KR20030031187A - 백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세균 폴리사카라이드 항원 백신 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 폐렴구균 폴리사카라이드 항원, 일반적으로 PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp125, Sp101, Sp128, Sp130 및 Sp133으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 스트렙토코커스 뉴모니애로부터의 폐렴구균 폴리사카라이드 컨쥬게이트 항원 및 임의로 TH1 유도 어쥬번트를 포함하는 백신에 관한 것이다.

Description

백신{VACCINE}
스트렙토코커스 뉴모니애는 침습성 질병, 예를 들어 폐렴, 균혈증 및 뇌막염 및 전이증식 관련 질병, 예를 들어 급성 중이염을 야기하는, 상당한 이환율 및 사망율 (특히 소아 및 노년층에서)의 원인이 되는 그람 양성 세균이다. 미국에서 60세 이상의 사람에 대한 폐렴구균성 폐렴 발생율은 100,000명당 3 내지 8명으로 추정된다. 환자의 20%에서는 균혈증 및 다른 증상, 예를 들어 뇌막염을 야기하고 이에 의한 사망율은 항생제 치료에도 불구하고 30%에 근접한다.
폐렴구균은 혈청형 특이성을 부여하는 화학적으로 연결된 폴리사카라이드로 캡슐화된다. 폐렴구균의 90가지의 혈청형이 알려져 있고, 캡슐은 보체 (complement)로부터 세균의 내부 표면을 보호할 뿐만 아니라 그 자체의 면역원성이낮기 때문에 폐렴구균의 주요한 병독성 결정자이다. 폴리사카라이드는 T-독립성 항원이고, 프로세싱되지 않거나 T-세포와 상호작용하는 MHC 분자상에 존재하지 않을 수 있다. 그러나, 이들은 B세포 상의 표면 수용체의 가교결합을 수반하는 교대 메카니즘을 통해 면역계를 자극할 수 있다.
몇가지의 실험에서 침습성 폐렴구균 질병에 대한 보호는 캡슐 특이적 항체와 가장 큰 관련성이 있고, 상기 보호는 혈청형 특이적이라는 것이 밝혀졌다.
폴리사카라이드 항원 기재 백신은 당업계에 공지되어 있다. 인간에 사용하기 위해 허가된 4개의 백신은 살모넬라 티피(Salmonella typhi)의 Vi 폴리사카라이드, 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)로부터의 PRP 폴리사카라이드, 혈청형 A, C, W135 및 Y로 이루어진 4가의 메닝고코커스(meningococcus), 및 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33에 대응하는 폴리사카라이드(폐렴구균성 혈액 단리물의 90% 이상을 구성)로 이루어진 23가의 폐렴구균 백신을 포함한다.
상기 마지막 3개의 백신은 유아의 심각한 이환율 및 사망율을 야기하는 호흡 감염을 발생시키는 세균에 대해 보호하는 작용을 하지만, 이들 백신은 2세 미만의 아동에서 부적절하게 면역원성을 보이기 때문에 상기 아동에 대한 사용이 허가되지 않았다 [Peltola et al. (1984), N. Engl. J. Med. 310: 1561-1566]. 스트렙토코커스 뉴모니애는 유아 및 아동의 침습성 세균 질병 및 중이염의 가장 흔한 원인이다. 유사하게, 노년층도 폐렴구균 백신에 대한 반응이 빈약하고 [Roghmann et al., (1987), J. Gerontol. 42: 265-270], 따라서 이들 연령층에서의 세균성 폐렴의 발생율이 증가한다 [Verghese and Berk, (1983) Medicine (Baltimore) 62: 271-285].
유아의 상기 면역원성의 결여를 극복하기 위해 고안된 전략은 큰 면역원성 단백질에 폴리사카라이드를 연결하여 방관자인 T-세포의 도움을 제공하고 컨쥬게이트되는 폴리사카라이드 항원에 대한 면역학적 기억을 유도하는 것을 포함한다. 폐렴구균 당단백질 컨쥬게이트 백신은 다양한 연령군에서 현재 안전하고, 면역원성 및 효능을 갖는 것으로 평가되고 있다.
23가의 비컨쥬게이트된 폐렴구균 백신은 임상 효능이 0% 내지 81%에 이를 정도로 매우 편차가 심한 것으로 밝혀졌다 (Fedson et al. (1994) Arch Intern Med. 154: 2531-2535). 상기 효능은 노년층과 같은 면역처리 위험군, Hodgkin 질병, 비장 제거술, 겸상적혈구병 및 감마글로불린혈증 (Fine et al. (1994) Arch Intern Med. 154: 2666-2677) 및 상기 질병 증상에 관련된 것으로 보인다. 상기 23가 백신은 폐렴구균성 폐렴 (노년층과 같은 특정 고위험군) 및 중이염에 대한 보호 효과를 보이지 않는다.
따라서, 개선된 폐렴구균 백신 조성물, 특히 노년층 및 아동에서 폐렴구균성 질병 (특히 폐렴)의 예방 또는 치료에 보다 효과적인 조성물에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명은 상기와 같은 개선된 백신을 제공한다.
<발명의 개요>
따라서, 본 발명은 하나 이상의 스트렙토코커스 뉴모니애 폴리사카라이드 항원 (바람직하게는 단백질 캐리어에 컨쥬게이트된) 및 폴리히스티딘 트리아드 패밀리 (Pht, 예를 들어 PhtA, PhtB, PhtD 또는 PhtE), Lyt 패밀리 (예를 들어 LytA, LytB 또는 LytC), SpsA, Sp128, Sp130, Sp125, Sp1O1 및 Sp133으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 스트렙토코커스 뉴모니애 단백질 항원 또는 이들의 트런케이트(truncate) 또는 면역학적 기능 균등체를 임의로 Th1 어쥬번트 (Th1 면역 반응을 우선적으로 유도하는 어쥬번트)와 함께 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 폐렴구균 단백질과 TH1 어쥬번트가 모두 포함된다. 상기 본 발명의 폐렴구균 단백질들의 조합물 및 본 발명의 폐렴구균 단백질과 다른 폐렴구균 단백질의 조합물을 포함하는 유리한 조성물도 제공한다. 본 발명의 조성물은 노년층 폐렴 치료에 특히 적합하다.
폐렴구균 폴리사카라이드 백신 (컨쥬게이트되거나 되지 않음)은 폐렴 발생율이 매우 높은 노년층에 대해 폐렴 보호 작용을 할 수 없다. 폐렴구균에 대한 주요 방어 메카니즘은 옵소노파고사이토시스(opsonophagocytosis) (폐렴구균 폴리사카라이드에 대한 항체의 생성에 의해 발생하는 체액성 B-세포/호중구 매개 현상, 세균은 최종적으로 식작용에 의해 소화됨)이지만, 관련 옵소닌 메카니즘의 일부, 즉 PMN (다핵형 세포)에 의한 수퍼옥시드의 생성, 다른 반응성 산소종의 생성, PMN 이동, PMN 세포사멸, PMN의 변형성이 노년층에서 손상된다. 항체 반응도 노년층에서 손상될 수 있다.
통상 승인된 정설과는 달리, 항-캡슐 폴리사카라이드 항체의 정상 수준은 폐렴구균이 숙주 세포를 침습하여 면역계의 상기 브랜치를 빠져나갈 수 있기 때문에세균의 완전한 제거에 효과적이지 않을 수 있다.
놀랍게도 본 발명자들은 면역계 (B-세포 매개)의 체액성 브랜치와 함께 면역계의 세포 매개 브랜치 (예를 들어 T-세포 매개 면역)을 동시에 자극함으로써 숙주로부터 폐렴구균 제거를 증강시킬 수 있는 시너지 (또는 협력)가 발생할 수 있다는 것을 밝혀내었다. 이것은 일반적으로 폐렴구균 감염의 예방 (또는 치료)에 유익하고, 폴리사카라이드 기재 백신이 효능을 발휘하지 않는 노년층에서 폐렴의 예방 (또는 치료)에 특히 중요한 발견이다.
특정 이론에 지지되기를 바라지 않지만, 본 발명자들은 폐렴구균 폴리사카라이드 (바람직하게는 단백질 캐리어에 컨쥬게이트됨)가 PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp125, Sp1O1, Sp128, Sp130 및 Sp133 (감염된 포유동물 세포의 표면 상의 클래스 II 및 MHC 클래스 I에 존재하고 프로세싱될 수 있는 단백질)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 폐렴구균 단백질과 함께 투여될 경우 면역계의 두 브랜치가 상기 방식으로 시너지 효과를 발휘할 수 있다는 것을 밝혀내었다. 상기 하나 이상의 폐렴구균 단백질이 그 자체에 의해 세포 매개 면역성을 촉발할 수 있지만, 본 발명자들은 또한 백신 제제 내의 TH1 유도 어쥬번트의 존재가 면역계의 세포 매개 면역성에 도움을 주고, 추가로 면역계의 두 브랜치의 시너지 효과를 더욱 증강시킨다는 것을 놀랍게도 밝혀내었다.
본 발명은 세균 폴리사카라이드 항원 백신, 그의 제조 방법 및 상기 폴리사카라이드의 의약에서의 용도에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)로부터의 단백질 항원 및 임의로 TH1 유도 어쥬번트와 함께 제제화된, 폐렴구균(pneumococcus) 폴리사카라이드 항원, 일반적으로 폐렴구균 폴리사카라이드 컨쥬게이트 항원을 포함하는 백신에 관한 것이다.
본 발명은 특히 노년층 (및(또는) 유아 및 소아)의 폐렴구균 감염의 예방 또는 치료를 위한 개선된 백신을 제공한다.
본 발명에서 환자는 55세 이상, 일반적으로 60세 이상, 보다 일반적으로는 65세 이상인 경우 노년층으로 간주한다.
따라서, 본 발명의 일실시태양에서 하나 이상의 스트렙토코커스 뉴모니애 폴리사카라이드 항원 및 PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp125, Sp1O1, Sp128, Sp130 및 Sp133으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 스트렙토코커스 뉴모니애 단백질 항원을 포함하는, 노년층 (및(또는) 유아 및 소아)에 사용하기 적합한 백신 조성물이 제공된다. 이 백신은 임의로 TH1 어쥬번트를 포함할 수 있다.
제2의 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상(2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)의 스트렙토코커스 뉴모니애 폴리사카라이드 항원(들) 및 PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp125, Sp1O1, Sp128, Sp130 및 Sp133으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 스트렙토코커스 뉴모니애 단백질 항원, 및 바람직하게는 TH1 어쥬번트를 포함하는 백신 (노년층의 폐렴 예방에 적합)을 제공한다.
상기 실시태양에서, 본 발명의 상기 폐렴구균 단백질들의 조합물 및 본 발명의 폐렴구균 단백질과 다른 폐렴구균 단백질의 조합물을 포함하는 백신도 이하에 설명하는 바와 같이 본 발명에 포함된다.
상기 백신은 또한 다른 고위험군, 예를 들어 유아 또는 소아의 폐렴구균 감염 (예를 들어 중이염) 치료에도 유용한 것으로 생각된다.
본 발명의 스트렙토코커스 뉴모니애 폴리사카라이드 항원
일반적으로, 본 발명의 스트렙토코커스 뉴모니애 백신은 폐렴구균의 4가지 이상의 혈청형에서 유도된 폴리사카라이드 항원 (바람직하게는 캐리어 단백질에 컨쥬게이트됨)를 포함할 것이다. 바람직하게는, 4개의 혈청형은 6B, 14, 19F 및 23F를 포함한다. 보다 바람직하게는, 7가지 이상의 혈청형, 예를 들어 혈청형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F에서 유래한 혈청형이 조성물에 포함된다. 보다 더 바람직하게는, 11가지 이상의 혈청형이 조성물에 포함된다. 예를 들어 한 실시태양의 조성물은 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F에서 유래한 캡슐 폴리사카라이드(바람직하게는 캐리어 단백질에 컨쥬게이트됨)를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 13가지 이상의 폴리사카라이드 항원 (바람직하게는 캐리어 단백질에 컨쥬게이트됨)이 포함되지만, 추가의 폴리사카라이드 항원, 예를 들어 23가 (예를 들어 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, llA, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F)도 본 발명에 포함된다..
