菌或不定型流感嗜血菌抗原可以亚单位的形式包含在疫苗中，或可以是在用细菌制作的囊泡外膜表面展示的抗原。
优选上述抗原组合物(和疫苗)是冻干的，直到使用时才临时用稀释剂重建。更优选它们在3D-MPL的存在下冻干，并在临用前用盐水溶液重建。或者，所述蛋白和多糖分别保存在疫苗接种的试剂盒中(任一成分或两者都被冻干)，临用前将所述成分重建，并混合或分别给予患者。Th1佐剂(优选3D-MPL)可与上述任何一种成分一起存在，或可与上述两种成分一起存在。
疫苗的冻干是本领域公知的。通常在抗结块剂如蔗糖或乳糖等糖类物质(最初的浓度为10mg/ml到200mg/ml)的存在下冻干液体疫苗。冻干通常需要一系列步骤，例如需进行这样一个循环：开始时的温度为69℃，3小时内逐渐调至-24℃，维持6小时，然后1个小时内逐渐将温度调节到-16℃，然后维持该温度6个小时，在3小时内将温度渐渐上调到+34℃，最后保持该温度9小时。
冻干使组合物更加稳定(例如它可阻止多糖抗原的降解)。令人惊奇的是，这个过程还可以提高抗肺炎球菌多糖的抗体滴度。这对PS 6B偶联物尤其明显。因此本发明的另一方面提供冻干的抗原组合物，其包含以3D-MPL(优选不使用以铝为基础的佐剂)为佐剂并与其偶联的PS 6B偶联物，还包含选自下组的肺炎球菌蛋白：PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133。
实施例
以下实施例用来对本发明进行说明，而非用以限制本发明。
实施例1
肺炎链球菌荚摸多糖
11价的候选疫苗包括荚膜多糖血清型1，3，4，5，6B，7F，9V，14，18C，19F和23F，它们的制备基本上如EP72513中所述。每种多糖都用CDAP化学法活化和衍生(WO95/08348)，并偶联到蛋白载体上。所有的多糖都以它们的天然形式进行偶联，只有血清型3例外(为降低粘度，需降低其大小)。
蛋白载体：
所选的蛋白载体是重组蛋白D(PD)，其来自不定型流感嗜血菌，在大肠杆菌中表达。
蛋白D的表达
流感嗜血菌蛋白D
用于蛋白D表达的基因构建
起始物质
编码蛋白D的DNA
蛋白D在流感嗜血菌的所有血清型和不定型菌株中是高度保守的。包含编码整个蛋白D基因的DNA序列的载体pHIC348从Dr.A.Forsgren，Department of Medical Mecrobiology，University of Lund，Malmo GeneralHospital，Malmo，Sweden获得。蛋白D的DNA序列已由Janson等(1991)Infect.Immun.59：119-125公布。
表达载体pMG1
表达载体pMG1由pBR322衍生而来(Gross et al.，1985)，其中插入了噬菌体λ来源的转录和翻译外来插入基因的调控序列(Shatzman et al.，1983)。另外，氨苄青霉素抗性基因被更换为卡那霉素抗性基因。
大肠杆菌菌株AR58
大肠杆菌菌株AR58通过用P1噬菌体原种转导N99而制备，所述噬菌体原种以前培养在SA500衍生物(galE∷TN10，λKil-cI857ΔH1)。N99和SA500是大肠杆菌K12菌株，来源于国立健康研究所(the National Institute ofHealth)的Dr.Martin Rosenberg实验室。
表达载体pMG1
为制备蛋白D，将编码该蛋白的DNA克隆到表达载体pMG1中。该质粒利用来自λ噬菌体DNA的信号驱动插入的外源基因的转录和翻译。所述载体包含启动子PL，操纵子OL和两个利用位点(Nutl和NutR)以解除有N蛋白时的转录极性效应(Gross et al.，1985)。将包含PL启动子的载体导入到大肠杆菌溶原性宿主中，以稳定质粒DNA。溶原性宿主菌株包含已整合到基因组中的复制缺陷型λ噬菌体DNA(Shatzman et al.，1983)。染色体上的λ噬菌体DNA指导cI抑制物蛋白的合成，该蛋白结合所述载体的OL抑制物，阻止RNA聚合酶与PL启动子的结合，从而阻止插入基因的转录。表达菌株AR58的cI基因包含温度敏感性突变体，这样PL指导的转录可通过温度的变化得到控制，即提高培养温度可灭活抑制物，启动外来蛋白的合成。这种表达系统能够在控制下合成外源蛋白，尤其是那些对细胞可能有毒性的蛋白(Shimataka和Rosenberg，1981)。
