KR20230117105A - 큐티박테리움 아크네스 재조합 파지, 그의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

큐티박테리움 아크네스 재조합 파지, 그의 제조 방법 및 용도 Download PDF

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블라스코 이네스 카나다스
오렐리 마띠유
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엘리고 바이오사이언스
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Abstract

본 발명은 재조합 씨. 아크네스 파지의 제조를 위해 DNA 벡터를 보유하는 씨. 아크네스 균주에 관한 것이다. 본 발명은 재조합 파지에 의해 감염된 씨. 아크네스로 이식유전자 발현을 일으킬 수 있는 재조합 파지의 제조를 위해서, 관심 유전자의 삽입을 일으키는 씨. 아크네스 파지 게놈과 상동성을 위한 주형이 존재하는, DNA 벡터를 보유하는 씨. 아크네스 생산자 세포를 포괄한다. 본 발명은 이들 벡터를 함유하는 씨. 아크네스 균주, 씨. 아크네스 재조합 파지 ?? 이들 재조합 파지를 사용하는 방법을 포괄한다.

Description

큐티박테리움 아크네스 재조합 파지, 그의 제조 방법 및 용도
본 발명은 큐티박테리움 아크네스 (Cutibacterium acnes) 재조합 파지 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
피부는 인체의 가장 큰 기관이고 우리 몸과 우리 환경 사이의 가장 큰 경계면이다. 이와 같이 또한 물리적 (예를 들어, UV, 상처), 화학적 (예를 들어, 산, 염기), 및 미생물 (바이러스, 박테리아, 진균) 위협으로부터 우리를 보호하는 장벽으로서 역할도 한다. 이러한 보호는 지질 매트릭스로 둘러싸인 조밀한 상호연결된 사멸 세포의 연속적인 층 (각질층)으로 만들어진 이의 수동적인 물리적 고립 성질의 결과일 뿐만은 아니다. 이것은 또한 항미생물 펩티드 (AMP)를 분비하고, 사이토카인 및 케모카인을 생산하여 림프성 면역 세포를 모집하며, 피부 상해를 감지하여 다른 과정 중에서도 상처 치유 기전을 촉발시키는 다양한 유형의 피부 및 면역 세포에 의해 조율되는 능동적 기전 덕분이다1.
피부는 우리가 태어난 이후에 최초로 미생물과 접촉하는 기관이고, 매우 다양한 미생물과 밀접하게 접촉하는 방대한 양의 면역 세포가 거주하며, 따라서, 피부 면역계는 지속적인 면역 반응 및 염증을 피하도록 병원체로부터 유익한 미생물을 인식하는 능력을 개발하는 것을 필요로 한다. 이러한 교육의 일부는 특정 박테리아 종이 피부에 집락화되어 그들이 내성이 되기 위해서 면역 반응을 조절하는 때의 어린 시기에 발생된다2. 이후에 이들 특정 박테리아 종은 피부에 안정하게 집락화되어서 군집을 확립하고 공생 균주가 될 수 있다.
피부는 신체 전반에서 생리적으로 공간적으로 균질하지 않다: 지성 (예를 들어, 뺨, 등), 습성 (예를 들어, 서혜부 주름부, 손발가락 사이 공간, 전주와 주름부) 및 건성 피부 (예를 들어, 손바닥 팔뚝부, 소지구 손바닥부)가 신체 부위에 의존하여 존재한다3. 이들 상이한 신체 부위는 상이한 생리적 상태와 연관되고 별개 마이크로바이옴을 보유하는데 지성 부위는 대부분이 큐티박테리움 아크네스 (Cutibacterium acnes) (이전에는 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes)로 알려짐)가 집락화하는데 반해서, 습성 부위에는 스타필로코쿠스 (Staphylococcus) 및 코리네박테리움 (Corynebacterium) 종이 보다 풍부하다4. 이들 생리적인 특징이외에도, 피부는 또한 상이한 부속 기관: 땀샘, 모낭, 피지선을 가져서 공간적으로 불균질하다. 이들 부속 기관의 집락화는 오직 최근에서야 연구되지만 피부 표면 (각질층)과 비교하여 차이를 보인다4-6.
이들 피부 부속 기관은 그들이 각질층을 갖지 않으므로 특별한 해부학적 장소이다. 결과적으로, 이들 부속 기관 내부의 미생물은 살아있는 각질세포와 접촉하고 진피 근접성으로 인해서 더 다양한 면역 세포에 접근한다. 모낭은 특별한 면역학적 성질을 갖는다. 이것은 예컨대 단핵구-유래 랑게르한스 세포 전구체와 같은 특별한 면역 세포를 모집할 수 있고7 상주 기억 T 세포 (TRM)를 능동적으로 유지할 수 있어서8 항원 제시를 위한 잠재적인 필수 장소가 된다. 모낭은 또한 이펙터 T 세포가 고갈되고 강력한 면역 억제 환경을 가져서 면역 특권 영역이 된다9.
공개된 문헌의 예는 피부-상주 박테리아가 온전한 피부 장벽을 통해 숙주 면역력에 적극적으로 관여하고, 종- 및 균주-의존적 방식으로 특별한 면역 세포를 활성화시킨다는 것을 보여준다 (Chen et al, Nature 2018; 555(7697):543). 예를 들어, 에스. 에피더미디스 (S. epidermidis)의 모두는 아니지만 일부 균주는 피부 감염에 대해 보호하는 에스. 에피더미디스-특이적 IL-17+CD8+ T 세포의 활성화를 유도한다 (Naik et al, Nature 2015, 520(7545):104-108).
각질층의 부재로 인해서, 피부 부속 기관은 또한 화학물에 대해 더 투과성인데 이들은 일반적으로 물 교환을 방지하는 각질층이 아닌 치밀-이음부 장벽만을 가로지르면 되서 그 결과로 모든 수용성 물질이 확산될 수 있기 때문이다.
모낭 및 피지샘을 포함하는 털피지샘 서브유닛은 이러한 피지가 풍부한 혐기성 환경에서 번성하는 씨. 아크네스 (C. acnes)가 주로 집락화된다. 큐티박테리움 아크네스 (이전에 프로피오니박테리움 아크네스)는 그람-양성 간상 내산소성 박테리아로서, 1897년에 피부에서 처음 단리되었다. 이것은 악티노마이세탈레스 (Actinomycetales) 목에 속하고, 프로피오니박테리아세아에 (Propionibacteriaceae) 과의 일부이며 큐티박테리움 (Cutibacterium) 속에 속한다. 이러한 속에는 다른 인간 피부 종 예컨대 큐티박테리움 아비둠 (Cutibacterium avidum), 큐티박테리움 그라눌로숨 (Cutibacterium granulosum) 및 큐티박테리움 휴머루시이 (Cutibacterium humerusii)가 포함된다10. 씨. 아크네스는 인간 피부 상에서 가장 우세하고 풍부한 박테리아 중 하나로서 피부 표면 (각질층) 및 모낭 둘 모두에서 발견될 수 있다. 대부분이 죽은 각질 세포와 접촉하는 각질층과 달리, 모낭 내부에서는, 매우 다양한 살아있는 세포 예컨대 각질세포, 줄기 세포, 피지 세포 및 면역 세포와 직접 접촉한다. 씨. 아크네스는 공생 박테리아이지만 또한 예컨대 심상성 좌창11 또는 진행성 반상 저색소증12-14 등과 같은 몇몇 피부 질환과 연관된다.
특히, 씨. 아크네스에 대한 새로운 발견은 특별한 계통형이 여드름 발생에서 핵심적인 역할을 할 수 있다는 것을 밝혀준다11. 정확히는, 여드름에서 씨. 아크네스 계통형 IA1의 역할이 널리 강조되고 있다. Fitz-Gibbon과 동료들은 리보타입 RT4 및 RT5 (계통군 IA1 내에서 분류)의 특징인, 염색체 영역, 유전자좌 1, 2, 및 3이 여드름과 강력하게 연관된다는 것을 입증하였다15. 이들 염색체 영역이 건강한 피부와 연관된 리보타입 (즉, RT6)에서 부재하므로, 그들은 여드름-연관된 씨. 아크네스 균주를 제거하기 위한 잠재적인 표적을 의미한다.
예컨대 심상성 좌창과 같은 질환을 예방 또는 치유하도록 특별한 프로염증성 균주를 제거하여 큐티박테리움 아크네스 개체군을 편집할 수 있거나 또는 숙주 면역 반응을 조절하거나 또는 상처 치유를 개선하도록 털피지샘 단위로 그들 특권 위치를 활용할 수 있는 것은 매력적인 치료 접근법이다. 이러한 접근법을 구현하기 위해서, 씨. 아크네스 균주를 원위치에서 유전자 변형시킬 수 있거나 또는 시험관내에서 유전자 변형된 씨. 아크네스를 제공할 수 있다. 종 및 균주 수준 둘 모두에서 개체내 및 개체간 마이크로바이옴 다양성이 크기때문에, 대부분의 환자 피부에서 집락화할 수 있는 단일한 조작된 씨. 아크네스 균주 또는 이의 칵테일을 제공하는 것은 어려워 보인다.
씨. 아크네스 개체군으로 원위치 DNA 전달은 국소 마이크로바이옴을 방해하지 않고 잠재적으로 사전-확립된 균주를 활용할 수 있도록 허용하여서 이러한 어려움을 회피할 방법을 제공한다. 그러나, 씨. 아크네스로 유전 물질의 원위치 전달은 몇가지 이유때문에 어려운 작업이다. 첫째로, 씨. 아크네스 내부에서 강건하게 자율적으로 복제될 수 있는 플라스미드같은 유전적 구성요소가 아직까지 존재하지 않는다. 소수의 설명된 유전자 변형은 상동성 재조합을 통한 합성 DNA의 게놈 삽입에 의해 이루어진다16-18. 이러한 시험관내 과정은 효율이 매우 낮은 것으로 확인되었고 그러한 사건을 선택하기 위한 항생제 선택 마커의 사용에 의존한다. 게다가, 이들 유전자 변형은 소수의 특정 균주 (KPA17202, 하나의 RT6 씨. 아크네스)에 국한되어서, 모든 씨. 아크네스 균주에 대해 일반화할 수 없다. 두번째로, 씨. 아크네스의 원위치 유전자 변형을 수행하기 위해서, 씨. 아크네스로 DNA의 전달을 필요로 한다. 씨. 아크네스로 DNA를 도입하기 위해 기술된 유일한 방법은 시험관내에서만 수행할 수 있는 방법인, 전기천공의 사용이다19,20.
본 발명은 파지-유래 입자를 사용하여, 복제되는 안정한 DNA 벡터의 결여 및 씨. 아크네스로 그들의 전달 둘 모두를 해결한다. 본 발명은 또한 씨. 아크네스 파지 게놈 조작을 위한 고유하고 견고한 도구를 제공한다.
본 발명은 큐티박테리움 아크네스 파지미드, 이들 파지미드, 큐티박테리움 아크네스 재조합 파지를 포함하는 박테리아 세포, 이들 파지미드를 포함하는 파지-유래 입자를 제조하기 위한 방법, 이들 파지미드를 포함하는 파지-유래 입자, 및 특히 큐티박테리움 아크네스 관련 장애 및/또는 질환의 치료에서 이들 파지미드, 입자, 및 세포를 사용하는 방법을 포괄한다.
본 발명은 재조합 DNA 파지미드 벡터, 이들 벡터를 포함하는 파지-유래 입자, 및 벡터를 보유하는 큐티박테리움 아크네스를 포괄하고, 벡터는
- 큐티박테리움 아크네스 파지 캡시드에 DNA 벡터의 패키징을 허용하는 파지 패키징 신호; 및
- 관심 유전자
를 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는
- 큐티박테리움 아크네스 파지 캡시드에 DNA 벡터의 패키징을 허용하는 파지 패키징 신호로서, 파지 패키징 신호 서열은 서열 SEQ ID NO: 76과 적어도 80, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 97, 98, 99, 또는 100% 동일한 것인 파지 패키징 신호; 및
- 관심 유전자
를 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는
- 큐티박테리움 아크네스 파지 캡시드에 DNA 벡터의 패키징을 허용하는 파지 패키징 신호;
- 관심 유전자; 및
- 큐티박테리움 아크네스에서 DNA 벡터의 선택을 허용하는 선택 마커
를 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는
- 큐티박테리움 아크네스 파지 캡시드로 DNA 벡터의 패키징을 허용하는 파지 패키징 신호로서, 파지 패키징 신호 서열은 서열 SEQ ID NO: 76과 적어도 80, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 97, 98, 99, 또는 100% 동일한 것인 파지 패키징 신호;
- 관심 유전자; 및
- 큐티박테리움 아크네스에서 DNA 벡터의 선택을 허용하는 선택 마커
를 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는
- 큐티박테리움 아크네스 파지 캡시드에 DNA 벡터의 패키징을 허용하는 파지 패키징 신호;
- 관심 유전자;
- 큐티박테리움 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원; 및
- 임의로 큐티박테리움 아크네스에서 DNA의 선택을 허용하는 선택 마커
를 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는
- 큐티박테리움 아크네스 파지 캡시드에 DNA 벡터의 패키징을 허용하는 파지 패키징 신호로서, 파지 패키징 신호 서열은 서열 SEQ ID NO: 76과 적어도 80, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 97, 98, 99, 또는 100% 동일한 것인 파지 패키징 신호;
- 관심 유전자;
- 큐티박테리움 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원; 및
- 임의로 큐티박테리움 아크네스에서 DNA 벡터의 선택을 허용하는 선택 마커
를 포함한다.
일 구현예에서, 파지 패키징 신호 서열은 서열 SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, 및 SEQ ID NO: 90으로 이루어진 군으로부터 선택되는 파지 패키징 신호 서열과 적어도 80, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 97, 98, 99, 또는 100% 동일하다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 씨. 아크네스 파지 복제 기원을 더 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 씨. 아크네스 파지 복제 기원을 더 포함하고, 파지 복제 기원 서열은 서열 SEQ ID NO: 67과 적어도 75, 77, 80, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일하다.
일 구현예에서, 관심 유전자는 항원을 코딩하는 DNA이다.
본 발명은 재조합 DNA 벡터를 함유하는 큐티박테리움 아크네스 파지-유래 입자의 생산을 위해 재조합 DNA 벡터를 보유하는 큐티박테리움 아크네스 생산자 세포를 포괄한다.
DNA 벡터는 전형적으로 큐티박테리움 아크네스 파지 게놈 또는 헬퍼 파지로부터 생산된 단백질에 패키징된다. 씨. 아크네스 파지 게놈은 예를 들어 씨. 아크네스 파지를 사용한 형질전환 또는 형질도입을 통해서, 씨. 아크네스 생산자 세포에 도입될 수 있는데 반해서 헬퍼 파지는, 예를 들어, 씨. 아크네스 생산자 세포로 DNA 벡터의 도입 이전 또는 이후에 형질전환 또는 접합을 통해서, 씨. 아크네스 생산자 세포에 도입될 수 있다 (도 1).
재조합 DNA 벡터를 보유하는 큐티박테리움 아크네스 생산자 세포는 전형적으로 큐티박테리움 아크네스 파지 게놈을 포함하여서 DNA 벡터를 보유하는 파지-유래 입자의 생산을 일으킨다.
일 구현예에서, 큐티박테리움 아크네스 파지 게놈은 비-조작/야생형 게놈이다.
다른 구현예에서, 큐티박테리움 아크네스 파지 게놈은 조작된다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 큐티박테리움 아크네스 수용자 세포가 아닌 큐티박테리움 아크네스 생산자 세포에서만 복제될 수 있는 복제 기원을 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는
- 큐티박테리움 아크네스 파지 캡시드에 DNA 벡터의 패키징을 허용하는 파지 패키징 신호;
- 적어도 하나의 관심 유전자;
- 오직 큐티박테리움 아크네스 생산자 세포에서만 복제를 허용하는 복제 기원; 및
- 임의로 큐티박테리움 아크네스에서 DNA 벡터의 선택을 허용하는 선택 마커
를 포함한다.
일 구현예에서, 선택 마커는 영양요구성 마커이고, 큐티박테리움 아크네스 생산자 세포 성장은 이러한 영양요구성 마커에 의존한다.
일 구현예에서, 선택 마커는 항생제 내성 마커이다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 CRISPR-Cas 시스템을 더 포함한다.
일 구현예에서, CRISPR-Cas 시스템은 씨. 아크네스 염색체 유전자좌를 표적화한다. 바람직하게, 표적화된 유전자좌는 씨. 아크네스 생산자 세포에 존재하지 않는다. 바람직하게, CRISPR-Cas 시스템 유래 CRISPR 어레이는 염색체 유전자좌를 표적화하는 하나 또는 몇 개의 crRNA를 발현한다.
일 구현예에서, CRISPR-Cas 시스템은 몇개의 씨. 아크네스 염색체 유전자좌를 표적화한다. 바람직하게, 표적화된 유전자좌는 씨. 아크네스 생산자 세포에 존재하지 않는다. 바람직하게, CRISPR-Cas 시스템 유래의 CRISPR 어레이는 염색체 유전자좌를 표적화하는 하나 또는 몇 개의 crRNA를 발현한다.
일 구현예에서, CRISPR-Cas 시스템은 씨. 아크네스 플라스미드 유전자좌를 표적화한다. 바람직하게, 표적화된 유전자좌는 씨. 아크네스 생산자 세포에 존재하지 않는다. 바람직하게, CRISPR-Cas 시스템 유래의 CRISPR 어레이는 플라스미드 유전자좌를 표적화하는 하나 또는 몇 개의 crRNA를 발현한다.
일 구현예에서, CRISPR-Cas 시스템은 몇개의 씨. 아크네스 플라스미드 유전자좌를 표적화한다. 바람직하게, 표적화된 유전자좌는 씨. 아크네스 생산자 세포에 존재하지 않는다. 바람직하게, CRISPR-Cas 시스템 유래의 CRISPR 어레이는 플라스미드 유전자좌를 표적화하는 하나 또는 몇 개의 crRNA를 발현한다.
일 구현예에서, CRISPR-Cas 시스템은 씨. 아크네스 생산자 세포에서 발현되지 않는다. 바람직하게 CRISPR-Cas 시스템은 씨. 아크네스 생산자 세포에서 억제된다.
일 구현예에서, CRISPR-Cas 시스템은 숙주 질환과 관련된 프로염증성 서열을 표적화한다.
일 구현예에서, CRISPR-Cas 시스템은 심상성 좌창과 관련된 프로염증성 서열을 표적화한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 DNA 벡터 자체를 표적화하는 CRISPR-Cas 시스템을 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 씨. 아크네스 파지에서 상동성 재조합을 위한 주형을 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 씨. 아크네스 염색체에서 상동성 재조합을 위한 주형을 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 씨. 아크네스 내생성 플라스미드에서 상동성 재조합을 위한 주형을 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 상동성 재조합을 위한 주형 및 주형 영역의 외부에서 DNA 벡터 자체를 표적화하는 CRISPR-Cas 시스템을 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 상동성 재조합을 위한 주형 및 주형 영역 외부에서 DNA 벡터 자체를 표적화하는 CRISPR-Cas 시스템을 포함하고, CRISPR-Cas 시스템 유래 RNA 가이드 (crRNA 또는 sgRNA)는 DNA 표적과 완벽하게 일치하지 않는다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 인테그라제 유전자 발현 카세트, 및 염색체 내부에서 DNA 벡터의 통합을 허용하는 부위 특이적 재조합 부위를 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 프라임 편집자 유전자 발현 카세트 및 하나 또는 다수의 pegRNA를 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 염기 편집자 유전자 발현 카세트 및 하나 또는 다수의 crRNA 또는 sgRNA를 포함한다.
일 구현예에서, 선택 마커는 catA 이다.
일 구현예에서, 선택 마커는 ermE 이다.
일 구현예에서, 선택 마커는 hygB 이다.
본 발명은 본 발명의 임의의 DNA 벡터를 포함하는 씨. 아크네스 파지-유래 입자를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 임의의 DNA 벡터를 포함하는, 씨. 아크네스, 특히 조작된 씨. 아크네스를 포괄한다.
특정 구현예에서, 조작된 씨. 아크네스는 적어도 하나, 2개, 3개 또는 그 이상의 DNA 벡터, 특히 본 발명의 DNA 벡터를 포함한다.
특정 구현예에서, 조작된 씨. 아크네스는 항원을 코딩하는 DNA를 포함하는 본 발명의 DNA 벡터를 포함한다.
본 발명은 파지-유래 입자에 의한 본 발명의 임의 벡터의 형질도입 이후에 조작된 씨. 아크네스를 포괄한다.
본 발명은 본 발명의 임의의 벡터를 함유하는 파지-유래 입자에 의한 형질도입 이후에 그의 게놈이 변경된 조작된 씨. 아크네스를 포괄한다.
본 발명은 씨. 아크네스를 본 발명의 임의 벡터로 형질도입시키는 단계, 벡터가 보유한 관심 유전자로 씨. 아크네스를 변형시키는 단계, 변형에 대해 선택하는 단계를 통해서 생산된 조작된 씨. 아크네스를 포괄한다.
본 발명은 씨. 아크네스를 본 발명의 임의 벡터로 형질도입시키는 단계, 벡터가 보유하는 관심 유전자로 씨. 아크네스를 변형시키는 단계, 변형에 대해 선택하는 단계, 및 조작된 씨. 아크네스에서 벡터를 소실시키는 단계를 통해서 생산된 조작된 씨. 아크네스를 포괄한다.
일 구현예에서, 조작된 씨. 아크네스는 벡터에 의해 보유된 CRISPR-Cas 시스템에 의해 변형되었고 본 발명의 임의 벡터를 함유하는 파지-유래 입자에 의해 형질도입된 것이다.
일 구현예에서, 조작된 씨. 아크네스는 씨. 아크네스 염색체에 외생성 유전자의 삽입을 통해 변형된 것이다.
일 구현예에서, 조작된 씨. 아크네스는 씨. 아크네스 플라스미드에 외생성 유전자의 삽입에 의해 변형된 것이다.
일 구현예에서, 조작된 씨. 아크네스는 씨. 아크네스 염색체의 내생성 유전자 서열의 결실 또는 돌연변이를 통해서 변형된 것이다.
일 구현예에서, 조작된 씨. 아크네스는 씨. 아크네스 염색체로 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드의 결실, 삽입 또는 치환을 통해서 변형된 것이다.
일 구현예에서, 조작된 씨. 아크네스는 씨. 아크네스 플라스미드에 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드의 결실, 삽입 또는 치환을 통해서 변형된 것이다.
본 발명은 씨. 아크네스 생산자 세포에 본 발명의 임의의 DNA 벡터의 도입 단계, 및 씨. 아크네스 파지 게놈과 접촉시키는 단계를 포함하는, 본 발명의 임의 벡터를 함유하는 씨. 아크네스 파지-유래 입자를 제조하기 위한 방법을 포괄한다.
본 발명은 씨. 아크네스에 본 발명의 임의의 DNA 벡터의 도입 단계를 포함하는 씨. 아크네스를 조작하기 위한 방법을 포괄한다. 방법은 변형된 씨. 아크네스를 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 씨. 아크네스 염색체 또는 내생성 플라스미드에 외생성 유전자의 삽입을 갖는 변형된 씨. 아크네스를 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 씨. 아크네스 염색체 또는 내생성 플라스미드에 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드의 하나 또는 몇 개 결실, 삽입 또는 치환을 갖는 변형된 씨. 아크네스를 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 임의의 방법을 통해서 생산된 파지-유래 입자를 포괄한다.
본 발명은 씨. 아크네스-관련 장애 또는 질환을 치료하기 위한 방법을 포괄한다. 일 구현예에서, 방법은 본 발명의 파지-유래 입자 또는 이러한 파지-유래 입자를 생산하는 박테리아를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 씨. 아크네스-관련 장애 또는 질환을 치료하기 위한 방법에서 사용을 위한 본 발명의 파지-유래 입자 또는 이러한 파지 유래 입자를 생산하는 박테리아에 관한 것이다.
본 발명은 장애 또는 질환 또는 피부 병태를 치료하기 위해서 또는 미용적 적용을 위해서 씨. 아크네스를 변형시키기 위한 방법을 포괄한다. 일 구현예에서, 방법은 본 발명의 파지-유래 입자 또는 이러한 파지-유래 입자를 생산하는 박테리아를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 장애 또는 질환 또는 피부 병태를 치료하기 위한 방법에서 사용을 위한 본 발명의 파지-유래 입자 또는 이러한 파지-유래 입자를 생산하는 박테리아에 관한 것이다.
일 구현예에서, 방법은 원위치 외에서 수행된다.
일 구현예에서, 방법은 원위치에서 수행된다.
일 구현예에서, 방법은 대상체로부터 단리된 씨. 아크네스 균주를 사용하여 원위치 외에서 수행된다.
본 명세서에 개시된 주제를 더욱 잘 이해하고 실제로 수행할 수 있는 방법을 예시하기 위해서, 구현예는 첨부된 도면을 참조하여, 비제한적인 예로서 설명될 것이다. 도면을 특별히 참조하여, 도시된 특정 사항은 예로서, 본 발명의 구현예의 예시적인 논의의 목적을 위한 것임을 강조한다.
도 1 은 씨. 아크네스 파지에 의해 감염된 패키징 신호 및 이식유전자를 갖는 DNA 벡터를 보유하는 씨. 아크네스 생산자 세포, 이어서 DNA 벡터를 보유하는 파지-유래 입자가 생산되고 씨. 아크네스 수용자 세포에 결합 시 복제되고 이식유전자 발현을 일으키는 DNA 벡터가 형질도입되는 것을 도시한다. 대안적으로, 씨. 아크네스 생산자는 파지에 의해 감염되지 않지만 파지-유래 입자 생산을 촉발하도록 유도되는 헬퍼 파지를 보유한다.
도 2 는 단리된 씨. 아크네스 박테리오파지의 숙주 범위 결정을 도시한다. 1 은 완전한 반점 용해의 균주 감염을 의미하고; 0.5 는 완전한 반점 용해 대신에 단일 플라크가 관찰되는 균주 감염의 보다 낮은 효율을 의미한다.
도 3 은 겔을 도시한다. 파지-유래 입자 적정으로부터의 개별 콜로니를 스트리킹하였고 개별 콜로니에 대한 PCR을 프라이머 IC208 (SEQ ID NO: 99)/IC310 (SEQ ID NO: 100)을 사용해 수행하여서 파지미드의 존재를 확인하였다. 1 및 2는 동일한 파지미드를 보유하는 파지-유래 입자의 독립적인 생산 및 적정으로부터 생성되는 형질도입체를 의미한다. B 및 W는 파지미드 추출물 (양성 대조군) 및 ATCC 11828 균주 (음성 대조군)에 대한 개별 PCR이다. 재스트리킹 이후에 플라스미드의 존재는 형질도입체가 복제성 파지미드를 보유한다는 것을 확인시켜준다.
도 4 는 재조합 주형을 보유하는 비-복제성 벡터를 사용하여 씨. 아크네스 게놈을 조작하기 위한 방법을 도시한다. 도 4A 는 씨. 아크네스에 접합되는 씨. 아크네스 염색체에 대한 단일 상동성 팔부 (HA)를 함유하는 벡터 (pEB_HR01)를 도시한다. 벡터가 씨. 아크네스에서 복제성이 아니기 때문에, 단일 재조합 사건을 수행하는 씨. 아크네스 세포만이 항생제 마커를 안정하게 유지하여서 항생제 플레이트 상에서 성장할 수 있다. 제1 재조합 사건을 수행하지 않은 세포 또는 제1 및 제2 재조합 사건을 수행한 세포는 항생제 플레이트 (에리쓰로마이신) 상에서 성장할 수 없다. 도 4B 는 씨. 아크네스에 접합되는 씨. 아크네스 염색체에 대한 2개 상동성 팔부를 함유하는 벡터 (pEB_HR02)를 도시한다. 최종 재조합체의 선택은 항생제 선택 (ErmE) 및 역 선택 (SacB)을 사용해 수행된다.
도 5 는 재조합 주형을 보유하는 복제성 CRISPR-Cas 시스템 선택 벡터를 사용하여 씨. 아크네스 게놈을 조작하기 위한 방법을 도시한다. 염색체와 상동성 DNA 재조합을 위한 주형을 함유하는 복제성 CRISPR-Cas 시스템 선택 벡터는 씨. 아크네스에 접합된다. 주형은 2개 상동성 팔부 (LHA 및 RHA)를 함유하여서 씨. 아크네스 염색체에서 상동성 재조합 및 CRISPR-Cas 시스템의 표적 서열의 제거를 일으킨다. 따라서, 오직 재조합체 씨. 아크네스만이 CRISPR-Cas 시스템을 발현하는 벡터의 존재에 대해서 선택될 때 에리쓰로마이신의 존재 하에서 성장할 수 있다.
도 6 은 CRISPR-Cas 시스템 및 재조합 주형을 보유하는 자기-표적화된 복제성 벡터를 사용하여 씨. 아크네스 게놈을 조작하기 위한 방법을 도시한다. 도 6A 는 씨. 아크네스에 접합되는, 2개 상동성 팔부가 측접된 항생제 선택 마커 및 상동성 영역 외부에서 벡터를 표적화하는 CRISPR-Cas 시스템을 함유하는 벡터를 도시한다. CRISPR-Cas 시스템은 벡터를 절단하여 주형의 선형화 및 플라스미드 상실을 일으킨다. 따라서, 오직 조합체 세포만이 항생제의 존재 하에서 성장할 수 있다. 도 6B 는 씨. 아크네스에 접합되는, 2개 상동성 팔부가 측접된 돌연변이체 대립유전자 및 상동성 영역 외부에서 벡터를 표적화하는 CRISPR-Cas 시스템을 비롯하여 씨. 아크네스 염색체의 비-돌연변이된 대립유전자를 함유하는 벡터를 도시한다. CRISPR-Cas 시스템은 벡터를 절단하여서 씨. 아크네스 염색체뿐만 아니라 플라스미드 상실 및 주형의 선형화를 일으킨다. 따라서, 오직 재조합체 세포만이 에리쓰로마이신의 존재 하에서 성장할 수 있다.
도 7 은 CRISPR-Cas 시스템을 사용한 씨. 아크네스 파지의 조작 및 선택을 위한 2-단계 방법을 도시한다. 도 7A 는 방법의 제1 단계를 도시한다. 제1 단계는 재조합 주형을 갖는 플라스미드를 함유하는 균주 (씨. 아크네스 pEB-PRECOMB)를 제1 파지 (wt PAC7)로 감염시켜서 돌연변이체 파지 (mt PAC7)를 생성시키는 것으로 이루어진다. 재조합 주형은 돌연변이체 대립유전자에 측접하는 좌측 상동성 팔부 (LHA) 및 우측 상동성 팔부 (RHA)를 함유한다. 2개 상동성 팔부는 플라스미드 (pEB-PRECOMB) 및 파지 게놈 간 생체내 재조합을 구동시킨다. 감염으로 수득된 현탁물은 초기 파지 (wt PAC7) 및 신규 돌연변이된 파지 (mt PAC7)의 혼합물을 함유한다. 도 7B 는 방법의 제2 단계를 도시한다. 양쪽 파지 입자 간에 선택을 위해서, 현탁물은 오직 wt PAC7 파지만을 표적화하고 mt PAC7 은 표적화하지 않는 CRISPR-Cas 시스템을 발현하는 플라스미드를 함유하는 씨. 아크네스 균주 (씨. 아크네스 pEB-PSCREEN)와 접촉된다. 그러므로, 씨. 아크네스 pEB-PSCREEN의 감염의 mt PAC7의 선택적 복제를 일으킨다.
도 8 은 상이한 크기의 파지 패키징 신호 (cos)를 갖는 DNA 벡터를 보유하는 파지-유래 입자의 씨. 아크네스 형질도입체를 도시한다. 역시 파지를 함유하는, 파지-유래 입자의 각 현탁물을 씨. 아크네스 ATCC 11828 위용원성과 혼합하였고, 혼합물을 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였고, 희석하고 4 μL의 각 희석물을 에리쓰로마이신 (5 μg/mL) 존재 하에 브루셀라 플레이트 상에 도말하였다. 동일한 DNA 벡터를 함유하는 각각의 파지-유래 입자 경우에, 독립 생산으로부터의 2개 현탁물을 사용하였다 (예를 들어, pIC400.1 및 pIC400.2).
도 9 는 씨. 아크네스 ATCC 11828 wt, pIC238 (Ca0s18233)을 보유하는 씨. 아크네스 ATCC 11828 및 pIC240 (Ca0s18234)를 보유하는 씨. 아크네스 ATCC 11828에 대해서, Sup-253이라고 하는, 편집/표적화 벡터 pIC253 (Ca0s18206)를 보유하는 씨. 아크네스 감염 후 수득된 상청액의 적정을 도시한다. 균주 씨. 아크네스 ATCC 11828은 야생형 파지 PAC7 및 상동성 재조합으로 수득된 임의 돌연변이체 파지에 대해 감수성이다. 균주 Ca0s18233은 야생형 파지 PAC7에 내성이고, pIC253 주형과 상동성 재조합으로 수득된 돌연변이체 파지에 대해 감수성이다. 균주 Ca0s18234 는 야생형 파지 PAC7에 대해 내성이고, pIC253과 상동성 재조합으로 수득된 돌연변이체 파지에 대해 내성이다.
도 10 은 씨. 아크네스 ATCC 11828 wt, pIC240 (Ca0s18234)을 보유하는 씨. 아크네스 ATCC 11828 및 pIC238 (Ca0s18233)을 보유하는 씨. 아크네스 ATCC 11828에 대해서, Sup-257이라고 하는, 편집/표적화 벡터 pIC257 (Ca0s18208)를 보유한 씨. 아크네스 감염 후 수득된 상청액의 적정을 도시한다. 균주 씨. 아크네스 ATCC 11828 은 야생형 파지 PAC7 및 상동성 재조합으로 수득된 임의 돌연변이체 파지 둘 모두에 대해 감수성이다. 균주 Ca0s18234 는 야생형 파지 PAC7에 내성이고, pIC257과 상동성 재조합으로 수득된 돌연변이체 파지에 대해 감수성이다. 균주 Ca0s18233 은 야생형 파지 PAC7 에 내성이고, pIC257과 상동성 재조합으로 수득된 돌연변이체 파지에 대해 내성이다.
도 11 은 씨. 아크네스 ATCC 11828 wt 및 pIC238 (Ca0s18233)을 보유하는 씨. 아크네스 ATCC 11828에 대해서, Sup-350이라고 하는, 편집 pIC350 (Ca0s18379)을 보유하는 씨. 아크네스 감염 후 수득된 상청액의 적정을 도시한다. 균주 씨. 아크네스 ATCC 11828 은 야생형 파지 PAC7 및 pIC350과 상동성 재조합으로 수득된 돌연변이체 파지 둘 모두에 대해 감수성이다. 균주 Ca0s18233 은 야생형 파지 PAC7 에 대해 내성이고, pIC350과 상동성 재조합으로 수득된 돌연변이체 파지에 대해 감수성이다.
도 12 는 씨. 아크네스 ATCC 11828 wt 및 pIC238 (Ca0s18233)을 보유하는 씨. 아크네스 ATCC 11828에 대해서, Sup-351이라고 하는, 편집 pIC351 (Ca0s18381)을 보유하는 씨. 아크네스 감염 후 수득된 상청액의 적정을 도시한다. 균주 씨. 아크네스 ATCC 11828 은 야생형 파지 PAC7 및 pIC351과 상동성 재조합으로 수득된 돌연변이체 파지 둘 모두에 대해 감수성이다. 균주 Ca0s18233 은 야생형 파지 PAC7 및 pIC351과 상동성 재조합으로 수득된 돌연변이체 파지 둘 모두에 대해 내성이다.
도 13 은 씨. 아크네스 파지 게놈 구성을 도시한다. 5개 상이한 영역은 다양한 기능: 패키징, 헤드부 조립, 꼬리부 조립, 용해, DNA 복제 (Brown et al28)에 관여되는 상이한 단백질을 코딩한다.
도 14 (AB) 는 1/10로 희석된 상이한 씨. 아크네스 배양 상청액 중 닭 오브알부민 (OVA) 단백질의 존재에 대한 ELISA로부터의 흡광도 값을 도시한다. 도 14A도 14B 는 2개 독립 복제물을 나타낸다. 막대 그래프는 동일한 상청액 배양물의 3개 기술적 복제물의 평균을 나타낸다. 씨. 아크네스 균주 ATCC 11828 (WT)이 음성 대조군으로서 사용되었다.
도 15 은 오브알부민을 분비하도록 조작된 상이한 씨. 아크네스 균주로부터의 배양 상청액에 대한 오브알부민 특이적 웨스턴 블롯을 도시한다. 좌측에서 우측으로: (1) Pageruler 래더, (2) 균주 Ca0s22120 유래 상청액, (3) 균주 Ca0s22122 유래 상청액, (4) 균주 Ca0s22126 유래 상청액, (5) 균주 Ca0s22128 유래 상청액, (6) 균주 Ca0s22130 유래 상청액, (7) 균주 Ca0s22132 유래 상청액, (8) 균주 Ca0s16973 유래 상청액, (9) 오브알부민.
도 16 은 겔을 도시한다. 좌측의 첫번째 웰 (1)은 GeneRuler 1 kb DNA 래더에 상응한다. 다른 웰은 프라이머 IC443/IC290를 사용해 플라크에 대해 사용된 PCR에 상응한다. 좌측에서 우측으로: (2) 균주 Ca0s20472의 론 + 감염된 Ca0s20855의 현탁물로부터의 플라크 nº5, (3) 균주 Ca0s20472의 론 + 감염된 Ca0s20855의 현탁물으로부터의 플라크 nº7, (4) 균주 Ca0s20472의 론 + PAC7의 현탁물로부터의 플라크 nº1, (5) 균주 Ca0s20472의 론 + PAC7의 현탁물로부터의 플라크 nº2, (6)균주 Ca0s20472의 론 + 감염된 Ca0s20857의 현탁물로부터의 플라크 nº3, (7) 균주 Ca0s20472의 론 + PAC7의 현탁물로부터의 플라크 nº3.
도 17 은 겔을 도시한다. 좌측의 첫번째 웰 (1)은 GeneRuler 1 kb DNA 래더에 상응한다. 다른 웰은 프라이머 IC619/AL219를 사용한 PCR에 상응한다. 좌측에서 우측으로: (웰 2-8) 플라크 nº28로부터 단리된 7개 플라크, (웰 9-15) 플라크 nº28로부터 단리된 7개 플라크, (웰 16) wt PAC7에 대한 PCR (양성 대조군), (웰 17) Ca0s22235의 론에 대한 음성 대조군.
도 18 은 PAC7 wt 게놈 (SEQ ID NO: 113) 및 프라이머 IC619 (SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 114)를 사용하여 PAC7-m28-gp45로부터 단리된 3개 상이한 플라크의 시퀀싱 간 DNA 정렬. 정렬은 Clustal Omega (Sievers, F. et al. Mol Syst Biol 7, 539-539 (2011))를 사용해 수행되었다.
본 발명자는 파지-유래 입자에 의한 형질도입에 의한 씨. 아크네스에서 재조합체 복제성 DNA의 도입을 최초로 입증하였다.
본 발명자는 또한 재조합체 자기-복제성 DNA 벡터를 보유하는, 씨. 아크네스 균주로부터의 씨. 아크네스 파지-유래 입자의 생산을 최초로 입증하였다.
본 발명은 파지 패키징 신호 및 관심 유전자를 포함하는 DNA 벡터를 보유하는 씨. 아크네스 균주, DNA 벡터를 함유하는 파지-유래 입자의 생산, 및 씨. 아크네스를 시험관내 또는 원위치에서 형질도입시키고 형질도입된 씨. 아크네스 세포에서 관심 유전자의 후속 발현을 위한 이러한 파지-유래 입자의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 파지-유래 입자에 의한 DNA 벡터의 형질도입을 통해서 수득된 변형된 씨. 아크네스 균주, DNA 벡터를 함유하거나 또는 그렇지 않은 변형된 씨. 아크네스 균주에 관한 것이다.
씨. 아크네스 파지는 천연적으로 인간 피부에 존재하고 1964년 최초로 단리된 이래로 여러번 단리되었다. 보다 최근에, 씨. 아크네스 파지의 시퀀싱은 ∼85% 동일성으로 흔치않게 높은 수준의 뉴클레오티드 보존성을 밝혀주었다. 지금까지 기술된 모든 씨. 아크네스 파지는 시포비리다에 (siphoviridae)로서 대략 30 kb의 게놈 크기 제한 및 유사한 게놈 구조를 갖는다. 그들의 작은 유전적 다양성에도 불구하고, 대부분의 씨. 아크네스 파지는 몇개의 씨. 아크네스 계통형을 감염시키는 능력을 가지며, 따라서 광범위-숙주 범위로서 간주된다. 그들의 원위치 감염성 및 그들의 광범위 숙주 범위는 그들을 씨. 아크네스 개체군으로 이식유전자 전달을 위해 조작하려는 관련 플랫폼으로 만든다.
본 발명자는 파지-유래 입자가 씨. 아크네스 세포 ("생산자 세포")에서 패키징 신호를 갖는 재조합 DNA 벡터 및 야생형 또는 조작된 씨. 아크네스 파지 게놈의 동시-발생으로부터 생산될 수 있다는 것을 최초로 보여준다. 파지-유래 입자는 "수용자" 씨. 아크네스 세포로 DNA 벡터를 형질도입시킬 수 있고 형질도입체의 선택을 허용하는 항생제 내성 유전자 같은 이식유전자를 발현할 수 있다. 이것은 피부 상에서 씨. 아크네스 개체군을 직접적으로 조작할 가능성을 광범위하게 확장시켜서, 많은 적용 (산업, 치료, 미용, 환경)을 위한 길을 열어준다. 본 발명은 DNA 벡터, 특히 파지미드를 보유하는 씨. 아크네스 "생산자" 세포, 및 파지-유래 입자를 생성시키는 방법 및 씨. 아크네스를 변형 또는 사멸시키기 위한 그들 용도를 포괄한다.
DNA 벡터
본 발명은 큐티박테리움 아크네스에서 사용을 위한 재조합 DNA 벡터를 포괄한다. 바람직하게, DNA 벡터는 씨. 아크네스 염색체에 통합되지 않은, 재조합 DNA 벡터이다. 벡터는 자손 세포로 전달을 허용한다. 벡터는 바람직하게 파지미드이다. DNA 벡터는 바람직하게 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원 및 파지 패키징 신호를 포함한다.
다양한 구현예에서, DNA 벡터는 파지 패키징 신호, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원, 씨. 아크네스에서 DNA 벡터의 선택을 허용하는 선택 마커, 관심 유전자, 및 씨. 아크네스 수용자 세포에서 복제가 아닌 씨. 아크네스 생산자 세포에서 복제를 허용하는 복제 기원의 임의 조합을 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 파지 패키징 신호, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원, 씨. 아크네스에서 DNA 벡터의 선택을 허용하는 제1 선택 마커 및 관심 유전자를 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 파지 패키징 신호, 씨. 아크네스 수용자 세포에서 복제가 아닌 씨. 아크네스 생산자 세포에서 복제를 허용하는 복제 기원, 씨. 아크네스에서 DNA 벡터의 선택을 허용하는 제1 선택 마커 및 관심 유전자를 포함한다.
바람직하게, 관심 유전자는 씨. 아크네스에 대해 외생성이고, 다시 말해서, 씨. 아크네스에서 천연적으로 발견되지 않는 것이다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 파지 패키징 신호로서, 파지 패키징 신호 서열이 서열 SEQ ID NO: 76과 적어도 80, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 97, 98, 99, 또는 100% 동일한 것인 파지 패키징 신호; 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원; 씨. 아크네스에서 DNA 벡터의 선택을 허용하는 선택 마커; 및 관심 유전자를 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 파지 패키징 신호로서, 파지 패키징 신호 서열이 서열 SEQ ID NO: 76과 적어도 80, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 97, 98, 99, 또는 100% 동일한 것인 파지 패키징 신호; 씨. 아크네스 또는 밀접하게 관련된 종에서 복제를 허용하는 복제 기원; 씨. 아크네스에서 DNA 벡터의 선택을 허용하는 선택 마커; 및 관심 유전자를 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 파지 패키징 신호로서, 파지 패키징 신호 서열이 서열 SEQ ID NO: 76과 적어도 80, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 97, 98, 99, 또는 100% 동일한 것인 파지 패키징 신호; 씨. 아크네스 또는 밀접하게 관련된 종에서 복제를 허용하는 복제 기원; 씨. 아크네스에서 DNA 벡터의 선택을 허용하는 선택 마커; 제1 박테리아에서 선택을 허용하는 선택 마커로서, 제1 박테리아는 이. 콜라이 (E. coli) 인 것인 선택 마커; 제1 박테리아에서 복제를 허용하는 복제 기원으로서, 제1 박테리아는 이. 콜라이인 것인 복제 기원; 및 관심 유전자를 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 전기천공을 사용하거나, 원형질체 전기천공을 사용하거나, 화학적 형질전환을 사용하거나, 접합을 사용하거나, 자연 능력을 사용하거나 또는 형질도입을 사용하여 씨. 아크네스 생산자 세포에 효율적으로 도입될 수 있고 안정하게 복제될 수 있다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 물리적 방법 예컨대 씨. 아크네스 세포의 전기천공 또는 씨. 아크네스 원형질체의 전기천공을 사용하여 씨. 아크네스 생산자 세포에 효율적으로 형질전환될 수 있고 거기서 안정하게 복제될 수 있다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 원형질체는 뮤타노리신 처리 또는 리소자임 처리, 뮤타노리신 및 리소자임 처리, 또는 뮤타노리신 및 리소자임 및 비드-비팅 처리에 이어서 저장성 배지에 재현탁을 사용하여 생성된다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 DNA 벡터 또는 DNA 벡터 + 유리 비드와 씨. 아크네스 원형질체 믹스를 사용하여 씨. 아크네스 생산자 세포에 효율적으로 형질전환될 수 있고 거기서 안정하게 복제될 수 있다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스에 DNA 벡터의 전달은 형질도입에 의한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 하기 씨. 아크네스 파지의 패키징 신호로 이루어진 군으로부터 선택되고: PAC7 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 68); PAC1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 69); PAC9 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 70); PAC2 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 71); PAC10 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 72); PAC22 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 73); PAC13 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 74); 및 PAC263 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 75), 씨. 아크네스로 DNA 벡터의 형질도입을 허용하는, PAC7 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 68); PAC1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 69); PAC9 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 70); PAC2 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 71); PAC10 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 72); PAC22 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 73); PAC13 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 74); 및 PAC263 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 75)의 파지로 이루어진 군으로부터 선택되는 씨. 아크네스 파지의 게놈으로부터 발현되는 단백질에 패키징된다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 패키징 신호를 포함하고, 이의 서열은 임의의 상기 패키징 신호의 서열과 적어도 80, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 97, 98, 99, 또는 100% 동일하다.