노년층 백신 처리 (예를 들어 폐렴 예방용)를 위해서는 15가 백신을 형성하기 위해 상기한 11가 항원 조성물에 혈청형 8 및 12F (가장 바람직하게는 15 및 22도 포함)를 포함시키는 것이 유리하고, 유아 또는 소아 (중이염이 주관심사가 되는)의 경우 13가 백신을 형성하기 위해 혈청형 6A 및 19A를 포함시키는 것이 유리하다.
상기 폴리사카라이드는 그 전체 길이의 천연 형태로 사용될 수 있지만, 면역원성을 계속 갖는, 크기가 감소된 폴리사카라이드도 사용할 수 있다 (예를 들어 EP 497524 및 497525 참조).
노년층(55세 이상)에서 폐렴 및 유아 (18개월 이하) 및 소아 (일반적으로 18개월 내지 5세)에서 중이염 예방/치료를 위해 본원에서 개시하는 다가 스트렙토코커스 뉴모니애 폴리사카라이드를 PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp125, Sp1O1, Sp128, Sp130 및 Sp133으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 스트렙토코커스 뉴모니애 단백질, 또는 그의 면역학적 기능 균등체와 조합하는 것이 본 발명의 바람직한 실시태양이다. 폐렴구균 단백질의 조합물도 후술하는 바와 같이 유리하게 이용될 수 있다.
본 발명의 폐렴구균 단백질
본 발명의 목적을 위해, "면역학적 기능 균등체"는 본 발명의 단백질의 하나 이상의 보호 에피토프를 포함하는 단백질의 펩티드로서 정의된다. 상기 에피토프는 표면 노출되고, 보존도가 높고, 숙주에서 멸균 항체 반응을 유도하거나 독성 효과를 억제할 수 있는 특징을 갖는다. 바람직하게는, 기능 균등체는 본 발명의 단백질의 15개 이상, 바람직하게는 30개 이상의 연속하는 아미노산을 갖는다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 단백질의 단편, 결실, 예를 들어 트랜스멤브레인 결실 변이체 (즉, 단백질의 세포외 도메인의 사용), 융합, 화학적 또는 유전적 비독성화 유도체 등도 이들이 천연 단백질과 실질적으로 동일한 면역 반응을 유도할 수 있다면 사용될 수 있다. 단백질 서열 내의 효능있는 B-세포 에피토프의 위치는 두가지 방법, 즉 2차원 구조 예측 및 항원 지수 예측을 조합하여 표면 노출되고 항원성인 펩티드를 확인함으로써 용이하게 결정할 수 있다. 2차원 구조 예측은 PSIPRED 프로그램 (David Jones, Brunel Bioinforrnatics Group, Dept. Biological Sciences,Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, UK)을 사용하여 수행할 수 있다. 항원 지수는 문헌 [Jameson and Wolf, CABIOS 4: 181-186 (1988)]에 기재된 방법을 기초로 하여 계산할 수 있다.
본 발명의 단백질은 모두가 폐렴구균의 외부 표면에 노출된 이하에 기재하는 단백질 (폐렴구균의 적어도 일부의 생활 주기 동안 숙주의 면역계에 의해 인식될 수 있음) 또는 폐렴구균에 의해 분비 또는 방출되는 단백질이다.
본 발명의 스트렙토코커스 뉴모니애 단백질은 바람직하게는 폴리히스티딘 트리아드 패밀리 (Pht)의 단백질, Lyt 패밀리의 단백질, 콜린 결합 단백질, LPXTG 모티브(X는 임의의 아미노산임)를 갖는 단백질, 타입 II 시그날 서열 모티브 LXXC (X는 임의의 아미노산임)를 갖는 단백질, 및 타입 I 시그날 서열 모티브를 갖는 단백질로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 상기 카테고리 (또는 모티브) 내의 바람직한 예는 하기 단백질 (또는 그의 트런케이트 또는 면역학적 기능 균등체)이다.
Pht (폴리히스티딘 트리아드) 패밀리는 단백질 PhtA, PhtB, PhtD 및 PhtE를 포함한다. 상기 패밀리는 지질화 서열, 프롤린 풍부 영역에 의해 분리된 2개의 도메인 및 가능하게는 금속 또는 뉴클레오시드 결합 또는 효소 활성에 관련된 수개의 히드티딘 트리아드, (3-5) 코일드-코일(coiled-coil) 영역, 보존된 N-말단 및 이종성 C 말단에 의해 특징지워진다. 이 패밀리는 시험된 모든 폐렴구균 균주에 존재한다. 상동성 단백질도 다른 스트렙토코커스 및 네이세리아(Neisseria)에서 발견되었다. 바람직한 상기 패밀리의 멤버는 PhtA, PhtB 및 PhtD를 포함한다. 보다 바람직하게는, PhtA 또는 PhtD를 포함한다. 그러나, 용어 Pht A, B, D, 및 E는 아래에서 인용된 문헌에 개시된 서열을 갖는 단백질 및 언급된 단백질과 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 그의 천연 (및 인공) 변이체를 의미하는 것으로 이해된다. 바람직하게는, 95% 이상, 가장 바람직하게는 97% 이상 동일하다.
Pht 단백질의 경우, PhtA는 WO 98/18930에 개시되어 있고, Sp36로도 언급된다. 상기한 바와 같이, 이는 폴리히스티딘 트리아드 패밀리의 단백질이고, LXXC의 타입 II 시그날 모티브를 갖는다.
PhtD는 WO 00/37105에 개시되어 있고, Sp036D로도 언급된다. 상기한 바와 같이, 이는 폴리히스티딘 트리아드 패밀리의 단백질이고, 타입 II LXXC 시그날 모티브를 갖는다.
PhtB는 WO 00/37105에 개시되어 있고, Sp036B로도 언급된다. PhtB 패밀리의 다른 멤버는 WO 00/17370에 개시된 C3-분해 폴리펩티드이다. 이 단백질도 폴리히스티딘 트리아드 패밀리에 속하고, 타입 II LXXC 시그날 모티브를 갖는다. 바람직한 면역학적 기능 균등체는 WO 98/18930에 개시된 단백질 Sp42이다. PhtB 트런케이트 (약 79kD)는 W099/15675에 개시되어 있고, 이 역시 PhtX 패밀리로 간주된다.
PhtE는 WO00/30299에 개시되어 있고, BVH-3으로 언급된다.
SpsA는 콜린 결합 단백질 (Cbp)로서 WO 98/39450에 개시되어 있다.
Lyt 패밀리는 세포 용해(lysis)와 관련된 멤브레인 관련 단백질이다. N-말단 도메인은 콜린 결합 도메인(들)을 포함하지만, Lyt 패밀리는 아래에 설명하는 콜린 결합 단백질 패밀리에서 발견되는 모든 특징을 갖는 것은 아니기 때문에, 본 발명에 있어서 Lyt 패밀리는 Cbp 패밀리와는 별개의 것으로 간주된다. Cbp 패밀리와는 달리, C-말단 도메인은 Lyt 단백질 패밀리의 촉매 활성 도메인을 포함한다. 이 패밀리는 LytA, B 및 C를 포함한다. Lyt 패밀리에 있어서, LytA는 문헌 [Ronda et al., Eur J Biochem, 164: 621-624 (1987)]에 개시되어 있다. LytB는 WO 98/18930에 개시되어 있고, Sp46으로도 언급된다. LytC는 WO 98/18930에 개시되어 있고, Sp91로도 언급된다. 상기 패밀리의 바람직한 멤버는 LytC이다.
또다른 바람직한 실시태양은 "Lyt"가 상기 정의한 바와 같고 "트런케이트"가 콜린 결합 영역의 50% 이상이 결여된 단백질을 의미하는 Lyt 패밀리 트런케이트이다. 바람직하게는, 상기 단백질은 전체 콜린 결합 영역이 결여된 것이다.
Sp125는 LPXTG (X는 임의의 아미노산임)의 세포벽에 앵커링된 모티브를 갖는 폐렴구균 표면 단백질의 예이다. 상기 모티브를 갖는 폐렴구균 표면 단백질의 상기 클래스 내의 임의의 단백질은 본 발명에서 유용한 것으로 밝혀졌고, 따라서 본 발명의 추가의 단백질로 간주된다. Sp125 자체는 WO 98/18930에 개시되어 있고, ZmpB (아연 메탈로프로테이나제)로도 언급된다.
Sp1O1은 WO 98/06734 (#y85993로 언급됨)에 개시되어 있다. 이것은 타입 I 시그날 서열에 의해 특징지워진다.
Sp133은 WO 98/06734 (#y85992로 언급됨)에 개시되어 있다. 이도 역시 타입 I 시그날 서열에 의해 특징지워진다.
Sp128 및 Sp130은 WO 00/76540에 개시되어 있다.
본 발명에 사용되는 단백질은 PhtD 및 PhtA, 또는 이들 단백질의 조합물로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 하나 이상의 폐렴구균 단백질과 다른 폐렴구균 단백질과의 유리한 조합
본 발명의 백신에서, 본 발명의 상기 각각의 단백질 (바람직하게는 PhtD와 PhtA 중 어느 하나 또는 둘 모두)은 다음의 하나 이상의 폐렴구균 단백질과 유리하게 조합될 수도 있다: 뉴몰리신 (pneumolysin, Ply로도 언급되고, 바람직하게는 화학 처리 또는 돌연변이에 의해 비독성화됨) [WO 96/05859, WO 90/06951, WO 99/03884], PsaA 및 그의 트랜스멤브레인 결실 변이체 (Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec; 64 (12): 5255-62), PspA 및 그의 트랜스멤브레인 결실 변이체 (US 5804193, WO 92/14488, WO 99/53940), PspC 및 그의 트랜스멤브레인 결실 변이체 (WO 97/09994, WO 99/53940), 콜린 결합 단백질 (Cbp) 패밀리의 멤버 [예를 들어 CbpA 및 그의 트랜스멤브레인 결실 변이체 (WO 97/41151, WO 99/51266)], 글리세르알데히드-3-포스페이트-데히드로게나제 (Infect. Immun. 1996 64: 3544), HSP70 (WO 96/40928), PcpA (Sanchez-Beato et al. FEMS Microbiol Lett 1998, 164: 207-14), M 유사 단백질 (SB의 EP 0837130) 및 어드헤신(adhesin) 18627 (SB의 EP 0834568). 본 발명은 또한 상기 단백질의 면역학적 기능 균등체 또는 트런케이트 (상기한 바와 같음)을 포함한다.
콜린 결합 단백질 패밀리에 있어서, 패밀리의 멤버는 콜린 친화도 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있는 폐렴구균 단백질로서 처음 확인되었다. 모든 콜린 결합 단백질은 세포벽 테이코산 및 멤브레인 연관 리포테이코산의 포스포릴콜린 잔기에 비공유결합에 의해 결합된다. 구조적으로, 이들은 전체 패밀리에 걸쳐 공통적인 몇개의 영역을 갖지만, 이 단백질의 특성 (아미노산 서열, 길이 등)은 상이할 수 있다. 일반적으로, 콜린 결합 단백질은 N 말단 영역 (N), 보존 반복 영역 (R1 및(또는) R2), 프롤린 풍부 영역 (P) 및 상기 단백질의 약 1/2을 포함하는, 다중 반복체로 이루어진 보존된 콜린 결합 영역 (C)을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "콜린 결합 단백질 패밀리 (Cbp)"는 WO 97/41151에서 확인된 콜린 결합 단백질 PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD 및 CbpG로 이루어진 군 중에서 선택된다. CbpA는 WO 97/41151에 개시되어 있다. CbpD 및 CbpG는 WO 00/29434에 개시되어 있다. PspC는 WO 97/09994에 개시되어 있다. PbcA는 WO 98/21337에 개시되어 있다. 바람직하게는, 콜린 결합 단백질은 CbpA, PbcA, SpsA 및 PspC로 이루어진 군 중에서 선택된다.
