CZ2003756A3 - Imunogenní prostředek - Google Patents

Imunogenní prostředek Download PDF

Info

Publication number
CZ2003756A3
CZ2003756A3 CZ2003756A CZ2003756A CZ2003756A3 CZ 2003756 A3 CZ2003756 A3 CZ 2003756A3 CZ 2003756 A CZ2003756 A CZ 2003756A CZ 2003756 A CZ2003756 A CZ 2003756A CZ 2003756 A3 CZ2003756 A3 CZ 2003756A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
protein
polysaccharide
vaccine
pneumococcal
streptococcus pneumoniae
Prior art date
Application number
CZ2003756A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ305324B6 (cs
Inventor
Craig Antony Joseph Laferriere
Jan Poolman
Original Assignee
Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9899575&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ2003756(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Smithkline Beecham Biologicals S. A. filed Critical Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Publication of CZ2003756A3 publication Critical patent/CZ2003756A3/cs
Publication of CZ305324B6 publication Critical patent/CZ305324B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/0208—Specific bacteria not otherwise provided for
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/125—Picornaviridae, e.g. calicivirus
    • A61K39/13—Poliovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Předkládaný vynález se týká vakcín obsahujících bakteriální polysacharidový antigen, jejich výroby a použití takových polysacharidů v medicíně.
Konkrétně se předkládaný vynález týká vakcín obsahujících pneumokokový polysacharidový antigen, typicky pneumokokový polysacharidový konjugovaný antigen, formulovaný s proteinovým antigenem od Streptococcus pneumoniae a případně s Thlindukujícím adjuvans.
Dosavadní stav techniky
Streptococcus pneumoniae je Gram-pozitivní bakterie odpovědná za významnou morbiditu a mortalitu (zejména u mladých a starých jedinců), způsobující invazivní onemocnění jako je pneumonie, bakteremie a meningitida, a onemocnění asociovaná s kolonizací, jako je akutní otitis media. Výskyt pneumokokové pneumonie v US pro jedince starší 60 let je 3 až 8 na 100000. Ve 20% případech tato infekce způsobuje bakteriemii a další manifestace, jako je meningitis, s mortalitou blížící se 30%, i při antibiotické terapii.
Pneumococcus je enkapsulovaný chemicky vázaným polysacharidem, který určuje serotypovou specificitu. Existuje 90 známých serotypů pneumokoků a kapsula je pro pneumokoky základní determinantou virulence, protože kapsule nejen chrání vnitřní povrch bakterie před komplementem, ale je též slabě imunogenní. Polysacharidy jsou T-independěntní antigeny a nemohou být zpracovány nebo prezentovány na MHC molekulách,
aby mohly interagovat s T-lymfocyty. Nicméně, mohou stimulovat imunitní systém alternativním mechanismem, který zahrnuje zesítění povrchových receptoru na B-lymfocytech.
V několika experimentech bylo prokázáno, že ochrana proti invazivnímu pneumokokovému onemocnění nej silněji koreluje s protilátkami specifickými pro kapsulu a že ochrana'je specifická pro serotyp.
Vakcíny na bázi polysacharidového antigenu jsou dobře známé v oboru. Mezi čtyři vakcíny, které byly schváleny k použití, patří Vi polysacharid Salmonella typhi, PRP polysacharid Haemophilus influenzae, tetravalentní menongokoková vakcína složená ze serotypů A, C, W135 a Y, a 23-valentní pneumokoková vakcína složená z polysacharidů odpovídajících serotypům 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 20, 20F, 23F a 33 (což tvoří alespoň 90% izolátů pneumokoků z krve).
Poslední tři uvedené vakcíny indukují ochranu před bakteriemi způsobujícími respirační infekce, které mají závažnou morbiditu a mortalitu u kojenců, ale nebyly schváleny pro použití u dětí mladších dvou let, protože jsou v této věkové skupině neadekvátně imunogenní (Peltola et al., 1984,
N. Engl. J. Med. 310: 1561-1566). Streptococcus pneumoniae je nej častější příčinou invazivních bakteriálních onemocnění a otitis media u kojenců a mladších dětí. Obdobně, u starých jedinců dochází ke špatné odpovědi na pneumokokové vakcíny (Roghmann et al., (1987), J. Gerontol. 42:265-270], což je důvodem zvýšené incidence bakteriální pneumonie v této populaci [Verghese a Berk, (1983) Medicine (Baltimore) 62:271285] .
Strategie, které byly navrženy pro překonání tohoto chybění imunogenicity u dětí, spočívají v navázání polysacharidu na velké imunogenní proteiny,které napomáhají v indukci Tlymfocytů a které indukují imunologickou paměť k polysacharidovému antigenu, se kterým jsou konjugované.
Vakcíny obsahující konjugovaný pneumokokový glykoprotein jsou v současnosti hodnoceny z hlediska bezpečnosti, imunogenicity a účinnosti v různých věkových skupinách.
23-valentní nekonjugovaná nekonjugovaná pneumokoková vakcina vykazovala různou klinickou účinnost, od 0% do 81% (Fedson et al. (1994) Arch Intern Med. 154: 2531-2535). Zdálo se, že účinnost souvisí s rizikovou skupinou, která je imunizována, jako jsou staří pacienti, pacienti s Hodginovou nemocí, po splenektomii, se srpkovitou anemií a agammaglobulinemií (Fine et al. (1994) Arch Intern Med. 154:2666-2677), a také s manifestací onemocnění. 23-valentní vakcina nevykazuje ochranu před pneumokokovou pneumonií (u některých rizikových jedinců, jako jsou staří lidé) a před otitis media.
Proto stále trvá potřeba vylepšené pneumokokové vakcíny, . zejména takové, která by byla více účinná v prevenci.nebo zmírnění pneumokokových onemocnění (zejména pneumonie) u starých jedinců a malých dětí.
Předkládaný vynález poskytuje takovou zlepšenou vakcínu.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje vakcinační prostředek, který obsahuje alespoň jeden polysacharidový antigen Streptococcus pneumoniae .(výhodně konjugovaný na proteinový nosič) a proteinový antigen Streptococcus pneumoniae vybraný ze skupiny • · · ·
zahrnující: rodinu poly-histidinové triády (Pht; například PhtA, PhtB, PhtD nebo PhtE), Lyt rodinu (například LytA, LytB nebo LytC), SpsA, Spl28, Spl30, Spl25, SplOl a Spl33, nebo jejich zkrácené nebo imunologicky funkční ekvivalenty, volitelně s Thl adjuvans (nebo s adjuvans indukujícím především Thl imunitní reakci). Výhodně je obsažen jak pneumokokový protein, tak Thl adjuvans. Vynález také popisuje výhodné prostředky obsahující kombinaci výše uvedených pneumokokových proteinů podle předkládaného vynálezu mezi sebou a s dalšími pneumokokovými proteiny. Prostředky podle předkládaného vynálezu jsou zejména vhodné pro léčbu stařecké pneumonie.
Pneumokokové polysacharidové vakcíny (konjugované či nikoliv) nemusí být schopné chránit před pneumonií u staré populace, ve které je incidence tohoto onemocnění velmi vysoká. Klíčovým o branným mechanismem proti pneumokokům je opsonofagocytosa (humáními B-lymfocyty/neutrofily zprostředkovaný děj způsobený produkcí protilátek proti pneumokokovému polysacharidu, při které je bakterie eventuálně fagocytována), některé složky opsonizačních mechanismů jsou však ve stáří narušeny, například produkce superoxidu PMN (polymorfonukleárními buňkami), produkce jiných reaktivních druhů kyslíku, mobilizace PMN, apoptosa PMN, deformabilita PMN. Ve stáří může být též narušena protilátková odpověď.
Oproti běžně akceptovanému dogmatu nemusí být normální hladiny protilátek proti polysacharidu kapsuly účinné v kompletní eliminaci bakterií, protože pneumokoky mohou invadovat do hostitelských buněk a tak mohou uniknout této složce imunitního systému.
Překvapivě předkladatelé vynálezu zjistili, že simultánní stimulací buněčné složky imunitního systému (například Tlymfocyty zprostředkované imunity) společně s humorální složkou imunitního systému (zprostředkovanou B-lymfocyty), je možno dosáhnou synergie (kooperace) , která může zesílit eliminaci pneumokoků z hostitele. Toto je objev, který napomůže prevenci (nebo léčbě) pneumokokové infekce obecně, ale který je zejména důležitý pro prevenci (nebo léčbu) pneumonie u starších jedinců, u kterých vakcíny na bázi polysacharidů nevykazují účinnost.
Bez vazby na jakoukoliv konkrétní teorii vynálezci zjistili, že obě složky imunitního systému mohou působit synergně tehdy, když je pneumokokový polysacharid (výhodně konjugovaný na proteinový nosič) podán s pneumokokovým proteinem vybraným ze skupiny zahrnující: PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, LytA, LytB, LytC, SpsA, Spl28, Spl30, Spl25, SplOl a Spl33 (což jsou proteiny, které mohou být zpracovány a prezentovány v kontextu MHC třídy II a I na povrchu infikovaných savčích buněk). Vynálezci také zjistili, že ačkoliv může jeden nebo více těchto pneumokokových proteinů spouštět buněčnou imunitu sám o sobě, napomáhá přítomnost Thl indukujícího adjuvans ve vakcíně této složce imunitního systému a překvapivě dále zesiluje synergii mezi oběma složkami imunitního systému.
Popis předkládaného vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje vylepšenou vakcínu pro prevenci nebo zmírnění pneumokokové infekce u starších jedinců (a/nebo kojenců a batolat).
• · · · · · • · · · · ·
V předkládaném vynálezu je pacient považován za starého jedince, pokud je mu více než 55 let, obvykle více. než 60 let, typicky více než 65 let.
V jednom provedení tedy vynález poskytuje vakcinační prostředek, vhodný pro použití u starých jedinců (a/nebo kojenců a batolat), který obsahuje alespoň jeden polysacharidový antigen Streptococcus pneumoniae a alespoň jeden proteinový antigen Streptococcus pneumoniae vybraný ze skupiny zahrnující: PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl30 a Spl33. Vakcína může volitelně obsahovat Thl adjuvans.
V jiném provedení vynález poskytuje vakcínu (vhodný pro prevenci pneumonie u starých jedinců), která obsahuje alespoň jeden (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 nebo 10) polysacharidový antigen Streptococcus pneumoniae a alespoň jeden proteinový antigen Streptococcus pneumoniae vybraný ze skupiny zahrnující: PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl30 a Spl33, a výhodně Thl adjuvans.
Výše uvedená provedení vakcín výhodně obsahujících vzájemné kombinace pneumokokových proteinů podle předkládaného vynálezu a kombinace s jinými pneumokokovými proteiny spadají též do rozsahu předkládaného vynálezu.
Předpokládá se, že taková vakcína bude také použitelná pro léčbu pneumokokových infekcí (například otitis media) v jiných rizikových skupinách populace, jako jsou kojenci nebo batolata.
Polysacharidové antigeny Streptococcus pneumoniae podle předkládaného vynálezu • · · ·
Typicky bude vakcina proti Streptococcus pneumoniae podle předkládaného vynálezu obsahovat polysacharidové antigeny (výhodně konjugované na proteinový nosič), kde polysacharidy jsou odvozeny od alespoň čtyř serotypů pneumokoka. Výhodně jsou těmito čtyřmi serotypy 6B, 14, 19F a 23F.\ Výhodněji je v přípravku obsaženo alespoň 7 serotypů, například ty polysacharidy, které jsou získány od serotypů 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F a 23F. Ještě výhodněji je v přípravku obsaženo alespoň 11 serotypů, například ty polysacharidy, které jsou získány od serotypů 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F a 23F (které jsou výhodně konjugovány na proteinový nosič). Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu je obsaženo alespoň 13 polysacharidových antigenů (které jsou výhodně konjugovány na proteinový nosič), ačkoliv další polysacharidové antigeny, například 23-valentní (jako jsou serotypy 1, 2, 3, 4, 5, 6B,
7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F a 33F) také spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.
Pro vakcinaci ve stáří (například pro prevenci pneumonie) je výhodné do 11-valentního antigenního prostředku zahrnout serotypy 8 a 12F (a nejlépe též 15 a 22), takže vznikne 15valentní vakcina, zatímco pro vakcinaci kojenců nebo batolat (kde se jedná o otitis media) je výhodné zahrnout serotypy 6A a 19A, za zisku 13-valentní vakcíny.
Ačkoliv mohou být polysacharidy popsané výše použity v úplné, nativní formě, mohou být použity též polysacharidy s redukovanou velikostí, které jsou stále ještě imunogenní (viz např. EP 497524 a 497525).
• · · ·
Pro prevenci nebo zmírnění pneumonie u starých jedinců (+55 let) a otitis media u kojenců (do 18 měsíců) a batolat (obvykle 18 měsíců až 5 let), je výhodným provedením vynálezu kombinování multivalentní polysacharid Streptococcus pneumoniae podle předkládaného vynálezu a protein Streptococcus pneumoniae vybraný ze skupiny zahrnující: PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl30 a Spl33, a jejich imunologicky funkční ekvivalenty. Kombinace pneumokokových proteinů může být také použita, jak je popsáno dále.
Pneumokokové proteiny podle předkládaného vynálezu
Imunologicky funkční ekvivalent je definován v předkládaném jako peptid nebo protein obsahující alespoň jeden protektivní epitop z proteinu podle předkládaného vynálezu. Takové 'epitopy jsou obvykle vystaveny na povrchu, jsou vysoce konzervovány a mohou vyvolat baktericidní protilátkovou reakci u hostitele nebo mohou zabránit toxickým účinkům. Výhodně může být použit funkční ekvivalent obsahující alespoň 15 a výhodně 30 nebo více sousedících aminokyselin z proteinu podle předkládaného vynálezu. Nejvýhodněji jsou použity fragmenty, deleční varianty proteinu, jako například transmembránové deleční varianty (tj. použije se extracelulární doména proteinu), fúze, chemicky nebo geneticky detoxifikované deriváty a podobně, za podmínky, že tyto ekvivalenty jsou schopné vyvolat v podstatě stejnou imunologickou reakci jako přirozený protein. Pozice potenciálních B-lymfocytárních epitopů v proteinové sekvenci může snadno určena pomocí identifikace peptidů, které jsou jak vystavené na povrchu, tak antigenní, kde toto určení lze provést za použití kombinace dvou metod: 2D-strukturální predikce a predikce antigenního indexu. Predikce 2D-struktury může být provedena za použití PSIPRED programu (od David Jones, Brunel Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, UK). Antigenní index může být vypočítán způsobem podle Jamesona a Wolfa (CABIOS
4:181-186 [1988]) .
Proteiny podle předkládaného vynálezu jsou následující proteiny, které jsou všechny exponovány na vnějším povrchu pneumokoka (a tak mohou být rozpoznávány imunitním systémem hostitele během alespoň části životního cyklu pneumokoka) nebo se jedná o proteiny, které jsou secernovány nebo uvolňovány pneumokokem.
Protein Streptococcus pneumoniae podle předkládaného vynálezu je vybrán ze skupiny zahrnující: proteiny z rodiny polyhistidinové triády (Pht), proteiny z Lyt rodiny, proteiny vážící cholin, proteiny mající LPXTG motiv (kde X je jakákoliv aminokyselina), proteiny mající motiv signální sekvence typu II LXXC (kde X je jakákoliv aminokyselina) a proteiny mající motiv signální sekvence typu I. Výhodnými příklady v těchto kategoriích (nebo motivech) jsou následující proteiny nebo jejich imunologicky funkční ekvivalenty.
Pht (Póly Histidinová Triáda) rodina obsahuje proteiny PhtA, PhtB, PhtD a PhtE. Rodina je charakterizována lipidační sekvencí, dvěma doménami separovanými regionem bohatým na prolin a několika histidinovými triádami, které se snad účastní na vazbě kovů nebo nukleosidů nebo na enzymatické aktivitě, (3-5) stočenými regiony, a konzervovaným N-koncem a heterogenním C-koncem. Tato rodina je.přítomná u všech testovaných kmenů pneumokoků. Homologní proteiny byly také zjištěny v jiných Streptokokách a Neisseriích. Mezi výhodné členy rodiny patří PhtA, PhtB a PhtD. Výhodněji obsahuje • ·· · · 99 9 9 99 9999