일 구현예에서, 파지 패키징 신호는 SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89 및 SEQ ID NO: 90로 이루어진 군으로부터 선택되는 파지 패키징 신호 서열과 적어도 80, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 97, 98, 99, 또는 100% 동일한 서열이다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스로 DNA 벡터의 전달은 접합에 의한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 oriT_pMRC01 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 1); oriT_RSF1010 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 2); oriT_pRS01 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 3); oriT_pMV158 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 4); oriT_pTF1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 5); oriT_pSC101 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 6); oriT_pBTK445 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 7); oriT_pBBR1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 8); oriT_R721 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 9); oriT_pRmeGR4a (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 10); oriT_ColE1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 11); oriT_pTiC58 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 12); oriT_pMdT1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 13); oriT_R1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 14); oriT_Tn5520 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 15); oriT_QKH54 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 16); oriT_R64 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 17); oriT_R751 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 18); oriT_RP4 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 19); oriT_pKL1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 20); oriT_RK2 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 21); oriT_R1162 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 22); oriT_Tn4555 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 23); oriT_pHT (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 24); oriT_Tn4399 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 25); oriT_Tn916 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 26); oriT_pST12 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 27); oriT_pCU1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 28); oriT_pSU233 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 29); oriT_F (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 30); oriT_pMAB01 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 31); oriT_R388 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 32); oriT_pS7a (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 33); oriT_pS7b (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 34); oriT_R702 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 35); oriT_pMUR274 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 36); oriT_R100 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 37); oriT_pVCR94deltaX (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 38); oriT_R46 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 39); oriT_pGO1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 40); 및 oriT_pIP501 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 41)로 이루어진 군으로부터 선택되는 전달 기원을 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pMRC01 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 1)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_RSF1010 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 2)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pRS01 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 3)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pMV158 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 4)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pTF1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 5)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pSC101 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 6)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pBTK445 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 7)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pBBR1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 8)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_R721 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 9)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pRmeGR4a (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 10)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_ColE1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 11)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pTiC58 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 12)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pMdT1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 13)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_R1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 14)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_Tn5520 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 15)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_QKH54 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 16)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_R64 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 17)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_R751 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 18)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_RP4 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 19)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pKL1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 20)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_RK2 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 21)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_R1162 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 22)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_Tn4555 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 23)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pHT (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 24)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_Tn4399 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 25)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_Tn916 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 26)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pST12 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 27)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pCU1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 28)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pSU233 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 29)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_F (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 30)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pMAB01 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 31)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_R388 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 32)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pS7a (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 33)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pS7b (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 34)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_R702 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 35)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pMUR274 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 36)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_R100 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 37)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pVCR94deltaX (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 38)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_R46 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 39)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pGO1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 40)을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pIP501 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 41)을 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 (oriT)을 포함하고, 이의 서열은 임의의 상기 oriT의 서열과 적어도 80, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 97, 98, 99, 또는 100% 동일하다.
일 구현예에서, 도너 박테리아, 예컨대 이. 콜라이는 pMRC01, RSF1010, pRS01, pMV158, pTF1, pSC101, pBTK445, pBBR1, R721, pRmeGR4a, ColE1, pTiC58, pMdT1, R1, Tn5520, QKH54, R64, R751, RP4, pKL1, RK2, R1162, Tn4555, pHT, Tn4399, Tn916, pST12, pCU1, pSU233, F, pMAB01, R388, pS7a, pS7b, R702, pMUR274, R100, pVCR94deltaX, R46, pGO1 및 pIP501로 이루어진 군으로부터 선택되는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존, 또는 통합성 및 접합성 구성요소 (ICE)를 보유하고; DNA 벡터를 씨. 아크네스 수용자 세포에 효율적으로 전달하는데 사용된다. 일 구현예에서 DNA 벡터는 전달 기원, 및 pMRC01; RSF1010; pRS01; pMV158; pTF1; pSC101; pBTK445; pBBR1; R721; pRmeGR4a; ColE1; pTiC58; pMdT1; R1; Tn5520; QKH54; R64; R751; RP4; pKL1; RK2; R1162; Tn4555; pHT; Tn4399; Tn916; pST12; pCU1; pSU233; F; pMAB01; R388; pS7a; pS7b; R702; pMUR274; R100; pVCR94deltaX; R46; pGO1 및 pIP501로 이루어진 군으로부터 선택되는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 및 통합성 및 접합성 구성요소 (ICE)의 연관된 렐락사제를 함유한다.
바람직한 구현예에서 DNA 벡터는 전달 기원, 및 pMRC01; RSF1010; pRS01; pMV158; pTF1; pSC101; pBTK445; pBBR1; R721; pRmeGR4a; ColE1; pTiC58; pMdT1; R1; Tn5520; QKH54; R64; R751; RP4; pKL1; RK2; R1162; Tn4555; pHT; Tn4399; Tn916; pST12; pCU1; pSU233; F; pMAB01; R388; pS7a; pS7b; R702; pMUR274; R100; pVCR94deltaX; R46; pGO1 및 pIP501로 이루어진 군으로부터 선택되는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 및 통합성 및 접합성 구성요소 (ICE)의 렐락사제를 포함한다.
바람직한 구현예에서 DNA 벡터는 oriT_pMRC01 (SEQ ID NO: 1); oriT_RSF1010 (SEQ ID NO: 2); oriT_pRS01 (SEQ ID NO: 3); oriT_pMV158 (SEQ ID NO: 4); oriT_pTF1 (SEQ ID NO: 5); oriT_pSC101 (SEQ ID NO: 6); oriT_pBTK445 (SEQ ID NO: 7); oriT_pBBR1 (SEQ ID NO: 8); oriT_R721 (SEQ ID NO: 9); oriT_pRmeGR4a (SEQ ID NO: 10); oriT_ColE1 (SEQ ID NO: 11); oriT_pTiC58 (SEQ ID NO: 12); oriT_pMdT1 (SEQ ID NO: 13); oriT_R1 (SEQ ID NO: 14); oriT_Tn5520 (SEQ ID NO: 15); oriT_QKH54 (SEQ ID NO: 16); oriT_R64 (SEQ ID NO: 17); oriT_R751 (SEQ ID NO: 18); oriT_RP4 (SEQ ID NO: 19); oriT_pKL1 (SEQ ID NO: 20); oriT_RK2 (SEQ ID NO: 21); oriT_R1162 (SEQ ID NO: 22); oriT_Tn4555 (SEQ ID NO: 23); oriT_pHT (SEQ ID NO: 24); oriT_Tn4399 (SEQ ID NO: 25); oriT_Tn916 (SEQ ID NO: 26); oriT_pST12 (SEQ ID NO: 27); oriT_pCU1 (SEQ ID NO: 28); oriT_pSU233 (SEQ ID NO: 29); oriT_F (SEQ ID NO: 30); oriT_pMAB01 (SEQ ID NO: 31); oriT_R388 (SEQ ID NO: 32); oriT_pS7a (SEQ ID NO: 33); oriT_pS7b (SEQ ID NO: 34); oriT_R702 (SEQ ID NO: 35); oriT_pMUR274 (SEQ ID NO: 36); oriT_R100 (SEQ ID NO: 37); oriT_pVCR94deltaX (SEQ ID NO: 38); oriT_R46 (SEQ ID NO: 39); oriT_pGO1 (SEQ ID NO: 40) 및 oriT_pIP501 (SEQ ID NO: 41)로 이루어진 군으로부터 선택되는 전달 기원을 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 임의의 이들 ICE와 적어도 80, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 97, 98, 99, 또는 100% 동일한 전달 기원 (oriT)을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원, 씨. 아크네스에서 접합을 허용하는 oriT, 피전달접합체 씨. 아크네스에서 선택을 허용하는 선택 마커, 및 도너 박테리아에서 선택을 허용하는 선택 마커를 포함하는 DNA 벡터를 포괄한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원 및 상기 정의된 바와 같은 씨. 아크네스로 접합을 허용하는 oriT를 포함하는 DNA 벡터를 포괄한다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 R6K (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 42); RK2 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 43); pBBR1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 44); pRO1600 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 45); RSF1010 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 46); pAMβ1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 47); pLME106 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 48); pTZC1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 49); pBC1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 50); pEP2 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 51); pWVO1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 52); pAP1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 53); pWKS1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 54); pLME108 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 55); pLS1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 56); pUB6060 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 57); p545 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 58); pJD4 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 59); pIJ101 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 60); pSN22 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 61); pGP01 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 62); pIP501 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 63); pCU1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 64); 및 pBAV1K-T5 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 65)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 R6K (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 42)이다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 RK2 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 43)이다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pBBR1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 44)이다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pRO1600 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 45)이다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 RSF1010 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 46)이다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pAMβ1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 47)이다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pLME106 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 48)이다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pTZC1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 49)이다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pBC1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 50)이다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pEP2 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 51)이다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pWVO1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 52)이다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pAP1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 53)이다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pWKS1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 54)이다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pLME108 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 55)이다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pLS1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 56)이다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pUB6060 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 57)이다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 p545 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 58)이다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pJD4 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 59)이다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pIJ101 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 60)이다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pSN22 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 61)이다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pGP01 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 62)이다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pIP501 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 63)이다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pCU1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 64)이다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pBAV1K-T5 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 65)이다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원을 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 R6K (SEQ ID NO: 42); RK2 (SEQ ID NO: 43); pBBR1 (SEQ ID NO: 44); pRO1600 (SEQ ID NO: 45); RSF1010 (SEQ ID NO: 46); pAMβ1 (SEQ ID NO: 47); pLME106 (SEQ ID NO: 48); pTZC1 (SEQ ID NO: 49); pBC1 (SEQ ID NO: 50); pEP2 (SEQ ID NO: 51); pWVO1 (SEQ ID NO: 52); pAP1 (SEQ ID NO: 53); pWKS1 (SEQ ID NO: 54); pLME108 (SEQ ID NO: 55); pLS1 (SEQ ID NO: 56); pUB6060 (SEQ ID NO: 57); p545 (SEQ ID NO: 58); pJD4 (SEQ ID NO: 59); pIJ101 (SEQ ID NO: 60); pSN22 (SEQ ID NO: 61); pGP01 (SEQ ID NO: 62); pIP501 (SEQ ID NO: 63); pCU1 (SEQ ID NO: 64); 및 pBAV1K-T5 (SEQ ID NO: 65)로 이루어진 군으로부터 선택되는 복제 기원을 포함한다.
바람직하게, 복제 기원은 임의의 상기 복제 기원의 서열과 적어도 80, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 97, 98, 99, 또는 100% 동일한 서열이다.
다양한 구현예에서, 선택 마커는 ermE, catA, hygB, ermX, tetW, erm(50) 및 다른 높은 GC 항생제 내성 유전자로부터 선택된다. 일 구현예에서, 선택 마커는 ermE 가 아니다. 일 구현예에서, 선택 마커는 catA 이다. 일 구현예에서, 선택 마커는 hygB 이다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 CRISPR-Cas 시스템을 더 포함한다. 전형적으로, CRISPR-Cas 시스템은 CRISPR 어레이를 포함한다. 전형적으로, CRISPR-Cas 시스템은 RNA 가이드 (crRNA 또는 sgRNA)를 포함한다.
일 구현예에서, CRISPR-Cas 시스템은 씨. 아크네스 염색체 유전자좌를 표적화한다. 바람직하게, 표적화된 유전자좌는 씨. 아크네스 생산자 세포에 존재하지 않는다. 바람직하게, CRISPR-Cas 시스템 유래의 CRISPR 어레이는 염색체 유전자좌를 표적화하는 하나 또는 몇 개의 crRNA를 발현한다.
일 구현예에서, CRISPR-Cas 시스템은 몇개의 씨. 아크네스 염색체 유전자좌를 표적화한다. 바람직하게, 표적화된 유전자좌는 씨. 아크네스 생산자 세포에 존재하지 않는다. 바람직하게, CRISPR-Cas 시스템 유래의 CRISPR 어레이는 염색체 유전자좌를 표적화하는 하나 또는 몇 개의 crRNA를 발현한다.
일 구현예에서, CRISPR-Cas 시스템은 씨. 아크네스 플라스미드 유전자좌를 표적화한다. 바람직하게, 표적화된 유전자좌는 씨. 아크네스 생산자 세포에 존재하지 않는다. 바람직하게, CRISPR-Cas 시스템 유래의 CRISPR 어레이는 플라스미드 유전자좌를 표적화하는 하나 또는 몇 개의 crRNA를 발현한다.
일 구현예에서, CRISPR-Cas 시스템은 몇개의 씨. 아크네스 플라스미드 유전자좌를 표적화한다. 바람직하게, 표적화된 유전자좌는 씨. 아크네스 생산자 세포에 존재하지 않는다. 바람직하게, CRISPR-Cas 시스템 유래의 CRISPR 어레이는 플라스미드 유전자좌를 표적화하는 하나 또는 몇 개의 crRNA를 발현한다.
일 구현예에서, CRISPR-Cas 시스템은 씨. 아크네스 생산자 세포에서 발현되지 않는다. 바람직하게 CRISPR-Cas 시스템은 씨. 아크네스 생산자 세포에서 억제된다.
일 구현예에서, CRISPR-Cas 시스템은 숙주 질환과 관련된 프로염증성 서열을 표적화한다.
일 구현예에서, CRISPR-Cas 시스템은 심상성 좌창과 관련된 프로염증성 서열을 표적화한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 상동성 재조합을 위한 주형을 포함하고, CRISPR-Cas 시스템은 DNA 벡터 자체를 표적화한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 씨. 아크네스 파지에서 상동성 재조합을 위한 주형을 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 씨. 아크네스 염색체에서 상동성 재조합을 위한 주형을 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 씨. 아크네스 내생성 플라스미드에서 상동성 재조합을 위한 주형을 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 상동성 재조합을 위한 주형 및 주형 영역 외부에서 DNA 벡터 자체를 표적화하는 CRISPR-Cas 시스템을 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 상동성 재조합을 위한 주형 및 주형 영역 외부에서 DNA 벡터 자체를 표적화하는 CRISPR-Cas 시스템을 포함하고, CRISPR-Cas 시스템 유래의 RNA 가이드 (crRNA 또는 sgRNA)는 DNA 표적과 완벽하게 일치되지 않는다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 인테그라제 유전자 발현 카세트 및 염색체 내부에서 DNA 벡터의 통합을 허용하는 부위 특이적 재조합 부위를 포함한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 염기 편집자 유전자 발현 카세트 및 하나 또는 다수의 crRNA 또는 sgRNA를 포함한다.
일 구현예에서, 염기 편집자는 유전자의 발현을 상기 유전자의 전사 또는 번역에 관여되는 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드를 편집하여 불활성화시키는데 사용된다. 보다 특히, 염기 편집자는 프로모터, RBS 또는 출발 코돈의 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드를 표적화한다.
일 구현예에서, 염기 편집자는 조기 중지 코돈을 도입시키는데 사용된다.
일 구현예에서, 염기 편집자는 하나 또는 몇 개 희귀 코돈을 도입시키는데 사용된다.
다른 구현예에서, 염기 편집자는 유전자의 발현을 상기 유전자의 전사 또는 번역에 관여되는 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드를 편집하여 조절하는데 사용된다. 보다 특히, 염기 편집자는 프로모터, RBS, 또는 출발 코돈의 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드를 표적화하여서, 유전자 발현에서 증가 또는 감소를 야기한다.
다른 구현예에서, 염기 편집자는 유전자 또는 경로의 활성의 불활성화, 감소 또는 증가를 야기하는 돌연변이를 복귀시키는데 사용된다.
다른 구현예에서, 염기 편집자는 병원성의 증가를 야기하는 돌연변이를 복귀시키는데 사용된다.
일 구현예에서, 염기 편집자는 유전자의 조절을, 이의 조절에 관여되는 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드 예컨대 오퍼레이터 서열, 전사 인자 결합 부위, 리보스위치, RNAse 인식 부위, 프로테아제 절단 부위, 메틸화 부위 또는 번역 후 변형 부위 (인산화, 글리코실화, 아세틸화, 푸필화...)의 뉴클레오티드를 편집하여서 변형시키는데 사용된다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 프라임 편집자 유전자 발현 카세트 및 하나 또는 다수의 pegRNA를 포함한다.
일 구현예에서, 프라임 편집자는 하나 또는 몇 개의 조기 중지 코돈을 도입시키는데 사용된다.
일 구현예에서, 프라임 편집자는 하나 또는 몇 개의 희귀 코돈을 도입시키는데 사용된다.
일 구현예에서, 프라임 편집자는 뉴클레오티드를 도입하거나 또는 결실시켜서 리딩 프레임에 프레임시프트를 유도하는데 사용된다.
다른 구현예에서, 프라임 편집자는 유전자의 발현을 상기 유전자의 전사 또는 번역에 관여되는 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드를 치환, 결실 또는 삽입시켜서 조절하는데 사용된다. 보다 특히, 프라임 편집자는 프로모터, RBS 또는 출발 코돈의 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드를 치환, 결실 또는 삽입시켜서, 유전자 발현에서 증가 또는 감소를 야기한다.
다른 구현예에서, 프라임 편집자는 유전자 또는 경로의 활성의 불활성화 또는 감소를 야기하는 돌연변이를 복귀시키는데 사용된다.
다른 구현예에서, 프라임 편집자는 병원성의 증가를 야기하는 돌연변이를 복귀시키는데 사용된다.
일 구현예에서, 벡터는 씨. 아크네스로부터 플라스미드의 추출 및 이. 콜라이에서 형질전환 및 복제를 허용하는 이. 콜라이 내성 마커 및 이. 콜라이 레플리콘을 포함하는 플라스미드이다.
일 구현예에서, 벡터는 이. 콜라이로부터 플라스미드의 추출 및 씨. 아크네스에서 형질전환 및 복제를 허용하는 이. 콜라이 내성 마커 및 이. 콜라이 레플리콘을 포함하는 플라스미드이다.
일 구현예에서, 벡터는 2개 복제 기원을 포함하는데, 하나는 씨. 아크네스 또는 씨. 아크네스 생산자 세포에서만 복제를 허용하고, 제2 복제 기원은 다른 박테리아에서 복제를 허용한다.
일 구현예에서, 상동성 재조합을 위한 주형 DNA를 포함하는 벡터는 재조합 속도를 증가시키는 유전자의 발현을 허용한다.
일 구현예에서, 상동성 재조합을 위한 주형은 재조합 지점의 상류 및 하류에 상동성 팔부를 함유한다. 이들 상동성 팔부는 적어도 50, 100, 500 또는 적어도 1000 bp 크기일 수 있다.
일 구현예에서, DNA 벡터가 포함하는 관심 유전자는 씨. 아크네스에 외생성인 이식유전자일 수 있다. 이식유전자는 하기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:
- 특이적 기질이 첨가되면 형광성 씨. 아크네스 세포를 야기하는 형광성 단백질 (예를 들어, UnaG)을 코딩하는 DNA;
- 씨. 아크네스 콜로니에 의한 발색성 화합물의 생산을 야기하는 효소 리포터 (예를 들어, LacZ)를 코딩하는 DNA;
- 인간 단백질 (예를 들어, 인터루킨)을 코딩하는 DNA;
- 항원 (예를 들어, 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 자기-항원, 알레르겐 또는 이식편-특이적 항원)을 코딩하는 DNA;
- CRISPR-Cas 시스템;
- 프라임-편집 시스템; 또는
- 염기-편집자 시스템.
특정 구현예에서, DNA 벡터에 의해 코딩되는 관심 유전자는 항원을 코딩하는 DNA, 보다 특히 하기 정의된 바와 같은, 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 자기-항원, 알레르겐 및 이식편-특이적 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원을 코딩하는 DNA이다.
DNA 벡터를 포함하는 씨. 아크네스 균주, 조작된 씨. 아크네스 균주
본 발명은 본 발명의 임의의 DNA 벡터를 포함하는 씨. 아크네스를 포괄한다. 본 발명은 또한 본 발명의 임의 방법으로 제조된 씨. 아크네스를 포괄한다. 따라서, 본 발명은 DNA 벡터를 보유하거나 또는 후속하여 씨. 아크네스로부터 DNA 벡터를 제거 (즉, 소실)했는지 여부와 무관하게, 파지-유래 입자에 의한 본 발명의 임의의 DNA 벡터의 형질도입 후에 변형된 씨. 아크네스를 포괄한다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 DNA 벡터를 함유하는 씨. 아크네스 생산자 세포로부터 파지-유래 입자를 생산하는 단계; 이들 파지-유래 입자를 씨. 아크네스 수용자 세포와 접촉시켜서 씨. 아크네스 수용자 세포로 DNA 벡터의 형질도입 및 벡터가 보유하는 관심 유전자 (예를 들어, CRISPR-Cas 시스템) 및/또는 씨. 아크네스 염색체에 삽입된 외생성 유전자에 의해 씨. 아크네스 수용자 세포의 변형을 일으키는 단계; 변형에 대해 선택하는 단계; 및 씨. 아크네스에서 벡터를 소실시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 씨. 아크네스를 포괄한다.
본 발명은 본 발명의 벡터를 보유하는 파지-유래 입자에 의해 형질도입된 CRISPR-Cas 시스템을 통해서 변형된 조작된 씨. 아크네스를 포괄한다.
본 발명은 DNA 벡터의 형질도입 및 씨. 아크네스 염색체로 외생성 유전자의 후속 삽입을 통해서 변형된 조작된 씨. 아크네스를 포괄한다.
본 발명은 DNA 벡터의 형질도입 및 씨. 아크네스 염색체 또는 씨. 아크네스 내생성 플라스미드로 내생성 유전자의 후속 결실 또는 돌연변이를 통해서 변형된 조작된 씨. 아크네스를 포괄한다.
본 발명은 본 발명의 DNA 벡터의 형질도입에 의해서 생산된 씨. 아크네스를 포괄한다.
본 발명은 플라스미드의 전달, 특히 접합을 통해서 변형된 조작된 씨. 아크네스를 포괄한다. 특정 구현예에서, 상기 플라스미드는 CRISPR-Cas 시스템을 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 상기 플라스미드는 외생성 유전자를 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 상기 플라스미드는 씨. 아크네스 염색체로 외생성 유전자를 삽입할 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 상기 플라스미드는 씨. 아크네스 염색체 또는 씨. 아크네스 내생성 플라스미드로 내생성 유전자를 결실 또는 돌연변이시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 플라스미드는 상기 정의된 바와 같은, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원, 및/또는 상기 정의된 바와 같은 전달 기원을 포함한다.
이전에 프로피오니박테리움 아크네스라고 불렸던, 큐티박테리움 아크네스는 역사적으로 recA 및 tly 시퀀싱을 기반으로 3개의 주요 계통형: IA, IB, II 및 III로 분류되었다. 이들 계통형은 상이한 MLST (multi-locus sequence typing) 체계를 사용하여 IA1, IA2, IB, II 및 III으로 더욱 세분되었다. 보다 최근에, Fitz-Gibbon 등 (Fitz-Gibbon, S. et al. (2013) J Invest Dermatol 133, 2152-2160)은 16S rRNA 유전자 (리보타이핑)의 서열 다양성을 비롯하여 계통형의 정밀한 분류를 기반으로 새로운 분류를 도입하였다: IA-1, IA-2, IB-1, IB-2, IB-3, IC, II, III. 본 개시는 이러한 분류를 언급하지만 이러한 분류 및 다른 것들 간 일치성은 당업자에게 충분히 공지되어 있고 하기 리뷰로부터 수득될 수 있다: (Dreno, B. et al. (2018). Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology 32, 5-14). 특정 구현예에서, 따라서 씨. 아크네스는 계통형 IA-1, IA-2, IB-1, IB-2, IB-3, IC, II 및 III으로 이루어진 군으로부터 선택되는 계통형 유래일 수 있다.
여드름 및 건강한 지원자로부터 단리된 균주의 전체 게놈 서열을 비교하여서, Fitz-Gibbon 및 동료들은 이전 연구에 따라서 여드름-연관 균주 (IA-2 및 IB-1) 및 건강-연관 균주 (II)를 동정할 수 있었다. 보다 흥미롭게, 그들은 여드름 연관 균주에 존재하고 중성 및 건강한 균주에 부재하는 특별한 유전자좌 (유전자좌 1, 유전자좌 2, 및 유전자좌 3)를 발견하였다. 유사한 유전자좌가 후속 메타게놈 분석에서 발견되어서 이들 유전자좌의 존재 및 심상성 좌창 간 연관성이 확인되었다 (Barnard, E. et al. (2016) Scientific Reports 6, srep39491).
면역 반응을 유도하는 특별한 균주 계통형의 능력이 최근에 조사되었다 (Yu et al. (2016) Journal of Investigative Dermatology 136:2221-2228). Yu 등은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)와 인큐베이션되었을 때 상이한 씨. 아크네스 계통형이 상이한 사이토카인 프로파일을 유도하였다는 것을 입증하였다. 보다 특히, 그들은 여드름-연관 계통형 IA-2 p+ (즉, 여드름과 연관된 대형 플라스미드를 가짐), IB-1, 및 IC가 높은 수준의 염증성 IFN-γ 및 IL-17이지만 낮은 수준의 IL-10을 유도시켰다는 것을 보여주어서, 이들 특별한 계통형이 Th1 및 Th17 반응 둘 모두를 유도할 수 있다는 것을 시사한다. 또한 그들은 계통형 IB-3, II 및 III이 보다 낮은 수준의 IL-17 (및 계통형 III 경우 IFN-γ)이지만 더 높은 수준의 IL-10을 유도하였다는 것을 보여주어서, Treg 반응의 유도를 시사한다. 그들은 또한 계통형 IA-1, IA-2 p- (즉, 여드름과 연관된 대형 플라스미드 없음) 및 IB-2가 보다 낮은 수준의 IFN-γ 및 IL-10 및 더 높은 수준의 IL-17을 유도하였다는 것을 보여주어서, 주로 Th17 반응의 유도를 시사한다.
그러므로, 특정 적응증에 대해 본 발명의 조작된 씨. 아크네스를 사용할 때 원하는 특정 면역 반응에 의존하여서, 소정 씨. 아크네스 계통형 또는 균주의 사용이 유리할 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 씨. 아크네스는 계통형 IA-2 p+, IB-1 및 IC로 이루어진 군으로부터 선택되는 계통형 유래이다. 다른 구현예에서, 씨. 아크네스는 계통형 IA-1, IA-2 p- 및 IB-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 계통형 유래이다. 여전히 다른 구현예에서, 씨. 아크네스는 계통형 IB-3, II 및 III으로 이루어진 군으로부터 선택되는 계통형 유래이다.
더 나아가서, 이전 연구는 에스. 에피더미디스 (S. epidermidis)에서, 상기 균주를 조작하여 동일한 종 내에서 상이한 균주에 의해 상이한 T 세포 반응을 유도하는 것이 가능하였다는 것을 보여주었다 (Chen et al. (2019) "Decoding commensal-host communication through genetic engineering of Staphylococcus epidermidis" bioRxiv https://doi.org/10.1101/664656).
그러므로, 특정 구현예에서, 씨. 아크네스는 소정 T 세포 반응을 유도하거나, 또는 유도하도록 조작된 균주이다. 특정 구현예에서, 보다 특히 씨. 아크네스 세포가 암의 예방 및/또는 치료에서 사용되도록 의도될 때, 상기 씨. 아크네스는 IFN-γ 및/또는 IL-17a의 증가된 수준을 유도하거나, 또는 유도하도록 조작된 균주이다. 특정 구현예에서, 보다 특히 씨. 아크네스 세포가 감염의 예방 및/또는 치료에서 사용되도록 의도될 때, 상기 씨. 아크네스는 IFN-γ 및/또는 IL-17의 증가된 수준을 유도하거나, 또는 유도하도록 조작된 균주이다. 특정 구현예에서, 보다 특히 씨. 아크네스 세포가 자가면역 질환의 예방 및/또는 치료에서 사용되도록 의도될 때, 상기 씨. 아크네스는 IL-10의 증가된 수준을 유도하거나, 또는 유도하도록 조작된 균주이다. 특정 구현예에서, 보다 특히 씨. 아크네스 세포는 알레르기, 예컨대 천식의 예방 및/또는 치료에서 사용되도록 의도될 때, 상기 씨. 아크네스는 IFN-g 및/또는 IL-10의 증가된 수준을 유도하거나, 또는 유도하도록 조작된 균주이다. 특정 구현예에서, 보다 특히 씨. 아크네스 세포가 이식 거부의 예방 및/또는 치료에서 사용되도록 의도될 때, 상기 씨. 아크네스는 IL-10의 증가된 수준을 유도하거나, 또는 유도하도록 조작된 균주이다.
본 발명의 재조합 자기-복제성 DNA 벡터를 포함하는 (또는 플라스미드, 특히 상기 정의된 바와 같은 접합성 플라스미드를 포함하는) 씨. 아크네스는 관심 분자의 발현 및 씨. 아크네스-숙주 상호작용의 조절을 위해 생성될 수 있다. 관심 분자는 씨. 아크네스에서 자기-복제성 DNA 벡터 (또는 플라스미드, 특히 접합성 플라스미드)에 보유될 수 있거나 또는 자기-복제성 DNA 벡터 (또는 상기 정의된 바와 같은, 플라스미드, 특히 접합성 플라스미드)의 작용을 통해서 씨. 아크네스의 염색체에 삽입될 수 있다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 씨. 아크네스 염색체 조작에 사용된다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 씨. 아크네스 플라스미드 조작에 사용된다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 씨. 아크네스 파지 조작에 사용된다.
일 구현예에서, DNA 벡터 (또는 상기 정의된 바와 같은, 플라스미드, 특히 접합성 플라스미드)는 관심 분자의 발현 및 씨. 아크네스-숙주 상호작용의 조절에 사용된다. 일 구현예에서, DNA 벡터 (또는, 상기 정의된 바와 같은, 플라스미드, 특히 접합성 플라스미드)는 씨. 아크네스에서 이식유전자의 발현에 사용된다. 이식유전자는 소정 프로모터 (항상성 또는 유도성)의 제어 하에서 있고 소정 종결자가 후속되는 재조합 자율-복제 DNA 벡터 (또는 플라스미드, 특히 접합성 플라스미드)에 클로닝될 수 있다. 씨. 아크네스로 이러한 벡터의 전달은 이식유전자의 발현을 허용한다. 이식유전자는 예를 들어, CRISPR-Cas 시스템일 수 있거나 또는 인간 단백질, 예컨대 인터루킨을 코딩할 수 있다. 일 구현예에서 DNA 벡터 (또는 플라스미드, 특히 접합성 플라스미드)는 단일 프로모터의 제어 하에 또는 상이한 프로모터의 제어 하에서 몇개 이식유전자를 코딩한다. 프로모터는 내생성 또는 외생성, 유도성 또는 항상성일 수 있다.
일 구현예에서, DNA 벡터 (또는 플라스미드, 특히 접합성 플라스미드)는 씨. 아크네스 게놈의 변형에 사용된다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스에 벡터 (또는 플라스미드, 특히 접합성 플라스미드)의 전달은 특정 부위에서 씨. 아크네스 게놈 (플라스미드 또는 염색체)을 절단하는 CRISPR/Cas 시스템의 발현을 허용하여서, 씨. 아크네스 게놈의 변형을 일으킨다. 일 구현예에서, 벡터 (또는 플라스미드, 특히 접합성 플라스미드)는 씨. 아크네스 게놈으로 관심 유전자의 통합을 촉진하도록 절단 부위와의 상동성 및 관심 유전자를 더 포함한다.
씨. 아크네스 균주로 DNA 벡터의 전달
일 구현예에서, 씨. 아크네스 생산자 세포로 본 발명의 임의의 DNA 벡터의 전달은 본 발명의 임의 DNA 벡터와 씨. 아크네스를 접촉시켜서 수행된다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 생산자 세포로 본 발명의 임의 DNA 벡터의 전달은 씨. 아크네스 세포로 형질감염 (예를 들어, 전기천공)을 통해 수행되고, 거기서 안정하게 복제된다. 일 구현예에서, 형질감염된 DNA 벡터는 dam(-) 이. 콜라이 세포 예컨대 ET12567로부터 정제되어서 24℃에서 적격하게 만들어진 씨. 아크네스 세포에 전기천공된다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 생산자 세포로 본 발명의 임의 DNA 벡터의 전달은 씨. 아크네스 원형질체로 형질감염 (예를 들어, 전기천공)에 의해 수행된다. 일 구현예에서 씨. 아크네스 원형질체는 뮤타노리신 처리 또는 리소자임 처리, 뮤타노리신 및 리소자임 처리, 또는 뮤타노리신 및 리소자임 및 비드-비팅 처리에 이어서 저장성 배지에 재현탁을 사용해 생성된다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 생산자 세포로 본 발명의 임의 DNA 벡터의 전달은 씨. 아크네스 원형질체를 DNA 벡터와 혼합하여 수행된다. 일 구현예에서 유리 비드가 DNA 벡터와 첨가되고 씨. 아크네스 원형질체에 DNA를 도입하기 위해 비드 비팅이 수행된다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스로 본 발명의 DNA 벡터의 전달은 형질도입에 의한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 PAC7 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 68); PAC1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 69); PAC9 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 70); PAC2 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 71); PAC10 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 72); PAC22 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 73); PAC13 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 74) 및 PAC263 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 75) 파지로 이루어진 군으로부터 선택되는 씨. 아크네스 파지의 한 패키징 신호를 포함하고, 파지 PAC7 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 68); PAC1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 69); PAC9 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 70); PAC2 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 71); PAC10 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 72); PAC22 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 73); PAC13 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 74) 및 PAC263 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 75)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 씨. 아크네스 파지의 게놈으로부터 발현되는 단백질에 패키징되어서, 씨. 아크네스로 DNA 벡터의 형질도입을 허용한다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 생산자 세포로 본 발명의 임의 DNA 벡터의 전달은 접합에 의한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원을 포함한다. 일 구현예에서, 도너 박테리움, 예컨대 이. 콜라이는 씨. 아크네스 수용자 세포로 DNA 벡터를 효율적으로 전달하는데 사용되고, 거기서 안정하게 복제된다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 oriT_pMRC01 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 1); oriT_RSF1010 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 2); oriT_pRS01 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 3); oriT_pMV158 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 4); oriT_pTF1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 5); oriT_pSC101 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 6); oriT_pBTK445 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 7); oriT_pBBR1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 8); oriT_R721 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 9); oriT_pRmeGR4a (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 10); oriT_ColE1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 11); oriT_pTiC58 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 12); oriT_pMdT1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 13); oriT_R1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 14); oriT_Tn5520 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 15); oriT_QKH54 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 16); oriT_R64 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 17); oriT_R751 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 18); oriT_RP4 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 19); oriT_pKL1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 20); oriT_RK2 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 21); oriT_R1162 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 22); oriT_Tn4555 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 23); oriT_pHT (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 24); oriT_Tn4399 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 25); oriT_Tn916 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 26); oriT_pST12 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 27); oriT_pCU1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 28); oriT_pSU233 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 29); oriT_F (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 30); oriT_pMAB01 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 31); oriT_R388 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 32); oriT_pS7a (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 33); oriT_pS7b (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 34); oriT_R702 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 35); oriT_pMUR274 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 36); oriT_R100 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 37); oriT_pVCR94deltaX (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 38); oriT_R46 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 39); oriT_pGO1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 40) 및 oriT_pIP501 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 41)로 이루어진 군으로부터 선택되는 전달 기원을 포함한다. 일 구현예에서, 도너 박테리움, 예컨대 이. 콜라이는 pMRC01; RSF1010; pRS01; pMV158; pTF1; pSC101; pBTK445; pBBR1; R721; pRmeGR4a; ColE1; pTiC58; pMdT1; R1; Tn5520; QKH54; R64; R751; RP4; pKL1; RK2; R1162; Tn4555; pHT; Tn4399; Tn916; pST12; pCU1; pSU233; F; pMAB01; R388; pS7a; pS7b; R702; pMUR274; R100; pVCR94deltaX; R46; pGO1 및 pIP501로 이루어진 군으로부터 선택되는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 통합성 및 접합성 구성요소 (ICE)를 보유하고, 씨. 아크네스 수용자 세포로 DNA 벡터를 효율적으로 전달하는데 사용된다. 일 구현예에서 DNA 벡터는 pMRC01; RSF1010; pRS01; pMV158; pTF1; pSC101; pBTK445; pBBR1; R721; pRmeGR4a; ColE1; pTiC58; pMdT1; R1; Tn5520; QKH54; R64; R751; RP4; pKL1; RK2; R1162; Tn4555; pHT; Tn4399; Tn916; pST12; pCU1; pSU233; F; pMAB01; R388; pS7a; pS7b; R702; pMUR274; R100; pVCR94deltaX; R46; pGO1 및 pIP501로 이루어진 군으로부터 선택되는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 통합성 및 접합성 구성요소 (ICE)의 전달 기원 및 연관된 렐락사제를 함유한다.
바람직한 구현예에서 DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pMRC01 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 1)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_RSF1010 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 2)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pRS01 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 3)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pMV158 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 4)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pTF1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 5)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pSC101 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 6)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pBTK445 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 7)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pBBR1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 8)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_R721 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 9)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pRmeGR4a (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 10)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_ColE1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 11)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pTiC58 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 12)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pMdT1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 13)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_R1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 14)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_Tn5520 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 15)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_QKH54 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 16)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_R64 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 17)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_R751 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 18)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_RP4 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 19)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pKL1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 20)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_RK2 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 21)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_R1162 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 22)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_Tn4555 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 23)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pHT (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 24)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_Tn4399 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 25)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_Tn916 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 26)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pST12 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 27)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pCU1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 28)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pSU233 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 29)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_F (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 30)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pMAB01 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 31)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_R388 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 32)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pS7a (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 33)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pS7b (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 34)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_R702 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 35)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pMUR274 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 36)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_R100 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 37)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pVCR94deltaX (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 38)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_R46 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 39)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pGO1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 40)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 벡터는 전달 기원 oriT_pIP501 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 41)을 포함한다.
일 구현예에서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 통합성 및 접합성 구성요소 (ICE)를 보유하는, 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis), 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei), 락토바실러스 페르멘툼 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus), 프로피오니박테리움 프루덴레이키 (Propionibacterium freudenreichii), 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis), 스타필로코쿠스 에피더미디스 (staphylococcus epidermidis), 스타필로코쿠스 아우레우스 (staphylococcus aureus), 큐티박테리움 그라눌로숨 (Cutibacterium granulosum), 큐티박테리움 휴메루시 (Cutibacterium humerusii), 엔테로코쿠스 패칼리스 (Enterococcus faecalis) 및 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 접합은 가동성 DNA 벡터 및 접합성 기구 (ICE, 플라스미드, 접합성 트랜스포존)를 보유하는, 도너 박테리아, 예컨대 이. 콜라이를 고밀도로 성장시켜서 수행된다. 도너 세포는 원심분리를 통해 펠렛화하고, 세척하여 가동성 및 접합성 DNA 벡터를 유지하기 위해 성장 동안 첨가된 항생제를 제거한다. 다음으로 도너 세포는 씨. 아크네스 세포의 존재 하에서 혼합된다. 혼합 도너 세포 - 씨. 아크네스는 브루셀라 한천 플레이트에 점적되고 혐기성 조건 하에 37℃에서 교접이 허용된다. 교접 이후에, 세포를 교접 플레이트로부터 수확하고, BHI 액체 배지에 재현탁하여, 하기가 보충된 브루셀라 한천 플레이트 상에 도말한다:
- 씨. 아크네스가 아닌 도너 세포를 사멸시키는 화합물, 또는
- 가동성 DNA 벡터를 선택하는 항생제.
수 일의 인큐베이션 이후에, 씨. 아크네스 콜로니는 적절한 선택으로 보충된 브루셀라 한천 플레이트 상에 스트리킹되고, 접합된 플라스미드의 존재는 특정 PCR을 통해서 확인된다. 씨. 아크네스의 정체를 비롯하여 도너 세포의 부재도 역시 PCR 분석을 통해서 확인된다.
일 구현예에서 접합은 하기 프로토콜에 따라서 수행된다: 가동성 DNA 벡터 및 접합성 기구 (ICE, 플라스미드, 접합성 트랜스포존)를 보유하는 이. 콜라이 도너 세포의 2 mL 밤샘 배양물을 LB 액체 배지에서 성장시키고, 6,000 x g에서 1분 동안 펠렛화시킨다. 상청액을 버리고, 펠렛은 500 μL의 사전 멸균된 LB 배지로 세척하고, 다시 동일한 조건을 사용하여 원심분리된다. 다음으로 펠렛은 10X 농축된 200 μL의 대수 성장 (OD600 = 0.5) 씨. 아크네스 수용체 BHI 배양물에 재현탁된다. 혼합물 이. 콜라이 - 씨. 아크네스는 브루셀라 한천 플레이트 상에 점적 (50 μL/반점)되고, 24시간 동안 혐기성 조건 하에 37℃에서 교접되도록 허용한다. 그 시간 이후에, 세포는 교접 플레이트로부터 수확되고, 300 μL의 BHI 액체배지에 재현탁되며, 가동성 DNA 벡터에 존재하는 선택 마커에 의존하여 50 μg/mL 폴리믹신 B 및 5 μg/mL 에리쓰로마이신 또는 3.5 μg/mL 클로람페니콜이 보충된 브루셀라 한천 플레이트에 도말된다. 7일 후에, 선택 존재 하에서 성장되는 씨. 아크네스 세포는 적절한 선택이 보충된 브루셀라 한천 플레이트 상에 스트리킹되고 접합된 플라스미드의 존재는 특정 PCR을 통해서 확인된다. 씨. 아크네스의 동일성을 비롯하여 이. 콜라이 도너 균주의 부재는 또한 PCR 분석으로 확인된다.
내생성 씨. 아크네스 플라스미드를 변형시키는 방법
천연 발생 씨. 아크네스 플라스미드는 기술된 적이 있었고21,22 그들 중 일부는 접합을 통해서 한 씨. 아크네스로부터 다른 것으로 전달될 수 있다20. 이러한 플라스미드를 변형시킬 수 있는 것은 심상성 좌창에서 그들 효과 특히 그들 프로-염증성 역할을 연구하거나 또는 씨. 아크네스의 추가적인 유전자 조작을 위해 그들을 사용하는데 관심이 있다. 본 발명자는 씨. 아크네스 플라스미드를 변형시키기 위한 방법을 개발하였다.
일 구현예에서, 방법은 제1 단계에서, 씨. 아크네스로
- 상기 정의된 바와 같은 씨. 아크네스에 대한 선택 마커,
- 상기 정의된 바와 같은 씨. 아크네스에 대한 복제 기원,
- 상기 정의된 바와 같은 파지 패키징 신호, 및
- 씨. 아크네스 내생성 플라스미드와 상동성 재조합을 위한 주형
을 포함하는 복제성 벡터를 도입시키는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 방법은 제1 단계에서, 씨. 아크네스로
- 상기 정의된 바와 같은 씨. 아크네스에 대한 선택 마커,
- 상기 정의된 바와 같은 씨. 아크네스에 대한 복제 기원,
- 상기 정의된 바와 같은 파지 패키징 신호,
- CRISPR-Cas 시스템, 및
- 씨. 아크네스 내생성 플라스미드와 상동성 재조합을 위한 주형
을 포함하는 복제성 벡터를 도입시키는 단계를 포함한다.
도입은 전기천공, 원형질체의 전기천공, 접합, 화학적 형질전환 또는 형질도입으로 달성될 수 있다. 씨. 아크네스 재조합체는 이후 바람직하게 항생제의 존재 하에서 성장된다.
재조합체는 이후 전형적으로 DNA 벡터를 보유하는 파지-유래 입자를 생산하도록 씨. 아크네스 파지로 감염시킨다.
다음으로, 파지-유래 입자는 전형적으로 내생성 플라스미드 예컨대 pIMPLE-HL096PA1을 함유하는 씨. 아크네스 수용자 세포와 혼합된다. 씨. 아크네스 형질도입체는 이어서 전형적으로 적절한 항생제에서 선택된다.
제2 단계에서, 씨. 아크네스 형질도입체는 상동성 재조합 사건 발생 기회를 증가시키도록 고밀도까지 항생제 A의 존재 하에서 성장된다. 상동성 재조합은 전형적으로 항생제 B에 대한 내성을 제공하는, 선택 마커의 도입을 일으킨다. 조밀한 배양에서, 야생형 내생성 플라스미드를 보유하는 씨. 아크네스 균주 및 내성 마커를 보유하는 재조합체 내생성 플라스미드가 전형적으로 존재한다. 이어서 고밀도 배양은 바람직하게 세척되고, 전형적으로 제3 항생제 C에 내성인 수용자 씨. 아크네스 균주의 존재 하에 둔다. 항생제 C 및 B를 사용한 피전달접합체의 선택은 전형적으로 재조합체 플라스미드를 갖는 수용자 세포의 선택을 일으킨다.
본 발명의 방법으로 가능한 다른 변형은 플라스미드 상에 이. 콜라이 레플리콘 및 이. 콜라이 내성 마커의 삽입을 포함하여서 씨. 아크네스로부터 플라스미드의 추출 및 이. 콜라이에서 형질전환 및 복제를 허용한다.
추가로, 상동성 재조합을 위한 주형 DNA를 보유하는 플라스미드는 바람직하게 재조합 속도를 증가시키는 유전자의 발현을 허용한다.
상동성 재조합을 위한 주형은 전형적으로 재조합 지점의 상류 및 하류에 상동성 팔부를 함유한다. 이들 상동성 팔부는 바람직하게 50, 100, 500, 1000 bp 길이 이상이다.
씨. 아크네스 게놈 조작 및 조작된 씨. 아크네스 균주
본 발명은 씨. 아크네스 게놈 조작 방법 및 임의의 본 발명의 방법으로 조작된 조작된 씨. 아크네스 균주를 포괄한다. "조작된 균주"는 자연계에서 존재하거나 또는 존재하지 않는 변경을 함유하도록 본 발명의 임의 방법을 통해서 수득된 균주이다. 예를 들어, 조작된 씨. 아크네스 균주는 본 발명의 임의의 벡터 또는 DNA를 포함할 수 있다.
본 발명은 접합을 통해서 씨. 아크네스 균주에 관심 DNA를 전달하기 위한 방법을 포괄한다. 본 발명은 또한 파지-유래 입자를 통해서 씨. 아크네스 균주에 관심 DNA를 전달하기 위한 방법을 포괄한다. 본 발명은 복제성 및 비-복제성 벡터 방법으로 씨. 아크네스 염색체를 조작하는 방법을 포괄한다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스로 DNA 벡터의 전달은 형질도입에 의한다. 일 구현예에서, DNA 벡터는 씨. 아크네스 파지로부터 기원하는 파지 패키징 신호 (cos)를 포함한다. 일 구현예에서, DNA 벡터를 함유하는 파지-유래 입자가 생성될 수 있고 DNA 벡터를 씨. 아크네스 세포로 형질도입시키는 것을 허용할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 적어도 하나 또는 2개 상동성 팔부를 갖는 재조합 주형을 포함하는 벡터를 사용하는 복제성 및 비-복제성 벡터 방법을 포괄한다.
씨. 아크네스 게놈을 조작하기 위해서, 본 발명자는 복제성 및 비-복제성 벡터를 사용하는 방법을 개발하였다.
비-복제성 벡터 방법
일 구현예에서, 비 복제성 벡터 방법은 적어도,
- 상기 정의된 바와 같은 파지 패키징 신호;
- 상기 정의된 바와 같은, 씨. 아크네스에 대한 선택 마커;
- 하나 또는 2개 상동성 팔부를 갖는 재조합 주형;
- 큐티박테리움 아크네스 생산자 세포에서만 복제를 허용하는 복제 기원; 및
- 임의로 역 선택 마커 예컨대 SacB
를 포함하는 벡터를 사용한다.
비 복제성 벡터 방법은 다른 씨. 아크네스 세포가 아닌 씨. 아크네스 생산자 세포에서만 복제하는 씨. 아크네스 레플리콘을 보유하는 벡터를 사용한다. 따라서, 이러한 벡터는 씨. 아크네스 생산자 세포에서 복제할 수 있고, 파지 게놈과 접촉 시 파지 캡시드에 패키징될 수 있어서 파지-유래 입자를 생성시키고, 그들이 복제되지 않는 씨. 아크네스 수용자 세포로 파지-유래 입자에 의해 형질도입된다.
방법은 게놈 내부에서 상동성 DNA 재조합을 위한 주형을 함유하는 플라스미드를 씨. 아크네스 생산자 세포로 도입시키는 단계를 포함한다. 주형은 하나 (도 4A) 또는 2개 상동성 영역 (도 4B)을 함유하여 상동성 재조합을 일으킨다.