大肠杆菌菌株AR58
AR58溶原性大肠杆菌菌株用于制备蛋白D载体，其是标准NIH大肠杆菌K12菌株N99的衍生物(F-su-galK2，lacZ-thr-)。它包含缺陷的溶原性λ噬菌体(galE∷TN10，λKil-cI857ΔH1)。其中Kil-表型阻止宿主大分子合成的关闭。cI857突变对cI抑制物赋予温度敏感性损伤。ΔH1缺失除去了λ噬菌体右侧的操纵子和宿主的bio，uvr3，和chlA基因座。AR58菌株是用P1噬菌体原种转导N99而制备的。所述原种以前培养在SA500衍生物(galE∷TN10，λKil-cI857ΔH1)上。N99中缺陷型溶原体的导入用四环素来筛选，是根据在邻近的galE基因中编码四环素抗性的TN10转座子的存在而进行的。
载体pMGMDPPrD的构建
包含编码流感病毒非结构蛋白S1的基因的pMGI载体(pMGNSI)被用来构建pMGMDPPrD。蛋白D基因用PCR从pHIC348载体扩增(Janson et al.，1991)，所用的PCR引物在5’和3’末端分别包含NcoI和XbaI限制性位点。然后将NcoI/XbaI片段导入到pMGNS1中NcoI和XbaI之间，从而产生包含NS1蛋白的N末端81个氨基酸，其后是PD蛋白的融合蛋白。该载体称作pMGNSIPrD。
在上述构建体的基础上构建用于蛋白D表达的最终的构建体。从pMGNSIPrD除去BamHI/BamHI片段。这种DNA水解除去了NS1编码区，而留下最开始的三个N末端残基。通过再次连接载体，产生编码融合蛋白的基因，所述蛋白具有以下的N末端氨基酸序列：
......MDP SSHSSNMANT.........
NS1                     蛋白D
蛋白D不包含前导肽或和通常连接有脂质链的N末端半胱氨酸。所以，该蛋白既不能分泌到周质，又不能脂质化，只能以可溶形式存在于细胞浆中。
将最后的构建体pMG-MDPPrD通过37℃热休克导入到AR58宿主菌株中。包含质粒的细菌在有卡那霉素的条件下筛选。用选定的内切核酸酶对分离出的质粒DNA进行消化来证明编码蛋白D的DNA插入子的存在。该重组大肠杆菌菌株称作ECD4。
蛋白D的表达受λPL启动子/OL操纵子的控制。宿主菌株AR58在基因组中包含温度敏感性cI基因，它可通过结合OL来阻止在低温下从λPL启动表达。一旦温度升高，cI从OL释放，蛋白D表达。发酵后将细胞浓缩并冻存。
从收获的细胞中提取和纯化蛋白D，操作如下进行：融化冰冻的培养细胞，将其重悬在细胞破碎液中(柠檬酸盐缓冲液pH6.0)，至OD650＝60。在p＝1000巴的条件下，使该悬液两次通过高压匀浆器。离心澄清上述细胞培养物的匀浆物，过滤除去细胞碎片。在第一个纯化步骤中，将过滤后的裂解物上样至阳离子交换层析柱(SP Sepharose Fast Flow)。PD通过离子间相互作用结合到凝胶基质上，通过逐步增加洗脱缓冲液的离子强度将其洗脱下来。
在第二步纯化中，杂质仍保留在阴离子交换基质(Q Sepharose Fast Flow)上。PD不结合凝胶，因而能在流出液中将其收集。
在上述两个柱层析步骤中，可用OD值监测所收集的级分。包含纯化的蛋白D的阴离子交换柱层析流出液，通过超滤浓缩。
最后使包含超滤滞留物的蛋白D过0.2μm的膜。
化字反应：
活化和偶联的化学反应：
活化和偶联的条件对每一多糖是特异性的。这些条件在表1中列出。将天然多糖(除了PS3)溶解在NaCl2M或用于注射的水中。评估所有血清型的最佳多糖浓度。
将100mg/ml CDAP的乙腈储存液(CDAP/PS的比例是0.75mg/mg PS)加入多糖溶液中。1.5分钟后，加入0.2M三乙基胺，以获得特定的活化pH值。在25℃2分钟内，在该pH条件下活化多糖。向被活化的多糖中加入蛋白D(它的量根据最初的PS/PD的比值决定)，在该pH偶联1小时。然后用甘氨酸在25℃30分钟且4℃过夜淬灭该反应。
用0.2M NaCl平衡过的Sephacryl 500HR凝胶过滤柱通过凝胶过滤纯化上述所得偶联物。
确定洗脱级分中的糖和蛋白含量。收集偶联物并用0.22μm的无菌膜过滤除菌。确定偶联物制品中的PS/蛋白比例。
鉴定：