9 9 · «9 9 99 9 • · 9 «99 9999
99999 99 9 99 99 rodina PhtA nebo PhtD. Je třeba si uvědomit, že termíny PhtA, B, D a E označují proteiny mající sekvence popsané ve výše uvedených citacích, stejně jako jejich přirozené (a uměle vyrobené) varianty, které mají sekvenci z alespoň 90% identickou jako uvedené proteiny. Výhodně je sekvence alespoň z 95% identická a nejlépe je alespoň z 97% identická.
S ohledem na PhtX proteiny je PhtA popsán ve WO 98/18930, a je též označován jako Sp36. Jak bylo uvedeno výše, jedná se o protein z rodiny polyhistidinové triády a obsahuje typ II signálního motivu LXXC.
PhtD je popsán ve WO 00/37105, a je též označován jako SpO36D. Jak bylo uvedeno výše, jedná se také o protein z rodiny polyhistidinové triády a obsahuje typ II signálního motivu LXXC.
PhtB je popsán ve WO 00/37105, a je též označován jako SpO36B. Jiným členem PhtB rodiny je C3-degradující polypeptid, jak je popsán ve WO 00/17370. Tento protein patří též do rodiny polyhistidinové triády a obsahuje typ II LXXC signálního motivu. Výhodný imunologicky funkční ekvivalent je protein Sp42 popsaný ve WO 98/18930. Zkrácená forma PhtB (přibližně 79kD) je popsána ve WO 99/15675 a je též považována za člena PhtX rodiny.
PhtE je popsán ve WO 00/30299 a je označován jako BVH-3.
SpsA je vazebný protein pro cholin popsaný ve WO 98/39450.
Lyt rodina jsou proteiny asociované s membránou asociované s buněčnou lýzou. N-koncová doména obsahuje vazebnou doménu pro cholin, ale Lyt rodina nemá všechny vlastnosti uvedené u rodiny vazebných proteinů pro cholin (Cbp) rodiny a tak je pro • ♦· ·· ···· ·· toto·· • · · · · · to toto · ······ to to to • to · · · to to to to to • · · · · · · · toto ·· předkládaný vynález Lyt rodina považována za rodinu odlišnou od Cbp rodiny. Na rozdíl od Cbp rodiny C-koncová doména obsahuje katalytickou doménu rodiny Lyt proteinu. Rodina zahrnuje LytA, B a C. S ohledem na LytX rodinu je LytA popsán v Ronda et al, Eur J Biochem, 164:621-624 (1987). LytB je popsán ve WO 98/18930, a je též označován jako Sp46.-LytC je také popsán v WO 98/18930, a je též označován jako Sp91. Výhodným členem této rodiny je LytC.
Jiným výhodným provedením jsou Lyt zkrácené formy, kde Lyt je definován výše a zkrácené formy označují Lyt proteiny bez 50% nebo více vazebného regionu pro cholin. Výhodně takové proteiny neobsahují celý vazebný region pro cholin.
Spl25 je příkladem povrchového proteinu pneumokoka s LPXTG motivem zakotveným v buněčné stěně (kde X je jakákoliv aminokyselina). Bylo zjištěno, že jakýkoliv protein s touto třídou pneumokokového povrchového proteinu s tímto motivem je užitečný v předkládaném vynálezu a proto se považuje za další protein podle předkládaného vynálezu. Spl25 sám je popsán ve WO 98/18930, a je také znám jako ZmpB — zinková metaloproteinasa.
SplOl je popsán ve WO 98/06734 (kde má označení #y85993). Je charakterizován signální sekvencí typu I.
Spl33 je popsán ve WO 98/06734 (kde má označení #y85992). Je také charakterizován signální sekvencí typu I.
Spl28 a Spl30 jsou popsány ve WO 00/76540.
····
Proteiny použitelné v předkládaném vynálezu jsou výhodně vybrány ze skupiny zahrnující PhtD a PhtA, nebo kombinace těchto proteinů.
Výhodné kombinace jednoho nebo více pneumokokových proteinů podle předkládaného vynálezu s jinými pneumokokovými proteiny
Ve vakcíně podle předkládaného vynálezu může být každý z výše uvedených proteinů podle předkládaného vynálezu (výhodně buď PhtD nebo PhtA nebo oba) kombinován s jedním nebo více pneumokokovými proteiny z následujícího seznamu: pneumolysin (též označovaný jako Pyl; výhodně detoxifikovaný chemickým zpracováním nebo mutací) (WO 96/05859, WO 90/06951, WO 99/03884); PsaA a varianty s transmembránovou delecí (Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec;64(12):5255-62. PspA a varianty s transmembránovou delecí (US 5804193, WO 92/14488 a WO 99/53940), PspC a varianty s transmembránovou delecí (WO 97/09994, WO 99/53940), proteiny rodiny vazebných proteinů pro cholin (Cbp) (například CbpA a jeho varianty s transmembránovou delecí )WO 97/41151, WO 99/51266), glyceraldehyd-3-fosfát-dehydrogenasa (Infect. Immunol. 1996, 64/3544), Hsp70 (WO 96/40928), PcpA (Sanchez-Beato et al.,
FEMS Microbiol. Lett. 1998, 164: 207-14), M-like protein (SB patentová přihláška č. EP 0837130) a adhesin 18627 (SB patentová přihláška č. EP 0834568). Předkládaný vynález také zahrnuje imunologicky funkční ekvivalenty nebo zkrácené formy těchto proteinů (jak byly definovány výše).
Členové rodiny vazebných proteinů pro cholin byly původně identifikovány jako pneumokokové proteiny, které mohou být přečištěny cholinovou-afinintní chromatografií. Všechny vazebné proteiny pro cholin jsou nekovalentně navázány na fosforylcholinové skupiny kyseliny teichoové buněčné stěny a ·· ·» ·«♦· ·· 4444 • · · · · · · 4 • 4 · · · 4 · 4 * 4 • · · · · · · · 4 4 4· kyseliny lipoteichoové asociované s buněčnou membránou. Strukturálně obsahují několik regionů společných celé rodině, ačkoliv se celkový přesný charakter proteinů může lišit (v aminokyselinové sekvenci, délce atd.). Obecně vazebné proteiny pro cholin obsahují N- terminální region (N), konzervované repetitivní regiony (Rl a/nebo R2), a region bohatý na prolin (F) a konzervovaný vazebný region pro cholin (C) , tvořený mnoha repetitivními úseky, který tvoří přibližně jednu polovinu proteinu. Termín rodina vazebných proteinů pro cholin (Cbp) označuje skupinu zahrnující vazebné proteiny pro cholin, jak jsou definovány ve WO 97/41151, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD a CbpG. CbpA je popsán v WO97/41151. CbpD a CbpG jsou popsány ve WO 00/29434. PspC je popsán v WO 97/09994.
PbcA je popsán ve WO 98/21337. Výhodně jsou vazebné proteiny pro cholin vybrané ze skupiny zahrnující CbpA, PbcA, SpsA a PspC.
Když je použit Cbp protein, tak může být použita Cbp zkrácená forma, kde Cbp je definován výše a zkrácená forma označuje Cbp protein, kterému chybí 50% nebo více vazebného regionu pro cholin (C). Výhodně takovým proteinům chybí celý vazebný region pro cholin. Výhodněji u takových zkrácených forem chybí (i) vazebný region pro cholin a (ii) a část Nkoncové poloviny proteinu, za zachování alespoň jednoho, repetitivního regionu (Rl nebo R2). Ještě výhodněji obsahuje zkrácená forma 2 repetitivní regiony (Rl a R2). Příklady takových výhodných provedení jsou NRlxR2 a RlxR2, jak jsou popsány ve WO 99/51266 nebo WO 99/51188, ale i další vazebné proteiny pro cholin bez podobného vazebného regionu spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.
Chimérické proteiny (nebo fúze) Cbp zkrácená forma-Lyt zkrácená forma mohou být také použity ve vakcíně podle • tt ·· ··*· ·· ···· • · · · · » · ♦ » · « · · * · · · · · ·····«· · · · · • · · · · · · « · · >···· · · · · ♦ ·· předkládaného vynálezu. Výhodně tyto formy obsahují NRlxR2 (nebo RlxR2) Cbp a C-koncovou část (C-term. tj. bez vazebných domén pro cholin) Lyt (např., LytCCterm nebo Sp91Cterm). Výhodněji je Cbp vybraný ze skupiny zahrnující CbpA, PbcA, SpsA a PspC. Ještě výhodněji se jedná o CbpA. Výhodně je LytX LytC (též označovaný jako Sp91).
Jiným provedením předkládaného vynálezu je PspA nebo PsaA zkrácená forma bez vazebné domény pro cholin (C) a exprimovaná jako fúzní protein s LytX. Výhodně je Lyt proteinem LytC.
Výhodné kombinace pneumokokových proteinů podle předkládaného vynálezu
Výhodně je kombinace proteinů podle předkládaného vynálezu vybrána ze 2 nebo více (3 nebo 4) různých kategorií, jako jsou proteiny mající motiv signální sekvence typu II LXXC (kde X je jakákoliv aminokyselina, např., z rodiny polyhistidinové triády (PhtX)), rodiny proteinů vážících cholin (CbpX), proteinů majících motiv signální sekvence typu I (např.,
SplOl), proteinů majících LPXTG motiv (kde X je jakákoliv aminokyselina, např., Spl28, Spl30), toxinu (např. Ply), atd. Výhodnými příklady v těchto kategoriích (nebo motivech) jsou proteiny uvedené výše nebo jejich imunologicky funkční ekvivalenty.. Toxin + Pht, toxin + Cbp, Pht + Cbp a toxin + Pht + Cbp jsou výhodnými kombinacemi.
Mezi výhodné kombinace patří, například, PhtD + NRlxR2,
PhtD + NRlxR2-Sp91Cterm chimérické nebo fúzní proteiny, PhtD + Ply, PhtD + Spl28, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NRlxR2, PhtA + NRlxR2-Sp91Cterm chimérické nebo fúzní proteiny, PhtA + Ply, PhtA + Spl28, PhtA + PsaA, PhtA + PspA, NRlxR2 + LytC, NRlxR2 + PspA, NRlxR2 + PsaA, NRlxR2 + Spl28, RlxR2 + LytC, · 0 0 · 0 00 0 *0 · · · • · 0 • 0 0 · ·· 00
RlxR2 + PspA, RlxR2 + PsaA, RlxR2 + Spl28, RlxR2 + PhtD, RlxR2 + PhtA. Výhodně je NRlxR2 (nebo RlxR2) z CbpA nebo PspC. Výhodněji je z CbpA.
Zejména výhodná kombinace pneumokokových proteinů obsahuje Ply (nebo jeho zkrácenou formu nebo imunologicky funkční ekvivalent) + PhtD (nebo jeho zkrácenou formu nebo imunologicky funkční ekvivalent) + NRlxR2 (nebo RlxR2).
Výhodně je NRlxR2 (nebo RlxR2) z CbpA nebo PspC. Výhodněji je z CbpA.
Bez vazby na jakoukoliv konkrétní teorii se zjistilo, že přípravek obsahující pneumokokový protein (nebo jakoukoliv kombinaci popsanou výše) podle předkládaného vynálezu může indukovat T-lymfocyty zprostředkovanou imunitní reakci proti pneumokokovému onemocnění - která je zejména žádoucí při obraně před pneumonií - kde tato reakce kooperuje s protilátkovou složkou imunitního systému s cílem inhibovat invazi pneumokoků a stimulovat opsonofagocytosu. Další výhoda související s použitím, proteinového antigenu spočívá v prezentaci dalších antigenů pro proces opsonofagocytosy.
V dalším provedení tedy vynález poskytuje vakcínu proti Streptococcus pneumoniae tvořenou vakcínou obsahující konjugovaný pneumokokový polysacharid, který je tvořen polysacharidovými antigeny získanými z alespoň čtař serotypů, lépe alespoň sedmi serotypů, nejlépe alespoň jedenácti serotypů, a alespoň jeden, ale lépe 2, 3 nebo 4 proteiny Streptococcus pneumoniae vybrané ze skupiny zahrnující: PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl30 a Spl33 (nebo kombinace pneumokokových proteinů popsané výše). Výhodně' je jedním proteinem PhtA (nebo jeho φ ΦΦ ·« φφφφ ΦΦ «ΦΦΦ φφφφ ΦΦ φ ΦΦ ·
ΦΦΦ ΦΦΦ φφφφ φφφφφ ΦΦ · φ · ·· imunologicky funkční ekvivalent). Nejlépe je jedním proteinem PhtD (nebo jeho imunologicky funkční ekvivalent).
Jak bylo uvedeno výše, problém spojený s polysacharidovým přístupem k vakčinaci spočívá v tom, že polysacharidy sami o sobě jsou slabými imunogeny. Pro překonání tohoto problému mohou být polysacharidy konjugovány na proteinové nosiče, které jsou pomocnými stimulanty T-lymfocytů. Proto je výhodné, aby byly polysacharidy použité v předkládaném vynálezu navázané na takové proteinové nosiče. Příklady takových nosičů, které jsou v současnosti běžně používané pro produkci polysacharidových imunogenů jsou difterický a tetanický toxoid (DT, DT CRM197, jiné DT mutanty a TT, v příslušném pořadí), přílipkový haemokyanin (KLH), OMPC z N. meningitidis, a přečištěný proteinový derivát Tuberculinu (PPD).
Výhodným nosičem pro imunogenní prostředky na bázi pneumokokových polysacharidů (nebo pro vakciny) je protein D z Haemophilus influenzae (EP 594610-B), nebo jeho fragmenty. Fragmenty vhodné pro použití jsou fragmenty obsahující Thelper epitopy. Konkrétně, fragment proteinu D bude výhodně obsahovat N-koncovou 1/3 proteinu. Protein D je překvapivě použitelný jako nosič ve vakcínách, ve kterých jsou konjugovány různé pneumokokové polysacharidové antigeny. Pokud se stejný nosič používá pro každý polysacharid, tak je pravděpodobné, že dojde k epitopové supresi. Překvapivě předkladatelé vynálezu zjistili, že protein D je vhodný pro minimalizaci takové epitopové suprese v kombinovaných vakcínách. Jeden nebo více pneumokokových polysacharidů v kombinaci může být výhodně konjugován na protein D a výhodně jsou všechny antigeny konjugovány v takové kombinované vakcínš na protein D.
Dalším výhodným nosičem pro pneumokokový polysacharid je pneumokokový protein samotný (jak je definován v oddíle pneumokokové proteiny podle předkládaného vynálezu) .
Polysacharid může být navázán na proteinový nosič jakoukoliv známou metodou (například Likhite, U.S. Patent 4372945 a Armor et al., U.S. Patent 4474757). Výhodně je provedena CDAP konjugace (WO 95/08348).
Výhodně je poměr protein:polysacharid (hmotnost:hmotnost) konjugátu 0,3:1 až 1:1, lépe 0,6:1 až 0,8:1 a nejlépe přibližně 0,7:1.
Vakcíny podle -předkládaného vynálezu obsahují výhodně adjuvans. Mezi vhodná adjuvans patří soli hliníku, jako je gelový hydroxid hlinitý (kamenec) nebo fosforečnan hlinitý, ale mohou také obsahovat vápník, hořčík, železo nebo zinek, nebo obsahovat nerozpustnou suspenzi acylovaného tyrosinu, nebo acylovaných sacharidů, kationtově nebo aniontové derivatizovaných polysacharidů, nebo polyfosfazenů.
Je výhodné, aby vybrané adjuvans bylo přednostním induktorem odpovědi TH1 typu, aby se posílila buněčná složka imunitní reakce.
THl adjuvans podle předkládaného vynálezu
Vysoké koncentrace cytokinů Thl-typu upřednostňují indukci buněčné imunitní reakce na daný antigen, zatímco vysoké koncentrace cytokinů Th2-typu vedou přednostně k indukci protilátkové imunitní reakce na antigen.
• ·» «φ φφφφ ·Φ »«·· ·«··»» ··« · φ · · · · φ φ f φ φ « φ φ φ φ « φ · φ « * · Φ ·ΦΦΦ
Ιο φφφ φφ φφ · ·· ··
Je důležité si uvědomit, že odlišení imunitní reakce Thl a Th2 typu není absolutní. Ve skutečnosti se u jedinců bude rozvíjet imunitní reakce, která je převažujícím způsobem typu Thl nebo Th2. Nicméně, často je výhodné rozdělovat rodiny cytokinu tak, jak je popsáno na myších CD4 +ve T lymfocytárních klonech v Mosmann a Coffman (Mosmann, T.R. a Coffinan, R.L. (1989) Thl and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties.
Annual Review of Immunology, 7, p 145-173). Tradičně jsou reakce Thl-typu asociované s produkcí INF-γ a IL-2 cytokinu Tlymfocyty. Další cytokiny často přímo asociované s indukcí imunitní reakce Thl-typu nejsou produkovány T-lymfocyty, jako je IL-12. Naopak, reakce Th2-typu jsou asociované se sekrecí IL-4, IL-5, IL-6, IL-10. Vhodné adjuvantní systémy, které podporují hlavně reakce Thl typu, jsou: Monofosforyl lipid A nebo a jeho deriváty, zejména 3-de-0-acylovaný monofosforyl lipid A (3D-MPL) .(pro jeho přípravu viz GB 2220211 A); kombinace monofosforyl-lipidu A, výhodně 3-de-O-acylovaného monofosforyl-lipidu A, a soli hliníku (například fosforečnanu hlinitého nebo hydroxidu hlinitého) nebo emulze olej ve vodě.
V takových kombinacích jsou antigen a 3D-MPL obsaženy ve stejné struktuře, což umožňuje účinné dodání antigenních a imunostimulačních signálů. Studie prokázaly, že 3D-MPL je schopen dále zesilovat imunogenicitu antigenu adsorbovaného na kamenec [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454Bl] .
Posílený systém je například kombinace monofosforyl lipidu A a saponinového derivátu, zejména kombinace QS21 a 3D-MPL, jak je popsána ve WO 94/00153, nebo méně reaktogenní prostředek, kde je QS21 utlumen cholesterolem a který je popsán ve WO 96/33739.
«9 9**9
Φ » ♦ * · 9 * 9 • 9 9 9 · * 9 · «9 · 9 9 99«
9 9 9 · 9 9»< * • · 999 · 9 9 · • 99 999 9« ··
Zejména účinný adjuvantní prostředek obsahující QS21, 3DMPL a tokoferol v emulzi olej ve vodě je popsán ve WO 95/17210, a tento prostředek je výhodným prostředkem.
