PL210198B1 - Immunogenna kompozycja, jej zastosowanie i sposób wytwarzania oraz zawierająca ją szczepionka przeciwko Streptococcus pneumoniae - Google Patents

Immunogenna kompozycja, jej zastosowanie i sposób wytwarzania oraz zawierająca ją szczepionka przeciwko Streptococcus pneumoniae

Info

Publication number
PL210198B1
PL210198B1 PL361401A PL36140101A PL210198B1 PL 210198 B1 PL210198 B1 PL 210198B1 PL 361401 A PL361401 A PL 361401A PL 36140101 A PL36140101 A PL 36140101A PL 210198 B1 PL210198 B1 PL 210198B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
protein
polysaccharide
immunogenic composition
pneumococcal
composition according
Prior art date
Application number
PL361401A
Other languages
English (en)
Other versions
PL361401A1 (pl
Inventor
Craig Antony Joseph Laferriere
Jan Poolman
Original Assignee
Smithkline Beecham Biolog
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9899575&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL210198(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Smithkline Beecham Biolog filed Critical Smithkline Beecham Biolog
Publication of PL361401A1 publication Critical patent/PL361401A1/pl
Publication of PL210198B1 publication Critical patent/PL210198B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/0208—Specific bacteria not otherwise provided for
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/125—Picornaviridae, e.g. calicivirus
    • A61K39/13—Poliovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest immunogenna kompozycja, jej zastosowanie i sposób wytwarzania oraz zawierająca ją szczepionka przeciwko Streptococcus pneumoniae. W szczególności niniejszy wynalazek dotyczy szczepionek obejmujących pneumokokowy antygen polisacharydowy w kombinacji z antygenem biał kowym ze Streptococcus pneumoniae i ewentualnie z adiuwantem indukującym Th1.
Streptococcus pneumoniae jest Gram-dodatnią bakterią odpowiedzialną za znaczną zachorowalność i śmiertelność (zwłaszcza u osób bardzo młodych i w podeszłym wieku), wywołującą inwazyjne choroby jak zapalenie płuc, bakteriemia i zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych oraz choroby związane z kolonizacją, jak ostre zapalenie ucha środkowego. Wskaźnik pneumokokowego zapalenia płuc w USA dla osób powyżej 60 roku życia jest szacowany na 3 do 8 na 100 000. W 20% przypadków prowadzi to do bakteriemii i innych objawów, jak zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych ze śmiertelnością bliską 30% nawet przy leczeniu antybiotykami.
Pneumokok posiada otoczkę z chemicznie połączonymi polisacharydami, które nadają swoistość serotypom. Znanych jest 90 serotypów pneumokokowych a otoczka jest główną determinantą zjadliwości, jako że otoczka nie tylko chroni wewnętrzną powierzchnię bakterii przed układem dopełniacza, ale jest sama słabo immunogenna. Polisacharydy są T-niezależnymi antygenami i nie mogą być przetwarzane i prezentowane na cząsteczkach MHC w celu oddziaływania z komórkami T. Mogą jednakże pobudzać układ odpornościowy przez alternatywny mechanizm, który dotyczy krzyżowego wiązania receptorów powierzchniowych na komórkach B.
W kilku doś wiadczeniach wykazano, że ochrona przeciw inwazyjnej chorobie pneumokokowej jest najsilniej związana z przeciwciałami swoistymi wobec otoczki i że ochrona jest swoista wobec serotypów.
Szczepionki uzyskane w oparciu o antygen polisacharydowy są dobrze znane w dziedzinie. Cztery, które były zarejestrowane do użytku u ludzi obejmują polisacharyd Vi z Salmonella typhi, polisacharyd PRP z Haemophilus influenzae, meningokokową szczepionkę tetrawalentną obejmująca serotypy A, C, W135 i Y oraz 23-walentną szczepionkę pneumokokową składającą się z polisacharydów odpowiadających serotypom 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F i 33 (składające się na co najmniej 90% pneumokokowych izolatów z krwi).
Ostatnie trzy szczepionki nadają ochronę przeciw bakteriom wywołującym zakażenia układu oddechowego z poważną zachorowalnością i śmiertelnością u niemowląt, chociaż szczepionki te nie były zarejestrowane do stosowania u dzieci poniżej drugiego roku życia, ponieważ nie były wystarczająco immunogenne w tej grupie wiekowej [Peltola i wsp. (1984), N. Engl. J. Med. 310:1561-1566]. Streptococcus pneumoniae jest najczęstszą przyczyną inwazyjnej choroby bakteryjnej i zapalenia ucha środkowego u niemowląt i dzieci młodszych. Podobnie ludzie w podeszłym wieku słabo odpowiadają na szczepionki pneumokokowe [Roghmann i wsp., (1987), J. Gerontol. 42:265-270], stąd podwyższona liczba przypadków bakteryjnego zapalenia płuc w tej populacji [Verghese i Berk, (1983) Medicine (Baltimore) 62:271-285].
Strategie opracowane w celu wyeliminowania tego braku immunogenności u niemowląt obejmują wiązanie polisacharydu do większych immunogennych białek, które pomagają biernym komórkom T i indukują pamięć immunologiczną wobec antygenu polisacharydowego, z którym są skoniugowane. Glikoproteinowe koniugowane szczepionki pneumokokowe są obecnie oceniane pod względem bezpieczeństwa, immunogenności i skuteczności w różnych grupach wiekowych.
23-walentna nieskoniugowana szczepionka pneumokokowa wykazała dużą różnorodność w skuteczności klinicznej, od 0% do 81% [Fedson i wsp. (1994) Arch Intern Med. 154:2531-2535)]. Skuteczność wydawała się być związana z grupą ryzyka, która była immunizowana, taką jak osoby w podeszłym wieku, z chorobą Hodgkina, po splenektomii, z anemią sierpowatą i agammaglobulinemiami [Fine i wsp. (1994) Arch Intern Med. 154:2666-2677), a także z objawami choroby. Szczepionka 23-walentna nie wykazywała ochrony wobec pneumokokowego zapalenia płuc (w pewnych grupach wysokiego ryzyka takich jak osoby w podeszłym wieku) i zapalenia ucha środkowego.
Dlatego istnieje potrzeba udoskonalenia kompozycji szczepionki pneumokokowej, zwłaszcza tej, która ma być bardziej skuteczna w ochronie i łagodzeniu objawów choroby pneumokokowej (zwłaszcza zapalenia płuc) u osób w podeszłym wieku i dzieci młodszych.
PL 210 198 B1
Niniejszy wynalazek dostarcza taką ulepszoną szczepionkę.
Niniejszy wynalazek dostarcza kompozycji immunogennej, obejmującej co najmniej jeden polisacharydowy antygen Streptococcus pneumoniae (korzystnie skoniugowany z białkiem nośnikowym) i co najmniej jeden antygen białkowy Streptococcus pneumoniae wybrany z grupy składającej się z rodziny biał ek z triadą polihistydynową (Pht; np. PhtA, PhtB, PhtD czy PhtE) lub ich skróconych albo immunologicznie funkcjonalnych odpowiedników, ewentualnie z adiuwantem, korzystnie adiuwantem Th1 (tj. adiuwantem pobudzającym dominującą immunologiczną odpowiedź Th1). Korzystnie zawarte są oba białko pneumokokowe i adiuwant Th1. Opisano także korzystne kompozycje obejmujące kombinacje każdego z każdym wyżej wymienionych białek pneumokokowych według wynalazku z innymi białkami pneumokokowymi.
W korzystnej postaci wykonania immunogenna kompozycja wedł ug wynalazku zawiera PhtD jako antygen białkowy Streptococcus pneumoniae. Również korzystnie immunogenna kompozycja według wynalazku ponadto zawiera Ply. Korzystniej antygen polisacharydowy w kompozycji według wynalazku jest prezentowany w postaci koniugatu polisacharyd-białko nośnikowe. Najkorzystniej białko nośnikowe jest wybrane z grupy składającej się z: toksoidu błoniczego, toksoidu tężcowego, CRM197, hemocyjaniny skałoczepu (KLH), białkowej pochodnej tuberkuliny (PPD) oraz białka D z H. influenzae.
W innej korzystnej postaci wykonania immunogenna kompozycja wedł ug wynalazku obejmuje co najmniej cztery pneumokokowe antygeny polisacharydowe z różnych serotypów.
Adiuwant stosowany korzystnie w kompozycji według wynalazku obejmuje sól glinu. W przypadku gdy adiuwant jest preferencyjnym induktorem odpowiedzi TH1, korzystnie obejmuje on co najmniej jeden z następujących: 3D-MPL, saponiny będącej czynnikiem pobudzającym układ immunologiczny lub immunostymulującego oligonukleotydu CpG. Również korzystnie adiuwant obejmuje nośnik wybrany z grupy zawierającej: emulsję olej w wodzie, liposomy oraz sól glinu.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie immunogennej kompozycji według wynalazku jako leku oraz szczepionka ją obejmująca.
Kompozycje według wynalazku są szczególnie przydatne w leczeniu zapalenia płuc u osób w podeszłym wieku i u małych dzieci. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zatem zastosowanie pneumokokowego antygenu polisacharydowego w kombinacji z białkowym antygenem Streptococcus pneumoniae wybranym z grupy składającej się z PhtA, PhtD, PhtB i PhtE, oraz ewentualnie adiuwantem indukującym TH1 do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia zapalenia płuc u pacjentów powyżej 55 roku życia lub zapalenia ucha środkowego u niemowląt i dzieci młodszych.
Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania immunogennej kompozycji według wynalazku etapy, który obejmuje etapy:
wybierania jednego lub większej liczby pneumokokowych antygenów polisacharydowych; wybierania jednego lub większej liczby antygenów białkowych z grupy składającej się z: PhtA,
PhtD, PhtB i PhtE, oraz mieszania tych antygenów polisacharydowych i białkowych z odpowiednią zaróbką.
Polisacharydowe szczepionki pneumokokowe (skoniugowane lub nie) mogą nie być zdolne do ochrony przed zapaleniem płuc w starszej populacji, gdzie częstość występowania choroby jest bardzo wysoka. Kluczem mechanizmu obronnego przeciw pneumokokowi jest opsonofagocytoza (odpowiedź humoralna zależna od komórek B/neutrofili, wywoływana przez wytwarzanie przeciwciał wobec pneumokokowego polisacharydu, przy czym bakteria ostatecznie ulega fagocytozie), chociaż u osób w podeszłym wieku część mechanizmów zaangażowanych w opsonizację jest osłabiona, przykładowo przez wytwarzanie nadtlenku przez PMN (krwinki białe obojętnochłonne, ang. polymorphonuclear cells), wytwarzanie innych rodzajów reaktywnych tlenków, mobilizację PMN, apoptozę PMN, zniekształcanie PMN. U osób w podeszłym wieku może być również osłabiona odpowiedź związana z przeciwciałami.
Przeciwnie do normalnie przyjmowanego dogmatu, prawidłowy poziom przeciwciał przeciw otoczkowym polisacharydom może nie być skuteczny w całkowitym usuwaniu bakterii, jako że pneumokoki mogą dokonywać inwazji komórek gospodarza unikając tej części systemu immunologicznego.
Zaskakująco, twórcy niniejszego wynalazku wykazali, że jednoczesna stymulacja części układu immunologicznego zależnego od komórek (na przykład odporność zależna od komórek T) wraz z humoralną częścią ukł adu immunologicznego (zależ n ą od komórek B), synergizm (bą d ź współ praca) może przynieść efekt w postaci wzmocnienia oczyszczania gospodarza z pneumokoków. Jest to
PL 210 198 B1 ujawnienie, które ogólnie wspomoże zapobieganie (lub leczenie) zakażeń pneumokokowych, ale w szczególności będzie ważne w zapobieganiu (lub leczeniu) zapalenia płuc u osób w podeszłym wieku, u których szczepionki polisacharydowe nie wykazują skuteczności.
Bez zamiaru wiązania z jakąkolwiek teorią twórcy niniejszego wynalazku wykazali, że oba ramiona układu immunologicznego mogą współpracować jeśli pneumokokowy polisacharyd (korzystnie skoniugowany z białkiem nośnikowym) jest podawany z pneumokokowym białkiem wybranym z grupy obejmującej: PhtA, PhtD, PhtB i PhtE (białka, które mogą być przetwarzane i prezentowane w kontekście klasy II i MHC klasy I na powierzchni zakażonych komórek ssaków). Chociaż jedno lub więcej z tych białek pneumokokowych moż e samo uwolnić komórkowo-zależną odporność, twórcy wynalazku wykazali również, że obecność adiuwanta indukującego Th1 w kompozycji szczepionki pomaga tej części układu immunologicznego i zaskakująco zwiększa synergizm pomiędzy dwiema częściami układu odpornościowego.
Szczegółowy opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dostarcza ulepszoną szczepionkę w szczególności do zapobiegania i łagodzenia objawów zakażeń pneumokokowych u osób w podeszłym wieku i/lub niemowląt i dzieci młodszych.
W kontekście wynalazku pacjent jest traktowany jako osoba w podeszłym wieku, jeśli ukończył co najmniej 55 rok życia, typowo jest osobą powyżej 60 roku życia i bardziej ogólnie powyżej 65 rok życia.
Tak więc w jednym z wykonań według wynalazku dostarczana jest kompozycja szczepionki odpowiednia do stosowania u osób w podeszłym wieku i/lub niemowląt i dzieci młodszych, obejmująca co najmniej jeden z antygenów polisacharydowych Streptococcus pneumoniae i co najmniej jeden antygen (antygeny) białkowe Streptococcus pneumoniae, wybrane z grupy składającej się z: PhtA, PhtD, PhtB i PhtE. Szczepionka może ewentualnie zawierać adiuwant Th1.
W drugim, korzystnym wykonaniu, niniejszy wynalazek dostarcza szczepionkę (odpowiednią w zapobieganiu zapaleniu płuc u osób w podeszłym wieku) obejmującą co najmniej jeden (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 lub 10) antygen (antygeny) polisacharydowy Streptococcus pneumoniae i co najmniej jeden antygen białkowy Streptococcus pneumoniae wybrany z grupy składającej się z: PhtA, PhtD, PhtB i PhtE oraz korzystnie adiuwant Th1.
W powyż szych wykonaniach przedstawione są szczepionki korzystnie obejmujące kombinacje wyżej wymienionych białek pneumokokowych według wynalazku, każde z każdym, oraz z innymi białkami pneumokokowymi są również zobrazowane w opisie poniżej.
Pokazano, że taka szczepionka będzie również użyteczna w leczeniu zakażenia pneumokokowego (na przykład zapalenia ucha środkowego) w innych grupach wysokiego ryzyka w populacji, jak niemowlęta czy dzieci młodsze.
Antygeny polisacharydowe Streptococcus pneumoniae
Typowo szczepionka przeciw Streptococcus pneumoniae według wynalazku będzie obejmować antygeny polisacharydowe (korzystnie skoniugowane z białkiem nośnikowym), przy czym polisacharydy pochodzą od co najmniej czterech serotypów pneumokokowych. Korzystnie cztery serotypy obejmują 6B, 14, 19F i 23F. Bardziej korzystnie kompozycja zawiera co najmniej 7 serotypów, przykładowo te otrzymane z serotypów 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F i 23F. Jeszcze bardziej korzystnie kompozycja zawiera co najmniej 11 serotypów, przykładowo kompozycja w jednym z wykonań zawiera polisacharydy otoczkowe pochodzące od serotypów: 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F i 23F (korzystnie skoniugowane z białkiem nośnikowym). W korzystnym wykonaniu według wynalazku zawartych jest co najmniej 13 antygenów polisacharydowych (korzystnie skoniugowanych z białkiem nośnikowym), chociaż dalsze antygeny polisacharydowe, przykładowo 23 walentne (takie jak serotypy 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F i 33F) są również rozważane według wynalazku.
W przypadku szczepienia osób w podeszłym wieku (na przykład w celu zapobiegania zapaleniu płuc) korzystne jest zawarcie serotypów 8 i 12F (i bardziej korzystne równocześnie serotypów 15 i 22) w 11-walentnej kompozycji antygenowej, opisanej powyżej, z wytworzeniem 15-walentnej szczepionki, podczas gdy dla niemowląt i dzieci młodszych (których najbardziej dotyczy zapalenie ucha środkowego) serotypy 6A i 19A są korzystnie zawarte w uzyskiwanej szczepionce 13-walentnej.
Chociaż powyższe polisacharydy mogą być używane w ich natywnej formie o pełnej długości, należy rozumieć, że polisacharydy o zmniejszonym rozmiarze, które są wciąż immunogenne, mogą być również wykorzystywane (zobacz na przykład EP 497524 i 497525).
PL 210 198 B1
Do zapobiegania/łagodzenia objawów zapalenia płuc u osób w podeszłym wieku (+55 lat) oraz zapalenia ucha środkowego u niemowląt (do 18 miesiąca życia) i dzieci młodszych (typowo od 18 miesiąca życia do 5 roku życia) korzystnym wykonaniem według wynalazku jest połączenie licznych składników polisacharydowych Streptococcus pneumoniae opisanych tutaj, z białkiem Streptococcus pneumoniae wybranym z grupy obejmującej: PhtA, PhtD, PhtB i PhtE lub ich immunologicznie funkcjonalnym odpowiednikiem. Kombinacja białek pneumokokowych może być również być korzystnie wykorzystana jak to opisano poniżej.
Pneumokokowe białka według wynalazku