对每一偶联物进行鉴定，它们都符合表2所列的所有条件。用Resorcinol检测法检测多糖的含量(μg/ml)，用Lowry检测法检测蛋白的含量(μg/ml)。用浓度比值确定最终的PS/PD的比值(w/w)。
DMAP的残余量(ng/μgPS)：
用CDSP活化多糖会在多糖中引入氰酸根基团，释放出DMAP(4-二甲基氨基吡啶)。用SB开发的特异性检测法检测DMAP的残余量。
游离多糖的含量(％)：
将一直在4℃保存或在37℃储存了7天的偶联物与α-PD抗体和饱和硫酸铵温育后进行离心，得到上清液，确定该上清液中的游离多糖的含量。
用α-PS/α-PS ELISA对上清液中的游离多糖定量。偶联物的缺乏也通过α-PD/α-PS ELISA控制。降低游离多糖的量可改进偶联疫苗。
抗原性：
用夹心ELISA分析同一偶联物的抗原性，其中抗体的捕获和检测分别用α-PS和α-PD进行。
游离蛋白含量(％)：
“游离的”蛋白D的残余水平在用SDS处理样品后检测。在0.1％的SDS存在的情况下，在100℃将偶联物加热10分钟，再注射到SEC-HPLC凝胶过滤柱(TSK3000-PWXL)上。因为蛋白D是二聚体，所以用SDS解离该蛋白的结构有可能会过高估计“游离的”蛋白D的水平。
分子大小(Kav)：
在SEC-HPLC凝胶过滤柱(TSK5000-PWXL)上确定分子的大小。
稳定性：
在HPLC-SEC凝胶过滤柱(TSK6000-PWXL)上检测一直4℃保存或在37℃储存了7天的偶联物的稳定性。
对11价的鉴定列于表2中。
蛋白偶联物可被吸附到磷酸铝上，并被收集，形成最终的疫苗。
结论：
制备出免疫原性偶联物，该偶联物显示可作为具有发展前景的疫苗的成分。针对11价的每一价都找到了最优质量的最终偶联型肺炎球菌多糖产物的最佳CDAP条件。
                                                       表1
                                 PS肺炎链球菌-蛋白D偶联物的特定活化/偶联/淬灭条件
    血清型     1     3(μfluid.)     4     5     6B     7F
  PS浓度(mg/ml)     2.0     3.0     2.0     7.5     5.4     3.0
  PS溶解     NaCl2M     NaCl2M     H2O     H2O     NaCl2M     NaCl2M
  PD浓度(mg/ml)     5.0     5.0     5.0     5.0     5.0     5.0
  PS/PD起始比(w/w)     1/1     1/1     1/1     1/1     1/1     1/1
  CDAP浓度(mg/mgPs)     0.75     0.75     0.75     0.75     0.75     0.75
  pHa＝pHc＝pHq     9.0/9.0/9.0     9.0/9.0/9.0     9.0/9.0/9.0     9.0/9.0/9.0     9.5/9.5/9.0     9.0/9.0/9.0
    血清型     9V     14     18C     19F     23F
  PS浓度(mg/ml)     2.5     2.5     2.0     4.0     3.3
  PS溶解     NaCl2M     NaCl2M     H2O     NaCl2M     NaCl2M
  PD浓度(mg/ml)     5.0     5.0     5.0     5.0     5.0
  PS/PD起始比(w/w)     1/0.75     1/0.75     1/1     1/0.5     1/1
  CDAP浓度(mg/mgPS)     0.75     0.75     0.75     0.75     0.75
  pHa＝pHc＝pHq     8.5/8.5/9.0     9.0/9.0/9.0     9.0/9.0/9.0     10/9.5/9.0     9.0/9.0/9.0
                          表2：11价肺炎球菌PS-PD疫苗的详细说明