Výhodně vakcína dále’obsahuje saponin, výhodněji QS21. Prostředek může dále obsahovat emulsi olej ve vodě a tokoferol (WO 95/17210).
Předkládaný vynález také poskytuje způsob pro přípravu vakcinačního prostředku, který zahrnuje smísení proteinu podle předkládaného vynálezu s farmaceuticky přijatelnou přísadou, jako je 3D-MPL.
Nemethylované CpG obsahující oligonukleotidy (WO 96/02555) jsou také přednostními induktory TH1 reakce a jsou použitelné v předkládaném vynálezu.
Zejména výhodný prostředek podle předkládaného vynálezu obsahuje jeden nebo více konjugovaných pneumokokových polysacharidů, jeden nebo více pneumokokových proteinů podle předkládaného vynálezu a Thl adjuvans. Bez vazby na jakoukoliv teorii může být indukce buněčné reakce pneumokokovým proteinem (jak je popsán výše) a kooperace mezi oběma složkami imunitního systému dosaženo při použití takových Thl adjuvans, což vede k zisku vakcíny účinné proti pneumokokovým onemocněním obecně, a zejména proti pneumokokové pneumonii u starých jedinců.
V dalším aspektu vynález poskytuje imunogen nebo vakcínu, jak je zde popsána, pro použití v medicíně.
Jedním provedením předkládaného vynálezu je způsob pro prevenci nebo zmírnění pneumonie u starých jedinců (+55 let),
4444 • 4 MM ** • · 4 4
4 4 4 4 • · · 4 4 4
4 4 4« ·> 44 4 • 4 4
4 4 »
4 4 4
44 při kterém je podáno uvedenému starému pacientovi bezpečné a účinné množství vakcíny obsahující polysacharidový antigen Streptococcus pneumoniae a pneumokokový protein vybraný ze skupiny zahrnující: PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl30 a Spl33,.a volitelně Thl adj uvans.
Jiným provedením předkládaného vynálezu je způsob pro prevenci nebo zmírnění pneumonie u otitis media u kojenců (do 18 měsíců) nebo batolat (obvykle 18 měsíců až 5 let), při kterém je podáno uvedenému kojenci nebo batoleti bezpečné a účinné množství vakcíny obsahující polysacharidový antigen Streptococcus pneumoniae a pneumokokový protein vybraný ze skupiny zahrnující: PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl30 a Spl33, a volitelně Thl adjuvans.
Výhodně je ve způsobech podle předkládaného vynálezu popsaných výše polysacharidový antigen přítomen jako konjugát polysacharidu a proteinu.
Příprava vakcín podle předkládaného vynálezu
Vakcinační prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro chránění nebo léčbu savců (výhodně lidí) vnímavých k infekci, pomocí podání uvedené vakcíny systémovým nebo slizničním způsobem. Toto podání může být formou intramuskulární, intraperitoneální, intradermální nebo podkožní; nebo prostřednictvím sliznice, jak je tomu. u orálního/alimentárního podání a podání do respiračního, genitourinárního traktu. Intranasální podání vakcín pro léčbu pneumonie nebo otitis media je výhodné . (protože může být zabráněno nasofaryngeálnímu přenášení pneumokoků, což zmírní •
·· · · • · · • · · • · · ··· ·· ·· ···· • · · • · · « · · · • · · · ·· ·· infekci v jejím nejčasnějším stadiu). Ačkoliv může být vakcína podle předkládaného vynálezu podána v jedné dávce, mohou být její složky podány také současně nebo v různou dobu (například, pokud je ve vakcíně obsažen polysacharid, může být podán samostatně ve stejnou dobu nebo 1-2 týdny po podání kombinace bakteriálních proteinů, za účelem optimální koordinace imunitní reakce. Kromě jediného způsobu podání mohou být použity.dva různé způsoby podání. Například, virové antigeny mohou být podány ID (intradermálně), zatímco bakteriální proteiny mohou být podány IM (intramuskulárnš) nebo IN (intranasálně)..Pokud jsou přítomné polysacharidy, tak mohou být podávány IM (nebo ID) a bakteriální proteiny mohou být podávány IN (nebo ID). Dále, vakcíny podle předkládaného vynálezu mohou být podány IM pro první dávku a IN pro dosycovací dávky.
Množství konjugovaného antigenu v každé dávce vakcíny je vybráno jako množství, které indukuje imunoprotektivní reakci bez významnějších nežádoucích účinků typických u vakcín.
Takové množství se velmi liší podle toho, jaký imunogen je použit a jak je prezentován. Každá dávka bude obecně obsahovat 0,1-100 μρ polysacharidů, výhodně 0,1-50 μρ, výhodněji 0,1-10 μρ, kdy 1 až 5 μρ je výhodná dávka.
Obsah proteinových antigenů ve vakcíně je obvykle v rozmezí 1-100 μρ, výhodně 5-50 μρ a nejlépe 5-25 μρ.
Optimální množství složek pro každou konkrétní vakcínu může být zjištěno za použití standardních studií využívajících pozorování vhodných imunitních reakcí u jedinců. Po iniciální vakcinaci může být jedinci podána jedna nebo více dosycovacích imunizací, které jsou podány v adekvátním dobu.
Příprava vakcín je obecně popsána ve Vaccine Design (The subunit and adjuvans approach (ed. Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenům Press New York). Enkapsulace v liposomech je popsána ve Fullerton, US Patent 4235877.
Ačkoliv mohou být vakcíny podle předkládaného vynálezu podány jakýmkoliv způsobem, je podání popsaných vakcín do kůže (ID) jedním z provedení předkládaného vynálezu. Lidská kůže je tvořena vnější rohovitou pokožkou, která se nazývá stratům corneum, pod kterou leží epidermis. Pod epidermis je vrstva označovaná jako dermis a pod touto vrstvou je podkožní tkáň. Výzkumníci prokázali, že injekce vakcíny do kůže, konkrétně do dermis, stimuluje imunitní reakci, která může být také asociována s mnoha dalšími výhodami. Intradermální vakcinace vakcínami podle předkládaného vynálezu tvoří výhodný rys předkládaného vynálezu.
Běžná technika intradermální vakcinace, mantoux technika, obsahuje kroky desinfekce kůže, a potom napnutí kůže jednou rukou zavedení tenké jehly (26-31 gauge) v úhlu 10-15°. Jakmile se hrana jehly zavede, tak se tělo jehly sníží a posunuje se dále, což se projeví zvedáním kůže při mírném tlaku, Potom se velmi pomalu injikuje kapalina, která vytvoří puchýř na kůži a potom se jehla vyjme.
Nověji byly popsány prostředky, které jsou specificky určené pro podání kapaliny do nebo skrz kůži, jako jsou například prostředky popsané ve WO 99/34850 a EP 1092444, a také tryskové injekční prostředky popsané například ve WO
01/13977; US 5480381, US 5599302, US 5334144, US 5993412 , US
5649912, US 5569189, US 5704911, US 5383851, US 5893397, US
5466220, US 5339163, US 5312335, US 5503627, US 5064413, US
5520639, US 4596556, US 4790824, US 4941880, US 4940460, WO
97/37705 a WO 97/13537. Mezi alternativní metody intradermálního podání vakcíny patří použití běžných injekčních stříkaček a jehel, nebo použití zařízení pro balistické podání solidních vakcín (WO 99127961), nebo použití transdermálních.náplastí (WO 97/48440; WO 98/28037); nebo aplikace na povrch kůže (transdermální nebo transkutánní podání) (WO 98/20734 ; WO 98/28037).
Když jsou vakcíny podle předkládaného vynálezu podávány do kůže, nebo přesněji do dermis, tak jsou vakcíny připraveny v malém objemu kapaliny, konkrétně v objemu mezi přibližně 0,05 ml a 0,2 ml.
Obsah antigenů v kožních nebo intradermálních vakcínách podle předkládaného vynálezu může být podobný jako v běžných intramuskulárních vakcínách. Nicméně, charakteristikou kožních nebo intradermálních vakcín je to, že mohou být tvořeny nízkou dávkou. Proto jsou proteinové antigeny v nízkodávkových vakcínách výhodně přítomny v dávce pouze 0,1 až 10 pg, výhodně 0,1 až 5 pg na dávku; a pokud je přítomen polysacharid konjugovaný s antigenem, tak je polysacharid přítomen v dávce 0,01-1 μρ, výhodně 0,01-0,5 pg polysacharidu na dávku.
Termín intradermální podání, jak je zde použit, označuje podání vakcíny do regionu dermis v kůži. Nicméně, vakcína nemusí být lokalizována'výlučně v dermis. Dermis je vrstva kůže lokalizovaná mezi přibližně 1,0 a přibližně 2,0 mm od povrchu lidské kůže, ale existují určité variace mezi jedinci a různými částmi těla. Obecně se předpokládá, že bude dosaženo dermis, pokud se pronikne 1,5 mm pod povrch kůže. Dermis je umístěna mezi stratům corneum a epidermis na povrchu a podkožní vrstvou směrem dolů. Podle způsobu podání může být • · · ·
vakcína nakonec lokalizována primárně nebo pouze v dermis, nebo může být nakonec umístěna v epidermis a dermis.
Předkládaný vynález také zahrnuje kombinované vakcíny, které poskytují ochranu před různými patogeny. Mnoho pediatrických vakcín se v současnosti podává ve formě kombinovaných vakcín, aby se redukoval počet injekcí, které dítě musí dostat. Tak mohou být pediatrické vakcíny obsahující antigeny z jiných patogenů formulovány s vakcínami podle předkládaného vynálezu. Například mohou být vakcíny podle předkládaného vynálezu formulovány s (nebo podávány samostatně, ale ve stejnou dobu) dobře známou 'trivaíentni' kombinovanou vakcínou obsahující Diphtherický toxoid (DT), tetanický toxoid (TT), pertussovou složku'[typicky detoxifikovsný Pertssícký toxoid (Pl) a filamentosní haemagglutinin (FHA) volitelně s pertactinem (PRN) a/nebo agglutininem 1+2], například s prodávanou vakcínou INFANRIXDTPa™ (SmithKline Beecham Biologicals), která obsahuje DT, TT, PT, FHA a PRN antigeny, nebo s pertusovou složkou tvořenou celými buňkami, jako je například vakcína prodávaná SmithKline Beecham Biologicals s.a. jako Tritanrix™. Kombinovaná vakcína může také obsahovat další antigen, jako je povrchový antigen viru hepatitidy B (HBsAg), antigeny Polio viru (například inaktivovaný trivaíentni polio virus — IPV), proteiny vnější membrány Moraxella catarrhalis, non-typické.proteiny' Haemophilus influenzae, proteiny vnější membrány N. meningitidis B.
Příklady výhodných proteinových antigenu Moraxella catarrhalis, které mohou být obsaženy v kombinované vakcíně (zejména pro prevenci otitis media) jsou: OMP106 [WO 97/41731 (Antex) & WO 96/34960 (PMC)]; OMP21; LbpA a/nebo
• ·
LbpB [WO 98/55606 (PMC)]; ThpA a/nebo ThpB [WO 97/13785 & WO ' 97/32980 (PMC)]; CopB Welminen ME, et al. (1993) Inféct.
Immun. 61:2003-2010]; UspAl a/nebo UspA2 [WO 93/03761 (University of Texas)]; OmpCD; HasR (PCT/EP99/03824); PilQ (PCT/EP99/03823); OMP85 (PCT/EP00/01468); lipo06 (GB 9917977.2); LipolO (GB 9918208.1); lipoll (GB 9918302.2); lipol8 (GB 9918038.2); P6 (PCT/EP99/03038); D15 (PCT/EP99/ 03822); OmplAl (PCT/EP99/06781); Hly3 (PCT/EP99/03257); a OmpE. Příklady netypických antigenů Haemophilus inftuenzae, které mohou být obsaženy v kombinované vakcíně (zejména pro prevenci otitis media) jsou: Fimbrinový protein [(US 5766608
Ohio State Research Foundation)] a fúze obsahující peptidy odvozené od tohoto proteinu (např. LBl(f) fúzní peptidy; US 5843464 (OSU) nebo WO 99/64067]; OMP26 [WO
97/0Γ638 (Cortecs)]; P6 [HP 281673 (State University'of New York)]; TbpA a/nebo ThpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmwl; Hmw2 ; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12641); protein D (EP 594610); P2; a P5 (WO 94/26304).
Dalšími zahrnutými kombinacemi jsou proteiny S. pneumoniae podle předkládaného vynálezu v kombinaci s virovými antigeny, například od chřipkového viru (atenuované, rozdělené nebo podjednotkové [např. povrchové glykoproteiny neuraminidasa (NA) a haemaglutinin (HA). Viz např., Chaloupka I. et al, Eur. Journal Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1996, 15: 121-127], RSV (např. F a G antigeny nebo F/G fúze, viz např. Schmidt A. C. et al, J Virol, May 2001, p 4594 - 4603), PIV3 (např. HN a F proteiny, viz Schmidt et al. , výše), Varicella (např·., atenuované, glykoproteiny I-V, atd.), a jakékoliv (nebo všechny) složky MMR (spalničky, zarděnky,.příušnice).
Výhodná pediatrická kombinovaná vakcína podle předkládaného vynálezu pro léčbu nebo·prevenci otitis media obsahuje: jeden • ·· ·« ···· · · ···· • · · · · · · · · ·
nebo více polysacharidových antigenů Streptococcus pneumoniae (výhodně konjugovaných na protein D) a jeden nebo více pneumokokových proteinů vybraných ze skupiny zahrnující: PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl30· a Spl33 (a jejich funkční ekvivalenty), a jeden nebo více povrchových antigenů od Moraxella catarrhalis a/nebo netypizovaného Haemophilus influenzae. Protein D může být výhodně použit jako proteinový nosič pro pneumokokové polysacharidy pro překonání potíží se supresí epitopů (jak byly popsány výše) a proto, že je sám imunogenem schopným produkovat B-lymfocyty zprostředkovanou ochranu proti netypizovatelnému H. influenzae (ntHi). Antigeny Moraxella catarrhalis a netypizovaného Haemophilus influenzae mohou být obsaženy ve vakcíně v podjednotkové formě, nebo mohou být přidány jako antigeny přítomné na povrchu vnější membrány vesikul vyrobených z bakterií.
Výhodně jsou antigenní prostředky (a vakcíny), které obsahují polysacharidy popsané výše, lyofilizovány do doby použití, kdy jsou rekonstituovány za použití ředidla.
Výhodněji jsou lyofilizovány za přítomnosti 3D-MPL a jsou rekonstituovány za použití salinického roztoku. Alternativně mohou být protein a polysacharid skladovány samostatně ve vakcinačním kitu (kde jsou jedna nebo obě složky lyofilizovány) a tyto složky jsou rekonstituovány a smíseny před použitím, nebo jsou podány pacientovi samostatně. Thi adjuvans (výhodně 3D-MPL) může být přítomno v obou složkách.
Lyofilizace vakcín je dobře známá v oboru. Obvykle se kapalná vakcína suší vymrážením za přítomnosti činidla zabraňujících tvorbě sraženin, jak je například sacharid, např. sacharosa nebo laktosa (která je přítomná v počáteční koncentraci 10-200 mg/ml). Lyofilizace má obvykle několik • · · ♦ · · · · · · ···· • · · · · · · · · ······· ··· · • · · ··· · · · · ····· ·· · ·· ·· kroků, například začíná cyklus pří —69 °C, postupně se teplota upraví na —24 °C během 3 hodin, potom se tato teplota udržuje po dobu 18 hodin, potom se postupně upraví na —16 °C během 1 hodin, potom se tato teplota udržuje po dobu 6 hodin, potom se během 3 hodin upraví na +34 °C a nakonec se tato teplota udržuje po dobu 9 hodin.
Lyofilizace přípravku vede k zisku stabilnějšího přípravku (například je bráněno rozkladu polysacharidových antigenů. Tento proces je také překvapivě odpovědný za vyšší titry protilátek proti pneumokokovým polysacharidům. Toto bylo zjištěno zejména pro PS 6B konjugáty. Dalším aspektem vynálezu je tedy lyofilizovaný antigenní prostředek obsahující PS 6B konjugát a 3D-MPL adjuvans (výhodně bez adjuvans na bázi hliníku) a pneumokokový protein vybraný ze skupiny zahrnující: PhtA, PhtB, PhtD,’ PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl30 a Spl33.
Příklady provedení vynálezu
Tyto příklady ilustrují, ale nijak neomezují předkládaný vynález.
Příklad 1. Kapsulární polysacharid Streptococcus pneumoniae
11-valentní testovaná vakcina obsahovala kapsulární polysacharidy serotypů 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F a 23F, které byly připraveny způsobem popsaným v EP 72513. Každý polysacharid byl 'aktivován a derivatizován za použití CDAP chemických činidel (WO 95/08348) a byl konjugován na proteinový nosič. Všechny polysacharidy byly konjugovány v jejich nativní formě, s výjimkou serotypů 3 (který byl zmenšen za účelem snížení viskozity).
Proteinový nosič:
Vybraným proteinovým nosičem je rekombinantní protein D (PD) z netypizovatelného H.influenzae, který byl exprimovaný v E. coli.
Exprese proteinu D
Protein D Haemophilus influenzae
Genetické konstrukty pro expresi proteinu D
Výchozí materiály
DNA kódující protein D
Protein D je vysoce konzervovaný mezi H. influenzae všech serotypů a netypizovatelnými kmeny. Vektor pHIC348 obsahující DNA sekvenci kódující celý gen pro protein D byl získán od Dr. A. Forsgrena, Department of Medical Microbiology, University of Lund, Malmo General Hospital, Malmo, Sweden. DNA sekvence proteinu D byla publikována v Janson et al. (1991), Infect. Immunol. 59: 119-125.
