JP2003530872A

JP2003530872A - 免疫原肺炎連鎖球菌タンパク質とそのワクチン組成物

Info

Publication number: JP2003530872A
Application number: JP2001578467A
Authority: JP
Inventors: ケーニッグ，スコット; ジョンソン，レスリー，エス．; アマダウ，ジョン，イー．
Original assignee: メディミューン，インコーポレイテッド
Priority date: 2000-04-27
Filing date: 2001-04-27
Publication date: 2003-10-21
Also published as: US6689369B2; WO2001081380A3; AU5577201A; CA2407455A1; WO2001081380A2; US20030166844A1; EP1278856A2; AU2001255772B2

Abstract

(57)【要約】本発明は肺炎球菌感染、とりわけ肺炎連鎖球菌属による感染の予防および処置のための新規な免疫原ポリペプチド、およびその治療活性断片、ならびにワクチンとワクチン組成物に関する。本発明は更に開示されたポリペプチドに対する抗体、ならびに疾病の予防およびまたは処置に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】

本出願は２０００年４月２７日に受理された合衆国暫定特許出願番号第６０／
２０００７４号に基づく優先権を主張し、その開示はここでその全体を引用例と
して本出願に組み込まれている。

【０００２】本発明は細菌感染に対する防御のためのワクチンおよびワクチン組成物の成分
として用いられる細菌表面タンパク質とその用途の分野に関する。

【０００３】

【背景技術】

肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）はグ
ラム陽性細菌であり、それは動物およびヒトの侵襲性感染症、例えば敗血症、髄
膜炎、中耳炎、大葉性肺炎などでの主要な作因となる（トゥオマネン他、ニュー
・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン、３２２巻、１２８０〜１２８
４ページ（１９９５年））。感染過程の一部として、肺炎球菌はレクチン状のや
り方で真核細胞炭水化物との結合により、上部および下部気道の非炎症性ヒト上
皮細胞と容易に結合する（カンデル他、マイクロビアル・パソロジー、１７巻、
３６１〜３７４ページ（１９９４年））。結合細菌の侵襲性肺炎感染への変換は
炎症性因子の局所生成を伴い、それは上皮細胞を活性化してその表面で受容体の
数と型を変化させる（カンデル他、ネイチャー、３７７巻、４３５〜４３８ペー
ジ（１９９５年））。明らかにそのような一つの受容体である血小板活性因子（
ＰＡＦ，パフ）は肺炎球菌により係合され、また非常に短時間、多分ＰＡＦの出
現に続く分単位の間に肺炎球菌生体は強力に高められた組織への粘着性と侵襲を
示す。ある可溶性受容体類似体は肺炎球菌感染の進行を防ぐことが示された（イ
ダンパーン−ヘイキーラ他、ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディシーズ
、１７６巻、７０４〜７１２ページ（１９９７年））。他のタンパク質が肺炎連
鎖球菌の病原性に関連してきていることが示唆されてきているが、大多数の遺伝
子産物は特徴付けられていない。

【０００４】かくして、各種の肺炎連鎖球菌血清型に対し防御を提供するためのワクチンと
して、またワクチン組成物の成分として使用するために肺炎連鎖球菌の各種の菌
株から共通にエピトープを持つポリペプチドの特徴付けられたサンプルを持つこ
とはきわめて有利であろうけれども、そのような源から精製およびまたは特徴付
けられたポリペプチドの欠除は、このような試験と評価に対するきびしい障害を
示してきた。本発明はこの問題を、肺炎球菌から誘導される組換えポリペプチド
を提示された防御能力と共に提供することにより解決する。

【０００５】

【発明の開示】

本発明の目的は、治療有効ワクチンおよびワクチン組成物を形成するのに使用
される分離およびまたは精製されたポリペプチド物質ならびにそれらをコード化
するポリヌクレオチドを提供することである。

【０００６】更に、本発明の目的は、細菌を原因とする疾病、とりわけ肺炎連鎖球菌の１個
またはそれ以上の菌株により生じる疾病の予防およびまたは処置に治療活性を持
つワクチンおよびワクチン組成物を提供することである。

【０００７】本発明のも一つの目的は、診断および治療用途の両方に役立ち得る本発明のポ
リペプチドに特異的なポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかの抗体を
提供することである。

【０００８】本発明の更なる目的は、肺炎球菌生体により起きる疫病の予防および処置のた
めのプロセスを提供することであり、ここで前記予防およびまたは処置はここで
開示されたポリペプチドを含むワクチンまたはワクチン組成物の使用に依存する
。このような予防およびまたは処置は、更に本発明のポリペプチドに特異的な抗
体を含む組成物に依存する。

【０００９】本発明の更なるも一つの目的は、その予防および治療活性断片を含むそのよう
なポリペプチドを組み込んだワクチンの生産並びにそのようなポリペプチドで見
出されるエピトープに特異的な抗体の産生のために、新規な肺炎球菌ポリペプチ
ドの組換え産生のためのプロセスを提供することである。このようなプロセスは
、ここで開示されたポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む組換え
ベクターと細胞の産生を含むことができる。

【００１０】

【発明の説明】

本発明は、一般に例えばヒトおよび動物が免疫応答を刺激する免疫原物質とし
ての細菌抗原およびその用途の分野に関する。より特異的には、本発明は広範囲
の病原性肺炎連鎖球菌属の血清型による感染に対しワクチン受容者を防御する抗
体の産生を刺激する機構として、肺炎連鎖球菌種から得られるポリペプチドで哺
乳種にワクチン接種することに関する。

【００１１】本発明は更に、（ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかである）そ
の抗体がそのような肺炎球菌感染の診断およびまたは受動免疫療法に用途を見出
すこのようなポリペプチドに対する抗体に関する。

【００１２】ある特異的実施例において、本発明は肺炎球菌により起こる中耳、鼻咽頭、肺
および気管支領域、血液、脳脊髄液、その他の感染などのような肺炎球菌感染の
予防およびまたは処置に関する。

【００１３】前記に従って、本発明は配列識別番号４に示されるアミノ酸配列を含む精製ポ
リペプチドに関する。しかし本発明は十分に広く、配列識別番号４のアミノ酸配
列に少なくとも約８０％の同一性、望ましくは少なくとも約９０％の配列同一性
、または相同性、もっとも望ましくは配列識別番号４のアミノ酸配列に少なくと
も９５％の同一性、とりわけ配列識別番号４のアミノ酸配列に少なくとも約９８
％の同一性で配列識別番号４のアミノ酸配列を持つポリペプチドが望ましい実施
例にある同一性を持つポリペプチドに関する。

【００１４】本発明に従って、配列を引用する場合に「パーセント同一性」または「パーセ
ント同一である」という用語は、パーセント相同性を含めて、記載されまたは特
許請求された配列（「基準配列」）と比較されるように配列が整列（「比較配列
」）された後で前記配列が特許請求の範囲または記載された配列（前記基準配列
）と比較されることを意味する。従って、パーセント同一性は下記の式のように
定義される。

【００１５】パーセント同一性＝１００［１（Ｃ／Ｒ）］ここでＣは、前記基準配列と比較配列の全長にわたってこれら基準配列と比較
配列の間に存在する差の数であり、ここで（ｉ）比較配列内の対応する塩基またはアミノ酸を持たない基準配列内に存在
する各塩基およびアミノ酸、（ii）基準配列内に存在する各間隙、および（iii）基準配列内にあり、比較配列内にある整列された塩基またはアミノ酸
とは異なる整列された各塩基またはアミノ酸、が一つの差を構成する。またここでＲは、比較配列の整列の全長にわたり基準配
列内にある塩基またはアミノ酸の数であり、基準配列に生成されたいずれの間隙
も塩基またはアミノ酸として計数される。