Cbp가 사용되는 추가의 단백질일 경우, 이 단백질은 "Cbp"가 상기 정의한 바와 같고 "트런케이트"가 콜린 결합 영역의 50% 이상이 결여된 단백질을 의미하는 Cbp 트런케이트이다. 바람직하게는, 상기 단백질은 전체 콜린 결합 영역이 결여된 것이다. 보다 바람직하게는, 상기 단백질 트런케이트에는 (i) 콜린 결합 영역 및 (ii) 상기 단백질의 N-말단 절반의 일부가 결여되어 있지만, 하나 이상의 반복체 영역 (R1 또는 R2)는 존재한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 트런케이트는 2개의 반복 영역 (R1 및 R2)를 갖는다. 상기 바람직한 예는 W099/51266 또는 W099/51188에 개시된 NR1xR2 및 R1xR2이지만, 유사한 콜린 결합 영역이 결여된 다른 콜린 결합 단백질도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
Cbp 트런케이트-Lyt 트런케이트 키메라 단백질 (또는 융합체)도 본 발명의백신에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 단백질은 Cbp의 NR1xR2 (또는 R1xR2) 및 Lyt의 C-말단 부분 ("Cterm", 즉 콜린 결합 도메인이 결여됨, 예를 들어 LytCCterm 또는 Sp91Cterm)을 포함한다. 보다 바람직하게는, Cbp는 CbpA, PbcA, SpsA 및 PspC로 이루어진 군 중에서 선택된다. 보다 더 바람직하게는, 상기 단백질은 CbpA이다. 바람직하게는, Lyt는 LytC (Sp91로도 언급됨)이다.
콜린 결합 도메인 (C)가 결여되고 Lyt와의 융합 단백질로서 발현되는 PspA 또는 PsaA 트런케이트도 사용될 수 있다. 바람직하게는 Lyt는 LytC이다.
본 발명의 목적을 위해 바람직한 폐렴구균 단백질의 조합물
바람직하게는, 본 발명의 단백질의 조합물은 LXXC (X는 임의의 아미노산임)의 타입 II 시그날 서열 모티브를 갖는 단백질 (예를 들어 폴리히스티딘 트리아드 패밀리 (Pht)), 콜린 결합 단백질 (Cbp), 타입 I 시그날 서열 모티브를 갖는 단백질 (예를 들어 Sp1O1), LPXTG 모티브 (X는 임의의 아미노산임)를 갖는 단백질 (예를 들어 Sp128, Sp130), 톡신 (예를 들어 Ply) 등과 같은 2개 이상 (3 또는 4개)의 상이한 카테고리로부터 선택된다. 상기 카테고리 (또는 모티브) 내의 바람직한 예는 상기한 단백질 또는 그의 면역학적 기능 균등체이다. 톡신 + Pht, 톡신 + Cbp, Pht + Cbp 및 톡신 + Pht + Cbp가 바람직한 카테고리 조합물이다.
바람직한 유리한 조합물은 PhtD + NR1xR2, PhtD + NR1xR2-Sp91Cterm 키메라 또는 융합 단백질, PhtD + Ply, PhtD + Sp128, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NR1xR2, PhtA + NR1xR2-Sp91Cterm 키메라 또는 융합 단백질, PhtA + Ply, PhtA + Sp128, PhtA + PsaA, PhtA + PspA, NR1xR2 + LytC, NR1xR2 + PspA, NR1xR2 + PsaA,NR1xR2 + sp128, R1xR2 + LytC, R1xR2 + PspA, R1xR2 + PsaA, R1xR2 + sp128, R1xR2 + PhtD, R1xR2 + PhtA를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는, NR1xR2 (또는 R1xR2)는 CbpA 또는 PspC로부터 유래한다. 보다 바람직하게는, CbpA로부터 유래한다.
폐렴구균 단백질의 특히 바람직한 조합물은 Ply (또는 그의 트런케이트 또는 면역학적 기능 균등체) + PhtD (또는 그의 트런케이트 또는 면역학적 기능 균등체) + NR1xR2 (또는 R1xR2)를 포함한다. 바람직하게는, NR1xR2 (또는 R1xR2)는 CbpA 또는 PspC로부터 유래한다. 보다 바람직하게는, CbpA로부터 유래한다.
특정 이론에 지지되기를 원치 않지만, 상기 조성물 내의 본 발명의 폐렴구균 단백질 (또는 상기한 조합물)은 폐렴구균에 의한 공격을 억제하고 옵소노파고사이토시스 자극을 위한 면역계의 체액성 브랜치와 협력하는, 폐렴구균 질병에 대한, 특히 폐렴구균에 대한 보호에 필요한 T-세포 매개 반응 유도를 돕는다. 상기 단백질 항원을 포함할 경우의 추가의 잇점은 옵소노파고사이토시스 과정을 위한 추가의 항원을 제시한다는 것이다.
따라서, 본 발명의 한 실시태양에서는 4개 이상의 혈청형, 바람직하게는 7개 이상의 혈청형, 보다 바람직하게는 11개 이상의 혈청형에서 유래한 폴리사카라이드 항원을 포함하는 폐렴구균 폴리사카라이드 컨쥬게이트 백신 및 PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, sp125, Sp1O1, sp128, sp130 및 sp133 (또는 상기한 폐렴구균 단백질의 조합물)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상, 바람직하게는 2, 3 또는 4개의 스트렙토코커스 뉴모니애 단백질을 포함하는 스트렙토코커스 뉴모니애 백신이 제공된다. 바람직하게는, 상기 단백질의 하나는 PhtA (또는 그의 면역학적 기능 균등체)이다. 가장 바람직하게는, 상기 단백질의 하나는 PhtD (또는 그의 면역학적 기능 균등체)이다.
상기한 바와 같이, 백신 처리에 폴리사카라이드를 사용할 경우 발생되는 문제는 폴리사카라이드 자체의 면역원성이 낮다는 것이다. 이를 극복하기 위해, 폴리사카라이드는 단백질 캐리어에 컨쥬게이트되어 방관자 T-세포가 도울 수 있도록 만들 수 있다. 따라서, 본 발명에 이용되는 폴리사카라이드는 상기 단백질 캐리어에 연결되는 것이 바람직하다. 폴리사카라이드 면역원 제조에 통상 사용되는 상기 캐리어의 예는 디프테리아 (Diphtheria) 및 테타누스 (Tetanus) 톡소이드 (각각 DT, DT CRM197 및 TT), 키홀 림펫 헤모시아닌 (Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH)), 엔. 메닝기티디스 (meningitidis) 유래의 OMPC 및 튜베르큘린 (Tuberculin)의 정제된 단백질 유도체 (PPD)를 포함한다.
폐렴구균 폴리사카라이드 기재 면역원 조성물 (또는 백신)을 위한 바람직한 캐리어는 해모필루스 인플루엔자 유래의 단백질 D (EP 594610-B) 또는 그의 단편이다. 사용하기 적합한 단편은 T 헬퍼 에피토프를 포함하는 단편을 포함한다. 특히, 단백질 D 단편은 단백질의 N 말단의 1/3을 포함하는 것이 바람직하다. 단백질 D 캐리어는 놀랍게도 다중 폐렴구균 폴리사카라이드 항원이 컨쥬게이트된 백신에서 캐리어로서 유용하다. 동일한 캐리어가 각각의 폴리사카라이드에 대해 사용될 경우 일반적으로 에피토프 억제가 발생할 가능성이 있다. 놀랍게도, 본 발명자들은 단백질 D가 조합 백신에서 상기 에피토프 억제 효과를 최소화하기에 특히 적합하다는 것을 밝혀내었다. 조합물 내의 하나 이상의 폐렴구균 폴리사카라이드는 단백질 D에 유리하게 컨쥬게이트될 수 있고, 모든 항원이 상기 조합 백신 내의 단백질 D에 컨쥬게이트되는 것이 바람직하다.
폐렴구균 폴리사카라이드의 추가의 바람직한 캐리어는 폐렴구균 단백질 자체 (상기 "본 발명의 폐렴구균 단백질" 부분에서 정의한 바와 같음)이다.
상기 폴리사카라이드는 임의의 공지된 방법에 의해 캐리어 단백질에 연결될 수 있다 (예를 들어 Likhite의 미국 특허 제4,372,945호 및 Armor 등의 미국 특허 제4,474,757호). 바람직하게는, CDAP 컨쥬게이션이 수행된다 (WO 95/08348).
바람직하게는, 컨쥬게이트의 단백질:폴리사카라이드 (중량:중량) 비율은 0.3:1 내지 1:1, 보다 바람직하게는 0.6:1 내지 0.8:1, 가장 바람직하게는 약 0.7:1이다.
본 발명의 백신은 어쥬번트를 포함하는 것이 바람직하다. 적합한 어쥬번트는 알루미늄염, 예를 들어 수산화알루미늄 겔 (alum) 또는 인산알루미늄을 포함하고, 칼슘, 마그네슘, 철 또는 아연의 염일 수도 있거나, 아실화 티로신 또는 아실화 당, 폴리사카라이드의 양이온 또는 음이온 유도체 또는 폴리포스파젠의 불용성 현탁액일 수도 있다.
어쥬번트는 면역 반응의 세포 매개 브랜치를 돕기 위해 TH1 타입의 반응을 우선적으로 유도하는 인듀서인 것을 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명의 TH1 어쥬번트
높은 수준의 TH1 타입 시토킨은 제시된 항원에 대한 세포 매개 면역 반응을유도하는 경향이 있고, 높은 수준의 TH2 타입 시토킨은 항원에 대한 체액성 면역 반응을 유도하는 경향이 있다.
TH1과 TH2 타입 면역반응의 구별이 절대적이지 않다는 것을 유의하는 것이 중요하다. 실제로, 개체는 TH1이 우세하거나 또는 TH2가 우세한 것으로 설명되는 면역 반응을 지지할 것이다. 그러나, 무린 CD4 +ve T 세포 클론에서 설명된 바와 같은 측면에서 시토킨 패밀리로 간주하는 것이 종종 편리하다 [Mosmann, T. R. and Coffman, R. L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, pl45-173]. 전통적으로, TH1 타입 반응은 T-림프구에 의한 INF-γ 및 IL-2 시토킨의 생성에 관련된다. 종종 TH1 타입 면역 반응 유도에 직접 관련된 다른 시토킨, 예를 들어 IL-12은 T-세포에 의해 생성되지 않는다. 이와 대조적으로, TH2 타입 반응은 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10의 분비와 관련된다. TH1 반응을 우세하게 촉진하는 적합한 어쥬번트 시스템은 모노포스포릴 리피드 A 또는 그의 유도체, 특히 3-데-O-아실화 모노포스포릴 리피드 A (3D-MPL) (이의 제조는 GB 2220211 A 참조), 및 모노포스포릴 리피드 A, 바람직하게는 3-데-O-아실화 모노포스포릴 리피드 A와 알루미늄염 (예를 들어 인산알루미늄 또는 수산화알루미늄)의 조합물 또는 수중유 에멀젼을 포함한다. 상기 조합물에서, 항원 및 3D-MPL은 동일한 입자 구조에 포함되어 항원 및 면역 자극 시그날의 보다 효율적인 전달을 가능하게 한다. 여러 연구는 3D-MPL이 alum-흡착 항원의 면역원성을 추가로 증강시킬 수 있음을 보여주었다 [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16: 708-14, EP 689454-B1].
증강된 시스템은 모노포스포릴 리피드 A와 사포닌 유도체의 조합물, 특히 WO 94/00153에 개시된 QS21과 3D-MPL의 조합물 또는 WO 96/33739에 개시된 QS21이 콜레스테롤로 켄칭된 반응원성이 낮은 조성물을 포함한다.
수중유 에멀젼 내의 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 포함하는 특히 효능있는 어쥬번트 제제는 WO 95/17210에 기재되어 있고, 바람직한 제제이다.
바람직하게는, 백신은 사포닌, 보다 바람직하게는 QS21을 추가로 포함한다. 또한, 제제는 수중유 에멀젼 및 토코페롤을 포함할 수 있다 (WO 95/17210).
또한, 본 발명은 본 발명의 단백질을 제약상 허용되는 부형제, 예를 들어 3D-MPL과 혼합하는 것을 포함하는 백신 제제의 제조 방법을 제공한다.
비메틸화 CpG 함유 올리고뉴클레오티드(WO 96/02555)도 TH1 반응의 우선적인 인듀서이고, 본 발명에 사용하기 적합하다.