Expresní vektor pMGl
Expresní vektor pMGl je derivátem pBR322 (Gross et al., 1985), do kterého byly zavedeny kontrolní elementy pro transkripci a translaci cizorodých insertovaných genů z bakteriofágu lambda (Shatzman et al., 1983). Kromě toho byl gen pro resistenci na ampicilin zaměněn za gen pro resistenci na kanamycin.
Kmen AR58 E. coli
Kmen AR58 E. coli byl připraven transdůkcí N99 Pl fágem předem kultivovaným na SA500 derivátu (galE::TN10, lambdaKil cI857 ΔΗ1). N99 a SA500 jsou kmeny K12 E. coli získané z laboratoře Dr. Martina Rosenberga v National Institute of Health.
Exprese vektoru pMGl
Pro produkci proteinu D se DNA kódující protein klonovala do expresního vektoru pMGl. Tento plasmid využívá signály z DNA fágu lambda pro řízení transkripce a translace insertovaných cizých genů. Vektor obsahuje promotor PL, operátor OL a dvě užitná místa (NutL a NutR) pro odstranění efektů transkripční polarity, když je poskytnut N protein (Gross et al., 1985). Vektory obsahující PL promotor se vložily do E. coli lysogenní hostitelské buňky pro stabilizování plasmidové DNA. Lysogenní hostitelské kmeny obsahují replikace-defektní DNA fágu lambda integrovanou do genomu (Shatzman.et al., 1983). Chromosomální DNA fágu lambda řídí syntézu cl represorového proteinu, který se váže na OL represor vektoru a brání vazbě RNA polymerasy na PL promotor a tak transkripci insertovaného genu. cl gen expresního kmene AR58 obsahuje teplotně-sensitivní mutant, takže transkripce řízená PL může být regulována teplotním posunem, tj. zvýšení kultivační teploty inaktivuje represor a je iniciována syntéza cizího proteinu. Tento systém umožňuje řízenou syntézu cizích proteinů, zejména těch, které mohou být toxické pro buňky (Shimataka and Rosenberg, 1981).
• ·· ·♦ 0000 00 ···· • · · · · · 0 · 0 0 • 0 · · · 0 0··· 000 00 00 0 00 00
AR58 lysogenní kmen E. coli použitý pro produkci proteinu D jako -nosiče je derivátem standardního NIH E.coli K12- kmenu N99 (F”su“galK2, lacZ“thr) . Obsahuje defektní lysogenní fág lambda (galE::TN10, lambdaKil“cl857 ΔΗ1). Kil“ fenotyp brání vypnutí syntézy makromolekul u hostitele. CI857 mutace způsobuje teplotně-sensitivní lézi v cl represoru. ΔΗ1 delece odstraňuje pravý operon fágu lambda a lokusy bio, uvr3 a chlA hostitele. Kmen AR58 byl připraven transdukcí N99 PÍ fágem předem kultivovaným na SA500 derivátu (galE::TN10, lambdaKilcI857 ΔΗ1). Vložení defektního lysogenu do N99 se selektuje pomocí tetracyklinu díky přítomnosti TN10 transposonu kódujícího resistenci na tetracyklin v sousedství galE genu.
Konstrukce vektoru pMGMDPPrD
Vektor pMG 1, který obsahuje gen kódující nestrukturální protein SI viru chřipky (pMGNSI) se použil pro konstrukci pMGMDPPrD. Gen proteinu D se amplifikoval PCR z vektoru pHIC348 (Janson et al., 1991) s PCR primery obsahujícími Ncol a Xbal restrikční místa'na 5' a 3' koncích, v příslušném pořadí. Ncol/Xbal fragment se potom vložil do pMGNSI mezi Ncol a Xbal, za vzniku fúzního proteinu obsahujícího N-koncových 81 aminokyselin proteinu NS1 a potom PD protein. Tento vektor se označil jako pMGNSlPrD.
Podle konstruktu popsaného výše se připravil konečný konstrukt pro expresi proteinu D. BamHI/BamHI fragment se odstranil z pMGNSlPrD. Tato hydrolýza DNA odstranila NS1 kódující region, kromě prvních tří N-koncových zbytků. Po religování vektoru se získal gen kódujícífúzní protein s následující N-terminální aminokyselinovou sekvencí:
—-----MDP SSHSSNMANT—-31
NS1
Protein D
Protein D neobsahoval vedoucí peptid nebo N-terminální cystein, na který se normálně váží lipidové řetězce. Protein není proto ani vylučován do periplasmy, ani lipidován a zůstává v cytoplasmě v solubilní formě.
Konečný konstrukt pMG-MDPPrD se vložil do AR58 hostitelského kmene pomocí teplotního šoku při 37 °C. Bakterie obsahující plasmid se selektovaly za přítomnosti kanamycinu. Přítomnost DNA insertu kódujícího protein D se prokázala trávením izolované plasmidové DNA vybranými endonukleasami. Rekombinantní kmen E. coli se označil jako ECD4 .
Exprese proteinu D byla pod kontrolou lambda PL promotoru/ 0L operátoru. Hostitelský kmen AR58 obsahuje teplotně sensitivní cl gen v genomu, který blokuje expresi z lambda PL při nízké teplotě vazbou na 0L. Když je teplota zvýšena, cl se uvolní z 0L a protein D se exprimuje. Na konci fermentace jsou buňky koncentrovány a zmraženy.
Extrakce ze získaných buněk a přečištění proteinu D se provedlo následujícím způsobem. Zmrazená buněčná peleta se rozmrazila a resuspendovala se v roztoku pro rozrušení buněk (citrátový pufr pH 6,0) na konečné OD65o = 60. Tato suspenze se zpracovala dvakrát ve vysokotlakém homogenizačním zařízení při P = 1000 barů. Homogenizát buněčné kultury se pročistil odstředěním a buněčná drť se odstranila filtrací. V prvním stupni přečištění se přefiltrovaný lyzát aplikoval do kationtové iontoměničové chromatografické kolony (SP Sepharose Fast Flow). PD se váže na gelovou matrici prostřednictvím iontových interakcí a eluuje se postupným zvyšováním iontové . síly elučního pufru.
Ve druhém stupni přečištění se nečistoty zachycují na aniontoměničové matrici (Q Sepharose Fast Flow). PD se neváže na gel a může být odebírán z výtokové frakce.
V obou stupních chromatografíe na koloně se odběr frakcí sleduje pomocí OD. Výplach z aniontoměničové chromatografické kolony obsahující přečištěný protein D se zahustí ultrafiltrací.
Ultrafiltrát obsahující protein D se nakonec nechá projít membránou vel. 0,2 μιη.
Chemická činidla
Aktivační a kondenzační chemická činidla
Aktivační a kondenzační podmínky jsou specifické pro každý polysacharid. Tyto podmínky jsou uvedeny v tabulce 1. Nativní polysacharid (s výjimkou PS3) se rozpustil v NaCl 2M nebo ve vodě pro injekce. Optimální koncentrace polysacharidů se hodnotila pro všechny serotypy.
Ze zásobního roztoku o koncentraci 100 mg/ml v acetonitrilu se CDAP (CDAP/PS poměr 0,75 mg/mg PS) přidal k roztoku polysacharidů. O 1,5 minuty později se přidal 0,2 M triethylamin, pro specifické aktivační pH. Aktivace polysacharidů se provedla při tomto pH během 2 minut při 25 °C. Protein D (jehož -množství závisí na počátečním poměru PS/PD) se přidal k aktivovanému polysacharidů a kondenzační reakce se provedla při specifickém pH během 1 hodiny. Reakce se potom utlumila glycinem během 30 minut při 25 °C a přes noc při 4 °C.
•4 4444 ♦ 4 ·· ♦«·· «44* 444 4
4 ♦ 4 444 ·· 444 4444
44 44 4 44 44
Konjugáty se přečistily gelovou filtrací za použití Sephacryl 500 HR gelové filtrační kolony uvedené do rovnováhy 0,2 M NaCl.
Určil se obsah karbohydrátu a proteinu v eluovaných frakcích. Konjugáty se kombinovaly a sterilně se přefiltrovaly na 0,22 μπι sterilizační membráně. Určily se poměry PS/protein v konjugovaných přípravcích.
Charakterizace
Každý konjugát se charakterizoval a splňoval specifikace popsané v tabulce 2. Obsah polysacharidu ^g/ml) se měřil Resorcinolovým testem a obsah proteinu (gg/ml) se měřil Lowryho testem. Konečný poměr PS/PD (hmot./hmot.) se určil podle poměru koncentrací.
Residuální obsah DMAP (ng/μρ PS):
Aktivace polysacharidu CDAP vkládá kyanatanovou skupinu do polysacharidu a uvolňuje DMAP (4-dimethylamino-pyridin). Zbytkový obsah DMAP se určil specifickým testem vyvíjeným v SB.
Obsah volného polysacharidu (%):
Obsah volného polysacharidu v konjugátu při 4 °C nebo skladovaném po dobu 7 dnů při 37 °C se určil na supernatantu získaném po inkubaci s α-PD protilátkami a nasyceným síranem amonným, po které se provedlo odstředění.
α-PS/ct-PS ELISA se použila pro kvantifikaci volného polysacharidu v supernatantu. Nepřítomnost konjugátu se také ·· ····
kontrolovala α-PS/ct-PS ELISA. Redukce množství volného polysacharidu vedla k zisku lepší konjugované vakcíny.
Antigenicita
Antigenicita stejných konjugátů se analyzovala v sandwichovém ELISA, ve kterém zachycovací protilátkou byla α-PS a detekční protilátkou byla a-PD.
Obsah volného proteinu (%):
Koncentrace volného zbytkového proteinu D se určila za použití metody se zpracováním vzorku pomocí SDS. Konjugát se zahříval po dobu 10 minut při 100 °C za přítomnosti SDS 0,1% a injikoval se do SEC-HPLC gelové filtrační kolony (TSK 3000 PWXL). Protože je protein D dimer, existuje riziko nadhodnocení koncentrace volného proteinu D v důsledku disociace struktury působením SDS.
Molekulová velikost (Kav):
Molekulová velikost se určila na SEC-HPLC gelové filtrační koloně (TSK 3000 - PWXL).
Stabilita:
Stabilita se měřila na HPLC gelové filtrační koloně (TSK 3000 - PWXL). Pro konjugáty přechovávané při 4 °C a skladované po dobu 7 dnů při 37 °C.
Charakterizace 11-valentního přípravku je uvedena v tabulce
2.
• a· a* ···· ·· ·#·· • · · · · · ♦ · · · • · · · · · ···♦ ··· ·« ·· « ·· ♦·
Proteinové konjugáty mohou být adsorbovány na fosforečnan hlinitý a mohou být uskladněny za vzniku konečné vakcíny.
Závěr:
Byly připraveny imunogenní konjugáty, které jsou složkami slibné vakcíny. Optimalizované CDAP podmínky pro nej lepší kvalitu konečného konjugovaného pneumokokového polysacharidu byly zjištěny pro každou z 11 valencí.
Tabulka 1: Specifické aktivační/kondenzační/utlumovací podmínky pro konjugáty PS Streptococcus pneumoniae-protein D
Serotyp 1 3 (pfluid) 4 5 6B 7F
Konc. PS (mg/ml) 2,0 3,0 2,0 7,5 5,4 3,0
Rozpouštění PS NaCl 2M NaCl 2M h2o h2o NaCl 2M NaCl 2M
Koncentrace PD (mg/ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Iniciální poměr PS/PD (hmot./hmot.) 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1
Koncentrace CDAP (mg/mg PS) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
PHa=pHc=pHq 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0
• ·· toto ···· ·· ·*·* ··«··· to·· «
Šero typ 9V 14 18C 19F 23F
Konc. PS (mg/ml) 2,5 2,5 2,0 4,0 3,3
Rozpouštění PS NaCl 2M NaCl 2M h2o NaCl 2M NaCl 2M
Koncentrace PD (mg/ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Iniciální poměr PS/PD (hmot./hmot.) 1/0,75 1/0,75 1/1 1/0,5 1/1
Koncentrace CDAP (mg/mg PS) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
PHa-pHc=pHq 8,5/8,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 10/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0
* ·· «» *·*« «V ·«·· • · · · * r · ·· l ····« · · ·· * · ·»· ·*· ···· ·· · *« ·· « «· ►·
Tabulka 2: Specifikace 11-valentní pneumokokové PS-PD vakcíny (první čísla kódu šarže
Oc +J
O
ÍM
0) ω
os o CM >—a
Q
Ph
SO
Q m
CM t““2
Q
Pí
ΙΖΊ
Q
CM
CM >—> Q
Ph rf
Q so
CO
CM >“5
Q
PH co o
O
CM CM >—> O CH o Q §
ρ CZ5
Ο\ ο
SO, CC Ρμ
© rn Ν <υ
ι—1 Ο Ο\ θ’ ο 43
SO
OO
Crt
O
Ph
Os CM
CM, rso ©
so
SO
Η ΓΊ 'protei
03 <Ζ3
Ρ! § ΡΗ
(D
£ S-H (0 ><υ
(0 C 4—> Ή S Ο
Ν Μ CH
OS
CM •'fr
O ©
CZ)
O
PH
N
D
SO ©” co co
I
CZ)
O
PH
N ω
CM >— © θ'
I
CZ)
O ph
N ω
J=1
CM
1—H
CM >—> Q CH co CM
Q so o CM ►—5
Q
PH
OS
1—H
Q
CM
CM >—i
Q
CH
I
Q
CM
O
CM
I—Ϊ
Q
CH r—1
O
CM
CM
CM ►““3
Q fH
Os o
Q in
CM
CM 1—j
Q
PH t>
O
Q
Ο ΓΊ 0 ΡΗ
Ο CM Os, r*—t Ν Ο
τ—ι C3 ο © 42
UO
Tf
CM © ’Ί 'Ί < o o
C o
CZ)
O
PH
CM
SO s© ©
O _ CM^ CM θ'
I
CZ)
O
PH
N <U co co ©
t §
O
PH
N (U
-O cg θ' so, θ' §
CZ)
O
PH
N
O r© i/g o
oo
Ήτ—Μ τ—I © Ο cz)
Ο
ΡΗ
Ν
Ο
cd
CZ)
O o
>
'Ctí >
J2 ”3
JD
O cc3
-§
©χ CZ3- CH 0β Sb
Ρ3
r—( V 1/2
Μζ © V
οχ w CH
3 53
‘53 +-» 0β
2t
ο ί-ι ob
ΡΗ 'tí,
Ο 43 ΡΗ
Ο >
Í3 <ΖΙ ο
Q
Μ ο
CZ)
Ο
I—<
ο >
>
<υ
ČZ5 (73
ΦΦ ·Μ«
ΦΦ ··»· • ΦΦ • φφφ · * Φ Φ · Φ
ΦΦΦ Φ » · «·· • ΦΦΦΦΦΦ φ Φ Φ · ~ο ΦΦΦΦΦΦ ΦΦΦΦ
Příklad 2: Příznivý dopad přidání jednoho nebo více pneumokokových proteinů podle předkládaného vynálezu +/- 3DMPL na protektivní účinnost PD-konjugované 11-valentní polysacharidové vakciny proti pneumokokové kolonizaci plic u myší
Imunologické odečty
ELISA stanovení sérových IgG specifických pro pneumokokový protein
Maxisorp Nunc imunoplotny se potáhly během 2 hodin při 37 °C 100 pg/jamku 2pg/ml proteinem naředěným v PBS. Plotny se promyly 3-krát NaCl 0,9% Tween-20 0,05% pufrem. Potom se přidala sériová 2-násobná ředění (v PBS/Tween 20, 0,05%, 100 μΐ na jamku) anti-proteinového referenčního séra jako standard (od 670 ng/ml IgG) a vzorky séra (od ředění 1/10) se inkubovaly po dobu 30 minut pří 20 °C za třepání. Po promytí, jak bylo popsáno výše, se kozí protilátka proti myšímu IgG konjugovaná s peroxidasou (Jackson) naředěná 5000x v PBS/Tween 20 0,05% inkubovala (100 pg/jamku) po dobu 20 °C za třepání. Po promytí se plotny inkubovaly po dobu 15 minut při teplotě místnosti se 100 -μΐ/jarnku detekčního pufru (OPDA 0,4 mg/ml a H20 0,05% v 100 mM citrátového pufru, pH 4,5). Detekce se ukončila přidáním IN HC1 v dávce 50 pg/jamku. Optické density se odečítaly při 490 a 620 nm za použití Emax čtečky ploten (Molecular Devices). Titr protilátky se vypočetl pomocí 4 parametrické matematické metody za použití SoftmaxPro softwaru.
Test opsonofagocytosy • ·· ·· ···· »· ···· ···.·· · » ♦> · ······ ··· ······· ♦ · · · ··· ··· «··· ··· ·« «· · ·« ··
Cílem tohoto testu je reprodukovatelně měření opsonizační kapacity testovaných vzorků séra proti Streptococcus pneumoniae serotypu 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F nebo 23F, za použití způsobu upraveného z publikované standardizované metody CDC (Steíner et al., Clinícal and Diagnostic Laboratory Immunology 4: 415: 1997).
Tento test napodobuje in vitro podmínky, které jsou in vivo primárním mechanismem eliminujícím invadující Streptococcus pneumoniae nebo pneumokoky. Tímto mechanismem je opsonizace pneumokoků, po které následuje fagocytosa a potom usmrcení mikroorganismů. Fagocytosa je proces, při kterém buňky pohltí materiál a uzavřou ho ve vakuole (fagosomu) v cytoplasmě. Pneumokoky jsou usmrceny tehdy, když jsou fagocytovány zdravými savčími fagocyty. Opsonizace je proces, který usnadňuje fagocytosu deponováním opsoninů, například protilátek a komplementu, na antigen.
V literatuře je popsáno mnoho opsonofagocytárních' testů. Standardizovaná metoda CDC byla testována v mnoha laboratořích (Steíner et al., ICAAC, Sept. 16-20, 2000, Toronto). Tento test byl potom upraven v SB, protože poskytuje základ pro srovnání pro jiné laboratoře, používá činidla a kontroly, která jsou obecně dostupná, a vyjadřuje výsledky jako titr (ředění) séra, které usnadňují zabíjení 50% životaschopných pneumokoků, což je jednotka, která je běžně používaná pro tento typ testu. Kromě toho bylo prokázáno, že tento upravený test může generovat výsledky, které dobře korespondují s 4 dalšími laboratořemi (Steíner et al., ICAAC, Sept. 16-20,
2000, Toronto).
Fagocytující buňkou použitou v tomto testu je buněčná linie HL60, která pochází od jedinců s promyelocytární leukémií a
která byla imortalizována Collinsem et al. V roce 1977 (Nátuře 270: 347-9). Tato buněčná linie se skládá z nediferencovaných hematopoetických buněk, které jsou tvořeny z 85% blasty a promyelocyty, z 6% myelocyty a z 9% diferencovanými buňkami. Polární sloučeniny mohou indukovat diferenciaci buněk do alespoň dvou různých linií. N,N-dimethylformamid indukuje diferenciaci granulocytů, což vede ke vzniku buněk podobných polymorfonukleárním buňkám (44% myelocytů a metamyelocytů a 53% segmentovaných a tyčkových PMN).
Ve verzi 2 tohoto testu se testované sérum inaktivuje teplem a připraví se 2-násobná sériová ředění od k v 96jamkových mikroplotnách v HBSS mediu obsahujícím 0,3% BSA. Konečný objem neředěného séra v každé jamce je 25 μΐ.