【００１６】一つの整列が、比較配列と基準配列の間にあって、またこの基準配列に対して
前記計算されたパーセント同一性がある特定のパーセント同一性にほぼ等しいか
またはそれより大である場合には、前記比較配列は前記基準配列に対して特定の
最小パーセント同一性を持つことになり、これは前記計算されたパーセント同一
性が特定のパーセント同一性よりも少ない場合であっても整列が存在することで
パーセント同一性を持つことになる。

【００１７】本発明は更に演繹アミノ酸配列（配列識別番号４）を持つポリペプチド、同じ
くこのようなポリペプチドの断片、類似体および誘導体に関する。

【００１８】ポリペプチド（配列識別番号４）に関して「断片」、「誘導体」および「類似
体」という用語は、このようなポリペプチドと同一の生物的機能または活性を本
質的に保持するポリペプチドを意味する。かくして一つの類似体は活性で成熟し
たポリペプチドを生成するためにプロタンパク質の切断により活性化できるプロ
タンパク質を含む。このような断片、誘導体および類似体は天然ポリペプチドの
活性が保持されるように、配列識別番号４のポリペプチドに十分な類似性を持つ
に違いないであろう。

【００１９】本発明のポリペプチドは組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポ
リペプチドであることができ、望ましくはそれは組換えポリペプチドである。

【００２０】ポリペプチド（配列識別番号４）の断片、誘導体または類似体は、（ｉ）１個またはそれ以上のアミノ酸残基が、保存配列または非保存配列のア
ミノ酸残基（望ましくは保存配列のアミノ酸残基）で置換され、このような置換
アミノ酸残基が遺伝コードによりコード化されるか、またはコード化されないも
の、または（ii）１個またはそれ以上のアミノ酸残基が１個の置換基を含むもの、または（iii）成熟ポリペプチドがポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例え
ばポリエチレングリコールなど）と融合されたもの、または（iv）付加されたアミノ酸が例えばリーダー配列または分泌配列、あるいは成
熟ポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精製のために使用される配列、など
のいずれであることができる。このような断片、誘導体および類似体はここで開
示される教訓から通常の技術を持つ者の範囲内にあるものと見做される。

【００２１】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは望ましくは分離された形態で
提供され、また望ましくは均質性に精製される。

【００２２】「分離された」という用語は、その物質がそのもとの環境（例えばそれが自然
発生の場合には、自然の環境）から取り出されることを意味する。例えば生きた
動物内に存在する自然発生ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは分離されない
が、自然系内に共存する物質の一部または全部から取り出された同じポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドは分離される。このようなポリヌクレオチドはベクタ
ーの一部となり得るし、およびまたはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドは組成物の一部となることができ、しかもなおこのようなベクターまたは
組成物がその自然環境の一部とはならないように分離し得る。

【００２３】異なる実施例では、本発明は配列識別番号４のアミノ酸配列に少なくとも約８
０％同一である、望ましくは配列識別番号４のアミノ酸配列に少なくとも約９０
％同一である、もっとも望ましくは配列識別番号４のアミノ酸配列に少なくとも
約９５％同一である、とりわけ前記分離ポリペプチドが配列識別番号４のアミノ
酸配列に少なくとも約９８％同一である、またもっとも特別には前記分離ポリペ
プチドが配列識別番号４のアミノ酸配列を持つポリペプチドを含む場合のアミノ
酸配列を含む分離ポリペプチドに関する。これらは前記分離ポリペプチドのいず
れかの免疫原活性断片を含んでいる。

【００２４】従来の技術で知られるように、２個のポリペプチドの間の「類似性」は、１個
のポリペプチドのアミノ酸配列とその保存アミノ酸置換物を第２のポリペプチド
の配列と比較することにより決定される。

【００２５】本発明のポリペプチドの断片または部分は、ペプチド合成により対応する全長
ポリペプチドを産生するために使用される。従って、断片は全長ポリペプチドを
産生するための中間体として使用できる。本発明のポリヌクレオチドの断片また
は部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成するために使用される。

【００２６】本発明は更に配列識別番号３のヌクレオチド配列、同じく配列識別番号３のヌ
クレオチド配列を持つポリヌクレオチドを含む分離およびまたは精製されたポリ
ヌクレオチドに関する。しかし本発明のポリヌクレオチドは、配列識別番号４の
ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列に少なくとも６５％同一であ
るヌクレオチド、望ましくは配列識別番号４のポリペプチドをコード化するヌク
レオチド配列に少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を持つポリヌクレ
オチド、もっとも望ましくは配列識別番号４のポリペプチドをコード化するヌク
レオチド配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を持つポリヌクレ
オチド、とりわけ配列識別番号４のアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配
列に少なくとも約９８％同一であヌクレオチド配列をポリヌクレオチド配列を持
つ場合のようなヌクレオチド配列をも包含するほど十分広く定義され、配列識別
番号４のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドがとりわけ望ましい。か
くして配列識別番号３のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドはとりわけも
っとも望ましい。

【００２７】ここで、使用され別途記載のものを除き、すべての用語は以下のように定義さ
れる。

【００２８】本発明に従って、「ＤＮＡセグメント」という用語は、分離された断片の形状
または大きなＤＮＡ構築物の一成分して、少なくとも一度は事実上純粋な形態で
分離されたＤＮＡから誘導されたＤＮＡポリマーを引用し、ここで純粋な形態と
は、内因性汚染物質を含まず、そのＤＮＡポリマーの量または濃度が前記セグメ
ントとその成分の同定、操作および回収を通常の生化学的方法、例えばクローニ
ングベクターを使用することにより実行可能である程度に純粋であることを引用
する。このようなセグメントは、内部の翻訳されない配列、または真核遺伝子に
典型的に存在するイントロンにより遮断されないオープンリーディングフレーム
の形態で提供される。翻訳されないＤＮＡの配列はオープンリーディングフレー
ムから下流、すなわちコーディング領域の操作または発現で干渉されない位置に
存在する。

【００２９】本発明に従って開示された核酸およびポリペプチド発現産物、同じくこれらの
核酸およびまたはこのようなポリペプチドを含有する発現ベクターは、「濃縮形
態」にある。ここで使用されるように、「濃縮」という用語は、物質の濃度が例
えば自然濃度の少なくとも約２，５，１０，１１０または１０００億であること
を意味し、有益には重量で０．０１％、望ましくは重量で少なくとも約０．１％
である。重量で約０．５％、１％、５％、１０％および２０％の濃縮調製物も考
えられる。本発明の配列、構築物、ベクター、クローンおよびその他の物質も望
ましくは濃縮または分離された形で存在する。

【００３０】ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）に関連する本発明の記述で「分離さ
れた」という語は、その物質がそのもとの環境（例えばそれが自然発生の場合に
は、自然の環境）から取り出されることを意味する。例えば生きた動物内に存在
する自然発生ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは分離されないが、自然系内
に共存する物質の一部または全部から取り出された同じポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドは分離される。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部とな
り得るし、およびまたはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成
物の一部となることができ、しかもなおこのようなベクターまたは組成物がその
自然化環境の一部とはならないように分離し得る。本発明のポリペプチドおよび
ポリヌクレオチドは望ましくは分離された形態で提供され、また望ましくは均質
に精製される。

【００３１】本発明に従って開示されたポリヌクレオチド、および組換えまたは免疫原ポリ
ペプチドは「精製された」形態にある。「精製された」という用語は、必ずしも
絶対的な純度を必要とはしない。むしろそれは相対的な定義として意図されたも
のであり、関連する技術に通じた人々にその用語が理解されるようにきわめて高
く精製された調製物も、また部分的に精製された調製物を含むことができる。例
えばｃＤＮＡライブラリーから分離された個々のクローンは、電気泳動的物質性
まで従来の方法で精製されている。出発物質または自然物質の精製は、１桁、望
ましくは２桁または３桁、より望ましくは４乃至５桁の大きさまでのものが特に
考慮される。更に重量で望ましくは０．００１％、または少なくとも０．０１％
、あるいは０．１％、より望ましくは重量で１％またはそれ以上の純度を持つ請
求されたポリペプチドが特に考慮される。