Dla celów niniejszego wynalazku „immunologicznie funkcjonalny odpowiednik jest definiowany jako peptyd obejmujący co najmniej jeden epitop ochronny z białka opisanego powyżej. Epitopy te są charakterystycznie prezentowane na powierzchni, wysoce konserwowane i mogą wywoływać u gospodarza bakteriobójczą odpowiedź związaną z przeciwciałami lub chronić go przed toksycznymi działaniami. Korzystnie, funkcjonalny odpowiednik ma co najmniej 15, a bardziej korzystnie 30 lub większą liczbę stycznych aminokwasów z białka według wynalazku. Najkorzystniej, fragmenty, delecje białka takie jak jego warianty z delecjami transbłonowymi (tzn. użycie zewnątrzbłonowych domen białek), fuzje, chemicznie lub genetycznie odtoksycznione pochodne i tym podobne mogą być wykorzystane pod warunkiem, że są zdolne do wzbudzenia zasadniczo takiej samej odpowiedzi immunologicznej jak białko natywne. Pozycję potencjalnych epitopów komórek B w sekwencji białka można z łatwością ustalić poprzez identyfikację peptydów, które są jednocześnie prezentowane na powierzchni i antygenowe, wykorzystując kombinację dwóch metod: przewidywanie struktury 2D i przewidywanie wykładnika antygenowego. Przewidywanie struktury 2D można wykonać przy użyciu programu PSIPRED (od David Jones, Brunei Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, Wielka Brytania). Wykładnik antygenowy można obliczyć w oparciu o metodę Jameson i Wolf (CABIOS 4:181-186 [1988]).
Białka w rozwiązaniach według wynalazku są następującymi białkami, z których wszystkie są prezentowane na zewnętrznej powierzchni pneumokoka (mogą być rozpoznawane przez układ odpornościowy gospodarza podczas co najmniej części cyklu życia pneumokoka) lub są białkami wydzielanymi lub uwalnianymi przez pneumokoka.
Białko Streptococcus pneumoniae jest korzystnie wybierane z grupy obejmującej: białko z rodziny z triadą polihistydynową (Pht), białko z rodziny Lyt, białko wiążące cholinę, białka posiadające motyw LPXTG (gdzie X jest dowolnym aminokwasem), białka posiadające motyw sekwencji sygnałowej typu II LXXC (gdzie X jest dowolnym aminokwasem) oraz białka posiadające motyw sekwencji sygnałowej typu I. Korzystnymi przykładami w tych kategoriach (lub motywach) są następujące białka (lub ich skrócone lub immunologicznie funkcjonalne odpowiedniki):
Rodzina Pht (z triadą polihistydynową) obejmuje białka PhtA, PhtB, PhtD i PhtE. Rodzinę charakteryzuje sekwencja przyłączania lipidów, dwie domeny rozdzielone obszarem bogatym w prolinę i kilka histydynowych triad, zaangażowanych prawdopodobnie w wiązanie metalu lub nukleozydów, lub w aktywność enzymatyczną (3-5) obszary typu coiled-coil (superskręcone), konserwowany koniec N i heterologiczny koniec C. Jest obecna we wszystkich szczepach badanych pneumokoków. Homologiczne białka znaleziono także u innych paciorkowców i Neiseria. Korzystni przedstawiciele rodziny obejmują PhtA, PhtB i PhtD. Bardziej korzystnie obejmują PhtA lub PhtD. Jest zrozumiałe, jednak, że określenia Pht A, B, D i E dotyczą białek posiadających sekwencje ujawnione w pracach cytowanych poniżej jak również ich naturalnie występujących (i wytworzonych przez człowieka) wariantów, które posiadają sekwencję homologiczną w co najmniej 90% identyczną z białkami odniesienia. Korzystnie jest ona w 95% identyczna i bardziej korzystnie w 97% identyczna.
Odnośnie białek Pht, PhtA jest ujawnione w WO 98/18930 i określane także jako Sp36. Jak zauważono powyżej, jest to białko z rodziny białek z triadą polihistydynową i posiada motyw sekwencji sygnałowej typu II LXXC.
PhtD jest ujawnione w WO 00/37105 i określane także jako Sp036D. Jak zauważono powyżej, jest to także białko z rodziny białek z triadą polihistydynową i posiada motyw sekwencji sygnałowej typu II LXXC.
PhtB jest ujawnione w WO 00/37105 i określane także jako Sp036B. Innym członkiem rodziny PhtB jest Polipeptyd Degradujący C3 ujawniony w WO 00/17370. Białko to także pochodzi z rodziny białek z triadą polihistydynową i posiada motyw sekwencji sygnałowej typu II LXXC. Korzystnym immunologicznie funkcjonalnym odpowiednikiem jest białko Sp42 ujawnione w WO 98/18930. Ucięte Ph około 79 kD) jest ujawnione w WO 99/15675 i jest ono także uważane za przedstawiciela rodziny PhtX.
PL 210 198 B1
PthE jest ujawnione w WO 00/30299 i jest określane jako BVH-3.
Białka stosowane w niniejszym wynalazku są korzystnie wybrane z grupy PhtD i PthA lub z kombinacji obu tych białek
Korzystne kombinacie jednego lub większej liczby białek z innymi białkami pneumokokowymi
W szczepionce według wynalazku każde z powyższych białek (korzystnie zarówno PhtD jak i PthA) można także korzystnie łączyć z jednym lub większą liczbą białek pneumokokowych z następującej listy: pneumolizyna (także określana jako Ply; korzystnie odtoksyczniona przez traktowanie chemicznie lub przez mutację) [WO 96/05859, WO 90/06951, WO 99/03884], PsaA i jego warianty z delecjami transbłonowymi (Berry i Paton, Infect Immun 1996, Grudz.; 64(12):5255-62), PspA i jego warianty z delecjami transbłonowymi (patent USA 5804193, WO 92/14488, WO 99/53940) PspC i jego warianty z delecjami transbłonowymi (WO 97/09994, WO 99/53940), przedstawiciel rodziny białka wiążącego cholinę (Cbp) [np. CbpA i jego warianty z delecjami transbłonowymi (W097/41151; WO 99/51266)], dehydrogenaza gliceraldehydu-3-fosforanowego (Infect. Immun. 1996, 64:3544), HSP70 (WO 96/4092) PcpA (sanchez-Beato i wsp. FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14) białko typu M (zgłoszenie patentowe SB nr EP 0837130) oraz adhezyna 18627 (zgłoszenie patentowe SB nr EP 0834568). Niniejszy wynalazek obejmuje także immunologicznie funkcjonalne odpowiedniki lub skrócone formy takich białek (jak określono powyżej).
Przedstawiciele rodziny białka wiążącego cholinę zostali pierwotnie zidentyfikowani jako białka pneumokokowe, które można oczyszczać przez chromatografię powinowactwa do choliny. Wszystkie białka wiążące cholinę są niekowalencyjnie związane z ugrupowaniami fosforylocholiny kwasu tejchowego ze ściany komórkowej oraz z kwasem lipotejchowym związanym z błonami. Strukturalnie posiadają one kilka wspólnych obszarów w całej rodzinie, chociaż właściwa natura białek (sekwencja aminokwasowa, długość itp.) może być różna. Zasadniczo, białka wiążące cholinę obejmują obszar na końcu N (N), obszary konserwowanych powtórzeń (R1 i/lub R2), obszar bogaty w prolinę (P) oraz konserwowany region wiążący cholinę (C) zbudowany z wielu powtórzeń, które obejmują średnio połowę białka. Stosowana w tym zgłoszeniu „rodzina białka wiążącego cholinę (Cbp) jest wybrana z grupy składającej się z białek wiążących cholinę jak określono w WO 97/41151, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD i CbpG. CbpA jest ujawnione w WO 97/41151. CbpD i CbpG są ujawnione w WO 00/29434. PspC jest ujawnione w WO 97/09994. PbcA jest ujawnione w WO 98/21337. Korzystnie białka wiążące cholinę są wybrane z grupy składającej się z CbpA, PbcA, SpsA i PspC.
Jeśli Cbp jest dodatkowym wykorzystywanym białkiem może ono być skróconym Cbp, przy czym „Cbp jest określone powyżej a „skrócone odnosi się do białek, które straciły 50% lub więcej obszaru wiążącego cholinę (C). Korzystnie białka takie tracą cały obszar wiążący cholinę. Bardziej korzystnie takie skrócone białka straciły (i) obszar wiążący cholinę i (ii) także fragment połowy N terminalnej białka, przy czym pozostał co najmniej jeden powtórzony obszar (R1 lub R2). Jeszcze bardziej korzystnie skrócone białko posiada 2 obszary (R1 i R2). Przykładami takich korzystnych wykonań są NR1xR2 i R1xR2 jak zilustrowano w WO 99/51266 lub WO 99/51188, chociaż, inne białka wiążące cholinę, które straciły podobny obszar wiążący cholinę są także rozpatrywane w zakresie niniejszego wynalazku.
Białka chimerowe skrócone Cbp - skrócone Lyt (lub fuzje) mogą także być użyte w szczepionce według wynalazku. Korzystnie obejmują one NR1xR2 (lub R1xR2) z Cbp i fragment końca C (Cterm, tzn., który stracił domeny wiążące cholinę) z Lyt (np. LytCterm lub Sp91Cterm). Bardziej korzystnie Cbp jest wybrany z grupy złożonej z CbpA, PbcA, SpsA i PspC. Jeszcze bardziej korzystnie jest CbpA. Korzystnie Lyt jest LytC (określany również jako Sp91).
Także można użyć skrócone białka PspA lub PsaA, które straciły domenę wiążącą cholinę (C) i są wyrażane w fuzji z Lyt. Korzystnie Lyt jest LytC.
Korzystne kombinacie białek pneumokokowych dla celów niniejszego wynalazku
Korzystne połączenia białek według wynalazku są wybrane z 2 lub większej liczby (3 lub 4) różnych kategorii takich jak białka posiadające motyw sekwencji sygnałowej typu II LXXC (gdzie X jest dowolnym aminokwasem, np. rodzina z triadą histydynową (Pht)), białka wiążące cholinę (Cbp), białka posiadające motyw sekwencji sygnałowej typu I (np. Sp101), białka posiadające motyw LPXTG (gdzie X jest dowolnym aminokwasem, np. Sp128, Sp130), toksyny (np. Ply) itd. Korzystnymi przykładami w tych kategoriach (lub motywach) są białka wspomniane powyżej lub ich immunologicznie funkcjonalne odpowiedniki. Korzystnymi połączeniami kategorii są toksyna + Pht, toksyna + Cbp, Plit + Cbp i toksyna + Pht + Cbp.
PL 210 198 B1
Korzystnie pożyteczne połączenia zawierają ale nie wyłącznie PhtD + NR1xR2, PhtD + NR1xR2-Sp91Cterm białka chimerowe lub fuzyjne, PhtD + Ply, PhtD + Sp128, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NR1xR2, PhtA + NR1xR2-Sp91 Cterm białka chimerowe lub fuzje, PhtA + Ply, PhtA + Sp128, PhtA + PsaA, PhtA + PspA, NR1xR2 + LytC, NR1xR2 + PspA, NR1xR2 + PsaA, NR1xR2 + Sp128, R1xR2 + LytC, R1xR2 + PspA, R1xR2 + PsaA, R1xR2 + Sp128, R1xR2 + PhtD, R1xR2 + PhtA. Korzystnie NR1xR2 (lub R1xR2) jest z CbpA lub PspC. Bardziej korzystnie jeśli jest z CbpA.
Szczególnie korzystne połączenie białek pneumokokowych obejmuje Ply (lub jego skrócony czy immunologicznie funkcjonalny odpowiednik) + PhtD (lub jego skrócony czy też immunologicznie funkcjonalny odpowiednik) + NR1xR2 (lub R1xR2). Korzystnie NR1xR2 (lub R1xR2) jest z CbpA lub PspC. Bardziej korzystnie jest z CbpA.
Bez zamiaru wiązania z jakąkolwiek teorią białko pneumokokowe (lub połączenia opisane powyżej) w kompozycji według wynalazku może pomóc indukować odpowiedź zależną od komórek T wobec choroby pneumokokowej - wymaganą zwłaszcza w ochronie przeciw zapaleniu płuc - współdziałającą z humoralną częścią układu odpornościowego w zapobieganiu inwazji pneumokoków i stymulowaniu procesu opsonofagocytozy. Dalszą korzyścią włączenia antygenu białkowego jest prezentacja dalszych antygenów wobec procesu opsonofagocytozy.
Zatem w wykonaniu według wynalazku dostarczana jest szczepionka przeciw Streptococcus pneumoniae obejmująca pneumokokową skoniugowaną szczepionkę polisacharydową obejmującą antygeny polisacharydowe pochodzące co najmniej od czterech serotypów, korzystniej co najmniej 7 serotypów, bardziej korzystnie 11 serotypów i co najmniej z jednym, ale korzystnie z 2, 3 lub 4 biał kami Streptococcus pneumoniae wybranymi z grupy obejmującej PhtA, PhtD, PhtB i PhtE (lub połączeń pneumokokowych białek jak opisano powyżej). Korzystnie jednym z białek jest PhtA (lub jego immunologicznie funkcjonalny odpowiednik). Bardziej korzystnie jedno z białek stanowi PhtD (lub jego immunologicznie funkcjonalny odpowiednik).
Jak wspomniano powyżej, problemem związanym z polisacharydowym podejściem do szczepionki jest fakt, że polisacharydy per se są słabymi immunogenami. Aby ominąć ten problem, polisacharydy mogą być skoniugowane z białkami nośnikowymi, które pomagają biernym komórkom T. Korzystne jest zatem, aby polisacharydy wykorzystywane według wynalazku były połączone z takimi białkami nośnikowymi. Przykłady takich nośników stosowanych obecnie powszechnie do wytwarzania immunogenów polisacharydowych obejmują toksoid błoniczy i tężcowy (odpowiednio DT, DT CRJVI197 i TT) hemocjaninę skał oczepu (KLH), OMPC z N. meningitidis oraz oczyszczona biał kowa pochodna tuberkuliny (PPD).
Korzystnym nośnikiem dla kompozycji immunogennych (lub szczepionek) opartych na pneumokokowym polisacharydzie jest białko D z Haemophilus influenzae (EP 594610-B) lub jego fragmenty. Fragmenty odpowiednie do zastosowania obejmują epitopy komórek T pomocniczych. W szczególności fragment białka D korzystnie będzie zawierał 1/3 końca N z białka. Nośnik z białka D jest zaskakująco przydatny jako nośnik w szczepionkach, w których skoniugowanych jest wiele polisacharydowych antygenów pneumokokowych. Zazwyczaj może wystąpić supresja epitopu jeśli ten sam nośnik jest stosowany dla każdego polisacharydu. Zaskakująco, twórcy niniejszego wynalazku ujawnili, że białko D jest szczególnie stosowne do zminimalizowania skutków takiej supresji epitopu w szczepionkach kombinowanych. Jeden lub większą liczbę połączonych pneumokokowych polisacharydów można korzystnie skoniugować z białkiem D, a korzystnie wszystkie antygeny są skoniugowane z białkiem D w takiej kombinowanej szczepionce.
Dalszym korzystnym nośnikiem dla polisacharydu pneumokokowego jest samo białko pneumokokowe (jak określono powyżej w rozdziale „Pneumokokowe białka według wynalazku).
Polisacharydy można łączyć z białkiem nośnikowym znaną metodą (przykładowo, podaną przez Likhite, w opisie patentowym USA nr 4372945 i Armor i wsp., w patencie USA 4474757). Korzystnie, przeprowadzana jest CDAP (WO 95/08348).
Korzystnie stosunek (wagowo:wagowy) białko:polisacharyd w koniugantach wynosi 0,3:1 do 1:1, bardziej korzystnie 0,6:1 do 0,8:1 i najkorzystniej 0,7:1.
Szczepionki według wynalazku korzystnie zawierają adiuwanty. Stosowne adiuwanty obejmują sole glinu, takie jak żel wodorotlenku glinu (alum) lub fosforan glinu, lecz także sole wapnia, magnezu, żelaza lub cynku lub mogą być nierozpuszczalnymi zawiesinami acetylowanej tyrozyny lub acetylowanych cukrów, kationowo i anionowo derywatyzowane polisacharydy lub polifosfazeny.
PL 210 198 B1
Korzystnie adiuwant jest wybrany jako uprzywilejowany induktor odpowiedzi typu Th1 w celu wzmocnienia części odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem komórek.
Adiuwanty Th1 według wynalazku
Wysokie poziomy cytokin typu Th1 przyczyniają się do indukcji komórkowej odpowiedzi immunologicznej na dany antygen, podczas gdy wysokie poziomy cytokin typu Th2 przyczyniają się do indukcji humoralnej odpowiedzi immunologicznej na dany antygen.
Ważne jest, aby pamiętać, że rozróżnienie odpowiedzi immunologicznej Th1 i Th2 nie jest całkowite. W rzeczywistości osobnik będzie utrzymywał odpowiedź immunologiczną, która jest opisana jako głównie Th1 lub głównie Th2. Chociaż, często wygodnie jest rozpatrywać rodziny cytokin w znaczeniu opisanym dla mysich klonów komórek T CD4 +ve przez Mosmann i Coffman (Mosmann, T.R. i Coffman, R.L. (1989) Th1 and Th2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Reyieyw of Immunology, 7, str. 145-173). Tradycyjnie, odpowiedzi typu
Th1 są związane z wytwarzaniem przez limfocyty T INF-γ i cytokin IL-2. Inne cytokiny, takie jak IL-12, często bezpośrednio związane z indukcją odpowiedzi immunologicznych typu Th1 nie są wytwarzane przez komórki T. Dla kontrastu odpowiedzi typu Th2 są związane z wydzielaniem IL-4, IL-5, IL-6, IL-10. Stosowne systemy adiuwanta, które pobudzają głównie odpowiedź Th1 obejmują: monofosforylolipid A lub jego pochodną w szczególności 3-de-O-acylowany monofosforylolipid A (3D-MPL) (opis jego wytwarzania przedstawiono w GB 222021 A) oraz kombinację monofosforylolipidu A, w szczególności 3-de-O-acylowanego monofosforylolipidu A, z solą glinu (przykładowo fosforanu glinu lub wodorotlenku glinu) lub emulsją olej w wodzie. W takich kombinacjach, antygen i 3D-MPL znajdują się w tych samych określonych strukturach, co pozwala na skuteczniejsze dostarczanie sygnałów antygenowych i immunostymulujących. Badania pokazały, że 3D-MPL są zdolne dodatkowo do wzmacniania immunogenności antygenu zaadsorbowanego na alumie [Thoelen i wsp. Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454-B1].
System wzmacniający wymaga kombinacji lipidu monofosforylowego A i pochodnej saponinowej, w szczególności kombinacji QS21 i 3D-MPL jak ujawniono w WO 94/00153 lub kompozycji mniej reaktywnej gdzie QS21 jest wyciszany cholesterolem, jak ujawniono w WO 96/33739.
Szczególnie silny preparat adiuwanta wymagający QS21, 3D-MPL i tokoferolu w emulsji woda w oleju opisano w WO 95/17210 i jest on korzystnym preparatem.