본 발명의 특히 바람직한 조성물은 하나 이상의 컨쥬게이트된 폐렴구균 폴리사카라이드, 하나 이상의 본 발명의 폐렴구균 단백질 및 TH1 어쥬번트를 포함한다. 특정 이론에 지지되기를 바라지 않지만, 폐렴구균 단백질 (상기한 바와 같음) 및 면역계의 두 브랜치의 협력에 의한 세포 매개 반응의 유도는 상기 Th-1 어쥬번트에 의해 촉진될 수 있고, 이에 의해 일반적인 폐렴구균 질병, 중요하게는 노년층의 폐렴구균성 폐렴에 대해 특히 효과적인 백신을 얻을 수 있다.
본 발명의 추가의 특징에서, 본원에서 개시된 면역원 또는 백신의 의약에서의 용도가 제공된다.
한 실시태양에서, 스트렙토코커스 뉴모니애 폴리사카라이드 항원 및 PhtA,PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, sp125, sp1O1, sp128, sp130 및 sp133으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 폐렴구균 단백질 및 임의로 TH1 어쥬번트를 포함하는, 본원에서 개시된 유효량의 안전한 백신을 노인 환자 (55세 이상)에게 투여하는 것을 포함하는 상기 노인의 폐렴 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
다른 실시태양에서, 스트렙토코커스 뉴모니애 폴리사카라이드 항원 및 PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, sp125, sp1O1, sp128, sp130 및 sp133으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 스트렙토코커스 뉴모니애 단백질 항원 및 임의로 TH1 어쥬번트를 포함하는, 유효량의 안전한 백신을 유아 (18개월 이하) 또는 소아 (일반적으로 18개월 내지 5세)에게 투여하는 것을 포함하는 상기 유아 또는 소아의 중이염의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
바람직하게는, 상기 본 발명의 방법에서 폴리사카라이드 항원은 폴리사카라이드 단백질 컨쥬게이트로서 존재한다.
본 발명의 백신 제제
본 발명의 백신 제제는 전신계 또는 점막 경로를 통한 투여에 의해 감염에 취약한 포유동물의 보호 또는 치료에 사용될 수 있다. 상기 투여는 근내, 복강내, 피내 또는 피하 경로를 통해 또는 구강/소화, 호흡, 비뇨생식기로의 점막 투여를 통한 주사를 포함할 수 있다. 폐렴 또는 중이염 치료를 위한 백신의 비내 투여가 바람직하다 (폐렴구균의 비강인두 존재를 보다 효과적으로 억제하여 그의 초기 단계에서 감염을 완화시킴). 본 발명의 백신을 단일 투여로 투여할 수 있지만, 그 성분을 동일한 시간에 또는 상이한 시간에 서로 함께 투여할 수도 있다 (예를 들어폐렴구균 폴리사카라이드는 서로 개별적으로 서로에 대해 면역 반응의 최적 협력을 위해 백신의 세균 단백질 성분과 동시에 또는 상기 성분 투여 1 내지 2주 후에 투여될 수 있다). 동시 투여의 경우, 최적 TH1 어쥬번트는 임의의 또는 모든 상이한 투여 형태로 존재할 수 있지만, 백신의 세균 단백질 성분과 조합하여 존재하는 것이 바람직하다. 단일 투여 경로 이외에, 2개의 상이한 투여 경로를 사용할 수 있다. 예를 들어, 임의의 바이러스 항원은 ID (피내) 투여될 수 있고, 세균 단백질은 IM (근내) 또는 IN (비내) 투여될 수 있다. 폴리사카라이드는 IM (또는 ID) 투여될 수 있고, 세균 단백질은 IN (또는 ID) 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 백신은 프라이밍(priming) 투여는 IM 투여로, 부스터(booster) 투여는 IN으로 투여할 수 있다.
각 백신 투여량 내의 컨쥬게이트 항원의 양은 일반적인 백신에서 유의한 부작용이 발생하지 않으면서 면역보호 반응을 유도하는 양으로서 선택된다. 상기 양은 사용되는 특정 면역원의 종류 및 이의 제시 방법에 따라 결정될 것이다. 일반적으로, 각 투여량은 0.1 - 100 ㎍, 바람직하게는 0.1 - 50 ㎍, 보다 바람직하게는 0.1 - 10 ㎍, 가장 바람직하게는 1 - 5 ㎍의 폴리사카라이드를 포함할 것으로 예상된다.
백신 내 단백질 항원의 함량은 일반적으로 1 - 100 ㎍, 바람직하게는 5 - 50 ㎍, 가장 일반적으로 5 - 25 ㎍이다.
특정 백신에서 성분의 최적량은 개체의 적절한 면역 반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 초기 백신 처리 후에 개체에 대해 1회 또는 적절한 시간 간격으로 수회의 부스터 면역처리를 실시할 수 있다.
백신 제제는 문헌 [Vaccine Design, "The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenum Press New York)]에 기재된 바와 같이 일반적으로 제조된다. 리포좀 내 캡슐화는 Fullerton의 미국 특허 제4,235,877호에 기재되어 있다.
본 발명의 백신을 임의의 경로로 투여할 수 있지만, 상기 백신의 피부내 (ID) 투여는 본 발명의 한 실시태양이다. 인간 피부는 표피 위에 존재하는 각질층으로 불리는 외부 "각질" 큐티클을 포함한다. 상기 표피 아래와 피하조직 위에 존재하는 진피로 불리는 층이 존재한다. 백신을 피부, 특히 진피내로 주사하면 많은 추가의 잇점과 관련될 수 있는 면역 반응이 자극된다는 것이 밝혀졌다. 본원에 개시된 백신을 사용한 피내 백신 처리는 본 발명의 바람직한 특징이다.
통상의 피내 주사 기술인 "망투 (mantoux) 방법"은 피부를 세정한 후 한손으로 신장시키면서 좁은 게이지 바늘(26-31 게이지) 위쪽에 존재하는 베벨(bevel)을 사용하여 10 내지 15도의 각도로 삽입하는 것을 포함한다. 바늘의 베벨이 삽입된 후에, 바늘의 배럴을 낮게 위치시킨 후 다시 전진시키면서 경미한 압력을 제공하여 피부 아래로부터 상승시킨다. 이어서, 액체를 매우 서서히 주사하여 피부 표면에 수포 또는 혹을 형성시키고, 바늘을 서서히 빼낸다.
보다 최근에는, 피부 내로 또는 피부를 통하여 액체 약물을 투여하도록 고안된 장치가 문헌에 기재되어 있고, 예를 들어 WO 99/34850 및 EP 1092444에 기재된 장치, WO 01/13977, 미국 특허 제5,480,381호, 제5,599,302호, 제5,334,144호,제5,993,412호, 제5,649,912호, 제5,569,189호, 제5,704,911호, 제5,383,851호, 제5,893,397호, 제5,466,220호, 제5,339,163호, 제5,312,335호, 제5,503,627호, 제5,064,413호, 제5,520,639호, 제4,596,556호, 제4,790,824호, 제4,941,880호, 제4,940,460호, WO 97/37705 및 WO 97/13537에 기재된 제트 주사 장치가 사용된다. 백신 제제의 다른 피내 투여 방법은 통상의 주사기 및 바늘, 또는 고체 백신의 발사체성 전달 (ballistic delivery)을 위해 고안된 장치 (WO 99/27961), 또는 경피 패치 (WO 97/48440, WO 98/28037)를 포함할 수 있거나 또는 피부 표면에 사용될 수 있다 (경내 전달, WO 98/20734, WO 98/28037).
본 발명의 백신이 피부에, 보다 구체적으로는 진피에 투여될 경우, 백신은 낮은 액체 부피, 특히 약 0.05 ml 내지 0.2 ml로 사용된다.
본 발명의 피부 또는 피내 백신내 항원의 함량은 근내 백신 (상기 참조)의 통상의 투여량과 유사할 수 있다. 그러나, 피부 또는 피내 백신의 특징은 그 제제가 "저투여량"일 수 있다는 것이다. 따라서, "저투여량" 백신내 단백질 항원은 투여량당 0.1 내지 10 ㎍, 바람직하게는 0.1 내지 5 ㎍의 소량으로 존재하고, 폴리사카라이드 (바람직하게는 컨쥬게이트된) 항원은 투여량당 0.01 - 1 ㎍, 보다 바람직하게는 0.01 내지 0.5 ㎍의 폴리사카라이드로 존재할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "피내 전달"은 피부의 진피 영역에 백신의 전달을 의미한다. 그러나, 백신은 반드시 진피에만 존재하는 것은 아니다. 진피는 인간 피부 표면으로부터 약 1.0 내지 약 2.0 mm 내부에 위치한 피부내 층이지만, 개인차에 따라, 신체 부분에 따라 상이한 양으로 존재한다. 일반적으로, 진피는 피부 표면의 1.5 mm 내부에 위치하는 것으로 생각할 수 있다. 진피는 표면의 각질층 및 표피와 아래의 피하층 사이에 존재한다. 전달 방식에 따라, 백신은 최종적으로 진피 내에 단독으로 또는 주요 성분으로 존재할 수 있거나 또는 표피 및 진피 내에 최종적으로 분배될 수 있다.
또한, 본 발명은 상이한 병원체에 대해 보호 작용을 하는 조합 백신을 포함한다. 많은 소아 백신은 현재 아동에게 주사 횟수를 줄이기 위해 조합 백신으로서 투여되고 있다. 따라서, 소아 백신을 위해 다른 병원체로부터의 다른 항원을 본 발명의 백신과 함께 제제화할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 백신은 디프테리아 톡소이드 (DT), 파상풍 톡소이드 (TT) 및 백일해 성분 [일반적으로 탈독소화 백일해 톡소이드 (PT) 및 필라멘트상 해마글루티닌 (FHA)와 임의의 퍼탁틴 (PRN) 및(또는) 아글루티닌 1+2]을 포함하는 공지의 '3가' 조합 백신, 예를 들어 DT, TT, PT, FHA 및 PRN 항원을 포함하는 시판 백신 INFANRIX-DTPaTM(SmithKline Beecham Biologicals), 또는 전체 세포 백일해 성분, 예를 들어 SmithKline Beecham Biologicals s.a.에서 시판하는 TritanrixTM와 함께 제제화할 수 있다 (또는 별개로 제제화되어 동시에 투여될 수 있다). 또한, 조합 백신은 다른 항원, 예를 들어 B형 간염 바이러스 표면 항원 (HBsAg), 폴리오 바이러스 항원 (예를 들어 불활성화된 3가 폴리오 바이러스-IPV), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis) 외부 멤브레인 단백질, 비타입성(non-typeable) 해모필루스 인플루엔자 단백질, 엔. 메닝기티디스 B 외부 멤브레인 단백질을 포함할 수 있다.
조합 백신 (특히 중이염 예방을 위한)에 포함될 수 있는 바람직한 모락셀라 카타랄리스 단백질 항원의 예는 OMP106 [WO 97/41731 (Antex) 및 WO 96/34960 (PMC)], OMP21, LbpA 및(또는) LbpB [WO 98/55606 (PMC)], TbpA 및(또는) TbpB [WO 97/13785 & WO 97/32980 (PMC)], CopB [Helminen ME, et al. (1993) Infect. Immun. 61: 2003-2010], UspAl 및(또는) UspA2 [WO 93/03761 (University of Texas)], OmpCD, HasR (PCT/EP99/03824), PilQ (PCT/EP99/03823), OMP85 (PCT/EP00/01468), lipo06 (GB 9917977.2), lipolO (GB 9918208.1), lipoll (GB 9918302.2), lipol8 (GB 9918038.2), P6 (PCT/EP99/03038), D15 (PCT/EP99/03822), OmplAl (PCT/EP99/06781), Hly3 (PCT/EP99/03257) 및 OmpE이다. 조합 백신 (특히 중이염 예방을 위한)에 포함될 수 있는 바람직한 비타입성 해모필루스 인플루엔자 항원의 예는 핌브린(Fimbrin) 단백질 [(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] 및 이로부터 유래한 펩티드를 포함하는 융합체 [예를 들어 LBl(f) 펩티드 융합체, US 5843464 (OSU) 또는 WO 99/64067], OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)], P6 [EP 281673 (State University of New York)], TbpA 및(또는) TbpB, Hia, Hsf, Hin47, Hif, Hmw1, Hmw2, Hmw3, Hmw4, Hap, D15 (WO 94/12641), 단백질 D (EP 594610), P2 및 P5 (WO 94/26304)를 포함한다.