【００３２】「コーディング領域」という用語は、自然ゲノム環境において、遺伝子の発現
産物に対して自然にまた正常にコードする遺伝子のその部分を引用する。すなわ
ちこれは、生体内で遺伝子の生得の発現産物に対してコードする領域である。こ
のコーディング領域は正常な、変異された、または変異された遺伝子から、また
さらにＤＮＡ配列または遺伝子から、ＤＮＡ合成に関して通常の領域を有する者
により周知の方法により実験室内で合成することができる。

【００３３】本発明に従って、「ヌクレオチド配列」という用語は、デオキシリボヌクレオ
チドのヘテロポリマーである。一般に本発明により提供されるタンパク質をコー
ド化するＤＮＡセグメントは、ｃＤＮＡ断片と短いオリゴヌクレオチドリンカー
から、または一連のオリゴヌクレオチドから組立てられ、かくして微生物または
ウイルスオペロンから誘導される調節要素より成る組換え転写単位内で発現され
ることが可能な一つの合成遺伝子を提供する。

【００３４】本発明に従ってポリペプチドのコーディングのためのＤＮＡ構築物の形成に際
し、ポリメラーゼ連鎖反応のための前進および復帰プライマーがそれぞれ配列識
別番号１および２で与えられる。

【００３５】「発現産物」という用語は、遺伝コード縮重および同じアミノ酸のコーディン
グの結果生じる遺伝子およびいずれかの核酸配列コーディング等量の自然翻訳産
物であるポリペプチドまたはタンパク質を意味する。

【００３６】コーディング配列に関連する場合に、「断片」という用語は、発現産物が完全
なコーディング領域の発現産物としての同一の生物機能または活性を基本的に保
持する完全なコーディング領域以下より成るＤＮＡの部分を意味する。

【００３７】「プライマー」という用語は、ＤＮＡの１個の鎖と対になり、ＤＮＡポリメラ
ーゼがデオキシリボヌクレオチド鎖の合成を開始する遊離３′−ＯＨ末端を提供
する短い核酸配列を意味する。

【００３８】「プロモーター」という用語は、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼを
連結することを伴うＤＮＡの領域を意味する。

【００３９】「オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）」という用語は、終止コドンなし
でアミノ酸をコード化する一連の三塩基連鎖であって、タンパク質に（潜在的に
）翻訳可能な配列である。

【００４０】ここで使用されるように、ＤＮＡ配列の引用は、一本鎖と二本鎖ＤＮＡの両方
を含む。かくして前後で特に指示しない限り、特異的な配列はそのような配列の
一本鎖ＤＮＡ；その補体を伴う配列の二重鎖と、そのような配列の補体とを引用
する。

【００４１】ここで使用されるように、ポリペプチドとの関連で使用された場合、「部分」
「セグメント」および「断片」という用語は、アミノ酸配列残基などの連続配列
を引用し、その配列はより大きな配列のサブセットを形成する。例えばポリペプ
チドがトリプシン、またはキモトリプシンなどの一般のエンドペプチダーゼで処
置された時には、このような処置から生じるオリゴペプチドは、出発ポリペプチ
ドの部分、セグメントまたは断片を表すものとなる。ポリヌクレオチドとの関連
で使用された場合には、このような用語は、いずれか一般のエンドヌクレアーゼ
と共に前記ポリヌクレオチドの処置により産生される産物を引用する。

【００４２】本発明に従って利用される技術の適用に際して、多くの従来の分子生物学手順
とプロトコルが文献で見出され、従来の技術に習熟した人には周知である。より
有用な引用例の源として、以下のものがある：サムブルック他、分子クローニン
グ；研究室マニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク（１９８９年）、ウー、他、遺伝子バイオテクノロジーの方法（ＣＲＣプレス
、ニューヨーク、ニューヨーク、（１９９７年）、および組換え遺伝子発現プロ
トコル、分子生物学での方法、所収、６２巻、所収（トゥーアン編、フマーナプ
レス、トトワ、ニュージャージー、１９９７年）、これらの開示はここで引用例
として組み込まれている。

【００４３】本発明は更にワクチン、またはワクチン組成物に関し、それは本発明に従って
開示されたポリペプチドおよびその免疫断片から選択されたその免疫原断片を含
むポリペプチドより成り、ここで前記ポリペプチドと断片は薬理許容担体内にあ
り、またここで前記ポリペプチドおよびまたは断片は動物に連鎖球菌属の生体に
対して抗体、望ましくは防御抗体を活かすのに有効な量で存在する。

【００４４】本発明のワクチンは、前述の通り配列識別番号４のポリペプチドなどのような
ここで開示されたポリペプチドの免疫原活性断片を含み、このような場合には、
その断片は一般に大きさが変化するものであり、しかし一般には長さで少なくと
も約２００のアミノ酸残基プラスマイナス５残基、望ましくは長さで少なくとも
２５０のアミノ酸残基、またもっとも望ましくは長さで少なくとも２７０のアミ
ノ酸残基プラスマイナス約５残基である免疫原断片であろう。

【００４５】本発明のワクチン組成物もまたここで開示されたポリヌクレオチドを含むこと
ができる。

【００４６】一般にワクチンは水溶性または懸濁液の形で注射用に調製される。油脂基材内
のワクチンも吸入用として周知である。使用前に溶解または懸濁される固形形態
のものも調製される。薬理許容担体、希釈剤および賦形剤は活性成分と適合し薬
用に許容されるものが添加される。

【００４７】ここで有用な薬用組成物は、いずれかの適切な希釈材または賦形剤を含む薬理
許容担体を含有し、それはこの組成物を受け入れる個体に有害な抗体の産生をそ
れ自身誘導しないいずれかの薬剤を含み、また適切でない毒性なしで投与される
ものである。薬理許容担体は必ずしもそれに限定されないが、水、食塩水、グリ
セロールおよびエタノールその他の液体を含み、鼻および他の気道での運搬また
は眼科系への運搬のためのスプレーを形成するのに有用な担体を含む。薬理許容
担体、希釈剤および他の賦形剤についての十分な議論がレミントン薬剤科学（マ
ック・パブリッシング・カンパニー、ニュージャーシー、最新版）に提出されて
いる。

【００４８】ワクチン組成物は、ワクチンの効果を改良するのに役立ち得るｐＨを安定させ
、またはアジュバント、加湿剤あるいは乳化剤として機能する追加物質をとり込
むことができる。

【００４９】ワクチンは一般に非経口投与用に調製され、皮下または筋肉内に注射される。
このようなワクチンは更に、周知の技術を利用して坐薬としてまたは経口投与用
に調製され、あるいは鼻または呼吸ルートを経由する投与用に調製される。

【００５０】病原性細菌、ウイルス、または他の微生物に対し免疫を与えるのに十分なワク
チン量はこの分野で周知の方法により決定される。この量はワクチン受容者の特
性と免疫水準に基づいて決定されるであろう。典型的には、投与されるワクチン
量は熟練した医師の判断により決定されるであろう。ワクチンが皮下または筋肉
内注射で投与される場合には、０．５乃至５００μｇの範囲の精製タンパク質が
与えられる。本発明で有用なように、このような投与量は一般に約１μｇ、多分
１０μｇ、あるいは５０μｇ、また１００μｇから５００μｇまでの免疫原タン
パク質、または免疫原ポリペプチドもしくはその免疫原活性断片を提供すること
で十分である。加えて１個以上のこのような活性物質がワクチン内に存在しても
よい。かくして１個以上の抗原構造物が、ここで開示される方法で使用するため
にワクチンまたはワクチン組成物の調製に使用される。これはそれぞれの濃度で
量的に等しいか、または決まったまたは決まっていないいずれかの比率で存在す
るように形成されるかの組合せの場合にのみ、免疫原活性を示す２個またはそれ
以上の個別の免疫原タンパク質またはポリペプチド、タンパク質またはポリペプ
チドを含む。かくしてここで開示されたプロセスに使用されるワクチン組成物は
、１個またはそれ以上の免疫原タンパク質、１個またはそれ以上の免疫原ポリペ
プチド、およびまたは前記免疫原タンパク質およびポリペプチドの抗原断片より
成る１個またはそれ以上の免疫原活性免疫原を含み、後者の断片は、本発明の用
途により選択されたいずれかの割合で存在する。本発明の方法に有用なワクチン
、およびワクチン組成物を作るのに必要な正確な成分、およびそれぞれの量は、
とりわけ処置または予防される疾病の性質、それが既に存在する場合そのような
異常の発病度、年齢、性、および受容者の一般健康状態、同じくこれらの方法を
利用する研究者および臨床家の職業的経験と性向により決定される。