Čtyři objemy HL60 buněk v koncentraci 107 buněk/ml (5 nebo 6 dnů po diferenciaci dimethylformamidem), 2 objemy bakterií Streptococcus pneumoniae (ve vhodném ředění) a 1 objem komplementu od králičích mláďat se smísí bezprostředně před použitím, a 25 μΐ směsi se přidají do každé jamky 96-jamkové mikroplotny obsahující naředěné sérum. Pro serotypy 1 a 6B se množství komplementu zvýší na konečnou koncentraci 12,5%, čímž se získá verze 3 testu.
Po dvou hodinách inkubace při 37 °C za třepání se plotna umístí na led pro ukončení opsonofagocytární reakce.
Hodnocení se provede určením jednotek tvořících kolonie (CFU) v každé jamce pomocí inkubace přes noc při 37 °C. Opsonizační titr (OT) se definuje jako převrácená hodnota ředění séra, které je schopné redukovat alespoň o 50% počet bakterií Streptococcus pneumoniae v jamkách (tj. 50 % • · · · • · · · · · · • · · · · · · ······ ··· usmrcování). % usmrcování se vypočte podle následujícího vzorce:
% usmrcování = (průměr CFU v kontrolních jamkách - CFU vzorku)/ průměr CFU v kontrolních jamkách x 100
Pneumokoková intranasální infekce OF1 myší týdnů staré samice OF1 myší se intranasálně infikovaly v anestesii 5105 CFU na myši adaptované Streptococcus pneumoniae serotypů 2, 4 nebo 6B. Plíce se odebraly za 6 hodin po infikování a homogenizovaly se (Ultarmax, 24000 rpm, 4 °C) v Todd Hewith Broth (THB, Gibco) mediu. Sériová 10-násobná ředění plicních homogenizátů se umístila při teplotě 37 °C do Petriho misek obsahujících THB agar doplněný kvasinkovým extraktem. Infekce plic pneumokoky se určila jako počet CFU/myš a vyjádřila se jako logaritmicky vážený průměr.
Detekční limit byl 2,14 log CFU/myš.
Příklad 2A: Efekt 3D-MPL adjuvans na imunitní reakci proti proteinu
V tomto příkladu jsme hodnotily vliv 3D-MPL adjuvans na imunitní reakci proti proteinu podle předkládaného vynálezu.
Skupiny 10 samic Balb/c myší stáří 6 týdnů se intramuskulárně imunizovaly, ve dny 0, 14 a 21, 1 μς proteinu obsaženým v A: A1PO4 100 μς; nebo Β: A1PO4 100 μρ + 5 μς 3D-MPL (3-de-O-acylovaný monofosforyl lipid A, od Ribi Immunochem).
IgG se měřil ELISA po podání třetího séra.
Pro libovolný antigen byla nej lepší imunitní reakce indukována u zvířat vakcinovaných přípravky obsahujícími 3DMPL.
Příklad 2B: Příznivý vliv přidání proteinu podle předkládaného vynálezu +/- 3D-MPL adjuvans na protektivní účinnost PDkonjugované 11-valentní polysacharidové vakcíny na kolonizaci plic pneumokoky u 0F1 myší, které byly intranasálně infikovány serotypem 2, 4. nebo 6B.
V tomto příkladu jsme hodnotili profylaktickou účinnost vakcíny obsahující 11-valentní konjugát polysacharid-protein D, protein podle předkládaného vynálezu a A1PO4 + 3D-MPL adjuvans, ve srovnání s klasickým přípravkem obsahujícím A1P04 adsorbovaný 11-valentní konjugát protein D-polysacharid.
Skupina 12 samic 0F1 myší stáří 4 týdny se imunizovaly podkožně ve dny 0 a 14 přípravkem obsahujícím A: 50 μς A1PO4;
B: 0,1 μς PS/serotyp PD-konjugovaná 1-valentní polysacharidová vakcína + 50 μς A1PO4; nebo C: 0,1 μg PS/serotyp PD-konjugovaná 1-valentní polysacharidová vakcína + 10 μς proteinu podle předkládaného vynálezu + 50 μg A1PO4 + 5 μς 3D-MPL (od Ribi Immunochem). Infekce byla provedena v den 21, jak bylo popsáno výše.
Jak bylo v tomto testu prokázáno, je významné ochrany dosaženo při použití 11-valentní polysacharidové konjugované vakcíny doplněné proteinem podle předkládaného vynálezu a obsahjící A1PO4 + 3D-MPL adjuvans. Naopak, žádná signifikantní ochrana nebyla pozorována u zvířat imunizovaných 11-valentním polysacharidovým konjugátem/AlPO4 přípravkem. Tento výsledek ukazuje, že přidání proteinu podle předkládaného vynálezu a
Ί
3DMPL adjuvans zesiluje účinnost 11-valentní polysacharidové konjugované vakcíny proti pneumonií.
Příklad 2C: Imunologická korelace ochrany zjištěné v příkladu’ 2B
Pro určení imunologických korelátů ochrany dosažené v příkladu 2B 11-valentní polysacharidovou konjugovanou vakcínou doplněnou proteinem podle předkládaného vynálezu a 3D-MPL se měřily serologické protilátkové reakce na polysacharid 2, 4 nebo 6B a protein podle předkládaného vynálezu před infikováním.
Titry protilátek se potom srovnávaly s počtem kolonií bakterií v plících příslušných zvířat určeným 6 hodin po infekci. R2 se vypočetl za použití Log/Log lineární regrese.
Vypočtený R2 může ukázat absenci korelace mezi protilátkovou imunitní reakcí a ochranou před oběma antigeny. Titry anti-6B (nebo 2 nebo 4) protilátek se statisticky významně nelišily ve skupinách imunizovaných 11-valentní konjugovanou vakcínou nebo stejnou vakcínou doplněnou proteinem podle předkládaného vynálezu a 3D-MPL. Proto není zlepšení ochrany pozorované pro přípravek C způsobeno pouze vyšší protilátkovou reakcí na polysacharid 6B (nebo 2 nebo 4).
Dohromady tyto výsledky naznačují, že ochrana není způsobena pouze protilátkovou imunitní reakcí, ale také buněčnou imunitní reakcí indukovanou proteinovým antigenem (výhodně za přítomnosti 3D-MPL). Toto dále podporuje přidání proteinového antigenu a účinného adjuvans k pneumokokové polysacharidové vakcíně, tak, aby bylo dosaženo spolupráce obou složek imunitní reakce pro dosažení optimální ochrany.
• ·· ·· ···· · · ···· ···· · · · ·· · ··· ··· · · · ··· · · · ···· ··· ·· ·· · ·· ··
Příklad 3: Kooperace obou složek imunitního systému u myší aktivně imunizovaných proteinem podle předkládaného vynálezu a pasivně imunizovaných protilátkami proti pneumokokovému PS
Příklad 3: Určení koncentrace pasivně podávaných protilátek proti 6B-polysacharidu (anti-PS) chránících proti pneumonii
Způsob:
Vakcinační skupiny: Čtyři skupiny po 16 myších byly pasivně imunizovány (i.p.) v den -1 100 μΐ neředěného krysího antipolysacharidového séra, kdy každá skupina byla imunizovaná způsobem popsaným dále (celkem 64 myší).
Skupina Specificita Koncentrace Ig v antiséru
GI cc-PS-6B 5 μg/ml
G2 a-PS-6B 2 μg/ml
G3 Ct-PS-βΒ 0,75 μg/ml
G4 Kontrola 0 μg/ml
Zvířata: 64 samců CD-I myší od Charles River, Canada, o hmotnosti přibližně 35 g (stáří přibližně 10 týdnů).
Anestesie: Myši byly anestezovány isofluranem (3%) plus 02 (1 1/min).
Organismus: Streptococcus pneumoniae N1387 (serotyp 6) byl získán z ploten obsahujících tryptikasový sojový agar (TSA) doplněný 5% koňskou krví, které byly suspendovány v 6 ml PBS. Bezprostředně před infikováním se 1 ml bakteriální suspenze naředil na 9 ml za použití roztaveného živného agaru (BBL) a
ponechal se při 41 °C. Myším se aplikovalo přibližně 6,0 loglO cfu/myš v objemu 50 μΐ.
Infekce: V den 0 se myši anestezovaly způsobem popsaným výše a infikovaly se Streptococcus pneumoniae N1387 (50 μΐ chladné bakteriální suspenze) pomocí intrabronchiální instilace cestou nechirurgické intratracheální intubace. Tento způsob byl popsán ve Woodnut and Berry (Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43: 29 (1999) ) .
Vzorky: V den 3 po infekci se 8 myší/skupinu utratilo nadměrnou dávkou CO2 a odebraly se plíce, které se homogenizovaly v 1 ml PBS. V PBS se připravila 10-násobná sériová ředění, za účelem spočítání počtu životaschopných bakterií. Vzorky se naočkovaly (20 μΐ) trojmo na TSA plotny doplněné 5% koňskou krví a inkubovaly se přes noc při 37 °C před tím, než se vyhodnocovaly. Další skupina myší se usmrtila v den 7 a vzorky se připravily stejným způsobem.
Výsledky:
Konc.· IgG (μρ/πιΐ) Počet bakterií (loglO cfu/plíce·) v den po infekci
v krysím séru
3 8
5 6,7 ± 0,7 (1/7) 7,2 ± 0,7 (5/8)
2 6,5 ± 0,7 (1/7) 6,9 ± 1,8 (4/7)
0,75 7,7 ± 0,5 (5/8) 4,8 ± 1,4 (2/8)
0 6,7 ± 1,5 (3/6) 6,3 ± 1,5 (3/9)
Čísla v závorkách jsou počty zvířat, která skonala před odběrem vzorku.
Závěr: Obecně, nebyl pozorován statisticky významný rozdíl v počtu bakterií izolovaných z jakékoliv léčené skupiny. Toto • · • · · ·
naznačuje, že nebylo dosaženo žádné měřitelné ochrany při použití protilátky proti polysacharidu k koncentraci do 5 Hg/ml, včetně.
Tento výsledek je podobný výsledku dosaženému v některých lidských klinických studiích, to znamená výsledku, že protilátka proti polysacharidu je nedostatečná pro ochranu před pneumokokovou pneumonií v některých populacích.
Příklad 3B: Stanovení ochrany před pneumonií dosažené aktivním podáním proteinu podle předkládaného vynálezu s nebo bez adjuvans, a synergie se sub-optimální anti-PS protilátkou
Způsob:
Zvířata: 128 samců CD-I myší od Charles River, Canada, o hmotnosti přibližně 20 g v 6 týdnech a 38 g v 10 týdnech (stáří přibližně 10 týdnů v době imunizace, 10 týdnů v době infekce).
Imunizace: 6 skupin po 16 myších se imunizovalo podkožní injekcí v dny -22 a -14 100 μΐ vakcíny, jak je podrobně popsána dále (celkem 128 myší). 3D-MPL se získal od Ribi/Corixa.
V den -1 se konkrétní skupiny (viz následující tabulka 1) pasivně imunizovaly (i.p. 100 μΐ) myší protilátkou proti polysacharidu v koncentraci 4,26 μς/πιΐ (4 ml 5 μ9/ιη1 + 1,3 ml 2 μg/ml).
Skupina Inj ikovaný obj em aktivní složky Vakcína podaná ve dny -22, -14 (dávka v μg) Inj ikovaný obj em pasivní složky Pasivní IgG (den - 1)
1-1 100 μΐ s.c. Protein/AlP04 (10/50) Ne
1-2 100 μΐ s.c. Protein/MPL/AlPO4 (10/5/50) Ne
1-3 100 μΐ s.c. Protein/AlP04 (10/50) 100 μΐ i.p. a-PS
1-4 100 μΐ s.c. Protein/MPL/AlP04 (10/5/50) 100 μΐ i.p. a-PS
1-5 100 μΐ s.c. Protein/AlP04 (10/50) 100 μΐ i.p. a-PS
1-6 100 μΐ s.c. Protein/AlP04 (10/50) Ne
Infekce: V den O se myši anestezovaly isofluranem (3%) plus 02 (1 1/min). Bakteriální inokulum se získalo odběrem kultivovaných Streptococcus pneumoniae N1387 (serotyp 6) z ploten obsahujících tryptikasový sojový agar (TSA) doplněný 5% koňskou krví, které byly suspendovány v 6 ml PBS. 10násobné ředění (1 ml + 9 ml) se připravilo v roztaveném živném agaru (41 °C) . Myši se infikovaly pomocí intrabronchiální instilace cestou nechirurgické intratracheální intubace a dávka byla přibližně 6,0 loglO cfu/myš v objemu 50 μΐ. Tento způsob byl popsán ve Woodnut and Berry (Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43: 29 (1999)).
Vzorky: 72 hodin po infekci se 8 myší/skupinu utratilo nadměrnou dávkou CO2 a odebraly se plíce, které se homogenizovaly v 1 ml PBS. V PBS se připravila 10-násobná • 99«
9999
9 99
9 9 9 •9 9 9
9 · 9 9 9
9 9 9 9 sériová ředění, za účelem spočítání počtu životaschopných bakterií. Vzorky se naočkovaly (20 μΐ) trojmo na TSA plotny doplněné 5% koňskou krví a inkubovaly se přes noc při 37 °C před tím, než se vyhodnocovaly. Další skupina myší se usmrtila v den 7 a vzorky se připravily stejným způsobem.
Analýza dat: Získaným výsledkem pro srovnání léčby je počet bakterií v plících v den 3 a 7 po infekci. Výsledky mohou být vyjádřeny jako skupinové průměry se standardními odchylkami. Statistická analýza může být provedena za použití Student-t testu, ve kterém je hodnota p < 0,05 považována za statisticky významnou.
Jak bylo uvedeno výše, protilátka proti polysacharidu samotná (skupina 1-5) neposkytuje ochranu před růstem pneumokoků v plících. Pneumokokový protein s A1PO4 adjuvans (skupina 1-1) také neposkytuje ochranu, ale účinkuje lépe než protein kombinovaný s 3D-MPL (skupina 1-2).
Nej významnější ochrana byla pozorována ve skupinách s polysacharidem i proteinem, zejména ve skupině, které byly podány všechny tři složky, protein, 3D-MPL a pasivně podaná protilátka proti polysacharidu (skupina 1-4). Tento závěr je podporován též stupněm mortality. Skupiny 1-3 a zejména 1-4 mají méně úmrtí ve srovnání s dalšími skupinami.
Závěr:
Protože byl pokus proveden s pasivně imunizovanými zvířaty, nemůže být synergní efekt aktivní imunizace proteinem ( + /MPL) způsoben zvýšením koncentrace protilátek proti polysacharidovému antigenu.
• · · ·· »···
Významná ochrana před pneumokokovou pneumonií byla pozorována ve skupinách imunizovaných proteinem i pasivně podanou protilátkou proti polysacharidu, zejména tehdy, pokud byl přítomen též 3D-MPL, což ukazuje na synergii této kombinace.
Pokud je imunizace proti polysacharidu provedena aktivně (výhodně konjugovaným polysacharidem), tak je tento efekt ještě výraznější, v důsledku efektu paměti B-lymfocytů, a konstantní hladiny anti-PS protilátky během pokusu budou přispívat ke kooperaci imunitní reakce.
Příklad 4: Způsob pro stanovení synergie korelováním ochrany
Základním mechanismem ochrany, které lidský organismus využívá pro eliminaci infekčního pneumokoka, je protilátkami zprostředkovaná opsonofagocytosa (Bruyn et al., Clin. Infect. Dis. 14: 251 (1992)). Ačkoliv bylo vyvinuto několik ELISA metod pro měření koncentrace protilátek ke kapsulárnímu polysacharidu jako korelátu ochrany, je zřejmé, že test opsonofagocytosy in vitro je lepším korelátem ochrany (Musher et al., J. Infect. Dis. 182: 158 (2000)).
Pneumokokové proteiny podle předkládaného vynálezu poskytují ochranu před pneumokokovou infekcí mechanismy, které jsou odlišné od protilátkami zprostředkované opsonofagocytosy. V příkladu 2 aktivní imunizace konjugátem a proteinem vykazovala synergní účinky, které nemohly být vysvětleny rozdíly v koncentraci protilátek, protože koncentrace byly stejné v obou skupinách. Proto musí mít residuální ochrana, která byla pozorována, příčinu v synergním účinku. Obdobně, protože je protilátka přidávána pasivně, může být stejného výsledku dosaženo v příkladu 3.
V mnoha případech jsou pneumokokové proteiny podle předkládaného vynálezu asociované s povrchem a předpokládá se, že budou mít nějakou opsonizační aktivitu sami o sobě. V tomto případě je možné odlišit mechanismus ochrany kvantitativním měřením opsonizační kapacity anti-pneumokokového proteinu, což může být použito pro hodnocení relativního příspěvku opsonizační aktivity k dalším synergním mechanismům ochrany.
V myším modelu kolonizace plic může být relativní ochrana každo.u vakcínou hodnocena podle eliminace bakterií z. plic. Alternativně může být účinnost vakcíny hodnocena z průběhu onemocnění, jak se obvykle určuje pro vakcíny.
% ochrany = (CFU/kontrolní plíce - CFU(vakcinovaná plíce)/ (CFU/kontrolní plíce) % účinnosti = (kontroly - vakcinovaní)/kontroly
Pro stanovení podílu ochrany nebo účinnosti, který je v důsledku synergního účinku, je třeba určit, jakou účinnost lze očekávat podle opsonizačních titrů.
Ve výše uvedeném příkladu 3 je % ochrany dosažené kombinací způsobeno synergií mezi složkami protein/protilátka, protože ani protein, ani protilátka proti polysacharidů samotné nedosahují takové ochrany.
Je možné zhodnotit velikost příspěvku synergního účinku k ochraně podle relativní opsonizační aktivity. Když je opsonizační aktivita dosažená protilátkou proti kapsulárnímu polysacharidů X, 'a opsonizační aktivita dosažená protilátkou proti pneumokovému proteinu Y, tak je celková opsonizační » » · φ · · • φ φ φ φφφ
• φ ** · aktivita X + Υ a relativní podíl opsonizační aktivity proteinu je Y/X + Y. Toto se srovná s relativní protektivní účinností vakcíny, kde anti-polysacharidová část vakcíny poskytuje protektivní účinnost A% a protektivní účinnost vakcíny obsahující polysacharid plus protein je B%. Další účinnost, která nenáleží opsonizační aktivitě, se potom označí jako residuální protektivní aktivita (synergní) = B%-A%-B%*(Y/X+Y).
Tento příklad'není omezen na hodnocení účinků synergie. Pokud budou identifikovány další koreláty ochrany, tak mohou být použity pro hodnocení synergního účinku.
Všechny publikace, včetně patentů a patentových přihlášek, citované v předkládaném vynálezu, jsou zde uvedeny ve své úplnosti jako odkazy.
toto • ·
Patentové » · · · í ·· ···· ••♦to· ?· · • · to · Λ * · · · · · · ·