일 구현예에서, 방법은 상동성 DNA가 씨. 아크네스 생산자 세포에 존재하지 않는 염색체 내부에서 상동성 DNA 재조합을 위한 주형, 씨. 아크네스 파지로부터 기원하는 파지 패키징 신호 (cos), 상기 정의된 바와 같은 씨. 아크네스에 대한 선택 마커, 및 씨. 아크네스 수용자 세포에서는 복제되지 않는 씨. 아크네스 생산자 세포를 위한 복제 기원을 함유하는 플라스미드를 보유하는, 씨. 아크네스 생산자 세포를 포함한다. 주형은 하나 (도 4A) 또는 2개 상동성 영역 (도 4B)을 함유하여서, 상동성 재조합을 일으킬 수 있다. 생산자 세포는 전형적으로 씨. 아크네스 파지에 의해 감염되어서 상동성 팔부(들)를 갖는 DNA 벡터를 함유하는 파지-유래 입자의 생산을 일으킨다. 파지-유래 입자는 바람직하게 씨. 아크네스 수용자 세포 (예를 들어, ATCC 11828)와 혼합된다. 형질도입체는 항생제 플레이트 상에서 선택될 수 있고, 항생제 플레이트 상에 스크리킹될 수 있고 플라스미드 통합은 PCR을 통해서 스크리닝될 수 있다. 플라스미드가 씨. 아크네스에서 복제성이 아니기 때문에, 항생제 마커를 안정하게 유지하는 재조합체 세포만이 항생제 플레이트에서 성장할 수 있다.
주형 DNA에 2개 상동성 팔부가 존재하는 경우에, 제1 재조합 사건 (교차라고도 함)은 전형적으로 플라스미드의 전체 통합을 야기한다. 이것은 전형적으로 제2 재조합 사건으로 이어져서 플라스미드 골격을 제거하고 염색체의 변행 또는 야생형 wt 유전자좌의 재구성을 야기한다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 생산자 세포는 씨. 아크네스 선택 마커, 예를 들어, ermE (pEB_HR02)에 측접되는 좌측 상동성 팔부 (LHA) 및 우측 상동성 팔부 (RHA)를 함유하는 벡터를 보유한다. 2개 상동성 팔부는 전형적으로 씨. 아크네스 생산자 세포 염색체와 일치되지 않는다. 일 구현예에서, 벡터는 또한 씨. 아크네스 파지로부터 기원하는 파지 패키징 신호 (cos), 씨. 아크네스에 대한 선택 마커 및 씨. 아크네스 수용자 세포에서 복제되지 않는 씨. 아크네스 생산자 세포를 위한 복제 기원을 함유한다. 일 구현예에서 DNA 벡터는 또한 플라스미드 골격에 제2 재조합 사건의 선택을 허용하는, 씨. 아크네스 역-선택 마커, 예컨대 sacB 를 함유한다. pEB_HR02를 보유하는 씨. 아크네스 생산자 세포는 전형적으로 파지에 의해 감염되어서 pEB_HR02를 포함하는 파지-유래 입자의 생산을 야기한다. 파지-유래 입자는 전형적으로 씨. 아크네스 수용자 세포 (예를 들어, ATCC 11828)의 존재 하에 둔다. 형질도입체는 전형적으로 항생제 (예를 들어, 에리쓰로마이신)가 보충된 플레이트 상에서 선택되고, 항생제 (예를 들어, 에리쓰로마이신)가 보충된 플레이트에 스트리킹되며, 플라스미드의 통합은 PCR을 통해서 확인된다. 플라스미드는 씨. 아크네스 수용자 세포에서 복제성이 아니기 때문에, 항생제 (예를 들어, 에리쓰로마이신)의 존재 하에서 성장할 수 있는 씨. 아크네스 클론은 단일 상동성 재조합 사건을 겪고, 전체 플라스미드의 통합을 야기하였다. 최종 재조합 유전자좌에 대해 선택하기 위해서, 세포는 전형적으로 역-선택 (예를 들어, 수크로스) 및 항생제 (예를 들어, 에리쓰로마이신)에 노출되고, sacB 활성으로 인해 세포 사멸을 야기한다 (전체 플라스미드는 염색체에 통합된 채로 남음). 생존자는 전형적으로 성공적인 최종 재조합 유전자좌 존재에 대해 PCR을 통해서 스크리닝된다. 일 구현예에서 DNA 벡터는 오직 하나의 상동성 팔부 (pEB_HR01)를 함유한다. 일 구현예에서, pEB_HR01 및 pEB_HR02 파지-유래 입자 둘 모두는 피부에 적용되고, 항생제 선택은 적용되지 않는다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 생산자 세포는 씨. 아크네스 선택 마커 ErmE (pEB_HR02)에 측접하는 좌측 상동성 팔부 (LHA) 및 우측 상동성 팔부 (RHA)를 함유하는 플라스미드 (벡터)를 보유한다. 벡터는 또한 바람직하게 이. 콜라이 복제 기원, 이. 콜라이 선택 마커, 접합성 플라스미드로부터의 렐락사제 및 oriT 및 씨. 아크네스 역-선택 마커, 예컨대 sacB 를 함유한다. pEB_HR02는 이. 콜라이 도너 균주 (예를 들어, Ec0s2862)를 형질전환시킬 수 있다. 형질전환체는 전형적으로 선택되고, 성장되어서, 씨. 아크네스 수용자 세포 (예를 들어, ATCC 11828)와 혼합된다. 피전달접합체는 전형적으로 항생제 (예를 들어, 에리쓰로마이신)가 보충된 플레이트 상에서 선택되어서, 항생제 (예를 들어, 에리쓰로마이신)가 보충된 플레이트에 스트리킹되고, 플라스미드의 통합은 PCR을 통해서 확인된다. 플라스미드는 씨. 아크네스 수용자 세포에서 복제성이 아니기 때문에, 항생제 (예를 들어, 에리쓰로마이신)의 존재 하에서 성장할 수 있는 씨. 아크네스 클론은 단일 상동성 재조합 사건을 겪었고, 전체 플라스미드의 통합을 야기하였다. 최종 재조합 유전자좌에 대해 선택하기 위해서, 세포는 전형적으로 역-선택 (예를 들어, 수크로스) 및 항생제 (예를 들어, 에리쓰로마이신)에 노출되어서, sacB 활성으로 인한 세포 사멸을 야기한다 (전체 플라스미드는 염색체에 통합된 채로 남음). 생존자는 전형적으로 성공적인 최종 재조합 유전자좌 존재에 대해 PCR을 통해 스크리닝된다.
복제성 CRISPR-Cas 시스템 선택 벡터 방법
본 발명은 씨. 아크네스에 대한 복제 기원을 포함하는 복제성 벡터를 포괄한다.
일 구현예에서, 복제성 CRISPR-Cas 선택 벡터 방법은 적어도,
- 상기 정의된 바와 같은 씨. 아크네스 파지로부터 기원되는 파지 패키징 신호 (cos);
- 상기 정의된 바와 같은, 씨. 아크네스에 대한 선택 마커;
- 씨. 아크네스에 대한 복제 기원;
- 2개 상동성 팔부를 갖는 재조합 주형; 및
- 씨. 아크네스에서 발현을 위한 CRISPR-Cas 시스템
을 포함하는 벡터를 사용한다.
일 구현예에서, 복제성 CRISPR-Cas 선택 벡터 방법은 적어도
- 상기 정의된 바와 같은, 이. 콜라이에 대한 선택 마커;
- 이. 콜라이에 대한 복제 기원;
- 상기 정의된 바와 같은, 씨. 아크네스에 대한 선택 마커;
- 2개 상동성 팔부를 갖는 재조합 주형;
- 씨. 아크네스에 대한 복제 기원; 및
- 씨. 아크네스에서 발현되는 CRISPR-Cas 시스템
을 포함하는 벡터를 사용한다.
따라서, 이러한 벡터는 이. 콜라이에서 복제될 수 있고 씨. 아크네스에서 복제될 수 있다. 그들은 또한 재조합을 원하는 야생형 유전자좌에서 이중 가닥 파괴를 유도할 수 있어서, 씨. 아크네스 수용자 세포의 사멸을 야기하는, CRISPR-Cas 시스템을 보유한다.
일 구현예에서, 방법은 염색체 내부에서 상동성 DNA 재조합을 위한 주형 및 씨. 아크네스 파지로부터 기원하는 파지 패키징 신호 (cos)를 함유하는 복제성 CRISPR-Cas 시스템 선택 벡터를 보유하는, 씨. 아크네스 생산자 세포, 예를 들어 균주 ATCC 6919의 용도를 포함한다. 일 구현예에서, 주형은 2개 상동성 영역 (도 5)을 함유하여서, 상동성 재조합을 야기시킨다. 생산자 세포는 바람직하게 CRISPR-Cas 시스템에 의해 표적화되는 야생형 유전자좌를 함유하지 않는다. 씨. 아크네스 생산자 세포는 전형적으로 씨. 아크네스 파지에 의해 감염되어서 DNA 벡터를 보유하는 파지-유래 입자의 생산을 야기한다. 파지-유래 입자는 전형적으로 씨. 아크네스 수용자 세포와 접촉된다. 씨. 아크네스 수용자 세포에 형질도입 후, DNA 주형 벡터로 재조합된 세포는 CRISPR-Cas 시스템에 의해 표적화되지 않는데, 예를 들어, 그들은 더 이상 연관된 PAM 서열을 갖지 않기 때문이다. 항생제-함유 배지, 예를 들어, 에리쓰로마이신 플레이트 상에 도말은 전형적으로 생존한 세포가 형질도입된 것을 보장하고 CRISPR-Cas 시스템을 발현하는 DNA 벡터 (예를 들어, 플라스미드)를 여전히 보유한다. 단일 콜로니는 전형적으로 항생제-함유 배지, 예를 들어, 에리쓰로마이신 플레이트 상에 스트리킹되고, 재조합 유전자좌는 전형적으로 PCR 및 시퀀싱을 통해서 확인된다.
일 구현예에서, 플라스미드 소실화 단계는 플라스미드를 제거하기 위해 수행된다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 생산자 세포는 CRISPR-Cas 시스템의 DNA 표적을 함유하지만 CRISPR-Cas 시스템은 씨. 아크네스 생산자 세포에서 발현되지 않지만 씨. 아크네스 수용자 세포에서는 발현된다. 보다 바람직하게 CRISPR-Cas 시스템은 씨. 아크네스 생산자 세포에서 억제되지만 씨. 아크네스 수용자 세포에서는 그렇지 않다.
이러한 방법은 무흔적 편집 예컨대 치환, 결실 또는 삽입에 사용될 수 있는데, 재조합체에 대한 선택을 위해서 선택 마커를 도입할 필요가 없고, 선택은 CRISPR-Cas 사멸에 의해 수행되기 때문이다.
자기-표적화된 복제성 벡터 방법
일 구현예에서, 본 발명은 자기-표적화된 복제성 벡터 방법을 포괄한다. 일 구현예에서, 본 발명은 재조합 효율을 증가시키는 것으로 확인된9 재조합 주형의 선형화를 야기하는, 하나 또는 몇 개 표적 서열에서 DNA 벡터 (예를 들어, 플라스미드)의 절단을 프로그램화하기 위한 CRISPR-Cas 시스템의 용도를 포괄한다. 자기-표적화 벡터를 클로닝할 수 있도록, 예를 들어, Cas 뉴클레아제를 코딩하는 유전자의 상류에 유도성 프로모터를 사용하여, 유도성 CRISPR-Cas 시스템을 사용할 수 있다. 이러한 유도성 프로모터와 리보스위치를 조합하여서, CRISPR-Cas 시스템 발현의 보다 더 엄격한 억제를 보장할 수 있다. 자기-표적화 CRISPR-Cas 시스템을 생성시키기 위한 다른 전략은 씨. 아크네스 수용자 세포가 아닌, 씨. 아크네스 생산자 세포에서 억제되는 프로모터에 의존적이다. 이러한 방식으로, CRISPR-Cas 시스템은 오직 씨. 아크네스 수용자 세포에 형질도입되면 활성화될 것이다.
이러한 전략을 사용하여서, 예를 들어, 유전자 치환은 상동성 팔부가 측접된 항생제 마커를 사용 (도 6A)하여서 또는 씨. 아크네스 염색체를 표적화할 때 박테리아를 사멸하는 CRISPR-Cas 시스템 능력을 사용하는 무흔적 재조합을 수행 (도 6B)하여서 수행될 수 있다.
DNA 벡터 (예를 들어, 플라스미드)의 도입 및 선택 이후에, 상동성 사건이 전형적으로 발생되어서 PAM 서열의 제거를 야기한다.
추가로, 상동성 재조합을 위한 주형 DNA를 보유하는 DNA 벡터 (예를 들어, 플라스미드)는 전형적으로 재조합 속도를 증가시키는 유전자의 발현을 허용한다.
일 구현예에서, DNA 벡터는 상동성 재조합을 위한 주형 및 주형 영역의 외부에서 DNA 벡터 그 자체를 표적화하는 CRISPR-Cas 시스템을 포함하고, CRISPR-Cas 시스템 유래의 RNA 가이드 (crRNA 또는 sgRNA)는 전형적으로 DNA 표적과 일치하지 않는다.
일 구현예에서, 본 발명은 적어도
- 상기 정의된 바와 같은, 씨. 아크네스 파지로부터 기원하는 파지 패키징 신호 (cos);
- 상기 정의된 바와 같은, 씨. 아크네스에 대한 선택 마커;
- 상기 정의된 바와 같은, 씨. 아크네스에 대한 복제 기원; 및
- 씨. 아크네스에서 발현을 위한 CRISPR-Cas 시스템
을 포함하는 벡터를 사용하는 복제성 벡터 방법을 포괄한다.
일 구현예에서, 벡터는 자발적 돌연변이 또는 재조합에 의해서 CRISPR-Cas 시스템 표적 서열을 더 이상 보유하지 않는 씨. 아크네스 수용자 세포를 제외하고 대부분의 씨. 아크네스 수용자 세포의 사멸을 야기하는 이중 가닥 파괴를 유도할 수 있는 CRISPR-Cas 시스템을 보유한다.
씨. 아크네스 파지 게놈 조작
본 발명은 본 발명의 씨. 아크네스 파지 게놈을 조작하기 위한 방법 및 본 발명의 임의 방법을 통해 조작된 것인 조작된 씨. 아크네스 파지를 포괄한다. "조작된 또는 재조합 파지"는 자연계에 존재하거나 또는 존재하지 않는 변경을 함유하도록 본 발명의 임의 방법을 통해 수득된 파지이다. 예를 들어, 조작된 씨. 아크네스 파지 게놈은 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드의 치환, 결실, 또는 삽입을 보유한다. 다른 예에서, 씨. 아크네스 파지 게놈은 파지 감염 시 발현되는 하나 또는 몇 개 이식유전자를 보유한다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지는 씨. 아크네스 파지 게놈에 하나 또는 몇 개 유전자 변형을 함유한다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 게놈 변형은 씨. 아크네스 파지 게놈으로 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환이다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 게놈 변형은 침묵화이다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 게놈 변형은 침묵화가 아니다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 게놈 변형은 시. 아크네스 파지 생산을 손상시키지 않는다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 게놈 변형은 파지 숙주 범위를 변형시킨다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 게놈 변형은 캡시드 생산 그 자체를 방해하지 않고 파지 캡시드로 이의 패키징의 억제를 초래한다. 보다 바람직하게, 게놈 변형은 파지 패키징 서열의 변형이다. 보다 더 바람직하게 변형은 파지 패키징 서열의 결실이다.
일 구현예에서, 결실된 파지 패키징 서열은 씨. 아크네스 파지 유래 cos 부위이고, cos 부위 서열은 서열 SEQ ID NO: 66과 적어도 80, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일하다.
일 구현예에서, 결실된 파지 패키징 서열은 씨. 아크네스 파지 유래 cos 부위이고, cos 부위 서열은 서열 SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89 및 SEQ ID NO: 90으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열(들)과 적어도 80, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일하다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 변형은 코딩 서열 내에 존재한다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 변형은 조절 구성요소 예컨대 프로모터, 전사 종결자, 복제 기원, RBS, 리보스위치 내에 존재한다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 변형은 비-코딩 서열 및 비-조절 서열 내에 존재한다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 변형은 씨. 아크네스 파지 게놈으로 하나 또는 몇 개 이식유전자의 삽입이다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 변형은 씨. 아크네스 파지 게놈으로 하나 또는 몇 개 이식유전자이 삽입이고, 삽입은 파지 게놈에 본래 존재하는 임의의 뉴클레오티드를 제거하지 않는다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 변형은 씨. 아크네스 파지 게놈으로 하나 또는 몇 개 이식유전자의 삽입이고, 삽입은 유전자간 영역에 존재한다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 변형은 씨. 아크네스 파지 게놈으로 하나 또는 몇 개 이식유전자의 삽입이고, 삽입은 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드를 치환시킨다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 변형은 씨. 아크네스 파지 게놈으로 하나 또는 몇 개 이식유전자의 삽입이고, 이식유전자는 상류 및 하류 유전자를 방해하지 않고 하나 또는 몇 개 유전자를 함유하는 전사 유닛 내 하나 또는 몇 개 유전자를 치환시킨다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 변형은 씨. 아크네스 파지 게놈으로 하나 또는 몇 개 이식유전자의 삽입이고, 이식유전자는 홀린 유전자를 치환한다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 변형은 씨. 아크네스 파지 게놈으로 하나 또는 몇 개 이식유전자의 삽입이고, 이식유전자는 엔도리신 유전자를 치환한다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 변형은 씨. 아크네스 파지 게놈으로 하나 또는 몇 개 이식유전자의 삽입이고, 이식유전자는 홀린 및 엔도리신 유전자를 치환한다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 변형은 씨. 아크네스 파지 게놈으로 하나 또는 몇 개 이식유전자의 삽입이고, 홀린 및 엔도리신 유전자는 불활성화되도록 이전에 변형된다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 변형은 씨. 아크네스 파지 게놈으로 하나 또는 몇 개 이식유전자의 삽입이고, 이식유전자는 상기 정의된 바와 같이, 씨. 아크네스에서 선택 마커이다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 변형은 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원의 삽입이다. 일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 변형은
- 상기 정의된 바와 같은, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원, 및
- 상기 정의된 바와 같은, 씨. 아크네스에서 선택 마커의 삽입이다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 변형은 씨. 아크네스 파지 게놈으로 하나 또는 몇 개 이식유전자의 삽입이고, 각각의 이식유전자는 프로모터, 하나 또는 몇 개 코딩 서열 및 전사 종결자를 함유한다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 변형은 씨. 아크네스 파지 게놈으로 하나 또는 몇 개 이식유전자의 삽입이고, 각각의 이식유전자는 프로모터, 그들 리보솜 결합 부위가 존재하는 하나 또는 몇 개 코딩 서열 및 전사 종결자를 함유하고, 프로모터는 유도성이다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 변형은 씨. 아크네스 파지 게놈으로 하나 또는 몇 개 이식유전자의 삽입이고, 각각의 이식유전자는 프로모터, 그들 리보솜 결합 부위가 존재하는 하나 또는 몇 개 코딩 서열, 및 전사 종결자를 함유하고, 프로모터는 특별한 씨. 아크네스 균주에서 활성이지만, 다른 씨. 아크네스 균주에서는 불활성이거나 또는 활성이 덜하다.
씨. 아크네스 파지 게놈를 조작하기 위해서, 본 발명자는 하기 단계를 통해서 재조합 씨. 아크네스 파지를 생성시키기 위한 방법을 개발하였다:
- 재조합 파지 게놈의 시험관내 또는 생체내 DNA 조립의 사용, 및 재조합 파지의 생산을 허용하는 재부팅 박테리아 예컨대, 제한없이, 씨. 아크네스로 재조합 파지 게놈의 도입 단계; 및/또는
- 씨. 아크네스에서 재조합의 사용 및 복제성 CRISPR-Cas 시스템 선택 벡터를 사용한 재조합 파지의 선택 단계.
게놈 조립 및 재부팅 방법에 의한 재조합 씨. 아크네스 파지 조작
본 발명은 변형된 파지 게놈을 생성시키도록 DNA 조립을 사용한 조작된 파지의 생산 및 조립된 변형된 파지 게놈을 함유하는 파지의 후속 생성을 위한 방법을 포괄한다.
일 구현예에서, DNA 단편은 재조합 씨. 아크네스 파지 게놈으로 조립되고 재부팅 박테리아에 도입되어서 재조합 씨. 아크네스 파지를 생산한다.
일 구현예에서, DNA 단편은 재조합 씨. 아크네스 파지 게놈으로 조립되고 재부팅 박테리아를 형질전환시켜서 재조합 씨. 아크네스 파지를 생산한다.
일 구현예에서, 재부팅 박테리아는 프로피오니박테리아세아에 (Propionibacteriaceae) 과 유래이다. 바람직하게, 재부팅 박테리아는 피. 프로덴레이치이 (P. freudenreichii)이고, 보다 더 바람직하게 재부팅 박테리아는 씨. 아크네스이다.
일 구현예에서, DNA 단편은 벡터 내 재조합 씨. 아크네스 파지 게놈으로 조립되고 재부팅 박테리아에 도입되어서 재조합 씨. 아크네스 파지를 생산한다.
일 구현예에서, DNA 단편은 벡터 내 재조합 씨. 아크네스 파지 게놈으로 조립되고, 재조합 파지가 생산된 다음에 씨. 아크네스 상에서 증폭되는 씨. 아크네스에 재조합 씨. 아크네스 파지 게놈을 보유하는 벡터를 접합시키는 박테리아 예컨대 이. 콜라이에 도입된다.
일 구현예에서, DNA 단편은 벡터 내 재조합 씨. 아크네스 파지 게놈으로 조힙되고, 재조합 파지를 생산한 다음에 씨. 아크네스 상에서 증폭시키는 씨. 아크네스에 재조합 씨. 아크네스 파지 게놈을 보유하는 벡터를 접합시키는 박테리아 예컨대 이. 콜라이에 형질전환된다.
일 구현예에서, DNA 단편은 벡터 내 재조합 씨. 아크네스 파지 게놈으로 조립되고, 벡터는
- 상기 정의된 바와 같은, 이. 콜라이에서 복제를 허용하는 복제 기원;
- 상기 정의된 바와 같은, 이. 콜라이에 대한 선택 마커;
- 상기 정의된 바와 같은, 접합성 플라스미드 유래 oriT;
- 임의로 접합성 플라스미드 유래 렐락사제; 및
- 임의로 상기 정의된 바와 같은, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원을 함유하고, 접합성 벡터를 보유하는 이. 콜라이로 형질전환된다. 재조합 씨. 아크네스 파지 게놈을 함유하는 벡터는 이어서 전형적으로 씨. 아크네스에 접합된다.
일 구현예에서, DNA 단편이 재조합 씨. 아크네스 파지 게놈로 조립되는 벡터는 박테리아 인공 염색체 (BAC)이다.
일 구현예에서, DNA 단편은 하기 기술 중 하나 또는 조합을 사용하여 시험관내에서 재조합 씨. 아크네스 파지 게놈로 조립된다:
- 깁슨 조립,
- PCR 조립,
- 골든 게이트 조립 및 파생품 (MOCLO, GoldenBraid...),
- GeneArt® Seamless 조립,
- SLIC 조립,
- CPEC 조립,
- LiCE 조립.
일 구현예에서, DNA 단편은 하기 방법 중 하나 또는 하기 방법의 조합을 통해서 생산된다:
- 씨. 아크네스 파지 게놈에 대한 PCR,
- 씨. 아크네스 파지 게놈의 분해,
- DNA 합성 (화학적 또는 효소적),
- 올리고 조립.
일 구현예에서, DNA 단편은 효모에서 형질전환 연관된 재조합 (Transformation Associated Recombination)(TAR)을 사용하여 생체내에서 재조합 씨. 아크네스 파지 게놈으로 조립된다.
일 구현예에서, DNA 단편은 클로닝 벡터 예컨대 박테리아 인공 염색체 (BAC), 효모 인공 염색체 (YAC), P1-유래 인공 염색체, 플라스미드 또는 임의 조합 내에 재조합 파지 게놈으로, 시험관내에서 또는 생체내에서 조립된다. 재조합 파지 게놈은 이후에 전형적으로 클로닝 벡터로부터 추출되고, 임의로 원형화되고, 재부팅 박테리아 균주에 도입된다.
일 구현예에서, 재조합 씨. 아크네스 파지 게놈은 형질전환을 통해서 씨. 아크네스에 도입된다. 보다 바람직하게 재조합 씨. 아크네스 파지 게놈은 전기천공을 통해서 씨. 아크네스에 도입된다.
일 구현예에서, 재조합 씨. 아크네스 파지 게놈은 씨. 아크네스 L-형 또는 씨. 아크네스 원형질체에 도입된다.
재조합 방법에 의한 씨. 아크네스 파지 조작
본 발명은 DNA 주형 및 씨. 아크네스 파지 게놈 간 재조합을 사용하여 씨. 아크네스 파지 게놈으로 변형을 도입시키는 단계, 및 변형된 파지 게놈을 함유하는 파지의 생성 단계를 포함하는 조작된 파지를 제조하기 위한 방법을 포괄한다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 게놈은 DNA 주형을 함유하는 씨. 아크네스 균주에 도입되고, 파지 게놈 및 DNA 주형 간 재조합 사건은 파지 게놈의 일부의 변형을 야기한 다음에 씨. 아크네스 파지에 패키징된다.
일 구현예에서, 조작된 씨. 아크네스 파지는
- 상기 정의된 바와 같은, 씨. 아크네스를 위한 선택 마커,
- 상기 정의된 바와 같은, 씨. 아크네스를 위한 복제 기원,
- 하나 또는 2개 상동성 팔부를 갖는 재조합 주형, 및
- 임의로 재조합 기구를 함유하는 복제성 벡터를 포함하는 씨. 아크네스 세포로 씨. 아크네스 파지 게놈의 도입 후에 생산된다.
일 구현예에서, 조작된 씨. 아크네스 파지는
- 상기 정의된 바와 같은, 도너 박테리아 예컨대 이. 콜라이에 대한 선택 마커,
- 상기 정의된 바와 같은 도너 박테리아 예컨대 이. 콜라이에 대한 복제 기원,
- 상기 정의된 바와 같은, 씨. 아크네스에 대한 선택 마커,
- 상기 정의된 바와 같은, 접합성 플라스미드 유래 oriT,
- 임의로 접합성 플라스미드 유래 렐락사제,
- 상기 정의된 바와 같은, 씨. 아크네스에 대한 복제 기원,
- 하나 또는 2개 상동성 팔부를 갖는 재조합 주형, 및
- 임의로 재조합 기구
를 함유하는 복제성 벡터를 갖는 씨. 아크네스로 씨. 아크네스 파지 게놈의 도입 후 생산된다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 게놈은 전기천공을 통해서 씨. 아크네스에 도입된다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지 게놈은 파지에 의한 감염을 통해서 씨. 아크네스에 도입된다.
일 구현예에서, 상동성 재조합을 위한 DNA 주형은 전기천공에 의해 도입되는 선형 이중 가닥 DNA (dsDNA) 또는 단일 가닥 DNA (ssDNA)이다.
일 구현예에서, 상도성 재조합을 위한 DNA 주형은 올리고뉴클레오티드이다.
일 구현예에서, 파지 게놈 및 DNA 주형 둘 모두는 씨. 아크네스에 형질전환된다. 바람직하게, 형질전환 방법은 전기천공이다.
재조합 파지 CRISPR-Cas 시스템 선택 방법
본 발명은 재조합 파지 CRISPR-Cas 시스템 선택 방법을 포괄한다. 본 발명은 씨. 아크네스에서 발현되고, 야생형 파지 또는 이전에 변형된 파지 게놈을 표적화하지만, 새롭게 생성된 재조합 씨. 아크네스 파지 게놈은 표적화하지 않는 조작된 CRISPR-Cas 시스템을 보유하는 씨. 아크네스 세포를 포괄한다.
일 구현예에서, 조작된 CRISPR-Cas 시스템은 내생성 CRISPR-Cas 시스템이다.
다른 구현예에서, CRISPR-Cas 시스템은 외생성 CRISPR-Cas 시스템이다.
일 구현예에서, CRISPR-Cas 시스템은 씨. 아크네스 염색체에 통합된 외생성 CRISPR-Cas 시스템이다.
일 구현예에서, CRISPR-Cas 시스템은 복제성 벡터 상의 외생성 CRISPR-Cas 시스템이다.
일 구현예에서, 본 발명은 적어도 하기를 포함하는, 복제성 CRISPR-Cas 시스템 선택 벡터를 포괄한다:
- 상기 정의된 바와 같은 씨. 아크네스에 대한 선택 마커,
- 상기 정의된 바와 같은, 씨. 아크네스에 대한 복제 기원, 및
- 씨. 아크네스에서 발현되고, 야생형 씨. 아크네스 파지 게놈 또는 이전에 변형된 파지 게놈을 표적화하지만, 새롭게 생성된 재조합 씨. 아크네스 파지 게놈은 표적화하지 않는 외생성 CIRSPR-Cas 시스템.
일 구현예에서, 본 발명은 적어도 하기를 포함하는 복제성 CRISPR-Cas 시스템 선택 벡터를 포괄한다:
- 상기 정의된 바와 같은, 도너 박테리아 예컨대 이. 콜라이에 대한 선택 마커,
- 상기 정의된 바와 같은, 도너 박테리아 예컨대 이. 콜라이에 대한 복제 기원,
- 상기 정의된 바와 같은, 씨. 아크네스에 대한 선택 마커,
- 상기 정의된 바와 같은, 접합성 플라스미드 유래 oriT
- 임의로 접합성 플라스미드 유래 렐락사제,
- 상기 정의된 바와 같은, 씨. 아크네스에 대한 복제 기원, 및
- 씨. 아크네스에서 발현되고, 야생형 씨. 아크네스 파지 게놈 또는 이전에 변형된 파지 게놈을 표적화하지만, 새롭게 생성된 재조합 씨. 아크네스 파지 게놈은 표적화하지 않는 외생성 CRISPR-Cas 시스템.
일 구현예에서, 방법은 씨. 아크네스, 예를 들어, 균주 ATCC 6919에, 하기를 함유하는 복제성 CRISPR-Cas 시스템 선택 벡터를 접합시키는 단계를 포함한다:
- 상기 정의된 바와 같은, 도너 박테리아 예컨대 이. 콜라이에 대한 선택 마커,
- 상기 정의된 바와 같은, 도너 박테리아 예컨대 이. 콜라이에 대한 복제 기원,
- 상기 정의된 바와 같은, 씨. 아크네스에 대한 선택 마커,
- 상기 정의된 바와 같은, 접합성 플라스미드 유래 oriT,
- 임의로 접합성 플라스미드 유래 렐락사제,
- 상기 정의된 바와 같은, 씨. 아크네스에 대한 복제 기원, 및
- 씨. 아크네스에서 발현되고, 야생형 씨. 아크네스 파지 게놈 또는 이전에 변형된 파지 게놈을 표적화하지만, 새롭게 생성된 재조합 씨. 아크네스 파지 게놈은 표적화하지 않는 외생성 CRISPR-Cas 시스템.
씨. 아크네스로 접합 후, 피전달접합체는 전형적으로 적절한 항생제 상에서 선택된다. 씨. 아크네스에서 복제성 CRISPR-Cas 시스템 선택 벡터의 존재의 PCR을 통한 임의의 확인 후, 단일 콜로니는 전형적으로 적절한 항생제의 존재 하에서 조밀한 배양으로 성장되고, 바람직하게 야생형 파지, 또는 이전에 생산된 재조합 파지, 및 새롭게 생산된 재조합 파지의 혼합물을 함유하는 씨. 아크네스 파지 현탁물과 혼합되고, 전형적으로 상부 한천 론으로서 부어진다. 임의로, 재조합 씨. 아크네스 파지의 제1 증폭은 복제성 CRISPR-Cas 시스템 선택 벡터를 보유하는 씨. 아크네스에 대해 수행될 수 있고, 파지 현탁물이 전형적으로 수득될 수 있으며, 상부 한천에 대한 복제성 CRISPR-Cas 시스템 선택 벡터를 보유하는 씨. 아크네스의 새로운 배양물과 혼합된다.
새롭게 생성된 재조합 파지는 전형적으로 결합하여, 그들 재조합 파지 게놈을 주입하고, 복제되어서 새로운 재조합 입자를 생성하여 플라크 형성을 일으키는데 반해서, 야생형 또는 이전에 생성된 재조합 파지는 CRISPR-Cas 시스템에 의해 인식되고 절단되는 그들 파지 게놈을 주입하여서 파지 복제 주기의 중단을 야기하고, 따라서 플라크 생산이 일어나지 않게 된다. 전형적으로 단일 플라크를 선택하여, 단리하여서, 재조합체이고 예상되는 유전자 변형을 보유하는 것을 확인한다. 마지막으로, 단리된 플라크는 전형적으로 씨. 아크네스 지시자 균주 또는 복제성 CRISPR-Cas 시스템 선택 벡터를 보유하는 씨. 아크네스로 재증폭되어서 바람직하게 순수한 파지 현탁물이 저장된다.
일 구현예에서, 재조합 DNA 파지는 예를 들어, 연관된 PAM 서열을 갖지 않기 때문에 CRISPR-Cas 시스템에 의해 표적화되지 않는다.
씨. 아크네스에서 재조합 파지를 제조하기 위한 방법
본 발명은 씨. 아크네스에서 파지-유래 입자를 제조하기 위한 방법을 포괄한다. 지금까지 기술된 씨. 아크네스 파지는 모두 유전적으로 극도로 보존되어 있고, 플라스미드 상태로서, 또는 그들 숙주의 염색체에서 통합되어서 안정하게 복제될 수 없다.1 그 결과로서, 그들은 그들이 감염시킨 세포의 사멸을 초래하기 때문에 조작하는 것이 어렵다. 이러한 문제를 해결하기 위해서, 본 발명자는 씨. 아크네스 파지를 조작하기 위한 2-단계 방법을 개발하였다.
제1 단계에서, 접합성 벡터를 보유하는 이. 콜라이 도너 균주는 하기를 포함하는 가동성 복제성 벡터 복제성 벡터 (예를 들어, pEB-PRECOMB)로 형질전환된다:
- 상기 정의된 바와 같은, 이. 콜라이에 대한 선택 마커,
- 상기 정의된 바와 같은, 이. 콜라이에 대한 복제 기원,
- 상기 정의된 바와 같은, 씨. 아크네스에 대한 선택 마커,
- 접합성 플라스미드 유래 렐락사제 및 oriT, 및
- 하나 또는 2개 상동성 팔부를 갖는 재조합 주형.
이. 콜라이 도너 세포 (이. 콜라이 pEB-PRECOMB) 및 씨. 아크네스 수용자 세포 (예를 들어, 씨. 아크네스 ATCC 6919) 간 접합이 수행된다. 씨. 아크네스 피전달접합체 (씨. 아크네스 pEB-PRECOMB)는 전형적으로 적절한 항생제 상에서 선택되어서 성장되고 씨. 아크네스 파지 (예를 들어, PAC7)에 의해 감염된다. 파지 감염 이후에, 재조합 사건이 일어나서, 야생형 씨. 아크네스 파지 (예를 들어, wt PAC7) 또는 부모 씨. 아크네스 파지 (즉, 원하는 재조합 파지가 기원하는 파지) 및 재조합 파지 (예를 들어, mt PAC7)를 함유하는 파지 용해물이 생성된다 (도 7A).
제2 단계에서, 복제성 플라스미드 (예를 들어, pEB-PSCREEN)는 하기를 포함하는 것이 사용된다:
- 상기 정의된 바와 같은, 이. 콜라이에 대한 선택 마커,
- 상기 정의된 바와 같은, 이. 콜라이에 대한 복제 기원,
- 상기 정의된 바와 같은, 씨. 아크네스에 대한 선택 마커, 및
- 상기 정의된 바와 같은, 접합성 벡터 유래 렐락사제 및 oriT, 및
- 씨. 아크네스에서 발현 및 야생형 파지 (예를 들어, PAC7)의 표적화를 위한 CRISPR-Cas 시스템.
일 구현예에서, 상기 복제성 플라스미드는 접합성 플라스미드를 보유하는 이. 콜라이 도너 균주로 형질전환된다 (예를 들어, 이. 콜라이 도너 균주pEB-PSCREEN의 생산이 일어남). 접합은 이. 콜라이 도너 균주 pEB-PSCREEN 및 씨. 아크네스 수용자 세포 (예를 들어, 씨. 아크네스 ATCC 6919) 간에 수행된다. 피전달접합체 씨. 아크네스 pEB-PSCREEN 세포는 전형적으로 항생제 플레이트 상에서 선택되고, 조밀한 배양으로 성장되고, 야생형 파지 (예를 들어, wt PAC7) 및 돌연변이체 파지 (예를 들어, mt PAC7)를 함유하는 파지 용해물과 혼합된다 (도 7B). 야생형 파지 게놈은 전형적으로 CRISPR-Cas 뉴클레아제에 의해 절단되고 복제될 수 없어서 플라크를 형성할 수 없는데 반해서, 재조합 mt 파지 게놈은 CRISPR-Cas 시스템에 의해 인식되지 않고 성공적으로 복제되어서 플라크 형성을 일으킨다. 단일 프라크를 전형적으로 단리하고, PCR을 통해 스크리닝하고 서열을 검증한다. 시퀀싱으로 확인되면, 재조합 파지는 전형적으로 야생형 씨. 아크네스 균주 또는 야생형 파지를 표적화하는 CRISPR-Cas 시스템 벡터를 갖는 씨. 아크네스 균주에서 증폭된다.
재조합 사건은 치환, 결실, 또는 삽입을 야기할 수 있고, 따라서 PAM 서열 또는 CRISPR-Cas 표적화에 필요한 서열의 임의 부분의 제거를 일으킨다. 삽입은 재조합 플라크를 단리하는데 도움이 되는 형광성 또는 효소적 리포터의 도입을 일으킬 수 있다.
상동성 재조합을 위한 주형은 전형적으로 재조합 지점의 상류 및 하류에 상동성 팔부를 함유한다. 이들 상동성 팔부는 전형적으로 적어도 50, 100, 500, 1000 또는 적어도 5000 bp 크기이다.
씨. 아크네스의 조작의 적용 예는 하기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:
- 파지 감염 동안 생산되고 세포가 용해될 때 방출되는 치료적 단백질의 발현,
- 파지 감염 동안 생산, 분비 또는 표면으로 이출되는 치료적 단백질의 발현,
- 파지의 캡시드 상에 특별한 단백질, 예컨대 항원의 표시,
- 파지의 숙주 범위의 변형, 및
- 엄격 용해성 파지 변이체의 수득.
추가적으로, 상동성 재조합을 위한 주형 DNA를 보유하는 벡터 (예를 들어, 플라스미드)는 전형적으로 재조합 속도를 증가시키는 유전자의 발현을 허용한다.
추가적으로, 상동성 재조합을 위한 주형 DNA를 보유하는 벡터 (예를 들어, 플라스미드)는 전형적으로 파지의 감염 동안 벡터의 선형화를 일으키는, 유도성 엔도뉴클레아제, 예컨대 제한없이, CRISPR-Cas 를 보유한다. 주형 벡터의 이러한 선형화는 전형적으로 재조합 속도의 증가를 야기한다.
조작된 씨. 아크네스 파지에 의한 단백질의 발현
본 발명은 조작된 씨. 아크네스 파지에 의한 단백질의 발현을 포괄한다. 파지로 발현 카세트의 도입을 통해서 단백질은 감염된 씨. 아크네스에 의해 발현될 수 있다. 발현 카세트 내 프로모터는 유도성일 수 있거나 또는 항상성일 수 있어서, 조작된 씨. 아크네스 파지에 의한 단백질의 유도성 또는 항상성 발현을 허용한다.
일 구현예에서, 파지는 씨. 아크네스-숙주 상호작용의 조절 및/또는 관심 분자의 발현에 사용된다. 일 구현예에서, 파지 게놈은 씨. 아크네스에서 이식유전자의 발현에 사용된다. 이식유전자는 소정 프로모터 (항상성 또는 유도성)의 제어 하에 이어서 소정 종결자가 후속되는 재조합 자율-복제 파지에 클로닝될 수 있다. 씨. 아크네스로 이러한 파지 게놈의 주입은 이식유전자의 발현을 허용한다. 이식유전자는 예를 들어, CRISPR-Cas 시스템, 염기 편집 또는 프라임 편집 발현 카세트일 수 있거나, 또는 인간 단백질, 예컨대 인터루킨을 코딩할 수 있거나, 또는 하기에 정의되는 바와 같이, 항원, 예컨대 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 자기-항원, 알레르겐 또는 이식-특이적 항원을 코딩할 수 있다.
조작된 씨. 아크네스 균주에 의한 단백질의 발현
본 발명은 조작된 씨. 아크네스 균주에 의한 단백질의 발현을 포괄한다. DNA 벡터로 발현 카세트를 도입시켜서, 단백질은 형질도입된 씨. 아크네스에 의해서 발현될 수 있다. 발현 카세트 내 프로모터는 유도성 또는 항상성일 수 있어서, 조작된 씨. 아크네스 균주에 의한 단백질의 유도성 또는 항상성 발현을 허용한다. 몇 개 단백질의 발현은 단일 전사 유닛 (오페론)으로서 또는 별개의 전사 유닛으로서 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 단백질은 하기에 정의되는 바와 같은, 항원, 예컨대 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 자기-항원, 알레르겐 또는 이식편-특이적 항원이다.
씨. 아크네스 파지
본 발명은 씨. 아크네스 파지 및 관련 조작된 파지, 이들 파지를 제조 하기 위한 방법, 및 씨. 아크네스를 형질도입시키기 위해 이들 파지를 사용하기 위한 방법을 포괄한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조작된 씨. 아크네스 파지는 자기-번식할 수 없다.
본 발명의 상황에서, 용어 "자기-번식" 및 "자기-복제"는 평등하게 사용되고, 자손을 갖는 능력, 특히 새로운 파지를 생산하는 능력을 의미한다.
본 명세서에서 "자기-번식을 할 수 없는 파지"란 상기 파지를 생산하는데 필요한 적어도 하나, 몇개 또는 모든 기능성 유전자(들) (본 명세서에서 "필수 유전자(들)"라고 함)가 상기 조작된 파지 (및 상기 조작된 파지에 포함되는 상기 파지 게놈)에서 부재하는 것을 의미한다.
바람직한 구현예에서, 상기 조작된 파지를 생산하는데 필요한 상기 적어도 하나, 몇 개 또는 기능성 유전자(들)는 생산자 세포, 바람직하게 플라스미드, 파지미드, 염색체 또는 생산자 세포에 존재하는 헬퍼 파지에 존재하여서, 상기 생산자 세포에서 상기 조작된 파지의 생산을 가능하게 한다. 이러한 구현예에서, 자기-번식할 수 없는 상기 조작된 씨. 아크네스 파지는 또한 조건적 복제성 씨. 아크네스 파지라고 한다.
본 발명의 상황에서, 조작된 파지를 생산하는데 필요한 상기 기능성 유전자는 (i) 상응하는 유전자의 부재 또는 (ii) 비기능성 형태로 상응하는 유전자의 존재를 통해서 부재할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조작된 파지를 생산하는데 필요한 상기 유전자의 서열은 상기 조작된 파지에서 부재한다. 바람직한 구현예에서, 상기 조작된 파지를 생산하는데 필요한 상기 유전자의 서열은 관심 핵산 서열로 치환된 것이다.
대안적으로, 상기 조작된 파지를 생산하는데 필요한 상기 유전자는 상기 조작된 파지에서, 비기능성 형태로, 예를 들어, 돌연변이체 비기능성 형태로, 또는 비발현성 형태로, 예를 들어, 결실되거나 또는 돌연변이된 비기능성 조절인자로, 존재한다. 바람직한 구현예에서, 상기 조작된 파지를 생산하는데 필요한 상기 유전자는 상기 조작된 파지에서, 생산자 세포에서 기능성인 채로 남아있지만, 수용자 세포에서는 비기능성이게 만드는 돌연변이된 형태로 존재한다.
본 발명의 상황에서, 상기 조작된 파지를 생산하는데 필요한 유전자는 상기 조작된 파지의 생산을 위해 요구되는 임의의 코딩 또는 비-코딩 핵산을 포괄한다.
상기 조작된 파지를 생산하는데 필요한 유전자의 예는 파지 구조 단백질을 코딩하는 유전자; 유전자 발현의 제어에 관여되는 파지 유전자; 전사 및/또는 번역 조절에 관여되는 파지 유전자; 파지 DNA 복제에 관여되는 파지 유전자; 파지 단백질의 생산에 관여되는 파지 유전자; 파지 단백질 폴딩에 관여되는 파지 유전자; 파지 DNA 패키징에 관여되는 파지 유전자; 및 박테리아 세포 용해에 관여되는 단백질을 코딩하는 파지 유전자를 포함한다.
일 구현예에서, 조작된 씨. 아크네스 파지는 상기 정의된 바와 같은 필수 유전자를 포함하고, 이의 발현은 씨. 아크네스 파지 프로모터에 의해 제어된다. 이것은 항상적으로 또는 유도성 시스템, 예컨대 유도성 프로모터 또는 리보스위치 하에서 발현될 수 있다. 상기 필수 유전자가 유도성 시스템 하에 존재할 때, 상기 조작된 씨. 아크네스 파지는 또한 조건적 복제성 파지로서 간주된다.
일 구현예에서, 조건적 복제성 파지는 특히 상기 조건적 복제성 파지에 부재하는 상기 필수 유전자(들)를 포함하지 않는, 비-조작된 씨. 아크네스 생산 균주를 사멸시키지 않거나 또는 사멸시킬 수 없다.
일 구현예에서, 조건적 복제성 파지는 CRISPR-Cas 시스템을 보유한다.
일 구현예에서, 조건적 복제성 파지는 이식유전자를 포함한다.
씨. 아크네스에서 파지-유래 입자
본 발명은 본 발명의 임의의 DNA 벡터를 포함하는 파지-유래 입자 및 이들 파지-유래 입자를 제조하기 위한 방법을 포괄한다.
일 구현예에서 본 발명의 임의의 DNA 벡터를 보유하는 씨. 아크네스 균주는 씨. 아크네스 파지와 접촉하여서 씨. 아크네스 균주로 파지 게놈의 도입 및 파지 캡시드의 조립 및 파지 캡시드 내부에 DNA 벡터의 패키징을 위해 필요한 파지 단백질의 발현을 야기한다.
일 구현예에서 상기 정의된 바와 같은 씨. 아크네스에 대한 선택 마커, 상기 정의된 바와 같은 씨. 아크네스 파지 패키징 신호 (cos 부위), 및 상기 정의된 바와 같은 씨. 아크네스에 대한 복제 기원을 포함하는 임의의 DNA 벡터를 보유하는 씨. 아크네스 균주는 씨. 아크네스 파지와 접촉하여서, 씨. 아크네스 균주로 파지 게놈의 도입 및 파지 캡시드의 조립 및 파지 캡시드 내부에 DNA 벡터의 패키징을 위해 필요한 파지 단백질의 발현을 야기한다.
일 구현예에서, 파지 게놈은 야생형 파지 게놈이다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스 파지는 PAC7 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 68)이다.
일 구현예에서, 파지 게놈은 조작된 파지 게놈이다.
파지-유래 입자는 당분야에 공지된 방법을 통해서 정제될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 DNA 벡터를 포함하는 정제된 파지-유래 입자를 포괄한다. 일 구현예에서, 정제된 파지-유래 입자는 단리된 조성물 또는 약학 조성물에 존재한다. 조성물은 적어도 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 또는 그 이상의 정제된 파지-유래 입자를 포함할 수 있다.
파지-유래 입자에 의한 씨. 아크네스의 서열 특이적 사멸
일 구현예에서, 본 발명은 CRISPR-Cas 시스템을 보유하는 파지-유래 입자에 의한 씨. 아크네스의 특이적 사멸을 포함한다.
CRISPR-Cas 시스템을 코딩하는 벡터 (예를 들어, 플라스미드)를 보유하는 파지-유래 입자는 최근에 박테리아의 원위치 서열 특이적 사멸을 수행하는데 사용되었다10,11. 본 발명자는 씨. 아크네스를 표적화하기 위한 이러한 파지-유래 입자의 제조하는 방법을 개발하였고, 본 발명에 포괄된다.
상기 방법에서, 본 발명의 DNA 벡터를 포함하는 씨. 아크네스 생산자 균주는 씨. 아크네스 파지, 예컨대 PAC7 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 68)과 접촉되어서 고 역가 파지 현탁물을 생성시킨다.