다른 조합물은 본 발명의 폐렴구균 PS 및 단백질과 예를 들어 인플루엔자로부터의 바이러스 항원 (약독화, 분할 또는 서브유닛 [예를 들어, 표면 당단백질 뉴라미니다제 (NA) 및 해마글루티닌 (HA), 예를 들어 Chaloupka 1. et al, Eur. Journal Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1996, 15: 121-127 참조]), RSV (예를 들어, F 및 G 항원 또는 F/G 융합체, 예를 들어 Schmidt A. C. et al, J Virol, May 2001, p. 4594-4603 참조), PIV3 (예를 들어 HN 및 F 단백질, Schmidt 등의 상기 문헌 참조), 바리셀라 (예를 들어 약독화 당단백질 I-V, 등), 및 임의의 (또는 모든) MMR (홍역, 이하선염, 풍진)의 성분(들)의 조합물이다.
전세계적인 중이염 치료 또는 예방을 위한 본 발명에 포함되는 바람직한 소아 조합 백신은 하나 이상의 스트렙토코커스 뉴모니애 폴리사카라이드 항원(들) (바람직하게는 단백질 D에 컨쥬게이트됨), PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, sp125, sp1O1, sp128, sp130 및 sp133으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 폐렴구균 단백질 (또는 그의 면역학적 기능 균등체), 및 모락세들라 카타랄리스 및(또는) 비타입성 해모필루스 인플루엔자 유래의 하나 이상의 표면 노출 항원을 포함한다. 단백질 D는 그 자체가 비타입성 에이취. 인플루엔자 (ntHi)에 대한 B 세포 매개 보호 효과를 생성시킬 수 있는 면역원이기 때문에 에피토프 억제 문제 (상기한 바와 같음)를 극복하기 위한 폐렴구균 폴리사카라이드에 대한 단백질 캐리어로서 유리하게 사용될 수 있다. 모락셀라 카타랄리스 또는 비타입성 해모필루스 인플루엔자 항원은 서브유닛 형태로 백신에 포함되거나 세균에서 유래한 외부 멤브레인 베지클 (blebs) 표면에 존재하는 항원으로서 첨가될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 항원 조성물 (및 백신)은 사용될 때까지 동결건조되고, 희석제로 즉석에서 재구성하여 사용된다. 보다 바람직하게는, 3D-MPL의 존재 하에 동결건조되고, 염수 용액으로 즉석에서 재구성된다. 별법으로, 단백질 및폴리사카라이드는 성분들이 재구성되어 사용 전에 혼합되거나 환자에게 별개로 투여되는 백신 키트 (어느 한 성분 또는 두 성분 모두 동결건조됨)에 별개로 보관될 수 있다. TH1 어쥬번트 (바람직하게는 3D-MPL)는 어느 하나의 성분 또는 두 성분 모두와 함께 존재할 수 있다.
백신의 동결건조는 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 액체 백신은 케이킹 방지제, 예를 들어 당, 예를 들어 수크로스 또는 락토스 (10 - 200 mg/mL의 초기 농도로 존재)의 존재 하에 동결건조된다. 동결건조는 일반적으로 일련의 단계, 예를 들어 -69 ℃에서 출발하여 점진적으로 3시간에 걸쳐 -24 ℃로 조정한 후 이 온도에서 18시간 동안 유지시키고 1시간에 걸쳐 점진적으로 -16 ℃로 조정하고, 이 온도에서 6시간 동안 유지시킨 후 3시간에 걸쳐서 점진적으로 +34 ℃로 조정하고, 최종적으로 이 온도에서 9시간 동안 유지시키는 싸이클로 수행한다.
조성물을 동결건조시켜 하나 이상의 안정한 조성물을 얻는다 (예를 들어 동결건조는 폴리사카라이드 항원의 분해를 억제한다). 또한, 상기 방법을 통해 놀랍게도 폐렴구균 폴리사카라이드에 대한 보다 높은 항체 역가를 얻을 수 있다. 이것은 PS 6B 컨쥬게이트에 대해 특히 의미있는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 다른 특징은 3D-MPL (바람직하게는 알루미늄 기재 어쥬번트 결여됨)을 사용하여 어쥬번트 처리된 PS 6B 컨쥬게이트, 및 PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, sp125, sp1O1, sp128, sp130 및 sp133으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 폐렴구균 단백질을 포함하는 동결건조된 항원 조성물이다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 예시하고자 한 것으로서 본 발명을 한정하는 것이 아니다.
실시예 1
에스. 뉴모니애 캡슐 폴리사카라이드:
11가 후보 백신은 EP 72513에 기재된 바와 같이 제조한 캡슐 폴리사카라이드 혈청형 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F를 포함한다. 각각의 폴리사카라이드는 CDAP 화학 (WO 95/08348)을 사용하여 활성화 및 유도체화시키고 단백질 캐리어에 컨쥬게이트시킨다. 모든 폴리사카라이드는 혈청형 3 (점도를 감소시키기 위해 크기를 감소시킴)을 제외하고 천연 형태로 컨쥬게이트된다.
단백질 캐리어:
선택되는 단백질 캐리어는 이. 콜라이 (E. coli)에서 발현되는 비타입성 해모필루스 인플루엔자 재조합 단백질 D (PD)이다.
단백질 D의 발현
해모필루스 인플루엔자 단백질 D
단백질 D 발현을 위한 유전 구조
출발 물질
단백질 D 코딩 DNA
단백질 D는 모든 혈청형의 에이치. 인플루엔자 및 비타입성 균주 중에서 가장 보존도가 높다. 전체 단백질 D를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 벡터 pHIC348는 포스그렌 박사 (Dr. A. Forsgren, Department of Medical Microbiology,University of Lund, Malmoe General Hospital, Malmoe, Sweden)로부터 입수하였다. 단백질 D의 DNA 서열은 문헌 [Janson et al. (1991) Infect. Immun. 59: 119-125]에 기재되어 있다.
발현 벡터 pMGl
발현 벡터 pMGl는 외래 삽입 유전자의 전사 및 번역을 위한 박테리오파지 λ 유래의 조절 성분(Shatzman et al., 1983)이 도입된 pBR322의 유도 벡터이다 (Gross et al., 1985). 또한, 앰피실린 내성 유전자가 카나마이신 내성 유전자로 교체되었다.
이. 콜라이 균주 AR58
이. 콜라이 균주 AR58은 SA500 유도체 (galE::TN10, lambdaKil-cI857 △Hl) 상에서 기성장시킨 P1 파지 원액으로 N99를 형질도입시켜 제조하였다. N99 및 SA500은 로젠버그 박사 (Dr. Martin Rosenberg, National Institute of Health) 실험실로부터 유도된 이. 콜라이 K12 균주이다.
발현 벡터 pMG 1
단백질 D의 생성을 위해, 이 단백질을 코딩하는 DNA를 발현 벡터 pMG 1에 클로닝하였다. 상기 플라스미드는 삽입 외래 유전자의 전사 및 번역을 유도하기 위해 람다 파지 DNA의 시그날을 이용한다. 상기 벡터는 N 단백질이 제공될 때 전사 극성 효과를 제거하기 위해서 프로모터 PL, 오퍼레이터 OL 및 2개의 이용 부위 (NutL 및 NutR)를 포함한다 (Gross et al., 1985). PL 프로모터를 포함하는 벡터는 이. 콜라이 리소겐성(lysogenic) 숙주에 도입되어 플라스미드 DNA를 안정화시킨다. 리소겐성 숙주 균주는 게놈 내에 통합된 복제 결함 람다 파지 DNA를 포함한다 (Shatzman et al., 1983). 염색체 람다 파지 DNA는 벡터의 OL 리프레서에 결합하는 cI 리프레서 단백질의 합성을 유도하여 PL 프로모터에 대한 RNA 폴리머라제의 결합을 억제하고 이에 따라 삽입 유전자의 전사를 억제한다. 발현 균주 AR58의 cI의 유전자는 PL 지시 전사가 온도 변화에 의해 조절될 수 있도록 온도 감수성 변이체를 포함한다. 즉, 배양 온도의 증가는 리프레서를 불활성화시켜 외래 단백질의 합성이 개시된다. 이 발현 시스템은 외래 단백질, 특히 세포에 독성일 수 있는 단백질의 조절된 합성을 가능하게 한다 (Shimataka & Rosenberg, 1981).
이. 콜라이 균주 AR58
단백질 D 캐리어의 제조에 사용되는 AR58 리소겐성 이. 콜라이 균주는 표준 NIH 이. 콜라이 K12 균주 N99의 유도체 (F-su-galK2, lacZ-thr-)이다. 이 균주는 결함 리소겐성 람다 파지 (galE::TN10, lambdaKil-cI857 △H1)를 포함한다. Kil-표현형은 숙주 거대분자 합성의 차단을 억제한다. cI857 돌연변이는 cI 리프레서에 온도 감수성 병변을 야기한다. △H1 결실은 람다 파지 우측 오페론 및 숙주 bio, uvr3 및 chlA 로커스를 제거한다. AR58 균주는 SA500 유도체 (galE::TN10, lambdaKil-cI857 △H1) 상에서 기성장시킨 P1 파지 원액으로 N99을 형질도입시켜 제조하였다. 결함 리소겐의 N99내 도입은 인접 galE 유전자 내의 테트라사이클린 내성을 코딩하는 TN10 트랜스포존의 존재에 의해 테트라사이클린으로 선발하였다.
벡터 pMGMDPPrD의 제조
인플루엔자 바이러스의 비구조 S1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 pMG 1 벡터 (pMGNSI)를 사용하여 pMGMDPPrD를 제조하였다. 단백질 D 유전자는 NcoI 및 XbaI 제한부위를 5' 및 3' 말단에 각각 포함하는 PCR 프라이머를 사용하여 pHIC348 벡터 (Janson et al. 1991)로부터 PCR에 의해 증폭하였다. 이어서, NcoI/XbaI 단편을 NcoI과 XbaI 사이에서 pMGNS1에 도입하여 NS1 단백질의 N-말단 81 아미노산 및 PD 단백질을 순서대로 포함하는 융합 단백질을 생성시켰다. 이 벡터를 pMGNSlPrD로 명명하였다.
상기 제조한 구조체를 기초로 하여 단백질 D 발현을 위한 최종 구조체를 제조하였다. BamHI/BamHI 단편을 pMGNSlPrD로부터 제거하였다. 이러한 DNA 가수분해는 처음 3개의 N-말단 잔기를 제외하고 NS1 코딩 영역을 제거하였다. 벡터의 복제시에 하기 N-말단 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 유전자가 생성되었다.
-----MDP SSHSSNMANT----
NS1 단백질 D
단백질 D는 리더 펩티드 또는 지질 사슬이 정상적으로 부착되는 N-말단 시스테인을 포함하지 않는다. 따라서, 상기 단백질은 주변세포질로 분비되거나 지질화되지 않고, 가용성 형태로 세포질에 존재한다.
최종 구조체 pMG-MDPPrD는 37 ℃에서의 열충격에 의해 AR58 숙주 균주 내로 도입된다. 플라스미드 함유 세균은 카나마이신의 존재 하에 선발하였다. 단백질D 코딩 DNA 삽입체의 존재는 선택된 엔도뉴클레아제로 단리된 플라스미드 DNA로 분해하여 입증하였다. 재조합 이. 콜라이 균주를 ECD4로 명명하였다.
단백질 D의 발현은 람다 PL프로모터/OL오퍼레이터의 조절 하에 수행된다. 숙주 균주 AR58은 OL에 결합함으로써 저온에서 람다 PL로부터의 발현을 차단하는 게놈 내의 온도 감수성 cI 유전자를 포함한다. 온도가 상승하면, cI가 OL로부터 방출되고 단백질 D가 발현된다. 발효 종료시에 세포를 농축하여 동결시킨다.