【００５１】本発明は、更に本発明に基づき開示されたいずれかのポリペプチドから選択さ
れた免疫原断片を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドより成るワ
クチン組成物の用途を熟慮し、ここで前記ポリヌクレオチドは、薬理許容担体に
懸濁され、またここで前記ポリヌクレオチドは連鎖球菌属の生体に対し、動物内
に防御抗体を引き出すのに有効な量で存在する。

【００５２】本発明は、更にここで開示されたポリペプチド、およびその免疫原断片よりな
るグループから選択されるポリペプチドに特異的に結合する分離抗体に関する。
このような分離抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であることが
できる。

【００５３】更に本発明のも一つの見地は、（すなわち、天然源からの精製により、または
クローニングもしくは直接化学合成により生成されたかのどのように調製された
かに拘りなく、モノクローナルまたはポリクローナル、天然または組換えの）１
個またはそれ以上の抗体を使用する方法に関し、望ましくは必ずしもそれが必要
でないが、本発明の方法で使用のために選択されたワクチンまたはワクチン組成
物に存在する１個またはそれ以上の抗原決定基に特異的な抗体を使用する方法に
関する。

【００５４】かくして本発明は、ここで開示された１個またはそれ以上の分離抗体より成る
一つの組成物に関し、ここで前記抗体は前に記載された適切または等量の希釈剤
または賦形剤を含む薬理許容担体に懸濁され、ここで前記抗体は、連鎖球菌属の
生体に対して動物を防御するように治療有効量で前記組成物に存在する。

【００５５】本発明は、更に疾病を指示し処置するのに予防または治療有効的なやり方で、
ここで開示されたワクチン組成物と抗体組成物を使用する方法に関する。かくし
て本発明は、本発明に従ってここで開示されたワクチン組成物の治療有効量を動
物に投与することより成る連鎖球菌属の一構成員による感染症に感染し、または
その感染の危険のある動物、とりわけ前記動物がヒト患者である場合にその感染
症を予防しまたは弱める方法に向けられる。

【００５６】本発明は、更に連鎖球菌属の一構成員により生じる感染症に感染し、またはそ
の感染の危険にある動物でその感染症を予防しまたは弱める方法に関し、それは
本発明に基づいて、ここで開示された１個またはそれ以上の抗体の治療有効量を
動物、とりわけ望ましくは前記動物がヒト患者である場合には、ヒト患者に投与
することにより成り、ここで前記抗体は、前記感染症を予防しまたは弱めるのに
有効な量で投与される。

【００５７】疾病、とりわけ連鎖球菌疾病の処置に有用である本発明のワクチン組成物は、
ここで開示されたように精製され、または分離されたポリペプチド、およびその
免疫原活性断片を含むものに限定されるのではなく、微生物が免疫系に免疫原ポ
リペプチド、またはその断片を発現し、また指定する微生物で形成される組成物
も含む。本発明の方法で用途を見出すこのような微生物は、他の合併症またはあ
り得る重複感染を避けるように適切に弱めることができる。

【００５８】かくして本発明は、ポリヌクレオチドで形質転換された微生物有機体を含むワ
クチン組成物を含み、それにより配列識別番号４のポリペプチドおよびその相同
ポリペプチドなどのようなここで開示されたポリペプチドより成るグループから
選択されたポリペプチドまたはその免疫原断片を発現するワクチン組成物を含む
。

【００５９】このようなワクチン組成物を利用するに際し、本発明の方法でもっとも多く用
途を見出す微生物は必ずしもそれに限定されないが、サルモネラ属、ミコバクテ
リウム属、連鎖球菌属、ポックスウイルス、およびアデノウイルスより成るグル
ープを含む。

【００６０】本発明はまた、ここで開示されたポリヌクレオチドを含むベクターに関する。

【００６１】本発明は、更に前記細胞にとり込まれたそのゲノム内、またはベクター内、ま
たは他の染色体外ポリヌクレオチド内を含む組換え細胞に関し、ここで前記ポリ
ヌクレオチドは、ここで開示された配列から選択された配列を持つ。このような
細胞は、本発明のポリペプチドを発現しまた分泌する手段としての用途を持ち、
更にこのようなポリペプチドを産生するよう遺伝子操作された哺乳類細胞を含み
、後者は、一般にこのような組換え細胞内に存在する本発明のポリヌクレオチド
によりコード化される。このような目的のために、「発現する」という用語は、
前記タンパク質の分泌を含むし、または含まないものであってもよい。かくして
組換え細胞がポリペプチドを内部的にのみ合成し、そのポリペプチドが次に細胞
を溶離し、ポリペプチドを溶離液から分離することにより収集しなければならな
い場合には、このプロセスは「発現する」または「発現」という用語に包含され
るであろう。

【００６２】本発明は、更に本発明のポリヌクレオチドである宿主細胞を含むベクターに関
し、この宿主細胞は本発明のベクターで遺伝子操作され、組換え技術により本発
明のポリペプチドの産生となる。

【００６３】宿主細胞は、本発明のベクター、例えばクローニングベクターまたは発現ベク
ターで遺伝子操作（形質導入、または形質転換あるいは形質移入）される。ベク
ターは、例えばプラスミド、ウイルス粒子ファージ等の形態にある。遺伝子操作
宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換細胞を選択し、あるいは本発明
の遺伝子を増幅するために適切に修飾された従来の栄養培地で培養することがで
きる。温度、ｐＨおよびその他のような培養条件は、発現のために選択された宿
主でこれまでに使用されたものであり、通常の技術を有する者にとっては明らか
であろう。

【００６４】本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチドを組換え法により産生するのに使
用できる。かくして例えばポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現する各種の
発現ベクターのいずれか一つに含まれる。このようなベクターは染色体、非染色
体および合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージ
ＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母菌プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡと
、また痘疹、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病などのウイルス
ＤＮＡとの組合せから誘導されるベクターを含む。しかし他のいずれかのベクタ
ーもそれが宿主内で複製可能であり生存可能であるならば使用することができる
。

【００６５】適切なＤＮＡ配列は、各種の手法でベクター内に挿入される。一般にＤＮＡ配
列は周知の手法で適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。このような
手法および他のものは、従来の技術の範囲内にあるものと見做される。

【００６６】発現ベクター内のＤＮＡ配列は、適切な発現制御配列（プロモーター）に操作
可能に連結されてｍＲＮＡ合成に向けられる。このようなプロモーターの代表的
な例としては、原核細胞または真核細胞あるいはそれらのウイルス内の遺伝子の
発現を制御するものとして知られているＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大
腸菌ｌａｃまたはｔｒｐ、ファージラムダＰ_Ｌプローモーターおよびその他のプ
ロモーターに言及することができる。また発現ベクターは、翻訳開始のためのリ
ボソーム結合部位および転写ターミネーターを含む。ベクターはまた、発現を増
幅するための適切な配列を含む。