                               (第一排批号代码表示血清型)
指标   D01PDJ227  D03PDJ236    D4PDJ228    D5PDJ235    D6PDJ209
PS/蛋白比例(w/w)游离多糖的含量(％)＜10％游离蛋白的含量(％)＜15％DMAP含量(ng/μgPS)＜0.5ng/μgPS分子量(Kav)稳定性     1/0.66180.20.18无漂移     1/1.091＜10.60.13无漂移     1/0.867190.40.12无漂移     1/0.869211.20.11低漂移     1/0.69090.30.13无漂移
   D07PDJ225   D09PDJ222   D14PDJ202    D18PDJ221   D19PDJ206   D23PDJ212
PS/蛋白比例(w/w)游离多糖的含量(％)＜10％游离蛋白的含量(％)＜15％DMAP含量(ng/μgPS)＜0.5ng/μgPS分子量(Kav)稳定性     1/0.58180.10.14无漂移     1/0.80＜10.30.60.14无漂移     1/0.68＜130.30.17无漂移     1/0.624210.20.10无漂移     1/0.454100.10.12漂移     1/0.740120.90.12无漂移
实施例2
添加一种或多种本发明的肺炎球菌蛋白+/-3D-MPL对PD偶联型11价多糖疫苗抗御小鼠中肺炎球菌肺定居的保护效力的有利影响
免疫指标
肺炎球菌蛋白特异性血清IgG的ELISA定量
将2μg/ml蛋白的PBS液以100μl/孔37℃包被Maxisorp Nunc免疫反应板2小时。用NaCl 0.9％Tween-20 0.05％缓冲液洗板3次。然后将抗蛋白血清参照物(用于制作标准曲线)(从670ng/ml IgG开始)和血清样品(从1/10稀释液开始)的连续2倍稀释液(在PBS/Tween20 0.05％中，每孔100μl)在搅拌下20℃温育30分钟。如前述洗板，之后加入PBS/Tween20 0.05％中5000x稀释的过氧化物酶偶联型山羊抗小鼠IgG(Jackson)(100μl/孔)搅拌下20℃温育30分钟。洗板后，加入100μl/孔的显影缓冲液(revelation buffer)(100mMpH4.5的柠檬酸盐缓冲液中含OPDA 0.4mg/ml和H2O2 0.05％)，室温温育这些免疫反应板15分钟。加入50μl/孔HCl 1N终止显影。用Emax immunoreader(Molecular Devices)在490nm和620nm读取光密度。用SoftMaxPro软件通过4参数数学计算法计算抗体滴度。
调理吞噬试验
该试验的目的是可重现性地检测待检血清样品针对肺炎链球菌血清型1，3，4，5，6B，7F，9V，14，18C，19F或23F的调理能力，所用检测方法是基于已公开的CDC标准方法(Steiner et al，Clinical and DiagnosticLaboratory Immunology 4：415.1997)而修改的。
该试验在体外再现体内所发生的清除入侵的肺炎链球菌或肺炎球菌的主要机制。那就是对肺炎球菌进行调理，然后进行吞噬和杀伤。“吞噬”是细胞吞入物质，并将其包裹在细胞质中的囊泡(吞噬体)中的过程。当肺炎球菌被健康的哺乳动物吞噬细胞吞噬后便被杀死。“调理”是通过调理素如抗体和补体在抗原上沉积而促进吞噬的过程。
文献已报道过许多调理吞噬试验。CDC标准检测法已在多种实验室条件下进行了检验(Steiner et al，ICAAC，Sept 16-20，2000，Toronto)。这后一种试验在SB得到修改，因为它提供了可与其它实验室进行比较的基础，它使用通常可获得的试剂和对照，并且其结果表示为能促进杀死50％活肺炎球菌的血清滴度(稀释度)，这种单位是这类检测常用的。事实上，修改后的试验得到的结果能与其它4个实验室极好地吻合(Steiner et al，ICAAC，Sept 16-20，2000，Toronto)。