일 구현예에서, 씨. 아크네스는
- 상기 정의된 바와 같은, 씨. 아크네스에 대한 선택 마커,
- 상기 정의된 바와 같은, 씨. 아크네스 파지 패키징 신호 (cos 부위),
- 상기 정의된 바와 같은, 씨. 아크네스에 대한 복제 기원, 및
- 특이적 씨. 아크네스 수용자 세포 염색체 유전자좌 (pTarget)를 표적화하는 CRISPR-Cas 시스템
을 포함하는 DNA 벡터를 포함한다.
고 역가 씨. 아크네스 파지 현탁물은 전형적으로 씨. 아크네스에 첨가된다. 전형적으로 현탁물은 플라스미드를 보유하는 파지-유래 입자 및 야생형 파지의 믹스를 함유한다. pTarget CRISPR-Cas 시스템에 의해 표적화되는 유전자좌를 보유하는 씨. 아크네스 세포의 접촉은 전형적으로 pTarget을 함유하는 파지-유래 입자로 수행된다. 이것은 생체내 또는 시험관 내에서 수행될 수 있다. 서열 특이적 사멸은 전형적으로 pTarget을 포함하는 파지-유래 입자를 함유하는 용해물에 대해 관찰된다.
일 구현예에서, pTarget 벡터 (예를 들어, 플라스미드)를 포함하는 파지-유래 입자는 파지와 혼합되지 않고 CRISPR-Cas 시스템에 의해 표적화되는 DNA를 보유하는 세포의 서열 특이적 사멸을 허용한다.
씨. 아크네스 플라스미드 소실화
천연 발생 씨. 아크네스 플라스미드가 기술되었었고, 그들 중 일부는 프로-염증성 표현형15,23 및 심상성 좌창16-18 과 연관되었다. 이러한 플라스미드를 소실할 수 있는 것은 그들 효과, 특히 심상성 좌창에서 그들 프로-염증성 역할을 연구하기 위해 흥미롭다. 본 발명자는 씨. 아크네스 플라스미드를 소실시키는 방법을 개발하였다.
제1 단계에서,
- 상기 정의된 바와 같은 씨. 아크네스 파지 패키징 신호,
- 임의로 상기 정의된 바와 같은, 씨. 아크네스에 대한 선택 마커,
- 상기 정의된 바와 같은, 오직 씨. 아크네스 생산자 세포에서만 복제를 허용하는 복제 기원, 및
- 이식유전자, 예컨대 표적 씨. 아크네스 수용자 세포에서 소실시키려는 내생성 플라스미드의 유전자 서열을 표적화하는 CRISPR-Cas 시스템으로서, 서열이 바람직하게 보존된 영역 예컨대 복제 기원 또는 심상성 좌창과 연관된 유전자좌에 존재하는 것인 이식유전자
를 포함하는 DNA 벡터를 보유하는 씨. 아크네스 생산자 세포는 씨. 아크네스 파지에 의해 감염되어서 DNA 벡터를 보유하는 파지-유래 입자의 생산을 야기시킨다.
씨. 아크네스 파지-유래 입자와 소실시키려는 내생성 플라스미드, 예컨대 pIMPLE-HL096PA1을 보유하는 씨. 아크네스 수용자 세포의 접촉이 수행된다. 이것은 생체내 또는 시험관내에서 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 씨. 아크네스 형질도입체는 적절한 항생제에서 선택될 수 있다. 단일 콜로니는 전형적으로 항생제를 함유하는 배지의 플레이트 상에 스트리킹되고 플라스미드의 존재는 전형적으로 PCR을 통해서 스크리닝된다. 이후에 플라스미드 pIMPLE-HL096PA1에 대한 양성 PCR이 수득되지 않은 단일 콜로니는 CRISPR-Cas 시스템을 포함하는 벡터 (예를 들어, 플라스미드)가 소실되고, 전형적으로 저온저장된다.
치료 방법
본 발명은 씨. 아크네스 관련 장애 또는 질환을 치료하기 위한 방법을 포괄한다.
본 발명은 광범위 피부 질환 및/또는 장애의 치료 및/또는 예방을 위한, 상기 정의된 바와 같은 조작된 씨. 아크네스 균주, 상기 정의된 바와 같은 파지-유래 입자, 및 상기 정의된 바와 같은 조작된 파지, 및/또는 그들을 생산하는 박테리아의 용도를 포괄한다.
본 발명은 상기 정의된 바와 같은 조작된 씨. 아크네스 균주, 상기 정의된 바와 같은 파지-유래 입자, 및 상기 정의된 바와 같은 조작된 파지, 및/또는 그들을 생산하는 박테리아를 사용하여 피지 생산, 모낭 과각질화, 피부 박테리아의 집락화, 및 염증의 감소를 치료하기 위한 방법을 포괄한다.
본 발명은 화장품 및 다른 조성물에서 상기 정의된 바와 같은 조작된 씨. 아크네스 균주의 용도를 포괄한다.
일 구현예에서, 본 발명은 조작된 씨. 아크네스에 의한 치료적 분자의 발현을 포괄한다.
일 구현예에서, 본 발명은 조작된 씨. 아크네스에 의한 비-치료적 분자의 발현을 포괄한다.
큐티박테리움 아크네스는 인간 피부 상에서 가장 우세하고 풍부한 박테리아 중 하나로서, 피부 표면 (각질층) 및 모낭 둘 모두에서 발견될 수 있다12. 모낭 내부에서, 다양한 살아있는 세포 예컨대 각질세포, 줄기 세포, 피지 세포 및 면역 세포와 직접 접촉한다. 이것은 각질층의 경우는 아닌데, 여기서는 대부분이 죽은 각질세포와 접촉한다13. 따라서, 모낭 내부 및 외부에 원위치에서 치료적 분자의 생산 및 전달을 위한 박테리아 몸체로서 씨. 아크네스를 사용하는 것이 흥미로워 보인다.
상기 정의된 바와 같은 파지-유래 입자 및 상기 정의된 바와 같은 조작된 파지, 및/또는 그들을 생산하는 박테리아는 대상체에게 피부 또는 다른 적절한 투여 방법을 통해서 피부에 전달될 수 있다.
본 발명에 따른 대상체는 동물, 바람직하게 포유동물, 보다 더 바람직하게 인간이다. 그러나, 용어 "대상체"는 또한 치료를 필요로 하는, 비-인간 동물, 특히 포유동물, 예컨대, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 염소, 당나귀, 토끼, 페럿, 저빌, 햄스터, 친칠라, 래트, 마우스, 기니 피크 및 비-인간 영장류, 특히, 또는 비-포유동물 예컨대 가금류를 의미한다.
본 발명에 따른 인간 대상체는 출생전 단계 인간, 신생아, 아동, 유아, 청소년 또는 임의 연령의 성인일 수 있다.
바람직하게, 치료는 정기적으로, 바람직하게 매일 내지 매달, 보다 바람직하게 매일 내지 2주마다, 보다 바람직하게 매일 내지 매주 투여되고, 보다 더 바람직하게 치료는 매일 투여된다. 특정 구현예에서, 치료는 1일 수회, 바람직하게 1일 2회 또는 3회, 보다 더 바람직하게 1일 3회 투여된다.
본 발명에 따른 상기 정의된 바와 같은 조작된 씨. 아크네스 균주, 상기 정의된 바와 같은 파지-유래 이바, 상기 정의된 바와 같은 조작된 파지, 및/또는 그들을 생산하는 박테리아 (예를 들어, 이. 콜라이 또는 씨. 아크네스)를 사용한 치료의 지속기간은 바람직하게 1일 내지 20주, 보다 바람직하게 1일 내지 10주, 여전히 보다 바람직하게 1일 내지 4주, 보다 더 바람직하게 1일 내지 2주를 포함한다. 특정 구현예에서, 치료의 지속기간은 약 1주이다. 대안적으로, 치료는 감염, 장애, 및/또는 질환이 지속되는 한 지속될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 정의된 바와 같은 조작된 씨. 아크네스 균주, 상기 정의된 바와 같은 파지-유래 입자, 상기 정의된 바와 같은 조작된 파지, 및/또는 그들을 생산하는 박테리아 (예를 들어, 이. 콜라이 또는 씨. 아크네스)의 약학 또는 수의학 조성물의 형태, 투여 경로, 및 투여 용량은 질환, 장애 및/또는 감염의 유형 및 중증도 (예를 들어,질환, 장애 및/또는 감염에 관여되는 박테리아 종 및 환자 또는 대상체 신체에서 이의 위치에 의존), 및 환자 또는 대상체, 특히 이의 연령, 체중, 성별, 및 일반적인 신체 상태에 따라서 당업자가 조정할 수 있다.
특히, 투여하려는, 본 발명에 따른 상기 정의된 바와 같은 조작된 씨. 아크네스 균주, 상기 정의된 바와 같은 파지-유래 입자, 상기 정의된 바와 같은 조작된 파지, 및/또는 그들을 생산하는 박테리아 (예를 들어, 이. 콜라이 또는 씨. 아크네스)의 양은 당업자에게 충분히 공지된 표준 절차를 통해서 결정되어야 한다. 환자 또는 대상체의 생리적 데이터 (예를 들어, 연령, 체격, 및 체중) 및 투여 경로는 치료적 유효량이 환자 또는 대상체에게 투여될 것이므로 적절한 용량을 결정하기 위해 고려되어야 한다.
예를 들어, 각 투여를 위한, 본 발명에 따른, 상기 정의된 바와 같은 파지-유래 입자 및/또는 조작된 파지의 총량은 104 내지 1015 입자를 포함한다.
바람직하게, 각각의 투여를 위한, 본 발명에 따른 상기 정의된 바와 같은 파지-유래 입자 및/또는 상기 정의된 바와 같은 조작된 파지 (예를 들어, 이. 콜라이 또는 씨. 아크네스), 또는 상기 정의된 바와 같은 조작된 씨. 아크네스 균주를 생산하는 조작된 박테리아의 총량은 104 내지 1015 박테리아를 포함한다.
본 발명은 형질도입된 씨. 아크네스 개체군을 사멸시키기 위한 독소 예컨대 뉴클레아제, 보다 바람직하게 CRISPR-Cas 시스템의 발현을 위한 플라스미드를 포괄한다.
본 발명은 CRISPR-Cas 시스템이 오직 특별한 균주에만 존재하고 다른 것들에는 존재하지 않는 서열을 표적화하여 씨. 아크네스 개체군 중에서 균주 특이적 사멸을 허용하는 CRISPR-Cas 시스템의 발현을 위한 플라스미드를 포괄한다.
본 발명은 씨. 아크네스 염색체 또는 씨. 아크네스 내생성 플라스미드의 변형을 포괄한다. 씨. 아크네스-숙주 관계의 변경을 야기하는 변형, 예컨대 결실, 치환 및/또는 삽입이 예를 들어 고려된다.
본 발명은 치료적 분자의 생산에 관여하는 하나 또는 몇 개 유전자를 함유하는 치료적 분자의 발현을 위한, 벡터, 예를 들어 플라스미드를 포괄한다.
치료적 분자가 씨. 아크네스 세포로부터 자유롭게 확산되지 않는 경우에, 예컨대 치료적 단백질 경우에, 씨. 아크네스 세포의 세포막 또는 세포벽 상에서 분비 또는 이출을 허용하는 신호 펩티드와의 융합체는 바람직하게 벡터, 예를 들어, 플라스미드에서 코딩된다. 분비 시스템 또는 신호 펩티드의 예는 TAT, SEC 및 유형 VII/WXG100 분비 시스템을 포함한다. 보다 특히, 신호 펩티드는 단백질 PPA0532 (전형적으로 2020년 11월 4일자로 UniprotKB 데이터베이스에서 Q6AAD1로 참조됨); PPA0533 (전형적으로 2020년 11월 4일자로 UniprotKB 데이터베이스에서 Q6AAD0으로 참조됨); PPA0534 (전형적으로 2020년 11월 4일자로 UniprotKB 데이터베이스에서 Q6AAC9로 참조됨); PPA0598 (전형적으로 2020년 11월 4일자로 UniprotKB 데이터베이스에서 Q6AA63으로 참조됨); PPA0644 (전형적으로 2020년 11월 4일자로 UniprotKB 데이터베이스에서 Q6AA16으로 참조됨); PPA0687 (전형적으로 2020년 11월 4일자로 UniprotKB 데이터베이스에서 Q6A9X2로 참조됨); PPA0721 (전형적으로 2020년 11월 4일자로 UniprotKB 데이터베이스에서 Q6A9T8로 참조됨); PPA0816 (전형적으로 2020년 11월 4일자로 UniprotKB 데이터베이스에서 Q6A9J4로 참조됨); PPA1310 (전형적으로 2020년 11월 4일자로 UniprotKB 데이터베이스에서 Q6A856으로 참조됨); PPA1498 (전형적으로 2020년 11월 4일자로 UniprotKB 데이터베이스에서 Q6A7M0으로 참조됨); PPA1662 (전형적으로 2020년 11월 4일자로 UniprotKB 데이터베이스에서 Q6A771로 참조됨); PPA1715 (전형적으로 2020년 11월 4일자로 UniprotKB 데이터베이스에서 Q6A720으로 참조됨); PPA1939 (전형적으로 2020년 11월 4일자로 UniprotKB 데이터베이스에서 Q6A6F6으로 참조됨); PPA2097 (전형적으로 2020년 11월 4일자로 UniprotKB 데이터베이스에서 Q6A608로 참조됨); PPA2105 (전형적으로 2020년 11월 4일자로 UniprotKB 데이터베이스에서 Q6A601로 참조됨); PPA2106 (전형적으로 2020년 11월 4일자로 UniprotKB 데이터베이스에서 Q6A600으로 참조됨); PPA2142 (전형적으로 2020년 11월 4일자로 UniprotKB 데이터베이스에서 Q6A5W4로 참조됨); PPA2164 (전형적으로 2020년 11월 4일자로 UniprotKB 데이터베이스에서 Q6A5U3으로 참조됨); PPA2175 (전형적으로 2020년 11월 4일자로 UniprotKB 데이터베이스에서 Q6A5T2로 참조됨), PPA2152 (전형적으로 2020년 11월 4일자로 UniprotKB 데이터베이스에서 Q6A5V4로 참조됨); PPA1340 (전형적으로 2020년 11월 4일자로 UniprotKB 데이터베이스에서 Q6A826으로 참조됨), 및 PPA2239 (전형적으로 2020년 11월 4일자로 UniprotKB 데이터베이스에서 Q6A5M0으로 참조됨)로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질로부터 추출될 수 있다.
분비를 원치 않거나 또는 기능성이 아닌 경우에, 용해 모듈이 세포를 용해하고 치료적 분자를 방출하기 위해서, 벡터, 예를 들어 플라스미드에 첨가될 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 치료적 분자는 씨. 아크네스 세포의 세포막 또는 세포벽 상에 표시될 수 있다. 표시하기 위해서, 관심 단백질은 전형적으로 씨. 아크네스 유래 클래스 F 소르타제 (Girolamo, S. D. et al.. Biochem J 476, 665-682 (2019))가 세포벽에 관심 단백질을 공유적으로 연결하도록 허용하는 N-말단 분비 신호 펩티드 예컨대 상기 기술된 것들을 비롯하여 C-말단 LPXTG 모티프를 요구한다. 추가로, PT 풍부 영역은 LPXTG 모티프의 상류에 통합될 수 있다. 대안적으로 LPxTG 모티프에 이어서 소수성 아미노산 및 양으로 하전된 C-말단을 조합한 보다 고전적인 세포벽 분류 서열 (CWSS)이 사용될 수 있다.
치료적 분자의 발현을 제어하기 위해서, 오페론으로서 또는 단일한 단리된 유전자로서, 유전자 중 하나 또는 몇 개는 유도성 시스템, 예컨대 유도성 프로모터, 리보스위치, RNA-기반 유도 시스템 또는 이의 조합의 제어 하에 놓일 수 있다. 몇몇 전사 강도의 몇몇 프로모터가 시험될 수 있고, 치료적 분자의 원위치 생산을 위해 최적화하기 위해서 상이한 RBS 강도와 조합될 수 있다. RBS 라이브러리 접근법은 시험관내 또는 원위치 발현을 위한 최선 RBS 변이체를 선택하기 위해 사용될 수 있다.
치료적 분자의 예는 항체, 항체-기반 약물, Fc 융합 단백질, 항응고제, 혈액 인자, 골 형태발생성 단백질, 조작된 단백질 스캐폴드, 효소, 성장 인자, 호르몬, 인터페론, 인터루킨, 및 혈전용해제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 예는 표적에 비공유적으로 결합되는 것들 (예를 들어, 단일클론 항체), 공유 결합에 영향을 미치는 것들 (예를 들어, 효소), 및 특이적 상호작용없이 활성을 발휘하는 것들 (예를 들어, 혈청 알부민)을 포함한다.
예를 들어, 암, 면역 장애, 감염 및/또는 다른 질환을 치료하기 위해 사용되는 치료적 분자 (예를 들어, 재조합 치료적 단백질)가 또한 본 명세서에서 고려된다. 이중특이적 mAb 및 다중특이적 융합 단백질, 및 약동학이 최적화된 단백질을 포함하는, 조작된 단백질이 또한 본 개시에 의해 고려된다.
일부 구현예에서, 치료적 단백질은 에타너셉트, 베바시주맙, 리툭시맙, 아달리무맙, 인플릭시맙, 트라스투주맙, 인슐린 글라진, 에포에틴 알파, 페그필그라스팀, 라니비주맙, 다베포에틴 알파, 인터페론 베타-la, 인터페론 베타-la, 인슐린 아스파트, Rhu 인슐린, 옥토코그 알파, 인슐린 라이스프로, 세툭시맙, 페그인터페론 알파-2a, 인터페론 베타-lb, 엡타코그 알파, 인슐린 아스파트, 오나보툴리늄독소A, 에포에틴 베타, Rec 항혈우병 인자, 필그라스틴, 인슐린 디터머, 나탈리주맙, 인슐린 (휴물린) 또는 팔리비주맙이다.
본 개시의 상황에서 발현될 수 있는 항체, 항체 단편, 및/또는 Fc 융합 단백질은 제한없이, 아바고보맙, 압식시맙, 악톡수맙, 아달리무맙, 아데카투무맙, 아펠리모맙, 아푸투주맙, 알라시주맙 페골, ALD, 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 알투모맙 펜테테이트, 아마툭시맙, 아나투모맙 마페나톡스, 아니프롤루맙, 안루킨주맙, 아폴리주맙, 알시투모맙, 아셀리주맙, 아티누맙, 아틀리주맙 (또는 토실리주맙), 아토롤리무맙, 바피뉴주맙, 바실릭시맙, 바비툭시맙, 벡투모맙, 벨리무맙, 벤랄리주맙, 베르틸리무맙, 베실레소맙, 베바시주맙, 베즐로톡수맙, 비시로맙, 비마그루맙, 비바투주맙 메르탄신, 블리나투모맙, 블로소주맙, 브렌툭시맙 베도틴, 브리아키누맙, 브로달루맙, 카나키누맙, 칸투주맙 메르탄신, 칸투주맙 라브탄신, 카플라시주맙, 카프로맙 펜데티드, 칼루맙, 카투막소맙, 세델리주맙, 세르톨리주맙 페골, 세툭시맙, 시타투주맙 보가톡스, 식수투무맙, 클라자키주맙, 클레놀릭시맙, 클리바투주맙 테트락세탄, 코나투무맙, 콘시주맙, 크레네주맙, 다세투주맙, 다클리주맙, 달로투주맙, 다라투무맙, 뎀시주맙, 데노수맙, 데투모맙, 돌리모맙 아리톡스, 드로지투맙, 둘리고투맙, 두필루맙, 두시기투맙, 에크로멕시맙, 에쿨리주맙, 에도바코맙, 에드레콜로맙, 에팔리주맙, 에푼구맙, 엘델루맙, 엘로투주맙, 엘실리모맙, 에나바투주맙, 엔리모맙 페골, 에노키주맙, 에노티쿠맙, 엔시툭시맙, 에피투모맙 시툭세탄, 엡라투주맙, 엘리주맙, 엘투막소맙, 에타라시주맙, 에트롤리주맙, 에볼로쿠맙, 엑스비비루맙, 파놀레소맙, 파랄리모맙, 팔레투주맙, 파시누맙, FBTA, 펠비주맙, 페자키누맙, 피클라투주맙, 피기투무맙, 플란보투맙, 폰톨리주맙, 포랄루맙, 포라비루맙, 프레솔리무맙, 풀라누맙, 푸툭시맙, 갈릭시맙, 가니투맙, 간테레루맙, 가빌리모맙, 겜투주맙 오조가미신, 게보키주맙, 기렌툭시맙, 글렘바투무맙 베도틴, 골리무맙, 고밀릭시맙, 구셀쿠맙, 이발리주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 이크루쿠맙, 이고보맙, 임시로맙, 임가투주맙, 인클라쿠맙, 인다툭시맙 라브탄신, 인플릭시맙, 인테투무맙, 이놀리모맙, 이노투주맙 오조가미신, 이필리무맙, 이라투무맙, 이톨리주맙, 익세키주맙, 켈릭시맙, 라베투주맙, 람브롤리주맙, 람팔리주맙, 레브리키주맙, 레말레소맙, 레르델리무맙, 렉사투무맙, 리비비루맙, 리겔리주맙, 린투주맙, 리릴루맙, 로델시주맙, 롤보투주맙 메르탄신, 루카투무맙, 루밀릭시맙, 마파투무맙, 마르게툭시맙, 마슬리모맙, 마브릴리무맙, 마투주맙, 메폴리주맙, 메텔리무맙, 밀라투주맙, 민레투모맙, 미투모맙, 모가물리주맙, 모롤리무맙, 모타비주맙, 목세투모맙 파수도톡스, 무로모납-CD3, 나콜로맙 타페나톡스, 나밀루맙, 납투모맙 에스타페나톡스, 나르나투맙, 나탈리주맙, 네바쿠맙, 네시투무맙, 네렐리모맙, 네스바쿠맙, 니모투주맙, 니볼루맙, 노페투모맙 메르펜탄, 오카라투주맙, 오크렐리주맙, 오둘리모맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 올로키주맙, 오말리주맙, 오나르투주맙, 오포르투주맙 모나톡스, 오레고보맙, 오르티쿠맙, 오텔릭시주맙, 옥셀루맙, 오자네주맙, 오조랄리주맙, 파기박시맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 파노바쿠맙, 파르사투주맙, 파스콜리주맙, 파테클리주맙, 파트리투맙, 펨투모맙, 페라키주맙, 페르투주맙, 펙셀리주맙, 피딜리주맙, 피나투주맙 베도틴, 핀투모맙, 플라쿨루맙, 폴라투주맙 베도틴, 포네주맙, 프릴릭시맙, 프리톡삭시맙, 프리투무맙, PRO, 퀼리주맙, 라코투모맙, 라드레투맙, 라피비루맙, 라무시루맙, 라니비주맙, 락시바쿠맙, 레가비루맙, 레슬리주맙, 릴로투무맙, 리툭시맙, 로바투무맙, 롤레두맙, 로모소주맙, 론탈리주맙, 로벨리주맙, 루플리주맙, 사말리주맙, 사릴루맙, 사투모맙 펜데티드, 세쿠키누맙, 세리반투맙, 세톡삭시맙, 세비루맙, 시브로투주맙, 시팔리무맙, 실툭시맙, 심투주맙, 시플리주맙, 시루쿠맙, 솔라네주맙, 솔리토맙, 소넵시주맙, 손투주맙, 스타물루맙, 술레소맙, 수비주맙, 타발루맙, 타카투주맙 테트락세탄, 타도시주맙, 탈리주맙, 타네주맙, 타플리투모맙 팝톡스, 테피바주맙, 텔리모맙 아리톡스, 테나투모맙, 테넬릭시맙, 테플리주맙, 테프로투무맙, TGN, 티실리무맙 (또는 트레멜리무맙), 틸드라키주맙, 티가투주맙, TNX-, 토실리주맙 (또는 아틀리주맙), 토랄리주맙, 토시투모맙, 토베투맙, 트랄로키누맙, 트라스투주맙, TRBS, 트레갈리주맙, 트레멜리무맙, 투코투주맙 셀몰류킨, 투비루맙, 우블리툭시맙, 우렐루맙, 우르톡사주맙, 우스테키누맙, 반틱투맙, 바팔릭시맙, 바텔리주맙, 베돌리주맙, 벨투주맙, 베팔리모맙, 베센쿠맙, 비실리주맙, 볼로식시맙, 보르세투주맙 마포도틴, 보투무맙, 잘루투무맙, 자놀리무맙, 자툭시맙, 지랄리무맙 및 졸리모맙 아리톡스를 포함한다.
본 개시의 상황에서 발현될 수 있는 Fc 융합 단백질의 다른 예는 제한없이, 에타너셉트, 알레파셉트, 아바타셉트, 릴로나셉트, 로미플로스팀, 벨라타셉트 및 아플리베르셉트를 포함한다.
본 개시의 상황에서 발현될 수 있는 항응고제 및/또는 혈액 인자의 예는 제한없이, 단백질 C, 단백질 S, 및 항트롬빈, 인자 I- VIII, 프로트롬비나제, 프로트롬빈, 트롬빈 폰 빌레브란트 인자 (vWF), 피브리노겐, 피브린 및 피브리노펩티드를 포함한다.
본 개시의 상황에서 발현될 수 있는 골 형태발생성 단백질 (BMP)의 예는 제한없이, BMP1-BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP 10, 및 BMP15를 포함한다.
본 개시의 상황에서 발현될 수 있는 효소의 예는 제한없이, IUBMB (International Union of Biochemistry and Molecular Biology)에 의해서 효소 위원회 번호 (Enzyme Commission Number) (EC)가 지정된 임의의 효소 (예를 들어, EC1-EC6)를 포함한다 (Webb, Edwin C. Enzyme nomenclature 1992: recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification of enzymes. San Diego: Published for the International Union of Biochemistry and Molecular Biology by Academic Press. ISBN 0-12-227164-5 (1992), 이들은 참조로 본 명세서에 편입됨). 다른 예는 스티렌 모노옥시게나제 (StyAB), 톨루엔 디옥시게나제 (TODC1C2AB), 루시퍼라제 및 락타제를 포함한다. 일부 구현예에서, 효소는 톨루엔 디옥시게나제이다. 일부 구현예에서, 효소는 스티렌 모노옥시게나제이다.
본 개시의 상황에서 발현될 수 있는 성장 인자의 예는 제한없이, 아드레노메둘린 (AM), 안지오포이어틴 (Ang), 자가분비 이동성 인자, 골 형태발생성 단백질 (BMP), 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 상피 성장 인자 (EGF), 에리쓰로포이어틴 (EPO), 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 신경 아교세포주-유래 신경영양 인자 (GDNF), 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 과립구 마크로파지 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 성장 분화 인자-9 (GDF9), 간세포 성장 인자 (HGF), 간암-유래 성장 인자 (HDGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 이동-촉진 인자, 미오스타틴 (GDF-8), 신경 성장 인자(NGF) 및 다른 뉴로트로핀, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 트롬보포이어틴 (TPO), 형질전환 성장 인자 알파 (TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 태반 성장 인자 (P1GF), 태아 소 소마토트로핀 (FBS) 및 IL-1 내지 IL7을 포함한다.
본 개시의 상황에서 발현될 수 있는 펩티드 호르몬의 예는 제한없이, 아밀린 (또는 섬 아밀로이드 폴리펩티드), 항뮬러관 호르몬 (또는 뮬러관 억제 인자 또는 호르몬), 아디포넥틴, 부신피질자극 호르몬 (또는 코르티코트로핀), 안지오텐시노겐 및 안지오텐신, 항이뇨 호르몬 (또는 바소프레신, 아르기닌 바소프레신), 심방성-나트륨이뇨 펩티드 (또는 아트리오펩틴), 뇌 나트륨이뇨 펩티드, 칼시토닌, 콜레시스토키닌, 코르티코트로핀-방출 호르몬, 엔케팔린, 엔도텔린, 에리쓰로포이어틴, 여포-자극 호르몬, 갈라닌, 가스트린, 그렐린, 글루카곤, 고나도트로핀-방출 호르몬, 성장 호르몬-방출 호르몬, 인간 융모막 고나도트로핀, 인간 태반성 락토겐, 성장 호르몬, 인히빈, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 (또는 소마토메딘), 렙틴, 리포트로핀, 황체형성 호르몬, 멜라닌세포 자극 호르몬, 모틸린, 오렉신, 옥시토신, 췌장 폴리펩티드, 부갑상선 호르몬, 프로락틴, 프로락틴 방출 호르몬, 렐락신, 레닌, 세크레틴, 소마토스타틴, 트롬보포이어틴, 갑상선-자극 호르몬 (또는 티로트로핀), 및 티로트로핀-방출 호르몬을 포함한다.
본 개시의 상황에서 발현될 수 있는 인터페론 (IFN)의 예는 제한없이, IFN-α, IFN-β, IFN-ω 및 IFN-γ를 포함한다.
본 개시의 상황에서 발현될 수 있는 인터루킨의 예는 제한없이, 인터루킨 1-17을 포함한다. 일부 구현예에서, 인터루킨은 인터루킨-4, 인터루킨-6, 인터루킨-10, 인터루킨-11 또는 인터루킨-13이다.
본 개시의 상황에서 발현될 수 있는 치료적 단백질의 다른 예는 제한없이, 인슐린 (혈당 조절인자), 프람린티드 아세테이트 (글루코스 제어), 성장 호르몬 GH (성장 부전), 페그비소만 (성장 호르몬 수용체 길항제), 메카세르민 (IGFl, 성장 부전), 인자 VIII (응고 인자), 인자 IX (응고 인자, 단백질 C 농축물 (항-응고), al-프로테이나제 억제제 (항-트립신 억제제), 에리쓰로포이어틴 (적혈구형성 자극), 필그라스팀 (과립구 콜로니-자극 인자, G-CSF; 호중구 증식 자극), 살그라모스팀36, 37 (과립구 마크로파지 콜로니-자극 인자, GM-CSF), 오프렐베킨 (인터루킨 ll, IL11), 인간 난포-자극 호르몬 (FSH), 인간 융모막 고나도트로핀 (HCG), 루트로핀-a (인간 황체형성 호르몬), 인터루킨 2 (IL2), 인터루킨-1 수용체 효현제, 데닐루킨 디프티톡스 (IL2 및 디프테리아 톡소의 융합체), 인터페론 알파콘 1 (공통 인터페론), 인터페론-2a (IFNa2a), 인터페론-2b (IFNa2b), 인터페론-n3 (IFNan3), 인터페론-pia (rIFN-β), 인터페론- βlb (rIFN-β), 인터페론-ylb (IFNy, 연어 칼시토닌 (32-아미노산 선형 폴리펩티드 호르몬), 테리파라티드 (인간 부갑상선 호르몬 1-34 잔기의 일부), 엑세나티드 (글루카곤-유사 펩티드 1과 유사한 작용을 갖는 인크레틴 모방체), 옥트레오티드 (천연 소마토스타틴을 모방하는 옥타펩티드), 디보테르민-a (재조합체 인간 골 형성성 단백질 2), 재조합 인간 골 형성성 단백질 7, 히스트렐린 아세테이트 (고나도트로핀-방출 호르몬; GnRH), 팔리페르민 (각질세포 성장 인자, KGF), 베카플러민 (혈소판-유래 성장 인자, PDGF), 네시리티드 (재조합체 인간 B-형 나트륨이뇨 펩티드), 레피루딘 (히루딘의 재조합 변이체, 다른 변이체는 비발리루딘임), 아나킨라 (인터루킨 1 (IL1) 수용체 길항제), 엔푸비리티드 (HIV-1 gp41-유래 펩티드), β-글루코세레브로시다제 (글루코스 및 세라미드로 가수분해), 알글루코시다제-a (글리코겐을 분해), 라로니다제 (리소솜 내에서 글리코사미노글리칸을 분해), 이두르술파제 (O-술페이트를 절단하여 GAG 축적을 방지), 갈술파제 (GAG로부터 말단 술페이트를 절단), 아갈시다제-β (인간 a-갈락토시다제 A, 글리코스핀고리피드를 가수 분해), 락타제 (락토스를 분해), 췌장 효소 (리파제, 아밀라제, 프로테아제; 음식물을 분해), 아데노신 데아미나제 (아데노신을 대사), 조직 플라스미노겐 활성인자 (tPA, 혈전 분해에 관여되는 세린 프로테아제), 인자 Vila (세린 프로테아제, 혈액 응고 유발), 드로트레코긴-a (세린 프로테아제, 인간 활성화된 단백질 C), 트립신 (세린 프로테아제, 단백질을 가수분해), 보툴리늄 독소 A형 (프로테아제, 시냅스 소포 융합에 관여되는 SNAP-25를 불활성화), 보툴리늄 독소 B형 (시냅스 소포 융합에 관여하는 SNAP-25를 불활성화시키는 프로테아제), 콜라게나제 (엔도펩티다제, 천연 콜라겐을 분해), 인간 데옥시리보뉴클레아제 I (엔도뉴클레아제, DNase I, DNA를 절단), 히알루로니다제 (히알루로난을 가수분해), 파파인 (시스테인 프로테아제, 단백질을 가수분해), L-아스파라기나제 (L-아스파라긴의 아스파르트산 및 암모니아로의 전환을 촉매), 라스부리카제 (우레이트 옥시다제, 요산의 알란토인으로의 전환을 촉매), 스트렙토키나제 (아니스트렙라제는 아니소일화된 플라스미노겐 스트렙토키나제 활성인자 복합체 (APS AC)임), 및 항트롬빈 III (세린 프로테아제 억제제)을 포함한다.
본 개시의 상황에서 발현될 수 있는 치료적 단백질의 다른 예는 하기에 정의된 바와 같은, 항원을 포함한다.
본 발명은 항원, 예컨대 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 자기-항원, 알레르겐 또는 이식편-특이적 항원의 발현을 위한 벡터 (예를 들어, 플라스미드)를 포함하는 조작된 씨. 아크네스를 더 포괄한다.
본 명세서에서 사용되는, "항원"은 면역학적 반응을 유발하는 하나 이상의 에피토프 (예를 들어, 선형, 입체형태 또는 둘 모두)를 함유하는 분자를 의미한다. 항원은 임의 유형일 수 있다. 특히, 이것은 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드, 탄수화물, 지질, 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA 일 수 있다. 특정 구현예에서, 이것은 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드이다. 본 명세서에서 의도되는, "단백질"은 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드를 포괄하는 것으로 이해한다. 더 나아가서, 본 발명의 목적을 위해서, "항원"은 단백질이 면역학적 반응을 유발하는 능력을 유지하는 한, 천연 서열에 대해서, 변형, 예컨대 결실, 부가 및 치환 (일반적으로 천연적 보존성)을 포함하는 단백질을 포괄한다. 이들 변형은 부위-지정 돌연변이유발을 통한 것과 같이, 의도적일 수 있거나, 또는 예컨대 항원을 생산하는 숙주의 돌연변이같이, 우발적일 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 항원은 특히 상기 항원에 특이적인, 면역 반응의 활성화 또는 증강을 유도한다. 대안적인 구현예에서, 상기 항원은 특히 상기 항원에 대한, 면역 반응의 관용화 또는 억제를 일으킨다.
특정 구현예에서, 상기 항원은 대상체 염증 반응을 감소시킨다.
특정 구현예에서, 상기 항원은 종양 항원이다.
"종양 항원"이란 본 명세서에서 종양 세포에서 생산된 항원성 물질을 의미한다. 종양 항원은 예를 들어, 펩티드-함유 종양 항원, 예컨대 폴리펩티드 종양 항원 또는 당단백질 종양 항원일 수 있다. 종양 항원은 또한 예를 들어, 사카라이드-함유 종양 항원, 예컨대 당지질 종양 항원 또는 강글리오시드 종양 항원일 수 있다.
종양 항원은 (a) 폴리펩티드 (예를 들어, 약 8 내지 약 20 아미노산 길이 범위일 수 있지만, 이 범위 밖의 길이도 일반적임), 리포폴리펩티드 및 당단백질을 포함하는, 폴리펩티드-함유 종양 항원, 및 (b) 폴리-사카라이드, 뮤신, 강글리오시드, 당지질 및 당단백질을 포함하는, 사카라이드-함유 종양 항원을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 게다가, 종양 항원은 (a) 암과 세포와 연관된 전체 길이 분자, (b) 결실, 부가 및/또는 치환된 부분을 갖는 분자를 포함하는, 이의 상동체 및 변형된 형태, 및 (c) 이의 단편일 수 있다. 종양 항원은 예를 들어, CD8+ 림프구에 의해 인식되는 클래스 I-제한 항원 또는 CD4+ 림프구에 의해 인식되는 클래스 II-제한된 항원을 포함한다.
수많은 종양 항원이 당분야에 공지되어 있고, 하기를 포함한다: (a) 암-고환 항원 예컨대 NY-ESO-1, SSX2, SCP1을 비롯하여 RAGE, BAGE, GAGE 및 MAGE 패밀리 폴리펩티드, 예를 들어, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, 및 MAGE- 12 (예를 들어, 흑색종, 폐, 두경부, NSCLC, 유방, 위장, 및 방광 종양을 해결하기 위해 사용될 수 있음), (b) 돌연변이된 항원, 예를 들어, p53 (다양한 고형 종양, 예를 들어, 직결장, 폐, 두경부 암과 연관), p21/Ras (예를 들어, 흑색종, 췌장 암 및 직결장 암과 연관), CD4 (예를 들어, 흑색종과 연관), MUM 1 (예를 들어, 흑색종과 연관), 캐스파제-8 (예를 들어, 두경부 암과 연관), CIA 0205 (예를 들어, 방광 암과 연관), HLA-A2-R1701, 베타 카테닌 (예를 들어, 흑색종과 연관), TCR (예를 들어, T-세포 비-호지킨 림프종과 연관), BCR-abl (예를 들어, 만성 골수성 백혈병과 연관), 트리오스포스페이트 이소머라제, IA 0205, CDC-27, 및 LDLR-FUT, (c) 과-발현된 항원, 예를 들어, 갈렉틴 4 (예를 들어, 직결장 암과 연관), 갈렉틴 9 (예를 들어, 호지킨 질환과 연관), 프로테이나제 3 (예를 들어, 만성 골수성 백혈병과 연관), WT 1 (예를 들어, 다양한 백혈병과 연관), 카본산 언히드라제 (예를 들어, 신장 암과 연관), 알돌라제 A (예를 들어, 폐 암과 연관), PRAME (예를 들어, 흑색종과 연관), HER-2/neu (예를 들어, 유방, 결장, 폐, 및 난소 암과 연관), 알파-태아단백질 (예를 들어, 간암과 연관), SA (예를 들어, 직결장 암과 연관), 가스트린 (예를 들어, 췌장 및 위 암과 연관), 텔로머라제 촉매 단백질, MUC-1 (예를 들어, 유방 및 난소 암과 연관), G-250 (예를 들어, 신장 세포 암종과 연관), 및 암배아 항원 (예를 들어, 유방 암, 폐 암, 및 위장관의 암 예컨대 직결장 암과 연관), (d) 공유 항원, 예를 들어, 흑색종-멜라닌세포 분화 항원 예컨대 MART-l/멜란 A, gplOO, MC1R, 멜라닌세포-자극 호르몬 수용체, 티로시나제, 티로시나제 관련 단백질-1/TRPl 및 티로시나제 관련 단백질-2/TRP2 (예를 들어, 흑색종과 연관), (e) 전립선 연관 항원 예컨대 PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2 (예를 들어, 전립선 암과 연관), (f) 면역글로불린 이디오타입 (예를 들어, 골수종 및 B 세포 림프종과 연관), 및 (g) (i) 당단백질 예컨대 시알릴 Tn 및 시알릴 Lex (예를 들어, 유방 및 직결장 암과 연관)를 비롯하여 다양한 뮤신으로서, 캐리어 단백질 (예를 들어, MUC-1은 LH에 커플링될 수 있음)에 커플링될 수 있는 것인 당단백질; (ii) 리포폴리펩티드 (예를 들어, 지질 모이어티에 연결된 MUC-1); (iii) 캐리어 단백질 (예를 들어, KLH)에 커플링될 수 있는 폴리사카라이드 (예를 들어, Globo H 합성 헥사사카라이드), (iv) 캐리어 단백질 (예를 들어, KLH)에 역시 커플링될 수 있는, 강글리오시드 예컨대 GM2, GM12, GD2, GD3 (예를 들어, 뇌, 폐 암, 흑색종과 연관)을 포함하는 다른 종양 항원, 예컨대 폴리펩티드- 및 사카라이드-함유 항원.
다른종양 항원은 pi 5, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, 엡스테인 바 바이러스 항원, EBNA, E6 및 E7을 포함한, 인간 파필로마바이러스 (HPV) 항원, B형 및 C형 간염 바이러스 항원, 인간 T-세포 림프친화성 바이러스 항원, TSP-180, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, mn-23H l, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, p 16, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV 18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (Mac-2 결합 단백질\사이클로필린 C-연관 단백질), TAAL6, TAG72, TLP, TPS 등을 포함한다.
다른 구현예에서, 상기 항원은 바이러스 항원이다.
"바이러스 항원"이란 본 명세서에서 바이러스 게놈에 의해 코딩되는 단백질을 의미한다.
일정 구현예에서, 바이러스 항원은 바람직하게 이의 생활 주기 중 적어도 한 단계 동안 바이러스의 표면에 노출되는 에피토프를 포함한다. 바이러스 항원은 바람직하게 다수 혈청형 또는 단리주에 걸쳐서 보존된다. 본 발명의 상황에서 사용에 적합한 바이러스 항원은 하기에 기재된 하나 이상의 바이러스로부터 유래된 항원을 비롯하여 하기에 확인된 특이적 항원 예를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
오르쏘믹소바이러스: 바이러스 항원은 오르쏘믹소바이러스, 예컨대 인플루엔자 A, B 및 C로부터 유래된 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, 오르쏘믹소바이러스 항원은 헤마글루티닌 (HA), 뉴라미니다제 (NA), 핵단백질(NP), 매트릭스 단백질 (M1), 막 단백질 (M2), 하나 이상의 트랜스크립타제 성분 (PB1, PB2 및 PA)을 포함한, 하나 이상의 바이러스 단백질로부터 선택된다. 일정 구현예에서 바이러스 항원은 HA 및 NA를 포함한다. 일정 구현예에서, 인플루엔자 항원은 유행병간 (연간) 독감 균주로부터 유래되는 반면, 다른 구현예에서, 인플루엔자 항원은 유행성 발병을 초래할 잠재성을 갖는 균주 (즉, 현재 순환되는 균주의 해마글루티딘과 비교하여 새로운 해마글루티닌을 갖는 인플루엔자 균주, 또는 조류 대상체에서 병원성이고 인간 집단에서 수평 전파될 잠재성을 갖는 인플루엔자 균주, 또는 인간에 병원성인 인플루엔자 균주)로부터 유래된다.
파라믹소비리다에 바이러스: 바이러스 항원은 파라믹소비리다에 바이러스, 예컨대 뉴모바이러스 (RSV), 파라믹소바이러스 (PIV), 메타뉴모바이러스 및 모르빌리바이러스 (홍역)로부터 유래된 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
뉴모바이러스: 바이러스 항원은 뉴모바이러스, 예컨대 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 소 호흡기 세포융합 바이러스, 쥐의 폐렴 바이러스, 및 칠면조 비기관염 바이러스로부터 유래된 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 뉴모바이러스는 RSV이다. 일정 구현예에서, 뉴모바이러스 항원은 하기의 표면 단백질 융합체 (F), 당단백질 (G) 및 소형 소수성 단백질 (SH), 매트릭스 단백질 M 및 M2, 뉴클레오캡시드 단백질 N, P 및 L, 및 구조 단백질 NS1 및 NS2를 포함한, 하나 이상의 단백질로부터 포함한다. 다른 구현예에서, 뉴모바이러스 항원은 F, G 및 M을 포함한다.
파라믹소바이러스: 바이러스 항원은 파라믹소바이러스, 예컨대 파라인플루엔자 바이러스 1형 - 4형 (PIV), 볼거리, 센다이 바이러스, 유인원 바이러스 5, 소 파라인플루엔자 바이러스, 니파바이러스, 헤니파바이러스 및 뉴캐슬병 바이러스로부터 유래된 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, 파라믹소바이러스는 PIV 또는 볼거리이다. 일정 구현예에서, 파라믹소바이러스 항원은 하나 이상의 하기 단백질로부터 선택된다: 헤마글루티닌-뉴라미니다제 (HN), 융합 단백질 F1 및 F2, 핵단백질(NP), 인단백질 (P), 대형 단백질 (L), 및 매트릭스 단백질 (M). 다른 구현예에서, 파라믹소바이러스 단백질은 HN, F1 및 F2를 포함한다. 다른 구현예에서, 라믹소바이러스는 니파바이러스 또는 헤니파바이러스이고, 항원은 하나 이상의 하기 단백질로부터 선택된다: 융합 (F) 단백질, 당단백질 (G) 단백질, 매트릭스 (M) 단백질, 뉴클레오캡시드 (N) 단백질, 대형 (L) 단백질 및 인단백질 (P).
폭스비리다에: 바이러스 항원은 대두창 및 소두창을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 예컨대 바리올라 베라같은, 오르토폭스바이러스로부터 유래된 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
메타뉴모바이러스: 바이러스 항원은 메타뉴모바이러스, 예컨대 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV) 및 조류 메타뉴모바이러스 (aMPV)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, 메타뉴모바이러스 항원은 하기의 표면 단백질 융합체 (F), 당단백질 (G) 및 소형 소수성 단백질 (SH), 매트릭스 단백질 M 및 M2, 뉴클레오캡시드 단백질 N, P 및 L을 포함하는, 하나 이상의 단백질로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 메타뉴모바이러스 항원은 F, G 및 M을 포함한다.
모르빌리바이러스: 바이러스 항원은 모르빌리바이러스, 예컨대 홍역으로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, 모르빌리바이러스 항원은 하나 이상의 하기 단백질로부터 선택된다: 헤마글루티닌 (H), 당단백질 (G), 융합 인자 (F), 대형 단백질 (L), 핵단백질(NP), 폴리머라제 인단백질 (P), 및 매트릭스 (M).
피코르나바이러스: 바이러스 항원은 피코르나바이러스, 예컨대 엔테로바이러스, 리노바이러스, 헤파르나바이러스, 카르디오바이러스 및 아프토바이러스로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, 항원은 엔테로바이러스로부터 유래되는 한편, 다른 구현예에서 엔테로바이러스는 폴리오바이러스이다. 여전히 다른 구현예에서, 항원은 리노바이러스로부터 유래된다.
엔테로바이러스: 바이러스 항원은 엔테로바이러스, 예컨대 폴리오바이러스 1형, 2형 또는 3형, 콕사키 A 바이러스 1형 내지 22형 및 24형, 콕사키 B 바이러스 1형 내지 6형, 에코바이러스 (ECHO) 바이러스) 1형 내지 9형, 11형 내지 27형 및 29형 내지 34형 및 엔테로바이러스 68 내지 71로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, 항원은 엔테로바이러스로부터 유래되는 한편, 다른 구현예에서 엔테로바이러스는 폴리오바이러스이다. 일정 구현예에서, 엔테로바이러스 항원은 하나 이상의 하기 캡시드 단백질 VP0, VP1, VP2, VP3 및 VP4로부터 선택된다.
부니야바이러스: 바이러스 항원은 오르토부니야바이러스, 예컨대 캘리포니아 뇌염 바이러스, 플레보바이러스, 예컨대 리프트 밸리열 바이러스, 또는 나이로바이러스, 예컨대 크림-콩고 출혈열 바이러스로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 리노바이러스: 바이러스 항원은 리노바이러스로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, 리노바이러스 항원은 하나 이상의 하기 캡시드 단백질: VP0, VP1, VP2, VP2 및 VP4로부터 선택된다.