【００６７】加えて発現ベクターは、望ましくは、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼあるい
は真核細胞培養のためのネオマイシン耐性、または大腸菌内でのテトラサイクリ
ンまたはアンピシリン耐性などのような、形質転換宿主細胞の選択のための表現
型特性を提供する１個またはそれ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。

【００６８】ここに記載された適切なＤＮＡ配列を含むベクター、同じく適切なプロモータ
ーまたは制御配列は、タンパク質を宿主が発現できるように適切な宿主を形質転
換するのに使用される。

【００６９】適切な宿主の代表的な例としては、大腸菌、ストレプトミセス属、ネズミチフ
ス菌などの細菌細胞；酵母菌などの真菌細胞；ショウジョウバエＳ２およびＳｐ
ｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓ黒
色腫などの動物細胞；アデノウイルス；植物細胞等がある。適切な宿主の選択は
この明細書での記載から従来の技術に習熟した者の範囲内にあるものと見做され
る。

【００７０】より詳細には、本発明は前に広範囲に記載した１個またはそれ以上の配列より
成る組換え構築物を含んでいる。この構築物は本発明の配列が前進または復帰方
向に配列して挿入されたプラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターを含
む。本実施例の望ましい見地において、前記構築物は更に例えば配列に操作可能
に連結されたプロモーターを含む調節配列を持つ。きわめて多数の適切なベクタ
ーおよびプロモーターが従来の技術に習熟した者に周知であり、商業的にも利用
可能である。下記のベクターがその例して知られており、細菌系では、ｐＱＥ７
０，ｐＱＥ６０，ｐＱＥ−９（製造業者キアーゲン）、ｐＢＳ，ｐＤ１０，ファ
ージスクリプト，ｐｓｉＸ１７４，ｐブルースクリプトＳＫ，ｐＢＳＫＳ，ｐＮ
Ｈ８Ａ，ｐＮＨ１６Ａ，ｐＮＨ１８Ａ，ｐＮＨ４６Ａ（製造業者ストラータジー
ン）；ｐＴＲＣ９９ａ，ｐＫＫ２２３−３，ｐＫＫ２３３−３，ｐＤＲ５４０，
ｐＲＩＴ５（製造業者ファルマシア）；真核系ではｐＷＬＮＥＯ，ｐＳＶ２ＣＡ
Ｔ，ｐＯＧ４４，ｐＸＴ１，ｐＳＧ（製造業者ストラータジーン），ｐＳＶＫ３
，ｐＢＰＶ，ｐＭＳＧ，ｐＳＶＬ（製造業者ファルマシア）などがそれである。
しかしいずれの他のプラスミドまたはベクターも、それが宿主細胞内で複製可能
でまた生存可能である限り使用することができる。

【００７１】プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベ
クター、または他のベクターを選択マーカーとして使用するいずれかの望ましい
遺伝子から選択することができる。２個の適切なベクターは、ｐＫＫ２３２−８
とｐＣＭ７である。とりわけ指示される細菌プロモーターは、ｌａｃ１，ｌａｃ
Ｚ，Ｔ３，Ｔ７，ｇｐｔ，ラムダＰ_Ｒ，Ｐ_Ｌおよびｔｒｐである。真核プロモー
ターは、ＣＭＶ即時初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、
レトロウイルスからのＬＴＲ_Ｓ、およびマウスメタロチオネイン−１である。適
切なベクターとプロモーターの選択は、この従来の技術の通常の知識の水準内に
ある。

【００７２】更なる実施例において、本発明は前記の構築物を含む宿主細胞に関する。宿主
細胞は哺乳類細胞などの高次の真核細胞、または酵母菌細胞のような低次の真核
細胞、あるいは細菌細胞などの原核細胞であることもできる。構築物の宿主細胞
への導入は、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥデキストラン仲介形質移入、
または電気窄孔法によって実行することできる。（デービス，Ｌ．，ジブナー，
Ｍ．，バッティ，Ｉ．，分子生物学の基本方法（１９８６年））。

【００７３】宿主細胞内の構築物は、組換え配列によりコード化される遺伝子産物を産生す
るために、従来のやり方で使用することができる。選択肢として、本発明のポリ
ペプチドは、従来のペプチド合成機により合成することができる。

【００７４】成熟タンパク質は、適切なプロモーターの制御の下で、哺乳類細胞、酵母菌、
細菌、または他の細胞で発現することができる。無細胞の翻訳系も、本発明のＤ
ＮＡ構築物から誘導されるＲＮＡを用いるこのようなタンパク質を産生するのに
使用することができる。原核および真核宿主を共に使用される適切なクローニン
グおよび発現ベクターは、サムブルック他、分子クローニング：研究室マニュア
ル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８９年）に
記載されており、その開示内容はここに引用例として組み込まれる。

【００７５】高次の真核細胞による本発明のポリペプチドをコード化するＤＮＡの転写は、
エンハンサーをベクター内に挿入することで増加する。エンハンサーはＤＮＡの
シス作用性エレメントであり、通常約１０乃至３００塩基対より成り、プロモー
ターに作用して並の転写を促進させる。実例としては、塩基対の複製起点の１０
０乃至２７０塩基対だけ後期側にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイ
ルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハ
ンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。

【００７６】一般に組換え発現ベクターは、複製起点、および細胞の形質転換を可能にする
選択マーカー、すなわち下流構造配列の直接転写に向う高度発現遺伝子から誘導
されるプロモーターを含む。このようなプロモーターは３−ホスホグリセリン酸
キナーゼ、α−因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質その他
の解糖酵素をコード化するオペロンから誘導することができる。異種構造配列は
、翻訳開始および終端配列、また望ましくは翻訳タンパク質の分泌を周辺質腔ま
た細胞外培地に向けることのできるリーダー配列を用いて適切な段階で組み立て
られる。選択肢として、前記異種配列は、望ましい特徴、例えば発現組換え産物
の安定化または単純化された精製などを付与するＮ末端同定ペプチドを含む融合
タンパク質をコード化することができる。

【００７７】細菌用の有用な発現ベクターが例えばＳＰ１３３タンパク質がその細胞から発
現されるべき場合、またはそのような細胞がワクチン組成物の成分として使用さ
れるべき場合には、望ましいタンパク質をコード化する構造ＤＮＡ配列と、適切
な翻訳開始および終結信号とを、機能プロモーターを持つ読み取り相に挿入する
ことにより構築される。ベクターはベクターのメンテナンスを確実にし、もし望
ましければ宿主内で増幅を提供するために１個またはそれ以上の表現型選択マー
カーと複製起点を含むであろう。形質転換用の適切な原核宿主は、大腸菌、枯草
菌、ネズミチフス菌、およびシュードモナス属、ストレプトミセス属、およびブ
ドウ球菌属の各種の種を含むが、他のものも同じく必要に応じて選択することが
できる。

【００７８】代表的であるが限定されない例として、細菌用の有用なベクターは、公知のク
ローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝的要素より成
る商業利用可能なプラスミドから誘導される選択マーカーおよび細菌複製起点を
含むことができる。このような商業的ベクターは、例えばｐＫＫ２２３−３（フ
ァルマチア・ファイン・ケミカルズ、ウプサラ、スエーデン）およびＧＥＭ１（
プロメガ・バイオテック、マジソン、ウィスコンシン、合衆国）である。前記ｐ
ＢＲ３２２「バックボーン」部分は、適切なプロモーターおよび発現される構造
配列と結合されている。

【００７９】適切な宿主菌株の形質転換およびその宿主菌株の適切な細胞密度までの成長に
引き続いて、選択されたプロモーターが、適切な手段（例えば温度シフトまたは
化学的導入）によって誘導され、細胞は追加の期間培養される。

【００８０】細胞は典型的には遠心分離で収穫され、物理的または化学的方法により破砕さ
れ、次いで精製粗物的は更なる精製のため保持される。

【００８１】タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結融解循環、超音波処理、機
械的破砕、または細胞溶離剤の使用を含むいずれかの便利な方法を用いて破壊す
ることができるが、このような方法は、従来の技術に習熟した者にとっては周知
の方法である。