在上述试验中所用的吞噬细胞是HL60细胞系，其来源于有早幼粒细胞白血病的个体，由Collins等于1977年建立为连续传代的细胞系(Nature270：347-9)。该细胞系由未分化的造血细胞组成，即85％的干细胞和早幼粒细胞，6％的中幼粒细胞和9％的已分化的细胞。极性化合物能诱导这些细胞分化成至少二种不同谱系。N，N二甲基甲酰胺诱导粒细胞分化，产生多形核-样细胞(polymorphonuclear-like cells)(44％的中幼粒细胞和晚幼粒细胞和53％的带状和节片状的PMN)。
在本试验的A2版本中，待检血清经过热灭活，并在96孔微量滴定板中，用包含0.3％BSA的HBSS培养基从1/4开始进行8次的连续2倍稀释。稀释后的血清的最终体积为每孔25μl。
4个体积的HL60细胞(107细胞/ml)(用二甲基甲酰胺分化后5或6天)，2个体积的肺炎链球菌(适当稀释的)和1个体积的幼兔补体在临用前混合，将25μl的该混合液加入到包含稀释血清的96孔微量滴定板的每个孔中。对血清型1和6B，补体的量增加到12.5％的最终浓度，进行A3版本的试验。
在环形摇动下37℃温育2小时后，将反应板放到冰上，以终止调理吞噬反应。
在37℃过夜温育，评估每孔中的集落形成单位(CFU)。“调理滴度”(OT)确定为能使孔中肺炎链球菌数量减少至少50％(即50％杀伤)的血清稀释度的倒数。％杀伤通过下面的等式计算：
杀伤％＝(CFU对照孔均值-CFU样品)/CFU对照孔的均值×100
在OF1小鼠中肺炎球菌的鼻内攻击
用5.105CFU的适合小鼠的肺炎链球菌血清型2，4或6B在麻醉下鼻内接种7周龄的OF1雌性小鼠。在攻击后6小时摘出小鼠的肺脏，在ToddHewith Broth(THB，Gico)培养基中匀浆(Ultramax，24000rpm，4℃)。用连续10倍稀释的肺匀浆物铺板在含补充了酵母提取物的THB琼脂的Petri盘上，37℃过夜。肺炎球菌的肺感染表示为CFU数/小鼠，它是对数权重的均值(logarithmic weighted-average)。检测极限是2.14 logCFU/小鼠。
实施例2A 3D-MPL佐剂针对抗蛋白免疫应答的作用
在本实施例中，我们评估了3D-MPL佐剂对于针对本发明蛋白的免疫应答的影响。
用1μg包含在A：AlPO4 100μg；或B：AlPO4 100μg+5μg 3D-MPL(3脱氧酰化单磷脂酰脂质A，由Ribi Immunochem提供)中的蛋白在第0天，14天和21天肌肉内免疫6周龄的雌性Balb/c小鼠，每组10只。在post-III血清中用ELISA检测IgG。
无论是哪一种抗原，用补充有3D-MPL的制剂免疫动物都显示出可诱导最好的免疫应答。
实施例2B添加本发明蛋白+/-3D-MPL佐剂对PD偶联型11价多糖疫苗抗御血清型2、4或6B鼻内攻击过的OF1小鼠中肺炎球菌的肺定居的有利影响。
在本实施例中，同传统的AlPO4吸附型11价多糖-蛋白D偶联物制品相比较，我们能评估包含11价多糖-蛋白D偶联物，本发明蛋白和AlPO4+3D-MPL佐剂的疫苗的预防效力。
用包含A：50μg AlPO4；B：0.1μg PS/血清型的PD偶联型11价多糖疫苗+50μg AlPO4；或C：0.1μgPS/血清型的PD偶联型11价多糖疫苗+10μg本发明蛋白+50μg AlPO4+5μg 3D-MPL(由Ribi Immunochem提供)的制剂，在第0天和14天对4周龄的雌性OF1小鼠皮下免疫，每组12只小鼠，在第21天如上所述进行攻击。
用该方法可发现，用补充有本发明蛋白和AlPO4+MPL佐剂的11价多糖偶联物疫苗可得到明显的保护作用。相反，用11价多糖偶联物/AlPO4制剂免疫动物没有观察到明显的保护作用。该结果证明添加本发明蛋白和3D-MPL佐剂可提高11价多糖偶联物疫苗抗御肺炎的效果。
实施例2C，免疫与实施例2B中显示的保护作用相关
为确立免疫与实施例2B中用补充有本发明蛋白和3D-MPL的11价多糖偶联物疫苗产生的保护作用相关，如上所述检测对多糖2，4或6B和本发明蛋白的攻击前血清抗体应答。
然后比较抗体滴度与攻击后6小时收集的相应动物的肺脏中检测到的细菌集落数。根据log/log线性回归计算R2。
计算出的R2显示体液免疫应答与针对两种抗原的保护作用之间不存在相关关系。抗6B(或2或4)抗体滴度在用11价偶联物免疫或用补充有本发明蛋白和3D-MPL的相同疫苗免疫的组之间没有明显差异。所以说，用制剂C所观察到的保护作用的改善不仅仅归因于对多糖6B(或2或4)的较高抗体应答。