헤파르나바이러스: 바이러스 항원은 헤파르나바이러스, 예컨대, 단지 예로서, A형 간염 바이러스 (HAV)로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
토가바이러스: 바이러스 항원은 토가바이러스, 예컨대 루비바이러스, 알파바이러스, 또는 아르테리바이러스로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, 항원은 루비바이러스, 예컨대 단지 예로서, 루벨라 바이러스로부터 유래된다. 일정 구현예에서, 토가바이러스 항원은 E1, E2, E3, C, NSP-1, NSPO-2, NSP-3 또는 NSP-4로부터 선택된다. 일정 구현예에서, 토가바이러스 항원은 E1, E2 또는 E3으로부터 선택된다.
플라비바이러스: 바이러스 항원은 플라비바이러스, 예컨대 진드기-매개 뇌염 (TBE) 바이러스, 뎅기 (1형, 2형, 3형 또는 4형) 바이러스, 황열 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 카야사나 포레스트 바이러스, 웨스트 나일 뇌염 바이러스, 세인트루이스 뇌염 바이러스, 러시아 봄-여름 뇌염 바이러스, 포와산 뇌염 바이러스로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, 플라비바이러스 항원은 PrM, M, C, E, NS-1, NS-2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, 및 NS5로부터 선택된다. 일정 구현예에서, 플라비바이러스 항원은 PrM, M 및 E로부터 선택된다.
페스티바이러스: 바이러스 항원은 페스티바이러스, 예컨대 소 바이러스성 설사병 (BVDV), 고전적 돼지 열병 (CSFV) 또는 보더병 (BDV)으로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
헤파드나바이러스: 바이러스 항원은 헤파드나바이러스, 예컨대 B형 간염 바이러스로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, 헤파드나바이러스 항원은 표면 항원 (L, M 및 S), 코어 항원 (HBc, HBe)으로부터 선택된다.
C형 간염 바이러스: 바이러스 항원은 C형 간염 바이러스 (HCV)로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, HCV 항원은 E1, E2, E1/E2, NS345 폴리단백질, NS 345-코어 폴리단백질, 코어, 및/또는 구조 영역 유래 펩티드 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일정 구현예에서, C형 간염 바이러스 항원은 하나 이상의 하기 단백질: HCV E1 및 또는 E2 단백질, E1/E2 이종이량체 복합체, 코어 단백질 및 비-구조적 단백질, 또는 이들 항원의 단편을 포함하고, 비-구조적 단백질은 임의로 변형되어서 효소 활성을 제거할 수 있지만 면역원성은 보유할 수 있다.
라브도바이러스: 바이러스 항원은 라브도바이러스, 예컨대 리싸바이러스 (공수병 바이러스) 및 베지큘로바이러스 (VSV)로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 라브도바이러스 항원은 당단백질 (G), 핵단백질(N), 대형 단백질 (L), 구조 단백질 (NS)로부터 선택될 수 있다.
칼리시비리다에; 바이러스 항원은 칼리시비리다에, 예컨대 노르워크 바이러스, 및 노르워크-유사 바이러스, 예컨대 하와이 바이러스 및 스노우 마운틴 바이러스로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
코로나바이러스: 바이러스 항원은 코로나바이러스, SARS, 인간 호흡기 코로나바이러스, 조류 감염성 기관지염 (IBV), 마우스 간염 바이러스 (MHV), 및 돼지 전염성 위장염 바이러스 (TGEV)로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, 코로나바이러스 항원은 스파이크 (S), 외피 (E), 매트릭스 (M), 뉴클레오캡시드 (N), 및 헤마글루티닌-에스터라제 당단백질 (HE)로부터 선택된다. 일정 구현예에서, 코로나바이러스 항원은 SARS 바이러스로부터 유래된다. 일정 구현예에서, 코로나바이러스는 WO 04/92360에 기술된 바와 같은 SARS 바이러스 항원으로부터 유래된다.
레트로바이러스: 바이러스 항원은 레트로바이러스, 예컨대 온코바이러스, 렌티바이러스 또는 스푸마바이러스로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, 온코바이러스 항원은 HTLV-1, HTLV-2 또는 HTLV-5로부터 유래된다. 일정 구현예에서, 렌티바이러스 항원은 HIV-1 또는 HIV-2로부터 유래된다. 일정 구현예에서, 항원은 HIV-1 아형 (또는 분기군) A, B, C, D, F, G, H, J, K, O를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, HIV-1 아형 (또는 분기군)으로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 항원은 A/B, A/E, A/G, A/G/I 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, HIV-1 순환성 재조합 형태 (CRF)로부터 유래된다. 일정 구현예에서, 레트로바이러스 항원은 gag, pol, env, tax, tat, rex, rev, nef, vif, vpu, 및 vpr로부터 선택된다. 일정 구현예에서, HIV 항원은 gag (p24gag 및 p55gag), env (gp160 및 gp41), pol, tat, nef, rev vpu, 미니단백질 (바람직하게 p55 gag 및 gp140v delete)로부터 선택된다. 일정 구현예에서, HIV 항원은 하나 이상의 하기 균주로부터 유래된다: HIVIIIb, HIVSF2, HIVLAV, HIVLAI, HIVMN, HIV-1CM235, HIV-1US4, HIV-1 SF162, HIV-1TV1, HIV-1MJ4. 일정 구현예에서, 항원은 HERV-K ("old" HERV-K 및 "new" HERV-K)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 내생성 인간 레트로바이러스로부터 유래된다.
레오바이러스: 바이러스 항원은 레오바이러스, 예컨대 오르토레오바이러스, 로타바이러스, 오르비바이러스, 또는 콜티바이러스로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, 레오바이러스 항원은 구조 단백질 λ1, λ2, λ3, μ1, μ2, σ1, σ2, 또는 σ3, 또는 구조 단백질 σNS, μNS, 또는 ols로부터 선택된다. 일정 구현예에서, 레오바이러스 항원은 로타바이러스로부터 유래된다. 일정 구현예에서, 로타바이러스 항원은 VP1, VP2, VP3, VP4 (또는 절단된 생산물 VP5 및 VP8), NSP1, VP6, NSP3, NSP2, VP7, NSP4, 또는 NSP5로부터 선택된다. 일정 구현예에서, 로타바이러스 항원은 VP4 (또는 절단된 생산물 VP5 및 VP8), 및 VP7을 포함한다.
파르보바이러스: 바이러스 항원은 파르보바이러스, 예컨대 파르보바이러스 B19로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, 파르보바이러스 항원은 VP-1, VP-2, VP-3, NS-1 및 NS-2로부터 선택된다. 일정 구현예에서, 파르보바이러스 항원은 캡시드 단백질 VP1 또는 VP-2이다.
델타 간염 바이러스 (HDV): 바이러스 항원은 HDV로부터 유래된 것, 특히 HDV 유래 δ-항원을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
E형 간염 바이러스 (HEV): 바이러스 항원은 HEV로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
G형 간염 바이러스 (HGV): 바이러스 항원은 HGV로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
인간 헤르페스바이러스: 바이러스 항원은 인간 헤르페스바이러스, 예컨대, 단지 예로서, 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV), 바리셀라-조스터 바이러스 (VZV), 엡스테인-바 바이러스 (EBV), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 인간 헤르페스바이러스 6 (HHV6), 인간 헤르페스바이러스 7 (HHV7), 및 인간 헤르페스바이러스 8 (HHV8)로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, 인간 헤르페스바이러스 항원은 최초기 단백질 (a), 초기 단백질 (β), 및 후기 단백질 (γ)로부터 선택된다. 일정 구현예에서, HSV 항원은 HSV-1 또는 HSV-2 균주로부터 유래된다. 일정 구현예에서, HSV 항원은 당단백질 gB, gC, gD 및 gH, 융합 단백질 (gB), 또는 면역 회피 단백질 (gC, gE, 또는 gl)로부터 선택된다. 일정 구현예에서, VZV 항원은 코어, 뉴클레오캡시드, 피막, 또는 외피 단백질로부터 선택된다. 생 약독화 VZV 백신은 상업적으로 입수가능하다. 일정 구현예에서, EBV 항원은 초기 항원 (EA) 단백질, 바이러스 캡시드 항원 (VCA), 및 막 항원 (MA)의 당단백질로부터 선택된다. 일정 구현예에서, CMV 항원은 캡시드 단백질, 외피 당단백질 (예컨대 gB 및 gH), 및 피막 단백질로부터 선택된다. 다른 구현예에서, CMV 항원은 하나 이상의 하기 단백질로부터 선택될 수 있다: pp65, IE1, gB, gD, gH, gL, gM, gN, gO, UL128, UL129, gUL130, UL150, UL131, UL33, UL78, US27, US28, RL5A, RL6, RL10, RL11, RL12, RL13, UL1, UL2, UL4, UL5, UL6, UL7, UL8, UL9, UL10, UL11, UL14, UL15A, UL16, UL17, UL18, UL22A, UL38, UL40, UL41A, UL42, UL116, UL119, UL120, UL121, UL124, UL132, UL147A, UL148, UL142, UL144, UL141, UL140, UL135, UL136, UL138, UL139, UL133, UL135, UL148A, UL148B, UL148C, UL148D, US2, US3, US6, US7, US8, US9, US10, US11, US12, US13, US14, US15, US16, US17, US18, US19, US20, US21, US29, US30 및 US34A. CMV 항원은 또한 하나 이상의 CMV 단백질의 융합체, 예컨대, 단지 예로서, pp65/IEl일 수 있다 (Reap et al., Vaccine (2007) 25:7441-7449).
파포바바이러스: 항원은 파포바바이러스, 예컨대 파필로마바이러스 및 폴리오마바이러스로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, 파필로마바이러스는 HPV 혈청형 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 및 65를 포함한다. 일정 구현예에서, HPV 항원은 혈청형 6, 11, 16 또는 18로부터 선택된다. 일정 구현예에서, HPV 항원은 캡시드 단백질 (L1) 및 (L2), 또는 E1 - E7, 또는 이의 융합체로부터 선택된다. 일정 구현예에서, HPV 항원은 바이러스-유사 입자 (VLP)에 제제화된다. 일정 구현예에서, 폴리오마바이러스 바이러스는 BK 바이러스 및 JK 바이러스를 포함한다. 일정 구현예에서, 폴리오마바이러스 항원은 VP1, VP2 또는 VP3으로부터 선택된다.
아데노바이러스: 항원은 아데노바이러스로부터 유래되는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 아데노바이러스 항원은 아데노바이러스 혈청형 36 (Ad-36)으로부터 유래된다. 일정 구현예에서, 항원은 Ad-36 코트 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 단백질 또는 펩티드 서열로부터 유래된다 (WO 2007/120362).
다른 구현예에서, 상기 항원은 박테리아 항원이다.
본 발명의 상황에서 사용에 적합한 박테리아 항원의 예는 박테리아로부터 유래되는 단백질, 폴리사카라이드 및 리포폴리사카라이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, 박테리아 항원은 이의 생활 주기 중 적어도 한 단계 동안 박테리아의 표면에 노출되는 에피토프를 포함한다. 박테리아 항원은 바람직하게 다수 혈청형에 걸쳐서 보존된다. 일정 구현예에서, 박테리아 항원은 하기 기재된 하나 이상의 박테리아로부터 유래되는 항원을 비롯하여 하기에 확인된 특이적 항원 예를 포함한다:
네이세리아 메닌지티디스 (Neisseria meningitidis): 엔. 메닌지티디스 항원은 엔. 메닌지티디스 혈청군 예컨대 A, C, W135, Y, X 또는 B로부터 유래되는, 단백질, 사카라이드 (폴리사카라이드, 또는 리포올리고사카라이드 포함)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 엔. 메닌지티디스 단백질 항원의 유용한 조합은 NHBA, fHbp, 및/또는 NadA 면역원 중 하나, 2개, 또는 3개를 포함한다.
스트렙토코쿠스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae): 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 항원은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 유래 사카라이드 (폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드 포함) 및/또는 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일정 구현예에서 사카라이드 항원은 하나 이상의 하기 뉴모코쿠스 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및/또는 33F로부터 선택된다. 백신 또는 면역원성 조성물은 다수의 혈청형 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 그 이상의 혈청형을 포함할 수 있다. 7-가, 9-가, 10-가, 11-가 및 13-가 접합 조합물은 이미 당분야에 공지되어 있고, 23-가 비접합 조합물도 마찬가지이다. 예를 들어, 10-가 조합물은 혈청형 1 , 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F 유래 사카라이드를 포함할 수 있다. 11-가 조합물은 혈청형 3 유래 사카라이드를 더 포함할 수 있다. 12-가 조합물은 10-가 혼합물에 첨가될 수 있고: 혈청형 6A 및 19A; 6A 및 22F; 19A 및 22F; 6A 및 15B; 19A 및 15B; r 22F 및 15B; 13-가 조합물은 11-가 혼합물에 첨가될 수 있다: 혈청형 19A 및 22F; 8 및 12F; 8 및 15B; 8 및 19A; 8 및 22F; 12F 및 15B; 12F 및 19A; 12F 및 22F; 15B 및 19A; 15B 및 22F 등. 일정 구현예에서, 단백질 항원은 하기 문헌에서 확인되는 단백질로부터 선택될 수 있다: WO 98/18931, WO 98/18930, US 특허 제6,699,703호, US 특허 제6,800,744호, WO 97/43303, WO 97/37026, WO 02/079241, WO 02/34773, WO 00/06737, WO 00/06738, WO 00/58475, WO 2003/082183, WO 00/37105, WO 02/22167, WO 02/22168, WO 2003/104272, WO 02/08426, WO 01/12219, WO 99/53940, WO 01/81380, WO 2004/092209, WO 00/76540, WO 2007/116322, LeMieux et al., Infect. Imm. (2006) 74:2453-2456, Hoskins et al., J. Bacteriol. (2001) 183:5709-5717, Adamou et al., Infect. Immun. (2001) 69(2):949-958, Briles et al., J. Infect. Dis. (2000) 182:1694-1701, Talkington et al., Microb. Pathog. (1996) 21(1):17-22, Bethe et al., FEMS Microbiol. Lett. (2001) 205(1):99-104, Brown et al., Infect. Immun. (2001) 69:6702-6706, Whalen et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. (2005) 43:73-80, Jomaa et al., Vaccine (2006) 24(24):5133-5139. 다른 구현예에서, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 단백질은 폴리히스티딘 트리아드 패밀리 (PhtX), 콜린 결합 단백질 패밀리 (CbpX), CbpX 절두형, LytX 패밀리, LytX 절두형, CbpX 절두형-LytX 절두형 키메라 단백질, 뉴모리신 (Ply), PspA, PsaA, Spl28, SpIOl, Spl30, Spl25, Spl33, 뉴모코커스 선모 서브유닛으로부터 선택될 수 있다.
스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) (그룹 A 스트렙토코쿠스): 그룹 A 스트렙토코쿠스 항원은 WO 02/34771 또는 WO 2005/032582 (GAS 40 포함)에서 확인된 단백질, GAS M 단백질의 단편의 융합체 (WO 02/094851, 및 [Dale, Vaccine (1999) 17:193-200], 및 [Dale, Vaccine 14(10): 944-948]에 기술된 것 포함), 피브로넥틴 결합 단백질 (Sfbl), 스트렙토코쿠스 헴-연관 단백질 (Shp), 및 스트렙토리신 S (SagA)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis): 모락셀라 항원은 WO 02/18595 및 WO 99/58562에서 확인되는 항원, 외막 단백질 항원 (HMW-OMP), C-항원, 및/또는 LPS를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
보르데텔라 퍼투시스 (Bordetella pertussis): 퍼투시스 항원은 퍼투시스 톡소이드 (PT) 및 피. 퍼투시스 유래 섬유상 해마글루티닌 (FHA), 임의로 또한 퍼탁틴 및/또는 아글루티노겐 2 및 3과의 조합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
버크홀데리아 (Burkholderia): 버크홀데리아 항원은 버크홀데리아 말레이 (Burkholderia mallei), 버크홀데리아 슈도말레이 (Burkholderia pseudomallei) 및 버크홀데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus): 에스. 아우레우스 항원은 에스. 아우레우스 유래 폴리사카라이드 및/또는 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 에스. 아우레우스 폴리사카라이드는 임의로 무독성 재조합체 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A에 접합된 5형 및 8형 캡슐 폴리사카라이드 (CP5 및 CP8), 예컨대 StaphVAX™, 336형 폴리사카라이드 (336PS), 폴리사카라이드 세포간 부착 (PIA, PNAG로도 알려짐)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 에스. 아우레우스 단백질은 표면 단백질, 인베이신 (류코시딘, 키나제, 히알루로니다제), 식세포작용의 삼킴을 억제하는 표면 인자 (캡슐, 단백질 A), 카로테노이드, 카탈라제 생산, 단백질 A, 코아굴라제, 응고 인자, 및/또는 진핵생물 세포 막을 용해하는 막-손상 독소 (임의로 해독됨) (헤몰리신, 류코톡신, 류코시딘)로부터 유래되는 항원을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, 에스. 아우레우스 항원은 하기 문헌에서 확인되는 단백질로부터 선택될 수 있다: WO 02/094868, WO 2008/019162, WO 02/059148, WO 02/102829, WO 03/011899, WO 2005/079315, WO 02/077183, WO 99/27109, WO 01/70955, WO 00/12689, WO 00/12131, WO 2006/032475, WO 2006/032472, WO 2006/032500, WO 2007/113222, WO 2007/113223, WO 2007/113224. 다른 구현예에서, 에스. 아우레우스 항원은 IsdA, IsdB, IsdC, SdrC, SdrD, SdrE, ClfA, ClfB, SasF, SasD, SasH (AdsA), Spa, EsaC, EsxA, EsxB, Emp, HlaH35L, CP5, CP8, PNAG, 336PS로부터 선택될 수 있다.
스타필로코쿠스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermis): 에스. 에피더미디스 항원은 점액-연관 항원 (SAA)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani) (파상풍): 파상풍 항원은 파상풍 톡소이드 (TT)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
클로스트리듐 퍼프린겐스 (Clostridium perfringens): 항원은 클로스트리듐 퍼프린겐스 유래 엡실론 독소를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
클로스트리듐 보툴리늄 (Clostridium botulinum) (보툴리누스 중독증): 보툴리누스 중독증은 씨. 보툴리늄으로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
코리네박테리움 디프테리아에 (Corynebacterium diphtheriae) (디프테리아): 디프테리아 항원은 디프테리아 독소, 바람직하게 해독된 독소, 예컨대 CRM 197을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, 디프테리아 톡소이드는 캐리어 단백질로서 사용된다.
해모필루스 인플루엔자에 (Haemophilus influenzae) B (Hib): Hib 항원은 Hib 사카라이드 항원을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. Hib 항원은 접합될 수 있다.
슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa): 슈도모나스 항원은 내독소 A, Wzz 단백질, 피. 애루지노사 LPS, PAO1 (O5 혈청형)로부터 단리된 LPS, 및/또는 외막 단백질 F (OprF)를 포함한 외막 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
브루셀라 (Brucella): 비. 아보르투스 (B. abortus), 비. 카니스 (B. canis), 비. 멜리텐시스 (B. melitensis), 비. 네오토마에 (B. neotomae), 비. 오비스 (B. ovis), 비. 수이스 (B. suis), 및 비. 핀니페디아에 (B. pinnipediae)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 브루셀라로부터 유래되는 박테리아 항원.
프란시셀라 (Francisella): 에프. 노비시다 (F. novicida), 에프. 필로미라기아 (F. philomiragia) 및 에프. 툴라렌시스 (F. tularensis)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 프란시셀라로부터 유래되는 박테리아 항원.
스트렙토코쿠스 아갈락티아에 (Streptococcus agalactiae) (그룹 B 스트렙토코쿠스): 그룹 B 스트렙토코쿠스 항원은 WO 02/34771, WO 03/093306, WO 04/041157, 또는 WO 2005/002619에서 확인되는 단백질 또는 사카라이드 항원 (단백질 GBS 80, GBS 104, GBS 276 및 GBS 322 포함, 및 혈청형 Ia, Ib, Ia/c, II, III, IV, V, VI, VII 및 VIII로부터 유래되는 사카라이드 항원 포함)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
네이세리아 고노로에아에 (Neiserria gonorrhoeae): 고노로에아에 항원은 Por (또는 포린) 단백질, 예컨대 PorB (참조: Zhu et al., Vaccine (2004) 22:660 - 669), 트랜스페린 결합 단백질, 예컨대 TbpA 및 TbpB (참조: Price et al., Infection and Immunity (2004) 71(1):277-283), 불투명 단백질 (예컨대, Opa), Rmp (reduction-modifiable protein), 및 외막 소포 (OMV) 조제물 (참조: Plante et al, J Infectious Disease (2000) 182:848-855), 또한, 예를 들어, WO99/24578, WO99/36544, WO99/57280, WO02/079243 참조)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis): 클라미디아 트라코마티스 항원은 혈청형 A, B, Ba 및 C (트라코마원, 실명의 원인), 혈청형 L1, L2 & L3 (성병성 림프육아종과 연관), 및 혈청형, D-K로부터 유래되는 항원을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, 클라미디아 트라코마티스 항원은 PepA (CT045), LcrE (CT089), ArtJ (CT381), DnaK (CT396), CT398, OmpH-like (CT242), L7/L12 (CT316), OmcA (CT444), AtosS (CT467), CT547, Eno (CT587), HrtA (CT823), 및 MurG (CT761)를 포함한, WO 00/37494, WO 03/049762, WO 03/068811, 또는 WO 05/002619에서 확인되는 항원을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
트레포네마 팔리둠 (Treponema pallidum) (매독): 매독 항원은 TmpA 항원을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
해모필루스 듀크레이 (Haemophilus ducreyi) (연성하감 유발): 듀크레이 항원은 외막 단백질 (DsrA)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
엔테로코쿠스 패칼리스 (Enterococcus faecalis) 또는 엔테로코쿠스 패시움 (Enterococcus faecium): 항원은 트리사카라이드 반복부 또는 다른 엔테로코쿠스 유래 항원을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori): 에이치. 파일로리 항원은 CagA, VacA, NAP, HopX, HopY 및/또는 우레아제 항원을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
스타필로코쿠스 사프로파이티쿠스 (Staphylococcus saprophyticus): 항원은 에스, 사프로파이티쿠스 항원의 160 kDa 헤마글루티닌을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
여시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica): 항원은 LPS를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
이. 콜라이 (E. coli): 이. 콜라이는 장독소원성 이. 콜라이 (ETEC), 장응집성 이. 콜라이 (EAggEC), 확산 부착성 이. 콜라이 (DAEC), 장병원성 이. 콜라이 (EPEC), 장외 병원성 이. 콜라이 (ExPEC) 및/또는 장출혈성 이. 콜라이 (EHEC)로부터 유래될 수 있다. ExPEC 항원은 부속 집락화 인자 (orf3526), orf353, 박테리아 Ig-유사 도메인 (그룹 1) 단백질 (orf405), orfl364, NodT-패밀리 외-막-인자-지단백질 유출 수송체 (orfl767), gspK (orf3515), gspJ (orf3516), tonB-의존적 시데로포어 수용체 (orf3597), 핌브리아 단백질 (orf3613), upec-948, upec-1232, 1형 핌브리아 단백질의 A 사슬 전구체 (upec-1875), yap H 상동체 (upec-2820), 및 헤몰리신 A (recp-3768)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) (탄저병): 비. 안트라시스 항원은 둘 모두가 보호 항원 (PA)으로서 알려진 공통 B-성분을 공유할 수 있는, A-성분 (치사 인자 (LF) 및 부종 인자 (EF))을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, 비. 안트라시스 항원은 임의로 해독된다.
여시니아 페스티스 (흑사병): 흑사병 항원은 F1 캡슐 항원, LPS, 여시니아 페스티스 V 항원을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
마이코박테리움 튜버큘로시스 (Mycobacterium tuberculosis): 결핵 항원은 지단백질, LPS, BCG 항원, 항원 85B의 융합 단백질 (Ag85B), ESAT-6, 마이코박테리움 튜버큘로시스 (Mtb) 이소시트레이트 데히드로게나제 연관 항원, 및 MPT51 항원을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
리켓치아 (Rickettsia): 항원은 외막 단백질 A 및/또는 B (OmpB)를 포함한, 외막 단백질, LPS, 및 표면 단백질 항원 (SPA)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
리스테리아 모노시토게네스 (Listeria monocytogenes): 박테리아 항원은 리스테리아 모노시토게네스로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
클라미디아 뉴모니아에 (Chlamydia pneumoniae): 항원은 WO 02/02606에서 확인되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
비브리오 콜레라에 (Vibrio cholerae): 항원은 프로테이나제 항원, LPS, 특히 비브리오 콜레라에 II의 리포폴리사카라이드, O1 Inaba O-특이적 폴리사카라이드, 브이. 콜레라 O139, IEM108 백신 및 폐쇄소대 독소 (Zot)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
살모넬라 티피 (Salmonella typhi) (장티푸스): 항원은 캡슐 폴리사카라이드 바람직하게 접합체 (Vi, 즉 vax-TyVi)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi) (라임병): 항원은 지단백질 (예컨대 OspA, OspB, Osp C 및 Osp D), 다른 표면 단백질 예컨대 OspE-관련 단백질 (Erps), 데코린-결합 단백질 (예컨대 DbpA), 및 항원 가변 VI 단백질, 예컨대 P39 및 P13 (통합 막 단백질)과 연관된 항원, VlsE 항원성 변이 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
포르피로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis): 항원은 피. 진지발리스 외막 단백질 (OMP)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
클렙시엘라 (Klebsiella): 항원은 OMP A를 포함한, OMP, 또는 임의로 파상풍 톡소이드에 접합된 폴리사카라이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상황에서 사용되는 다른 박테리아 항원은 캡슐 항원, 폴리사카라이드 항원, 또는 임의의 상기의 단백질 항원을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, 본 발명의 상황에서 사용되는 박테리아 항원은 그람-음성 박테리아로부터 유래되는 한편, 다른 구현예에서, 그들은 그람-양성 박테리아로부터 유래된다. 일정 구현예에서, 본 발명의 상황에서 사용되는 박테리아 항원은 호기성 박테리아로부터 유래되는 한편, 다른 구현예에서, 그들은 혐기성 박테리아로부터 유래된다.
다른 구현예에서, 상기 항원은 진균 항원이다.
본 발명의 상황에서 사용되는 진균 항원의 예는 하기 기재되는 하나 이상의 진균으로부터 유래되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
진균 항원은 에피더모파이톤 플로코숨 (Epidermophyton floccosum), 미크로스포룸 아우도우이니 (Microsporum audouini), 미크로스포룸 카니스 (Microsporum canis), 미크로스포룸 디스토르툼 (Microsporum distortum), 미크로스포룸 에퀴눔 (Microsporum equinum), 미크로스포룸 집숨 (Microsporum gypsum), 미크로스포룸 나눔 (Microsporum nanum), 트리코파이톤 콘센트리쿰 (Trichophyton concentricum), 트리코파이톤 에퀴눔 (Trichophyton equinum), 트리코파이톤 갈리나에 (Trichophyton gallinae), 트리코파이톤 집세움 (Trichophyton gypseum), 트리코파이톤 메그니니 (Trichophyton megnini), 트리코파이톤 멘타그로파이테스 (Trichophyton mentagrophytes), 트리코파이톤 퀸케아눔 (Trichophyton quinckeanum), 트리코파이톤 루브룸 (Trichophyton rubrum), 트리코파이톤 스코엔레이니 (Trichophyton schoenleinii), 트리코파이톤 톤수란스 (Trichophyton tonsurans), 트리코파이톤 베루코숨 (Trichophyton verrucosum), 티. 베루코숨 (T. verrucosum) var. album, var. discoides, var. ochraceum, 트리코파이톤 비올라세움 (Trichophyton violaceum), 및/또는 트리코파이톤 파비포르메 (Trichophyton faviforme)를 포함한, 더마토파이테스 (Dermatophytes)로부터 유래될 수 있다.
진균 항원은 또한 아스퍼질러스 푸미가투스 (Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 플라부스 (Aspergillus flavus), 아스퍼질러스 니거 (Aspergillus niger), 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 테레우스 (Aspergillus terreus), 아스퍼질러스 시도위 (Aspergillus sydowii), 아스퍼질러스 플라바루스 (Aspergillus flavarus), 아스퍼질러스 글라우쿠스 (Aspergillus glaucus), 블라스토스키조마이세스 카피타투스 (Blastoschizomyces capitatus), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 칸디다 에놀라제 (Candida enolase), 칸디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis), 칸디다 글라브라타 (Candida glabrata), 칸디다 크루세이 (Candida krusei), 칸디다 파랍실로시스 (Candida parapsilosis), 칸디다 스텔라토이데아 (Candida stellatoidea), 칸디다 크루세이 (Candida krusei), 칸디다 파라크세이 (Candida parakwsei), 칸디다 루시타니아에 (Candida lusitaniae), 칸디다 슈도트로피칼리스 (Candida pseudotropicalis), 칸디다 구일리에르몬디 (Candida guilliermondii), 클라도스포리움 카리오니 (Cladosporium carrionii), 콕시디오이데스 임미티스 (Coccidioides immitis), 블라스토마이세스 더마티티디스 (Blastomyces dermatitidis), 크립토코쿠스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 제오트리쿰 클라바툼 (Geotrichum clavatum), 히스토플라스마 캅술라툼 (Histoplasma capsulatum), 클렙시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae), 미크로스포리디아 (Microsporidia), 엔세팔리토조온 (Encephalitozoon) spp., 셉타타 인테스티날리스 (Septata intestinalis) 엔테로시토조온 비에네우시 (Enterocytozoon bieneusi); 덜 일반적으로 브라키올라 (Brachiola) spp, 미크로스포리디움 (Microsporidium) spp., 노세마 (Nosema) spp., 플레이스토포라 (Pleistophora) spp., 트라키플레이스토포라 (Trachipleistophora) spp., 비타포르마 (Vittaforma) spp, 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스 (Paracoccidioides brasiliensis), 뉴모시스티스 카리니 (Pneumocystis carinii), 피티움 인시디오숨 (Pythium insidiosum), 피티로스포룸 오발레 (Pityrosporum ovale), 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 보울라르디 (Saccharomyces boulardii), 사카로바이세스 폼베 (Saccharomyces pombe), 스세도스포리움 아피오스퍼뭄 (Scedosporium apiospermum), 스포로트릭스 스켄키 (Sporothrix schenckii), 트리코스포론 베이겔리 (Trichosporon beigelii), 톡소플라스마 곤디 (Toxoplasma gondii), 페니실리움 마네페이 (Penicillium marneffei), 말라세지아 (Malassezia) spp., 폰세카에아 (Fonsecaea) spp., 완지엘라 (Wangiella) spp., 스포로트릭스 (Sporothrix) spp., 바시디오볼루스 (Basidiobolus) spp., 코니디오볼루스 (Conidiobolus) spp., 리조푸스 (Rhizopus) spp, 무코르 (Mucor) spp, 압시디아 (Absidia) spp, 모르티에렐라 (Mortierella) spp, 쿤닌가멜라 (Cunninghamella) spp, 삭세나에아 (Saksenaea) spp., 알터나리아 (Alternaria) spp, 큐르불라리아 (Curvularia) spp, 헬민토스포리움 (Helminthosporium) spp, 푸사리움 (Fusarium) spp, 아스퍼질러스 (Aspergillus) spp, 페니실리움 (Penicillium) spp, 모닐리니아 (Monilinia) spp, 리족토니아 (Rhizoctonia) spp, 파에실로마이세스 (Paecilomyces) spp, 피토마이세스 (Pithomyces) spp, 클라도스포리움 (Cladosporium) spp 로부터 유래될 수 있다.
예를 들어, 진균 항원은 칸디다 (Candida) 진균 예컨대 씨. 알비칸스 (C. albicans)에 대해 면역 반응을 유발시킬 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 항원은 자기-항원이다.
본 발명의 상황에서, 용어 "자기-항원"은 대상체에게 천연이고 자가면역 질환의 발병에 관여될 수 있는 면역원성 항원을 의미한다.
일부 구현예에서, 자기-항원은 중추 신경계 (CNS) 항원이다. 일부 구현예에서, 자기-항원은 다발성 경화증-연관 항원, 진성 당뇨병-연관 항원, 류마티스성 관절염 연관 항원, 심근염 연관 자기-항원, 또는 갑상선염 연관 항원이다.
예시적인 자기-항원은 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는, 예를 들어, US 특허 출원 공개 번호 제2016/0022788호에 개시된다.
일부 구현예에서, 자기-항원은 다발성 경화증-연관 항원이다. 일부 구현예에서, 자기-항원은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG), 미엘린 염기성 단백질 (MBP), 미엘린 연관 당단백질 (MAG), 알파B-크리스탈린, S100베타, 또는 단백지질 단백질 (PLP)로부터 유래되거나 또는 그의 항원성 펩티드이다.
일부 구현예에서, 자기-항원은 진성 당뇨병-연관 항원이다. 일부 구현예에서, 자기-항원은 인슐린, 크로모그라닌 A, 글루탐산 데카르복실라제 (GAD1; GAD67), 글루타메이트 데카르복실라제 2 (GAD2; GAD65) 및 섬-특이적 글루코스-6-포스파타제 촉매 서브유닛-관련 단백질 및 이의 조합으로부터 선택된다. 이들 항원의 항원성 단편 및 항원성 유도체가 또한 고려된다. 일부 구현예에서, 항원은 프로인슐린일 수 있다.
일부 구현예에서, 자기-항원은 류마티스성 관절염 연관 항원이다. 일부 구현예에서, 류마티스성 관절염 연관 자기-항원은 펩티드 (Q/R)(K/R)RAA일 수 있다. 일부 구현예에서, 관절염 연관 자기-항원은 II형 콜라겐 또는 이의 단편일 수 있다.
일부 구현예에서, 자기-항원은 심근염 연관 자기-항원이다. 일부 구현예에서, 심근염 연관 자기-항원은 미오신 또는 항원성 단편 또는 항원성 유도체이다. 일부 구현예에서, 항원은 인간 미오신에 함유된 펩티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 a-미오신 내에 함유된 펩티드일 수 있다.
일부 구현예에서, 자기-항원은 갑상선염 연관 항원이다. 일부 구현예에서, 자기-항원은 갑상선 퍼옥시다제 (TPO), 티로글로불린, 또는 펜드린으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 상기 항원은 알레르겐이다.
"알레르겐"은 소인이 있는 개체에서 IgE 항체의 생산을 유발시키는, 물질, 일반적으로 단백질로서 정의된다. 유사한 정의가 하기 참조에 표시된다: Clin. Exp. Allergy, No. 26, pp. 494-516 (1996); Mol. Biol. of Allergy and Immunology, ed. R. Bush, Immunology and Allergy Clinics of North American Series (August 1996). 특정 구현예에서, 항원은 단백질 알레르겐으로서, 다시 말해서, 약 6 내지 20 아미노산의 짧은 펩티드, 폴리펩티드, 또는 전체 단백질을 포함한, 알레르기 반응을 촉발시킬 가능성이 있는 임의 아미노산 사슬이다.
알레르겐의 비제한적인 예는 꽃가루 알레르겐 (예컨대 나무-, 풀, 잡초-, 및 잔디 꽃가루 알레르겐), 곤충 알레르겐 (예컨대 흡입인자, 타액 및 독 알레르겐, 예를 들어, 바퀴벌레 및 작은 곤충 알레르겐, 벌목 독 알레르겐), 진드기 알레르겐, 동물 털 및 비듬 알레르겐 (예를 들어, 개, 고양이, 말, 래트, 마우스 등 유래), 및 식품 알레르겐을 포함한다.
예를 들어, 단백질 알레르겐은 더마토파고이데스 (Dermatophagoides) 속의 단백질 알레르겐; 펠리스 (Felis) 속의 단백질 알레르겐; 암브로시아 (Ambrosia) 속의 단백질 알레르겐; 롤리움 (Lolium) 속의 단백질 알레르겐; 크립토메리아 (Cryptomeria) 속의 단백질 알레르겐; 알테르나리아 (Alternaria) 속의 단백질 알레르겐; 알데르 (Alder) 속의 단백질 알레르겐; 베툴라 (Betula) 속의 단백질 알레르겐; 블로미아 (Blomia) 속의 단백질 알레르겐; 쿠에르쿠스 (Quercus) 속의 단백질 알레르겐; 올레아 (Olea) 속의 단백질 알레르겐; 아르테미시아 (Artemisia) 속의 단백질 알레르겐; 플란타고 (Plantago) 속의 단백질 알레르겐; 파리에타리아 (Parietaria) 속의 단백질 알레르겐; 카닌 (Canine) 속의 단백질 알레르겐; 블라텔라 (Blattella) 속의 단백질 알레르겐; 아피스 (Apis) 속의 단백질 알레르겐; 쿠프레수스 (Cupressus) 속의 단백질 알레르겐; 투이아 (Thuya) 속의 단백질 알레르겐; 카마에시파리스 (Chamaecyparis) 속의 단백질 알레르겐; 페리플라네타 (Periplaneta) 속의 단백질 알레르겐; 아그로피론 (Agropyron) 속의 단백질 알레르겐; 세칼레 (Secale) 속의 단백질 알레르겐; 트리티쿰 (Triticum) 속의 단백질 알레르겐; 시노로돈 (Cynorhodon) 속의 단백질 알레르겐; 주니페루스 (Juniperus) 속의 단백질 알레르겐; 닥틸리스 (Dactylis) 속의 단백질 알레르겐; 페스투카 (Festuca) 속의 단백질 알레르겐; 포아 (Poa) 속의 단백질 알레르겐; 아베나 (Avena) 속의 단백질 알레르겐; 홀쿠스 (Holcus) 속의 단백질 알레르겐; 안톡산툼 (Anthoxanthum) 속의 단백질 알레르겐; 아레나테룸 (Arrhenatherum) 속의 단백질 알레르겐; 아그로스티스 (Agrostis) 속의 단백질 알레르겐; 플레움 (Phleum) 속의 단백질 알레르겐; 팔라리스 (Phalaris) 속의 단백질 알레르겐; 파스팔룸 (Paspalum) 속의 단백질 알레르겐; 및 소르굼 (Sorghum) 속의 단백질 알레르겐으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기-확인된 속의 일부로부터 유래되는 다양한 기지의 단백질 알레르겐의 예는 베툴라 (Betula) (베루코사 (verrucosa)) Bet v I; Bet v II; 블로미아 (Blomia) Blo t I; Blo t III; Blo t V; Blo t XII; 시노로돈 (Cynorhodon) Cyn d I; 더마토파고이데스 (Dermatophagoides) (프테로니시누스 (pteronyssinus) 또는 파리나에 (farinae)) Der p I; Der p II; Der p III; Der p VII; Der f I; Der f II; Der f III; Der f VII; 펠리스 (Felis) (도메스티쿠스 (domesticus)) Fel d I;암브로시아 (Ambrosia) (아르테미이스폴리아 (artemiisfolia)) Amb a I.1; Amb a I.2; Amb a I.3; Amb a I.4; Amb a II; 롤리움 (Lollium) (페렌네 (perenne)) Lol p I; Lot p II; Lol p III; Lot p IV; Lol p IX (Lol p V 또는 Lol p Ib); 크립토메리아 (Cryptomeria) (자포니카 (japonica)) Cry j I; Cry j II; 카니스 (Canis) (파밀리아리스 (familiaris)) Can f I; Can f II; 주니페루스 (Juniperus) (사비노이데스 (sabinoides) 또는 비르기니아나 (virginiana)) Jun s I; Jun v I; 주니페루스 (Juniperus) (아세이 (ashei)) Jun a I; Jun a II; 닥틸리스 (Dactylis) (글로메라타 (glomerata)) Dac g I; Dac g V; 포아 (Poa) (프레텐시스 (pretensis)) Poa p I; Phl p I; Phl p V; Phl p VI 및 소르굼 (Sorghum) (할레펜시스 (halepensis)) Sor h I을 포함한다.
식품 알레르겐은 우유 및 유제품, 계란, 콩류 (땅콩 및 대두), 견과류, 곡류 (예컨대, 밀), 십자화과 (예컨대, 겨자), 갑각류, 어류, 및 연체동물로부터 기원할 수 있다. 특히, 식품 알레르겐은 오브알부민 또는 글루텐일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은, 항원, 예컨대 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 자기-항원, 알레르겐 또는 이식편-특이적 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는, 상기 정의된 바와 같은, DNA 벡터, 또는 상기 DNA 벡터를 포함하는 조작된 씨. 아크네스; 및 임의로 보조제를 포함하는 백신 및/또는 면역원성 및/또는 면역치료적 조성물을 포괄한다.
열-불안정성 장독소 (LT), 콜레라-독소 (CT), 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB), 중합 리포솜, 돌연변이체 독소, 프로바이오틱 박테리아, 올리고뉴클레오티드, RNA, siRNA, DNA, 지질을 포함하는, 백신접종을 위한 임의의 통상적이거나 또는 탐색적인, 합성 또는 생물학적 보조제를 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법을 포괄하고, 이 방법은 상기 정의된 바와 같은, 종양 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터, 또는 상기 DNA 벡터를 포함하는 조작된 씨. 아크네스의 치료적 또는 예방적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 대상체에서 암을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법에서 사용을 위한 상기 정의된 바와 같은, 종양 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터, 또는 상기 DNA 벡터를 포함하는 조작된 씨. 아크네스에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "암"은 탈조절 또는 비제어적인 세포 성장을 특징으로 하는 악성종을 포함하는 일종의 과증식성 질환을 의미한다. 거의 모든 조직의 암이 공지되어 있다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프양 악성종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 하기에 기재되며 편평 세포 암 (예를 들어, 상피 편평 세포 암), 폐 암 (소세포 폐 암, 비-소세포 폐 암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평 암종 포함), 복막암, 간세포 암, 위장 암을 포함한 위 또는 위의 암, 췌장 암, 교모세포종, 자궁 암, 난소 암, 간 암, 방광 암, 간세포암, 유방 암, 결장 암, 직장 암, 직결장 암, 자궁내막 암, 자궁 암종, 타액선 암종, 신장 또는 신장의 암, 전립선 암, 갑상선 암, 간 암종을 비롯하여, 두경부 암을 포함한다. 용어 "암"은 원발성 악성 세포 또는 종양 (예를 들어, 세포가 본래 악성종 또는 종양 부위 이외에 대상체의 다른 신체 부위로 이동하지 않은 것) 및 속발성 악성 세포 또는 종양 (예를 들어, 전이로 발생한 것, 본래 종양 부위와 상이한 2차 부위로 악성 세포 또는 종양 세포의 이동)을 포함한다.
용어 "암"은 "과도한 세포 증식" 또는 "세포 증식성 질환"이라고도 할 수 있는, 보다 넓은 범주의 용어 "비정상적 세포 증식" 내에 포괄된다. 질환 연관된 비정상적 세포 증식의 예는 전이성 종양, 악성 종양, 양성 종양, 암, 전암, 과증식증, 사마귀, 및 용종을 비롯하여, 비-암성 병태 예컨대 양성 흑색종, 양성 연골종, 양성 전립선 비대증, 기태, 이형성성 모반, 이형성증, 과증식증, 및 상피층 내에서 발생되는 다른 세포 성장을 포함한다. 전암의 부류는 후천성 소형 또는 미시적 전암, 핵 비정형 동반의 후천성 거대 병변, 암으로 진행하는 유전성 과형성 증후군이 발생한 전조 병변, 및 후천성 미만성 과형성증 및 미만성 화생을 포함한다. 소형 또는 미시적 전암의 예는 HGSIL (high grade squamous intraepithelial lesion of uterine cervix), AIN (anal intraepithelial neoplasia), 성대 이형성증, (결장의) 이상 선와, PIN (prostatic intraepithelial neoplasia)을 포함한다. 핵 비정형 동반의 후천성 거대 병변의 예는 관형 선종, AILD (angioimmunoblastic lymphadenopathy with dysproteinemia), 비정형 수막종, 위 용종, 큰판 유사건선, 골수이형성증, 제자리 유두상 이행 세포 암종, 과도한 모세포 동반 난치성 빈혈, 및 슈나이더 파필로마를 포함한다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법을 포괄하고, 이 방법은 상기 정의된 바와 같은, 바이러스 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터, 또는 상기 DNA 벡터를 포함하는 조작된 씨. 아크네스의 치료적 또는 예방적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 대상체에서 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법에서 사용을 위한, 상기 정의된 바와 같은, 바이러스 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터, 또는 상기 DNA 벡터를 포함하는 조작된 씨. 아크네스에 관한 것이다.
상기 구현예에서, 상기 항원은 바람직하게 특히 상기 항원에 특이적은 면역 반응의 활성화 또는 증강을 유도시킨다.
바이러스 감염의 특정 예는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 폐렴, 장염, 및 망막염; 엡스테인-바 바이러스 (EBV) 림프증식성 질환; 수두/대상포진 (바리셀라 조스터 바이러스, VZV에 의해 유발); HSV-1 및 HSV-2 점막염; HSV-6 뇌염, BK-바이러스 출혈성 방광염; 바이러스 인플루엔자; 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)에 의한 폐렴; AIDS (HIV에 의해 유발); A형, B형 또는 C형 간염을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 바이러스 감염의 추가 예는 레트로비리다에; 피코르나비리다에 (예를 들어, 폴리오 바이러스, A형 간염 바이러스; 엔테로바이러스, 인간 콕사키 바이러스, 리노바이러스, 에코바이러스); 칼시비리다에 (예컨대, 위장염을 유발하는 균주); 토가비리다에 (예를 들어, 말 뇌염 바이러스, 루벨라 바이러스); 플라비비리다에 (예를 들어, 뎅기 바이러스, 뇌염 바이러스, 황열 바이러스); 코로나비리다에 (예를 들어, 코로나바이러스); 라브도비리다에 (예를 들어, 수포성 구내염 바이러스, 공수병 바이러스); 필로비리다에 (예를 들어, 에볼라 바이러스); 파라믹소비리다에 (예를 들어, 파라인플루엔자 바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스); 오르토믹소비리다에 (예를 들어, 인플루엔자 바이러스); 분가비리다에 (예를 들어, 한탄 바이러스, 분가 바이러스, 플레보바이러스 및 나이로 바이러스); 아레나비리다에 (출혈열 바이러스); 레오비리다에 (예를 들어, 레오바이러스, 오르비바이러스 및 로타바이러스); 비마비리다에; 헤파드나비리다에 (B형 간염 바이러스); 파르보비리다에 (파르보바이러스); 파포바비리다에 (파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스); 아데노비리다에 (대부분의 아데노바이러스); 헤르페스비리다에 (헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) 1 및 HSV-2, 바리셀라 조스터 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 헤르페스 바이러스); 폭스비리다에 (바리올라 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스); 및 이리도비리다에 (예컨대 아프리카 돼지 열병 바이러스); 및 미분류 바이러스 (예를 들어, 해면양 뇌병증의 병인, 델타 간염의 병원체 (B형 간염 바이러스의 결함성 위성으로 여겨짐), 비-A형, 비-B형 간염의 병원체 (클래스 1 = 내부 전파; 클래스 2 = 비경구 전파 (즉, C형 간염)); 노르워크 및 관련 바이러스, 및 아스트로바이러스에 의해 유발되는 감염을 포함한다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 박테리아 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법을 포괄하고, 방법은 상기 정의된 바와 같은, 박테리아 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터, 또는 상기 DNA 벡터를 포함하는 조작된 씨. 아크네스의 치료적 또는 예방적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 대상체에서 박테리아 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법에서 사용을 위한, 상기 정의된 바와 같은, 박테리아 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터, 또는 상기 DNA 벡터를 포함하는 조작된 씨. 아크네스에 관한 것이다.
상기 구현예에서, 상기 항원은 바람직하게 특히 상기 항원에 특이적인, 면역 반응의 활성화 또는 증강을 유도한다.