Korzystnie szczepionka dodatkowo obejmuje saponinę, bardziej korzystnie QS21. Preparat może także obejmować emulsję olej w wodzie i tokoferol (WO 95/17210).
Niniejszy wynalazek dostarcza także sposobu wytwarzania preparatów szczepionki obejmujący mieszanie białka według niniejszego wynalazku z farmaceutycznie dopuszczoną zaróbką taką jak 3D-MPL.
Korzystnymi induktorami odpowiedzi Th1 są także oligonukleotydy zawierające niemetylowane CpG (WO 96/02555) i są one odpowiednie do zastosowania według niniejszego wynalazku.
Szczególnie korzystne kompozycje według wynalazku obejmują jeden lub większą liczbę skoniugowanych polisacharydów pneumokokowych, jedno lub większą liczbę białek pneumokokowych oraz adiuwanta Th1. Bez zamiaru wiązania z jakąkolwiek teorią indukcja odpowiedzi komórkowej poprzez białko pneumokokowe (jak opisano powyżej) oraz współdziałanie pomiędzy dwoma ramionami układu immunologicznego mogą być wspomagane przez zastosowanie adiuwanta Th1, w wyniku czego uzyskiwana jest szczególnie skuteczna szczepionka ogólnie przeciw pneumokokowej chorobie, a w szczególności przeciw pneumokokowemu zapaleniu płuc u osób w podeszłym wieku.
W dalszym aspekcie według niniejszego wynalazku dostarczany jest immunogen lub szczepionka jak tu opisano do zastosowania w medycynie.
Niniejszym opisano sposób zapobiegania lub łagodzenia objawów zapalenia płuc u starszych ludzi (+55 lat) obejmujący podawanie bezpiecznej i skutecznej ilości szczepionki, jak tu opisano, obejmującej antygen polisacharydowy Streptococcus pneumoniae i białko pneumokokowe wybrane z grupy obejmującej: PhtA, PhtD, PhtB i PhtE i ewentualnie adiuwanta Th1, dla omawianych starszych pacjentów.
Niniejszym opisano również sposób zapobiegania lub łagodzenia objawów zapalenia ucha środkowego u niemowląt (do 18 miesiąca) lub dzieci młodszych (typowo 18 miesięcy do 5 roku życia) obejmujący podawanie bezpiecznej i skutecznej ilości szczepionki obejmującej antygen polisacharydowy Streptococcus pneumoniae i antygen białkowy Streptococcus pneumoniae wybrany z grupy obejmującej: PhtA, PhtD, PhtB i PhtE, oraz ewentualnie adiuwanta Th1, dla omawianych niemowląt lub dzieci młodszych.
PL 210 198 B1
Korzystnie w sposobach tych, jak opisano powyżej, antygen polisacharydowy jest obecny jako koniugat polisacharydu z białkiem.
Preparaty szczepionki według wynalazku
Preparaty szczepionki według niniejszego wynalazku mogą być wykorzystane do ochrony lub leczenia ssaków wrażliwych na zakażenie, za pomocą zastosowania wyżej wymienionej szczepionki drogą systemową lub śluzówkową. Zastosowania te mogą obejmować iniekcje drogą domięśniową, dootrzewnową śródskórną lub podskórną; lub podawanie na śluzówki jamy ustnej/przewodu pokarmowego oraz układu oddechowego i moczowo-płciowego. Donosowe podawanie szczepionek w leczeniu zapalenia płuc lub zapaleniu ucha środkowego jest bardziej korzystne (jako że zapobieganie nosogardłowemu nosicielstwu pneumokoków może być bardziej efektywne, osłabiając w ten sposób zakażenie na jego najwcześniejszym etapie). Chociaż szczepionka według wynalazku może być podawana w pojedynczej dawce, jej składniki mogą również być podawane jednocześnie w tym samym czasie lub w różnym czasie (na przykład polisacharydy pneumokokowe mogą być podawane osobno w tym samym czasie lub 1-2 tygodnie po podaniu białka bakteryjnego, będącego składnikiem szczepionki dla optymalnej koordynacji odpowiedzi immunologicznych, odnoszących się do każdej z nich). Przy jednoczesnym podawaniu może być obecny dowolny adiuwant Th1 w jakimkolwiek lub we wszystkich różnych podawaniach, jednakże jest korzystnie jeśli jest obecny w kombinacji z bakteryjną komponentą białkową szczepionki. Dodatkowo do pojedynczej drogi podania, mogą być wykorzystywane 2 różne drogi podania. Na przykład, każdy z wirusowych antygenów może być podawany ID (śródskórnie), podczas gdy białka bakteryjne mogą być podawane IM (domięśniowo) lub IN (donosowo). Polisacharydy mogą być podawane IM (lub ID) i białka bakteryjne mogą być podawane IN (lub ID). Dodatkowo, szczepionki według wynalazku mogą być podawane IM w pierwszych dawkach i IN w dawkach przypominających.
Ilość koniugowanego antygenu w każdej dawce szczepionki jest wybierana na podstawie ilości indukującej odpowiedź immuno-ochronną bez znaczących objawów niepożądanych w typowych szczepionkach. Taka ilość jest różna zależnie od swoistego immunogenu, który jest stosowany i od sposobu w jaki jest on prezentowany. Ogólnie oczekuje się, że każda dawka będzie zawierać 0,1-100 μg polisacharydu, korzystnie 0,1-50 μg, korzystniej 0,1-10 μg, z czego 1-5 μg jest najbardziej korzystnym zakresem.
Zawartość antygenów białkowych w szczepionce będzie typowo w zakresie 1-100 μg, korzystnie 5-50 μg, najbardziej typowo 5-25 μg.
Optymalna ilość składników dla danej szczepionki może być sprawdzona w standardowych badaniach związanych z obserwacjami odpowiednich odpowiedzi immunologicznych u badanych osobników. Po początkowym szczepieniu osobniki mogą otrzymać jedną lub kilka przypominających immunizacji, odpowiednio rozłożonych w czasie.
Preparat szczepionki jest ogólnie opisany w Vaccine Design („The subunit and adjuvant approach (wyd. Powell M.F. & Newmann M.J.) (1995) Plenum Press New York). Hermetyzacja wewnątrz liposomów jest opisana przez Fullertona, patent USA 4235877.
Chociaż szczepionki według niniejszego wynalazku mogą być podawane każdą drogą, śródskórne (ID) podawanie opisanych szczepionek stanowi jedno z wykonań według niniejszego wynalazku. Skóra ludzka obejmuje zewnętrzny rogowy naskórek, nazywany warstwą rogową naskórka, która przykrywa naskórek. Pod tym naskórkiem jest warstwa nazywana skórą właściwą, która przykrywa z kolei tkanki podskórne. Naukowcy wykazali, że taka śródskórna iniekcja szczepionki, zwłaszcza w warstwę skóry właściwej, pobudza odpowiedź immunologiczną, która również może być związana z licznymi dodatkowymi korzyściami. Szczepienie śródskórne opisanymi tutaj szczepionkami stanowi korzystną cechę dla rozwiązań według niniejszego wynalazku.
Konwencjonalna technika iniekcji śródskórnej, „procedura mantoux, obejmuje etapy czyszczenia skóry, następnie naciągania jej jedną ręką i umieszczania końca wąskiej igły (rozmiar 26-31) zwróconej do góry pod kątem 10-15°. Kiedy skos igły zostaje umieszczony, światło igły jest opuszczane i dalej wysuwane naprzód podczas, gdy dostarczany lekki nacisk podnosi ją ponad skórę. Płyn jest następnie wstrzykiwany bardzo powoli i w ten sposób tworzy pęcherzyk lub wypukłość na powierzchni skóry, następnie powoli wycofuje się igłę.
Ostatnio zostały opisane przyrządy, które są zaprojektowane specyficznie do podawania środków płynnych do lub przez skórę, na przykład przyrządy opisane w WO 99/34850 i EP 1092444, również przyrządy wstrzykujące opisane na przykład w WO 01/13977; patent USA 5480381, patent USA
PL 210 198 B1
5599302, patent USA 5334144, patent USA 5993412, patent USA 5649912, patent USA 5569189, patent USA 5704911, patent USA 5383851, patent USA 5893397, patent USA 5466220, patent USA 5339163, patent USA 5312335, patent USA 5503627, patent USA 5064413, patent USA 5520,639, patent USA 4596556, patent USA 4790824, patent USA 4941880, patent USA 4940460, WO 97/37705 i WO 97/13537. Alternatywne metody podawania śródskórnego preparatów szczepionki mogą obejmować konwencjonalne strzykawki i igły lub przyrządy zaprojektowane do balistycznego dostarczania stałych szczepionek (WO 99/27961), lub plastry przezskórne (WO 97/48440; WO 98/28037); lub stosowane na powierzchni skóry (śródskórne lub przezskórne podawanie WO 98/20734; WO 98/28037).
Kiedy szczepionki według wynalazku są podawane doskórnie lub bardziej specyficznie do warstwy skóry właściwej, szczepionka znajduje się w małej objętości płynu, w szczególności w objętości pomiędzy około 0,05 ml i 0,2 ml.
Zawartość antygenów w skórnych lub śródskórnych szczepionkach według wynalazku może być podobna do konwencjonalnych dawek ustalonych dla domięśniowych szczepionek (zobacz powyżej). Jednakże jest cechą szczepionek skórnych lub śródskórnych, że mogą być wytwarzane „w niskiej dawce. Zatem antygeny białkowe w szczepionkach „o niskiej dawce są korzystnie obecne w tak małej ilości jak 0,1 do 10 μg, korzystnie 0,1 do 5 μg na dawkę, a antygeny polisacharydowe (korzystniej koniugowane) mogą być obecne w zakresie 0,01-1 μg, korzystniej pomiędzy 0,01 a 0,5 μg polisacharydu na dawkę.
Użyty tu termin „śródskórne podawanie oznacza podawanie szczepionki w obszar skóry właściwej. Jednakże szczepionka nie musi być koniecznie podawana wybiórczo do warstwy skóry właściwej. Skóra właściwa jest warstwą w skórze zlokalizowaną pomiędzy około 1,0 i 2,0 mm od powierzchni skóry ludzkiej, ale istnieje pewna różnorodność pomiędzy osobnikami i pomiędzy różnymi częściami ciała. Ogólnie można się spodziewać, że osiągnie się warstwę skóry właściwej na wysokości 1,5 mm poniżej powierzchni skóry. Skóra właściwa jest zlokalizowana pomiędzy warstwą rogową naskórka i naskórkiem na powierzchni a warstwą podskórną poniżej. Zależnie od sposobu podawania szczepionka może być ostatecznie umieszczona jedynie lub przede wszystkim w skórze właściwej lub może być ostatecznie dystrybuowana w naskórku i w skórze właściwej.
Niniejszy wynalazek rozważa również kombinację szczepionek, które chronią przeciwko różnym patogenom. Wiele pediatrycznych szczepionek jest obecnie dostępnych jako szczepionki kombinowane, aby w ten sposób ograniczyć liczbę iniekcji, które dzieci muszą otrzymać. Zatem w pediatrycznych szczepionkach inne antygeny z innych patogenów mogą być uwzględnione w szczepionkach według wynalazku. Na przykład, szczepionki według wynalazku mogą być formułowane z (lub podawane osobno, ale w tym samym czasie) dobrze znaną trzywalentną kombinowaną szczepionką obejmującą toksoid błoniczy (DT), toksoid tężcowy (TT) i komponenty krztuścowe [typowo odtoksyczniony toksoid krztuścowy (PT) i włóknista hemaglutynina (FHA) z dowolną pertaktyną (PRN) i/lub aglutyniną 1+2], na przykład handlowa szczepionka INFANRIX-DTPa™ (SmithKlineBeecham Biologicals), zawierająca antygeny DT, TT, PT, FHA i PRN, lub ze składnikami całej komórki krztuścowej, na przykład handlowy Tritarix firmy SmithKlineBeecham Biologicals. Kombinowana szczepionka może również obejmować inny antygen, taki jak powierzchniowy antygen wirusa zapalenia wątroby typu B (HbsAg), antygeny wirusa Polio (na przykład inaktywowany trzywalentny wirus Polio - IPV), białka błony zewnętrznej Moraxella catarrhalis, białka nietypowalne (bezotoczkowe) H. influenzae, białka błony zewnętrznej N. meningitidis B.
Przykłady korzystnych antygenów białkowych Moraxella catarrhalis, które mogą być zawarte w kombinowanej szczepionce (zwłaszcza do zapobiegania zapaleniu ucha środkowego) to: OMP106
[WO 97/41731 (Antex) i WO 96/34960 (PMC)]; OMP21; LbpA i/lub LbpB [WO 98/55606 (PMCP]; TbpA i/lub TbpB [WO 97/13785 i WO 97/32980 (PMC)]; CopB (Helminen ME i wsp. (1993) Infect. Immun. 61: 2003-2010]; UspA1 i/lub UspA2 [WO 93/03761 (University of Texas)]; OmpCD; HasR (PCT/EP99/03824; PilQ (PCT/EP99/03823); OMP85 (PCT/EPOO/01468); lipo06 (GB 9917977.2); lipo10 (GB 9918208.1); lipo11 (GB 9918302.2); lipo18 (GB 9918038.2); P6 (PCT/EP99/03038); D15 (PCT/EP99/03822); OmpA1 (PCT/EP99/06781); Hly3 (PCT/EP99/03257) i OmpE. Przykłady antygenów nietypowalnych Haemophilus influenzae, które mogą być zawarte w kombinacji szczepionki (zwłaszcza do zapobiegania zapaleniu ucha środkowego) obejmują: białko fimbrynowe [(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] i fuzje obejmujące jego peptydy [na przykład fuzje peptydu LBl(f);
PL 210 198 B1
US 5843464 (OSU) lub WO 99/64067]; OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [EP 281673 (State University of New York)]; TbpA i/lub TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmw1; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12641); białko D (EP 594610); P2 i P5 (WO 94/26304).
Inne rozważane kombinacje to pneumokokowe PS i białko według wynalazku w kombinacji z antygenami wirusowymi, na przykład z wirusem grypy (atenuowanym, rozszczepionym lub podzielonym na jednostki [na przykład powierzchniowe glikoproteiny neuraminidazy (NA) i hemaglutynina (HA). Zobacz, na przykład, Chaloupka I. i wsp., Eur, Journal Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1996, 15: 121-127], RSV (np. antygeny F i G lub fuzje F/G, zobacz np. Schmidt A. C. i wsp., J Virol, Maj 2001, str. 45944603), PIV3 (np. białka HN i F, zobacz Schmidt i wsp., powyżej). Varicella (np. atenuowana, glikoproteiny I-V, itd.) oraz każda (lub wszystkie) komponenty MMR (odra, świnka, różyczka).
Korzystna pediatryczna kombinacja szczepionki rozważana według wynalazku dla ogólnego leczenia i zapobiegania zapaleniu ucha środkowego obejmuje: jeden lub więcej antygen(ów) polisacharydowych Streptococcus pneumoniae (korzystnie skoniugowane z białkiem D), jedno lub więcej białek pneumokokowych wybranych z grupy obejmującej: PhtA, PhtD, PhtB i PhtE (lub ich immunologicznie funkcjonalne odpowiedniki) i jeden lub więcej powierzchniowo prezentowanych antygenów z Moraxella catarrhalis i/lub nietypowalnych Haemophilus influenzae. Białko D może być korzystnie używane jako białko nośnikowe dla polisacharydów pneumokokowych, aby pokonać problemy supresji epitopów (jak wspomniano powyżej) i ponieważ samo jest immunogenem zdolnym do ochrony za pośrednictwem komórek B przed nietypowalnym H. influenzae (ntHi). Antygeny Moraxella catarrhalis i nietypowalnych Haemophilus influenzae mogą być zawarte w szczepionce w formie podjednostki lub mogą być dodane jako antygeny obecne na powierzchni pęcherzyków (bąbelków) błony zewnętrznej pochodzących od bakterii.
Korzystnie kompozycje antygenowe (i szczepionki) opisane tutaj wcześniej są liofilizowane do czasu, w którym będą użyte, kiedy to są na poczekaniu odtwarzane w rozpuszczalniku. Bardziej korzystnie są one liofilizowane w obecności 3D-MPL i są na poczekaniu odtwarzane w roztworze soli fizjologicznej. Alternatywnie, białko i polisacharyd mogą być przechowywane osobno w zestawie szczepionkowym (albo jedna albo obie komponenty są liofilizowane), komponenty są odtwarzane i albo mieszane przed użyciem, albo podawane osobno pacjentowi. Adiuwant Th1 (korzystnie 3D-MPL) może być obecny albo w jednej albo w dwóch komponentach.
Liofilizacja szczepionek jest dobrze znana w dziedzinie wynalazku. Typowo płynna szczepionka jest osuszana w formie zamrożonej w obecności czynników zapobiegających zbrylaniu na przykład cukrów, takich jak sacharoza lub laktoza (obecnych w początkowym stężeniu 10-200 mg/ml). Typowo liofilizacja składa się z serii etapów, na przykład cykl rozpoczyna się w 69°C, stopniowo temperatura jest obniżana do -24°C w ciągu 3 godzin, następnie utrzymywana przez 18 godzin, następnie stopniowo podwyższana do -16°C w ciągu 1 godziny, następnie temperatura ta jest utrzymywana przez 6 godzin, następnie stopniowo podwyższana do +34°C w ciągu 3 godzin i ostatecznie ta temperatura jest utrzymywana przez 9 godzin.
Liofilizowanie kompozycji daje w rezultacie bardziej stabilną kompozycję (na przykład zabezpiecza to przed zniszczeniem antygenów polisacharydowych). Metoda ta jest również zadziwiająco odpowiedzialna za wyższe miano przeciwciał przeciw polisacharydom pneumokokowym. Wykazano, że było to szczególnie korzystne dla koniugatów PS 6B. Innym aspektem wynalazku jest zatem liofilizowana antygenowa kompozycja obejmująca koniugat PS 6B z adiuwantem 3D-MPL (korzystnie pozbawionym adiuwantów na bazie glinu) i pneumokokowe białko wybrane z grupy obejmującej: PhtA, PhtD, PhtB i PhtE.
Przykłady
P r z y k ł a d 1
Polisacharyd otoczkowy S. pneumoniae
11-walentna szczepionka - kandydat zawiera polisacharydy otoczkowe serotypów 1,3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F i 23F, które wytworzono zasadniczo jak opisano w EP 72513. Każdy polisacharyd jest aktywowany i derywatyzowany przy użyciu reakcji chemicznej z CDAP (WO 95/08348) i koniugowany z białkiem nośnikowym. Wszystkie polisacharydy są koniugowane w ich natywnej formie, z wyjątkiem serotypu 3, (którego rozmiar był zredukowany, aby obniżyć jego lepkość).