Claims (16)

1. Imunogenní prostředek vyznačující s e ' t í m, že obsahuje alespoň jeden polysacharidový antigen Streptococcus pneumoniae a alespoň jeden proteinový antigen Streptococcus pneumoniae vybraný ze skupiny zahrnující: PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl30 a Spl33, a jejich imunologicky funkční ekvivalenty.
2. Imunogenní prostředek podle nároku lvyznačuj ící se t i m, že polysacharidový antigen je prezentován ve formě konjugátu polysacharid-proteinový nosič.
3. Imunogenní prostředek podle nároku 2vyznačuj ící se t i m, že proteinový nosič je vybrán ze skupiny zahrnující: difterický toxoid, tetanický toxoid, CRM197, přílipkový haemokyanin (KLH), proteinový derivát tuberkulinu (PPD) a protein D z H. influenzae.
4. Imunogenní prostředek podle jakéhokoliv z nároků 1 až 3 vyznačující se tím, že vakcína obsahuje alespoň čtyři pneumokokové polysacharidové antigeny z různých serotypů.
5. Imunogenní prostředek podle jakéhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že dále obsahuje adjuvans.
6. Imunogenní prostředek podle nároku 5vyznačuj ící se t i m, že adjuvans zahrnuje sůl hliníku.
7. Imunogenní prostředek podle nároku 5vyznačuj ící se t i m, že adjuvans je přednostním induktorem Thi reakce.
··* ·
8. Imunogenní prostředek podle nároku 7 vyznačuj ící se t i m, že adjuvans zahrnuje alespoň jedno adjuvans z následující skupiny: 3D-MPL, saponinové imunostimulační činidlo nebo imunostimulační CpG oligonukleotid.
9. Imunogenní prostředek podle nároku 8 vyznačuj ící se t i m, že adjuvans obsahuje nosič vybraný ze skupiny zahrnující: emulzi olej-ve-vodě, liposomy a sůl hliníku.
10. Imunogenní prostředek podle jakéhokoliv z předchozích nároků vyznačující se t i m, že je určen pro použití jako léčivo.
11. Vakcina vyznačující se tím, že obsahuje imunogenní prostředek podle nároku 1-9.
12. Způsob pro prevenci nebo zmírnění infekce Streptococcus pneumoniae u pacientů starších 55 let vyznačuj ící se 't í m, že zahrnuje podání účinného množství vakcíny obsahující polysacharid Streptococcus pneumoniae a alespoň jeden protein Streptococcus pneumoniae vybraný ze skupiny zahrnující PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl30 a Spl33, a volitelně Thlindukující adjuvans.
13. Použití pneumokokového polysacharídového antigenu v kombinaci s proteinovým antigenem Streptococcus pneumoniae vybraným ze skupiny zahrnující PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl30 a Spl33, a volitelně Thl indukujícího adjuvans, při výrobě léčiva pro prevenci nebo léčbu pneumonie u pacientů starších 55 let.
*»
0»· *· ♦
• W *
• 0 00« • 0 • * · • · • * 0 «* ·· ·« 00
14. Použití pneumokokového polysacharidového antigenu v kombinaci s proteinovým antígenem Streptococcus pneumoniae vybraným ze skupiny zahrnující PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl30 a Spl33, a volitelně Thl indukujícího adjuvans, při výrobě léčiva pro prevenci nebo léčbu otítis media u kojenců nebo batolat.
15. Způsob přípravy imunogenního prostředku podle jakéhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
selekci jednoho nebo více pneumokokových polysacharidových antigenů;
selekci jednoho nebo více pneumokokových proteinových antigenů ze skupiny skládající se z PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA,·Spl25, SplOl, Spl28, Spl30 a Spl33; a smísení uvedeného polysacharidového a proteinového antigenu s vhodnou přísadou.
16. Způsob pro prevenci nebo zmírnění otitis media u kojenců v yznačující se tím, že zahrnuje podání bezpečného a účinného množství vakciny obsahující polysacharidový antigen Streptococcus pneumoniae a alespoň jeden proteinový antigen Streptococcus pneumoniae vybraný ze skupiny zahrnující PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl30 a Spl33, a volitelně Thl indukujícím adjuvans, uvedenému kojenci.
CZ2003-756A 2000-09-15 2001-09-12 Imunogenní prostředek, způsob jeho přípravy, vakcína s jeho obsahem a léčivo obsahující pneumokokový polysacharidový antigen v kombinaci s proteinovým antigenem Streptococcus pneumoniae CZ305324B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0022742.1A GB0022742D0 (en) 2000-09-15 2000-09-15 Vaccine