【００８２】種々の哺乳類細胞培養系も同じく組換えタンパク質を発現するために使用する
ことができる。哺乳類発現系の例は、グラズマン、細胞、２３巻、１７５ページ
（１９８１年）に記載されたサルの腎臓の線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適
合性ベクターを発現することのできる他の細胞系であり、例えばＣ１２７，３Ｔ
３，ＣＨＯ、ヒーラおよびＢＫＫ細胞系を含む。哺乳類発現ベクターは、複製起
点、適切なプロモーターとエンハンサー、およびいずれかの必要なリボソーム結
合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写
終結配列、および５′フランキング非転写配列などを含む。ＳＶ４０スプライス
から誘導されるＤＮＡ配列およびポリアデニル化部位は、必要とされる非転写遺
伝子エレメントを提供するために使用できる。

【００８３】ポリペプチドは、組換え細胞培養から回収精製することができ、その方法は、
硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陽イオンまたは陰イオン交換
クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマ
トグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイトクロマトグ
ラフィおよびレクチン（アフィニティ）クロマトグラフィを含む。必要に応じて
成熟タンパク質の形状完成のためのタンパク質再折りたたみ（構造復元）ステッ
プを使用することもできる。最後に高速液体クロマトグラフィ（ＡＰＬＣ）を最
終ステップとして使用することができる。

【００８４】本発明のポリペプチドは、自然に精製された産物、または化学的合成法の産物
、もしくは原核または真核細胞宿主（例えば細菌、酵母菌、高等植物、昆虫およ
び哺乳類などの培養細胞）からの遺伝子組換え技術により産生された産物のいず
れであってもよい。遺伝子組換え生成手順で使用された宿主に依存して、本発明
のポリペプチドはグリコシル化、または非グリコシル化のいずれかの処理を受け
る。本発明のポリペプチドは、初期のメチオニンアミノ酸残基を含むこともでき
る。

【００８５】本発明の手順を実行するにあたり、特定の緩衝液、培地、試薬、細胞、培養条
件その他の引用は限定することを意図したものではなくて、議論が提示される特
定の状況の中で従来の技術で普通の知識を存する者が関心を持ち、価値があるも
のと認識するであろうすべての関連物質を含むように読み取られるべきであるこ
とが、当然のことながら理解されねばならない。例えば、一つの緩衝液または培
養培地を他のものに置換して、しかもなお同一ではないにしても類似の結果を達
成することはしばしば可能である。従来の技術を有する者は、適切でない実験を
実施することなく、ここで開示された方法と手順を用いて彼等の目的に最適に役
立たせるこれらの置換を行うことできるためのこのようなシステムと方法に関す
る十分な知識を持つことであろう。

【００８６】本発明は更に下記の限定されない実施例により詳細に記述されるであろう。こ
れらの実施例の開示を適用するにあたり、本発明に基づき開示される方法の他の
および異なる実施例が間違いなく通常の知識を有する者に何かを示唆するであろ
うことを明らかに留めておくべきである。

【００８７】実施例１＜抗ＳＰ１３３を持つ活性タンパク質＞Ａ．ＳＰ１３３のクローニング、発現および精製増幅の標的として使用されるゲノムＤＮＡが、ゲノム配列化に使用されたもの
と同じ菌株である肺炎連鎖球菌（Ｎ４菌株）から分離された。ＳＰ１３３をコー
ド化する遺伝子断片のヌクレオチド配列は、配列識別番号３に含まれ、ＳＰ１３
３ポリペプチドの対応するアミノ酸配列は配列識別番号４に含まれる。プライマ
ー（配列識別番号１および２）はＳＰ１３３遺伝子断片を増幅し、例えばニッケ
ルアフィニティクロマトグラフィによる精製のために続くヒスチジン標識タンパ
ク質産物の発現と共に、発現ベクターｐＱＥ１０へのクローニングを促進するよ
うに設計された。配列識別番号１および２のプライマーにより増幅された断片の
クローニングは、最終的には配列識別番号４のポリペプチドに帰着する（これが
ＳＰ１３３と表示される）。勿論このタンパク質は、配列識別番号４に用いる化
学的手段を用いて容易に直接合成することができる。

【００８８】Ｂ．ＳＰ１３３でのワクチン接種は致死性肺炎連鎖球菌攻撃を防御する図１Ａおよび１Ｂで示された実験のそれぞれにおいて、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス
は、ＳＰ１３３タンパク質で皮下（ｓ．ｃ．）免疫化された（完全フロイントマ
ジュバント（ＣＦＡ）５０ｍｌに乳化されたＰＢＳ５０μｌ内に１５μｇ投入）
。グループ１０または１９のシャム免疫化マウスが、アジュバントのみのＰＢＳ
（食塩加リン酸緩衝液）を受けた。不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）で
の１５μｇのタンパク質による第２の免疫接種が３週後に投与された。シャムグ
ループはＩＦＡと共にＰＢＳを受けた。血液は７週に（後眼窩出血で）抜き取ら
れた。各グループからの血清は、エリザにより抗ＳＰ１３３抗体の分析用として
プールされた。マウスは８週にＳＪ２肺炎連鎖球菌菌株（６Ｂ血清型；Ｐ．フリ
ン，セント・ジュード・チルドレンズ・リサーチ・ホスピタル，メンフィス、テ
ネシーより提供）約８００コロニー形質単位（ＣＦＵ）または３４０ＣＦＵの腹
腔内注射で攻撃された。予備実験では、この菌株のＬＤ_５０が約１０ＣＦＵであ
ると認定された。マウスは生存していた１５日間モニターされた。２個サンプル
の対数ランクテストが全身疾病のマウスモデルの死に対する防御を評価するため
に使用された。

【００８９】図１Ａと１Ｂで示された２個の実験は、組換えＳＰ１３３の同じ調製物を使用
した。

【００９０】図１Ａで示された実験では、ＳＰ１３３で免疫化された１０匹のマウスからの
一次免疫後７週に収集された血清は、１：２，０４８，０００の終点エリザ力価
を有していた。シャム免疫化マウスから得た血清では、抗ＳＰ１３３抗体は検出
されなかった。ＳＰ１３３タンパク質で免疫化された１０匹のマウスの内４匹は
、研究期間中（１５日間）（肺炎球菌８００ＣＦＵの）攻撃に生存した。シャム
免疫化マウスの１０匹すべては１２日までに死んだ。

【００９１】図１Ｂで示される実験では、ＳＰ１３３で免疫化された２０匹のマウスからの
一次免疫後７週に収集された血清は、１：１，０２４，０００の終点エリザ力価
を有していた。シャム免疫化マウスから得た血清では、抗ＳＰ１３３抗体は検出
されなかった。ＳＰ１３３タンパク質で免疫化された２０匹のマウスの内９匹は
、研究期間中（１５日間）（肺炎球菌３４０ＣＦＵの）攻撃に生存した。シャム
免疫化マウスの１９匹中１７匹が９日までに死んだ。

【００９２】これらのデータは、組換えＳＰ１３３タンパク質でのマウスの免疫化が、全身
性肺炎感染と死からマウスを防御できる応答を引き出したことを示している（両
研究でＰ＜０．０５）。組換え肺炎球菌タンパク質が４血清型（ノルウェー４菌
株）ＤＮＡ配列に基づき生成され、一方攻撃が異種ＳＪ２菌株（６Ｂ血清型）を
採用したという事実により交差防御が示された。