Białko nośnikowe:
Wybrane białko nośnikowe jest zrekombinowanym białkiem D (PD) nietypowalnego Haemophilus influenzae wyrażonym w E. coli.
PL 210 198 B1
Ekspresja białka D
Białko D z Haemophilus influenzae
Konstrukt genetyczny do ekspresji białka D
Materiały wyjściowe
DNA kodujący białko D
Białko D jest silnie konserwowane u H. influenzae wszystkich serotypów i szczepów nietypowalnych. Wektor pHIC348 zawierający sekwencję DNA kodującą cały gen białka D otrzymano od dr A. Forsgrena, Department of Medical Microbiology, University of Lund, Malmo General Hospital, Malmo, Szwecja. Sekwencja DNA białka D była opublikowana przez Janson i wsp. (1991) Infect. Immun. 59:119-125.
Wektor ekspresyjny pMG1
Wektor ekspresyjny pMG1 jest pochodną pBR322 (Gross i wsp., 1985), do którego wprowadzono elementy kontroli transkrypcji i translacji dla wstawianych obcych genów pochodzące z bakteriofagaλ (Shatzman i wsp., 1983). Dodatkowo, gen nadający oporność na ampicylinę wymieniono na gen nadający oporność na kanamycynę.
Szczep E. coli ARS 8
Szczep E. coli ARS 8 wytworzono przez transdukcję N99 roztworem podstawowym faga P1 hodowanego pierwotnie na szczepie pochodnym SA500 (gal::TN10, lambdaKil- cI857 AH1). Szczepy N99 i SA500 są szczepami pochodzącymi z laboratorium dr Martina Rosenberga w National Institute of Health.
Wektor ekspresyjny pMG1
Do wytworzenia białka D, DNA kodujący białko sklonowano w wektorze ekspresyjnym pMG 1. Plazmid ten wykorzystuje sekwencje sygnałowe z DNA faga lambda w celu kierowania transkrypcją i translacją wprowadzonych obcych genów. Wektor zawiera starter PL, operator OL i dwa miejsca wykorzystywane (NutL i NutR) do zmniejszenia efektów polarności transkrypcji, kiedy dostarczone jest białko N (Gross i wsp., 1985). Wektory zawierające starter PL są wprowadzane do lizogenicznej E. coli jako gospodarza dla stabilizacji plazmidu. Szczepy lizogenicznego gospodarza zawierają DNA faga lambda, defektywnego w procesie replikacji, w postaci zintegrowanej z genomem (Shatzman i wsp., 1983). Chromosomalny DNA faga lambda kieruje syntezą białka represora cl, który wiąże się z operatorem OL z wektora i uniemożliwia wiązanie się polimerazy RNA do startera PL i tym samym transkrypcję wstawionego genu. Gen cl ze szczepu ekspresyjnego AR58 zawiera wrażliwe na temperaturę przesunięcie tak, że PL kierujący transkrypcją można regulować zmianą temperatury, tzn. podniesienie temperatury hodowli inaktywuje represor i rozpoczyna się synteza obcego białka. Taki system ekspresji pozwala na kontrolowanie syntezy obcych białek w szczególności tych, które mogą być toksyczne dla komórki (Shimataka i Rosenberg, 1981).
Szczep E. coli AR58
Lizogeniczny szczep E. coli AR58 używany do wytwarzania białka D będącego nośnikiem jest pochodną standardu NIH E. coli K12 szczep N99 (F su galK2, lacZ thr). Zawiera on defektywnego lizogennego faga lambda (gal::TN10 lambdaKil cI857 ΔΗ1). Fenotyp Kil zapobiega wyłączaniu syntezy makrocząsteczek gospodarza. Mutacja cI857 nadaje wrażliwość na temperaturę receptorowi cl. Delecja ΔΗΙ usuwa prawy operon faga lambda oraz loci gospodarza bio, uvr3 i ch1A. Szczep AR58 wytworzono przez transdukcję N99 roztworem podstawowym faga P1 hodowanego pierwotnie na szczepie pochodnym SA500 (gal::TN10, lambdaKil cI857 ΔΗΙ). Wprowadzenie defektywnego lizogenu do N99 selekcjonowano tetracykliną na podstawie obecności transpozonu TN10 kodującego oporność na tetracyklinę w przylegającym genie galE.
Konstrukcja wektora pMGMDPPrD
Wektor pMG1 zawierający gen kodujący niestrukturalne białko S1 wirusa grypy (pMGNS1) wykorzystano do konstrukcji pMGMDPPrD. Gen białka D amplifikowano przy użyciu PCR na matrycy wektora pHIC348 (Janson i wsp., 1991) stosując startery zawierające miejsca restrykcyjne Ncol i Xbal odpowiednio na końcach 5' i 3'. Fragment NcoI/XbaI wprowadzono do pMGNS1 pomiędzy Ncol i Xbal wytwarzając w ten sposób białko zawierające na końcu N 81 aminokwasów z białka NS1, a za nimi białko PD. Wektor oznaczono jako pMGNS1PrD.
Na bazie konstruktu opisanego powyżej wytworzono końcowy konstrukt do wytwarzania białka D. Z pMGNS1PrD usunięto fragment BamHI/BamHI. Taka hydroliza DNA usuwa region kodujący NS1 z wyjątkiem pierwszych trzech reszt na końcu N. Po ponownej ligacji wektora wytworzono gen kodujący fuzję białkową o następującej sekwencji na końcu N:
PL 210 198 B1
---MDP SSHSSNMANT--NS1 Białko D
Białko D nie zawiera peptydu liderowego lub cysteiny na końcu N, do której normalnie dołączone są łańcuchy lipidowe. Białko nie jest zatem ani wydzielane do peryplazmy, ani lipidowane i pozostaje w cytoplazmie w formie rozpuszczalnej.
Końcowy konstrukt pMG-MDPPrD wprowadzono do szczepu gospodarza AR58 za pomocą szoku cieplnego w 37°C. Bakterie zwierające plazmid selekcjonowano w obecności kanamycyny. Obecność wprowadzonego DNA kodującego białko D wykazano poprzez trawienie wyizolowanego DNA plazmidowego za pomocą wybranych endonukleaz. Zrekombinowany szczep E. coli określono jako ECD4.
Ekspresja genu białka D znajduje się pod kontrolą startera PI/operatora OI, faga lambda. Szczep gospodarza AR58 zawiera w genomie gen kodujący temperaturo-wrażliwy cl, który blokuje ekspresję z PL faga lambda w niskiej temperaturze dzięki wiązaniu do OL. Kiedy podniesiona jest temperatura cl jest uwalniany z OL i wytwarzane jest białko D. Po zakończeniu fermentacji komórki są zagęszczane i mrożone.
Ekstrakcję z zebranych komórek i oczyszczanie białka D prowadzono w następujący sposób. Zamrożona hodowla komórek jest rozmrażana i zawieszana w roztworze do otwierania komórek (bufor cytrynianowy pH 6,0) do końcowego OD650=60. Zawiesina jest przepuszczana dwukrotnie przez homogenizator wysokociśnieniowy przy P = 1000 barów. Homogenat hodowli komórkowej jest klarowany przez wirowanie i resztki komórkowe są usuwane przez filtrację. W pierwszym etapie oczyszczania przefiltrowany lizat jest nanoszony na kolumnę do chromatografii kationowymiennej (SP Sepharose Fast Flow). PD wiąże się ze złożem żelowym dzięki oddziaływaniom jonowym i jest wymywane za pomocą skokowo wzrastającej siły jonowej buforu do wymywania.
W drugim etapie oczyszczania zanieczyszczenia są zatrzymywane na złożu anionowymiennym (Q Sepharose Fast Flow). PD nie wiąże się z żelem i może być zbierane z eluatu.
W obu etapach z chromatografią kolumnową zbieranie frakcji jest monitorowane przez OD. Eluat z anionowymiennej chromatografii kolumnowej zawierający białko D jest zatężany przez ultrawirowanie.
Roztwór zawierający białko D po ultrawirowaniu jest ostatecznie przepuszczany przez membranę 0,2 μm.
Chemia:
Chemia aktywacji i sprzęgania
Warunki aktywacji i sprzęgania są specyficzne dla każdego polisacharydu. Są one podane w tabeli 1. Natywny polisacharyd (z wyjątkiem PS3) rozpuszczano w 2M NaCl lub w wodzie do zastrzyków. Optymalne stężenie polisacharydu było oceniane dla wszystkich serotypów.
CDAP (CDAP/PS w stosunku 0,75 mg/ml PS) dodawano do roztworu polisacharydowego z roztworu podstawowego 100 mg/ml. 1,5 min później dodawano 0,2 M trietyloaminę do uzyskania określonego pH aktywacji. Aktywację polisacharydu prowadzono w tym pH przez 2 min w 25°C. Białko D (ilość zależna od stosunku PS/PD) dodawano do aktywowanego polisacharydu i reakcję sprzęgania prowadzono w określonym pH przez 1 godzinę. Reakcje wygaszano glicyną przez 30 min w 25°C i przez noc w 4°C.
Koniuganty oczyszczano poprzez filtrację na żelu przy użyciu kolumny do filtracji ze złożem Sephacryl 500HR gel zrównoważonej 0,2 M NaCl.
We frakcjach wymywanych określano zawartość węglowodanów i białka. Koniugaty zbierano w pule i filtrowano sterylnie na 0,22 μm membranach do sterylizacji. W preparatach białka określano stosunki PS/białka.
Charakterystyka:
Każdy koniugat charakteryzowano i jego dane umieszczono w tabeli 2. Zawartość polisacharydów ^g/ml) mierzono testem Rezorcynolowym, a zawartość białka ^g/ml) testem Lowrego. Końcowy stosunek PS/PD (w/w) określano przy pomocy stosunku stężeń. Zawartość pozostałej DMAP (ngYg PS):
Aktywacja polisacharydu przy użyciu CDAP wprowadza grupę cyjanianową do polisacharydu i uwalniana jest DMAP (4-dimetyloamino-pirydyna). Zawartość pozostałej DAMP określano specyficznym testem opracowanych w SB.
PL 210 198 B1
Zawartość wolnego polisacharydu (%):
Zawartość wolnego polisacharydu z koniugatów trzymanych w 4°C lub przechowywanych 7 dni w 37°C określano w supernatancie uzyskanym po inkubacji z przeciwciałami α-PD i wytrącaniu siarczanem amonu, oraz po których następowało wirowanie.
Do określenia ilości wolnego polisacharydu w supernatancie stosowano test ELISA α-PS/a-PS. Brak koniugatu także kontrolowano testem ELISA α-PD/a-PS. Zredukowanie ilości wolnego polisacharydu prowadziło do uzyskania ulepszonej szczepionki skoniugowanej.
Antygenowość:
Antygenowość niektórych koniugatów analizowano w teście kanapkowym ELISA, gdzie wychwytywanie i wykrywanie przeciwciał prowadzono odpowiednio z α-PS i α-PD. Zawartość wolnego białka (%):
Poziom „wolnego pozostałego białka D określono przy użyciu sposobu z traktowaniem próbki SDS. Koniugaty grzano przez 10 min w 100°C w obecności 0,1% SDS i nastrzykiwano na kolumnę filtracyjną SEC-HPLC gel (TSK 3000-PWXL). Ponieważ białko D jest dimerem, istnieje ryzyko przeszacowania poziomu „wolnego białka D z powodu rozdysocjowania struktury przez SDS.
Masa cząsteczkowa (Kav):
Masę cząsteczkową oznaczano na kolumnie filtracyjnej SEC-HPLC gel (TSK 5000-PWXL). Stabilność:
Stabilność koniugatów trzymanych w 4°C lub przechowywanych 7 dni w 37°C w mierzono na kolumnie filtracyjnej HPLC-SEC gel (TSK 6000-PWXL).
Charakterystykę 11-walentnych przedstawiono w tabeli 2.
Koniugaty białkowe można adsorbować na fosforanie glinu i zbierać w pule w celu wytworzenia ostatecznej szczepionki.
Wnioski:
Wytworzono immunogenne koniugaty, które przedstawiono jako komponenty obiecującej szczepionki. Znaleziono odpowiednie warunki CDAP do uzyskania końcowego produktu skoniugowanego polisacharydu pneumokokowego dla każdego z 11 składników.
T a b e l a 1
Specyficzne warunki aktywacji/sprzęgania/wygaszania koniugatów PS S. pneumoniae-białko D.
Serotyp 1 3 ^płynne) 4 5 6B 7F
Stężenie PS (mg/ml) 2,0 3,0 2,0 7,5 5,4 3,0
Rozpuszczanie PS NaCl 2M NaCl 2M H2O H2O NaCl 2M NaCl 2M
Stężenie PD (mg/ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Początkowy stosunek PS/PD (w/w) 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1
Stężenie CDAP (mg/mg PS) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
pHa-pHc-pHq 9,0/9,0 /9,0 9,0/9,0 /9,0 9,0/9,0 /9,0 9,0/9,0 /9,0 9,5/9,5 /9,0 9,0/9,0 /9,0
Serotyp 9V 14 18C 19F 23F
Stężenie PS (mg/ml) 2,5 2,5 2,0 4,0 3,3
Rozpuszczanie PS NaCl 2M NaCl 2M H2O NaCl 2M NaCl 2M
Stężenie PD (mg/ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Początkowy stosunek PS/PD (w/w) 1/0,75 1/0,75 1/1 1/0,5 1/1
Stężenie CDAP (mg/mg PS) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
pHa-pHc-pHq 8,5/8,5 /9,0 9,0/9,0 /9,0 9,0/9,0 /9,0 10/9,5 /9,0 9,0/9,0 /9,0
PL 210 198 B1
T a b e l a 2
Specyfikacja 11-walentnej pneumokokowej szczepionki PS-PD (pierwsze numery kodu serii wskazują serotyp)
Kryteria D01PDJ227 D03PDJ236 D4PDJ228 D5PDJ235 D6PDJ209
Stosunek PS/Prot (w/w) 1/0,66 1/1,09 1/0,86 1/0,86 1/0,69
Zawartość czystego polisach. (%) < 10% 1 1 7 9 0
Zawartość czystego polisach. (%) < 15% 8 < 1 19 21 9
Zawartość DMAP (ng/gg PS) <0,5 ng/gg PS 0,2 0,6 0,4 1,2 0,3
Masa cząsteczkowa (Kav) 0,18 0,13 0,12 0,11 0,13
Stabilność bez zmian bez zmian bez zmian bez zmian bez zmian
D07PDJ225 D09PDJ222 D14PDJ202 D18PDJ221 D19PDJ206 D23PDJ212
Stosunek PS/Prot (w/w) 1/0,58 1/0,80 1/0,68 1/0,62 1/0,45 1/0,74
Zawartość czystego polisach. (%) < 10% 1 < 1 < 1 4 4 0
Zawartość czystego polisach. (%) < 15% 8 0,3 3 21 10 12
Zawartość DMAP (ng/gg PS) <0,5 ng/gg PS 0,1 0,6 0,3 0,2 0,1 0,9
Masa cząsteczkowa (Kav) 0,14 0,14 0,17 0,10 0,12 0,12
Stabilność bez zmian bez zmian bez zmian bez zmian bez zmian bez zmian
P r z y k ł a d 2
Korzystny wpływ dodania jednego lub większej liczby białek pneumokokowych według wynalazku +/- 3D-MPL na skuteczność ochronną skoniugowanej z PD 11-walentnej polisacharydowej szczepionki przeciwko pneumokokowej kolonizacji płuc u myszy
Odczyty immunologiczne
Oznaczanie swoistego wobec białka pneumokokowego IgG z osocza w teście ELIS A
Płytki do oznaczeń immunologicznych typu Maxisorp Nunc opłaszczano przez 2 godz. w 37°C
100 μΐ/studzienkę 2 μg/ml białka rozcieńczonego w PBS. Płytki płukano 3-krotnie buforem 0,9% NaCl, 0,05% Tween 20. Następnie dodawano serię 2-krotnych rozcieńczeń (w PBS/0,05%) Tween 20, 100 gl na studzienkę) surowicy anty-białko jako odnośnika do krzywej wzorcowej (zaczynając od 670 ng/ml IgG) i próbki surowicy (zaczynając od rozcieńczenia 1/10) inkubowano przez 30 min w 20°C mieszając. Po płukaniu, jak opisano wcześniej, inkubowano skoniugowane z peroksydazą kozie antymysie IgG (Jackson) rozcieńczone 5000x w PBS/0,05% Tween 20 (100 μl/studzienkę) przez 30 min w 20°C mieszając. Po płukaniu, płytki są inkubowane przez 15 min w temp. pokojowej z 100 gl/studzienkę buforu wywołującego (OPDA 0,4 mg/ml i 0,05%) H2O2 w 100 mM buforze cytrynianowym pH 4,5). Wywoływanie jest hamowane przez dodanie 50 μl/studzienkę 1N HCl. Gęstości optyczne są odczytywane przy 490 i 620 nm przy użyciu urządzenia do odczytów immunologicznych Emax (Molecular Devices). Miano przeciwciał oblicza się metodą 4 parametrów matematycznych przy użyciu oprogramowania SoftMaxPro.
Test opsonofagocytozy
Celem tego testu jest powtarzalny pomiar pojemności opsonizacyjnej badanych próbek surowicy przeciwko serotypom Streptococcus pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F lub 23F przy użyciu metody zaadaptowanej z opublikowanej standaryzowanej metody według CDC (Steiner i wsp., Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 4: 415, 1997).
Test ten odtwarza in vitro to, co dzieje się in vivo w pierwotnym mechanizmie usuwania dokonujących inwazji Streptococcus pneumoniae lub pneumokoków. To jest opsonizację pneumokoków, następnie fagocytozę, a następnie zabicie. „Fagocytoza jest procesem, dzięki któremu komórki po16
PL 210 198 B1 chłaniają materiał i zamykają go w wakuoli (fagosomie) w cytoplazmie. Pneumokoki są zabijane po sfagocytowaniu przez zdrowe ssacze fagocyty. „Opsonizacja jest procesem, dzięki któremu wzmacniana jest fagocytoza poprzez umiejscowienie opsonin, np. przeciwciała i komplementu na antygenie.
W literaturze opisywano szereg testów opsonofagocytozy. Wystandaryzowana metoda według CDC była testowana w zespołach wielu laboratoriów (Steiner i wsp., ICAAC, Sierpień 16-20, 2000, Toronto). Ten ostatni test został zaadoptowany w SB, ponieważ dostarczał on podstawę do porównywania z innymi laboratoriami, wykorzystywał odczynniki i kontrole, które są ogólnie dostępne i podawał wyniki jako miano (rozcieńczenie) surowicy zdolne do zabicia 50% żywych pneumokoków, jednostkę powszechnie stosowaną w tego typu testach. Rzeczywiście, pokazano, że zaadaptowany test może dawać wyniki odpowiadające całkiem dobrze wynikom pochodzącym z 4 innych laboratoriów (Steiner i wsp., ICAAC, Sierpień 16-20, 2000, Toronto).
Komórką fagocytującą stosowaną w teście jest linia komórkowa HL60, która pochodziła od osobnika z białaczką promielocytową i została wyprowadzona jako stała linia komórkowa przez Collins i wsp., 1977 (Nature, 270:347-9). Linia komórkowa składa się z niezróżnicowanych komórek krwiotwórczych, to jest 85% komórek blastycznych i promielocytów, 6% mielocytów i 9% komórek zróżnicowanych. Związki polarne mogą indukować różnicowanie tych komórek w dwie różne linie. N,N-dimetyloformamid indukuje różnicowanie granulocytarne dające komórki o różnokształtnych jądrach (44% mielocytów i metamielocytów i 53% wstęgowych i posegmentowanych komórek PMN).
W Wersji A2 testu, surowice do badania są inaktywowane cieplnie i przygotowywanych jest 8 dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń, zaczynając od %, w 96-studzienkowych mikropłytkach w pożywce HBSS zawierającej 0,3% BSA. Końcowa objętość rozcieńczonej surowicy w każdej studzience wynosi 25 gl.