박테리아 감염의 예는 헬리코박터 파일로리스 (Helicobacter pyloris), 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 마이코박테리아 (Mycobacteria) sp. (예컨대, 엠. 튜버큘로시스 (M. tuberculosis), 엠. 아비움 (M. avium), 엠. 인트라셀룰라레 (M. intracellulare), 엠. 칸사시 (M. kansasii), 엠. 고르도나에 (M. gordonae)), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 네이세리아 고도로에아에 (Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닌지티디스 (Neisseria meningitidis), 리스테리아 모노시토게네스 (Listeria monocytogenes), 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes)(그룹 A 스트렙토코쿠스), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에 (Streptococcus agalactiae)(그룹 B 스트렙토코쿠스), 스트렙토코쿠스 (Streptococcus)(녹색 그룹), 스트렙토코쿠스 패칼리스 (Streptococcus faecalis), 스트렙토코쿠스 보비스 (Streptococcus bovis), 스트렙토코쿠스 (Streptococcus) (혐기성 sps.), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae), 병원성 캄필로박터 (Campylobacter) sp., 엔테로코쿠스 (Enterococcus) sp., 해모필루스 인플루엔자에 (Haemophilus influenzaee), 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis), 코리네박테리움 디프테리아에 (Corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 (Corynebacterium) sp., 에리시펠로트릭스 루시오파티아에 (Erysipelothrix rhusiopathiae), 클로스트리듐 퍼프린겐스 (Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani), 엔테로박터 애로게네스 (Enterobacter aerogenes), 클렙시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae), 파스퇴렐라 멀토시다 (Pasteurella multocida), 박테로이데스 (Bacteroides) sp., 푸소박테리움 뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum), 스트렙토바실러스 모닐리포르미스 (Streptobacillus moniliformis), 트레포네마 팔리둠 (Treponema pallidum), 트레포네마 퍼테누에 (Treponema pertenue), 렙토스피라 (Leptospira), 및 악티노마이세스 이스라엘리 (Actinomyces israelii)에 의해 유발되는 감염을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 진균 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법을 포괄하고, 이 방법은 상기 정의된 바와 같은, 진균 항원을 코딩하는 DNA 벡터, 또는 상기 DNA 벡터를 포함하는 조작된 씨. 아크네스의 치료적 또는 예방적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 대상체에서 진균 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법에서 사용을 위한 상기 정의된 바와 같은, 진균 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터, 또는 상기 DNA 벡터를 포함하는 조작된 씨. 아크네스에 관한 것이다.
상기 구현예에서, 상기 항원은 바람직하게 특히 상기 항원에 특이적인, 면역 반응의 활성화 또는 증강을 유도시킨다.
진균 감염의 예는 아스페르길루스증; 아구창 (칸디다 알비칸스 (Candida albicans)에 의해 유발); 크립토콕쿠스증 (크립토코쿠스 (Cryptococcus)에 의해 유발); 및 히스토플라스마증을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 진균 감염의 예는 크립토코쿠스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캅슐라툼 (Histoplasma capsulatum), 콕시디오이데스 임미티스 (Coccidioides immitis), 블라스토마이세스 더마티티디스 (Blastomyces dermatitidis), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 또는 칸디다 알비칸스 (Candida albicans)에 의해 유발되는 감염을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 자가-면역 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법을 포괄하고, 이 방법은 상기 정의된 바와 같은, 자기-항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터, 또는 상기 DNA 벡터를 포함하는 조작된 씨. 아크네스의 치료적 또는 예방적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 대상체에서 자가-면역 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법에서 사용을 위한 상기 정의된 바와 같은, 자기-항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터, 또는 상기 DNA 벡터를 포함하는 조작된 씨. 아크네스에 관한 것이다.
상기 구현예에서, 상기 항원은 바람직하게 특히 상기 항원에 대해서 면역 반응의 관용화 또는 억제를 일으킨다.
자가면역 질환은 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 중증 근무력증, 건선, 전신 홍반성 루푸스, 자가면역 갑상선염 (하시모토 갑상선염), 그레이브스병, 염증성 장 질환, 자가면역 포도막염, 심근염, 다말성근염, 및 1형 당뇨병을 포함한, 일정 유형의 당뇨병을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 알레르기, 예컨대 천식을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법을 포괄하고, 이 방법은 상기 정의된 바와 같은, 알레르겐을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터, 또는 상기 DNA 벡터를 포함하는 조작된 씨. 아크네스의 치료적 또는 예방적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 대상체에서 알레르기, 예컨대 천식을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법에서 사용을 위한 상기 정의된 바와 같은, 알레르겐을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터, 또는 상기 DNA 벡터를 포함하는 조작된 씨. 아크네스에 관한 것이다.
상기 구현예에서, 상기 항원은 바람직하게 특히 상기 항원에 대한 면역 반응의 관용화 또는 억제를 일으킨다.
본 개시의 상황에서 알레르기는 상기 정의된 알레르겐으로 인한 알레르기 또는 천식과 관련된다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 이식편 거부를 예방 및/또는 치료하기 위한 방법을 포괄하고, 이 방법은 상기 정의된 바와 같은, 이식편-특이적 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터, 또는 상기 DNA 벡터를 포함하는 조작된 씨. 아크네스의 치료적 또는 예방적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 대상체에서 이식편 거부를 예방 및/또는 치료하기 위한 방법에서 사용을 위한 상기 정의된 바와 같은, 이식편-특이적 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터, 또는 상기 DNA 벡터를 포함하는 조작된 씨. 아크네스에 관한 것이다.
상기 구현예에서, 상기 항원은 바람직하게 특히 상기 항원에 대한 면역 반응의 관용화 또는 억제를 일으킨다.
달리 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에서 언급되는 모든 공개물은 참조로 본 명세서에 편입된다. 본 개시는 모순이 존재하는 정도까지 편입된 공개물의 임의 개시 내용을 대체하는 것으로 이해한다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 단수형 "한", "하나", 및 "그"는 달리 명백하게 명시하지 않으면 복수 참조를 포함한다는 것을 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "항원"에 대한 언급은 둘 이상의 항원의 혼합물 등을 포함한다.
정의
≪ 전달 비히클 ≫
본 명세서에서 사용되는, 용어 ≪ 전달 비히클 ≫ 은 박테리아로 페이로드의 전달을 허용하는 임의 수단을 의미한다.
제한없이, 박테리오파지 스캐폴드, 바이러스 스캐폴드, 화학 기반 전달 비히클 (예를 들어, 사이클로덱스트린, 칼슘 포스페이트, 양이온 중합체, 양이온 리포솜), 단백질-기반 또는 펩티드-기반 전달 비히클, 지질-기반 전달 비히클, 나노입자-기반 전달 비히클, 비-화학-기반 전달 비히클 (예를 들어, 형질전환, 전기천공, 소노포레이션, 광학 형질감염), 입자-기반 전달 비히클 (예를 들어, 유전자총, 마그네토펙션, 임팔러펙션, 입자 충격, 세포-침투성 펩티드) 또는 도너 박테리아 (접합)를 포함하여, 본 발명에 포괄되는 몇개 유형의 전달 비히클이 존재한다.
전달 비히클의 임의 조합이 또한 본 발명에 포괄된다.
전달 비히클은 박테리오파지 유래 스캐폴드를 의미할 수 있고, 천연, 진화, 또는 조작된 캡시드로부터 수득될 수 있다.
일부 구현예에서, 전달 비히클은 박테리아가 그들 자신이 환경으로부터 페이로드를 흡수하는데 천연적으로 적격하므로 페이로드이다.
≪ 접합 ≫
접합은 도너 박테리아가 수용자 박테리아에게 DNA를 적극적으로 전달하는 과정이다. DNA 전달은 oriT DNA에 닉을 형성하고 그에 공유적으로 결합하는 렐락사제로 알려진 단백질에 의한 전달 기원 (oriT)의 인식을 포함한다. 렐락사제 및 단일 가닥 DNA는 전형적으로 IV형 분비 시스템을 통해서 수용자 세포로 주입된다. 플라스미드 또는 ICE (통합성 접합성 구성요소)의 접합 동안, 렐락사제의 전달은 플라스미드 또는 ICE의 롤링 써클 복제와 커플링된다. 수용자에 존재하면, 렐락사제는 oriT에서 전달된 가닥을 재원형화시키게 된다 (Smillie et al, Microbiology and Molecular Biology Rev, 2010, P.434-452).
접합성 플라스미드의 예는 F, R388, RP4, RK2, R6K이다. 하기 그룹의 플라스미드는 빈번하게 접합성이며 IV형 분비 시스템을 보유한다: IncA, IncB/O (Ind O), IncC, IncD, IncE, IncFI, lncF2, IncG, IncHM, lncHI2, Inch, Incl2, IncJ, IncK, IncL/M, IncN, IncP, IncQI, lncQ2, IncR, IncS, IncT, IncU, IncV, IncW, IncXI, lncX2, IncY, IncZ, ColE1, ColE2, ColE3, p15A, pSC101, lncP-2, lncP-5, lncP-7, lncP-8, lncP-9, Ind, Inc4, Inc7, Inc8, Inc9, Inc1 1, Inc13, Ind 4 또는 Ind 8.
IV형 분비 시스템의 목록은 공공 데이터베이스 예컨대 AtlasT4SS에서 찾을 수 있다.
접합은 플라스미드에 제한되지 않고 oriT가 존재할 때 박테리아의 염색체에서도 발생될 수 있다. 이것은 염색체에서 접합성 플라스미드의 재조합을 통해서 천연적으로 또는 염색체에서 관심 위치에 oriT를 도입시켜서 인공적으로 일어날 수 있다. 특정 부류의 접합성 구성요소는 통합성 및 접합성 구성요소 (ICE)로서 알려져 있다. 이들은 원형 플라스미드 형태로 유지되지 않고 숙주 염색체에 통합된다. 전달 시, ICE는 염색체로부터 잘려진 다음에 접합성 플라스미드와 유사한 방식으로 전달된다. 수용자 세포에 있으면, ICE는 수용자의 염색체에 통합된다. ICE 구성요소의 목록은 공공 데이터베이스 예컨대 ICEberg에서 찾을 수 있다.
전달 기원 및 IV형 분비 시스템 유전자 둘 모두를 보유하는 ICE 또는 플라스미드는 일반적으로 이동성 구성요소라고 하는 반면, oriT만을 보유하는 ICE 또는 플라스미드는 가동성 플라스미드라고 할 수 있다. 가동성 구성요소는 다른 플라스미드에 의해서 또는 숙주 세포의 염색체로부터, IV형 분비 시스템이 트랜스로 발현되는 경우에만 도너 세포로부터 수용자 세포로 전달될 수 있다.
≪ 페이로드 ≫
본 명세서에서 사용되는 용어 ≪ 페이로드 ≫ 는 전달 비히클에 의해서 박테리아로 전달되는 임의의 핵산 서열 또는 아미노산 서열, 또는 둘의 조합 (예컨대, 제한없이, 펩티드 핵산 또는 펩티드-올리고뉴클레오티드 접합체)을 의미하다.
용어 ≪ 페이로드 ≫ 는 또한 플라스미드, 벡터, 또는 카고를 의미할 수도 있다.
페이로드는 천연, 진화 또는 조작된 박테리오파지 게놈으로부터 수득되는 파지미드 또는 파스미드일 수 있다. 페이로드는 또한 천연, 진화, 또는 조작된 박테리오파지 게놈으로부터 수득되는 파지미드 또는 파스미드의 일부만으로 구성될 수도 있다.
일부 구현예에서, 페이로드는 박테리아가 그들 스스로 환경으로부터 페이로드를 흡수하는데 천연적으로 적격하기 때문에 전달 비히클이다.
≪ 핵산 ≫
본 명세서에서 사용되는, 용어 "핵산"은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나 또는 단일 가닥 및 이중 가닥 둘 모두의 일부를 함유하는 공유적으로 연결된 적어도 2개 뉴클레오티드의 서열을 의미한다. 본 발명의 핵산은 천연 발생, 재조합 또는 합성일 수 있다. 핵산은 원형 서열 또는 선형 서열의 형태 또는 양쪽 형태의 조합일 수 있다. 핵산은 DNA, 게놈 또는 cDNA, 또는 RNA 또는 이 둘의 조합일 수 있다. 핵산은 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드의 임의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 잔틴, 하이포잔틴, 이소시토신, 5-히드록시메틸시토신 및 이소구아닌을 포함한, 염기의 임의 조합을 함유할 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 변형된 염기의 다른 예는 하기 문헌에 상술된다: Chemical Reviews 2016, 116 (20) 12655-12687. 용어 "핵산"은 또한 제한없이, 포스포르아미드, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, O-메틸포스포로아미다이트 연결 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드 핵산을 포함하는 다른 골격을 함유할 수 있는 임의 핵산 유사체를 포괄한다. 핵산의 상기 특성의 임의 조합이 또한 본 발명에 포괄된다.
≪ 벡터 ≫
본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터"는 소정 숙주 세포에서 폴리펩티드를 발현할 수 있는 서열의 임의 구성체를 의미한다. 벡터가 사용되는 경우 벡터의 선택은 당업자에게 충분히 공지된 바와 같이 숙주 박테리아를 형질전환시키는데 사용되는 방법에 의존한다. 벡터는 제한없이, 플라스미드 벡터 및 재조합 파지 벡터, 또는 표적 박테리아에 본 발명의 폴리펩티드를 전달하는데 적합한 것으로 알려진 임의의 다른 벡터를 포함할 수 있다. 당업자는 본 발명의 임의의 단리된 뉴클레오티드 또는 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포를 성공적으로 형질전환, 선택 및 증식시키기 위해서 벡터에 존재해야만 하는 유전자 구성요소를 잘 알고 있다.
≪ 파지미드 ≫
본 명세서에서 사용되는 용어 "파지미드" 또는 "파스미드"는 동등하고, 박테리오파지 게놈의 적어도 하나의 서열을 포함하는 재조합 DNA 벡터를 의미한다. 본 개시의 파지미드는 파지 패키징 부위 및 임의로 복제 기원 (ori), 특히 박테리아 및/또는 파지 복제 기원을 포함한다. 일 구현예에서, 본 개시의 파지미드는 박테리아 복제 기원을 포함하지 않고, 따라서 박테리아에 주입되었을 때 그 자체로 복제될 수 없다. 대안적으로, 파지미드 플라스미드 복제 기원, 특히 박테리아 및/또는 파지 복제 기원을 포함한다.
≪ 패키징된 파지미드 ≫
본 명세서에서 사용되는 용어 "패키징된 파지미드" 또는 "파지-유래 입자"는 박테리오파지 스캐폴드, 박테리아 바이러스 입자 또는 캡시드에 캡슐화되는 파지미드를 의미한다. 특히, 박테리오파지 스캐폴드, 박테리아 바이러스 입자 또는 박테리오파지 게놈이 없는 캡시드를 의미한다. 패키징된 파지미드 또는 파지-유래 입자는 당업자에게 충분히 공지된, 헬퍼 파지 전략으로 생산될 수 있다. 헬퍼 파지는 캡슐화시키려는 본 발명에 따른 파지미드에 필수적인 구조 및 기능 단백질을 코딩하는 모든 유전자를 포함한다. 패키징된 파지미드 또는 파지-유래 입자는 당업자에게 역시 공지된, 위성 바이러스 전략으로 생산될 수 있다. 위성 바이러스는 모든 형태발생적 기능에 대해서 헬퍼 바이러스와 숙주 세포의 동시-감염에 의존하는 핵산으로 구성되는, 하위바이러스원인 반면, 모든 이의 에피솜 기능 (통합 및 면역력, 다수카피 플라스미드 복제)을 위해서, 위성은 헬퍼로부터 완전히 자율적이다. 일 구현예에서, 위성 유전자는 P2 캡시드 크기를 이의 더 작은 게놈에 맞도록 제어하는 P4 Sid 단백질에 대해 기술된 바와 같은, 헬퍼 파지의 캡시드 크기 감소를 촉진하는 단백질을 코딩할 수 있다.
≪ 펩티드 ≫
본 명세서에서 사용되는 용어 "펩티드"는 서로 간에 연결된 적어도 2개 아미노산의 짧은 사슬, 및 단백질의 나머지와 독립적으로 발현되지 않는 일부, 서브세트 또는 단편인 단백질의 일부, 서브세트, 또는 단편을 의미한다. 일부 예에서, 펩티드는 단백질이다. 일부 다른 예에서, 펩티드는 단백질이 아니고, 펩티드는 오직 단백질의 일부, 서브세트 또는 단편을 의미한다. 바람직하게, 펩티드는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 아미노산 내지 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200 아미노산 크기이다.
"조작된"
본 명세서에서 사용되는, 용어 "조작된"은 본 발명의 박테리아 세포, 파지, 파지-유래 입자, 파지미드 또는 벡터가 분자 생물학 기술에 의해 조작된 것을 의미한다. 당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 박테리아 세포, 파지, 파지-유래 입자, 파지미드 또는 벡터의 조작은 핵산 서열을 도입시키거나 또는 변형시키기 위한 의도적인 행동을 의미하고 박테리아 세포, 파지, 파지-유래 입자, 파지미드 또는 벡터의 자연 진화를 통한 핵산 서열의 도입 또는 변형은 포함하지 않는다.
"동일성 백분율"
본 명세서에서 사용되는 동일성 백분율은 그의 서열들이 정렬된 중합체 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드)와 관련하여 계산된다. 2개 서열 간 동일성 백분율은 2개 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 개수, 및 각 갭의 길이를 고려한, 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수 (즉, % 상동성 = 동일한 위치의 #/위치의 총 # x 100)이다. 서열의 비교 및 2개 서열 간 동일성 백분율의 결정은 하기 비제한적인 예에 기술된 바와 같이, 수학 알고리즘을 사용해 수행될 수 있다.
2개 아미노산 서열 간 동일성 백분율은 PAM120 가중 잔기 표, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용하여, ALIGN 프로그램 (version 2.0)에 통합된 E. Meyers 및 W. Miller의 알고리즘 (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988))을 사용해 결정될 수 있다. 또한, 2개 아미노산 서열 간 동일성 백분율은 BLOSUM62 매트릭스, BLOSUM30 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치, 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지 (www.gcg.com에서 입수가능)의 GAP 프로그램에 통합된 Needleman 및 Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) 알고리즘을 사용해 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, BLOSUM30 매트릭스는 12의 갭 오픈 패널티 및 4의 갭 연장 패널티와 함께 사용된다.
CRISPR-Cas 시스템
CRISPR-Cas 시스템은 2개 별개 구성요소, 즉, i) CRISPR 연관 뉴클레아제 (Cas 또는 "CRISPR 연관 단백질")의 경우에, 엔도뉴클레아제 및 ii) 가이드 RNA를 코딩하는 DNA를 의미한다. CRISPR 시스템의 유형에 의존하여, 가이드 RNA는 CRISPR (crRNA) 박테리아 RNA 및 tracrRNA (trans-activating RNA CRISPR)의 조합으로 이루어진 키메라 RNA의 형태일 수 있다 (Jinek et al., Science 2012). 가이드 RNA는 Cas 단백질에 대한 가이드로서 제공되는 "스페이싱 서열"에 상응하는 crRNA에 대한 표적화 특이성, 및 단일 전사물에서 tracrRNA의 입체형태적 성질을 조합한다. 가이드 RNA 및 Cas 단백질이 세포에서 동시에 발현될 때, 표적 게놈 서열은 영구적으로 차단 (및 위치에 의존하여, 표적 및 주변 서열의 소멸 및/또는 세포 사멸 유발) 또는 변형될 수 있다. 변형은 복구 매트릭스에 의해 가이드될 수 있다.
CRISPR-Cas 시스템은 뉴클레아제 작용 기전에 의존하여 하기의 2개 주요 클래스를 포함한다:
- 클래스 1은 다수-서브유닛 이펙터 복합체로 구성되고, I형, III형 및 IV형을 포함한다;
- 클래스 2는 단일-유닛 이펙터 모듈, 예컨대 Cas9 뉴클레아제로 구성되고, II형 (II-A,II-B,II-C,II-C 변이체), V형 (V-A,V-B,V-C,V-D,V-E,V-U1,V-U2,V-U3,V-U4,V-U5) 및 VI형 (VI-A,VI-B1,VI-B2,VI-C,VI-D)을 포함한다.
본 발명에 따른 관심 서열은 Cas 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 다양한 CRISPR 효소는 본 발명에 따른 플라스미드 상에서 관심 서열로서 사용을 위해 이용가능하다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 II형 CRISPR 효소, II-A형 또는 II-B형 CRISPR 효소이다. 다른 구현예에서, CRISPR 효소는 I형 CRISPR 효소 또는 III형 CRISPR 효소이다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 DNA 절단을 촉매한다. 일부 다른 구현예에서, CRISPR 효소는 RNA 절단을 촉매한다. 일 구현예에서, CRISPR 효소는 가이드 RNA 또는 단일 가이드 RNA (sgRNA)에 커플링될 수 있다. 일정 구현예에서, 가이드 RNA 또는 sgRNA는 항생제 내성 유전자, 병독성 단백질 또는 인자 유전자, 독소 단백질 또는 인자 유전자, 박테리아 수용체 유전자, 막 단백질 유전자, 구조 단백질 유전자, 분비형 단백질 유전자, 일반 약물에 대한 내성 발현 유전자, 및 숙주에 대해 유해한 효과를 유발하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자를 표적화한다.
관심 서열은 페이로드에 의해 코딩되는 Cas 단백질 및/또는 가이드 RNA와 조합하거나 또는 단독으로, 표적화된 박테리아에 내생성인 Cas 단백질을 가이드하기 위한 가이드 RNA 또는 sgRNA를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
다수-서브유닛 이펙터의 일부로서 또는 단일-유닛 이펙터로서 Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (Csn1 및 Csx12로도 알려짐), Cas10, Cas11 (SS), Cas12a (Cpf1), Cas12b (C2c1), Cas12c (C2c3), Cas12d (CasY), Cas12e (CasX), C2c4, C2c8, C2c5, C2c10, C2c9, Cas13a (C2c2), Cas13b (C2c6), Cas13c (C2c7), Cas13d, Csa5, Csc1, Csc2, Cse1, Cse2, Csy1, Csy2, Csy3, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csn2, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx13, Csx1, Csx15, SdCpf1, CmtCpf1, TsCpf1, CmaCpf1, PcCpf1, ErCpf1, FbCpf1, UbcCpf1, AsCpf1, LbCpf1, 이의 상동체, 이의 오솔로그, 이의 변이체, 또는 이의 변형된 형태를 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 PAM (Protospacer Adjacent Motif) 부위에서 표적 핵산의 양쪽 가닥을 절단한다.
특정 구현예에서, CRISPR 효소는 임의의 Cas9 단백질, 예를 들어, 임의의 천연 발생 박테리아 Cas9를 비롯하여, 이의 임의 변이체, 상동체 또는 오솔로그이다.
"Cas9"란 단백질 Cas9 (Csn1 또는 Csx12라고도 함) 또는 이의 기능성 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 의미하는 것으로서, 다시 말해서 가이드 RNA(들)와 상호작용할 수 있고 효소 활성 (뉴클레아제)을 발휘하여서 표적 게놈의 DNA의 이중 가닥 절단을 수행하도록 허용하는 것을 의미한다. 따라서, "Cas9"는 변형된 단백질, 예를 들어 단백질의 사전정의된 기능에 필수적이지 않은 단백질의 도메인, 특히 gRNA (들)와 상호작용을 위해 필요하지 않은 도메인을 제거하도록 절두된 것을 의미한다.
본 발명의 상황에서 사용되는 Cas9 (전체 단백질 또는 이의 단편)를 코딩하는 서열은 임의의 기지 Cas9 단백질로부터 수득될 수 있다 (Fonfara et al., 2014; Koonin et al., 2017). 본 발명에서 유용한 Cas9 단백질의 예는 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) (SpCas9), 스트렙토코쿠스 써모필레스 (Streptococcus thermophiles) (St1Cas9, St3Cas9), 스트렙토코쿠스 뮤탄스 (Streptococcus mutans), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) (SaCas9), 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) (CjCas9), 프란시셀라 노비시다 (Francisella novicida) (FnCas9) 및 네이세리아 메닌지티데스 (Neisseria meningitides) (NmCas9)의 Cas9 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상황에서 사용되는 Cpf1 (Cas12a) (전체 단백질 또는 이의 단편)을 코딩하는 서열은 임의의 기지 Cpf1 (Cas12a) 단백질로부터 수득될 수 있다 (Koonin et al., 2017). 본 발명에서 유용한 Cpf1(Cas12a) 단백질의 예는 악시다미노코쿠스 (Acidaminococcus) sp, 라크노스피라세아에 박테리우 (Lachnospiraceae bacteriu) 및 프란시셀라 노비시다 (Francisella novicida)의 Cpf1(Cas12a) 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상황에서 사용되는 Cas13a (전체 단백질 또는 이의 단편)을 코딩하는 서열은 임의의 기지 Cas13a (C2c2) 단백질로부터 수득될 수 있다 (Abudayyeh et al., 2017). 본 발명에서 유용한 Cas13a (C2c2) 단백질의 예는 렙토트리키아 와데이 (Leptotrichia wadei) (LwaCas13a)의 Cas13a (C2c2) 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상황에서 사용되는 Cas13d (전체 단백질 또는 이의 단편)를 코딩하는 서열은 임의의 기지 Cas13d 단백질로부터 수득될 수 있다 (Yan et al., 2018). 본 발명에서 유용한 Cas13d 단백질의 예는 유박테리운 시라에움 (Eubacterium siraeum) 및 루미노코쿠스 (Ruminococcus) sp 의 Cas13d 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 관심 핵산 서열은 항생제 내성 유전자, 병독성 인자 또는 단백질 유전자, 독소 인자 또는 단백질 유전자, 박테리아 수용체, 막 단백질, 구조 단백질, 분비형 단백질을 발현하는 유전자, 일반 약물에 대한 내성을 발현하는 유전자 및 숙주에 대해 유해한 효과를 유발하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의, 유전자 발현의 감소 또는 불활성화를 위한 CRISPR/Cas9 시스템이다
일 구현예에서, CRISPR-Cas 시스템은 병독성 인자를 표적화하여서 불활성화시키는데 사용된다. 병독성 인자는 숙주에 대해 가해진 손상 정도를 증가시켜서 숙주-병원체 상호작용을 변경시키는 병원체에 의해 생산되는 임의 물질일 수 있다. 병독성 인자는 예를 들어, 숙주의 면역 반응을 회피하거나, 숙주 세포로의 출입을 촉진하거나, 숙주로부터 영양분을 수득하거나, 또는 숙주에서 다른 생리적 과정을 억제하기 위해서, 숙주에서 니쉐의 집락화 또는 세포 부착을 포함하여, 많은 방식으로 병원체에 의해 사용된다. 병독성 인자는 효소, 내독소, 부착 인자, 운동 인자, 보체 회피에 관여하는 인자, 소거 인자 및 생물막 형성을 촉진하는 인자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적화된 병독성 인자 유전자는 이. 콜라이 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, EHEC-HlyA, Stx1 (VT1), Stx2 (VT2), Stx2a (VT2a), Stx2b (VT2b), Stx2c (VT2c), Stx2d (VT2d), Stx2e (VT2e) and Stx2f (VT2f), Stx2h (VT2h), stx2k, fimA, fimF, fimH, neuC, kpsE, sfa, foc, iroN, aer, iha, papC, papGI, papGII, papGIII, hlyC, cnf1, hra, sat, ireA, usp ompT, ibeA, malX, fyuA, irp2, traT, afaD, ipaH, eltB, estA, bfpA, eaeA, espA, aaiC, aatA, TEM, CTX, SHV, csgA, csgB, csgC, csgD, csgE, csgF, csgG, csgH, T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS (분비 시스템)일 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적화된 병독성 인자 유전자는 시겔라 디센테리아에 (Shigella dysenteriae) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, stx1 및 stx2일 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적화된 병독성 인자 유전자는 여시니아 페스티스 (Yersinia pestis) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, yscF (플라스미드-유래 (pCDl) T3SS 외부 침 서브유닛)일 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적화된 병독성 인자 유전자는 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, fslA일 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적화된 병독성 인자 유전자는 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, pag (탄저균 독소, 세포-결합 보호 항원)일 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적화된 병독성 인자 유전자는 비브리오 콜레라 (Vibrio cholera) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, ctxA 및 ctxB (콜레라 독소), tcpA (독소 공-조절 선모), 및 toxT (마스터 병독성 조절인자)일 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적화된 병독성 인자 유전자는 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, 피오버딘 (예를 들어, 시그마 인자 pvdS, 생합성 유전자 pvdL, pvdl, pvdJ, pvdH, pvdA, pvdF, pvdQ, pvdN, pvdM, pvdO, pvdP, 수송체 유전자 pvdE, pvdR, pvdT, opmQ), 시데로포어 피오켈린 (예를 들어, pchD, pchC, pchB, pchA, pchE, pchF 및 pchG, 및 독소 (예를 들어, exoU, exoS 및 exoT)일 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적화된 병독성 인자 유전자는 클렙시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, fimA (부착, I형 핌브리아 주요 서브유닛), 및 cps (캡슐 폴리사카라이드)일 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적화된 병독성 인자 유전자는 아시네토박터 바우만니 (Acinetobacter baumannii) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, ptk (캡슐 중합) 및 epsA (조립)일 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적화된 병독성 인자 유전자는 살모넬라 엔테리카 티피 (Salmonella enterica Typhi) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, MIA (침입, SPI-1 조절인자), ssrB (SPI-2 조절인자), 및 유출 펌프 유전자 acrA, acrB 및 tolC를 포함한, 담즙 내성과 연관된 것일 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적화된 병독성 인자 유전자는 푸소박테리움 뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, FadA 및 TIGIT일 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적화된 병독성 인자 유전자는 박테로이데스 프라질리스 (Bacteroides fragilis) 병독성 인자 유전자 예컨대, 제한없이, bft일 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적화된 병독성 인자 유전자는 큐티박테리움 아크네스 (Cutibacterium acnes) 포르피린 유전자, CAMP-인자 (CAMP1, CAMP2, CAMP3, CAMP4), 히알루로네이트 리아제 (HYL-IB/II, HYL-IA), 리파제 (GehA, GehB), 해몰리신, 시알리다제, 엔도글리코세라미다제, 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제, 더마탄 술페이트 어드헤신 (DsA1, DsA2), 프롤린-트레오닌 반복부 (PTR) 또는 여드름 연관 게놈 유전자좌 1, 2, 3 (플라스미드), 4에 포함된 임의의 병독성 인자 예컨대 Tomida 등에 기술된 바와 같은 조밀 부착 유전자좌 (tad), 스트렙토리신 S-연관 유전자 (sag), 비-리보솜 펩티드 신써타제 (NRPS)일 수 있다.
다른 구현예에서, CRISPR/Cas9 시스템은 항생제 내성 유전자 예컨대, 제한없이, GyrB, ParE, ParY, AAC(1), AAC(2'), AAC(3), AAC(6'), ANT(2"), ANT(3"), ANT(4'), ANT(6), ANT(9), APH(2"), APH(3"), APH(3'), APH(4), APH(6), APH(7"), APH(9), ArmA, RmtA, RmtB, RmtC, Sgm, AER, BLA1, CTX-M, KPC, SHV, TEM, BlaB, CcrA, IMP, NDM, VIM, ACT, AmpC, CMY, LAT, PDC, OXA β-락타마제, mecA, Omp36, OmpF, PIB, bla (blaI, blaR1) 및 mec (mecI, mecR1) 오페론, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 클로람페니콜 포스포트랜스퍼라제, 에탐부톨-내성 아라비노실트랜스퍼라제 (EmbB), MupA, MupB, 통합 막 단백질 MprF, Cfr 23S rRNA 메틸트랜스퍼라제, 리팜핀 ADP-리보실트랜스퍼라제 (Arr), 리팜핀 글리코실트랜스퍼라제, 리팜핀 모노옥시게나제, 리팜핀 포스포트랜스퍼라제, DnaA, RbpA, RNA 폴리머라제의 리팜핀-내성 베타-서브유닛 (RpoB), Erm 23S rRNA 메틸트랜스퍼라제, Lsa, MsrA, Vga, VgaB, 스트렙토그라민 Vgb 리아제, Vat 아세틸트랜스퍼라제, 플루오로퀴놀론 아세틸트랜스퍼라제, 플루오로퀴놀론-내성 DNA 토포이소머라제, 플루오로퀴놀론-내성 GyrA, GyrB, ParC, 퀴놀론 내성 단백질 (Qnr), FomA, FomB, FosC, FosA, FosB, FosX, VanA, VanB, VanD, VanR, VanS, 린코사미드 뉴클레오티딜트랜스퍼라제 (Lin), EreA, EreB, GimA, Mgt, Ole, 마크롤리드 포스포트랜스퍼라제 (MPH), MefA, MefE, Mel, 스트렙토트리신 아세틸트랜스퍼라제 (sat), Sul1, Sul2, Sul3, 술폰아미드-내성 FolP, 테트라사이클린 불활성화 효소 TetX, TetA, TetB, TetC, Tet30, Tet31, TetM, TetO, TetQ, Tet32, Tet36, MacAB-TolC, MsbA, MsrA,VgaB, EmrD, EmrAB-TolC, NorB, GepA, MepA, AdeABC, AcrD, MexAB-OprM, mtrCDE, EmrE, adeR, acrR, baeSR, mexR, phoPQ, mtrR, 또는 종합 항생제 내성 데이터베이스 (CARD https://card.mcmaster.ca/)에 기술된 임의의 항생제 내성 유전자를 표적화하여 불활성화시키는데 사용된다.
다른 구현예에서, CRISPR/Cas9 시스템은 박테리아 독소 유전자를 표적화하여 불활성화시키는데 사용된다. 박테리아 독소는 외독소 또는 내독소로 분류될 수 있다. 외독소는 생성되어서 능동적으로 분비되고, 내독소는 박테리아의 일부로 남아있는다. 박테리아 독소에 대한 반응은 중증 염증을 포함할 수 있어서, 패혈증을 초래할 수 있다. 이러한 독소는 예를 들어 보툴리늄 신경독소, 파상풍 독소, 스타필로코쿠스 독소, 디프테리아 독소, 탄저균 독소, 알파 독소, 백일해 독소, 시가 독소, 열-안정성 장독소 (이. 콜라이 ST), 콜리박틴, BFT (비. 프라질리스 (B. fragilis) 독소) 또는 Henkel 등 (Toxins from Bacteria in EXS. 2010 ; 100: 1-29)에 기술된 임의 독소일 수 있다.
염기 편집
염기 편집 (BE)은 DNA 또는 RNA 분자 상의 특별한 뉴클레오티드 염기쌍을 다른 것으로 치환하는 능력을 의미한다. 최근까지, 생체내에 DNA에서 특이적 치환을 수행하는 유일한 방법은 관심 유전자좌와, 특이적 염기쌍 변화를 보유하는, 주형 DNA의 재조합을 사용하는 것이었다. 염기 편집 기술은 완전하게 상이한 전략에 의존한다. DNA의 교환은 없고, 대신에 효소 반응은 뉴클레오티드를 다른 것으로 전환시켜서 dsDNA의 수준에서 불일치를 초래하고 이후 세포 기구에 의해 보정된다.
염기 편집에 대한 주요한 도전 중 하나는 표적 뉴클레오티드, 예를 들어 병원성에 관여되는 SNP로 뉴클레오티드 전환을 수행하는 효소의 활성을 제한하는 방법이다. 이러한 공간적 제한은 최근에 CRISPR-Cas 시스템을 용도 변경하여 달성되었다. 실제로, 오직 단일 가닥 DNA 상에서 활성인 염기 변형 효소에 촉매적으로 손상되거나 또는 불활성인 Cas 뉴클레아제를 융합하면, 고효율 염기 편집을 달성하는 것이 가능하다. 이것은 복합체가 RNA-DNA 염기 쌍형성에 의해서 이의 DNA 표적에 어닐링될 때 'R 루프'에서 국소 ssDNA 버블을 생성시키는 CRISPR-Cas 능력 덕분에 가능하다.
지금까지 설명된 7개 유형의 DNA 염기 편집자가 존재한다:
- C:G를 T:A로 전환시키는 시토신 염기 편집자 (CBE) (Komor, A et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533:420-4. (2016)).
- A:T를 G:C로 전환시키는 아데닌 염기 편집자 (ABE) (Programmable base editing of A·T to G·C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551(7681) 464-471 (2017)).
- C:G를 G:C로 전환시키는 시토신 구아닌 염기 편집자 (CGBE) (Chen, L et al. Precise and programmable C:G to G:C base editing in genomic DNA. Biorxiv (2020) ; Kurt, I et al. CRISPR C-to-G base editors for inducing targeted DNA transversions in human cells. Nature Biotechnology (2020)).
- C:G를 A:T로 전환시키는 시토신 아데닌 염기 편집자 (CABE) (Zhao, D et al. New base editors change C to A in bacteria and C to G in mammalian cells. Nature Biotechnology (2020)).
- A:T를 C:G로 전환시키는 아데닌 시토신 염기 편집자 (ACBE)  (Liu, D et al. A:T to C:G base editors and uses thereof. 국제 특허 출원 공개 번호 WO2020181180 (2020)).
- A:T를 T:A로 전환시키는 아데닌 티민 염기 편집자 (ATBE) (Liu, D et al. A:T to C:G base editors and uses thereof. 국제 특허 출원 공개 번호 WO2020181180 (2020)).
- T:A를 A:T로 전환시키는 티민 아데닌 염기 편집자 (TABE) (Liu, D et al. T:A TO A:T base editing through adenosine methylation. 국제 특허 출원 공개 번호 WO2020181193 (2020); Liu, D et al. T:A TO A:T base editing through thymine alkylation. 국제 특허 출원 공개 번호 WO2020181178 (2020); Liu, D et al. T:A TO A:T base editing through adenine excision. 국제 특허 출원 공개 번호 WO2020181195 (2020)).
염기 편집자는 염기 변형 효소가 상이하다. CBE는 하기 ssDNA 시티딘 데아미나제에 의존한다: APOBEC1, rAPOBEC1, APOBEC1 돌연변이체 또는 진화 형태 (evoAPOBEC1), 및 APOBEC 상동체 (APOBEC3A (eA3A), Anc689), 시티딘 데아미나제 1 (CDA1), evoCDA1, FERNY, evoFERNY. ABE는 직렬 융합체 TadA-TadA* (여기서, TadA*은 TadA의 진화 형태임)의 데옥시아데노신 데아미나제 활성, ssDNA 상에서 아데노신을 이노신으로 전환시킬 수 있는, 이. 콜라이 tRNA 아데노신 데아미나제 효소에 의존한다. TadA*은 TadA-8a-e 및 TadA-7.10을 포함한다.
염기 변형 효소를 제외하고, 편집 효율, 정밀성, 및 모듈성을 증가시키기 위해 염기 편집자에 구현되는 변형이 또한 존재하였다:
- 염기 편집을 복귀시키는 염기 절단 복구 기전을 방지하도록 하나 또는 2개 우라실 DNA 글리코실라제 억제제 도메인 (UGI)의 첨가;
- 세포에서 비-상동성 말단 연결 기전 (NHEJ)을 억제하여 삽입-결실 비율을 감소시키는 Mu-GAM의 첨가;
- 비-편집 가닥 상에 닉을 생성시켜서, 이의 복구 및 결과적으로 편집된 염기의 고정을 선호하는 닉카제 활성 Cas9 (nCas9 D10A)의 사용;
- 예를 들어 상이한 유기체, 상이한 PAM 모티프 또는 상이한 충실도를 갖는 돌연변이체 또는 상이한 패밀리 (예를 들어, Cas12a) 유래의 다양한 Cas 단백질의 사용.
DNA 기반 편집자 단백질의 비제한적인 예는 BE1, BE2, BE3, BE4, BE4-GAM, HF-BE3, 스나이퍼-BE3, 표적-AID, 표적-AID-NG, ABE, EE-BE3, YE1-BE3, YE2-BE3, YEE-BE3, BE-PLUS, SaBE3, SaBE4, SaBE4-GAM, Sa(KKH)-BE3, VQR-BE3, VRER-BE3, EQR-BE3, xBE3, Cas12a-BE, Ea3A-BE3, A3A-BE3, TAM, CRISPR-X, ABE7.9, ABE7.10, ABE7.10*, xABE, ABESa, VQR-ABE, VRER-ABE, Sa(KKH)-ABE, ABE8e, SpRY-ABE, SpRY-CBE, SpG-CBE4, SpG-ABE, SpRY-CBE4, SpCas9-NG-ABE, SpCas9-NG-CBE4, enAsBE1.1, enAsBE1.2, enAsBE1.3, enAsBE1.4, AsBE1.1, AsBE1.4, CRISPR-Abest, CRISPR-Cbest, eA3A-BE3, AncBE4를 포함한다. 
시토신 구아닌 염기 편집자 (CGBE)는 하기에 융합된 닉카제 CRISPR로 이루어진다:
- 시토신 데아미나제 (rAPOBEC) 및 염기 절단 복구 단백질 (예를 들어, rXRCC1) (Precise and programmable C:G to G:C base editing in genomic DNA. Biorxiv (2020)).
- 래트 APOBEC1 변이체 (R33A) 단백질 및 이. 콜라이-유래 우라실 DNA N-글리코실라제 (eUNG) (Kurt, I et al. CRISPR C-to-G base editors for inducing targeted DNA transversions in human cells. Nature Biotechnology (2020)).
- 시토신 아데닌 염기 편집자 (CABE)는 Cas9 닉카제, 시티딘 데아미나제 (예를 들어,ID), 및 우라실-DNA 글리코실라제 (Ung)로 이루어진다 (Zhao, D et al. New base editors change C to A in bacteria and C to G in mammalian cells. Nature Biotechnology (2020)).
- ACBE는 핵산 프로그램가능한 DNA-결합 단백질 및 아데닌 옥시다제를 포함한다 (Liu, D et al. A:T to C:G base editors and uses thereof. 국제 특허 출원 공개 번호 WO2020181180 (2020)).
- ATBE는 Cas9 닉카제 및 하나 이상의 아데노신 데아미나제 또는 옥시다제 도메인으로 이루어진다 (Liu, D et al. A:T to T:A base editing through adenine deamination and oxidation. 국제 특허 출원 공개 번호 WO2020181202 (2020)).
- TABE는 Cas9 닉카제 및 아데노신 메틸트랜스퍼라제, 티민 알킬트랜스퍼라제, 또는 아데노신 데아미나제 도메인으로 이루어진다 (Liu, D et al. T:A TO A:T base editing through adenosine methylation. 국제 특허 출원 공개 번호 WO2020181193 (2020); Liu, D et al. T:A TO A:T base editing through thymine alkylation. 국제 특허 출원 공개 번호 WO2020181178 (2020); Liu, D et al. T:A TO A:T base editing through adenine excision. 국제 특허 출원 공개 번호 WO2020181195 (2020)).
염기 편집자 분자는 또한 Cas 단백질에 융합된 상기 열거된 편집자 효소 (예를 들어, ABE 및 CBE의 조합) 중 둘 이상으로 이루어질 수 있다. 이들 생분자는 이중 염기 편집자로 명명되고 2개 상이한 염기를 편집할 수 있다 (Grunewald, J et al. A dual-deaminase CRISPR base editor enables concurrent adenine and cytosine editing, Nature Biotechnology (2020); Li, C et al. Targeted, random mutagenesis of plant genes with dual cytosine and adenine base editors, Nature Biotechnology (2020)).
일 구현예에서, 염기 편집자는 전사 또는 번역에 관여되는 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드를 편집하여서 유전자의 발현을 불활성화시키는데 사용된다. 보다 특히, 염기 편집자는 프로모터, RBS, 출발 코돈의 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드를 표적으로 한다.
일 구현예에서, 염기 편집자는 조기 중지 코돈을 도입시키는데 사용된다.
일 구현예에서, 염기 편집자는 하나 또는 몇 개 희귀 코돈을 도입시키는데 사용된다.
다른 구현예에서, 염기 편집자는 전사 또는 번역에 관여되는 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드를 편집하여 유전자의 발현을 조절하는데 사용된다. 보다 특히, 염기 편집자는 프로모터, RBS, 출발 코돈의 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드를 표적으로 하여, 유전자 발현의 증가 또는 감소를 야기한다.
다른 구현예에서, 염기 편집자는 유전자 또는 경로의 활성에서 불활성화, 감소 또는 증가를 야기하는 돌연변이를 복귀시키는데 사용된다.
다른 구현예에서, 염기 편집자는 병원성의 증가를 야기하는 돌연변이를 복귀시키는데 사용된다.
일 구현예에서, 염기 편집자는 이의 조절에 관여되는 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드 예컨대 오퍼레이터 서열, 전사 인자 결합 부위, 리보스위치, RNAse 인식 부위, 프로테아제 절단 부위, 메틸화 부위, 번역후 변형 부위 (인산화, 글리코실화, 아세틸화, 푸필화...)의 뉴클레오티드를 편집하여서 유전자의 조절을 변형시키는데 사용된다.
RNA 기반 편집
RNA 염기 편집은 DNA 염기 편집과 동일한 원리를 기반으로 한다: RNA 염기의 다른 것으로의 전환을 촉매하는 효소는 이의 전환을 국소적으로 수행하도록 표적 염기에 가까워져야만한다. 지금까지 RNA 편집에 사용되는 유일한 효소는 dsRNA 구조에서 아데노신을 이노신으로 전환시키는 ADAR 패밀리 유래 아데노신 데아미나제이다. 몇몇 중대한 연구들은 dsRNA에 대한 이러한 특이성을 사용하였고 국소 RNA 염기 편집을 프로그래밍하기 위해서 ADAR 데아미나제 도메인 (ADARDD)을 안티센스 올리고에 융합시켰다. 보다 최근에 RNA 분자에 결합하는 일부 CRISPR-Cas 시스템의 능력은 RNA 편집으로 용도 변경되었다. ADAR2 데아미나제 도메인의 과활성 돌연변이체 (REPAIRv1 경우 ADAR2DD-E488Q 및 REPAIRv2 경우 ADAR2DD-E488Q-T375G)에 융합된 촉매적으로 죽은 Cas13b 효소 (dPspCas13b)를 사용하여, Cox 등은 이전 RNA 편집 전략과 비교하여 특이성 및 효율을 개선시켰다.
RNA 기반 편집자 단백질의 비제한적인 예는 REPAIRv1, REPAIRv2를 포함한다. 
일 구현예에서, RNA 염기 편집자는 번역에 관여되는 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드를 편집하여 유전자의 발현을 불활성화시키는데 사용된다. 보다 특히, 염기 편집자는 5'UTR, RBS, 출발 코돈의 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드를 표적으로 한다.
일 구현예에서, RNA 염기 편집자는 조기 중지 코돈을 도입시키는데 사용된다.
일 구현예에서, RNA 염기 편집자는 하나 또는 몇 개 희귀 코돈을 도입시키는데 사용된다.
다른 구현예에서, RNA 염기 편집자는 번역에 관여되는 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드를 편집하여 유전자의 발현을 조절하는데 사용된다. 보다 특히, 염기 편집자는 5'UTR, RBS, 출발 코돈의 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드를 표적화하여서 유전자 발현의 증가 또는 감소를 야기시킨다.
다른 구현예에서, RNA 염기 편집자는 유전자 또는 경로의 활성에서 불활성화 또는 감소를 야기하는 돌연변이를 복귀시키는데 사용된다.
다른 구현예에서, 염기 편집자는 병원성의 증가를 야기하는 돌연변이를 복귀시키는데 사용된다.
프라임 편집
Anzalone 등 (Anzalone, A. V. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature 576, 149-157 (2019), 참조로 본 명세서에 편입됨)이 기술한 바와 같이, 프라임 편집자 (PE)는 프라임 편집 RNA (pegRNA; 역전사를 위한 주형 영역을 포함하는 가이드 RNA)와 조합하여 사용되는 역전사효소에 융합된 nCas9로 이루어진다.
프라임 편집은 삽입, 결실 (indels)의 도입 및 12 염기 대 염기 전환을 허용한다. 프라임 편집은 Cas 단백질에 의해 생성된 닉 부위에서 프라임 편집 가이드 RNA (pegRNA)가 가져온 RNA 서열을 DNA로 전환시키는, Cas 닉카제 변이체에 융합된, 역전사효소 (RT)의 능력에 의존한다. 이러한 과정으로 생성된 DNA 플립은 표적화된 DNA 서열에 포함되거나 또는 포함되지 않는다. 