综上所述，上述结果提示所述保护作用不仅仅是由体液免疫应答介导，还有由蛋白抗原所诱导的细胞介导的免疫(优选在3D-MPL的存在下)。该结果为以下做法提供了额外的支持：为协调免疫系统的两种免疫以获得最佳保护，可向肺炎球菌多糖偶联物疫苗中加入蛋白抗原和强效佐剂。
实施例3-用本发明蛋白主动免疫并用抗肺炎球菌PS的抗体被动免疫的小鼠体内免疫系统的两种免疫之间的协调作用
实施例3A-找出被动给予抗-6B-多糖(抗-PS)抗体能抗御肺炎的浓度
方法
疫苗组：4组小鼠，每组16只，在第-1天用100μl未经稀释的大鼠抗多糖抗血清如下进行被动免疫(i.p.)(共64只小鼠)：
    组别     特异性   抗血清中的IgG浓度
    G1     α-PS-6B     5μg/ml
    G2     α-PS-6B     2μg/ml
    G3     α-PS-6B     0.75μg/ml
    G4     对照     0μg/ml
动物：64只雄性CD-1小鼠，来自Charles River，Canada，重约35g(约10周龄)。
麻醉：用异氟醚(isoflurane)(3％)加O2(1L/分钟)麻醉小鼠。
生物：肺炎链球菌N1387(血清型6)收获自补充有5％马血的胰胨豆胨琼脂(TSA)培养物，并悬浮在6ml PBS中。即将进行感染时，将1ml细菌悬液稀释在9ml冷却融化的营养培养基(BBL)中，并维持在41℃。给予小鼠50μl容积中的约6.0 log 10cfu/小鼠。
感染：在如上所述麻醉小鼠的当天，用非手术的气管内插管经气管内灌输肺炎链球菌N1387(50μl冷却的细菌悬液)。该方法由Woodnut和Berry描述(Antimicrob.Ag.Chemotherap.43：29(1999))。
样品：感染后的第三天，用过量的CO2处死8只小鼠/组，切下肺脏并在1ml PBS中进行匀浆。然后用PBS进行连续的10倍稀释以产生多个不同的活细菌数。在进行评估前，将样品一式三份注入(20μl)到补充有5％马血的TSA培养板上，37℃温育过夜。其它组小鼠在第7天处死，如上所述制作样品。
结果：
    大鼠血清中的IgG浓度(μg/ml)          感染后不同天数时的细菌数(log 10cfu/肺)
    3     8
    5     6.7±0.7(1/7)     7.2±0.7(5/8)
    2     6.5±0.7(1/7)     6.9±1.8(4/7)
    0.75     7.7±0.5(5/8)     4.8±1.4(2/8)
    0     6.7±1.5(3/6)     6.3±1.5(3/9)
圆括号中的数字表示在制作样品之前已死的动物数。
结论：总的来说，分离自任何治疗组的细菌数没有明显的区别。这提示抗多糖抗体在浓度高达5μg/ml(包括5μg/ml)时没有可检测到的保护作用。
该结果与某些人类临床试验中观察的结果类似，即抗多糖抗体不足以预防某些人群中的肺炎球菌性肺炎。
实施例3B-确定用或没用佐剂的情况下主动给药本发明的蛋白针对肺炎所引起的预防作用，和与亚最适量抗PS抗体的协同作用。
方法：动物：128只雄性CD-1小鼠(在6周龄时免疫，感染时10周龄)，来自Charles River，St.Constant，Quebec，Canada。6周龄时动物重约20克，10周龄时38克。
免疫：6组，每组16只小鼠用100μl疫苗在第-22天和-14天如下进行皮下注射免疫(共128只小鼠)。3D-MPL得自Ribi/Corixa。
在第-1天，用4.26μg/ml(4ml的5μg/ml+1.3ml的2μg/ml)的小鼠抗多糖抗体对特定组(见下表)进行被动免疫(i.p.100μl)。
    组别     主动注射的体积 -22天，-14天给予的疫苗(剂量μg)    被动注射的体积   被动注射的IgG(第-1天)
    1-1     100μl s.c. 蛋白/AlPO4(10/50)     无
    1-2     100μl s.c. 蛋白/MPL/AlPO4(10/5/50)     无
    1-3     100μl s.c. 蛋白/AlPO4(10/50)   100μl i.p.     α-PS