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2003756A3 true CZ2003756A3 (cs) 2003-10-15
CZ305324B6 CZ305324B6 (cs) 2015-08-05

Family

ID=9899575

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2003-757A CZ305343B6 (cs) 2000-09-15 2001-09-12 Imunogenní prostředek, vakcína s jeho obsahem, její použití a způsob její výroby
CZ2003-756A CZ305324B6 (cs) 2000-09-15 2001-09-12 Imunogenní prostředek, způsob jeho přípravy, vakcína s jeho obsahem a léčivo obsahující pneumokokový polysacharidový antigen v kombinaci s proteinovým antigenem Streptococcus pneumoniae

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2003-757A CZ305343B6 (cs) 2000-09-15 2001-09-12 Imunogenní prostředek, vakcína s jeho obsahem, její použití a způsob její výroby

Country Status (25)

Country Link
US (5) US20040081662A1 (cs)
EP (6) EP2314313B1 (cs)
JP (3) JP4903975B2 (cs)
KR (5) KR20100091241A (cs)
CN (3) CN101502648B (cs)
AT (1) ATE516815T1 (cs)
AU (4) AU2054802A (cs)
BR (2) BR0113821A (cs)
CA (2) CA2422002C (cs)
CY (1) CY1111915T1 (cs)
CZ (2) CZ305343B6 (cs)
DK (1) DK1317279T3 (cs)
ES (4) ES2551097T3 (cs)
GB (1) GB0022742D0 (cs)
HK (1) HK1057698A1 (cs)
HU (2) HUP0301092A3 (cs)
IL (4) IL154608A0 (cs)
MX (2) MXPA03002265A (cs)
NO (2) NO336186B1 (cs)
NZ (2) NZ524286A (cs)
PL (2) PL210198B1 (cs)
PT (1) PT1317279E (cs)
SI (1) SI1317279T1 (cs)
WO (2) WO2002022167A2 (cs)
ZA (2) ZA200301526B (cs)

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7078042B2 (en) * 1995-09-15 2006-07-18 Uab Research Foundation Pneumococcal surface protein C (PspC), epitopic regions and strain selection thereof, and uses therefor
US6800744B1 (en) 1997-07-02 2004-10-05 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to Streptococcus pneumoniae for diagnostics and therapeutics
US7153952B1 (en) 1997-07-02 2006-12-26 sanofi pasteur limited/sanofi pasteur limitée Nucleic acid and amino acid sequences relating to Streptococcus pneumoniae for diagnostics and therapeutics
US7128918B1 (en) * 1998-12-23 2006-10-31 Id Biomedical Corporation Streptococcus antigens
CZ303653B6 (cs) * 1999-03-19 2013-01-30 Smithkline Beecham Biologicals S. A. Imunogenní prostredek
US7074415B2 (en) * 2000-06-20 2006-07-11 Id Biomedical Corporation Streptococcus antigens
GB0115176D0 (en) 2001-06-20 2001-08-15 Chiron Spa Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
AU2002351623A1 (en) 2001-12-20 2003-07-09 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
EP2275125A3 (en) * 2002-04-02 2011-03-09 Ben Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Protein-based streptococcus pneumoniae vaccines
US8691243B2 (en) 2002-04-02 2014-04-08 Ben-Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Protein-based Streptococcus pneumoniae vaccine
WO2004032958A1 (en) 2002-10-11 2004-04-22 Chiron Srl Polypeptide-vaccines for broad protection against hypervirulent meningococcal lineages
GB0227346D0 (en) 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741
US8229903B2 (en) * 2002-12-19 2012-07-24 International Business Machines Corporation Suggesting data interpretations and patterns for updating policy documents
WO2004067030A2 (en) 2003-01-30 2004-08-12 Chiron Srl Injectable vaccines against multiple meningococcal serogroups
US8084235B2 (en) 2003-03-13 2011-12-27 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Purification process for bacterial cytolysin
EP1477802A1 (en) * 2003-05-16 2004-11-17 Erasmus Universiteit Rotterdam Method for selecting and producing vaccine components and vaccines based thereon
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
ATE506963T1 (de) 2003-10-02 2011-05-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Kombinationsimpfstoffe gegen meningitis
KR20070095868A (ko) * 2004-09-21 2007-10-01 사노피 파스퇴르 인크 다가 수막구균 유도체화된 다당류-단백질 접합체 및 백신
AU2011253684B8 (en) * 2005-04-08 2013-07-11 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
CN102716480B (zh) 2005-04-08 2023-03-21 惠氏有限责任公司 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物
GB0522765D0 (en) 2005-11-08 2005-12-14 Chiron Srl Combination vaccine manufacture
GB0524066D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Chiron Srl 741 ii
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
CA2808919C (en) 2005-12-22 2016-04-19 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Streptococcus pneumoniae capsular saccharide vaccine
AU2006336520B2 (en) * 2005-12-28 2011-09-15 The Uab Research Foundation Pneumococcal serotypes
US8808707B1 (en) 2006-05-08 2014-08-19 Wyeth Llc Pneumococcal dosing regimen
WO2008022298A2 (en) * 2006-08-17 2008-02-21 The Uab Research Foundation Immunogenic pcpa polypeptides and uses thereof
CL2008001491A1 (es) * 2007-05-24 2008-11-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion liofilizada que comprende uno o mas antigenos y un agonista del receptor de tipo toll 9 (tlr9); y procedimiento de preparacion.
EP2687228B1 (en) 2007-06-26 2017-07-19 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates
GB0713880D0 (en) 2007-07-17 2007-08-29 Novartis Ag Conjugate purification
US20160228500A9 (en) * 2007-07-23 2016-08-11 Martina Ochs Immunogenic Polypeptides and Monoclonal Antibodies
AU2008280799B2 (en) * 2007-07-23 2013-07-11 Sanofi Pasteur Limited Immunogenic polypeptides and monoclonal antibodies
GB0714963D0 (en) 2007-08-01 2007-09-12 Novartis Ag Compositions comprising antigens
WO2009033742A2 (en) * 2007-09-14 2009-03-19 Katholieke Universiteit Leuven Streptococcus pneumoniae vaccines
EP2235531B1 (en) * 2008-02-01 2015-01-14 Sanofi Pasteur Limited Assay for diagnosing streptococcus pneumoniae
US8466167B2 (en) 2008-03-03 2013-06-18 Irm Llc Compounds and compositions as TLR activity modulators
CA2756533A1 (en) 2009-03-24 2010-09-30 Novartis Ag Combinations of meningococcal factor h binding protein and pneumococcal saccharide conjugates
TR201802380T4 (tr) 2009-06-10 2018-03-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa Benzonaftiridin içeren aşılar.
AU2010290896B2 (en) 2009-09-02 2014-07-03 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic compositions including TLR activity modulators
TWI445708B (zh) 2009-09-02 2014-07-21 Irm Llc 作為ｔｌｒ活性調節劑之化合物及組合物
CN102695523A (zh) 2009-09-10 2012-09-26 诺华有限公司 针对呼吸道疾病的组合疫苗
CN101690810B (zh) * 2009-10-21 2011-08-17 辽宁益康生物股份有限公司 一种鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗佐剂及其制备方法
WO2011057148A1 (en) 2009-11-05 2011-05-12 Irm Llc Compounds and compositions as tlr-7 activity modulators
JP5814933B2 (ja) 2009-12-15 2015-11-17 ノバルティス アーゲー 免疫増強化合物の均質な懸濁物およびその使用
KR20120107121A (ko) * 2009-12-22 2012-09-28 사노피 파스퇴르 리미티드 면역원성 조성물
EP2515940A4 (en) 2009-12-22 2013-10-09 Sanofi Pasteur Ltd IMMUNOGENIC COMPOSITIONS AND CORRESPONDING METHODS
GB201003920D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Method of treatment
GB201003922D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
EP2549990A1 (en) 2010-03-23 2013-01-30 Irm Llc Compounds (cystein based lipopeptides) and compositions as tlr2 agonists used for treating infections, inflammations, respiratory diseases etc.
WO2012072769A1 (en) 2010-12-01 2012-06-07 Novartis Ag Pneumococcal rrgb epitopes and clade combinations
WO2012075428A1 (en) * 2010-12-03 2012-06-07 Sanofi Pasteur Limited Composition for immunization against streptococcus pneumoniae
US20140072622A1 (en) * 2011-05-17 2014-03-13 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine against streptococcus pneumoniae
JP2015510872A (ja) 2012-03-07 2015-04-13 ノバルティス アーゲー Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原の増強された製剤
JP2014000016A (ja) * 2012-06-15 2014-01-09 National Agriculture & Food Research Organization 豚丹毒菌の新規な抗原タンパク質、その遺伝子、及び組換えベクターとその利用
RU2510281C2 (ru) * 2012-06-22 2014-03-27 Общество с ограниченной ответственностью "Эпитоп" (ООО "Эпитоп") ВАКЦИНА ПРОТИВ ПНЕВМОНИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ Streptococcus pneumoniae, НА ОСНОВЕ ГИБРИДНОГО БЕЛКА
GB201218660D0 (en) 2012-10-17 2012-11-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
KR20150072444A (ko) * 2012-10-17 2015-06-29 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 하나 이상의 스트렙토코커스 뉴모니애 캡슐 사카라이드 컨쥬게이트 및 해모필루스 인플루엔자로부터의 단백질 Ｅ 및／또는 ＰｉｌＡ를 포함하는 단백질 성분을 포함하는 면역원성 조성물
BR112015015795A2 (pt) 2013-01-01 2017-07-11 Agfa Graphics Nv copolímeros de etilenovinil acetal e seu uso em precursores de chapas de impressão litográfica
CN105188747A (zh) 2013-02-01 2015-12-23 葛兰素史密斯克莱生物公司 包含toll样受体激动剂的免疫组合物的皮内递送
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2015183676A1 (en) * 2014-05-29 2015-12-03 Kapre Subhash V Synthetic peptides as carriers for conjugation with polysaccharides
US9815886B2 (en) 2014-10-28 2017-11-14 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
CN108780282A (zh) 2016-03-16 2018-11-09 爱克发有限公司 加工平版印刷版的设备和相应方法
EP3562838A2 (en) 2016-12-28 2019-11-06 Henriques Normark, Birgitta Microparticles from streptococcus pneumoniae as vaccine antigens
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
US10729763B2 (en) 2017-06-10 2020-08-04 Inventprise, Llc Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds
BR112019026192B1 (pt) 2017-06-10 2022-05-10 Inventprise, Llc Vacinas de conjugado multivalente com polissacarídeos de conjugado bivalente ou multivalente que fornecem imunogenicidade e avidez melhoradas
KR20200123436A (ko) 2018-02-12 2020-10-29 이니뮨 코퍼레이션 톨-유사 수용체 리간드
CN113795306A (zh) * 2019-03-13 2021-12-14 圣朱德儿童研究医院 用于减少肺炎链球菌传播的疫苗组合物和方法
EP3778253A1 (en) 2019-08-13 2021-02-17 Agfa Nv Method for processing a lithographic printing plate
IL302449A (en) 2020-11-04 2023-06-01 Eligo Bioscience CUTIBACTERIUM ACNES PHAGES RECOMBINANT, the production method and their uses