Cztery objętości komórek HL60 przy 107 komórek/ml (5 lub 6 dni po zróżnicowaniu formamidem dimetylowym), 2 objętości bakterii S. pneumoniae (w odpowiednim rozcieńczeniu) i 1 objętość komplementu z młodego królika są mieszane przed użyciem i 25 gl mieszaniny jest dodawane do każdej studzienki 96-studzienkowych mikropłytek zawierających rozcieńczone surowice. Dla serotypu 1 i 6B ilość komplementu jest zwiększona do 12,5% stężenia końcowego, co daje Wersję A3 testu.
Po dwugodzinnej inkubacji w 37°C w orbitalnej wytrząsarce, płytka jest umieszczana na lodzie w celu zahamowania reakcji opsonofagocytozy.
Szacowane są jednostki tworzące kolonie (CFU) w każdej studzience poprzez inkubację przez noc w 37°C. „Miano opsonowe (OT) jest zdefiniowane jako odwrotność rozcieńczenia surowicy zdolnego do zredukowania do co najmniej 50% liczby bakterii S. pneumoniae w studzienkach (tj. 50%) zabicia). % zabicia jest obliczany na podstawie następującego wzoru:
% zabicia = (średnia CFU studzienki kontrolnej - CFU próbki)/ średnia CFU studzienki kontrolnej x 100
Pneumokokowa prowokacja donosowa u myszy OF1
Siedem jednotygodniowych samic myszy OF1 szczepiono donosowo pod narkozą 5.105 CFU zaadaptowanymi dla myszy serotypami S. pneumoniae 2, 4 lub 6B. Usuwano płuca 6 godz. po prowokacji i homogenizowano (Ultramax, 24000 rpm, 4°C) w pożywce Todd Hewith Broth (THB, Gibco). Seryjne 10-krotne rozcieńczenia homogenatów płuc wysiewano na szalki Petriego zawierające ekstrakt drożdżowy uzupełniony agarem THB i umieszczano na noc w 37°C. Pneumokokowe zapalenie płuc jest określane jako liczba CFU/mysz, wyrażona jako średnia ważona logarytmiczna. Granica wykrywalności wynosi 2,14 log CFU/mysz.
P r z y k ł a d 2A
Wpływ adiuwanta 3D-MPL na anty-białkową odpowiedź immunologiczną
W niniejszym przykładzie możemy oszacować wpływ dodania adiuwanta 3D-MPL na odpowiedź immunologiczną przeciwko białku według wynalazku.
Grupy po 10, 6 tygodniowych samic myszy Balb/c immunizowano domięśniowo w dniu 0, 14 i 21 1 gg białka zawartego w A: 100 gg AIPO4 lub B: 100 gg AIPO4 + 5 gg 3D-MPL (3-de-O-acetylowany lipid monofosforylowy A). ELISA IgG jest mierzone w surowicy post III.
Dla dowolnego antygenu, najlepsze odpowiedzi immunologiczne są indukowane u zwierząt zaszczepionych preparatami uzupełnionymi w 3D-MPL.
P r z y k ł a d 2B
Korzystny wpływ dodania białka według wynalazku +/- adiuwanta 3D-MPL na skuteczność ochronną skoniugowanej z PD 11-walentnej polisacharydowej szczepionki przeciw pneumokokowej kolonizacji płuc u myszy OF1 prowokowanych donosowo serotypem 2, 4 lub 6B.
PL 210 198 B1
W niniejszym przykładzie możemy oszacować skuteczność profilaktyczną szczepionki zawierającej koniugat 11-walentnego polisacharydu z białkiem D, białkiem według wynalazku i adiuwantami AIPO4 + 3D-MPL w porównaniu z klasycznie adsorbowanym na AIPO4 preparatem koniugatu 11-walentnego polisacharydu z białkiem D.
Grupy po 12, 4 tygodniowych samic myszy OF1 immunizowano podskórnie w dniu 0 i 14 preparatami zawierającymi A: 50 μg AIPO4; B: 0,1 μg PS/serotyp skoniugowanej z PD 11-walentnej polisacharydowej szczepionki + 50 μg AIPO4; lub C: 0,1 μg PS/serotyp skoniugowanej z PD 11-walentnej polisacharydowej szczepionki + 10 μg białka według wynalazku + 50 μg AIPO4 + 5 μg 3D-MPL (dostarczonego przez Ribi Immunochem). Prowokację wykonano w 21 dniu jak opisano.
Jak można wykazać za pomocą tej metody, znacząca ochrona jest nadawana przez 11-walentną polisacharydową szczepionkę skoniugowaną uzupełnioną białkiem według wynalazku i adiuwantem z AIPO4 + 3D-MPL. Przeciwnie, nie zaobserwowano znaczącej ochrony u zwierząt immunizowanych preparatem skoniugowanego 11-walentnego polisacharydu/AlPO4. Wynik ten może dowodzić tego, że dodanie białka według wynalazku i adiuwanta 3D-MPL wzmacnia skuteczność 11-walentnej polisacharydowej szczepionki skoniugowanej przeciw zapaleniu płuc.
P r z y k ł a d 2C
Korelacje immunologiczne ochrony pokazanej w przykładzie 2B
W celu ustalenia korelacji immunologicznych ochrony nadawanej w przykładzie 2B przez 11-walentną polisacharydową szczepionkę skoniugowaną uzupełnioną białkiem według wynalazku i 3D-MPL, można zmierzyć jak, opisano poniżej, odpowiedzi przeciwciał serologicznych przed prowokacją na polisacharyd 2, 4 lub 6B i na białko według wynalazku.
Miana przeciwciał są następnie porównywane z liczbą kolonii bakterii liczonych w płucach odpowiednich zwierząt zbieranych 6 godz. po prowokacji. R2 są obliczane jako Log/Log liniowej regresji.
Obliczony R2 może wskazywać na brak korelacji pomiędzy humoralnymi odpowiedziami immunologicznymi i ochroną dla obu antygenów. Miana przeciwciała anty-6B (lub 2 lub 4) nie różnią się znacząco w grupach immunizowanych 11-walentną szczepionką skoniugowaną lub tą samą szczepionką uzupełnioną białkiem według wynalazku i 3D-MPL. Zatem ulepszenie ochrony widoczne dla preparatu C nie zależy jedynie od wyższej odpowiedzi przeciwciał na polisacharyd 6B (lub 2 lub 4).
Biorąc to wszystko razem pod uwagę, wyniki mogą sugerować, że ochrona nie odbywa się za pośrednictwem samych humoralnych odpowiedzi immunologicznych, lecz raczej także dzięki odporności komórkowej indukowanej przez antygen białkowy (korzystnie w obecności 3D-MPL). Może dać to dodatkowe poparcie dla dodawania antygenu(ów) białkowego i mocnego adiuwanta(ów) do pneumokokowej skoniugowanej szczepionki polisacharydowej dla koordynowania obydwu części układu immunologicznego w celu optymalnej ochrony.
P r z y k ł a d 3
Współpraca obu ramion układu odpornościowego u myszy immunizowanej aktywnie białkiem według wynalazku i immunizowanej biernie przeciwciałami przeciw PS pneumokokowemu.
P r z y k ł a d 3A
Określenie stężenia biernie podawanych przeciwciał przeciw polisacharydowi 6B (anty-PS) chroniących przed zapaleniem płuc.
Metoda
Grupy szczepionkowe: Cztery grupy 16 myszy były biernie immunizowane (i.p.) pierwszego dnia 100 μl nie rozcieńczonej szczurzej surowicy odpornościowej przeciw-polisacharydowi zgodnie z grupami wyszczególnionymi poniżej (ogółem 64 myszy).
Grupa Specyficzność Stężenie IgG w surowicy odpornościowej
G1 a-PS-6B 5 pg/ml
G2 a-PS-6B 2 pg/ml
G3 a-PS-6B 0,75 pg/m
G4 Kontrola 0 pg/ml
Zwierzęta: 64 mysie samce CD-1 z Charles River, Kanada, ważące w przybliżeniu 35 g (w przybliżeniu w wieku 10 tygodni).
PL 210 198 B1
Znieczulenie: Myszy znieczulano izofluranem (3%) wraz z O2 (1 L/min).
Organizm: S. pneumoniae N1387 (serotyp 6) był zbierany z płytek z agarem tryptozowosojowym (TSA) uzupełnianym 5% krwią końską i zawieszany w 6 ml PBS. Tuż przed zakażeniem 1 ml zawiesiny bakteryjnej rozcieńczano w 9 ml rozpuszczonego i schłodzonego agaru odżywczego (nutrient agar, BBL) i trzymano w 41 °C. Mysz otrzymywała około 6,0 log10 cfu/mysz w objętości 50 gl.
Zakażenie: Dnia 0 mysz była znieczulana, jak opisano powyżej, i zakażana S. pneumoniae N1387 (50 gl schłodzonej zawiesiny bakteryjnej) przez dooskrzelowe zakropienie poprzez niechirurgiczną intubację dotchawiczą. Metodę tę opisali Woodnut i Berry (Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43: 29 (1999)).
Próbki: Trzeciego dnia po zakażeniu, 8 myszy na grupę poświęcano przez przedawkowanie CO2, płuca wycinano i homogenizowano w 1 ml PBS. Dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia przygotowano w PBS aby policzyć żyjące bakterie. Próbki (20 gl) w trzech powtórzeniach inokulowano na płytki z TSA uzupełnionym 5% krwi końskiej i przed oceną inkubowano przez noc w 37°C. Dalsze mysie grupy poświęcano 7 dnia, a próbki przygotowywano jak wyżej.
Wyniki
Stężenie IgG (gg/ml) w szczurzej surowicy Liczba bakterii (log10 cfu/płuca) w dniach po zakażeniu
3 8
5 6,7±0,7 (1/7) 7,2±0,7 (5/8)
2 6,5±0,7 (1/7) 6,9±1,8 (4/7)
0,75 7,7±0,5 (5/8) 4,8±1,4 (2/8)
0 6,7±1,5 (3/6) 6,3±1,5 (3/9)
W nawiasach podano liczby zwierząt, które zmarły przed czasem pobrania próbki.
Wniosek: Ogólnie nie było znaczącej różnicy w liczbach baterii izolowanych w różnych grupach, którymi się zajmowano. To wskazuje, że niemożliwa do zmierzenia ochrona była dostarczana przez przeciwciała skierowane przeciw polisacharydom w stężeniach dochodzących do i równych 5 gg/ml.
Jest to podobne do tego, co obserwowano w niektórych badaniach klinicznych u ludzi, gdzie przeciwciała przeciw-polisacharydowe w niektórych populacjach są niewystarczające do ochrony przed pneumokokowym zapaleniem płuc.
P r z y k ł a d 3B
Określenie ochrony przed zapaleniem płuc, którą daje aktywne podawanie białka według wynalazku z lub bez adiuwanta i synergizmu z suboptymalnymi przeciwciałami anty-PS.
Metoda
Zwierzęta: 128 mysich samców CD-1 (w wieku 6 tygodni podczas immunizacji, w wieku 10 tygodni podczas zakażenia) z Charles River, St. Constant, Quebec, Kanada. Zwierzęta ważyły około 20 g w 6 tygodniu i 38 g w 10 tygodniu.
Immunizacje: Sześć grup po 16 myszy jest immunizowanych 100 gg szczepionki podskórną iniekcją w dniach 22 i 14, jak wyszczególniono poniżej (ogółem 128 myszy). 3D-MPL jest otrzymywane z Ribi/Corixa.
Dnia -1, specyficzne grupy (patrz tabela poniżej) są biernie immunizowane (i.p. 100 gl) w stężeniu 4,26 gg/ml (4 ml z 5 pg/ml + 1,3 ml z 2 gg/ml) mysich przeciwciał przeciw-polisacharydowych.
Grupa Iniekcja Objętość Aktywna Dni podawania szczepionki, 22,-14 (Dawka gg) Iniekcja Objętość Bierna Bierne IgG (1 dzień)
1-1 100 gl s.c. Białko/AlPO4 (10/50) Żaden
1-2 100 gl s.c. Białko/MPL/AlPO4 (10/5/50) Żaden
1-3 100 gl s.c. Białko/AlPO4 (10/50) 100 gl i.p. α-PS
1-4 100 gl s.c. Białko/MPL/AlPO4 (10/5/50) 100 gl i.p. α-PS
1-5 100 gl s.c. MPL/AlPO4 (5/50) 100 gl i.p. α-PS
1-6 100 gl s.c. MPL/AlPO4 (5/50) Żaden
PL 210 198 B1
Zakażenie: Dnia 0, myszy są poddawane znieczuleniu (3% izofluran plus 1 l/min O2). Zawiesiny bakteryjne są przygotowywane przez zbieranie S. pneumoniae N1387 (serotyp 6) z agaru tryptozowo-sojowego (TSA) uzupełnionego 5% krwią końską i zawieszanie w 6 ml PBS. Dziesięciokrotne rozcieńczenie (1 ml plus 9 ml) jest przygotowywane w rozpuszczonym i schłodzonym agarze odżywczym (trzymanym w 41°C) tuż przed zakażeniem. Myszy są zakażane przez dooskrzelowe zakropienie przez intubację dotchawiczą i otrzymują około 6,0 log10 cfu/mysz w objętości 50 gl. Metodę tę opisali Woodnut i Berry (Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43: 29 (1999)).
Próbki: W 72 po zakażeniu, 8 myszy na grupę poświęcano przez przedawkowanie CO2, płuca wycinano i homogenizowano w 1 ml PBS. Dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia są przygotowywane w PBS aby policzyć żyjące bakterie. Próbki (20 gl) w trzech powtórzeniach inokulowano na płytki z TSA uzupełnionym 5% krwi końskiej i przed oceną inkubowano przez noc w 37°C. Dalsze mysie grupy są poświęcane 8 dnia po zakażeniu, a próbki przygotowywano jak wyżej.
Analiza danych
Uzyskaną miarą dla porównania leczenia jest liczba bakterii w płucach dnia 3 i 7 po zakażeniu. Wyniki mogą być przedstawiane jako średnie grupowe ze standardowymi odchyleniami. Analiza statystyczna powinna być wykonywana przy użyciu testu t-Studenta, gdzie wartość P < 0,05 jest uznawana jako znacząca.
Jak przedstawiono powyżej, można wykazać, że same przeciwciała przeciw polisacharydom (grupa 1-5) nie dostarczają ochrony przeciw pneumokokom rosnącym w płucach. Pneumokokowe białko z adiuwantem AlPO4 (grupal-1) może również nie nadawać ochrony, ale może ją nadawać w lepszym stopniu, kiedy białko jest połączone z 3D-MPL (grupa 1-2).
Najbardziej znaczącą ochronę można zaobserwować w grupach z występującymi równocześnie przeciwciałem przeciw-polisacharydowym i białkiem, zwłaszcza w grupie mającej wszystkie trzy elementy, białko, 3D-MPL i biernie podawane przeciwciało przeciw-polisacharydowe (grupa 1-4). Ten wniosek może być również poparty wskaźnikiem śmiertelności. Grupy 1-3, a zwłaszcza 1-4 miały mniej zgonów w porównaniu z innymi grupami.
Wniosek:
Jako, że doświadczenie wykonano z biernie immunizowanymi zwierzętami, efekt synergistyczny także aktywnie immunizowanych białkiem (+/- MPL) nie może być związany ze wzrostem poziomu przeciwciał przeciwko antygenowi polisacharydowemu.
Znaczącą ochronę przeciw pneumokokowemu zapaleniu płuc można zobaczyć w grupach immunizowanych jednocześnie białkiem i biernym podaniem przeciwciała przeciw-polisacharydowego, szczególnie jeśli 3D-MPL jest również obecny, co wskazuje na synergizm tej kombinacji.
Jeśli immunizacja przeciw-polisacharydowa jest prowadzona czynnie (korzystnie z koniugowanym polisacharydem), efekt ten będzie nawet bardziej zaznaczony, jako efekt pamięci komórek B, a stałe poziomy przeciwciała anty-PS w trakcie doświadczenia będą przyczyniać się do współpracy w odpowiedzi immunologicznej.
P r z y k ł a d 4
Sposób określania synergizmu przez korelację z ochroną
Podstawowym mechanizmem ochrony, używanym przez organizm ludzki do usuwania zakaźnych pneumokoków jest przeciwciało pośredniczące w opsonofagocytozie (Bruyn i wsp. Clin Infect Dis. 14:251 (1992)). Podczas gdy kilka metod ELISA ustalono do mierzenia stężenia przeciwciała wobec otoczkowego polisacharydu jako skorelowanego z ochroną stało się oczywiste, że test opsonofagocytozy in vitro jest lepiej skorelowany z ochroną (Musher i wsp. J. Infect. Dis. 182: 158 (2000)).
Białka pneumokokowe dostarczają ochrony przeciw pneumokokowemu zakażeniu za pomocą mechanizmów różniących od opsonofagocytozy, w której pośredniczą przeciwciała. W Przykładzie 2, czynna immunizacja zarówno koniugatem jak i białkiem może pokazać synergistyczny efekt, który nie może być wyjaśniony różnicami w stężeniach przeciwciał dopóki są one takie same w obu grupach. W ten sposób pozostała ochrona, którą można obserwować musi pochodzić od synergistycznego efektu. Podobnie ponieważ przeciwciało jest dodawane biernie, taki sam wniosek można wysnuć z przykładu 3.
W wielu przypadkach białka pneumokokowe są połączone z powierzchnią i oczekuje się, że same mają pewną aktywność opsonizacyjną. W tym wypadku możliwe jest rozróżnienie mechanizmu ochronnego przez ilościowy pomiar zdolności opsonizacyjnej białka przeciw-pneumokokowego, które może być wykorzystane do oceny względnego udziału aktywności opsonizacyjnej w stosunku do innych synergistycznych mechanizmów ochrony.
PL 210 198 B1
W mysim płucnym modelu kolonizacji, względna ochrona każdej szczepionki może być oceniana na podstawie oczyszczania płuc z bakterii. Lub alternatywnie, skuteczność szczepionki może być oceniana na podstawie wskaźników przypadków, jak to jest zazwyczaj określane dla szczepionek.
% ochrony=(CFU/płuco kontrolne-CFU/pł uco szczepione)/(CFU/płuco kontrolne) % skuteczności=(przypadki kontrolne - przypadki szczepione)/(przypadki kontrolne)
Aby określić część ochrony lub skuteczności, która jest wynikiem efektu synergistycznego, przedmiotem określenia jest, której części skuteczności można oczekiwać na podstawie współczynnika mian opsonizacyjnych.
Powyżej w przykładzie 3, % ochrony przez kombinację jest zależny od synergizmu pomiędzy komponentami białko/przeciwciało jako, że ani samo białko ani samo przeciwciało przeciw-polisacharydowe nie nadają wystarczającej ochrony.
Możliwa jest ilościowa ocena ochrony efektu synergistycznego na podstawie względnej aktywności opsonizacyjnej. Jeśli aktywność opsonizacyjna nadawana przez przeciwciała przeciw otoczce polisacharydowej stanowią X, a aktywność opsonizacyjna nadawana przez przeciwciała przeciw pneumolcokowemu białku stanowi Y, wówczas ogólna aktywność opsonizacyjna może być przedstawiona jako X + Y, a względna część aktywności opsonizacyjnej białka jako Y/X + Y. Jest to porównane z względną skutecznością ochronnej szczepionki, przy czym część przeciw-polisacharydowa szczepionki nadaje skuteczność ochronną A%, a skuteczność ochronna szczepionki polisacharydowej wraz z białkiem stanowi B%. Dodatkowa skuteczność, za którą nie może odpowiadać aktywność opsonizacyjna jest określana jako pozostała aktywność ochronna(synergizm) = B% - A% - B%*(Y/X+Y)
Przykład ten nie ma celu ograniczenia sposobów oceny efektu synergizmu. Jeśli tylko inne korelujące z ochroną zostaną wykryte, mogą być wykorzystane do oceny tego synergistycznego efektu.