【００９３】実施例２＜肺炎連鎖球菌の細胞表面標識＞Ａ．フローサイトメトリー分析肺炎球菌（ＳＪ２菌株）が、中間対数相で３７℃で０．５％酵母菌抽出物（Ｔ
ＨＹ）培地で補充されたトッド・ヒューイット肉汁で培養された。細菌は収穫さ
れ、５％の熱不活性胎仔ウシ血清（ＦＣＳ；バイオウィッテーカー，ウォーカー
ズビル、メリーランド）を含むＰＢＳで、４，０００×ｇで１０分１度洗浄され
た。細菌細胞数は０．１ｍｌ／管で５×１０^６細胞に調節された。１：１００に
希釈された（実施例１で既に記載されたように）ＳＰ１３３で免疫化されたマウ
スから得られた貯蔵された血清が各管に加えられ、氷上に１時間置かれた。余分
の抗体はＦＣＳ（洗浄緩衝液）を含むＰＢＳ１ｍｌでの遠心分離で洗い流された
。アレクサ４８８接合ヤギ抗マウスＩｇ（分子プローブス、ユージーン、オレゴ
ン）が５×１０^６細菌当り１μｇで加えられ、氷上に３０分置かれた。洗浄後サ
ンプルは、洗浄緩衝液に懸濁され、データ獲得と分析のためにリシスＩＩソフト
ウェアを使用するベクトン・ディキンソン・ファクスター（Ｒ）・プラスを用い
てフローサイトメトリーで分析された。平均チャンネル蛍光での増加は、一次免
疫血清による結合を示していた。既知の細菌細胞表面であるＣｂｐＡに対する免
疫血清（図２参照）が正の対照として使用された。

【００９４】ＳＰ１３３に対する抗血清が、フローサイトメトリーにより視覚化されて、Ｓ
Ｊ２細菌の表面標識に現れた（図２）。これらのデータは生のＳＰ１３３タンパ
ク質が無傷肺炎球菌（ＳＪ２菌株）の細胞表面に露出されることを示している。

【００９５】実施例３＜肺炎連鎖球菌の菌株の間でのＳＰ１３３の保存＞Ａ．ウエスタンブロット分析この実験で使用された肺炎球菌菌株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（１０８０１ユニバーシティブールバード、マサチューセッツ、バ
ージニア２０１１０−２２０９）から獲得され、それは多価肺炎球菌糖質ワク
チンでのそれぞれの血清型から１個の分離されたものを含む。加えてＮ４（４血
清型）およびＳＪ２（６Ｂ血清型）を含むいくつかの研究用菌株および各種の一
次臨床分離物がＳＰ１３３発現のために試験された。すべての細胞溶離液を調製
するために、肺炎球菌は３７℃で０．５％酵母菌抽出物（ジフコ、デトロイト、
ミシガン）と共に２ｍｌトッド−ヒューイット肉汁内で中間対数相（６２０ｎｍ
での吸光度、０．４乃至０．６）まで成長した。細菌は遠心分離で収穫され、水
で２回洗浄された。ペレットが２００μｌの溶解緩衝液（０．０１％のドデシル
硫酸ナトリウム、０．１５Ｍのクエン酸ナトリウム、および０．１％のデオキシ
コール酸ナトリウム）に再懸濁され、３７℃で３０分保温され、次いで等量の２
×ＳＳＣ（０．３Ｍの塩化ナトリウム、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム）に希
釈された。溶離液内のタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分けられ、ニトロセ
ルロース膜（バイオ−ラッド・ラボラトリーズ、ハーキュリーズ、カリフォルニ
ア）に移され、標準ウエスタンブロッティング法で抗体でプローブされた。（実
施例１に記載のように）ＳＰ１３３で免疫化されたマウスから獲得されたプール
血清が１：３，０００の希釈で使用された。結合抗体はファルマシア・エイアシ
ャム，インコーポレイテッド（ピスケータウエイ、ニュージャージー）からの化
学発光キットを用いてペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウスＩｇＧで検出された。

【００９６】マウス抗ＳＰ１３３血清は試験されたすべての肺炎球菌溶離液（ＷＵ２菌株の
み除く；図３参照）内で３２キロダルトンの識別できる分子量を持つ主要な帯を
検出した。

【００９７】これらのデータは、ＳＰ１３３が現在使用される多糖ワクチン内で表される２
３肺炎球菌血清型の菌株の間で抗原として保存されることを示している。

【００９８】実施例４＜ヒトにおけるＳＰ１３３の免疫原性＞ＳＰ１３３が、ヒトでの肺炎球菌感染の間免疫原性であるかどうかを決定する
ために、培養が確認された肺炎球菌菌血症を持つ患者（それぞれ患者１，２，３
および４；血清型１，１２，５および１８Ｃ）から得た血清が、組換えＳＰ１３
３タンパク質を含有するウエスタンブロットで試験された。図４で示される実験
において、４人の患者（１乃至４として示されたもの）からの血清が１：５００
で希釈され、（シグナル配列を欠いている）ＳＰ１３３を含有するプローブブロ
ットに使用された。Ａ（急性）と標識されたレーンは、肺炎球菌感染の診断後す
ぐに収集された血清でプローブされた。Ｃ（回復期）と標識されたレーンは、１
ヶ月（患者１および２）、最初の血清収集から８日（患者３および４）のいずれ
かで収集された血清をプローブされた。患者１および２にとっては、ＳＰ１３３
との回復期血清の反応性は、対応する急性血清のそれよりもより強いものがあっ
た。

【００９９】これらのデータは、ＳＰ１３３がヒト免疫系で認識されることを示し、またＳ
Ｐ１３３タンパク質と結合できる抗体が、ヒトにおける自然肺炎連鎖球菌感染の
間に産生され得ることを示唆している。患者が各種の肺炎球菌菌株で感染される
ので、これらのデータは更に、ＳＰ１３３が抗原の形で保存される。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の組換えＳＰ１３３ポリペプチド調製を使用する実験の結
果（図１Ａと１Ｂそれぞれ）を示す図。この実験データは、肺炎球菌菌株ノルウ
ェー４血清型（Ｎ４）から誘導された組換えＳＰ１３３ポリペプチドでの活性免
疫化が、同種異系菌株ＳＪ２（６Ｂ血清型）を用いる肺炎球菌敗血症のモデルで
、マウスを死から防御したことを示している。図１Ａで示される実験において、
免疫化された１０匹の内の４匹のマウスが、肺炎球菌の約８００ＣＦＵ（コロニ
ー形成単位）での攻撃に続く１５日の観察期間生存した。これとは逆に、（食塩
加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）プラスアジュバントのみを注射された）シャム免疫化
マウス１０匹すべては１２日までに死んだ。図１Ｂで示される実験は、組換えＳ
Ｐ１３３で免疫化された２０匹のマウスを使用した。この結果は、肺炎球菌の約
３４０ＣＦＵでの攻撃に続く１５日の観察期間９匹のマウスが生存したことを示
している。これとは逆に、シャム免疫化マウスの１９匹の内１７匹が同じ期間に
死んだ。両実験では、組換えＳＰ１３３ポリペプチドで免疫化されたマウスは、
シャム免疫化マウスのそれと比べて生存数の著しい差を示していた。

【図２】免疫標識およびフローサイトメトリーによる細菌細胞表面でのＳ
Ｐ１３３の検出を示す図。この結果は、ＳＰ１３３タンパク質に対し、高められ
た免疫血清が無傷肺炎球菌（ＳＪ２菌株）の細胞表面を標識できることを実証し
ている。

【図３】組換えＳＰ１３３ポリペプチドに対して、高められた抗血清でプ
ローブされた現在利用できる肺炎球菌ワクチンに含まれるそれぞれ２３血清型か
ら調製された、全細胞溶離液のウエスタンブロットを示す図。試験された肺炎連
鎖球菌菌株の殆んどすべては、ＳＰ１３３の予測された分子量に一致して、（抗
ＳＰ１３３抗血清と反応する）約３２キロダルトンの分子量を持つタンパク質を
検出した。ＳＰ１３３タンパク質は、３血清型菌株（ＷＵ２）から調製された溶
離液では検出されなかったけれども、２個の他の３血清型菌株（ＡＴＣＣ３およ
びＡ６６）でＳＰ１３３タンパク質が検出された。