    1-4     100l s.c. 蛋白/MPL/AlPO4(10/5/50)   100μl i.p.     α-PS
    1-5     100μl s.c. MPL/AlPO4(5/50)   100μl i.p.     α-PS
    1-6     100μl s.c. MPL/AlPO4(5/50)     无
感染：当天对小鼠进行麻醉(3％的异氟醚加1L/分钟O2)。肺炎链球菌N1387(血清型6)收获自补充有5％马血的胰胨豆胨琼脂(TSA)培养物，并悬浮在6ml PBS中，得到细菌接种物。即将进行感染时，在冷却融化的营养琼脂中(维持在41℃)制备10倍稀释液(1m加9ml)。用气管内插管经气管内灌输法感染小鼠，并给予小鼠50μl容积中的约6.0 log 10cfu/小鼠。该方法由Woodnut和Berry描述(Antimicrob.Ag.Chemotherap.43：29(1999))。
样品：感染后72小时，用过量的CO2处死8只小鼠/组，切下肺脏并在1ml PBS中进行匀浆。然后用PBS进行连续10倍稀释以产生多个不同的活细菌数。在进行评估前，将样品一式三份接种(20μl)到补充有5％马血的TSA培养板上，37℃温育过夜。其它组小鼠在感染后第8天处死，如上所述制作样品。
数据的分析
以感染后3天和7天肺脏中的细菌数量来比较治疗的结果。所述结果表示为组平均值和标准差。用Student t检验进行统计学分析，其中P值小于0.05认为是有显著性。
如上所述，仅仅使用抗多糖抗体(1-5组)不能针对肺炎球菌在肺脏中的生长提供保护作用。肺炎球菌蛋白加佐剂AlPO4(1-1组)也不能引起保护作用，但所述蛋白与3D-MPL组合(1-2组)的情况要好一些。
抗多糖抗体加蛋白组可观察到最明显的保护作用，尤其在有所有三种成分，即蛋白，3D-MPL以及被动给药的抗多糖抗体的组(1-4组)。该结论也得到死亡率的支持。1-3组，特别是1-4组与其它组相比死亡率低。
结论：
正如用被动免疫动物所作的试验所示，另外用蛋白(+/-MPL)主动免疫的协同效应不是由于抗多糖抗原的抗体的水平增加。
在用蛋白加被动给予抗多糖抗体进行免疫的组，尤其当3D-MPL也存在时，可观察到对肺炎球菌肺炎有明显的保护作用，这提示上述组合的协同作用。
如果抗多糖免疫是主动免疫(优选用偶联的多糖)，上述作用将更明显，因为B细胞有记忆效应，抗PS抗体在整个试验过程中的水平保持不变，都导致免疫应答的协作。
实施例4-通过与保护作用的相关性确定协同作用
人体用来清除感染的肺炎球菌的主要保护机制是抗体介导的调理吞噬作用(Bruyn et al.Clin.Infect.Dis.14：251(1992))。目前已建立了数种ELISA方法，以检测荚膜多糖抗体的浓度，作为保护作用的相关指标，很明显，体外调理吞噬试验是更好的保护作用相关指示(Musher et al.J.Infect.Dis.182：158(2000))。
本发明肺炎球菌蛋白可提供针对肺炎球菌感染的保护作用，其机制不同于抗体介导的调理吞噬作用。在实施例2中，偶联物和蛋白共同进行主动免疫能产生协同作用，而这种协同作用不能用抗体浓度的差异来解释，因为在所涉及的两组试验中，抗体的浓度相同。因此，能观察到的另一部分保护作用一定来自协同效应。同样，因抗体是被动加入的，故在实施例3中也获得了同样的结论。
在许多情况下，本发明的肺炎球菌蛋白是表面结合蛋白，预计它们本身即可提供一些调理活性。在这种情况下，通过定量检测抗肺炎球菌蛋白的调理活性来区别保护机制是可能的，所述检测可用来评估调理活性对保护作用的其它协同机制所起相对作用。
在小鼠肺定居模型中，每种疫苗的相对保护可用对肺脏中细菌的清除来评估。或者，用通常对疫苗评估所用的，以病例率(case rates)来评估疫苗的效力。
％保护＝(CPU/对照肺脏-CPU/疫苗肺脏)/(CPU/肺脏对照)
％效力＝(对照病例-疫苗病例)/(对照病例)
为确定来源于协同效应的保护或效力所占的部分，关键是确定哪一部分效力是基于调理滴度的比率而产生的。
在实施例3中，通过组合产生的％保护是由于蛋白/抗体成分之间的协同而产生的，因为所述蛋白或所述抗多糖抗体单独都不能提供更多的保护。