프라임 편집 시스템은 하기를 포함한다;
- Cas 닉카제 변이체 예컨대 역전사효소 도메인 예컨대 M-MLV RT 또는 이의 돌연변이체 형태 (M-MLV RT(D200N), M-MLV RT(D200N/L603W), M-MLV RT(D200N/L603W/T330P/ T306K/W313F)에 융합된 Cas9-H840A;
- 프라임 편집 가이드 RNA (pegRNA).
편집을 선호하기 위해서, 프라임 편집 시스템은 본래 가닥이 아닌 편집된 가닥과 어닐링되도록 sgRNA를 디자인하여서 편집된 가닥 플랩의 해결 이후에만 비-편집 DNA 가닥에 대한 Cas 닉카제 활성을 표적화하는 추가 sgRNA의 발현을 포함할 수 있다.
프라임 편집 시스템의 비제한적인 예는 PE1, PE1-M1, PE1-M2, PE1-M3, PE1-M6, PE1-M15, PE1-M3inv, PE2, PE3, PE3b, CRISPEY (Cas9 Retron precISe Parallel Editing via homologY), sgRNA에 융합되고 적어도 역전사효소를 포함하는 레트론 단백질 및 Cas9와 함께 발현되는 레트론 RNA (Sharon, E. et al. Functional Genetic Variants Revealed by Massively Parallel Precise Genome Editing. Cell 175, 544-557.e16 (2018).), SCRIBE 전략: 단일 가닥 어닐링 단백질 (SSAPs)12로도 알려진, 단일 가닥 DNA의 재조합을 촉진하는 리콤비나제와 조합하여 발현되는 레트론 시스템을 포함한다. 이러한 리콤비나제는 파지 리콤비나제 예컨대 람다 레드, recET, Sak, Sak4, 및 Wannier 등 (Wannier, T. M. et al. Improved bacterial recombineering by parallelized protein discovery. Biorxiv 2020.01.14.906594 (2020) doi:10.1101/2020.01.14.906594.)이 기술한 새롭게 기술된 SSAP, Karberg 등 (Karberg, M. et al. Group II introns as controllable gene targeting vectors for genetic manipulation of bacteria. Nat Biotechnol 19, 1162-7 (2001)이 기술하고 많은 박테리아 종에 대해 적합화된 그룹 II 인트론 기반의 타겟트론 시스템, Simon 등 (Simon, A. J., Ellington, A. D. & Finkelstein, I. J. Retrons and their applications in genome engineering. Nucleic Acids Res 47, 11007-11019 (2019))이 기술한 바와 같은, 다른 레트론 기반 유전자 표적화 접근법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 프라임 편집 시스템은 전사 또는 번역에 관여되는 하나 또는 몇 개의 뉴클레오티드를 치환, 결실, 삽입시켜서 유전자의 발현을 불활성화시키는데 사용된다. 보다 특히, 프라임 편집 시스템은 프로모터, RBS, 코딩 서열에서 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드를 치환, 결실, 삽입시킨다.
일 구현예에서, 프라임 편집 시스템은 하나 또는 몇 개 조기 중지 코돈을 도입시키는데 사용된다.
일 구현예에서, 프라임 편집 시스템은 하나 또는 몇 개 희귀 코돈을 도입시키는데 사용된다.
일 구현예에서, 프라임 편집 시스템은 리딩 프레임에서 프레임시프트를 유도하는 뉴클레오티드를 도입, 결실시키는데 사용된다.
다른 구현예에서, 프라임 편집 시스템은 전사 또는 번역에 관여하는 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드를 치환, 결실, 삽입시켜서 유전자의 발현을 조절하는데 사용된다. 보다 특히, 프라임 편집 시스템은 프로모터, RBS, 출발 코돈에서 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드를 치환, 결실, 삽입시켜서, 유전자 발현의 증가 또는 감소를 야기시킨다.
다른 구현예에서, 프라임 편집 시스템은 유전자 또는 경로의 활성에서 불활성화 또는 감소를 야기하는 돌연변이를 복귀시키는데 사용된다.
다른 구현예에서, 프라임 편집 시스템은 병원성의 증가를 야기하는 돌연변이를 복귀시키는데 사용된다.
본 발명은 하기 구현예를 포괄한다:
1. 재조합 씨. 아크네스 파지.
2. 구현예 1의 재조합 씨. 아크네스 파지에 있어서, 적어도 하나의 이식유전자를 포함한다.
3. 구현예 2의 재조합 씨. 아크네스 파지에 있어서, 상기 이식유전자는 CRISPR-Cas 시스템 또는 CRISPR-Cas 시스템의 일부이다.
4. 구현예 1의 재조합 씨. 아크네스 파지에 있어서, 숙주 범위는 상응하는 야생형 씨. 아크네스 파지의 숙주 범위와 상이하다.
5. 구현예 1의 재조합 씨. 아크네스 파지에 있어서, 조작된 캡시드를 포함한다.
6. 구현예 5의 재조합 씨. 아크네스 파지에 있어서, 항원은 조작된 캡시드의 표면 상에 표시된다.
7. 재조합 DNA 벡터를 보유하는 씨. 아크네스 세포로서,
- 씨. 아크네스 파지 게놈과 상동성 재조합을 위한 DNA 주형
- 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원; 및
- 임의로 씨. 아크네스에서 DNA 벡터의 선택을 허용하는 제1 선택 마커를 포함한다.
8. 구현예 7의 씨. 아크네스 세포에 있어서, 씨. 아크네스 파지 게놈은 상기 세포에 도입된다.
9. 구현예 7의 씨. 아크네스 세포에 있어서, 씨. 아크네스 파지 게놈은 DNA 벡터와 재조합되어서 재조합 파지의 생산을 일으킨다.
10. 하기를 포함하는 재조합 씨. 아크네스 파지의 선택적 생산을 위한 DNA 벡터를 보유하는 씨. 아크네스 세포:
- 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원;
- 상기 씨. 아크네스에서 발현되지만 새롭게 생성된 재조합 씨. 아크네스 파지 게놈을 표적화하지 않는 CRISPR-Cas 시스템; 및
- 임의로 씨. 아크네스에서 DNA 벡터의 선택을 허용하는 제1 선택 마커.
11. 야생형 또는 부모 씨. 아크네스 파지 및 재조합 씨. 아크네스 파지를 함유하는 파지 용해물을 제조하기 위한 방법으로서, 야생형 또는 부모 씨. 아크네스 파지 게놈은 구현예 7의 씨. 아크네스 세포에 도입된다.
12. 재조합 씨. 아크네스 파지를 선택하기 위한 방법으로서, 야생형 또는 부모 씨. 아크네스 파지 및 재조합 씨. 아크네스 파지를 함유하는 파지 용해물은 구현예 10의 씨. 아크네스 세포와 혼합되어서, 재조합 씨. 아크네스 파지의 선택적 생산을 일으킨다.
13. 씨. 아크네스 관련 장애 또는 질환을 치료하기 위한 방법으로서, 대상체에게 구현예 1-6 중 어느 하나의 재조합 씨. 아크네스 파지 또는 구현예 11-12의 방법으로 수득된 재조합 씨. 아크네스 파지를 투여하는 단계를 포함한다.
14. 재조합 DNA 벡터로서,
- 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원;
- 임의로 씨. 아크네스에서 DNA 벡터의 선택을 허용하는 제1 선택 마커; 및
- 관심 유전자
를 포함하는 것인 재조합 DNA 벡터.
15. 구현예 14의 DNA 벡터에 있어서, 씨. 아크네스와 접합을 허용하는 oriT; 도너 박테리아에서 복제를 허용하는 복제 기원; 및 도너 박테리아에서 선택을 허용하는 제2 선택 마커를 더 포함한다.
16. 구현예 14 또는 15의 DNA 벡터에 있어서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 R6K (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 42)이다.
17. 구현예 14 또는 15의 DNA 벡터에 있어서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 RK2 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 43)이다.
18. 구현예 14 또는 15의 DNA 벡터에 있어서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pBBR1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 44)이다.
19. 구현예 14 또는 15의 DNA 벡터에 있어서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pRO1600 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 45)이다.
20. 구현예 14 또는 15의 DNA 벡터에 있어서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 RSF1010 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 46)이다.
21. 구현예 14 또는 15의 DNA 벡터에 있어서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pAMβ1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 47)이다.
22. 구현예 14 또는 15의 DNA 벡터에 있어서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pLME106 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 48)이다.
23. 구현예 14 또는 15의 DNA 벡터에 있어서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pTZC1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 49)이다.
24. 구현예 14 또는 15의 DNA 벡터에 있어서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pBC1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 50)이다.
25. 구현예 14 또는 15의 DNA 벡터에 있어서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pEP2 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 51)이다.
26. 구현예 14 또는 15의 DNA 벡터에 있어서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pWVO1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 52)이다.
27. 구현예 14 또는 15의 DNA 벡터에 있어서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pAP1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 53)이다.
28. 구현예 14 또는 15의 DNA 벡터에 있어서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pWKS1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 54)이다.
29. 구현예 14 또는 15의 DNA 벡터에 있어서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pLME108 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 55)이다.
30. 구현예 14 또는 15의 DNA 벡터에 있어서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pLS1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 56)이다.
31. 구현예 14 또는 15의 DNA 벡터에 있어서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pUB6060 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 57)이다.
32. 구현예 14 또는 15의 DNA 벡터에 있어서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 p545 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 58)이다.
33. 구현예 14 또는 15의 DNA 벡터에 있어서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pJD4 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 59)이다.
34. 구현예 14 또는 15의 DNA 벡터에 있어서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pIJ101 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 60)이다.
35. 구현예 14 또는 15의 DNA 벡터에 있어서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pSN22 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 61)이다.
36. 구현예 14 또는 15의 DNA 벡터에 있어서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pGP01 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 62)이다.
37. 구현예 14 또는 15의 DNA 벡터에 있어서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pIP501 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 63)이다.
38. 구현예 14 또는 15의 DNA 벡터에 있어서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pCU1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 64)이다.
39. 구현예 14 또는 15의 DNA 벡터에 있어서, 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원은 pBAV1K-T5 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 65)이다.
40. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_pMRC01 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 1)이다.
41. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_RSF1010 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 2)이다.
42. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_pRS01 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 3)이다.
43. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_pMV158 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 4)이다.
44. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_pTF1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 5)이다.
45. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_pSC101 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 6)이다.
46. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_pBTK445 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 7)이다.
47. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_pBBR1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 8)이다.
48. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_R721 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 9)이다.
49. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_pRmeGR4a (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 10)이다.
50. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_ColE1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 11)이다.
51. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_pTiC58 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 12)이다.
52. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_pMdT1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 13)이다.
53. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_R1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 14)이다.
54. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_Tn5520 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 15)이다.
55. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_QKH54 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 16)이다.
56. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_R64 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 17)이다.
57. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_R751 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 18)이다.
58. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_RP4 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 19)이다.
59. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_pKL1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 20)이다.
60. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_RK2 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 21)이다.
61. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_R1162 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 22)이다.
62. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_Tn4555 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 23)이다.
63. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_pHT (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 24)이다.
64. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_Tn4399 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 25)이다.
65. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_Tn916 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 26)이다.
66. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_pST12 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 27)이다.
67. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_pCU1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 28)이다.
68. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_pSU233 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 29)이다.
69. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_F (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 30)이다.
70. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_pMAB01 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 31)이다.
71. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_R388 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 32)이다.
72. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_pS7a (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 33)이다.
73. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_pS7b (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 34)이다.
74. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_R702 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 35)이다.
75. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_pMUR274 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 36)이다.
76. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_R100 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 37)이다.
77. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_pVCR94deltaX (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 38)이다.
78. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_R46 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 39)이다.
79. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_pGO1 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 40)이다.
80. 구현예 15 내지 39 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서, oriT는 oriT_pIP501 (전형적으로 서열 SEQ ID NO: 41)이다.
81. 구현예 14 내지 80 중 어느 하나의 DNA 벡터에 있어서,
- 렐락사제 유전자;
- 피전달접합체 씨. 아크네스에서 선택을 허용하는 선택 마커; 및
- 도너 박테리아에서 선택을 허용하는 선택 마커로서, 도너 박테리아는 접합성 기구를 발현하는, 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존, 또는 통합성 및 접합성 구성요소 (ICE)를 보유하는 이. 콜라이 균주인 것인 선택 마커
를 더 포함한다.
82. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE pMRC01을 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
83. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE RSF1010을 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
84. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE pRS01을 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
85. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE pMV158을 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
86. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE pTF1을 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
87. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE pSC101을 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
88. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE pBTK445를 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
89. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE pBBR1을 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
90. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE R721을 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
91. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE pRmeGR4a를 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
92. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE ColE1을 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
93. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE pTiC58을 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
94. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE pMdT1을 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
95. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE R1을 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
96. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE Tn5520을 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
97. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE QKH54를 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
98. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE R64를 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
99. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE R751을 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
100. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE RP4를 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
101. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE pKL1을 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
102. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE RK2를 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
103. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE R1162를 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
104. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE Tn4555를 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
105. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE pHT를 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
106. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE Tn4399를 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
107. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE Tn916을 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
108. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE pST12를 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
109. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE pCU1을 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
110. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE pSU233을 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
111. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE F를 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
112. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE pMAB01을 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
113. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE R388을 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
114. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE pS7a를 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
115. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE pS7b를 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
116. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE R702를 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
117. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE pMUR274를 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
118. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE R100을 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
119. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE pVCR94deltaX를 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
120. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE R46을 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
121. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE pGO1을 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
122. 구현예 81의 DNA 벡터에 있어서, 도너 박테리아는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존 또는 ICE pIP501을 보유하는 이. 콜라이 균주이다.
123. 구현예 14 내지 122 중 어느 하나의 임의의 DNA 벡터를 포함하는 조작된 씨. 아크네스.
124. 씨. 아크네스를 구현예 14 내지 122 중 어느 하나의 임의의 벡터와 접촉시켜서 생산된 조작된 씨. 아크네스.
125. 씨. 아크네스에 구현예 14 내지 122 중 어느 하나의 DNA 벡터를 도입시키는 단계를 포함하는 씨. 아크네스를 조작하기 위한 방법.
실시예
실시예 1. 씨. 아크네스로 DNA 페이로드의 전달을 위한 파지-유래 입자
합성 DNA 페이로드를 함유하고 이것을 씨. 아크네스 내부로 주입할 수 있는 씨. 아크네스 파지-유래 입자를 개발하였다. 이식유전자 발현을 허용하는 재조합 DNA 벡터의 안정하고 자율적인 복제를 최초로 입증한다. 이들 파지-유래 입자는 씨. 아크네스 생산자 세포 내부에서 씨. 아크네스 파지 게놈 및 DNA 페이로드의 동시-발생 시 생산된다. DNA 페이로드는 씨. 아크네스 생산자 세포로 상이한 방법 예컨대 전기천공, 원형질체의 전기천공, 접합, 화학적 형질전환, 형질도입에 의해서 씨. 아크네스 생산자 세포에 도입된다. 이러한 파지-유래 입자는 높은 효율 및 특이성으로 원위치에서 모든 씨. 아크네스 균주에 치료적 분자를 코딩하는 DNA를 전달할 가능성을 열어주어서, 예를 들어, 면역조절자의 분비를 통해 면역계의 조절 또는 CRISPR-CaS 발현으로 인한 서열 특이적 사멸을 허용한다.
면역계를 조절하거나 또는 상처 치유를 개선시키기 위해 털피지샘 단위로 그들 특권 위치를 활용하거나 또는 질환 예컨대 심상성 좌창을 예방 또는 치유하기 위해 특별한 프로염증성 균주를 제거하여 큐티박테리움 아크네스 개체군을 편집할 수 있는 것은 매력적인 치료적 접근법이다. 이러한 접근법을 구현하기 위해서, 원위치에서 씨. 아크네스 균주를 유전자 변형시킬 수 있거나 또는 시험관내에서 유전자 변형된 씨. 아크네스를 제공할 수 있다. 종 및 균주 수준 둘 모두에서 거대한 개체내 및 개체간 마이크로바이옴 다양성 때문에, 대부분의 환자의 피부에 집락화할 수 있는 조작된 단일 씨. 아크네스 균주 또는 이의 칵테일을 제공하는 것이 어려워 보인다.
씨. 아크네스 개체군에게 원위치에서 DNA의 전달은 국소 마이크로바이옴을 방해하지 않고 잠재적으로 사전-확립된 균주를 활용할 수 있도록 허용하여서 이러한 어려움을 피하는 방법을 제공한다. 그러나, 씨. 아크네스로 유전 물질의 원위치 전달은 몇몇 이유때문에 도전적인 작업이다. 첫째로, 씨. 아크네스 내부에서 강건하게 자율적으로 복제할 수 있는 유전적 구성요소, 예컨대 플라스미드가 아직까지 존재하지 않는다. 소수의 설명된 유전자 변형은 상동성 재조합을 통한 합성 DNA의 게놈 삽입으로 이루어진다26. 이러한 시험관내 과정은 효율이 매우 낮은 것으로 확인되었고 이러한 사건을 선택하기 위한 항생제 선택 마커의 사용에 의존한다. 게다가, 이들 유전자 변형은 몇가지 특별한 균주 (KPA17202)로 제한되었고 모든 씨. 아크네스 균주에 대해 일반화될 수 없다. 둘째로, 씨. 아크네스의 원위치 유전자 변형을 수행하기 위해서, DNA의 전달이 필요하다. 씨. 아크네스로 DNA를 도입하기 위한 유일하게 기술된 방법은 전기천공의 사용이고26,27, 오직 시험관내에서만 수행할 수 있는 방법이다.
본 발명은 원위치에 씨. 아크네스 개체군 내부에서 합성 DNA의 전달 및 유지를 해결한다. 파지 게놈을 희생시켜서 파지 캡시드 내부에 패키징된 합성 DNA 벡터/페이로드로 구성된 파지-유래 입자가 사용된다. 파지-캡시드를 강탈하여서, 박테리아 숙주로 DNA를 형질도입시키는 파지의 능력을 이용하였다. 이들 파지-유래 입자는, 파지의 천연 박테리아 숙주의 존재 하에 있을 때, 박테리아에 결합하여서, DNA 벡터/페이로드를 박테리아 세포질 내부에 주입시킬 수 있고 거기서 복제되어 관심 단백질의 발현을 야기할 수 있다.
씨. 아크네스 파지는 피부에 천연적으로 존재하고 거기서 그들은 숙주로서 씨. 아크네스를 사용하여 감염 및 복제된다. 씨. 아크네스 파지는 광범위 숙주 범위를 갖는데, 그들이 지금까지 단리된 대부분의 씨. 아크네스 균주 다양성을 감염시킬 수 있다는 것을 의미한다. 이것은 이들 파지의 캡시드를 그들 유전적 다양성과 무관하게 모든 씨. 아크네스 균주로 원위치 DNA 전달하기 위한 매우 효율적인 비히클로 만든다. 씨. 아크네스 파지로부터 파지-유래 입자를 개발하기 위해서, 지원자 개체의 피부로부터 몇몇 파지가 먼저 제조사 설명서에 따라서, Biore Deep Cleansing Pore Strips (Kao Brands Company)을 사용해 코 미세면포를 샘플채취하여 단리되었다. 코로부터 제거한 후에, 미세면포를 수집하였고, 멸균수에 균질화시키고 RCM 한천 플레이트 상에 도말하였다. 혐기성 조건 하에 37℃에서 7일 동안 인큐베이션 후에, 씨. 아크네스 성장층에서 플라크를 관찰할 수 있었다. 플라크를 단리하였고 파지를 지시자 균주에서 증폭시켰다. 파지 DNA는 Promega wizard DNA clean-up 시스템을 사용해 추출하였고 기계적 무작위 단편화를 통해 라이브러리 제조를 위해 보내서 Illumina MiSeq 플랫폼으로 시퀀싱하였다. 시퀀싱 판독값은 Spades를 사용해 조립하였다. 이전 공개물로부터 예상한 바와 같이, 단리된 파지는 다른 시퀀싱된 파지와 유전적으로 유사하였다.
숙주-범위 결정은 기지의 계통발생적 다양성을 포함하는, 씨. 아크네스 균주의 컬렉션에 대해 상이한 단리된 파지를 사용해 수행하였다. 모든 파지는 대부분의 씨. 아크네스 균주를 감염시킬 수 있어서, 이전에 보고된 바와 같이, 광범위한 숙주-범위를 보여주었다 (도 2). PAC7 파지는 추가 실험에 선택되었다.
파지 PAC7의 게놈을 정제하였고, 기계적으로 전단하여서, 무작위 DNA 단편화되게 하였고 무-PCR 라이브러리 준비는 illumina Mi-seq를 사용해 쌍형성-말단 시퀀싱 이전에 수행하였다. DNA 판독값은 Spades를 사용해 조립하였고, 단일 contig를 수득하고 주석을 달았다. 주석을 단 이후에, 응집-말단을 확인하였고 응집-말단을 함유하는, 상이한 크기의 DNA 단편은 소형 터미나제에 의한 인식 및 파지 캡시드에 파지 게놈의 패키징을 허용하는 패키징 서열 (응집 말단을 갖는 파지 경우 cos 부위라고 함)을 확인하기 위해 클로닝하였다. PAC7 유래의 잠재적 패키징 신호는 2개의 상이한 배향으로 pIC086 벡터에 클로닝되었다. pIC086 벡터는 하기를 함유한다:
- 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원, 및
- 씨. 아크네스에서 기능성인 선택 마커 (여기서 에리쓰로마이신에 대한 내성을 제공함).
Cos 함유 벡터 (코스미드)는 서열 검증된, 이. 콜라이 DH10B 클로닝 균주에 클로닝되었다. DNA 벡터 (표 1)는 씨. 아크네스 균주 ATCC 11828에 도입되었고, 재조합체는 에리쓰로마이신 존재의 한천 플레이트 상에서 선택되었다.
파지-유래 입자를 생산하기 위해서, DNA 벡터를 보유하는 상이한 씨. 아크네스 균주의 액체 배양물 (표 2)을 성장시켰고 PAC7을 감염시켰다. cos PAC7 (Ca0s16973)이 없는 플라스미드를 함유하는 균주가 대조군으로서 사용되었다. 감염 후에, 상청액을 여과하였고 수집하였다. 파지 게놈 및 DNA 벡터 둘 모두는 패키징 신호를 함유하기 때문에, 그들은 캡시드로 패키징에 대해 경쟁하여서, 파지/파지-유래 입자 혼합물을 생성시킨다.
현탁물 중 다수 파지 및 파지-유래 입자를 정량하기 위해서, 파지 및 파지-유래 입자 적정을 수행하였다. 파지-유래 입자의 적정은 먼저 씨. 아크네스 ATCC 6919를 사용해 수행하여서, 파지 감염으로 인한 높은 효율의 사멸을 보여주었지만, 형질도입체를 관찰할 수 없었다. 이들 조건에서, 형질도입체는 파지와 공-감염되어서, 형질도입된 세포의 사멸 및 파지-유래 입자 역가의 과소평가를 야기하였다. 이를 피하기 위해서, 씨. 아크네스 ATCC 11828 위용원성 균주를 사용한 적정을 수행하기로 결정하였다. 실제로, 씨. 아크네스 파지는 실험실 조건에서 엄격하게 잠재성 또는 엄격하게 용원성 파지가 아니다. 그들은 그들 게놈을 세포에 주입할 수 있고 게놈에 통합되지 않고 세포에서 휴면 상태로 머무를 수 있다. 위용원성 상태로 파지를 보유하는 이들 세포는 파지 사멸에 면역성이다. 파지/파지-유래 입자 적정을 위한 위용원성 배양을 사용하여, 더 높은 양의 형질도입체가 관찰되었다. 그러나 파지에 의한 씨. 아크네스의 일부 잔여 사멸로 인해서, 동일한 생산자 세포의 감염으로부터의 상이한 생산에서 파지-유래 입자 역가의 큰 가변성이 관찰될 수 있다 (도 8). 파지의 농도는 플라크 어세이를 통해 결정하였고, 각 현탁물에 대해서 대략 107 PFU/μL의 역가로 모든 파지/파지-유래 입자 현탁물에 대해 높은 농도의 파지를 보여주었다 (표 3). 몇몇 콜로니는 PCR을 통해서 코스미드를 보유하는 씨. 아크네스인 것으로 확인되었다. cos 없는 pIC086 플라스미드를 보유하는 Ca0s16973의 감염으로부터의 파지 현탁물은 임의의 형질도입체를 보이지 않아서, 패키징, 및 따라서, 파지미드 입자의 생산이 cos 보유 플라스미드에 특이적이었음이 확인되었다.
상이한 크기의 파지 패키징 신호를 포함하는 DNA 벡터를 보유하는 파지-유래 입자의 적정은 형질도입체 수의 유의한 편차를 보이지 않는다 (도 8). 파지-유래 입자 역가는 모든 상이한 코스미드 간에 유사하여서 그들이 모두 기능성이고 파지-유래 입자를 생산하도록 파지 캡시드 내부에 DNA 벡터의 패키징을 허용한다는 것을 의미한다.
결과는 최초로, 다음을 보여준다:
- 씨. 아크네스에서 합성 DNA 벡터의 파지-유래 입자에 의한 형질도입,
- 씨. 아크네스에서 DNA 벡터의 복제,
- 복제성 DNA 벡터에 의해 보유되는 이식유전자 (에리쓰로마이신 내성 유전자)의 발현.
이것은 씨. 아크네스에서 원위치 DNA 전달, 유전자 변형 및 이식유전자 발현의 개발을 위한 중요한 획기적인 사건이다
재료 및 방법:
코스미드 구축: Cos 단편은 희석된 파지 PAC7 현탁물에 대한 PCR을 통해 추출하였고, 겔 정제하고, SapI 골든 게이트 반응 및 pIC086 벡터를 사용해 클로닝하였다.
씨. 아크네스에 코스미드의 도입은 접합, 자연 능력, 형질도입을 사용하여, 예컨대 전기천공, 원형질체 전기천공, 화학적 형질전환같은 방법을 통해 수행할 수 있다.
씨. 아크네스 접합: LB 액체배지 (Fisher Scientific)에서 성장된, 상이한 가동성 셔틀 플라스미드를 보유하는 이. 콜라이 도너의 2 mL 밤샘 배양물을 벤치탑에서 6,000 x g로 1분 동안 원심분리하여 펠렛화하였다. 상청액을 버렸고 펠렛은 500 μL의 사전 멸균된 LB 배지로 세척하였으며, 동일한 조건을 사용해 다시 원심분리하였다. 각 펠렛은 10X (BHI broth, Oxoid)로 농축된 200 μL의 대수기 성장된 (OD600 = 0.5) 씨. 아크네스 수용체 BHI 배양물에 재현탁하였다. 이. 콜라이 - 씨. 아크네스 혼합물을 브루셀라 한천 플레이트 (Sigma-Aldrich) 상에 점적 (50 μL/반점)하였고 24시간 동안 혐기성 조건 하에 37℃에서 교접하도록 허용하였다. 그 시간 이후에, 세포는 교접 플레이트로부터 수확하였고, 300 μL의 BHI 액체 배지에 재현탁하였고, 50 μg/mL 폴리믹신 B (Sigma-Aldrich) 및 5 μg/mL 에리쓰로마이신 (Sigma-Aldrich) 또는 5 μg/mL 클로람페니콜 (Sigma-Aldrich)이 보충된 브루셀라 한천 플레이트에 도말하였다. 7일 후에, 선택 존재 하에서 성장된 씨. 아크네스 세포를 적절한 선택이 보충된 브루셀라 한천 플레이트 상에 스트리킹하였고 접합된 플라스미드의 존재는 특이적 PCR을 통해 확인하였다. 씨. 아크네스의 정체를 비롯하여 이. 콜라이 도너 균주의 부재도 역시 PCR 분석으로 확인하였다.
파지/파지-유래 입자 생산: 상이한 벡터를 보유하는 씨. 아크네스 ATCC 11828의 밤샘 배양물 (구성체 당 2개 클론)은 5 μg/mL 에리쓰로마이신이 보충된 10 mL BHI 배양물로 설정되었다. 파지미드 pIC328로부터의 생산은 양성 대조군으로서 사용하였다. 밤샘 배양 이후에, OD600가 0.8-1에 도달하면, 15 mL의 각 배양물을 채취하였고 3,000 x g로 5분 동안 스핀 다운시켰다. 상청액을 버리고 펠렛은 200 μL의 PAC7 파지 현탁물에 재현탁하였고 30분 동안 실온에 벤치에 방치하여서 파지가 세포를 감염시킨다. 1시간 후에, 15 mL의 BHI 배지를 각 배양물에 첨가하였고 혐기성 조건 하에 37℃에서 밤새 성장/감염되도록 허용하였다. 밤샘 인큐베이션 이후에, 배양물은 매우 맑아서, 감염이 일어났다는 것을 의미하였다. 배양물은 3,000 x g로 5분 동안 스핀다운하였고, 상청액을 0.45 μm 필터를 통해 여과하였다.
파지 적정: 파지/패키징된 파지미드 혼합물의 연속 희석물은 MgSO4 5 mM 중에 만들었고 4 μL의 각 희석물을 균주 ATCC 11828 및 아가로스 4.5 g/L의 상층을 함유하는 브루셀라 플레이트 상에 점적하였다. 혐기성 조건 하에 37℃에서 밤샘 인큐베이션 이후에, 용해 플라스크를 계측하였다.
파지-유래 입자 적정: 씨. 아크네스 ATCC 11828 위용원성 세포의 90 μL의 밤샘 배양물 (OD600 approx 0.8-1, x10 농축)을 미희석 내지 10-4 희석물 (MgSO4 5 mM에 희석)로부터의 10 μL의 파지/파지-유래 입자와 혼합하였다. 파지가 없는 세포 대조군을 어세이에 포함시켰다. 배양물은 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이러한 제1 인큐베이션 기간 이후에, 배양물 (박테리아 + 상이한 희석물의 파지/파지-유래 입자)은 BHI 중에 최대 10-7 까지 연속 희석하였고 3 내지 4시간 동안 혐기성 조건 하에 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 이후에, 4 μL의 각 희석물을 에리쓰로마이신 (5 μg/mL)의 존재 및 부재 하에서 브루셀라 플레이트 상에 점적하였다. 37℃에 혐기성 조건 하에서 5일 인큐베이션 후에, BHI 플레이트 및 BHI + 에리쓰로마이신 5 μg/mL 플레이트 상의 콜로니를 스캐닝하였다 (도 8).
위용원성 생산: 균주는 형질도입 시험 전에 신선하게 만들었다. PAC7 파지를 씨. 아크네스 ATCC 11828 세포의 현탁물에 첨가하였고 BHI 한천 플레이트 상에 도말하였다. 3 내지 4일의 인큐베이션 이후에, 플레이트에서 성장한 세포를 회수하였고 더 많은 세포를 갖도록 다시 도말하거나 또는 적정에 사용하였다. 플레이트에서 연속적인 성장이 필요하면, 씨. 아크네스 파지는 위용원성 상태로 균주를 유지하기 위해서 배양물에 첨가된다.
씨. 아크네스 세포로 파지미드 형질도입의 확인: 에리쓰로마이신이 보충된 BHI 플레이트 상에서 관찰된 콜로니는 BHI + 에리쓰로마이신 플레이트에서 재단리하였다. 스트리킹 이후에 수득된 개별 에리쓰로마이신 내성 콜로니는 이후 PCR로 시험하여서 파지미드의 존재를 확인하였다 (도 3).
형질도입체의 PCR 검증: 파지미드의 존재를 검토하기 위한 콜로니 PCR은 프라이머 IC208/IC310을 사용해 수행하였다. 프라이머 AD1261/AD1262를 사용해 수행된 PCR을 또한 포함시켜서 씨. 아크네스 정체를 확인하였다.
실시예 2. CRISPR-Cas 시스템을 사용한 씨. 아크네스의 조작 및 선택
단일 뉴클레오티드 변형 (SNM)은 2개 상이한 전략을 통해 CRISPR을 사용해 씨. 아크네스 파지 PAC7의 다양한 유전자좌에서 수행되었다. 첫번째 전략에서, 편집 주형 및 미변형 (미조작 또는 wt 파지)을 표적화하는 CRISPR 시스템 둘 모두를 함유하는 단일 벡터는 WT과 비교하여 재조합 파지를 생성시키고 선택적으로 증폭하도록 허용한다. 그러나, 돌연변이체 파지의 단리 단계가 필요하다. 두번째 전략에서, 편집 주형을 보유하는 하나, 및 wt 파지를 표적화하는 CRISPR 시스템을 보유하는 하나의 2개 벡터가 돌연변이체 파지를 수득하고 선택하는데 필요하다. 이 문헌에서, 양쪽 실시예가 포함되고 개별적으로 설명된다:
단일 벡터 전략:
DNA 서열 및 연관된 주석을 사용하여서, 추정 엔도리신 유전자 (SEQ ID NO: 77) 및 cos 서열 (SEQ ID NO: 66)을 확인하였고, 이러한 유전자좌에서 SNM을 시도하고자 결정하였다. 엔도리신 유전자좌의 경우에, 단일 염기 변화는 번역 후에 소위 동의 돌연변이라고 하는, 본래 또는 wt 서열과 동일한 단백질을 야기한다. 양쪽 경우에서, 편집 주형은 제2 상동성 재조합 사건 이후에, 파지 게놈의 의도하는 변형을 일으키고, 이중 가닥 파괴를 수행하기 위해 CRISPR 시스템에 필요한 PAM 서열은 제거되도록 디자인되었다. 이러한 시나리오에서, 돌연변이체 파지가 아닌, 오직 미변형된 파지만이 CRISPR 시스템에 의해 표적화되어서, 돌연변이체-wt 구별에 필요한 선택을 제공한다.
pIC104로 명명된 CRISPR 벡터는 PAC7을 조작하는데 필요한 구성요소를 더 도입시키기 위해 선택되었다. pIC104 는 이. 콜라이 - 씨. 아크네스 셔틀 플라스미드이고, 하기를 포함한다:
. 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원
. 씨. 아크네스에서 기능성인 선택 마커 (여기서 에리쓰로마이신에 대한 내성을 제공함)
. 씨. 아크네스에 DNA 페이로드를 접합시키기 위한 렐락사제 및 연관된 전달 기원 (oirT)
. 이. 콜라이에서 복제를 허용하는 기원 및 선택 마커
. 씨. 아크네스 발현을 위해 사전 코돈-최적화된, SpCas9를 코딩하는 유전자, 및 sgRNA를 포함한, CRISPR 표적화에 필요한 구성요소.
pIC104로 표적/씨드 서열의 도입은 벡터 pIC238 및 pIC240를 야기하였는데, 이 경우에 엔도리신 (SEQ ID NO: 79) 및 cos 부위 (SEQ ID NO: 80)가 각각 표적화된다. pIC238 및 pIC240로 편집 주형 (엔도리신 경우 SEQ ID NO: 81, cos 경우 SEQ ID NO: 82)의 도입은 각각 벡터 pIC253 및 pIC257을 생성시켰다. 벡터 (편집/표적화 벡터)는 이. 콜라이 DH10B 클로닝 균주에 클로닝되었고, 서열을 검증하고, 접합 기구를 보유하는 이. 콜라이 도너 균주로 형질전환되었다. 이들 벡터는 최종적으로 씨. 아크네스 균주 ATCC 11828에 접합되었고 형질전환체는 에리쓰로마이신이 보충된 한천 플레이트 상에서 선택되었다. 하기 균주들이 생성되었다: Ca0s18233 (pIC238을 보유하는 씨. 아크네스 ATCC 11828); Ca0s240 (pIC240을 보유하는 씨. 아크네스 ATCC 11828); Ca0s18206 (pIC253을 보유하는 씨. 아크네스 ATCC 11828); 및 Ca0s18208 (pIC257을 보유하는 씨. 아크네스 ATCC 11828).
조작된 파지를 생산하기 위해서, DNA 벡터 pIC253 (Ca0s18206) 또는 pIC257 (Ca0s18208)을 보유하는 상이한 씨. 아크네스 균주의 액체 배양물을 성장시켰고 파지 PAC7로 감염시켰다. 감염 이후에, 상청액을 여과하였고 수집하였다. 여기서 파지 PAC7로 감염 후 각각 균주 Ca0s18206 및 Ca0s18208로부터 수득된 이들 상청액을 Sup-253 및 Sup-257이라고 한다. 이론적으로, 미변형된 파지는 CRISPR 시스템에 의해 표적화되었고, 상청액은 높은 분율의 조작된 파지를 함유하고, wt 파지 표적화 효율은 CRISPR 시스템의 효율 및 사용된 씨드 서열에 의존적이다.
현탁물 중 돌연변이체 및 wt 파지의 존재를 결정하고 정량하기 위해서, 파지 적정을 수행하였다. 적정은 pIC238 (Ca0s18233) 및 pIC240 (Ca0s18234)을 보유하는 씨. 아크네스 ATCC 11828 및 씨. 아크네스 ATCC 11828에서 수행되었는데, 이 파지 경우에 각각 엔도리신 또는 cos 유전자좌에서 변형되었다 (도 9 및 도 10). 상기 언급한 바와 같이, 이들 벡터는 각 유전자좌에 대해 의도된 변형에 대해 선택된 CRISPR 시스템을 함유한다. 돌연변이체 파지가 수득되고 복제되었으면, 표적화 벡터를 보유하는 씨. 아크네스 ATCC 11828에 대해 적정했을 때 재조합 파지에 상응하는 플라크가 관찰되어야 한다. cos 유전자좌에 대한 표적화 벡터를 보유하는 균주에서 엔도리신 유전자좌에 대한 편집 주형을 함유하는 균주의 감염 후 수득된 상청액의 적정 - 및 그 반대-은 이 실험에서 대조군으로서 제공된다 (이러한 상청엑에서 수득된 임의 파지는 wt 파지가 표적화되는 것과 동일한 방식으로 wt cos 유전자좌를 표적화하는 벡터를 보유하는 씨. 아크네스에 의해 표적화되어야 함).
씨. 아크네스 ATCC 11828에 대한 상청액의 적정 후 수득된 개별 플라크는 각각 Sup-253 및 Sup-257의 경우에 프라이머 IC443/IC444 및 IC446/AD1289를 사용한 PCR을 통해서 스크리닝되었고, 파지 돌연변이체의 정체는 게놈 시퀀싱을 통해서 확인되었다. 이전에 단리 및 시퀀싱된 플라크로 씨. 아크네스 ATCC 11828의 재-감염 후 수득된 단리된 플라크의 시퀀싱 결과는 조작된 파지의 정체를 더욱 확인시켜 주었다.
2-벡터 전략:
DNA 서열 및 연관 주석을 사용하여, 추정 엔도리신 유전자 (SEQ ID NO: 77)를 확인하였고 이러한 유전자좌에서 SNM을 시도하고자 결정하였다. 단일 염기 변화는 소위 동의 돌연변이라고 하는, 번역 후 본래 또는 wt 서열과 동일한 단백질을 야기한다. 편집 주형 또는 상동성 팔부는 제2 상동성 재조합 사건 이후에, 파지 게놈의 의도된 변형을 일으키고, 이중 가닥 파손을 수행하기 위해 CRISPR 시스템에 필요한 PAM 서열은 제거되도록 디자인되었다. 이러한 시나리오에서, 돌연변이체 파지가 아닌 오직 미변형된 파지만이 CRISPR 시스템에 의해 표적화되어서 돌연변이체-wt 구별에 필요한 선택을 제공한다.
pIC086으로 명명된 셔틀 가동성 벡터가 편집 주형을 더 도입하기 위해 선택되었다. pIC086은 이. 콜라이 - 씨. 아크네스 셔틀 플라스미드로서, 하기를 포함한다:
. 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원
. 씨. 아크네스에서 기능성인 선택 마커 (여기서 에리쓰로마이신에 대한 내성을 제공함)
. 씨. 아크네스에 DNA 페이로드를 접합시키기 위한 렐락사제 및 연관된 전달 기원 (oirT)
. 이. 콜라이에서 복제를 허용하는 기원 및 선택 마커.
pIC104로 명명된 CRISPR 벡터는 PAC7을 조작하는데 필요한 구성요소를 더 도입시키기 위해 선택되었다. pIC104 는 이. 콜라이 - 씨. 아크네스 셔틀 플라스미드로서, 하기를 포함한다:
. 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원
. 씨. 아크네스에서 기능성인 선택 마커 (여기서 에리쓰로마이신에 대한 내성을 제공함)
. 씨. 아크네스에 DNA 페이로드를 접합시키기 위한 렐락사제 및 연관된 전달 기원 (oirT)
. 이. 콜라이에서 복제를 허용하는 기원 및 선택 마커
. 씨. 아크네스 발현을 위해 사전에 코돈-최적화된, SpCas9를 코딩하는 유전자 및 sgRNA를 포함하는, CRISRP 표적화에 필요한 구성요소.
pIC086으로 편집 주형의 도입은 벡터 pIC350을 야기하였다. pIC104에 표적/씨드 서열의 도입은 벡터 pIC238을 야기하였다. 상이한 유전자좌에 대한 편집 주형을 함유하는 벡터 (벡터 pIC351)가 또한 대조군으로서 포함되었다. 표적화 및 편집 벡터는 이. 콜라이 DH10B 클로닝 균주에 클로닝되었고, 서열 검증되고, 접합 기구를 보유하는 이. 콜라이 도너 균주에 형질전환되었다. 이들 벡터는 최종적으로 씨. 아크네스 균주 ATCC 11828에 접합되었고 형질전환체는 에리쓰로마이신이 보충된 한천 플레이트 상에서 선택되었다. 하기 균주들이 생성되었다: Ca0s18233 (pIC238을 보유하는 씨. 아크네스 ATCC 11828); Ca0s18379 (pIC350을 보유하는 씨. 아크네스 ATCC 11828); 및 Ca0s18381 (pIC351을 보유하는 씨. 아크네스 ATCC 11828).
조작된 파지를 생산하기 위해서, DNA 벡터 pIC350 (Ca0s18379) 및 pIC351 (편집 주형에 대한 대조군; 균주 Ca0s18381)을 보유하는 상이한 씨. 아크네스 균주의 액체 배양물을 성장시켰고 파지 PAC7로 감염시켰다. 감염 후에, 상청액을 여과하였고 수집하였다. 여기서 이들 상청액은 각각 균주 Ca0s18379 및 Ca0s18381을 파지 PAC7로 감염시킨 후 수득된 것들로서 Sup-350 및 Sup-351이라고 한다. 이론적으로, 상동성 재조합이 일어나면, 현탁물은 wt 및 조작된 파지의 혼합물을 함유한다.
현탁물 중 돌연변이체 및 wt 파지의 존재를 선택 및 정량하기 위해서, 파지 적정을 수행하였다. 적정은 씨. 아크네스 ATCC 11828 및 pIC238을 보유하는 씨. 아크네스 ATCC 11828 (Ca0s18233)에 대해 수행되었다 (도 11). 벡터 pIC238은 의도하는 변형에 대해 선택된 CRISPR 시스템을 함유한다. 돌연변이체 파지가 수득되었으면, Sup-350에 대한 파지 적정가는 씨. 아크네스 ATCC 11828 및 표적화 벡터 pIC238을 보유하는 씨. 아크네스 ATCC 11828 (Ca0s18233)에 대해 적정했을 때 상이해야 한다. 씨. 아크네스 ATCC 11828 은 wt 파지 PAC7 및 조작된 파지 둘 모두에 대해서 감수성인데 반해서, pIC238을 보유하는 씨. 아크네스는 조작된 파지에 대해서만 감수성이다. 씨. 아크네스 ATCC 11828 및 pIC238을 보유하는 씨. 아크네스 (Ca0s18233)에 대한 Sup-351 (편집 주형에 대한 대조군)의 적정은 동일해야 하는데, 양쪽 균주가 wt 파지 PAC7 및 조작된 파지 둘 모두에 대해 감수성이기 때문이다 (도 12).
씨. 아크네스 ATCC 11828에 대한 상청액의 적정 후 수득된 개별 플라크는 프라이머 IC443/IC444 및 IC446/AD1289를 사용한 PCR을 통해서 스크리닝되었고 파지 돌연변이체의 정체는 게놈 시퀀싱을 통해 확인되었다. 이전에 단리 및 시퀀싱된 파지로 씨. 아크네스 ATCC 11828의 재-감염 후 수득된 단리된 플라크의 시퀀싱 결과는 조작된 파지의 정체를 더욱 확인시켜 주었다.
재조합 씨. 아크네스 파지가 DNA 벡터에 의해 보유된 DNA 주형 및 씨. 아크네스 파지 게놈 간에 씨. 아크네스에서 생체내 재조합 (리콤비니어링)을 사용해 효율적으로 생산될 수 있다는 것이 최초로 입증되었다. 이들 재조합 입자는 DNA 벡터가 재조합 파지 게놈이 아닌 wt 파지 게놈을 표적화하는 CRISPR-Cas 시스템을 함유하면 wt 입자와 비교하여 선택적으로 직접적으로 증폭될 수 있다 (1 벡터 전략). 달리 wt 파지 게놈을 표적화하는 CRISPR-Cas 시스템을 함유하는 않는 DNA 벡터를 사용해 수득된, 소수의 재조합 입자는 재조합 파지 게놈이 아닌 wt 파지 게놈을 표적화하는 CRISPR-Cas 시스템을 보유하는 씨. 아크네스 균주의 제2 감염을 사용해 선택될 수 있다 (2 벡터 전략). 이러한 입증은 단일 뉴클레오티드 변형을 사용해 수행되었지만, 파지 생산을 방해하지 않고 이식유전자의 도입을 포함한 하나 또는 몇 개 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 치환은 예를 들어 생체내에서 치료적 단백질을 발현하거나 또는 씨. 아크네스 파지 숙주 범위를 변형시키기 위한 도구를 갖는 씨. 아크네스 재조합 파지를 사용할 가능성을 열어준다.
재료 및 방법:
씨. 아크네스 접합: LB 액체배지 (Fisher Scientific)에서 성장된, 상이한 가동성 셔틀 플라스미드를 보유하는 이. 콜라이의 2 mL 밤샘 배양물을 벤치탑에서 6,000 x g로 1분 동안 원심분리하여 펠렛화하였다. 상청액을 버렸고 펠렛은 500 μL의 사전 멸균된 LB 배지로 세척하였으며, 동일한 조건을 사용해 다시 원심분리하였다. 각 펠렛은 10X로 농축된 200 μL의 대수기 성장된 (OD600 = 0.5) 씨. 아크네스 수용체 BHI 배양물 (BHI broth, Oxoid)에 재현탁하였다. 이. 콜라이 - 씨. 아크네스 혼합물을 브루셀라 한천 플레이트 (Sigma-Aldrich) 상에 점적 (50 μL/반점)하였고 24시간 동안 혐기성 조건 하에 37℃에서 교접하도록 허용하였다. 그 시간 후에 세포를 교접 플레이트로부터 수확하였고, 300 μL의 BHI 액체배지에 재현탁하였으며 50 μg/mL 폴리믹신 B (Sigma-Aldrich) 및 5 μg/mL 에리쓰로마이신 (Sigma-Aldrich) 또는 5 μg/mL 클로람페니콜 (Sigma-Aldrich)이 보충된 브루셀라 한천 플레이트 상에 도말하였다. 7일 후에, 선택 존재 하에서 성장된 씨. 아크네스 세포를 적절한 선택이 보충된 브루셀라 한천 플레이트 상에 스트리킹하였고 접합된 플라스미드의 존재는 특이적 PCR을 통해서 확인하였다. 씨. 아크네스의 정체를 비롯하여 이. 콜라이 도너 균주의 부재를 또한 PCR 분석을 통해 확인하였다
파지 생산: DNA 벡터를 보유하는 씨. 아크네스 또는 씨. 아크네스 ATCC 11828의 액체 배양물 (BHI + 에리쓰로마이신 5 μg/mL)을 대수기까지 성장시키고, 원심분리하여서, 100 μL의 씨. 아크네스 파지 PAC7 현탁물 (대략 105 PFU/μL)에 재현탁하였다 (대략 108-109 세포). 다음으로 혼합물을 30분 내지 60분 동안 RT에서 인큐베이션하여서 감염이 일어나도록 하였다. 인큐베이션 후에, 혼합물은 5 μg/mL 에리쓰로마이신이 보충된 5 mL BHI에 희석하였고, 밤새 37℃에 혐기성 조건 하에서 인큐베이션하였다. 밤샘 인큐베이션 후, 배양물을 원심분리하였고 0.2 μm 막 필터를 통해 여과하였다.