【図４】ＳＰ１３３での患者の血清の反応性を示すウエスタンブロットの
図。組換えＳＰ１３３タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、ニトロ
セルロースに移された。血清は２個の異なる時点で（上部の数字で示された）４
人の患者から収集された。（急性血清として「Ａ」で示された）第一次収集物は
病気の発症直後のものであり、一方（「回復期血清」の「Ｃ」で示された）第二
次収集物は８日乃至３０日後に行われた。これらの血清は、ブロットをプローブ
するために使用された。このデータは、回復期の血清で対応する急性血清がなし
たもの以上により強くＳＰ１３３と反応したことを示している。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/315 Ｃ０７Ｋ 16/12 16/12 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 21/08 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者アマダウ，ジョン，イー．アメリカ合衆国，20874 メリーランド，ジャーマンタウン，シャムロックグレンサークル 20822 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 CA04 EA04 GA11 HA15 4B064 AG31 CA19 CC24 DA01 4B065 AA49Y AA90X AB01 BA02 CA24 CA25 CA45 4C085 AA03 AA13 AA14 BA14 BB11 CC23 CC32 EE01 GG03 GG04 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA11 DA76 DA86 EA31 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列識別番号４のアミノ酸配列に少なくとも約８０％同一で
あるアミノ酸配列を含むことを特徴とする一つの分離ポリペプチド。
【請求項２】請求項１記載の分離ポリペプチドであって、ここで前記ポリ
ペプチドが配列識別番号４のアミノ酸配列に少なくとも約９０％同一であること
を特徴とする分離ポリペプチド。
【請求項３】請求項１記載の分離ポリペプチドであって、ここで前記ポリ
ペプチドが配列識別番号４のアミノ酸配列に少なくとも約９５％同一であること
を特徴とする分離ポリペプチド。
【請求項４】請求項１記載の分離ポリペプチドであって、ここで前記ポリ
ペプチドが配列識別番号４のアミノ酸配列に少なくとも約９８％同一であること
を特徴とする分離ポリペプチド。
【請求項５】請求項１記載の分離ポリペプチドであって、ここで前記ポリ
ペプチドが配列識別番号４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする分離ポリペプ
チド。
【請求項６】配列識別番号４のポリペプチドをコード化すポリヌクレオチ
ド配列に少なくとも６５％同一であるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする
一つの分離ポリヌクレオチド。
【請求項７】請求項６記載の分離ポリヌクレオチドであって、ここで前記
ポリヌクレオチドが配列識別番号４のポリペプチドをコード化するポリヌクレオ
チド配列に少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むことを特徴とす
る分離ポリヌクレオチド。
【請求項８】請求項６記載の分離ポリヌクレオチドであって、ここで前記
ポリヌクレオチドが配列識別番号４のポリペプチドをコード化するヌクレオチド
配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする分
離ポリヌクレオチド。
【請求項９】請求項６記載の分離ポリヌクレオチドであって、ここで前記
ポリヌクレオチドが配列識別番号４のポリペプチドをコード化するヌクレオチド
配列に少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする分
離ポリヌクレオチド。
【請求項１０】請求項６記載の分離ポリヌクレオチドであって、ここで前
記ポリヌクレオチドが配列識別番号４のポリペプチドをコード化するヌクレオチ
ド配列を含むことを特徴とする分離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】請求項６記載の分離ポリヌクレオチドであって、ここで前
記ポリヌクレオチドが配列識別番号３のヌクレオチド配列を含むことを特徴とす
る分離ポリヌクレオチド。
【請求項１２】ポリペプチドを含む一つのワクチン組成物であって、請求
項１，２，３，４および５記載のポリペプチドより成るグループから選択された
その免疫原断片を含み、ここで前記ポリペプチドと断片が薬理許容担体に懸濁さ
れ、またここで前記ポリペプチドおよびまたは断片が連鎖球菌属の生体に対し動
物に防御抗体を引き出すのに有効な量で存在することを特徴とするワクチン組成
物。
【請求項１３】請求項１２記載のワクチン組成物であって、ここで前記免
疫原断片が長さで少なくとも２００アミノ酸残基であることを特徴とするワクチ
ン組成物。
【請求項１４】請求項１２記載のワクチン組成物であって、ここで前記免
疫原断片が長さで少なくとも２５０アミノ酸残基であることを特徴とするワクチ
ン組成物。
【請求項１５】請求項１２記載のワクチン組成物であって、ここで前記免
疫原断片が長さで少なくとも２７０アミノ酸残基であることを特徴とするワクチ
ン組成物。
【請求項１６】免疫原活性断片を含む請求項１，２，３，４および５に基
づくポリペプチドより成るグループから選択されるポリペプチドに特異的に結合
することを特徴とする一つの分離抗体。
【請求項１７】請求項１６記載の分離抗体であって、ここで前記抗体がモ
ノクローナル抗体であることを特徴とする分離抗体。
【請求項１８】請求項１７記載の分離抗体を含む一つの組成物であって、
ここで前記抗体が薬理許容担体に懸濁され、またここで前記抗体が連鎖球菌属の
生体に対し、動物を防御するような治療有効量で存在することを特徴とする組成
物。
【請求項１９】肺炎連鎖球菌の１個の構成員に感染するか、またはその感
染の危険のある動物に、それにより生じる感染を予防しまたは弱める一つの方法
であって、前記動物に請求項１２記載のワクチン組成物の治療有効量を投与する
ことを含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】請求項１９記載の方法であって、ここで前記動物がヒトで
あることを特徴とする方法。
【請求項２１】肺炎連鎖球菌の１個の構成員に感染するか、またはその感
染の危険のある動物に、それにより生じる感染を予防しまたは弱める一つの方法
であって、前記動物に請求項１７記載の抗体の治療有効量を投与することを含み
、ここで前記抗体が前記感染を予防し、または弱めるのに有効な量で投与される
ことを特徴とする方法。
【請求項２２】請求項２１記載の方法であって、ここで前記動物がヒトで
あることを特徴とする方法。
【請求項２３】一つのワクチン組成物であって、ポリヌクレオチドで形質
転換され、またそれにより請求項１，２，３，４および５記載のポリペプチドよ
り成るグループから選択されるポリペプチド、またはその免疫原断片を発現する
微生物生体を含むことを特徴とするワクチン組成物。
【請求項２４】請求項２３記載のワクチン組成物であって、ここで前記形
質転換微生物がサルモネラ属、ミコバクテリウム属、連鎖球菌属、ポックスウイ
ルス、およびアデノウイルスより成るグループから選択されることを特徴とする
ワクチン組成物。
【請求項２５】請求項６，７，８，９，１０および１１記載のポリヌクレ
オチドより成るグループから選択されるポリヌクレオチドを含むことを特徴とす
る一つのベクター。
【請求項２６】そのヌクレオチド配列が請求項６，７，８，９，１０およ
び１１記載のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列より成るグループから選択さ
れることを特徴とする一つの組換え細胞。
【請求項２７】請求項１，２，３，４および５記載のポリペプチドより成
るグループから選択されるその免疫断片を含むポリペプチドを発現することを特
徴とする一つ組換え細胞。
【請求項２８】請求項１，２，３，４および５記載のポリペプチドを請求
項２６または２７記載の組換え細胞から発現することにより前記ポリペプチドを
作ることを特徴とする一つのプロセス。
【請求項２９】一つのワクチン組成物であって、請求項１，２，３，４お
よび５記載のポリペプチドより成るグループから選択され、その免疫原断片を含
むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含み、ここで前記ポリヌクレ
オチドが薬理許容担体に懸濁され、またここで前記ポリヌクレオチドが連鎖球菌
属の生体に対し動物に防御保護抗体を引き出すのに有効な量で存在することを特
徴とするワクチン組成物。