Family Cites Families (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4372945A (en) 1979-11-13 1983-02-08 Likhite Vilas V Antigen compounds
IL61904A (en) 1981-01-13 1985-07-31 Yeda Res & Dev Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same
BE889979A (fr) 1981-08-14 1982-02-15 Smith Kline Rit Procede de preparation de polysaccharides bacteriens capsulaires antigeniques purifies, produits obtenus et leur utilisation
US5360897A (en) * 1981-08-31 1994-11-01 The University Of Rochester Immunogenic conjugates of streptococcus pneumonial capsular polymer and toxin or in toxiad
US4761283A (en) * 1983-07-05 1988-08-02 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4882317A (en) * 1984-05-10 1989-11-21 Merck & Co., Inc. Covalently-modified bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers and methods of preparing such polysaccharides and conjugataes and of confirming covalency
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US4709017A (en) 1985-06-07 1987-11-24 President And Fellows Of Harvard College Modified toxic vaccines
US5173294A (en) 1986-11-18 1992-12-22 Research Foundation Of State University Of New York Dna probe for the identification of haemophilus influenzae
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4940460A (en) 1987-06-19 1990-07-10 Bioject, Inc. Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly
US5339163A (en) 1988-03-16 1994-08-16 Canon Kabushiki Kaisha Automatic exposure control device using plural image plane detection areas
US4912094B1 (en) * 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5006914A (en) * 1988-12-02 1991-04-09 Advanced Technology Materials, Inc. Single crystal semiconductor substrate articles and semiconductor devices comprising same
JP3237842B2 (ja) * 1988-12-16 2001-12-10 オランダ国 ニューモリシンミュータント及びそれから製造されたニューモコッカルワクチン
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
CA2059693C (en) 1991-01-28 2003-08-19 Peter J. Kniskern Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae
CA2059692C (en) 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
US5980909A (en) * 1991-02-15 1999-11-09 Uab Research Foundation Epitopic regions of pneumococcal surface protein A
DK0571538T5 (da) 1991-02-15 2002-03-04 Uab Research Foundation Strukturgen for pneumokokprotein
US5476929A (en) 1991-02-15 1995-12-19 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
US6592876B1 (en) 1993-04-20 2003-07-15 Uab Research Foundation Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products
US5552146A (en) 1991-08-15 1996-09-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to useful antigens of Moraxella catarrhalis
GB9118204D0 (en) 1991-08-23 1991-10-09 Weston Terence E Needle-less injector
US5371197A (en) * 1991-09-24 1994-12-06 Merck & Co., Inc. Protein-dimeric polysaccharide conjugate vaccine
JP3428646B2 (ja) 1992-06-18 2003-07-22 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバードカレッジ ジフテリア毒素ワクチン
ATE188613T1 (de) 1992-06-25 2000-01-15 Smithkline Beecham Biolog Adjuvantien enthaltende impfstoffzusammensetzung
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
DE69331437T2 (de) * 1992-09-16 2002-09-05 Univ Tennessee Res Corp Antigene des hybriden m-proteins und träger für gruppe a streptokokkenimpfstoff
US5569189A (en) 1992-09-28 1996-10-29 Equidyne Systems, Inc. hypodermic jet injector
US5334144A (en) 1992-10-30 1994-08-02 Becton, Dickinson And Company Single use disposable needleless injector
GB9224584D0 (en) 1992-11-23 1993-01-13 Connaught Lab Use of outer membrane protein d15 and its peptides as vaccine against haempohilus influenzae diseases
HU219056B (hu) 1993-03-23 2001-02-28 Smithkline Beecham Biologicals Sa 3-O-Dezacilezett monofoszforil-lipid A-t tartalmazó vakcinakészítmény
EP1300156A3 (en) 1993-05-18 2003-05-07 The Ohio State University Research Foundation Otitis media vaccine
JP3828145B2 (ja) 1993-09-22 2006-10-04 ヘンリー エム．ジャクソン ファウンデイション フォー ザ アドバンスメント オブ ミリタリー メディスン 免疫原性構成物の製造のための新規シアン化試薬を使った可溶性炭水化物の活性化方法
GB9326253D0 (en) * 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
WO1995024176A1 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Bioject, Inc. Ampule filling device
US5466220A (en) 1994-03-08 1995-11-14 Bioject, Inc. Drug vial mixing and transfer device
US5866135A (en) * 1994-04-21 1999-02-02 North American Vaccine, Inc. Group A streptococcal polysaccharide immunogenic compositions and methods
US5917017A (en) 1994-06-08 1999-06-29 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines bearing a mutated R domain
ATE420171T1 (de) 1994-07-15 2009-01-15 Univ Iowa Res Found Immunomodulatorische oligonukleotide
US5565204A (en) 1994-08-24 1996-10-15 American Cyanamid Company Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections
US5599302A (en) 1995-01-09 1997-02-04 Medi-Ject Corporation Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US6440425B1 (en) 1995-05-01 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
JPH11507214A (ja) 1995-06-07 1999-06-29 バイオケム ヴァシーンズ インク． Ｈｓｐ７０ファミリーに属する連鎖球菌の熱ショック蛋白質メンバー
GB9513074D0 (en) 1995-06-27 1995-08-30 Cortecs Ltd Novel anigen
US6290970B1 (en) 1995-10-11 2001-09-18 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor protein of Moraxella
US5893397A (en) 1996-01-12 1999-04-13 Bioject Inc. Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus
US6090576A (en) 1996-03-08 2000-07-18 Connaught Laboratories Limited DNA encoding a transferrin receptor of Moraxella
GB9607549D0 (en) 1996-04-11 1996-06-12 Weston Medical Ltd Spring-powered dispensing device
ATE323721T1 (de) 1996-05-01 2006-05-15 Univ Rockefeller Cholin-bindendes protein, welches als gegen pneumokokken gerichtetes vakzin verwendet wird
US6245335B1 (en) * 1996-05-01 2001-06-12 The Rockefeller University Choline binding proteins for anti-pneumococcal vaccines
US5744417A (en) 1996-05-02 1998-04-28 Lyondell Petrochemical Company Supported catalyst
US7341727B1 (en) 1996-05-03 2008-03-11 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same
AR008242A1 (es) 1996-06-18 1999-12-29 Alza Corp Dispositivo para atravesar el estrato corneo de una superficie corporal
JP2000514308A (ja) 1996-08-16 2000-10-31 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 新規原核生物ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびそれらの使用
US5882896A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation M protein
US5882871A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation Saliva binding protein
EP0941335A2 (en) 1996-10-31 1999-09-15 Human Genome Sciences Streptococcus pneumoniae polynucleotides and sequences
US6291654B1 (en) 1996-11-12 2001-09-18 Regents Of The University Of Minnesota Method for isolating a C3 binding protein of streptococcus pneumoniae
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
AU722574B2 (en) 1996-12-20 2000-08-10 Alza Corporation Device and method for enhancing transdermal agent flux
DE19708537A1 (de) 1997-03-03 1998-09-10 Biotechnolog Forschung Gmbh Neues Oberflächenprotein (SpsA-Protein) von Streptococcus pneumoniae etc.
FR2763244B1 (fr) * 1997-05-14 2003-08-01 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition vaccinale multivalente a porteur mixte
US5993412A (en) 1997-05-19 1999-11-30 Bioject, Inc. Injection apparatus
AU739129B2 (en) 1997-06-03 2001-10-04 Connaught Laboratories Limited Lactoferrin receptor genes of moraxella
KR100619350B1 (ko) * 1997-07-21 2006-09-05 박스터 헬쓰케어 에스.에이. 변형 면역성 뉴멀리신 백신조성물
US6224880B1 (en) * 1997-09-24 2001-05-01 Merck & Co., Inc. Immunization against Streptococcus pneumoniae using conjugated and unconjugated pneumoccocal polysaccharide vaccines
EP1017828A1 (en) * 1997-09-24 2000-07-12 Regents Of The University Of Minnesota HUMAN COMPLEMENT C3-DEGRADING PROTEINASE FROM $i(STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE)
EP0916726A1 (en) * 1997-11-13 1999-05-19 Rijksuniversiteit te Groningen Attaching substances to micro-organisms
AU756828B2 (en) 1997-12-02 2003-01-23 Powderject Vaccines, Inc. Transdermal delivery of particulate vaccine compositions
IT1298087B1 (it) 1998-01-08 1999-12-20 Fiderm S R L Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni
US6709658B1 (en) * 1998-02-12 2004-03-23 Wyeth Holdings Corporation Pneumococcal vaccines formulated with interleukin-12
TR200003498T2 (tr) 1998-04-07 2001-10-22 St. Jude Children's Research Hospital Amino asit sekansından oluşan bir polipetit, bunun aşıları ve kullanımları
EP1067962B1 (en) 1998-04-07 2010-03-24 MedImmune, LLC Derivatives of pneumococcal choline binding proteins for vaccines
AU770378B2 (en) 1998-04-23 2004-02-19 Uab Research Foundation Pneumococcal surface protein C(PspC), epitopic regions and strain selection thereof, and uses therefor
GB9812613D0 (en) 1998-06-11 1998-08-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
IL142017A0 (en) 1998-09-24 2002-03-10 Univ Minnesota Human complement c3-degrading polypeptide from streptococcus pneumoniae
GB2359228A (en) 1998-11-17 2001-08-15 Schlumberger Technology Corp Transmitting information over a communication link
AU2027400A (en) 1998-11-19 2000-06-05 St. Jude Children's Research Hospital Identification and characterization of novel pneumococcal choline binding proteins, cbpg and cbpd, and diagnostic and therapeutic uses thereof
JP4689044B2 (ja) 1998-12-21 2011-05-25 メディミューン，インコーポレーテッド ワクチン用の肺炎連鎖球菌タンパク質と免疫原断片
EP1034792A1 (en) * 1999-03-11 2000-09-13 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Intranasal delivery of pneumococcal polysaccharide vaccines
CZ303653B6 (cs) * 1999-03-19 2013-01-30 Smithkline Beecham Biologicals S. A. Imunogenní prostredek
JP2003501110A (ja) 1999-06-10 2003-01-14 メディミューン，インコーポレーテッド 肺炎連鎖球菌タンパク質とワクチン
WO2000076541A1 (en) * 1999-06-10 2000-12-21 Uab Research Foundation Pneumococcal surface protein combination vaccine
US6319224B1 (en) 1999-08-20 2001-11-20 Bioject Medical Technologies Inc. Intradermal injection system for injecting DNA-based injectables into humans
US6494865B1 (en) 1999-10-14 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Intradermal delivery device including a needle assembly

Also Published As

Publication number Publication date
PL361395A1 (en) 2004-10-04
HUP0301092A2 (hu) 2003-09-29
US20060051361A1 (en) 2006-03-09
AU2002238193B2 (en) 2005-05-12
CY1111915T1 (el) 2015-11-04
ES2551097T3 (es) 2015-11-16
CN1253205C (zh) 2006-04-26
CN101502648A (zh) 2009-08-12
EP2140878A1 (en) 2010-01-06
US20040081662A1 (en) 2004-04-29
GB0022742D0 (en) 2000-11-01
EP1317280B1 (en) 2015-07-15
KR20030031188A (ko) 2003-04-18
EP1317280A2 (en) 2003-06-11
PT1317279E (pt) 2011-10-11
JP4880184B2 (ja) 2012-02-22
EP2314313B1 (en) 2017-12-27
ZA200301524B (en) 2004-04-21
AU2002220548B2 (en) 2005-04-14
CA2422002C (en) 2013-06-18
EP2140878B1 (en) 2015-08-26
JP4903975B2 (ja) 2012-03-28
IL154607A (en) 2010-11-30
MXPA03002265A (es) 2004-12-03
EP1317279A2 (en) 2003-06-11
WO2002022168A3 (en) 2002-06-27
PL210198B1 (pl) 2011-12-30
KR20100091241A (ko) 2010-08-18
US20110008419A1 (en) 2011-01-13
NO20031183D0 (no) 2003-03-14
JP2004508417A (ja) 2004-03-18
KR101268790B1 (ko) 2013-05-29
JP2004508416A (ja) 2004-03-18
CZ305343B6 (cs) 2015-08-12
EP2305297A1 (en) 2011-04-06
DK1317279T3 (da) 2011-10-24
MXPA03002264A (es) 2004-12-03
KR20110132483A (ko) 2011-12-07
EP2314313A1 (en) 2011-04-27
SI1317279T1 (sl) 2011-11-30
HK1057698A1 (en) 2004-04-16
CA2422002A1 (en) 2002-03-21
WO2002022167A2 (en) 2002-03-21
BR0113821A (pt) 2003-06-24
IL154607A0 (en) 2003-09-17
ZA200301526B (en) 2004-06-04
EP1317279B1 (en) 2011-07-20
PL361401A1 (en) 2004-10-04
WO2002022168A2 (en) 2002-03-21
US20080081050A1 (en) 2008-04-03
ATE516815T1 (de) 2011-08-15
KR100991916B1 (ko) 2010-11-04
BR0113822A (pt) 2003-06-24
IL154608A (en) 2010-11-30
ES2368902T3 (es) 2011-11-23
NZ524287A (en) 2005-03-24
NO20031183L (no) 2003-05-13
CN100486642C (zh) 2009-05-13
HUP0301043A2 (hu) 2003-09-29
CZ305324B6 (cs) 2015-08-05
EP2305298A1 (en) 2011-04-06
CZ2003757A3 (cs) 2003-10-15
CA2421998A1 (en) 2002-03-21
NO336186B1 (no) 2015-06-08
IL154608A0 (en) 2003-09-17
NO20031184L (no) 2003-05-14
CA2421998C (en) 2015-01-06
HUP0301092A3 (en) 2011-03-28
PL209247B1 (pl) 2011-08-31
JP2012006969A (ja) 2012-01-12
HUP0301043A3 (en) 2011-03-28
NO337730B1 (no) 2016-06-13
KR20030031187A (ko) 2003-04-18
KR20080080683A (ko) 2008-09-04
CN101502648B (zh) 2013-07-03
US20140099339A1 (en) 2014-04-10
CN1477970A (zh) 2004-02-25
ES2659400T3 (es) 2018-03-15
AU2054802A (en) 2002-03-26
NO20031184D0 (no) 2003-03-14
CN1694723A (zh) 2005-11-09
KR100805991B1 (ko) 2008-02-26
AU3819302A (en) 2002-03-26
NZ524286A (en) 2005-05-27
WO2002022167A3 (en) 2002-06-27
ES2545876T3 (es) 2015-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ2003756A3 (cs) Imunogenní prostředek
AU2002220548A1 (en) Vaccine against streptococcus penumoniae
AU2002238193A1 (en) Vaccine against streptococcus pneumoniae

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20150912