수거한 세포의 추출 및 단백질 D의 정제는 다음과 같이 수행하였다. 동결 세포 배양 펠렛을 해동하여 세포 붕해액 (시트레이트 완충액 pH 6.0)에 최종 OD650가 60이 되도록 재현탁시켰다. 현탁액을 P = 1000 bar에서 고압 균질화기에 2회 통과시켰다. 세포 배양 균질액을 원심분리에 의해 투명하게 만들고, 세포 파쇄물을 여과 제거하였다. 제1 정제 단계에서, 여과된 세포 용해액을 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 (SP Sepharose Fast Flow)에 걸었다. PD가 이온 상호작용에 의해 겔 매트릭스에 결합하고, 용출 완충액의 이온 강도의 단계적 증가에 의해 용출되었다.
제2 정제 단계에서, 불순물은 음이온 교환 매트릭스(Q Sepharose Fast Flow)에 잔류한다. PD는 겔에 결합하지 않고 유동액 내로 수거할 수 있다.
두 컬럼 크로마토그래피 단계에서, 분획 수거는 OD에 의해 모니터링하였다. 정제된 단백질 D를 포함하는 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 통하여 유동액은 한외여과에 의해 농축하였다.
한외여과 잔류액을 포함하는 단백질 D 농축액은 최종적으로 0.2 ㎛ 멤브레인을 통과시켰다.
화학:
활성화 및 커플링 화학:
활성화 및 커플링 조건은 각 폴리사카라이드에 대해 특이적이다. 이를 하기 표 1에 나타내었다. 천연 폴리사카라이드 (PS3 제외)는 주사를 위해 NaCl 2M 또는 물에 용해하였다. 최적 폴리사카라이드 농도를 모든 혈청형에 대해 평가하였다.
아세토니트릴 중의 100 mg/ml 원액으로부터 CDAP (CDAP/PS 비율 0.75 mg/mg PS)를 폴리사카라이드 용액에 첨가하였다. 1.5분 후에, 0.2M 트리에틸아민을 첨가하여 특이적 활성화 pH로 만들었다. 폴리사카라이드의 활성화는 상기 pH에서 2분 동안 25 ℃에서 수행하였다. 단백질 D (그 양은 초기 PS/PD 비율에 의해 결정됨)를 활성화된 폴리사카라이드에 첨가하고, 커플링 반응을 특이적 pH에서 1시간 동안 수행하였다. 이어서, 글리신을 사용하여 25 ℃에서 30분, 4 ℃에서 철야에 걸쳐 반응을 정지시켰다.
0.2M NaCl로 평형화시킨 Sephacryl 500HR 겔 여과 컬럼을 사용하여 컨쥬게이트를 겔 여과에 의해 정제하였다.
용출된 분획의 탄수화물 및 단백질 함량을 결정하였다. 컨쥬게이트를 모아서 0.22 ㎛ 멸균 멤브레인으로 멸균 여과하였다. 컨쥬게이트 제제 내의 PS/단백질 비율을 결정하였다.
특성 분석:
각 컨쥬게이트의 특성을 결정하였고, 하기 표 2에 나타낸 기준을 충족하였다. 폴리사카라이드 함량 (㎍ g/ml)은 레소르시놀 시험으로 결정하였고, 단백질 함량 (㎍/ml)은 로우리 (Lowry) 시험으로 결정하였다. 최종 PS/PD 비율 (w/w)은 농도 비율에 의해 결정하였다.
잔류 DMAP 함량 (ng/㎍ PS):
CDAP를 사용한 폴리사카라이드의 활성화는 폴리사카라이드에 시아네이트기를 도입하고, DMAP (4-디메틸아미노-피리딘)를 방출시킨다. 잔류 DMAP 함량은 SB에서 개발한 특정 분석법으로 결정하였다.
유리 폴리사카라이드 함량 (%):
4 ℃에서 유지하거나 37 ℃에서 7일간 보관한 컨쥬게이트의 유리 폴리사카라이드 함량을 α-PD 항체 및 포화 황산암모늄과 함께 인큐베이션한 후 얻은 상등액에 대해 결정한 후 원심분리하였다.
상등액 내의 유리 폴리사카라이드의 정량화를 위해 α-PS/α-PS ELISA를 사용하였다. 또한, α-PD/α-PS ELISA로 컨쥬게이트의 비존재를 조절하였다. 유리 폴리사카라이드 양의 감소를 통해 개선된 컨쥬게이트 백신을 얻을 수 있었다.
항원성:
동일한 컨쥬게이트에 대한 항원성은 항체의 포획 및 검출이 각각 α-PS 및 α-PD인 샌드위치 타입 ELISA로 분석하였다.
유리 단백질 함량 (%):
"유리" 잔류 단백질 D의 수준은 시료의 SDS 처리 방법을 사용하여 결정하였다. SDS 0.1 %의 존재 하에 컨쥬게이트를 100 ℃에서 10분 동안 가열하고, SEC-HPLC 겔 여과 컬럼 (TSK 3000-PWXL)에 주입하였다. 단백질 D가 이량체이기 때문에, SDS를 갖는 구조의 해리에 의해 "유리" 단백질 D의 수준이 과다하게 평가될 위험이 있다.
분자 크기 (Kav):
분자 크기는 SEC-HPLC 겔 여과 컬럼 (TSK 5000-PWXL)로 결정하였다.
안전성:
안정성은 4 ℃에서 유지하고 37 ℃에서 7일 동안 보관한 컨쥬게이트에 대해 HPLC-SEC 겔 여과 (TSK 6000-PWXL)로 결정하였다.
11가 특성을 하기 표 2에 나타내었다.
단백질 컨쥬게이트는 인산알루미늄에 흡착되어 회수함으로써 최종 백신을 형성할 수 있다.
결론:
유망한 백신 성분으로 밝혀진 면역원성 컨쥬게이트를 제조하였다. 가장 품질이 우수한 최종 컨쥬게이트된 폐렴구균 폴리사카라이드 제품의 최적 CDAP 조건이 11가 각각에 대해 규명되었다.
PS 에스. 뉴모니애-단백질 D 컨쥬게이트의 특이적 활성화/커플링/정지 조건
혈청형 1 3 4 5 6B 7F
PS 농도(mg/ml) 2.0 3.0 2.0 7.5 5.4 3.0
PS 용해 NaCl 2M NaCl 2M H2O H2O NaCl 2M NaCl 2M
PD 농도(mg/ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
초기 PS/PD비율(w/w) 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1
CDAP 농도(mg/mg PS) 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75
pHa=pHc=pHq 9.0/9.0/9.0 9.0/9.0/9.0 9.0/9.0/9.0 9.0/9.0/9.0 9.5/9.5/9.0 9.0/9.0/9.0
혈청형 9V 14 18C 19F 23F
PS 농도(mg/ml) 2.5 2.5 2.0 4.0 3.3
PS 용해 NaCl 2M NaCl 2M H2O NaCl 2M NaCl 2M
PD 농도(mg/ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
초기 PS/PD비율(w/w) 1/0.75 1/0.75 1/1 1/0.5 1/1
CDAP 농도(mg/mg PS) 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75
pHa=pHc=pHq 8.5/8.5/9.0 9.0/9.0/9.0 9.0/9.0/9.0 10/9.5/9.0 9.0/9.0/9.0
11가 폐렴구균 PS-PD 백신의 특성 (배치 코드의 첫번째 숫자는 혈청형을 나타냄)
기준 D01PDJ227 D03PDJ236 D4PDJ228 D5PDJ235 D6PDJ209
PS/Prot 비율 (w/w) 1/0.66 1/1.09 1/0.86 1/0.86 1/0.69
유리 폴리사카라이드 함량(%)<10% 1 1 7 9 10
유리 단백질 함량(%)<15% 8 <1 19 21 9
DMAP 함량 (ng/㎍ PS)<0.5 ng/㎍ PS 0.2 0.6 0.4 1.2 0.3
분자 크기 (Kav) 0.18 0.13 0.12 0.11 0.13
안정성 변화없음 변화없음 변화없음 약간의변화 변화없음
기준 D07PDJ225 D09PDJ222 D14PDJ202 D18PDJ221 D19PDJ206 D23PDJ212
PS/Prot (w/w) 1/0.58 1/0.80 1/0.68 1/0.62 1/0.45 1/0.74
유리 폴리사카라이드함량(%) <10% 1 <1 <1 4 4 0
유리 단백질 함량(%)<15% 8 0.3 3 21 10 12
DMAP 함량 (ng/㎍ PS)<0.5 ng/㎍ PS 0.1 0.6 0.3 0.2 0.1 0.9
분자 크기 (Kav) 0.14 0.14 0.17 0.10 0.12 0.12
안정성 변화없음 변화없음 변화없음 변화없음 변화발생 변화없음
실시예 2 - 마우스에서 폐렴구균 폐 군집에 대한 PD-컨쥬게이트된 11가 폴리사카라이드 백신의 보호 효능에 대한 본 발명의 하나 이상의 폐렴구균 단백질 (3D-MPL의 존재/부재하)의 유리한 첨가 효과
면역학적 판독
폐렴구균 단백질 특이적 혈청 IgG의 ELISA 투여량
Maxisorp Nunc 면역플레이트를 PBS로 희석한 100 ㎕/웰의 단백질(2 ㎍/ml)로 37 ℃에서 2시간 동안 코팅하였다. 플레이트를 NaCl 0.9% Tween-20 0.05% 완충액으로 3회 세척하였다. 이어서, 표준곡선으로 첨가된 항-단백질 혈청 표준 (670 ng/ml IgG에서 출발) 및 혈청 시료 (1/10 희석액으로 출발)의 연속적인 2배 희석액 (PBS/Tween-20 0.05%로 희석, 웰당 100 ㎕)을 교반 하에 20 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 상기한 바와 같이 세척한 후, PBS/Tween-20 0.05% 중에 5000x 희석된 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG (Jackson)을 20 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다 (100 ㎕/웰). 세척한 후, 플레이트를 100 ㎕/웰의 표시 완충액 (100 mM pH 4.5 시트레이트 완충액 중의 OPDA 0.4 mg/ml 및 H2020.05%)과 함께 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 50 ㎕/웰의 HCl (1N)을 첨가하여 표시 반응을 정지시켰다. Emax 면역판독기(immunoreader) (Molecular Devices)를 사용하여 490 및 620 nm에서 광학 밀도를 판독하였다. 항체 역가는 SoftMaxPro 소프트웨어를 사용하여 4 파라미터 수학 방법에 의해 계산하였다.
옵소노파고사이토시스 분석
상기 분석의 목적은 CDC의 표준 방법 (Steiner et al, Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 4: 415.1997)의 변형 방법을 사용하여 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 또는 23F에 대한 시험 혈청 시료의 옵소닌화 능력을 측정하는 것이다.
상기 분석은 침습성 스트렙토코커스 뉴모니애 또는 폐렴구균을 제거하는 1차 메카니즘으로서 체내에서 발생하는 것을 시험관 내에서 재현한다. 이는 파고사이토시스에 의한 폐렴구균의 옵소닌화 및 치사이다. "파고사이토시스"는 세포가 물질을 둘러싸서 세포질 내의 액포 (파고좀) 내에 포획하는 현상이다. 폐렴구균은 건강한 포유동물의 파고사이트에 의해 파고사이토시스될 때 죽게 된다. "옵소닌화"는 옵소닌, 예를 들어 항체 및 보체의 항원 상 침적에 의해 파고사이토시스가 촉진되는 현상이다.
문헌에 보고된 많은 옵소노파고사이토시스 분석법이 존재한다. CDC의 표준 방법은 다중 실험 세팅으로 시험되었다 (Steiner et al, ICAAC, Sept 16-20,2000, Toronto). 이 분석법은 다른 분석법과 비교를 위한 기초를 제공하고, 일반적으로 입수할 수 있는 시약과 대조군을 사용하고, 이 유형의 분석에 통상 사용되는 단위인 생존가능 폐렴구균의 50%의 치사를 촉진할 수 있는 혈청의 역가 (희석율)로서 결과를 표현하기 때문에 SB에서 적용되었다. 실제로, 상기 변형 분석법은 4개의 다른 분석 방법과 매우 대응하는 결과를 얻을 수 있음이 밝혀졌다 (Steiner et al, ICAAC, Sept 16-20,2000, Toronto).