在相对调理活性的基础上评估协同效应的保护程度是可能的。如抗荚膜多糖抗体所赋予的调理活性是X，抗肺炎球菌蛋白抗体所赋予的活性是Y，则总调理活性可表示为X+Y，蛋白的调理活性的相对比例可表示为Y/X+Y。将其与疫苗的相对保护效力相比较，其中疫苗的抗多糖部分提供的保护效力是A％，多糖加蛋白的疫苗的保护效力是B％。那些并非由调理活性所致的额外效力即可计为剩余保护活性(协同作用)＝B％-A％-B％*(Y/X+Y)。
该实施例无意于限制评估协同作用的方式。一旦发现保护作用的其它相关指标，便可用这些相关指标来评估协同作用。
正如对每篇文献分别引入作参考的说明一样，本发明引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请都纳入本文作参考。

Claims (16)

1.一种免疫原性组合物，其包含至少一种肺炎链球菌多糖抗原和至少一种选自下组的肺炎链球菌蛋白抗原：PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133，或其免疫功能等效物。
2.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述多糖抗原以多糖-蛋白载体偶联物的形式存在。
3.权利要求2的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白选自下组：白喉类毒素，破伤风类毒素，CRM197，匙孔血蓝蛋白(KLH)，结核菌素的蛋白衍生物(PPD)和流感嗜血杆菌蛋白D。
4.权利要求1至3任一项的免疫原性组合物，其中所述疫苗包含至少4种来源于不同血清型的肺炎球菌多糖抗原。
5.本发明权利要求的免疫原性组合物，还包含佐剂。
6.权利要求5的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含铝盐。
7.权利要求5的免疫原性组合物，其中所述佐剂是TH1应答的优先诱导剂。
8.权利要求7的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含至少一种选自下组的物质：3D-MPL，皂苷免疫刺激物，或免疫刺激性CpG寡核苷酸。
9.权利要求8的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含选自下组的载体：水包油乳剂，脂质体和铝盐。
10.本文权利要求的免疫原性组合物，其用作药物。
11.包含权利要求1-9的免疫原性组合物的疫苗。
12.一种预防或缓解55岁以上患者的肺炎链球菌感染的方法，其包含给药有效量的疫苗，所述疫苗包含肺炎链球菌多糖和至少一种选自下组的肺炎链球菌蛋白，还任选包含TH1诱导佐剂：PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133。
13.与肺炎链球菌蛋白抗原组合并可选与TH1诱导型佐剂组合的肺炎球菌多糖抗原的用途，用于制备预防或治疗55岁以上患者的肺炎的药物，所述肺炎链球菌蛋白抗原选自PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133。
14.与肺炎链球菌蛋白抗原组合并可选与TH1诱导型佐剂组合的肺炎球菌多糖抗原的用途，用于制备预防或治疗婴幼儿的中耳炎的药物，所述肺炎链球菌蛋白抗原选自PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133。
15.一种制备本发明权利要求的免疫原性组合物的方法，该方法包含：
选择一种或多种肺炎球菌多糖抗原；
选择一种或多种选自下组的肺炎球菌蛋白抗原：PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133；和
将上述多糖，蛋白抗原和适当的赋形剂混合。
16.一种预防或缓解婴幼儿中耳炎的方法，其包含向所述婴幼儿给药安全并有效的量的疫苗，所述疫苗包含肺炎链球菌多糖抗原和选自下组的肺炎链球菌蛋白抗原，并任选包含TH1佐剂：PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133。
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