Claims (16)

1. Immunogenna kompozycja, znamienna tym, że obejmuje co najmniej jeden antygen polisacharydowy Streptococcus pneumoniae i co najmniej jeden antygen białkowy Streptococcus pneumoniae wybrany z grupy składającej się z: PhtA, PhtD, PhtB i PhtE lub ich immunologicznie funkcjonalnych odpowiedników.
2. Immunogenna kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że antygen białkowy Streptococcus pneumoniae stanowi PhtD.
3. Immunogenna kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że ponadto zawiera Ply.
4. Immunogenna kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 3, znamienna tym, że antygen polisacharydowy jest prezentowany w postaci koniugatu polisacharyd-białko nośnikowe.
5. Immunogenna kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że białko nośnikowe jest wybrane z grupy składającej się z: toksoidu błoniczego, toksoidu tężcowego, CRM197, hemocyjaniny skałoczepu (KLH), białkowej pochodnej tuberkuliny (PPD) oraz białka D z H. influenzae.
6. Immunogenna kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 5, znamienna tym, że obejmuje co najmniej cztery pneumokokowe antygeny polisacharydowe z różnych serotypów.
7. Immunogenna kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 6, znamienna tym, że dodatkowo obejmuje adiuwant.
8. Immunogenna kompozycja według zastrz. 7, znamienna tym, że adiuwant obejmuje sól glinu.
9. Immunogenna kompozycja według zastrz. 7, znamienna tym, że adiuwant jest preferencyjnym induktorem odpowiedzi Th1.
10. Immunogenna kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że adiuwant obejmuje co najmniej jeden z następujących: 3D-MPL, saponiny będącej czynnikiem pobudzającym układ immunologiczny lub immunostymulującego oligonukleotydu CpG.
11. Immunogenna kompozycja według zastrz. 10, znamienna tym, że adiuwant obejmuje nośnik wybrany z grupy zawierającej: emulsję olej w wodzie, liposomy oraz sól glinu.
12. Immunogenna kompozycja określona w jednym z zastrz. 1-11 do zastosowania jako lek.
13. Szczepionka, znamienna tym, że obejmuje immunogenna kompozycję określoną w jednym z zastrz. 1-11.
PL 210 198 B1
14. Zastosowanie pneumokokowego antygenu polisacharydowego w kombinacji z białkowym antygenem Streptococcus pneumoniae wybranym z grupy składającej się z PhtA, PhtD, PhtB i PhtE, oraz ewentualnie adiuwantem indukującym Th1 do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia zapalenia płuc u pacjentów powyżej 55 roku życia.
15. Zastosowanie pneumokokowego antygenu polisacharydowego w kombinacji z antygenem białkowym Streptococcus pneumoniae wybranym z grupy składającej się z: PhtA, PhtD, PhtB i PhtE, i ewentualnie z adiuwantem indukującym Th1, do wytwarzania leku do zapobiegania i leczenia zapalenia ucha środkowego u niemowląt i dzieci młodszych.
16. Sposób wytwarzania immunogennej kompozycji określonej w jednym z zastrz. 1 - 11, znamienny tym, że obejmuje etapy:
wybierania jednego lub większej liczby pneumokokowych antygenów polisacharydowych; wybierania jednego lub większej liczby antygenów białkowych z grupy składającej się z: PhtA,
PhtD, PhtB i PhtE, oraz mieszania tych antygenów polisacharydowych i białkowych z odpowiednią zaróbką.
PL361401A 2000-09-15 2001-09-12 Immunogenna kompozycja, jej zastosowanie i sposób wytwarzania oraz zawierająca ją szczepionka przeciwko Streptococcus pneumoniae PL210198B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0022742.1A GB0022742D0 (en) 2000-09-15 2000-09-15 Vaccine