상기 분석에 사용된 파고사이토시스 세포는 전골수세포성 백혈병 환자로부터 유래한 HL60 세포주이고, 문헌 [Collins et al., 1977, Nature 270: 347-9]에서 연속 세포주로서 확립되었다. 이 세포주는 미분화 조혈 세포, 즉 85% 아세포 및 전골수세포, 6% 골수세포 및 9% 분화세포로 구성된다. 극성 화합물은 세포를 2개 이상의 상이한 계통으로의 분화를 유도할 수 있다. N,N-디메틸포름아미드는 다형핵 유사 세포(44% 골구세포 및 후골수세포 및 53% 결집 분할 PMN)를 생성시키는 과립구 분화를 유도한다.
상기 분석법의 버젼 A2에서, 시험 혈청은 열에 의해 불활성화되고, 1/4에서 시작하여 8개의 2배 연속 희석액을 0.3% BSA를 포함하는 HBSS 배지로 96웰 마이크로플레이트에서 제조하였다. 각 웰 내의 희석된 혈청의 최종 부피는 25 ㎕이었다.
107세포/ml의 HL60 세포 4부피 (디메틸포름아미드를 사용한 분화 5 또는 6일 후), 에스. 뉴모니애 세균 (적합한 희석율의) 2부피 및 새끼 토끼 보체 1부피를 사용 전에 혼합하고, 25 ㎕의 혼합물을 희석 혈청을 포함하는 96웰의 각웰에 첨가하였다. 혈청형 1 및 6B의 경우, 보체의 양은 최종 농도 12.5% 최종 농도로 증가시켜 상기 분석법의 버젼 A3으로 분석하였다.
오비탈 진탕 하에서 37 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후에, 플레이트를 빙상에 놓아 옵소노파고사이토시스 반응을 정지시켰다.
37 ℃에서 철야 인큐베이션하여 각 웰 내의 콜로니 형성 단위(CFU)를 평가하였다. "옵소닌 역가" (OT)는 웰내의 50% 이상의 에스. 뉴모니애 세균의 감소 (즉, 50% 사멸)을 야기할 수 있는 혈청의 희석율의 역으로서 정의된다. 사멸율은 다음 식으로 계산된다.
사멸율 (%) = [(대조용 웰의 평균 CFU - 시료의 CFU)/대조용 웰의 평균 CFU] x 100
OF1 마우스의 폐렴구균 비내 시험
5 x 105CFU의 마우스 순응시킨 에스. 뉴모니애 혈청형 2, 4 또는 6B를 마취 상태의 7주령의 OF1 마우스 암컷에 비내 접종하였다. 접종 6시간 후에 폐를 제거하여 Todd Hewith Broth (THB, Gibco) 배지에서 균질화시켰다 (Ultramax, 24000 rpm, 4 ℃). 폐 균질액의 연속적인 10배 희석액을 효모 추출물 보충된 THB 아가 함유 페트리 디쉬 상에 37 ℃에서 철야 위치시켰다. 폐렴구균의 폐 감염은 대수 가중 평균(logarithmic weighted-average)으로 표현되는 CFU/마우스로 결정하였다. 검출 한계는 2.14 log CFU/마우스이었다.
실시예 2A: 항-단백질 면역반응에 대한 3D-MPL 어쥬번트의 효과
본 실시예에서는 본 발명의 단백질에 대한 면역 반응에 대한 3D-MPL 어쥬번트 처리의 효과를 측정할 수 있다.
10마리의 6주령 Balb/c 마우스 그룹을 A: AlP04100 ㎍, 또는 B: AlP04100㎍ + 5 ㎍ 3D-MPL (3 데-O-아실레이트화 모노포스포릴 리피드 A, Ribi Immunochem)에 포함된 1 ㎍ 단백질을 사용하여 0, 14 및 21일차에 근내 면역처리하였다. ELISA IgG를 post-III 혈청으로 측정하였다.
어떤 항원의 경우에도, 3D-MPL-보충 제제로 백신처리된 동물에서 가장 우수한 면역 반응이 유도될 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 2B: 혈청형 2, 4 또는 6B를 비내 투여하여 시험한 OFI 마우스에서 폐렴구균의 폐 군집에 대한 PD-컨쥬게이트된 11가 폴리사카라이드 백신의 보호 효능에 대한 본 발명의 단백질 첨가(3D-MPL 어쥬번트 존재 또는 부재하)시의 유리한 효과
본 실시예에서, 11가 폴리사카라이드-단백질 D 컨쥬게이트, 본 발명의 단백질 및 AlP04+ 3D-MPL 어쥬번트를 포함하는 백신의 예방 효능을 전통적인 AlP04-흡착 11가 폴리사카라이드-단백질 D 컨쥬게이트 제제와 비교하여 평가할 수 있다.
12마리의 4주령 OF1 마우스 그룹을 A: 50 ㎍ AlP04, B: 0.1 ㎍ PS/혈청형 PD-컨쥬게이트된 11가 폴리사카라이드 백신 + 50 ㎍ AlP04, 또는 C: 0.1 ㎍ PS/혈청형 PD-컨쥬게이트된 11가 폴리사카라이드 백신 + 10 ㎍ 본 발명의 단백질 + 50 ㎍ AlP04+ 5 ㎍ 3D-MPL (Ribi Immunochem)을 포함하는 제제를 사용하여 0 및 14일차에 피하 면역처리하였다. 면역성 시험은 상기한 바와 같이 21일차에 수행하였다.
상기 방법에 의해 밝혀진 바와 같이, 본 발명의 단백질로 보충되고 AlP04+ MPL 어쥬번트 처리된 11가 폴리사카라이드 컨쥬게이트 백신에 의해 유의한 보호 효과가 제공된다. 이와 대조적으로, 11가 폴리사카라이드 컨쥬게이트/AlP04제제로 면역처리된 동물에서는 유의한 보호 효과가 관찰되지 않았다. 이 결과는 본 발명의 단백질 및 3D-MPL 어쥬번트의 첨가가 폐렴에 대한 11가 폴리사카라이드 컨쥬게이트 백신의 효능을 증강시킨다는 것을 입증한다.
실시예 2C: 실시예 2B에서 밝혀진 보호 효능의 면역 상호관계
실시예 2B에 의해 제시된 보호 효능의 면역 상호관계를 확립하기 위해서, 본 발명의 단백질 및 3D-MPL로 보충된 11가 폴리사카라이드 컨쥬게이트 백신에 의해 폴리사카라이드 2, 4 또는 6B, 및 본 발명의 단백질에 대한 예비 백신 시험된 혈청학적 항체 반응을 상기한 바와 같이 결정할 수 있다.
이어서, 항체 역가를 백신 시험 6시간 후에 수거된 대응하는 동물의 폐에서 측정된 세균 콜로니수와 비교하였다. R2는 Log/Log 선형 회귀로 계산한다.
계산된 R2는 두 항원 모두에 대해 체액성 면역 반응과 보호 효능 사이에 상호관계가 없음을 보여줄 수 있다. 항-6B (또는 2 또는 4) 항체 역가는 11가 컨쥬게이트 백신 또는 본 발명의 단백질 및 3D MPL로 보충된 동일한 백신으로 면역처리된 그룹에서 크게 상이하지 않았다. 따라서, 제제 C에서 관찰된 보호 효능 개선은 반드시 폴리사카라이드 6B (또는 2 또는 4)에 대한 보다 높은 항체 반응에 의한 것만은 아니다.
상기 결과들은 보호 효능이 체액성 면역 반응 단독에 의해 매개되는 것이 아니라 단백질 항원 (바람직하게는 3D-MPL의 존재 하에)에 의해 유도된 세포 매개 면역원성에 의해서도 매개된다는 것을 시사한다. 이것은 최적 보호를 위해 면역계의 두 브랜치의 상호 협력을 위해 폐렴구균 폴리사카라이드 컨쥬게이트 백신에 단백질 항원(들) 및 효능있는 어쥬번트(들)를 첨가해야 하는 추가의 근거를 제공할 수 있다.
실시예 3 - 본 발명의 단백질로 능동 면역처리되고 폐렴구균 PS에 대한 항체로 수동 면역처리된 마우스에서 면역계의 두 브랜치의 상호협력
실시예 3A - 폐렴에 대해 보호하는 수동 투여된 항-6B-폴리사카라이드 (항-PS) 항체의 농도
방법
백신 그룹: 그룹당 16마리 마우스로 이루어진 4개의 그룹 (총 64마리)을 하기 그룹에 따라 비희석된 100 ㎕의 래트 항-폴리사카라이드 항혈청으로 1일차에 복강내 주사로 수동 면역처리하였다.
그룹 성분 항혈청내 IgG 농도
G1 α-PS-6B 5 ㎍/ml
G2 α-PS-6B 2 ㎍/ml
G3 α-PS-6B 0.75 ㎍/ml
G4 대조군 0 ㎍/ml
동물: 체중이 약 35 g (약 10주령)인 64마리의 CD-1 마우스 수컷 (Charles River, Canada)
안락사: 마우스는 이소플루란 (3%) + 02(1 L/min)로 안락사시켰다.
유기체: 5% 말 혈액으로 보충된 트립티카제 콩 아가 플레이트 (TSA)로부터에스. 뉴모니애 N1387 (혈청형 6)를 회수하여 6 ml의 PBS에 현탁시켰다. 감염 직전에, 1 ml의 세균 현탁액을 9 ml의 냉각된 용융 영양 아가 (BBL)에 희석하고, 41 ℃에서 유지하였다. 마우스에 50 ㎕의 부피로 약 6.0 loglO cfu/마우스를 투여하였다.
감염: 0일차에 마우스를 상기한 바와 같이 마취시키고, 비수술적 기관내 삽관법을 통해 기관지 점적에 의해 에스. 뉴모니애 N1387 (50 ㎕ 냉각된 세균 현탁액)로 감염시켰다. 이 방법은 문헌 [Woodnut and Berry, Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43: 29 (1999)]에 기재되어 있다.
시료: 감염 3일 후에, 8 마우스/그룹을 C02과다 투여로 희생시키고, 폐를 절제하여 1 ml PBS에 균질화시켰다. 생존 세균수를 계산하기 위해 PBS로 10배 연속 희석액을 제조하였다. 시료를 5% 말 혈액으로 보충된 TSA 플레이트에 3회 접종 (20 ㎕)하고, 평가 전에 37 ℃에서 철야 인큐베이션하였다. 추가 세트의 마우스를 7일차에 희생시켜 상기와 같이 시료를 제조하였다.
결과:
래트 혈청 내IgG 농도(㎍/ml) 감염 후 세균 숫자 (log 10 cfu/폐)
감염 3일후 감염 8일후
5 6.7 ±0.7 (1/7) 7.2 ±0.7 (5/8)
2 6.5 ±0.7 (1/7) 6.9 ±1.8 (4/7)
0.75 7.7 ±0.5 (5/8) 4.8 ±1.4 (2/8)
0 6.7 ±1.5 (3/6) 6.3 ±1.5 (3/9)
괄호 내의 숫자는 시료 채취 전에 죽은 동물의 숫자임
결론: 일반적으로, 임의의 처리 그룹으로부터 단리한 세균수는 크게 상이하지 않았다. 이것은 5 ㎍/ml 이하의 농도에서 항-폴리사카라이드 항체에 의해 어떠한 측정가능한 보호 효과가 제공되지 않았음을 나타낸다.
이것은 일부 인간 임상 시험에서 관찰된 사실, 즉 항-폴리사카라이드 항체가 일부 집단에서 폐렴구균성 폐렴에 대해 보호 효과를 제공하기에는 불충분하였다는 사실과 유사하다.
실시예 3B - 본 발명의 단백질을 어쥬번트와 함께 또는 어쥬번트 없이 능동 투여시 제공되는 폐렴으로부터의 보호 및 최적 미만의 항-PS 항체와의 시너지 효과의 결정
방법
동물: 128마리의 CD-1 마우스 (면역 처리시 6주령 (약 20 g), 감염시 10주령 (약 38 g)) (Charles River, St. Constant, Quebec, Canada).
면역처리: 상기한 바와 같이 -22 및 -14일차에 100 ㎕의 백신을 피하 주사(s.c.)하여 16마리의 마우스로 이루어진 6개 그룹을 면역처리하였다 (총 128마리의 마우스). 3D-MPL는 Ribi/Corixa로부터 입수하였다.