파지 적정: 파지 현탁물을 MgSO4 5 mM에 연속 희석하였고 씨. 아크네스 ATCC 11828 wt 또는 표적 벡터를 보유하는 씨. 아크네스 ATCC 11828 (Ca0s18233 및 Ca0s18234)을 함유하는 BHI 이중-층 플레이트 상에 점적하였다 (4 μl/반점). 혐기성 조건 하에 37℃에서 2일 인큐베이션 후에, 용해 플라크를 계측하였다.
파지 돌연변이체의 PCR 스크리닝: 개별 플라크에 대한 PCR은 각각 엔도리신 및 cos 유전자좌에서 수득된 SNM에 대해 프라이머 IC443/IC444 및 IC446/AD1289를 사용해 수행하였다.
실시예 3. CRISPR-Cas 시스템을 사용한 씨. 아크네스 파지로 이식유전자의 도입 및 발현
이식유전자 발현 카세트의 도입은 제1 씨. 아크네스 균주에서, 생체내 상동성 재조합에 이어서 이식유전자 발현 카세트를 함유하는 씨. 아크네스 재조합 파지의 선택을 사용하고, WT 파지를 표적화하지만 재조합 파지는 표적화하지 않는 CRISPR-Cas 시스템을 발현하는 벡터를 보유하는 제2 씨. 아크네스 균주에서, 씨. 아크네스 파지의 다양한 유전자좌에서 수행된다. 감염 시 이식유전자 발현을 관찰할 수 있다.
박테리오파지 조작의 한가지 도전은 기능성 입자의 생산에 영향을 미치지 않고 유전자 변형을 수행할 수 있는 것이다. 이것은 특히 어려워 보이는데 박테리오파지 게놈이 소수의 비-코딩 영역을 갖고, 그들 유전자 프로그램이 자손 생산을 최대화하기 위해 엄격하게 조절되기 때문이다. 이러한 유전적 제한의 예로서, 대부분의 박테리오파지는 그의 전사가 종결-방지 기전 또는 특이적 RNA 폴리머라제 또는 시그마 인자의 발현에 의존하는 긴 오페론으로서 그들 유전자 정보를 구성한다. 유전자 정보의 고밀도의 다른 예는 수많은 중복 코딩 서열의 존재이다. 실제로 많은 유전자가 그들 리보솜 결합 부위 및 그들 출발 코돈을 유전자 상류 내에 갖는다. 마지막으로 그들의 작은 크기때문에, 전형적으로 유전자의 오직 작은 분획만이 파지 생활 주기에 필수적이지 않다.
모든 이들 이유때문에, 파지의 생산을 방해하지 않고 이식유전자를 도입시키는 것이 어렵고 따라서 단지 특별한 유전자 및 특별한 유전자간 영역만이 이식유전자를 도입하는데 사용될 수 있다.
씨. 아크네스 파지의 유전적 아키텍처는 고도로 보존되어 있고 다음의 상이한 기능을 갖는 5개의 상이한 영역이 확인되었다: 패키징, 헤드부 조립, 꼬리부 조립, 용해, DNA 복제 (도 13).
이식유전자의 합입을 위한 몇몇 후보 유전자좌가 선택되었다 (표 8). 이들 유전자좌는 몇가지 이유때문에 선택되었다.
유전자좌 1은 예를 들어 잠재적 오페론의 말단에 존재하고 (표 8 유전자좌 1) 따라서 이식유전자의 도입이 아마도 상류 유전자에 영향을 미치지 않을 것이다.
유전자좌 2는 꼬리부 조립을 코딩하는 영역의 말단 및 용해 영역의 상류 사이에 존재한다. 여기서 이식유전자의 도입은 꼬리부 조립에 영향을 미치지 않아야 하고 홀린 및 엔도리신으로 이루어지는, 하류 용해 유전자에 대한 영향이 발생되면, 예를 들어, 클로로포름 처리를 사용하여 씨. 아크네스 세포를 용해시켜서 재조합 입자를 여전히 생산할 수 있다.
유전자좌 3은 HNH 엔도뉴클레아제 유전자의 하류에 있고, 하류에 어떠한 유전자도 존재하지 않아서 이식유전자 삽입의 잠재적 간섭을 제한한다.
이식유전자는 하나 또는 몇 개 유전자를 삽입시킬 수 있거나 또는 치환시킬 수 있다. 이식유전자는 번역 단위 (RBS-CDS)로서, 또는 단일 코딩 서열로서, 그 자신의 프로모터 및 종결자를 가질 수 있다.
씨. 아크네스 파지 게놈의 어떠한 유전자좌가 이식유전자 삽입, 파지의 생산 및 감염 동안 이식유전자의 발현을 허용하는가를 결정하기 위해서, 리포터 유전자, 여기서는 씨. 아크네스 발현을 위해 코돈 최적화된 산소 독립적 및 빌리루빈 의존적 형광 유전자 UnaG (SEQ ID NO: 84)의 발현을 구동하는 전사 단위 (프로모터 RBS CDS 종결자) 또는 번역 단위 (RBS-CDS)가 삽입된다.
이식유전자의 도입은 생체내 재조합을 사용해 수행될 것이다.
파지 게놈 삽입 부위에 대한 상류 및 하류에 1 kb 상동성 및 그 사이에 이식유전자를 갖는 플라스미드를 하기를 포함하는 이. 콜라이 - 씨. 아크네스 셔틀 가동성 벡터에 클로닝한다 (표 9):
. 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원
. 씨. 아크네스에서 기능성인 선택 마커 (여기서 에리쓰로마이신에 대한 내성을 제공함)
. 씨. 아크네스에 DNA 페이로드를 접합시키기 위한 렐락사제 및 연관된 전달 기원 (oirT)
. 이. 콜라이에서 복제를 허용하는 기원 및 선택 마커.
CRISPR 벡터는 이식유전자를 갖는 재조합 씨. 아크네스 파지를 선택하도록 구축될 것이다. pIC104 는 하기를 포함하는 이. 콜라이 - 씨. 아크네스 셔틀 플라스미드이다:
. 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원
. 씨. 아크네스에서 기능성인 선택 마커 (여기서 에리쓰로마이신에 대한 내성을 제공함)
. 씨. 아크네스에 DNA 페이로드를 접합시키기 위한 렐락사제 및 연관된 전달 기원 (oirT)
. 이. 콜라이에서 복제를 허용하는 기원 및 선택 마커
. 씨. 아크네스 발현을 위해 코돈-최적화된 SpCas9를 코딩하는 유전자 및 sgRNA 스캐폴드를 포함하는, CRISPR 표적화에 필요한 구성요소.
이식유전자 삽입 유전자좌에서 WT 파지를 표적화하는 몇몇 sgRNA 표적 후보는 pIC104에 클로닝된다 (표 10).
표적화 및 편집 벡터는 이. 콜라이 DH10B 클로닝 균주에 클로닝되고, 서열을 검증하고, 접합 기구를 보유하는 이. 콜라이 도너 균주에 형질전환된다. 이들 벡터는 최종적으로 씨. 아크네스 균주 ATCC 11828에 접합되고 형질전환체는 에리쓰로마이신이 보충된 한천 플레이트 상에서 선택된다.
조작된 파지를 생산하기 위해서, 각각 pIC86-UnaGPAC7locus1, pIC86-UnaGPAC7locus2, pIC86-UnaGPAC7locus3을 보유하는 상이한 씨. 아크네스 균주의 액체 배양물을 성장시켰고, 파지 PAC7로 감염시켰다. 감염 후에, 상청액을 여과하였고 수집하였다. 이론적으로, 상동성 재조합이 일어났으면, 현탁물은 wt 및 조작된 파지의 혼합물을 함유한다.
현탁물 중 돌연변이체 및 WT 파지의 존재를 선택하고 정량하기 위해서, 파지 적정을 수행하였다. 적정은 씨. 아크네스 ATCC 11828, 및 각각 pIC104-PAC7locus1, pIC104-PAC7locus2, pIC104-PAC7locus3을 보유하는 씨. 아크네스 ATCC 11828로 수행된다. 씨. 아크네스 ATCC 11828 은 wt 파지 PAC7 및 조작된 파지 둘 모두에 감수성인데 반해서, pIC104 유도체를 보유하는 씨. 아크네스는 상응하는 유전자좌에서 조작된 파지에만 감수성이다. 적정은 또한 CRISPR-Cas 특이성에 대한 대조군으로서 비조작된 유전자좌를 표적화하는 pIC104 유도체에 대해 수행된다. 적정은 빌리루빈 (20 μM)이 보충된 BHI 에리쓰로마이신 (5 μg/mL) 상에서 스폿 어세이를 통해 수행된다. 빌리루빈이 UnaG 형광에 필요하다.
씨. 아크네스 ATCC 11828 및 pIC104 유도체를 보유하는 씨. 아크네스에 대한 상청액의 적정 후 수득된 개별 플라크에 대해서 파란색 빛에서 형광에 대해 스크리닝된다. 형광을 나타내는 플라크는 이식유전자의 존재를 검토하기 위해서 PCR을 통해 스크리닝된다. 마지막으로 삽입 유전자좌의 시퀀싱이 수행된다.
다음으로 재조합 플라크를 단리하고, 씨. 아크네스 ATCC 11828 또는 상응하는 pIC104 유도체를 보유한 씨. 아크네스 11828에서 재증폭한다.
관찰된 형광 플라크 및 전체 플라크의 예상 개수는 하기 표에 요약된다 (표 11).
이식유전자가 삽입되고 형광이 관찰된 유전자좌는 이식유전자 발현에 적합하다.
유전자좌의 스크리닝을 기반으로, 재조합 파지를 통해서 발현시키고자 하는 몇 개 잠재적 치료 단백질, 특히 IL-10 및 항-TNF알파를 삽입시킨다.
결론적으로, 씨. 아크네스 파지를 조작하는 능력은 하기 2개 기능의 조합을 허용한다:
- 원위치 이식유전자 발현
- 원위치 씨. 아크네스 개체군의 분획의 사멸.
이것은 예를 들어, 항-염증성 단백질 예컨대 IL-10을 발현하면서 염증을 초래하는 씨. 아크네스 세포를 사멸시킴으로써, 씨. 아크네스 집락화가 너무 높고/높거나 염증 반응을 초래하는, 질환 또는 병태에 대해 유리한 결과를 제공할 수 있다.
재료 및 방법:
씨. 아크네스 접합: LB 액체배지 (Fisher Scientific)에서 성장시킨, 접합 기구 및 상이한 가동성 셔틀 플라스미드 및 접합성 플라스미드 또는 ICE를 보유하는 이. 콜라이 도너 균주의 2 mL 밤샘 배양물을 벤치탑에서 6,000 x g로 1분 동안 펠렛화하였다. 상청액을 버렸고 펠렛은 500 μL의 사전 멸균된 LB 배지로 세척하였으며, 동일한 조건을 사용해 다시 원심분리하였다. 각 펠렛은 10X로 농축된 200 μL의 대수기 성장된 (OD600 = 0.5) 씨. 아크네스 수용체 BHI 배양물 (BHI broth, Oxoid)에 재현탁하였다. 이. 콜라이 - 씨. 아크네스 혼합물을 브루셀라 한천 플레이트 (Sigma-Aldrich) 상에 점적 (50 μL/반점)하였고 24시간 동안 혐기성 조건 하에 37℃에서 교접하도록 허용하였다. 그 시간 이후에, 세포를 교접 플레이트로부터 수확하였고, 300 μL의 BHI 액체배지에 재현탁하고, 50 μg/mL 폴리믹신 B (Sigma-Aldrich) 및 5 μg/mL 에리쓰로마이신 (Sigma-Aldrich) 또는 3.5 μg/mL 클로람페니콜 (Sigma-Aldrich)이 보충된 브루셀라 한천 플레이트 상에 도말하였다. 7일 후에, 선택 존재 하에서 성장된 씨. 아크네스를 적절한 선택이 보충된 브루셀라 한천 플레이트 상에 스트리킹하였고, 접합된 플라스미드의 존재를 특이적 PCR을 통해 확인하였다. 씨. 아크네스의 정체를 비롯하여 이. 콜라이 도너 균주의 부재를 또한 PCR 분석을 통해 확인하였다.
파지 생산: DNA 벡터를 보유하는 씨. 아크네스 또는 씨. 아크네스 ATCC 11828의 액체 배양물 (BHI + 에리쓰로마이신 5 μg/mL)을 대수기까지 성장시키고, 원심분리하여서, 100 μL의 씨. 아크네스 파지 PAC7 현탁물 (대략 105 PFU/μL)에 재현탁하였다 (대략 108-109 세포). 그 다음에 혼합물을 30-60분 동안 RT에서 인큐베이션하여서 감염이 일어나도록 하였다. 인큐베이션 후에, 혼합물은 5 μg/mL 에리쓰로마이신이 보충된 5 mL BHI에 희석하였고, 밤새 37℃에 혐기성 조건 하에서 인큐베이션되었다. 밤샘 인큐베이션 후, 배양물을 원심분리하였고, 0.2 μm 막 필터를 통해 여과시켰다.
파지 적정: 파지 현탁물은 MgSO4 5 mM에 연속 희석하였고, 씨. 아크네스 ATCC 11828 wt 또는 표적화 벡터를 보유하는 씨. 아크네스 ATCC 11828을 함유하는 BHI 이중-층 플레이트 상에 점적하였다 (4 μl/반점). 혐기성 조건 하에 37℃에서 2일 인큐베이션 후에, 용해 플라크를 계측하였다.
파지 돌연변이체의 PCR 스크리닝: 개별 플라크에 대한 PCR은 이식유전자 한쪽에 일치하고 다른 한쪽은 WT 파지에 일치하는 프라이머를 사용해 수행하였다.
실시예 4
유전자 변형된 씨. 아크네스 균주의 효과는 면역 세포에 대한 그들 효과에 대해서, 특히 특이적 사이토카인 또는 면역 프로파일을 유도하는 그들 능력에 대해서, 이전에 기술된 프로토콜에 따라서, 시험관내에서 시험된다.
특히, 필요하면, 임의로 변형 및/또는 개조하여, [Yu et al. (2016) Journal of Investigative Dermatology 136:2221-2228]에 개시된 프로토콜을 상기 균주에서 구현한다.
실시예 5: 조작된 씨. 아크네스 균주에 의한 항원의 분비
털피지샘 단위 (PSU)는 다양한 세포 세트 예컨대 면역 세포, 피지 세포 및 줄기 세포를 함유하는 복잡한 피부 부속부이다. 이것은 또한 고도로 혈관화된 영역으로서 분자의 전신 전달을 위한 진입 지점이 된다. PSU 마이크로바이오타는 씨. 아크네스가 우세하므로, 원위치에서 재조합체 단백질을 분비하는 씨. 아크네스를 조작하는 능력은 혈액 중에서 분자의 전달을 비롯하여 존재하는 세포의 활성을 조절하기 위해서 매우 관심있다. 본 실시예는 DNA 벡터의 사용이, 씨. 아크네스로 도입되면, 재조합 단백질, 여기서는 닭 오브알부민 항원 단백질의 분비를 야기한다는 것을 입증한다. 본 발명은 피부 프로바이오틱으로서 특별한 관심 단백질 예컨대 항원을 분비하는 조작된 씨. 아크네스를 사용할 가능성을 열어준다. 대안적으로 조작된 파지 또는 파지-유래 입자는 PSU에 이미 존재하는 씨. 아크네스 개체에서, 관심 단백질의 분비를 코딩하는, DNA 벡터를 전달하는데 사용될 수 있다.
씨. 아크네스는 인간 피부의 가장 풍부하고 우세한 공생 박테리아 중 하나이다. 피부 표면에서도 단리될 수 있더라도 대개는 PSU에 상주한다. 특별한 계통형에 속하는 특별한 균주가 심상성 좌창 질환과 연관되었고 "프로-염증성"으로 간주된다. 상이한 씨. 아크네스 계통형 간에 차이를 특징규명하기 위해서, 몇몇 연구들은 프로-염증성 표현형에 특이적인 잠재적 단백질을 확인하기 위해 분비체를 특징규명하였다. 확인된 분비형 단백질의 서브세트를 사용하여서, 본 발명자는 signalP를 사용하여 추정 분비 신호 펩티드 (표 12)를 확인할 수 있었다 (Armenteros, J. et al. SignalP 5.0 improves signal peptide predictions using deep neural networks. Nat Biotechnol 37, 420-423 (2019)).
씨. 아크네스에서 재조합 단백질의 분비를 구동하는 이들 분비 신호 펩티드의 능력을 시험하기 위해서, 본 발명자는 하기를 포함하는 몇개의 복제성 플라스미드를 구축하였다:
- 재조합체 단백질의 발현을 구동하는 프로모터,
- 씨. 아크네스에 대해 최적화된 닭 오브알부민 CDS 코돈의 N-말단에 융합된 분비 시스템으로 단백질을 전달하는 신호 펩티드,
- 씨. 아크네스에 대한 에리쓰로마이신 선택 마커, 및
- 씨. 아크네스에서 기능성인 복제 기원.
상이한 DNA 벡터 (표 13)를 씨. 아크네스 ATCC 11828 (표 14)에 도입시켰다. 씨. 아크네스 세포로의 도입은 상이한 방법 예컨대 씨. 아크네스로 전기천공, 원형질체의 전기천공, 접합, 화학적 형질전환, 형질도입을 통해 수행될 수 있다. 씨. 아크네스로의 DNA 벡터의 존재는 콜로니 PCR을 통해서, 선택적 플레이트 상에 스트리킹 후에, 확인하였다. 상이한 씨. 아크네스 배양물 상청액 중에 닭 오브알부민 단백질의 분비는 ELISA (도 14) 및 웨스턴 블롯 (도 15)을 사용하여 모니터링하였다. 도 14에 도시된 바와 같이, ELISA 실험의 양쪽 복제물은 Ca0s22124를 제외하고, 야생형 씨. 아크네스 (씨. 아크네스 ATCC 11828)와 비교하여, 대부분의 조작된 씨. 아크네스 균주에 대해서 유의하게 더 높은 흡광도를 보인다. 균주 Ca0s22126은 배양물 상청액 중에서 분비된 오브알부민의 더 높은 수준을 의미하는 최고 신호를 반복적으로 제공하였다. 분비는 웨스턴 블롯을 통해서 추가로 확인하였다 (도 15). 40 kDa 바로 위의 단일 밴드가 균주 Ca0s22120, Ca0s22122, Ca0s22126, Ca0s22128 및 Ca0s22132로부터의 배양물 상청액에서 관찰되었다. 이러한 밴드는 오브알부민 크기 (43kDa) 및 오브알부민 대조군 웰로부터의 희미한 밴드에 상응한다. 상이한 분비 플라스미드를 클로닝하는데 사용된 빈 플라스미드를 보유하는 대조군 균주 Ca0s16973 경우에 밴드가 관찰되지 않았다. 보다 강한 밴드가 Ca0s22126에서 관찰되어서 ELISA 결과가 확인되었다.
결론적으로, 본 발명자는 복제성 DNA 플라스미드를 사용하여 씨. 아크네스에 의한 재조합 단백질의 분비를 위한 내생성 씨. 아크네스 분비 펩티드의 사용을 최초로 기술한다.
재료 및 방법:
플라스미드 구축: 합성 DNA 단편을 주문하였고 p1047 플라스미드 (pIC086)에서 SapI 골든 게이트 클로닝을 사용해 조립하였다.
접합: 실시예 1의 재료 및 방법에 기술된 바와 같다.
ELISA: 항생제 없는 BHI에 스트리킹한 플라스미드 없는 대조군 균주를 제외하고, 저온저장된 상이한 씨. 아크네스 균주를 BHI + 에리쓰로마이신 플레이트에 스트리킹하였고, 플레이트를 37℃에 혐기성 조건 하에서 4-7일 동안 인큐베이션하였다. 완전하게 성장하면, BHI + 5 μg/mL 에리쓰로마이신의 10 mL 배양물에 상응하는 스트리킹으로부터의 접종원을 접종하였고 하루 밤새 혐기성 조건에 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, OD600nm 를 측정하여서 성장 차이를 제어하였다. 1 mL의 배양물을 1.5 mL 튜브에 분배하였고 6분 동안 6000 g로 원심분리하였다. 10 μL의 상청액을 90 μL의 1X PBS가 사전 충전된 고-결합성 96웰 플레이트 (Greiner 655061)로 옮겼다. 37℃에서 2시간 동안 덮혀진 플레이트의 인큐베이션을 수행하였다. 인큐베이션 후에, 샘플을 플레이트로부터 폐기하였고, 100 μL의 PBS + 5% 소 혈청 알부민 (BSA)을 첨가하고 덮힌 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 100 μL의 PBS + 0.05% Tween 20을 사용한 3회 연속 세척을 100 μL의 1차 항체 용액 (PBS 1X + 1% BSA + 0.05% Tween 20에 1/1000으로 희석된 항-OVA innovagen PA-O323-100)의 첨가 전에 수행하였다. 덮힌 플레이트를 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 100 μL의 PBS + 0.05% Tween 20을 사용한 3회 연속 세척 단계를 100 μL의 2차 항체 용액 (PBS 1X + 1% BSA + 0.05% Tween 20에 1/5000으로 희석된 항-토끼 Invitrogen A16035 항체)의 첨가 및 RT에서 1시간 인큐베이션 전에 수행하였다. 인큐베이션 후에, 샘플을 플레이트로부터 폐기하였고 100 μL의 PBS + 0.05% Tween 20를 사용한 최종 3회 연속 세척 단계를 수행하였다. 100 μL의 TMB-ELISA 기질 (Thermo Scientific 34028)을 각 웰에 첨가하였고 10분 내지 12분 동안 RT에서 광 보호 하에 인큐베이션을 수행하였다. 100 μL의 1 M 황산을 각 웰에 첨가하여 반응을 중지시켰다. 450 nm에서 흡광도 측정은 infinite 판독기 (Tecan)를 사용해 수행하였다.
웨스턴 블롯: 항생제 없는 BHI에 스트리킹된 플라스미드없는 대조군 균주를 제외하고, 저온저장된 상이한 씨. 아크네스 균주를 BHI + 에리쓰로마이신 플레이트에 스트리킹하였고, 플레이트를 37℃에 혐기성 조건에서 4-7일 동안 인큐베이션하였다. 완전하게 성장되면, BHI + 5 μg/mL 에리쓰로마이신의 10 mL 배양물에 상응하는 스트리킹으로부터의 접종원을 접종하였고 하루 밤새 37℃에 혐기성 조건에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, OD600 을 측정하여 성장 차이를 제어하였다. 1 mL의 배양물을 1.5 mL 튜브에 분배하였고, 6분 동안 6000 g로 원심분리하였다. 0.2 μm 필터를 사용해 상청액을 여과하였다. 30 μL의 여과된 상청액은 100℃에서 10분 동안 끓이기 전에 7.5 μL의 LDS 샘플 완충액 (B0008 Invitrogen™) 및 3 μL의 Bolt™ 항산화제 (BT0005 Invitrogen™)가 보충되었다. 30 μL의 혼합물을 Bolt™ 4 내지 12% Bis-Tris 겔 (NW04120 Invitrogen™)에 로딩하였다. 이동 후에, 니트로셀룰로스 막으로의 전달을 수행하였다. 전달 후에, 막은 먼저 PBS + 0.05% Tween 20 중 5% 탈지유 용액에 1시간 동안 함침된 다음에, 4℃에서 밤새 1:1000로 희석된 1차 항체 (항-OVA innovagen PA-O323-100)를 함유하는 PBS + 0.05% Tween 20 중 20 mL의 5% 탈지유 용액에 함침되었고, 3회 PBS + Tween 0.05%로 세척되고 나서, 1시간 동안 1:5000로 희석된 2차 항체 (항-토끼 Invitrogen A16035 항체)를 함유하는 PBS + 0.05% Tween 20 중 20 mL의 5% 탈지유 용액에 함침되고, 3회 PBS + Tween 0.05%로 세척되었다. 화학발광성 기질 (34580 Thermofisher)을 사용하여 최종 노출 단계를 수행하였다. iBright CL1000 (Invitrogen™)을 사용해 이미지화를 수행하였다.
실시예 6: CRISPR-Cas 시스템을 사용한 씨. 아크네스 파지로 재조합 DNA의 도입
발명자는 씨. 아크네스 파지 게놈 내에 몇몇 재조합 DNA 단편의 성공적인 도입을 입증하였다. 3.3 kb 정도로 큰 단편의 도입은 플라크를 생산하는 조작된 씨. 아크네스 파지의 능력을 없애지 않고 수행할 수 있었다. 조작된 씨. 아크네스 파지는 상이한 씨. 아크네스 균주 (Ca0s20855, Ca0s20857, Ca0s20859)를 먼저 야생형 PAC7로 감염시켜서 생산되었다. 각각의 이들 균주 (표 15)는 파지 삽입 유전자좌의 상류 및 하류에 존재하는 상동성 영역이 측접된 삽입시키려는 재조합 DNA와 상동성 재조합을 위한 주형을 보유하는 DNA 벡터를 함유한다 ( 7A). 선택된 유전자좌는 표 8에 기술된 바와 같은 유전자좌 1이었다.
첫번째 감염이 수행되면, WT 파지 (PAC7) 및 잠재적 돌연변이체 파지 둘 모두를 함유하는 파지 현탁물을 탑 (top) 어세이의 스크리닝 균주와 혼합하였다. 인큐베이션 후에, 플라크는 모든 3개 현탁물에서 관찰할 수 있었다. 돌연변이체 파지 플라크는 각각의 개별 플라크로부터 PCR을 사용해 야생형 파지 플라크와 구별하였다. 확인되면, 추정 돌연변이체 플라크를 선택하였고 Ca0s20472와 새로운 상부층에 스트리킹하여 단리하였다. 프라이머 IC443 (SEQ ID NO: 101)/IC290 (SEQ ID NO: 106)를 사용하여, 단리된 플라크에 대한 새로운 PCR을 수행하여서, 파지 유전자좌 1에 재조합 삽입부의 존재를 확인하였다 ( 16). PAC7의 감염으로 생성된 플라크는 wt PAC7에 상응하는 크기 (2.4kb)에서 밴드를 제공하였는데 반해서, Ca0s20855 및 Ca0s20859의 감염으로 생성된 플라크는 더 큰 크기, 각각 3.3 kb 및 5.4 kb에서 밴드를 제공하였다. PCR 생산물의 시퀀싱을 수행하였고 파지 게놈의 유전자좌 1에서 재조합 DNA의 도입을 확인하였다. 그러므로, 본 발명자는 씨. 아크네스 파지 게놈으로 재조합 DNA의 도입을 최초로 입증하였다.
재료 및 방법:
파지 생산: DNA 벡터를 보유하는 씨. 아크네스의 20 mL의 조밀한 액체 배양물 (BHI + 에리쓰로마이신 5 μg/mL)을 대수기까지 성장시켰고, 원심분리하였으며, 200 μL의 씨. 아크네스 파지 PAC7 현탁물 (대략 107 PFU/μL)에 재현탁하였다 (대략 108-109 세포). 다음으로 혼합물을 30-60분 동안 RT에서 인큐베이션하여서 감염이 일어나도록 하였다. 인큐베이션 후에, 20 mL의 BHI를 혼합물에 첨가하여서 밤새 37℃에 혐기성 조건 하에서 인큐베이션하였다. 밤샘 인큐베이션 후, 배양물을 원심분리하였고, 0.2 μm 막 필터를 통해 여과하였다.
탑 어세이: 100 μL의 파지 현탁물을 2 mL의 0.45% BHI 한천의 최종 혼합물로 Ca0s20472의 조밀한 배양물과 혼합하였다. 모든 혼합물을 5 μg/mL 에리쓰로마이신이 보충된 브루셀라 플레이트에 부었다.
실시예 7: 조건적-복제성 파지의 생산/생성
천연 발생 또는 조작된 파지의 칵테일을 사용한 파지 요법은 균주 또는 종의 특이적 제거를 통해서 마이크로바이오타를 조절하는 방식으로서 또는 병원성 박테리아의 사멸에 대해 항생제에 대한 매력적인 대안인 것으로 보인다. 약물로서 파지의 특이한 특성 중 하나는 복제하는 그들 능력이다. 실제로, 하나의 파지에 의한 표적 박테리아의 각 감염 이후에, 수백개의 입자가 생성될 수 있다. 이러한 복제는 파지 약물 물질의 활성이 실제로 제공되는 용량에 의해서만 단독으로 제어되는 것이 아니라 얼마나 많은 파지 복제가 일어날 수 있는가에 의해서도 제어된다는 것을 의미한다. 파지 복제량은 표적 박테리아 개체군의 접근성 및 존재량을 비롯하여 표적 개체군의 정체에 의해서도 좌우될 수 있다. 실제로 상이한 균주는 상이한 방출량을 야기할 수 있는데, 한 파지에 의한 감염으로부터의 파지 자손의 상이한 수를 의미한다. 이들 비제어적인 약력학적 측면은 파지가 병원성 균주의 개체군을 박멸하는데 사용될 때 무시할만한 단점일 수 있지만, 소정 마이크로바이오타 중에서 소정 박테리아 개체군의 정확한 조절에 파지를 사용하고자 의도하는 경우에는 문제일 수 있다.
본 명세서에서 본 발명자는 조건적 복제성 씨. 아크네스 파지를 선택하는 방법을 입증하는데, 이들 파지는 표적 박테리아 개체군이 아니라 특이적 조작된 숙주 생산 균주에서 복제할 수 있다. 본 발명은 고전적인 파지 요법에 대한 대안으로서 조건적-복제성 파지의 사용을 위한 길을 열었다.
파지가 그 자체의 더 많은 카피를 성공적으로 생산하기 위해서는, 하기 여러 단계를 거쳐야 한다:
1) 박테리아 숙주에 결합하고 세포질로 이의 게놈의 주입 단계,
2) 이의 게놈의 복제 단계,
3) 신규 캡시드의 생산에 필요한 상이한 유전자의 발현 단계,
4) 캡시드로 새롭게 복제된 게놈의 패키징 단계, 및
5) 숙주 박테리아 세포의 활발한 용해 덕분에 입자의 방출 단계.
생산되는 파지 입자의 수를 최대화하는 방식으로, 모든 이들 단계의 완료는 수십개의 유전자의 조정된 발현을 필요로 한다. 예를 들어, 용해에 관여되는 유전자 예컨대 홀린 및 엔도리신의 발현은 프로그래밍되어서 용해는 오직 대부분의 파지 입자 조립이 수행되고 나면 일어나게 된다. 조건적-복제성 파지를 생성시키기 위해서, 발명자는 파지 게놈에서, 완전한 파지 복제 주기에 필수적인 하나 또는 몇 개 유전자를 결실시키거나 또는 불활성화시키고, 그들을 트랜스로 제공하도록 제안한다.
개념 증명으로서, 본 발명자는 필수 엔도뉴클레아제 유전자 (gp45, SEQ ID NO: 107)에 결실이 존재하는 조건적-복제성 씨. 아크네스 파지를 생산할 수 있었다.
첫째로, spCas9를 발현하는 플라스미드 (p2192), 필수 엔도뉴클레아제 유전자 (SEQ ID NO: 108)의 영역에서 wt PAC7 파지를 표적화하는 sgRNA, 및 P138 프로모터를 사용하여 필수 엔도뉴클레아제를 발현하는 카세트를 함유하는 씨. 아크네스 균주 (Ca0s22235)를 생성시켰다. PAC7 파지의 현탁물은 탑 어세이에서 균주 Ca0s22235와 혼합하였다. 인큐베이션 후에, 플라크를 수득하였고 프라이머 IC446 (SEQ ID NO: 103)/AL97 (SEQ ID NO: 109)를 사용하여 결실에 대해 PCR을 통해서 스크리닝하였다. 2개 플라크 (nº28 및 nº42)는 wt PAC7과 비교하여 더 짧은 밴드 크기를 보였고 엔도뉴클레아제 유전자좌에 잠재적 결실을 의미한다. 플라크를 선택하였고, 선택적 균주 Ca0s22235와 개별적으로 재-단리하였다. 인큐베이션 후에, 플라크는 IC619 (SEQ ID NO: 110)/AL219 (SEQ ID NO: 111)를 사용한 PCR을 위해 선택되었다. PCR은 wt PAC7 플라크와 비교하여 플라크 nº28 (PAC7-m28-gp45) 및 nº42에 대해서 더 작은 밴드 크기를 갖는 필수 엔도뉴클레아제 내 결실의 존재를 확인하였다 (도 17). PCR 생산물의 시퀀싱은 파지 PAC7-m28-gp45에 대한 엔도뉴클레아제의 처음 25개 아미노산의 부분 결실을 보여주었다 (도 18). 씨. 아크네스 ATCC 11828 균주의 존재 하에서 단리된 플라크의 스트리킹은 파지 PAC7-m28-gp45 경우 플라크를 야기하지 않았지만, 플라크 nº42로부터 단리된 파지에 대해서는 플라크를 관찰할 수 있었다. 이것은 파지 PAC7-m28-gp45가 필수 엔도뉴클레아제를 트랜스로 발현하는 균주 Ca0s22235에서 플라크를 생산할 수 있는데 반해서 균주 ATCC 11828 (필수 엔도뉴클레아제 유전자를 보유하지 않음)에서는 플라크를 생산할 수 없다는 것을 의미한다. 따라서, 파지 PAC7-m28-gp45는 엔도뉴클레아제를 트랜스로 발현하는 균주에서만 복제할 수 있는 조건적-복제성 파지이다.
결론적으로, 본 발명자는 최초로 씨. 아크네스 조건적-복제성 파지의 생산을 입증하였다. 엔도뉴클레아제 gp45에 결실을 함유하는 이러한 파지는 엔도뉴클레아제를 트랜스로 발현하는 조작된 균주에서만 복제할 수 있었다.
재료 및 방법:
파지 생산: DNA 벡터를 보유하는 씨. 아크네스의 20 mL의 조밀한 액체 배양물 (BHI + 에리쓰로마이신 5 μg/mL)을 대수기까지 성장시켰고, 원심분리시키고 200 μL의 씨. 아크네스 파지 PAC7 현탁물 (대략 107 PFU/μL)에 재현탁하였다 (대략 108-109 세포). 다음으로 혼합물을 30-60분 동안 RT에서 인큐베이션시켜서 감염이 일어나도록 하였다. 인큐베이션 후에, 20 mL의 BHI를 혼합물에 첨가하였고 밤새 37℃에 혐기성 조건 하에서 인큐베이션시켰다. 밤샘 인큐베이션 후, 배양물을 원심분리하고 0.2 μm 막 필터를 통해 여과시켰다.
탑 어세이: 50 μl의 파지 현탁물을 2 ml의 0.45% BHI 한천의 최종 혼합물로, 50 μl의 Ca0s22235 고 세포 밀도와 혼합하였다. 혼합물은 5 ug/ml 에리쓰로마이신이 보충된 BHI 한천 플레이트에 부었다. 상부층 플레이트는 37℃에 혐기성 조건에서 인큐베이션하였다.
참조문헌
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tgaactgtag gagatgtgtc ctgggtggct gatggttttc gggtattgtg 24720 ctagaggcat tacttgtcgc ttgtgttcca tgtgttgcgg gtgtcttggc cggcgtggtg 24780 ttgctggtag gcgaggagtg cgaggcagtg ccaggctgcg tgtgctagat ggggtagccc 24840 ggattcgtgg tcgaggttgt tgccttgctg ccatgatagt agatgcctgt agagggcgtc 24900 gacactgtgg ctccacgggt atcctccggt ccagttgttg tcgccatatt tggtggcacc 24960 gtatccggct acttcgccta gggcgtgaag ggatgctggg tcgatgaggg agagcctgca 25020 gagtttcaat tcttttcggg caccgctgtt ggggtcggtg tacatgcggg tgggctcatc 25080 catggggtgt gtgctcctta agggtgggtt actggttgtt gttgtgggct agggcggcgg 25140 cgagaataat gatggcgagg gtttcggcta tcagtatggg tgttgtgatc atttggtgtc 25200 tcggggattg ttggtgagtg ttgaggcacc caggagggtg gcgagggcgc atgcggcaat 25260 aatggcgagg gctgccttgt gtggggtgcc ggttgcgtac atccatgtga tgatggcacc 25320 ttggatccag gctaggctgg tgaagaaggt ttcgtagctg tgcagctcaa tgttgttgtt 25380 gggtgtgttc atgcttgctc ctgaagaatg gtgttgatgg ttttataaat gttgtacagg 25440 tcggtttcga tagataacag ttggttgatt tggtggtcga gatcaatgtc tgggttgagt 25500 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540 cagttgtcgg cacaggtggc ccagtcggtg aataagctgc atcacgatgt tggtgtggtt 600 caggttcaga atggtgattt gggtaaacgt gttgatgcct tgtcgtgggt gaagaatcct 660 gtgacgggga agctgtggcg cactaaggat gctttgtgga gtgtctggta ttacgtgttg 720 gagtgtcgta gccgtcttga caggctcgag tctgctgtca acgatttgaa aaagtgatgg 780 tggtttgttg tgggtaaaca gttttggtta ggtttgctgg agcgtgctct gaaaactttt 840 gttcaaacgt ttgttgccgt gttgggggtt actgcgggtg tcacctatac tgcggagtcg 900 tttcgtggtt tgccgtggga atccgcgctg atcacggcaa cggttgctgc tgtcctgtcg 960 gttgctacct cgtttggtag cccgtcgttt gtggccggca agcccggcaa gcagccccag 1020 gtggatgcgg gtttggttcc accggatgat gggggcttgg ttgagccgca tatggtggat 1080 gtgtcggatc ctggcatgat cgagccgacg gatgatgcgg atcttgccgg ctatgagcct 1140 cggcgtgcag ccgagtcgga ggttggcacg gtagagtcta ctgttgcata attgaatata 1200 gatgtgtgcc ccagcggtgc tgccacgatt gtgtggtggc ggctgctggg gcactatttt 1260 tgtatatgcg gtgtggtcat catcagagcc aggcagggtc ggcgaggagg gtttgcagtt 1320 cgtcagtcag acgggcggtg tggaacccgt cggccgccgc gtggtggatc tggaccgaaa 1380 gtggcagcag gaggcgagcg tcacgctctg tgtaacggcc gagagtgaag atcggtgcca 1440 ggtgatccca accgtcacgg atatcaagag tgaatccggt gaaggaggcc cacggcaggg 1500 aggacacatc gaaagcgtta gggggggggt ttccctgcgg gaagaagtcg gtggcgcggg 1560 agtgctcggc cagcaacggg gcagcggtat cgtggaaggt gccgaagtct gggtcgtacg 1620 gagcccacac acaggcgaag gtctctcgtt ccggattgaa aacggtgaag gctgggtgga 1680 cgaccggcca gacagcgggg tcgccggagg ccgtcaggca catacggaac tcctcgtgtc 1740 ggttgacgac ggtggccaaa gcccacacct gggccaagta cgatttgcgc ggggagcggc 1800 gcagggcggc cgcgaaggcg gtcacgtcca cctcgacggt catggcgtaa gtgcagggca 1860 cgcgacgacg gtagtggtcg aagtgctgcc ggcgcggcca cgtgtccagg tcgattgggg 1920 ccggggtcgg gatcggggcg tccatctcag taggtccctt tctgtccgtt gcgcggcgtc 1980 cccgacgctc ttactgcagg agactcttcc aaggccgcgg ccgttctgac ggcaactggg 2040 agagaatatc aactctgccc attaggcgcg aatcctgatg cgagatgaga tattgccgac 2100 cgaggagaag cccccaaaga aattccacgc tcagcgggct caactgacgc cccaagagaa 2160 ccggacccgc ccaggccgca ccccctatga ttcgttgctg tcgatggtgt cttcgagcat 2220 ctgatacagg tggaggcagg tagagatagt ttcgctggcc tgatcgagaa cgttccggcc 2280 gataacgttt ttgtggttgt cgcggtggcg gatgatagcc cacatgatct cgtcggctgc 2340 cgcctgtaat agtttggcct ggtatgcgat tccggcgagc cagtctagtg cttcctggct 2400 tgtatagggg ctctggtcct cgctgttgcc gcgggtgttg ctgttgtttg tggggtgtcc 2460 tgcactgtcg catagccaca ggatttcgct gcactcgtct agcgtgtctt ggtcgatagc 2520 gagatcgtcg aggctgacat tgttgacggt aaggttcacg ttgtcgaggg agatgggtac 2580 accgtactgg ttttcgacac tgtcaacaat gttttccagc tgttgcatgt tggtgggctg 2640 ttgttggacg atacggtgta tcgctgtgtt gagggtggtg taggtgatgt tgtgtgtgtt 2700 gtccatggtt tttatgccat tccttcgtta tcgtctggca tgtagtatgt gctgtttgcg 2760 tactcggtta acgtcatcag tgtttggtct gcccactgtt tcacggtttg ccgggtgact 2820 ccgagtcgtt gggcggctgt ggcgtaggtt tgatcatacc cgtatacttc ccggaatgct 2880 gccaacctag ctaggtgttt cctctgtttg gatggttcac aggtgagggt gtagtcgtcg 2940 atggctagct gtagatcgat catggagacg atgttgttgc cgtggtgttg tggcgcggt 2999 <210> 113 <211> 383 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAC7 wt 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Claims (31)

  1. 재조합 씨. 아크네스 (C. acnes) 파지.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 이식유전자를 포함하는 것인 재조합 씨. 아크네스 파지.
  3. 제2항에 있어서, 상기 이식유전자는 CRISPR-Cas 시스템 또는 CRISPR-Cas 시스템의 일부인 재조합 씨. 아크네스 파지.
  4. 제2항에 있어서, 상기 이식유전자는 항원을 코딩하는 DNA 인 재조합 씨. 아크네스 파지.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 재조합 파지의 숙주 범위는 상응하는 야생형 씨. 아크네스 파지의 숙주 범위와 상이한 것인 재조합 씨. 아크네스 파지.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조작된 캡시드를 포함하는 것인 재조합 씨. 아크네스 파지.
  7. 제6항에 있어서, 항원은 조작된 캡시드의 표면에 표시되는 것인 재조합 씨. 아크네스 파지.
  8. - 씨. 아크네스 파지 게놈과 상동성 재조합을 위한 DNA 주형,
    - 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원, 및
    - 임의로 씨. 아크네스에서 DNA 벡터의 선택을 허용하는 제1 선택 마커
    를 포함하는 재조합 DNA 벡터를 보유하는 씨. 아크네스 세포.
  9. 제8항에 있어서, 씨. 아크네스 파지 게놈은 상기 세포로 도입되는 것인 씨. 아크네스 세포.
  10. 제8항에 있어서, 씨. 아크네스 파지 게놈은 DNA 벡터와 재조합되어서 재조합 파지의 생산이 일어나는 것인 씨. 아크네스 세포.
  11. 항원을 코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 DNA 벡터를 포함하는 씨. 아크네스 세포.
  12. - 씨. 아크네스에서 복제를 허용하는 복제 기원,
    - 상기 씨. 아크네스 세포에서 발현되지만 새롭게 생성된 재조합 씨. 아크네스 파지 게놈을 표적화하지 않는 CRISPR-Cas 시스템, 및
    - 임의로 씨. 아크네스에서 DNA 벡터의 선택을 허용하는 제1 선택 마커
    를 포함하는 재조합 씨. 아크네스 파지의 선택적 생산을 위한 DNA 벡터를 보유하는 씨. 아크네스 세포.
  13. 야생형 또는 부모 씨. 아크네스 파지 및 재조합 씨. 아크네스 파지를 함유하는 파지 용해물을 제조하기 위한 방법으로서, 야생형 또는 부모 씨. 아크네스 파지 게놈은 제8항의 씨. 아크네스 세포로 도입되는 것인, 제조 방법.
  14. 재조합 씨. 아크네스 파지를 선택하기 위한 방법으로서, 야생형 또는 부모 씨. 아크네스 파지 및 재조합 씨. 아크네스 파지를 함유하는 파지 용해물을 제12항의 씨. 아크네스 세포와 혼합하여서, 재조합 씨. 아크네스 파지의 선택적 생산을 일으키는 것인, 선택 방법.
  15. 씨. 아크네스 관련 장애 또는 질환을 치료하기 위한 방법으로서, 대상체에게제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항의 재조합 씨. 아크네스 파지, 또는 제13항 또는 제14항의 방법으로 수득된 재조합 씨. 아크네스 파지를 투여하는 단계를 포함하는 것인, 치료 방법.
  16. 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터를 포함하는 제11항의 씨. 아크네스 세포를 포함하는 백신 및/또는 면역원성 조성물.
  17. 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법으로서, 상기 대상체에게 종양 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터를 포함하는 제11항의 씨. 아크네스 세포의 치료적 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것인 예방 및/또는 치료 방법.
  18. 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법으로서, 상기 대상체에게 바이러스 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터를 포함하는 제11항의 씨. 아크네스 세포의 치료적 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것인 예방 및/또는 치료 방법.
  19. 박테리아 감염의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에서, 박테리아 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법으로서, 상기 대상체에게 박테리아 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터를 포함하는 제11항의 씨. 아크네스 세포의 치료적 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것인 예방 및/또는 치료 방법.
  20. 진균 감염의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 진균 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법으로서, 상기 대상체에게 진균 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터를 포함하는 제11항의 씨. 아크네스 세포의 치료적 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것인 예방 및/또는 치료 방법.
  21. 자가면역 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법으로서, 상기 대상체에게 자기-항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터를 포함하는 제11항의 씨. 아크네스 세포의 치료적 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것인 예방 및/또는 치료 방법.
  22. 알레르기의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 알레르기를 예방 및/또는 치료하기 위한 방법으로서, 상기 대상체에게 알레르겐을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터를 포함하는 제11항의 씨. 아크네스 세포의 치료적 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것인 예방 및/또는 치료 방법.
  23. 이식 거부의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 이식 거부를 예방 및/또는 치료하기 위한 방법으로서, 상기 대상체에게 이식편-특이적 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터를 포함하는 제11항의 씨. 아크네스 세포의 치료적 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것인 예방 및/또는 치료 방법.
  24. 씨. 아크네스 관련 장애 또는 질환을 치료하기 위한 방법에서 사용을 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항의 재조합 씨. 아크네스 파지 또는 제13항 또는 제14항의 방법으로 수득된 재조합 씨. 아크네스 파지.
  25. 제11항에 있어서, 대상체에서 암을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법에서 사용을 위한 종양 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터를 포함하는 것인 씨. 아크네스 세포.
  26. 제11항에 있어서, 대상체에서 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법에서 사용을 위한 바이러스 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터를 포함하는 것인 씨. 아크네스 세포.
  27. 제11항에 있어서, 대상체에서 박테리아 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법에서 사용을 위한 박테리아 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터를 포함하는 것인 씨. 아크네스 세포.
  28. 제11항에 있어서, 대상체에서 진균 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법에서 사용을 위한 진균 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터를 포함하는 것인 씨. 아크네스 세포.
  29. 제11항에 있어서, 대상체에서 자가면역 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법에서 사용을 위한 자기-항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터를 포함하는 것인 씨. 아크네스 세포.
  30. 제11항에 있어서, 대상체에서 알레르기를 예방 및/또는 치료하기 위한 방법에서 사용을 위한 알레르겐을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터를 포함하는 것인 씨. 아크네스 세포.
  31. 제11항에 있어서, 대상체에서 이식 거부를 예방 및/또는 치료하기 위한 방법에서 사용을 위한 이식편-특이적 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 벡터를 포함하는 것인 씨. 아크네스 세포.
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