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL361401A1 PL361401A1 (pl) 2004-10-04
PL210198B1 true PL210198B1 (pl) 2011-12-30

Family

ID=9899575

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL361401A PL210198B1 (pl) 2000-09-15 2001-09-12 Immunogenna kompozycja, jej zastosowanie i sposób wytwarzania oraz zawierająca ją szczepionka przeciwko Streptococcus pneumoniae
PL361395A PL209247B1 (pl) 2000-09-15 2001-09-12 Immunogenna kompozycja, zawierająca ją szczepionka, zastosowanie szczepionki oraz sposób wytwarzania szczepionki

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL361395A PL209247B1 (pl) 2000-09-15 2001-09-12 Immunogenna kompozycja, zawierająca ją szczepionka, zastosowanie szczepionki oraz sposób wytwarzania szczepionki

Country Status (25)

Country Link
US (5) US20040081662A1 (pl)
EP (6) EP2314313B1 (pl)
JP (3) JP4903975B2 (pl)
KR (5) KR20100091241A (pl)
CN (3) CN101502648B (pl)
AT (1) ATE516815T1 (pl)
AU (4) AU2054802A (pl)
BR (2) BR0113821A (pl)
CA (2) CA2422002C (pl)
CY (1) CY1111915T1 (pl)
CZ (2) CZ305343B6 (pl)
DK (1) DK1317279T3 (pl)
ES (4) ES2551097T3 (pl)
GB (1) GB0022742D0 (pl)
HK (1) HK1057698A1 (pl)
HU (2) HUP0301092A3 (pl)
IL (4) IL154608A0 (pl)
MX (2) MXPA03002265A (pl)
NO (2) NO336186B1 (pl)
NZ (2) NZ524286A (pl)
PL (2) PL210198B1 (pl)
PT (1) PT1317279E (pl)
SI (1) SI1317279T1 (pl)
WO (2) WO2002022167A2 (pl)
ZA (2) ZA200301526B (pl)

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7078042B2 (en) * 1995-09-15 2006-07-18 Uab Research Foundation Pneumococcal surface protein C (PspC), epitopic regions and strain selection thereof, and uses therefor
US6800744B1 (en) 1997-07-02 2004-10-05 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to Streptococcus pneumoniae for diagnostics and therapeutics
US7153952B1 (en) 1997-07-02 2006-12-26 sanofi pasteur limited/sanofi pasteur limitée Nucleic acid and amino acid sequences relating to Streptococcus pneumoniae for diagnostics and therapeutics
US7128918B1 (en) * 1998-12-23 2006-10-31 Id Biomedical Corporation Streptococcus antigens
CZ303653B6 (cs) * 1999-03-19 2013-01-30 Smithkline Beecham Biologicals S. A. Imunogenní prostredek
US7074415B2 (en) * 2000-06-20 2006-07-11 Id Biomedical Corporation Streptococcus antigens
GB0115176D0 (en) 2001-06-20 2001-08-15 Chiron Spa Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
AU2002351623A1 (en) 2001-12-20 2003-07-09 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
EP2275125A3 (en) * 2002-04-02 2011-03-09 Ben Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Protein-based streptococcus pneumoniae vaccines
US8691243B2 (en) 2002-04-02 2014-04-08 Ben-Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Protein-based Streptococcus pneumoniae vaccine
WO2004032958A1 (en) 2002-10-11 2004-04-22 Chiron Srl Polypeptide-vaccines for broad protection against hypervirulent meningococcal lineages
GB0227346D0 (en) 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741
US8229903B2 (en) * 2002-12-19 2012-07-24 International Business Machines Corporation Suggesting data interpretations and patterns for updating policy documents
WO2004067030A2 (en) 2003-01-30 2004-08-12 Chiron Srl Injectable vaccines against multiple meningococcal serogroups
US8084235B2 (en) 2003-03-13 2011-12-27 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Purification process for bacterial cytolysin
EP1477802A1 (en) * 2003-05-16 2004-11-17 Erasmus Universiteit Rotterdam Method for selecting and producing vaccine components and vaccines based thereon
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
ATE506963T1 (de) 2003-10-02 2011-05-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Kombinationsimpfstoffe gegen meningitis
KR20070095868A (ko) * 2004-09-21 2007-10-01 사노피 파스퇴르 인크 다가 수막구균 유도체화된 다당류-단백질 접합체 및 백신
AU2011253684B8 (en) * 2005-04-08 2013-07-11 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
CN102716480B (zh) 2005-04-08 2023-03-21 惠氏有限责任公司 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物
GB0522765D0 (en) 2005-11-08 2005-12-14 Chiron Srl Combination vaccine manufacture
GB0524066D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Chiron Srl 741 ii
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
CA2808919C (en) 2005-12-22 2016-04-19 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Streptococcus pneumoniae capsular saccharide vaccine
AU2006336520B2 (en) * 2005-12-28 2011-09-15 The Uab Research Foundation Pneumococcal serotypes
US8808707B1 (en) 2006-05-08 2014-08-19 Wyeth Llc Pneumococcal dosing regimen
WO2008022298A2 (en) * 2006-08-17 2008-02-21 The Uab Research Foundation Immunogenic pcpa polypeptides and uses thereof
CL2008001491A1 (es) * 2007-05-24 2008-11-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion liofilizada que comprende uno o mas antigenos y un agonista del receptor de tipo toll 9 (tlr9); y procedimiento de preparacion.
EP2687228B1 (en) 2007-06-26 2017-07-19 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates
GB0713880D0 (en) 2007-07-17 2007-08-29 Novartis Ag Conjugate purification
US20160228500A9 (en) * 2007-07-23 2016-08-11 Martina Ochs Immunogenic Polypeptides and Monoclonal Antibodies
AU2008280799B2 (en) * 2007-07-23 2013-07-11 Sanofi Pasteur Limited Immunogenic polypeptides and monoclonal antibodies
GB0714963D0 (en) 2007-08-01 2007-09-12 Novartis Ag Compositions comprising antigens
WO2009033742A2 (en) * 2007-09-14 2009-03-19 Katholieke Universiteit Leuven Streptococcus pneumoniae vaccines
EP2235531B1 (en) * 2008-02-01 2015-01-14 Sanofi Pasteur Limited Assay for diagnosing streptococcus pneumoniae
US8466167B2 (en) 2008-03-03 2013-06-18 Irm Llc Compounds and compositions as TLR activity modulators
CA2756533A1 (en) 2009-03-24 2010-09-30 Novartis Ag Combinations of meningococcal factor h binding protein and pneumococcal saccharide conjugates
TR201802380T4 (tr) 2009-06-10 2018-03-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa Benzonaftiridin içeren aşılar.
AU2010290896B2 (en) 2009-09-02 2014-07-03 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic compositions including TLR activity modulators
TWI445708B (zh) 2009-09-02 2014-07-21 Irm Llc 作為ｔｌｒ活性調節劑之化合物及組合物
CN102695523A (zh) 2009-09-10 2012-09-26 诺华有限公司 针对呼吸道疾病的组合疫苗
CN101690810B (zh) * 2009-10-21 2011-08-17 辽宁益康生物股份有限公司 一种鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗佐剂及其制备方法
WO2011057148A1 (en) 2009-11-05 2011-05-12 Irm Llc Compounds and compositions as tlr-7 activity modulators
JP5814933B2 (ja) 2009-12-15 2015-11-17 ノバルティス アーゲー 免疫増強化合物の均質な懸濁物およびその使用
KR20120107121A (ko) * 2009-12-22 2012-09-28 사노피 파스퇴르 리미티드 면역원성 조성물
EP2515940A4 (en) 2009-12-22 2013-10-09 Sanofi Pasteur Ltd IMMUNOGENIC COMPOSITIONS AND CORRESPONDING METHODS
GB201003920D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Method of treatment
GB201003922D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
EP2549990A1 (en) 2010-03-23 2013-01-30 Irm Llc Compounds (cystein based lipopeptides) and compositions as tlr2 agonists used for treating infections, inflammations, respiratory diseases etc.
WO2012072769A1 (en) 2010-12-01 2012-06-07 Novartis Ag Pneumococcal rrgb epitopes and clade combinations
WO2012075428A1 (en) * 2010-12-03 2012-06-07 Sanofi Pasteur Limited Composition for immunization against streptococcus pneumoniae
US20140072622A1 (en) * 2011-05-17 2014-03-13 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine against streptococcus pneumoniae
JP2015510872A (ja) 2012-03-07 2015-04-13 ノバルティス アーゲー Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原の増強された製剤
JP2014000016A (ja) * 2012-06-15 2014-01-09 National Agriculture & Food Research Organization 豚丹毒菌の新規な抗原タンパク質、その遺伝子、及び組換えベクターとその利用
RU2510281C2 (ru) * 2012-06-22 2014-03-27 Общество с ограниченной ответственностью "Эпитоп" (ООО "Эпитоп") ВАКЦИНА ПРОТИВ ПНЕВМОНИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ Streptococcus pneumoniae, НА ОСНОВЕ ГИБРИДНОГО БЕЛКА
GB201218660D0 (en) 2012-10-17 2012-11-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
KR20150072444A (ko) * 2012-10-17 2015-06-29 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 하나 이상의 스트렙토코커스 뉴모니애 캡슐 사카라이드 컨쥬게이트 및 해모필루스 인플루엔자로부터의 단백질 Ｅ 및／또는 ＰｉｌＡ를 포함하는 단백질 성분을 포함하는 면역원성 조성물
BR112015015795A2 (pt) 2013-01-01 2017-07-11 Agfa Graphics Nv copolímeros de etilenovinil acetal e seu uso em precursores de chapas de impressão litográfica
CN105188747A (zh) 2013-02-01 2015-12-23 葛兰素史密斯克莱生物公司 包含toll样受体激动剂的免疫组合物的皮内递送
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2015183676A1 (en) * 2014-05-29 2015-12-03 Kapre Subhash V Synthetic peptides as carriers for conjugation with polysaccharides
US9815886B2 (en) 2014-10-28 2017-11-14 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
CN108780282A (zh) 2016-03-16 2018-11-09 爱克发有限公司 加工平版印刷版的设备和相应方法
EP3562838A2 (en) 2016-12-28 2019-11-06 Henriques Normark, Birgitta Microparticles from streptococcus pneumoniae as vaccine antigens
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
US10729763B2 (en) 2017-06-10 2020-08-04 Inventprise, Llc Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds
BR112019026192B1 (pt) 2017-06-10 2022-05-10 Inventprise, Llc Vacinas de conjugado multivalente com polissacarídeos de conjugado bivalente ou multivalente que fornecem imunogenicidade e avidez melhoradas
KR20200123436A (ko) 2018-02-12 2020-10-29 이니뮨 코퍼레이션 톨-유사 수용체 리간드
CN113795306A (zh) * 2019-03-13 2021-12-14 圣朱德儿童研究医院 用于减少肺炎链球菌传播的疫苗组合物和方法
EP3778253A1 (en) 2019-08-13 2021-02-17 Agfa Nv Method for processing a lithographic printing plate
IL302449A (en) 2020-11-04 2023-06-01 Eligo Bioscience CUTIBACTERIUM ACNES PHAGES RECOMBINANT, the production method and their uses