-1일차에 특정 그룹 (하기 표 참조)을 4.26 ㎍/ml (5 ㎍/ml의 4 ml + 2 ㎍/ml의 1.3 ml) 농도의 마우스 항-폴리사카라이드 항체로 수동 면역처리하였다 (100 ㎕ 복강내 (i.p.) 투여).
그룹 주사 부피(능동) 백신 제공일 -22일, -14일(투여량 ㎍) 주사 부피(수동) 수동 IgG(-1일)
1-1 100 ㎕ s.c. 단백질/AlPO4(10/50) 없음
1-2 100 ㎕ s.c. 단백질/MPL/AlPO4(10/5/50) 없음
1-3 100 ㎕ s.c. 단백질/AlPO4(10/50) 100 ㎕ i.p. α-PS
1-4 100 ㎕ s.c. 단백질/MPL/AlPO4(10/5/50) 100 ㎕ i.p. α-PS
1-5 100 ㎕ s.c. MPL/AlPO4(5/50) 100 ㎕ i.p. α-PS
1-6 100 ㎕ s.c. MPL/AlPO4(5/50) 없음
감염: 0일차에 마우스를 안락사시켰다 (3% 이소플루란 + 1 L/min O2). 세균 접종물을 5% 말 혈액으로 보충된 트립티카제 콩 아가 플레이트 (TSA)로부터 성장한 에스. 뉴모니애 N1387 (혈청형 6)을 회수하여 6 ml의 PBS에 현탁시켜 제조하였다. 감염 직전에, 10배 희석액 (1 ml + 9 ml)을 냉각된 용융 영양 아가(41℃에서 유지됨)로 제조하였다. 마우스에 비수술적 기관내 삽관법을 통해 기관지 점적에 의해 약 6.0 loglO cfu/마우스를 부피 50 ㎕로 투여하였다. 상기 방법은 문헌 [Woodnut and Berry, Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43: 29 (1999)]에 기재되어 있다.
시료: 감염 72시간 후에, 8 마우스/그룹을 C02과다 투여로 희생시키고, 폐를 절제하여 1 ml PBS에 균질화시켰다. 생존 세균수를 계산하기 위해 PBS로 10배 연속 희석액을 제조하였다. 시료를 5% 말 혈액으로 보충된 TSA 플레이트에 3회 접종 (20 ㎕)하고, 평가 전에 37 ℃에서 철야 인큐베이션하였다. 추가 세트의 마우스를 감염 8일 후에 희생시켜 상기와 같이 시료를 제조하였다.
데이타 분석:
처리 비교를 위한 결과는 감염 3일 및 7일 후의 폐내 세균수이다. 결과는 표준편차와 함께 그룹 평균으로서 제시할 수 있다. 통계 분석은 Students t-시험 (0.05 미만의 P값은 유의한 것으로 간주함)을 사용하여 수행하였다.
상기 입증된 바와 같이, 항-폴리사카라이드 항체 단독 (그룹 1-5)는 폐에서 폐렴구균의 성장에 대한 보호 효능을 부여하지 않은 것으로 밝혀졌다. AlP04로 어쥬번트 처리된 폐렴구균 단백질 (그룹 1-1)도 보호 효능을 부여할 수 없지만, 이 단백질이 3D-MPL과 조합될 경우 (그룹 1-2) 우수한 정도로 보호 효능을 부여한다.
가장 큰 보호 효능은 항-폴리사카라이드 항체 및 단백질을 모두 투여한 그룹, 특히 3개의 성분, 즉 단백질, 3D-MPL 및 수동 투여된 항-폴리사카라이드 항체를 갖는 그룹 (그룹 1-4)에서 확인되었다. 상기 결론은 또한 치사율에 의해서도 지지될 수 있다. 그룹 1-3, 특히 1-4는 다른 그룹에 비해 치사율이 더 낮다.
결론:
수동 면역처리된 동물을 사용하여 실험을 수행하였기 때문에, 단백질 (+/-MPL)로 능동 면역처리시의 시너지 효과는 폴리사카라이드 항원에 대한 항체 수준의 증가에 의한 것이 아닐 수 있다.
폐렴구균성 폐렴에 대한 유의한 보호 효능은 특히 3D-MPL이 존재할 경우 단백질과 수동 투여된 항-폴리사카라이드 항체 모두로 면역처리된 그룹에서 확인할 수 있고, 이것은 상기 조합물의 시너지 효과를 나타낸다.
항-폴리사카라이드 면역처리가 능동적으로 (바람직하게는 컨쥬게이트된 폴리사카라이드를 사용하여) 수행될 경우, 상기 효과는 B 세포 기억의 효과로서 훨씬 더 현저할 것이고, 실험 기간 전체를 통하여 항-PS 항체의 일정한 수준은 면역 반응 협력에 기여할 것이다.
실시예 4 - 보호 효능의 상호관계에 의한 시너지의 결정 방법
인체가 감염된 폐렴구균을 제거하기 위해 이용하는 보호 메카니즘은 항체 매개 옵소노파고사이토시스이다 (Bruyn et al. Clin. Infect. Dis. 14: 251 (1992)).보호 효능 상호관련도로서 캡슐 폴리사카라이드에 대한 항체 농도를 측정하기 위해 수개의 ELISA 방법이 개발되었지만, 시험관내 옵소노파고사이토시스 분석법이 우수한 보호 효능 관련도 분석법이다 (Musher et al. J. Infect. Dis. 182: 158 (2000)).
본 발명의 폐렴구균 단백질은 항체 매개 옵소노파고사이토시스와 상이한 메카니즘에 의해 폐렴구균 감염에 대한 보호 효능을 제공한다. 실시예 2에서, 컨쥬게이트와 단백질 모두를 사용한 면역처리는 시너지 효과를 보였고, 이것은 항체 농도가 두 그룹에서 동일하기 때문에 항체 농도 차이로 설명할 수 없다. 따라서, 관찰될 수 있는 나머지 보호 효능은 시너지 효과에 기인한 것이 분명하다. 유사하게, 항체를 수동 투여하였기 때문에, 동일한 결론을 실시예 3에서 내릴 수 있다.
많은 경우에, 본 발명의 폐렴구균 단백질은 표면 결합되고, 그 자체로 일부의 옵소닌 활성을 제공할 것으로 기대된다. 이 경우, 항-폐렴구균 단백질의 옵소닌화 능력의 정량적 측정을 통한 보호 효능 메카니즘을 차별화할 수 있고, 이것은 다른 시너지 보호 메카니즘에 대한 옵소닌 활성의 상대적 기여도를 평가하기 위해 사용될 수 있다.
마우스 폐 군집 모델에서, 각 백신의 상대 보호율은 폐로부터의 세균 제거로부터 평가할 수 있다. 또는, 별법으로 백신 효능은 정상적으로 백신에 대해 측정된 이환율로부터 평가할 수 있다.
보호율 (%) = (CFU/폐 대조군 - CFU/폐 백신)/(CFU/폐 대조군)
효능 (%) = (대조군 이환율 - 백신 이환율)/(대조군 이환율)
시너지 효과로부터 기인한 보호율 또는 효능 비율을 결정하기 위해서는 옵소닌 역가 비율을 기초로 하여 어느 정도의 효능이 예상되는지를 결정하는 것이 중요하다.
상기 실시예 3에서, 조합물에 의한 보호율 (%)은 단백질 또는 항-폴리사카라이드 항체 단독으로는 보호 효능을 제공할 수 없기 때문에 단백질/항체 성분 사이의 시너지에 의한 것이다.
옵소닌 상대 활성을 기초로 하여 시너지 효과의 보호량을 평가할 수 있다. 항-캡슐 폴리사카라이드 항체에 의해 부여되는 옵소닌 활성이 X이고, 항-폐렴구균 단백질 항체에 의해 부여되는 옵소닌 활성이 Y이면, 총 옵소닌 활성은 X + Y로 나타낼 수 있고, 단백질의 옵소닌 활성의 상대 비율은 Y/X+Y이다. 이것은 백신의 항-폴리사카라이드 부분이 A%의 보호 효능을 제공하고 폴리사카라이드 + 단백질의 백신 보호 효능이 B%인 백신의 상대 보호 효능과 비교된다. 옵소닌 활성에 의해 평가될 수 없는 추가의 효능은 하기 잔류 보호 활성 (시너지) = B% - A% - B% * (Y/X+Y)로 평가한다.
상기 실시예는 시너지 효과를 평가하는 방법을 제한하고자 의도한 것은 아니다. 다른 보호 효능 상관관계가 확인되면, 상기 시너지 효과 평가에 사용할 수 있다.
특허 및 특허출원을 포함하여 본원에 인용된 모든 문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함되었다고 구체적으로 표시된 것처럼 본원에 참고로 포함된다.

Claims (16)

  1. 하나 이상의 스트렙토코커스 뉴모니애 폴리사카라이드 항원 및 PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, sp125, sp101, sp128, sp13O 및 sp133으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 스트렙토코커스 뉴모니애 단백질 항원 또는 이들의 면역학적 기능 균등체를 포함하는 면역원 조성물
  2. 제1항에 있어서, 폴리사카라이드 항원이 폴리사카라이드-단백질 캐리어 컨쥬게이트의 형태로 존재하는 것인 면역원 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 캐리어 단백질이 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드, CRM197, 키홀 림펫 헤모시아닌 (Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH)), 튜베르큘린 (Tuberculin)의 단백질 유도체 (PPD) 및 에이치. 인플루엔자의 단백질 D로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 면역원 조성물.
  4. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 백신이 상이한 혈청형으로부터의 4개 이상의 폐렴구균 폴리사카라이드 항원을 포함하는 것인 면역원 조성물.
  5. 제1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 어쥬번트를 추가로 포함하는 면역원 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 어쥬번트가 알루미늄염을 포함하는 것인 면역원 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 어쥬번트가 TH1 반응의 우선적 인듀서인 면역원 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 어쥬번트가 3D-MPL, 사포닌 면역자극제 및 면역자극성 CpG 올리고뉴클레오티드 중의 하나 이상을 포함하는 것인 면역원 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 어쥬번트가 수중유 에멀젼, 리포좀 및 알루미늄염으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 캐리어를 포함하는 것인 면역원 조성물.
  10. 제1항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 면역원 조성물.
  11. 제1항 내지 9항 중 어느 한 항 기재의 면역원 조성물을 포함하는 백신.
  12. 스트렙토코커스 뉴모니애 폴리사카라이드 항원 및 PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, sp125, sp1O1, sp128, sp130 및 sp133으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 스트렙토코커스 뉴모니애 단백질 및 임의로 TH1 유도 어쥬번트를 포함하는 유효량의 백신을 투여하는 것을 포함하는, 55세 이상의 환자의 스트렙토코커스 뉴모니애 감염의 예방 또는 치료 방법.
  13. 폐렴구균 폴리사카라이드 항원과, PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, sp125, sp1O1, sp128, sp130 및 sp133으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 스트렙토코커스 뉴모니애 단백질 항원 및 임의로 TH1 유도 어쥬번트의 조합물의 55세 이상의 환자의 폐렴의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 용도.
  14. 폐렴구균 폴리사카라이드 항원과, PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, sp125, sp1O1, sp128, sp130 및 sp133으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 스트렙토코커스 뉴모니애 단백질 항원 및 임의로 TH1 유도 어쥬번트의 조합물의 유아 또는 소아의 중이염의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 용도.
  15. 하나 이상의 폐렴구균 폴리사카라이드 항원(들)을 선택하는 단계,
    PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, sp125, sp1O1, sp128, sp130 및 sp133으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 폐렴구균 단백질 항원(들)을 선택하는 단계 및
    상기 폴리사카라이드 및 단백질 항원을 적합한 부형제와 혼합하는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 10항 중 어느 한 항 기재의 면역원 조성물의 제조 방법.
  16. 스트렙토코커스 뉴모니애 폴리사카라이드 항원 및 PhtA, PhtD, PhtB, PhtE,SpsA, LytB, LytC, LytA, sp125, sp1O1, sp128, sp130 및 sp133으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 스트렙토코커스 뉴모니애 단백질 항원 및 임의로 TH1 어쥬번트를 포함하는 유효량의 안전한 백신을 유아에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 유아의 중이염 예방 또는 치료 방법.
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