Family Cites Families (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4372945A (en) 1979-11-13 1983-02-08 Likhite Vilas V Antigen compounds
IL61904A (en) 1981-01-13 1985-07-31 Yeda Res & Dev Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same
BE889979A (fr) 1981-08-14 1982-02-15 Smith Kline Rit Procede de preparation de polysaccharides bacteriens capsulaires antigeniques purifies, produits obtenus et leur utilisation
US5360897A (en) * 1981-08-31 1994-11-01 The University Of Rochester Immunogenic conjugates of streptococcus pneumonial capsular polymer and toxin or in toxiad
US4761283A (en) * 1983-07-05 1988-08-02 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4882317A (en) * 1984-05-10 1989-11-21 Merck & Co., Inc. Covalently-modified bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers and methods of preparing such polysaccharides and conjugataes and of confirming covalency
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US4709017A (en) 1985-06-07 1987-11-24 President And Fellows Of Harvard College Modified toxic vaccines
US5173294A (en) 1986-11-18 1992-12-22 Research Foundation Of State University Of New York Dna probe for the identification of haemophilus influenzae
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4940460A (en) 1987-06-19 1990-07-10 Bioject, Inc. Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly
US5339163A (en) 1988-03-16 1994-08-16 Canon Kabushiki Kaisha Automatic exposure control device using plural image plane detection areas
US4912094B1 (en) * 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5006914A (en) * 1988-12-02 1991-04-09 Advanced Technology Materials, Inc. Single crystal semiconductor substrate articles and semiconductor devices comprising same
JP3237842B2 (ja) * 1988-12-16 2001-12-10 オランダ国 ニューモリシンミュータント及びそれから製造されたニューモコッカルワクチン
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
CA2059693C (en) 1991-01-28 2003-08-19 Peter J. Kniskern Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae
CA2059692C (en) 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
US5980909A (en) * 1991-02-15 1999-11-09 Uab Research Foundation Epitopic regions of pneumococcal surface protein A
DK0571538T5 (da) 1991-02-15 2002-03-04 Uab Research Foundation Strukturgen for pneumokokprotein
US5476929A (en) 1991-02-15 1995-12-19 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
US6592876B1 (en) 1993-04-20 2003-07-15 Uab Research Foundation Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products
US5552146A (en) 1991-08-15 1996-09-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to useful antigens of Moraxella catarrhalis
GB9118204D0 (en) 1991-08-23 1991-10-09 Weston Terence E Needle-less injector
US5371197A (en) * 1991-09-24 1994-12-06 Merck & Co., Inc. Protein-dimeric polysaccharide conjugate vaccine
JP3428646B2 (ja) 1992-06-18 2003-07-22 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバードカレッジ ジフテリア毒素ワクチン
ATE188613T1 (de) 1992-06-25 2000-01-15 Smithkline Beecham Biolog Adjuvantien enthaltende impfstoffzusammensetzung
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
DE69331437T2 (de) * 1992-09-16 2002-09-05 Univ Tennessee Res Corp Antigene des hybriden m-proteins und träger für gruppe a streptokokkenimpfstoff
US5569189A (en) 1992-09-28 1996-10-29 Equidyne Systems, Inc. hypodermic jet injector
US5334144A (en) 1992-10-30 1994-08-02 Becton, Dickinson And Company Single use disposable needleless injector
GB9224584D0 (en) 1992-11-23 1993-01-13 Connaught Lab Use of outer membrane protein d15 and its peptides as vaccine against haempohilus influenzae diseases
HU219056B (hu) 1993-03-23 2001-02-28 Smithkline Beecham Biologicals Sa 3-O-Dezacilezett monofoszforil-lipid A-t tartalmazó vakcinakészítmény
EP1300156A3 (en) 1993-05-18 2003-05-07 The Ohio State University Research Foundation Otitis media vaccine
JP3828145B2 (ja) 1993-09-22 2006-10-04 ヘンリー エム．ジャクソン ファウンデイション フォー ザ アドバンスメント オブ ミリタリー メディスン 免疫原性構成物の製造のための新規シアン化試薬を使った可溶性炭水化物の活性化方法
GB9326253D0 (en) * 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
WO1995024176A1 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Bioject, Inc. Ampule filling device
US5466220A (en) 1994-03-08 1995-11-14 Bioject, Inc. Drug vial mixing and transfer device
US5866135A (en) * 1994-04-21 1999-02-02 North American Vaccine, Inc. Group A streptococcal polysaccharide immunogenic compositions and methods
US5917017A (en) 1994-06-08 1999-06-29 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines bearing a mutated R domain
ATE420171T1 (de) 1994-07-15 2009-01-15 Univ Iowa Res Found Immunomodulatorische oligonukleotide
US5565204A (en) 1994-08-24 1996-10-15 American Cyanamid Company Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections
US5599302A (en) 1995-01-09 1997-02-04 Medi-Ject Corporation Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US6440425B1 (en) 1995-05-01 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
JPH11507214A (ja) 1995-06-07 1999-06-29 バイオケム ヴァシーンズ インク． Ｈｓｐ７０ファミリーに属する連鎖球菌の熱ショック蛋白質メンバー
GB9513074D0 (en) 1995-06-27 1995-08-30 Cortecs Ltd Novel anigen
US6290970B1 (en) 1995-10-11 2001-09-18 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor protein of Moraxella
US5893397A (en) 1996-01-12 1999-04-13 Bioject Inc. Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus
US6090576A (en) 1996-03-08 2000-07-18 Connaught Laboratories Limited DNA encoding a transferrin receptor of Moraxella
GB9607549D0 (en) 1996-04-11 1996-06-12 Weston Medical Ltd Spring-powered dispensing device
ATE323721T1 (de) 1996-05-01 2006-05-15 Univ Rockefeller Cholin-bindendes protein, welches als gegen pneumokokken gerichtetes vakzin verwendet wird
US6245335B1 (en) * 1996-05-01 2001-06-12 The Rockefeller University Choline binding proteins for anti-pneumococcal vaccines
US5744417A (en) 1996-05-02 1998-04-28 Lyondell Petrochemical Company Supported catalyst
US7341727B1 (en) 1996-05-03 2008-03-11 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same
AR008242A1 (es) 1996-06-18 1999-12-29 Alza Corp Dispositivo para atravesar el estrato corneo de una superficie corporal
JP2000514308A (ja) 1996-08-16 2000-10-31 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 新規原核生物ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびそれらの使用
US5882896A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation M protein
US5882871A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation Saliva binding protein
EP0941335A2 (en) 1996-10-31 1999-09-15 Human Genome Sciences Streptococcus pneumoniae polynucleotides and sequences
US6291654B1 (en) 1996-11-12 2001-09-18 Regents Of The University Of Minnesota Method for isolating a C3 binding protein of streptococcus pneumoniae
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
AU722574B2 (en) 1996-12-20 2000-08-10 Alza Corporation Device and method for enhancing transdermal agent flux
DE19708537A1 (de) 1997-03-03 1998-09-10 Biotechnolog Forschung Gmbh Neues Oberflächenprotein (SpsA-Protein) von Streptococcus pneumoniae etc.
FR2763244B1 (fr) * 1997-05-14 2003-08-01 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition vaccinale multivalente a porteur mixte
US5993412A (en) 1997-05-19 1999-11-30 Bioject, Inc. Injection apparatus
AU739129B2 (en) 1997-06-03 2001-10-04 Connaught Laboratories Limited Lactoferrin receptor genes of moraxella
KR100619350B1 (ko) * 1997-07-21 2006-09-05 박스터 헬쓰케어 에스.에이. 변형 면역성 뉴멀리신 백신조성물
US6224880B1 (en) * 1997-09-24 2001-05-01 Merck & Co., Inc. Immunization against Streptococcus pneumoniae using conjugated and unconjugated pneumoccocal polysaccharide vaccines
EP1017828A1 (en) * 1997-09-24 2000-07-12 Regents Of The University Of Minnesota HUMAN COMPLEMENT C3-DEGRADING PROTEINASE FROM $i(STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE)
EP0916726A1 (en) * 1997-11-13 1999-05-19 Rijksuniversiteit te Groningen Attaching substances to micro-organisms
AU756828B2 (en) 1997-12-02 2003-01-23 Powderject Vaccines, Inc. Transdermal delivery of particulate vaccine compositions
IT1298087B1 (it) 1998-01-08 1999-12-20 Fiderm S R L Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni
US6709658B1 (en) * 1998-02-12 2004-03-23 Wyeth Holdings Corporation Pneumococcal vaccines formulated with interleukin-12
TR200003498T2 (tr) 1998-04-07 2001-10-22 St. Jude Children's Research Hospital Amino asit sekansından oluşan bir polipetit, bunun aşıları ve kullanımları
EP1067962B1 (en) 1998-04-07 2010-03-24 MedImmune, LLC Derivatives of pneumococcal choline binding proteins for vaccines
AU770378B2 (en) 1998-04-23 2004-02-19 Uab Research Foundation Pneumococcal surface protein C(PspC), epitopic regions and strain selection thereof, and uses therefor
GB9812613D0 (en) 1998-06-11 1998-08-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
IL142017A0 (en) 1998-09-24 2002-03-10 Univ Minnesota Human complement c3-degrading polypeptide from streptococcus pneumoniae
GB2359228A (en) 1998-11-17 2001-08-15 Schlumberger Technology Corp Transmitting information over a communication link
AU2027400A (en) 1998-11-19 2000-06-05 St. Jude Children's Research Hospital Identification and characterization of novel pneumococcal choline binding proteins, cbpg and cbpd, and diagnostic and therapeutic uses thereof
JP4689044B2 (ja) 1998-12-21 2011-05-25 メディミューン，インコーポレーテッド ワクチン用の肺炎連鎖球菌タンパク質と免疫原断片
EP1034792A1 (en) * 1999-03-11 2000-09-13 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Intranasal delivery of pneumococcal polysaccharide vaccines
CZ303653B6 (cs) * 1999-03-19 2013-01-30 Smithkline Beecham Biologicals S. A. Imunogenní prostredek
JP2003501110A (ja) 1999-06-10 2003-01-14 メディミューン，インコーポレーテッド 肺炎連鎖球菌タンパク質とワクチン
WO2000076541A1 (en) * 1999-06-10 2000-12-21 Uab Research Foundation Pneumococcal surface protein combination vaccine
US6319224B1 (en) 1999-08-20 2001-11-20 Bioject Medical Technologies Inc. Intradermal injection system for injecting DNA-based injectables into humans
US6494865B1 (en) 1999-10-14 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Intradermal delivery device including a needle assembly

Also Published As

Publication number Publication date
PL361395A1 (pl) 2004-10-04
HUP0301092A2 (hu) 2003-09-29
US20060051361A1 (en) 2006-03-09
AU2002238193B2 (en) 2005-05-12
CY1111915T1 (el) 2015-11-04
ES2551097T3 (es) 2015-11-16
CN1253205C (zh) 2006-04-26
CN101502648A (zh) 2009-08-12
EP2140878A1 (en) 2010-01-06
US20040081662A1 (en) 2004-04-29
GB0022742D0 (en) 2000-11-01
EP1317280B1 (en) 2015-07-15
KR20030031188A (ko) 2003-04-18
EP1317280A2 (en) 2003-06-11
PT1317279E (pt) 2011-10-11
JP4880184B2 (ja) 2012-02-22
EP2314313B1 (en) 2017-12-27
ZA200301524B (en) 2004-04-21
AU2002220548B2 (en) 2005-04-14
CA2422002C (en) 2013-06-18
EP2140878B1 (en) 2015-08-26
JP4903975B2 (ja) 2012-03-28
IL154607A (en) 2010-11-30
MXPA03002265A (es) 2004-12-03
EP1317279A2 (en) 2003-06-11
WO2002022168A3 (en) 2002-06-27
KR20100091241A (ko) 2010-08-18
US20110008419A1 (en) 2011-01-13
NO20031183D0 (no) 2003-03-14
JP2004508417A (ja) 2004-03-18
KR101268790B1 (ko) 2013-05-29
JP2004508416A (ja) 2004-03-18
CZ305343B6 (cs) 2015-08-12
EP2305297A1 (en) 2011-04-06
DK1317279T3 (da) 2011-10-24
MXPA03002264A (es) 2004-12-03
KR20110132483A (ko) 2011-12-07
EP2314313A1 (en) 2011-04-27
SI1317279T1 (sl) 2011-11-30
HK1057698A1 (en) 2004-04-16
CA2422002A1 (en) 2002-03-21
WO2002022167A2 (en) 2002-03-21
BR0113821A (pt) 2003-06-24
IL154607A0 (en) 2003-09-17
ZA200301526B (en) 2004-06-04
EP1317279B1 (en) 2011-07-20
PL361401A1 (pl) 2004-10-04
WO2002022168A2 (en) 2002-03-21
US20080081050A1 (en) 2008-04-03
CZ2003756A3 (cs) 2003-10-15
ATE516815T1 (de) 2011-08-15
KR100991916B1 (ko) 2010-11-04
BR0113822A (pt) 2003-06-24
IL154608A (en) 2010-11-30
ES2368902T3 (es) 2011-11-23
NZ524287A (en) 2005-03-24
NO20031183L (no) 2003-05-13
CN100486642C (zh) 2009-05-13
HUP0301043A2 (hu) 2003-09-29
CZ305324B6 (cs) 2015-08-05
EP2305298A1 (en) 2011-04-06
CZ2003757A3 (cs) 2003-10-15
CA2421998A1 (en) 2002-03-21
NO336186B1 (no) 2015-06-08
IL154608A0 (en) 2003-09-17
NO20031184L (no) 2003-05-14
CA2421998C (en) 2015-01-06
HUP0301092A3 (en) 2011-03-28
PL209247B1 (pl) 2011-08-31
JP2012006969A (ja) 2012-01-12
HUP0301043A3 (en) 2011-03-28
NO337730B1 (no) 2016-06-13
KR20030031187A (ko) 2003-04-18
KR20080080683A (ko) 2008-09-04
CN101502648B (zh) 2013-07-03
US20140099339A1 (en) 2014-04-10
CN1477970A (zh) 2004-02-25
ES2659400T3 (es) 2018-03-15
AU2054802A (en) 2002-03-26
NO20031184D0 (no) 2003-03-14
CN1694723A (zh) 2005-11-09
KR100805991B1 (ko) 2008-02-26
AU3819302A (en) 2002-03-26
NZ524286A (en) 2005-05-27
WO2002022167A3 (en) 2002-06-27
ES2545876T3 (es) 2015-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100805991B1 (ko) 백신
JP5551579B2 (ja) ワクチン
AU2002220548A1 (en) Vaccine against streptococcus penumoniae
AU2002238193A1 (en) Vaccine against streptococcus pneumoniae
MXPA01009455A (en) Vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification