CN102802664B

CN102802664B - 免疫原性组合物

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Publication number: CN102802664B
Application number: CN201080064532.1A
Authority: CN
Inventors: S.加利钱; K.哈珀; B.朱蒂奇; M.奥赫斯-奥诺兰汉姆亨; G.莫尔菲尔德; F.奥萨; M-D.萨尔哈
Original assignee: Sanofi Pasteur SA
Current assignee: Sanofi Pasteur SA
Priority date: 2009-12-22
Filing date: 2010-12-20
Publication date: 2017-04-05
Anticipated expiration: 2030-12-20
Also published as: IL242592A; WO2011075823A1; AR079712A1; ZA201204628B; CA2783955A1; EP2515938A1; EP2515938A4; BR112012018343A2; CN102802664A; JP5894083B2; JP2016104776A; US20130183350A1; KR20120107121A; IL220576B; JP2013515015A; AU2010335970A1; AU2010335970B2

Abstract

本公开涉及包含分离的免疫原性肺炎链球菌PcpA多肽和至少一种另外的抗原(例如，选自多组氨酸三联体家族蛋白的分离的免疫原性肺炎链球菌多肽(例如PhtD))的免疫原性组合物和使用这些组合物用于预防和治疗由肺炎链球菌引起的疾病的方法。

Description

免疫原性组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年12月22日提交的美国序号61/289,236和2010年4月19号提交的美国序号61/325,660的优先权，其通过引用以其整体结合到本文中。

发明领域

本发明涉及免疫学领域，特别地，涉及肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)抗原及其在免疫中的用途。

背景技术

肺炎链球菌是相当普遍存在的人病原体，在健康儿童和成人的上呼吸道中经常发现。这些细菌可感染数个器官(包括肺、中枢神经系统(CNS)、中耳和鼻道)并引起一系列的疾病(即有症状的感染)，例如窦感染、中耳炎、支气管炎、肺炎、脑膜炎和菌血症(败血症)。尽管抗生素治疗，肺炎球菌性脑膜炎(这些肺炎球菌性疾病的最严重形式)还是与显著的死亡率和发病率有关(Quagliarello等(1992)N.Engl.J.Med.327：864-872)。两岁以下的儿童和老年人特别易受有症状的肺炎球菌感染。

目前，有两种可得的肺炎球菌疫苗类型。第一种包含来自23种类型的肺炎链球菌的荚膜多糖，它们总共代表约90％引起肺炎球菌感染的菌株的荚膜类型。然而，该疫苗在幼儿中不是非常免疫原性的，幼儿是高度易受肺炎球菌感染的年龄组，因为他们在2岁之前不对多糖抗原产生良好的免疫反应。在成年人中，该疫苗对菌血症性肺炎已显示约60％有效，但由于年龄或基础医疗条件，在肺炎球菌感染风险较高的成年人中有效性较差(Fedson和Musher 2004，“Pneumococcal Polysaccharide Vaccine(肺炎球菌多糖疫苗)”，第529-588页；载于Vaccines.S.A.Plotikin和W.A.Orenstein(主编)，W.B.Saunders and Co.，Philadelphia，PA；Shapiro等，N.Engl.J.Med.325：1453-1460(1991))。

第二种可得的类型是缀合疫苗。这些疫苗包含与蛋白载体缀合的血清型特异性荚膜多糖抗原，引起血清型-特异性保护(9)。目前可得的是7-价和13-价缀合疫苗：7-价包含7种多糖抗原(来源于血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的荚膜)，而13-价包含13种多糖抗原(除了7-价涵盖的那些外，还来源于血清型1、3、5、6A、7F和19A的荚膜)。亦开发了9-价和11-价缀合疫苗，且各包含对不被7-价涵盖的血清型特异的多糖(即9-价中的血清型1和5和11-价中的型3和7F)。

缀合疫苗的生产是复杂和昂贵的，部分由于需要产生7(或9或11)种与蛋白载体各自缀合的不同多糖。这样的疫苗也不能很好地涵盖发展中世界的感染，在发展中世界，不被缀合疫苗涵盖的肺炎链球菌的血清型是非常常见的(Di Fabio等，Pediatr.Infect.Dis.J.20：959-967(2001)；Mulholland，Trop.Med.Int.Health 10：497-500(2005))。使用7-价缀合疫苗亦显示引起具有不被疫苗中所包含的7种多糖代表的荚膜类型的菌株的定植增加和疾病(Bogaert等，Lancet Infect.Dis.4：144-154(2004)；Eskola等，N.Engl.J.Med.344-403-409(2001)；Mbelle等，J.Infect.Dis.180：1171-1176(1999))。

作为目前可得的基于多糖的疫苗的备选，许多肺炎链球菌抗原已被建议作为针对肺炎链球菌的基于蛋白的疫苗的可能候选物。然而，到目前为止，没有这样的疫苗在市场上是目前可得的。因此，仍需要对肺炎链球菌的有效治疗。

概述

描述用于引起针对链球菌感染(例如肺炎链球菌)的免疫反应的免疫原性组合物和方法。更具体地，本公开涉及包含免疫原性PcpA多肽和/或多组氨酸三联体家族的免疫原性多肽(PhtX：PhtA、B、D、E)的免疫原性组合物、用于其产生的方法及其用途。也提供免疫原性PcpA和PhtX多肽(例如PhtD)(包括PcpA和PhtD的片段以及各自的变体)和编码这些多肽的核酸。免疫原性组合物包含免疫原性PcpA多肽和/或多组氨酸三联体家族的免疫原性多肽(PhtX：PhtA、B、D、E)和/或解毒的肺炎链球菌溶血素。另外提供制备针对链球菌多肽的抗体的方法和使用这样的抗体用于治疗和/或预防链球菌感染(例如肺炎链球菌感染)的方法。

还提供组合物，例如药物组合物(例如，疫苗组合物)，其包含一种或多种免疫原性PcpA多肽、PhtX多肽和/或解毒的肺炎链球菌溶血素蛋白。任选地，组合物可包含佐剂。组合物亦可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂，相对于没有一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，其增加多肽/蛋白的热稳定性。在一个实例中，相对于没有一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，一种或多种药学上可接受的赋形剂使PcpA、PhtX和/或解毒的肺炎链球菌溶血素蛋白的热稳定性增加0.5℃以上。组合物可为液体形式、干粉形式、冷冻干燥的、喷雾干燥的和或泡沫干燥的。一种或多种药学上可接受的赋形剂可例如选自缓冲剂、张度剂、简单碳水化合物、糖、碳水化合物聚合物、氨基酸、寡肽、多氨基酸、多元醇及其醚、洗涤剂、脂质、表面活性剂、抗氧化剂、盐、人血清白蛋白、明胶、甲醛或者它们的组合。

还提供诱导受试者中对肺炎链球菌的免疫反应的方法，其涉及给予受试者本文所述的组合物。还提供本发明的组合物在诱导受试者中对肺炎链球菌的免疫反应中的用途或在制备用于在该目的中使用的药物中的用途。

本发明提供数个优势。例如，将本发明的组合物给予受试者引起针对许多肺炎链球菌菌株感染的免疫反应。此外，本发明的多价组合物包含肺炎链球菌免疫原性多肽的特定组合，当给予时，其不经历抗原干扰并可提供累加效应。使用本文所述的赋形剂可引起组合物内的多肽/蛋白的热稳定性增加。

本发明的其他特征和优势从下述详述、附图和权利要求中将显而易见。

附图简述

参考附图，从下述描述将进一步理解本发明，其中：

图1描绘用不同剂量的PcpA和PhtD免疫的小鼠的血清抗-蛋白IgG抗体效价(实施例2)。在该研究中，将重组PhtD和PcpA与AlOOH佐剂组合作为单价或二价制剂。将Balb/c小鼠以3周间隔皮下免疫3次，并在第一次免疫前和第一、第二和第三次免疫后收集血液。通过终点ELISA评估IgG效价。所有已接受PcpA和PhtD蛋白的小鼠在免疫后都产生了抗原-特异性抗体反应。

图2a-d描绘用50μg抗原/剂量的PcpA和/或PhtD免疫的大鼠的血清抗-蛋白IgG抗体效价。在该研究中，将大鼠在第0、21和42天使用50μg抗原/剂量用对照Tris缓冲盐水(10mM Tris pH 7.4，150mM NaCl)、佐以氢氧化铝的二价PhtD和PcPA、无佐剂的二价PhtD和PcPA或者佐以氢氧化铝的PcpA免疫大鼠。将来自测试前、第44天和第57天出血的血清通过ELISA测试抗PhtD的抗体效价和PcpA特异性IgG抗体效价。

图3描绘各组的免疫小鼠的存活百分比(实施例5)。在该研究中，使用鼻内攻击模型评价重组PhtD和PcpA的二价制剂。用致死剂量的肺炎链球菌菌株(MD，14453或941192)攻击免疫的动物。

图4a、4b。图4a描绘通过终点稀释ELISA测量的总抗原-特异性IgG效价和各组的几何平均效价(+/-SD)。图4b描绘通过定量ELISA测量的总抗原-特异性效价。在该研究中(实施例7)，(使用两个不同批次的各PhtD和PcpA)制备PhtD和PcpA的二价组合物并与磷酸盐处理的AlOOH(2mM)配制。将多组的6只雌性CBA/j小鼠用合适的制剂以3周间隔肌内或皮下免疫3次。第3次(最后)出血后，用致死剂量的肺炎链球菌菌株MD攻击小鼠。

图5描绘各组的存活百分比。在该研究中(实施例6)，(使用两个不同批次的各PhtD和PcpA)制备PhtD和PcpA的二价组合物并与磷酸盐处理的AlOOH(2mM)配制。将多组的6只雌性CBA/j小鼠用合适的制剂以3周间隔肌内或皮下免疫3次。第3次出血后，用致死剂量的肺炎链球菌菌株MD攻击小鼠。

图6描绘通过相应的兔抗血清识别在Mn2+缺失的培养基中生长的各种肺炎球菌菌株的细菌表面上的PcpA和PhtD(实施例9)。

图7描绘纯化的人抗-PcpA和抗-PhtD抗体与菌株WU2的细菌细胞表面上的蛋白(PcpA、PhtD)的结合(实施例9)。

图8描绘每log给予的稀释血清所观察到的％存活(实施例10)。

图9描绘通过ELISA测量的总IgG效价的概况(实施例11)。

图10a-f单价和二价制剂(用AlO(OH)或磷酸盐处理的AlO(OH)(PTH)配制)中PcpA和PhtD的稳定性。使用AlO(OH)或具有终浓度为2mM磷酸盐的PTH制备制剂，然后在各种温度(即5℃、25℃、37℃或45℃)下孵育。然后通过RP-HPLC评估完整的抗原浓度。

图11 PhtD和PcpA在应激条件下的稳定性，如通过ELISA评价。将100μg/mL的二价制剂在37℃孵育12周并通过ELISA评价抗原性。

图12A在10％山梨糖醇(■)、10％海藻糖(●)、10％蔗糖(Δ)、TBS pH 9.0(◆)和TBS pH 7.4(○)存在下，通过RP-HPLC研究赋形剂对PcpA(在50℃储存3天)稳定性的影响。

图12B在10％山梨糖醇、10％海藻糖、10％蔗糖、TBS pH 9.0和TBS pH 7.4存在下，通过定量夹心ELISA研究赋形剂对PcpA (在50℃储存3天)抗原性的影响。将制剂在50℃储存3天。对于各制剂，在零时(白条)和三天储存后(黑条)评价抗原性。

图13 pH对有佐剂的蛋白物理稳定性的影响。将PcpA(A)、PhtD(B)和PlyD1(C)佐以不同pH值的氢氧化铝或磷酸铝，并通过荧光迹线的导数分析获得Tm值。

图14描绘通过终点稀释ELISA测量的总抗原-特异性IgG效价和各组的几何平均效价(+/-SD)。

图15A、B、C描绘给予小鼠的每抗原剂量引起的总抗原-特异性IgG效价，如通过ELISA测量。

发明详述

描述用于引起哺乳动物中针对肺炎链球菌的免疫反应以及用于治疗和预防哺乳动物中由肺炎链球菌引起的疾病的组合物和方法，哺乳动物例如人。提供包含免疫原性PcpA多肽和/或多组氨酸三联体家族的免疫原性多肽(PhtX：PhtA、PhtB、PhtD、PhtE)的免疫原性组合物、用于其产生的方法及其用途。组合物可包含解毒的肺炎链球菌溶血素或其免疫原性片段。方法包括被动和主动免疫法，其包括给予(例如皮下、肌内)包含一种或多种实质上纯的肺炎球菌(例如，肺炎链球菌)多肽、抗多肽自身的抗体或者它们的组合的免疫原性组合物。本发明亦包括链球菌属(例如，肺炎链球菌)多肽，包含肺炎球菌多肽的免疫原性组合物(例如，疫苗)，产生这样的组合物的方法和产生肺炎球菌(例如，肺炎链球菌)抗体的方法。下文进一步描述这些方法和组合物。

本发明的组合物包含一、二、三或更多种免疫原性多肽。组合物可单独或组合地包含例如PcpA的免疫原性多肽、多组氨酸三联体家族蛋白成员(例如，PhtA、PhtB、PhtD和PhtE，本文引用为PhtX蛋白)的免疫原性多肽、解毒的肺炎链球菌溶血素多肽。亦可在组合物中包含这些多肽的免疫原性片段和融合物(例如PhtB和PhtE的融合物)。这些免疫原性多肽可任选与肺炎球菌糖或其他肺炎球菌多肽组合使用。

在一个多组分实例中，免疫原性组合物包含免疫原性PcpA多肽和一种或多种免疫原性PhtX多肽。这种组合物的一个优选实施方案包含免疫原性PhtD多肽和免疫原性PcpA多肽。在另一实例中，组合物包含免疫原性PcpA多肽、免疫原性PhtX多肽(例如，PhtD)和解毒的肺炎链球菌溶血素。在本文实施例中描述免疫原性组合物(例如，以二价和三价形式)的某些实施方案。

多肽

免疫原性PcpA多肽包含全长PcpA氨基酸序列(存在或不存在信号序列)、其片段及其变体。适用于本文所述的组合物中使用的PcpA多肽包括例如来自肺炎链球菌菌株B6的GenBank登录号CAB04758、来自肺炎链球菌菌株TIGR4的GenBank登录号NP_和来自肺炎链球菌菌株R6的GenBank登录号NP_359536的那些，和来自肺炎链球菌菌株14453的那些。

肺炎链球菌14453基因组中的全长PcpA的氨基酸序列是SEQID NO：2。用于与本发明一起使用的优选PcpA多肽包含与SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：7具有50％以上(例如60、65、70、75、80、85、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5以上)同一性的氨基酸序列。用于与本发明一起使用的优选多肽包含SEQ IDNO：2的至少8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250个以上的连续氨基酸的片段。优选的片段包含来自SEQ ID NO：2的表位。其他优选的片段缺失来自SEQ ID NO：2的N端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25以上)氨基酸和/或来自SEQ ID NO：2的C端的一个或多个氨基酸，同时保留SEQ ID NO：2的至少一个表位。另外优选的片段缺失来自SEQ ID NO：2的N端的信号序列。优选的PcpA多肽是SEQ ID NO：7。

任选地，PcpA的免疫原性多肽包含一个或多个富亮氨酸区(LRR)。这些LLR存在于天然存在的PcpA中，或与天然存在的LRR具有约60-约99％序列同一性(包括，例如80％、85％、90％或95％序列同一性)。成熟PcpA蛋白(即缺失信号肽的蛋白)中的LRR可在WO2008/022302中公开的特定序列(例如WO 2008/022302的SEQ IDNO：1、2、41和45)中发现。

PcpA的免疫原性多肽任选缺失通常存在于天然存在的成熟PcpA蛋白中的胆碱结合结构域锚序列。成熟PcpA蛋白的胆碱结合锚的天然存在的序列公开于WO 2008/022302的SEQ ID NO：52。更具体地，免疫原性多肽包含具有一个或多个氨基酸取代的天然存在的PcpA的N端区，且该N端区与天然存在的PcpA有约60-约99％序列同一性或在两者之间的任何同一性(例如80、85、90和95％同一性)。在一个或多个保守氨基酸取代存在或不存在下和在信号序列存在或不存在下，N端区可包含SEQ ID NO：2(或WO2008/022302的SEQ ID NO：1、2、3、4、41或45)的氨基酸序列。N端区可包含与SEQ ID NO：1或7(在本文序列表中所示)或WO2008/022302的SEQID NO：1、2、3、4或41有约60-约99％序列同一性(或80-99％同一性之间的任何同一性)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2和7的免疫原性片段包含SEQ ID NO：2和7的5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190和191个氨基酸残基或者5-191之间任何数量的氨基酸残基。PcpA的免疫原性片段的实例公开于WO2008/022302。

任选地，PcpA的免疫原性多肽缺失LRR。缺失LRR的免疫原性多肽的实例公开于WO2008/022302的SEQ ID NO：29、SEQ IDNO：30和SEQ ID NO：31。

适用于本发明组合物的免疫原性PhtX多肽包含全长PhtA、PhtB、PhtD或PhtE氨基酸序列(存在或不存在信号序列)、其免疫原性片段、其变体及其融合蛋白。适用于本文所述的组合物中使用的PhtD多肽包括，例如尤其GenBank登录号AAK06760、YP816370和NP35851的那些。肺炎链球菌14453基因组中的全长PhtD的氨基酸序列是SEQ ID NO：1。优选的PhtD多肽(来源于肺炎链球菌14453基因组)是SEQ ID NO：5。

本发明的PhtX多肽的免疫原性片段能够引起对相应的全长成熟氨基酸序列特异的免疫反应。

免疫原性PhtX(例如，PhtD)多肽包括连接有信号序列的全长蛋白、移除信号序列(例如，N端上的20个氨基酸)的成熟全长蛋白、PhtX的变体(天然存在的或另外例如合成来源的)和PhtX的免疫原性片段(例如，包含存在于天然存在的成熟PhtX蛋白中的至少15或20个连续氨基酸的片段)。

PhtD的免疫原性片段的实例公开于PCT公布WO2009/012588。

用于与本发明一起使用的优选PhtD多肽包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5具有50％以上(例如60、65、70、75、80、85、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5以上)同一性的氨基酸序列。用于与本发明一起使用的优选多肽包含SEQ ID NO：1的至少8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250个以上的连续氨基酸的片段。优选的片段包含来自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5的表位。其他优选的片段缺失来自SEQID NO：1的N端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25以上)氨基酸和/或来自SEQ ID NO：1的C端的一个或多个氨基酸，同时保留SEQ ID NO：1的至少一个表位。另外优选的片段缺失来自SEQ ID NO：1的N端的信号序列。优选的PhtD多肽是SEQ ID NO：5。

肺炎链球菌溶血素(Ply)是涉及肺炎球菌发病机制的多个步骤(包括抑制纤毛搏动和破坏上皮细胞之间的紧密连接)的溶细胞-活化毒素(Hirst等Clinical andExperimental Immunology(2004))。数种肺炎链球菌溶血素是已知的，且(解毒后)可适用于本文所述的组合物中使用，包括例如尤其GenBank登录号Q04IN8、P0C2J9、Q7ZAK5和ABO21381。在一个实施方案中，Ply具有SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列。

用于与本发明一起使用的免疫原性肺炎链球菌溶血素多肽包括连接有信号序列的全长蛋白、移除信号序列的成熟全长蛋白、肺炎链球菌溶血素的变体(天然存在的或另外例如合成来源的)和肺炎链球菌溶血素的免疫原性片段(例如，包含存在于天然存在的成熟肺炎链球菌溶血素蛋白中的至少15或20个连续氨基酸的片段)。

本发明的免疫原性肺炎链球菌溶血素多肽的免疫原性变体和片段能够引起对相应的全长成熟氨基酸序列特异的免疫反应。本发明的免疫原性肺炎链球菌溶血素多肽是解毒的；即，与由肺炎链球菌产生并释放的成熟野生型肺炎链球菌溶血素蛋白相比，它们没有或具有降低的毒性。本发明的免疫原性肺炎链球菌溶血素多肽可被例如化学(例如，使用甲醛处理)或遗传(例如，以突变形式重组产生)解毒。

用于本发明中使用的免疫原性解毒的肺炎链球菌溶血素的优选实例公开于PCT公布号WO 2010/071986。如该篇申请中所公开，解毒的肺炎链球菌溶血素可为在野生型序列的位置65、293和428上包含氨基酸取代的突变体肺炎链球菌溶血素蛋白。在优选的解毒的肺炎链球菌溶血素蛋白中，三个氨基酸取代包含T₆₅→C、G₂₉₃→C和C₄₂₈→A。优选的免疫原性并解毒的肺炎链球菌溶血素多肽是SEQ IDNO：9。

用于与本发明一起使用的优选肺炎链球菌溶血素多肽包含与SEQ ID NO：9或SEQID NO：10具有50％以上(例如60、65、70、75、80、85、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5以上)同一性的氨基酸序列。用于与本发明一起使用的优选多肽包含SEQ ID NO：9或10的至少8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250个以上的连续氨基酸的片段。优选的片段包含来自SEQ ID NO：9或SEQ IDNO：10的表位。其他优选的片段缺失来自SEQ ID NO：9或10的N端的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25以上)氨基酸和/或来自SEQ ID NO：9或10的C端的一个或多个氨基酸，同时保留SEQID NO：9或10的至少一个表位。另外优选的片段缺失来自SEQ ID NO：10的N端的信号序列。

本文所述的PcpA、PhtX(例如，PhtD)和肺炎链球菌溶血素的免疫原性多肽及其片段包括变体。使用本领域公知的方法，针对其免疫原性能力选择本文所述的免疫原性多肽的这种变体，这种变体可包含一种或多种保守氨基酸修饰。免疫原性多肽(PcpA、PhtD、肺炎链球菌溶血素)的变体包含具有与公开的序列(即，SEQ ID NO：2或7(PcpA)；SEQ ID NO：1或5(PhtD)；SEQ ID NO：9或10(Ply))有约60-约99％序列同一性(或60-99％同一性之间的任何同一性)的氨基酸序列。氨基酸序列修饰包括取代、插入或缺失改变。取代、缺失、插入或其任何组合可在单个变体中组合，只要变体是免疫原性多肽即可。插入包括氨基和/或羧基端融合物以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。与氨基或羧基端融合物的那些相比，插入通常将为较小的插入，例如大约1-4个残基。缺失的特征是从蛋白序列中移除一个或多个氨基酸残基。通常在蛋白分子内的任何一个位点上缺失不超过约2-6个残基。通常通过位点特异性诱变编码蛋白的DNA中的核苷酸，藉此产生编码变体的DNA，并其后在重组细胞培养物中表达DNA，制备这些变体。用于在具有已知序列的DNA中的预定位点进行取代突变的技术是公知的，并包括但不限于M13引物诱变和PCR诱变。氨基酸取代通常为单残基但可同时在许多不同位置发生。取代的变体是其中至少一个残基已被移除并在该位置上插入不同的残基的那些。这种取代通常按照下表进行并称为保守取代。其他的取代是本领域技术人员是公知的。

本文使用的氨基酸取代可为保守或非保守的。保守氨基酸取代可涉及将天然氨基酸残基用非天然残基取代，使得对该位置上氨基酸残基的尺寸、极性、电荷、疏水性或亲水性有很少或没有影响，并特别地，不导致免疫原性降低。合适的保守氨基酸取代在下文表1中示出。

表1

原始残基	例示性保守取代	优选的保守取代
			Ala	Val、Leu、Ile	Val
Arg	Lys、Gln、Asn	Lys
			Asn	Gln	Gln
Asp	Glu	Glu
			Cys	Ser、Ala	Ser
Gln	Asn	Asn
			Glu	Asp	Asp
Gly	Pro、Ala	Ala
			His	Asn、Gln、Lys、Arg	Arg
Ile	Leu、Val、Met、Ala、Phe、正亮氨酸	Leu
			Leu	正亮氨酸、Ile、Val、Met、Ala、Phe	Ile
Lys	Arg、1，4-二氨基丁酸、Gln、Asn	Arg
			Met	Leu、Phe、Ile	Leu
Phe	Leu、Val、Ile、Ala、Tyr	Leu
			Pro	Ala	Gly
Ser	Thr、Ala、Cys	Thr
			Thr	Ser	Ser
Trp	Tyr、Phe	Tyr
			Tyr	Trp、Phe、Thr、Ser	Phe
Val	Ile、Met、Leu、Phe、Ala、正亮氨酸	Leu

所选特定氨基酸取代可取决于选择的位点的位置。在某些实施方案中，编码多肽和/或片段的核苷酸基于遗传密码的简并性被取代(即，与“摆动”假说一致)。当核酸是可用于表达细胞中的多肽的重组DNA分子时(例如，表达载体)，摆动型取代将引起具有与由DNA分子最初编码的序列相同的氨基酸序列的多肽的表达。如上所述，然而，取代可为保守或非保守的或者其任何组合。使用公知的技术，熟练的技术人员将能够确定本文提供的多肽和/或片段的合适变体。

类似物可与天然存在的肺炎链球菌多肽在氨基酸序列中和/或凭借非序列修饰而不同。非序列修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化、羧基化或糖基化中的改变。本发明多肽的“修饰”包括在一个或多个组成氨基酸上化学或酶促衍生的多肽(或其类似物，例如其片段)。这种修饰可包括，例如侧链修饰、骨架修饰以及N和C端修饰(例如乙酰化、羟基化、甲基化、酰胺化以及与碳水化合物或脂质部分、辅因子等连接)及其组合。本发明的修饰多肽可保留未修饰多肽的生物活性或可显示降低或增加的生物活性。

通过沿着其序列长度比对两条多肽(例如，候选多肽和例如SEQID NO：2的多肽)的残基以优化相同氨基酸的数量，可确定两条多肽的结构相似性；在进行比对时各序列或两者序列中的空位是允许的，以便优化相同氨基酸的数量，但是，尽管如此，各序列中的氨基酸仍必须以其正确顺序保持。候选多肽是与参照多肽比较的多肽。候选多肽可被分离(例如从微生物中)，或可使用重组技术产生，或化学或酶促合成。

使用全局算法(例如，Needleman-Wunsch)，可进行氨基酸序列的配对比较分析。备选地，使用局部比对算法(例如，BLAST 2搜索算法的Blastp程序，如由Tatiana等，(FEMSMicrobiol.Lett，174 247-250(1999)所述，并在美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站上可得)，可比较多肽。对所有BLAST 2搜索参数可使用默认值，包括矩阵＝BLOSUM62、开放空位罚分＝11、延伸空位罚分＝1、空位x下降＝50、期望10、字长＝3和过滤器开。Smith和Waterman算法是另一种可使用的局部比对工具(1988)。

在比较两条氨基酸序列中，结构相似性可被称为百分比“同一性”或可被称为百分比“相似性”。“同一性”指存在相同氨基酸。“相似性”指不仅存在相同氨基酸而且存在保守取代。本发明多肽中某氨基酸的保守取代可选自表1中所示该氨基酸所属类别的其他成员。

通过使用聚合酶链式反应(PCR)或通过使用本领域技术人员知晓的备选标准技术，可例如但不限于从野生型或突变体肺炎链球菌细胞中分离编码免疫原性多肽的核酸，或备选地，可从携带合适DNA基因(例如pcpA、phtD、ply)的肺炎链球菌菌株的DNA直接获得。使用的可能菌株例如包括肺炎链球菌菌株TIGR4和14453。在优选的实施方案中，多肽是重组来源于肺炎链球菌菌株14453。本发明的分离核酸分子的优选实例具有在SEQ ID NO：3、4、6和8中示出的核酸序列。这些序列的序列保守变体和功能保守变体为本发明所涵盖。

使用标准分子生物学技术和表达系统(参见例如，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第三版，Sambrook等，Cold Spring Harbor Press，2001)，可产生本发明的多肽。例如，可分离编码免疫原性多肽的基因片段并可将编码免疫原性多肽的多核苷酸克隆到任何市售表达载体(例如，pBR322和pUC载体(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA))或表达/纯化载体(例如，GST融合载体(Pfizer，Inc.，Piscataway，N.J.))中，然后在合适原核、病毒或真核宿主中表达。通过常规方法，或在商业表达/纯化系统的情况下依据制造商的使用说明，然后可实现纯化。

备选地，可例如但不限于从野生型或突变体肺炎链球菌细胞中分离本发明的免疫原性多肽(包括变体)，和使用商业自动化方法(例如，全部固相合成、部分固相法、片段组合法或溶液合成)通过化学合成。

本发明的多肽优选具有免疫原性活性。“免疫原性活性”指多肽引起受试者中的免疫反应的能力。对多肽的免疫反应是在受试者中发生细胞和/或抗体介导的对多肽的免疫反应。通常，免疫反应包括但不限于一种或多种下述效应：抗体、B细胞、辅助性T细胞、阻抑性T细胞和/或细胞毒性T细胞的产物导向多肽的一个或多个表位。术语“表位”指反应于特异性B细胞和/或T细胞以便产生抗体的抗原上的位点。免疫原性活性可为保护性的。术语“保护性免疫原性活性”指多肽引起受试者中预防或抑制肺炎链球菌(引起疾病)感染的免疫反应的能力。

组合物

将公开的免疫原性肺炎链球菌多肽用于产生免疫原性组合物，例如疫苗组合物。免疫原性组合物是当给予受试者(例如，哺乳动物)时诱导或增强针对组合物内所包含抗原的免疫反应的组合物。该反应可包括诱导抗体的产生(例如，通过刺激B细胞)或基于T细胞的反应(例如，溶细胞反应)。这些反应可以是或可以不是保护性或中和性的。保护性或中和性免疫反应是对与抗原相一致的感染生物体(例如抗原所源自的生物体)有害但对受试者有益(例如通过降低或预防感染)的免疫反应。当在动物中测试时，本文使用的保护性或中和性抗体可与相应的野生型肺炎链球菌多肽(或其片段)反应，并降低或抑制相应的野生型肺炎链球菌多肽的致死率。在给予宿主时引起保护性或中和性免疫反应的免疫原性组合物可被视为疫苗。

当给予受试者时，组合物包含量足以引起免疫反应的免疫原性多肽。用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的免疫原性多肽以及所需的任何其他组分。“免疫有效量”意指，以单剂量或作为一系列的部分将该量给予给受试者对治疗或预防有效。

在由两种、三种或更多种免疫原性多肽(例如PcpA、PhtD和/或解毒的肺炎链球菌溶血素)组成的组合物中，多肽组分优选是相容的并以合适的比例组合以避免抗原干扰以及以优化任何可能的协同作用。例如，各组分的量可在约5μg-约500μg/剂量、5μg-约100μg/剂量或25μg-约50μg/剂量的范围内。优选地，范围可为5或6μg-50μg/抗原组分/剂量。在一个实例中，组合物包含25μg PhtX(例如，PhtD)的免疫原性多肽和25μg PcpA的免疫原性多肽。在一个不同的实例中，组合物还包含25μg肺炎链球菌溶血素(例如解毒的肺炎链球菌溶血素；PlyD1(SEQ ID NO：9))。

在下文所示的实施例中，在动物模型中比较PhtX(例如，PhtD)与PcpA的二组分疫苗组合物以及PcpA、PhtX(例如，PhtD)与解毒的肺炎链球菌溶血素(例如，PlyD1)的三组分疫苗组合物的各种抗原比。出乎意料地，在测试的抗原比下未观察到统计上显著的抗原干扰。同样出乎意料地，在小鼠的被动免疫研究中使用兔血清发现对用二价组合物(或三价组合物)免疫有反应而引起的抗原-特异性抗体以累加的方式作用。因此，在多组分组合物中，这些组分可以等量存在(例如1∶1，1∶1∶1)。注意到对各抗原的预计最小抗原剂量，组分可以其他比例存在(例如，PcpA∶PhtX(PhtD)∶肺炎链球菌溶血素，约1∶1∶1-约1∶5∶25)。在一个实例中，三价组合物包含PcpA∶PhtD∶肺炎链球菌溶血素为1∶4∶8的比例的量(μg/剂量)的PcpA、PhtD和肺炎链球菌溶血素(例如PlyD1)。在一个不同的实例中，PcpA∶PhtD∶肺炎链球菌溶血素的比例为1∶1∶1。

本发明的组合物可以由本领域技术人员合适确定的量和方案通过合适的途径(例如，经皮(例如，肌内、静脉内、腹膜内或皮下)、透皮、粘膜(鼻内)或局部)给予。例如，可给予1-250μg或10-100μg的组合物。对于预防或治疗的目的，可给予组合物1、2、3、4或更多次。在一个实例中，一次或多次给予可作为“初始-加强”方案的一部分发生。当给予多剂量时，剂量可通过例如一周、一个月或数个月将彼此分开。

本发明的组合物(例如，疫苗组合物)可在存在或不存在佐剂时给予。佐剂通常为可增强抗原的免疫原性的物质。佐剂可在获得性和先天性免疫(例如，toll样受体)两者中起作用并以多种方式发挥功能，不是所有的方式被理解。

许多物质(天然和合成两者)已显示作为佐剂起作用。例如，佐剂可包括但不限于无机盐、鲨烯混合物、胞壁酰肽、皂苷衍生物、分枝杆菌细胞壁制备物、特定乳剂、单磷酰脂A、分枝菌酸衍生物、非离子嵌段共聚物表面活性剂、Quil A、霍乱毒素B亚单位、聚磷腈和衍生物、免疫刺激复合物(ISCOM)、细胞因子佐剂、MF59佐剂、脂质佐剂、粘膜佐剂、特定细胞外毒素和其他组分、特定寡核苷酸、PLG等。这些佐剂可在本文所述的组合物和方法中使用。

在某些实施方案中，在包含含有至少鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子表面活性剂和疏水性非离子表面活性剂的水包油乳剂的佐剂存在下给予组合物，其中所述水包油乳剂通过相转变温度法获得且其中90％体积的油滴具有小于200nm(任选小于150nm)的尺寸。这种乳剂描述于以其整体结合到本文中的WO2007006939(VaccineComposition Comprising a Thermoinversable Emulsion(包含热可逆乳剂的疫苗组合物))。除了所述的鲨烯水包油乳剂外或代替之，组合物亦可包含产品E6020(具有CAS号287180-63-6)。产品E6020描述于US2007/0082875(其通过引用以其整体结合到本文中)。

在某些实施方案中，组合物单独或联合佐剂一起包含TLR激动剂(例如，TLR4激动剂)。例如，佐剂可包含TLR4激动剂(例如，TLA4)、鲨烯、水性溶剂、属于聚氧乙烯烷基醚化学物质类的非离子亲水性表面活性剂、非离子疏水性表面活性剂，且其为热可逆的。这种佐剂的实例描述于以其整体结合到本文中的WO2007080308(Thermoreversible Oil-in-WaterEmulsion(热可逆水包油乳剂))。在一个实施方案中，组合物以CpG和铝盐佐剂(例如，明矾)的组合为佐剂。

铝盐佐剂(或化合物)是本发明的实践中使用的佐剂之一。使用的铝盐佐剂的实例包括氢氧化铝(例如，结晶偏氢氧化铝AlO(OH)和氢氧化铝Al(OH)₃)。氢氧化铝是包含Al³⁺离子和氢氧基(-OH)的铝化合物。当产生的混合物是包含氢氧基的铝化合物时，亦可使用氢氧化铝与其他铝化合物(例如羟基磷酸盐或羟基硫酸盐)的混合物。在特定实施方案中，铝佐剂是偏氢氧化铝(例如，具有铝盐佐剂的组合物不应该暴露于极端温度(即(低于冰点(0℃)或极其热(例如，≥70℃))是本领域公知的，因为这样的暴露可能不利地影响吸附的抗原和佐剂两者的稳定性和免疫原性。

发明人已注意到，当用氢氧化铝佐剂(AlO(OH))为佐剂时，PcpA和PhtD多肽的降解速率高(如在下文实施例中讨论)。发明人已发现，PcpA和PhtD多肽以已用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、羧酸盐、二膦酸盐或者两种或更多种这些化合物的混合物预处理包含氢氧基的铝化合物(例如，氢氧化铝佐剂)为佐剂，增加这些多肽的稳定性。因此，本文提供包含免疫原性PcpA多肽或免疫原性PhtX多肽(例如，PhtD)与已用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、羧酸盐、二膦酸盐或者两种或更多种这些化合物的混合物处理的含有氢氧基的铝化合物的组合物制剂，其中相对于其中多肽吸附于未处理的铝化合物的组合物，该处理增加免疫原性多肽的稳定性。在优选的实施方案中，将铝化合物用磷酸盐处理。亦提供包含PcpA和PhtX(例如，PhtD)两者的免疫原性多肽与已用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、羧酸盐、二膦酸盐或者两种或更多种这些化合物的混合物处理的含有氢氧基的铝化合物的多价组合物，其中相对于其中多肽吸附于未处理的铝化合物的组合物，该处理增加免疫原性多肽的稳定性。

在本发明一个特定实施方案中，将铝化合物(例如，氢氧化铝佐剂)用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、羧酸盐、二膦酸盐或者两种或更多种这些化合物的混合物处理。通过以这种方式处理铝化合物，铝化合物中的许多氢氧基(-OH)被对其进行处理所用的相应离子置换(例如，磷酸基(PO₄))。该取代降低铝化合物的PZC和化合物微环境的pH。以足够的量加入磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、羧酸盐或二膦酸盐离子来降低微环境的pH至使抗原稳定的水平(即，抗原水解的速率降低)。必要的量将取决于许多因素，例如所涉及的抗原、抗原的等电点、抗原的浓度、使用的辅佐(adjuvant)方法和制剂中存在的任何另外抗原的量和性质。疫苗领域的本领域技术人员能够评估相关的因素并确定加入铝化合物中以增加抗原稳定性的磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、羧酸盐、二膦酸盐的浓度(并因此，可制备相应的制剂和组合物)。例如，可进行滴定研究(即，加入增加浓度的磷酸盐等至铝化合物中)。

适合使用的磷酸盐化合物包括与磷酸相关的任何化合物(例如，磷酸的无机盐和有机酯)。磷酸盐是包含磷酸根离子(PO₄ ^3-)、磷酸氢根离子(HPO₄ ^2-)或磷酸二氢根离子(H₂pO^4-)连同任何阳离子的无机化合物。磷酸酯是其中磷酸的氢被有机基团置换的有机化合物。可代替磷酸盐使用的化合物实例包括阴离子氨基酸(例如，谷氨酸、天冬氨酸)和磷脂。

适合使用的羧酸盐化合物包括羧酸(例如，苹果酸、乳酸、富马酸、戊二酸、EDTA和EGTA)的任何有机酯、盐和阴离子。适合使用的硫阴离子包括包含硫酸基(SO₄基)的任何化合物，例如硫酸的盐或酯(例如硫酸钠、硫酸铵、亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、硫代硫酸盐)。适合使用的二膦酸盐化合物实例包括氯膦酸盐、帕米膦酸盐、替鲁膦酸盐和阿伦膦酸盐。

在本发明一个优选实施方案中，将磷酸基以盐的形式加入氢氧化铝佐剂中。优选地，磷酸根离子由包含磷酸二钠一钠的缓冲溶液提供。

在本发明的优选实践中，如本文所例示，将铝化合物(例如偏氢氧化铝)用磷酸盐处理(例如，通过如实施例中所述的方法)。在该方法中，将偏氢氧化铝的水性悬浮液(大约20mg/mL)与磷酸缓冲溶液(例如，大约400mol/L)混合。优选的终磷酸基浓度为约2mM-20mM。然后将混合物用缓冲剂(例如，Tris-HCl、具有盐水的Tris-HCl、HEPES)稀释以制备偏氢氧化铝与磷酸基(POx)的悬浮液。优选地，缓冲剂是10mM Tris-HCl和150mM NaCl，pH为约7.4。然后将悬浮液在室温混合大约24小时。优选地，元素铝在终悬浮液中的浓度在约0.28mg/mL-1.68mg/mL的范围内。更优选地，元素铝的浓度为约0.56mg/mL。

然后可将PcpA、PhtD和解毒的肺炎链球菌溶血素的免疫原性多肽(单独或组合地)吸附于处理的氢氧化铝。优选地，将大约0.2-0.4mg/mL的抗原与处理的氢氧化铝佐剂的悬浮液混合(例如，在室温或在2-8℃，在定轨混合器中，大约30分钟或大约12-15小时或大约24小时)。

使用本领域已知的标准方法，可评估抗原吸附的百分比。例如，可移除并离心(例如，以10,000rpm)抗原/佐剂制备物的等分试样以从佐剂悬浮液(上清液)中分离未吸附的蛋白(沉淀)。可使用二辛可宁酸蛋白测定(BCA)或反相高效液相色谱(RP-HPLC)测定上清液中的蛋白浓度。如下计算吸附百分比：％A＝100-([PrSN]×100/[PrCtr])，其中[PrSN]是上清液中蛋白的浓度，[PfCtr]是相应的无佐剂的对照中的浓度。在优选的实施方案中，％吸附范围为约70％-约100％。在更优选的实施方案中，％吸附为至少约70％。

在有佐剂的免疫的一个实施方案中，免疫原性多肽和/或其片段可与细菌多糖共价偶联以形成多糖缀合物。这种缀合物可用作用于引起针对与多肽和/或其片段缀合的细菌多糖的T细胞依赖的免疫原性反应的免疫原。

当在常规冷冻温度(例如约2℃-约8℃)长期储存时，公开的制剂是稳定的。制剂显示很少或无颗粒团聚、抗原浓度无显著降低并保留显著水平的免疫原性和/或抗原性至少6个月或12个月，优选18个月。短语“抗原浓度无显著降低”旨在意指组合物保留至少50％、60％或70％的最初抗原浓度，更优选至少约80％、85％或90％的最初抗原浓度，更优选至少约91％、92％、98％、99％以上的初次配制呈现的抗原浓度。抗原浓度可例如通过基于RP-HPLC、SDS-PAGE或ELISA的方法测量。

稳定制剂或包含稳定制剂的免疫原性组合物维持实质程度的结构完整性(例如，维持实质量的最初抗原浓度等)。

可通过测量例如呈现的抗原浓度(例如，通过RP-HPLC)或通过利用例如SDS-PAGE分析评估抗原降解，来评估稳定性。可将制剂中的抗原浓度与用相同但未处理(即未用磷酸根或碳酸根离子处理)的铝化合物制备的制剂的抗原浓度比较。稳定性预测和/或比较工具包括例如Stability SystemTM(ScienTek Software，Inc.)，其使用Arrhenius Treatment预测储存温度(2℃-8℃)下的速率常数。用于测量抗原浓度和免疫原性的标准测定是本领域已知的并在实施例中描述。可通过例如用引起疾病的对应于制剂中存在的特定抗原的病原体或毒素攻击后评价免疫和未免疫的受试者的存活率，评估保护功效。

本发明的免疫原性组合物优选为液体形式，但它们可为冻干的(按照标准方法)或泡沫干燥的(如在WO2009012601，Antigen-Adjuvant Compositions and Methods(抗原-佐剂组合物和方法)中所述)。根据本发明的一个实施方案，组合物为液体形式。可将免疫剂量配制成0.5-1.0ml的体积。液体制剂可为适合给药的任何形式，包括例如溶液剂或混悬剂。因此，组合物可包含可被缓冲的液体介质(例如盐水或水)。

制剂(和组合物)的pH优选为约6.4-约8.4。更优选地，pH为约7.4。组合物的例示性pH范围为5-10，例如5-9、5-8、5.5-9、6-7.5或6.5-7。pH可通过使用缓冲剂维持。

本发明的免疫原性组合物的药物制剂亦可任选包含一种或多种本领域公知的赋形剂(例如稀释剂、增稠剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、佐剂、洗涤剂和/或免疫刺激剂)。合适的赋形剂将与抗原和本领域已知的铝佐剂相容。稀释剂的实例包括粘合剂、崩解剂或分散剂，例如淀粉、纤维素衍生物、苯酚、聚乙二醇、丙二醇或甘油。药物制剂亦可包含一种或多种活性成分，例如抗微生物剂、抗炎剂和麻醉剂。洗涤剂的实例包括Tween(聚山梨醇酯)，例如Tween80。本发明的组合物包含的合适赋形剂是本领域已知的。

本发明提供包含PcpA、PhtX(例如，PhtD)和/或解毒的肺炎链球菌溶血素蛋白以及一种或多种对组合物提供有益性质(例如，增加组合物的一种或多种蛋白的稳定性)的药学上可接受的赋形剂的组合物。本发明的组合物中可包含的化合物或赋形剂包括例如，缓冲剂(例如，甘氨酸、组氨酸)；张度剂(例如，甘露糖醇)；碳水化合物(例如糖或糖醇(例如山梨糖醇、海藻糖或蔗糖；1-30％))或碳水化合物聚合物(例如葡聚糖)；氨基酸，寡肽或多氨基酸(多达100mM)；多元醇(例如，甘油，且浓度多达20％)；洗涤剂，脂质或表面活性剂(例如Tween 20、Tween 80或pluronics，具有多达0.5％的浓度)；抗氧化剂；盐(例如氯化钠、氯化钾、氯化镁或醋酸镁，多达150mM)或者它们的组合。

可在本发明的组合物中使用的赋形剂的实例包括在表11和下文实施例中列出的那些。在各种实例中，赋形剂可为引起热稳定性增加(例如，为至少0.5(例如0.5-5、1-4或2-3))的那些，热稳定性通过例如下文所述的测定(例如，SYPRO Orange的外部荧光)测量。

例示性的赋形剂和缓冲剂包括山梨糖醇(例如，4-20％，5-10％)，(参见表11)。这些赋形剂可在本发明中以表11中所列的浓度使用。备选地，该量可变化例如0.1-10倍，如本领域所理解。本领域已知的其他碳水化合物、糖醇、表面活性剂和氨基酸亦可包含在本发明的组合物中。

可单独或组合地使用赋形剂和缓冲剂。这种组合物的pH可为例如5.5-8.0或6.5-7.5，并可将组合物以液体或冻干形式储存在例如2-8℃。在组合物的变化中，可将山梨糖醇用蔗糖(例如，4-20％或5-10％)或海藻糖(例如，4-20％或5-10％)替换。组合物的其他变化包含在本发明中并涉及使用本文所列的其他组分。基于上文，本发明的一种例示性组合物包含10％山梨糖醇，pH 7.4。

在一个实施方案中，单价PlyD1组合物每剂可包含，在约：10mM Tris HCl和约150mM NaCl，约pH 7.4中的范围为5-50μg的抗原、PTH佐剂(具有约0.56mg/mL元素铝，包含2mM磷酸钠缓冲液，在约pH 7.5)。

在另一个实施方案中，单价PhtD组合物每剂可包含，在约：10mM Tris HCl和约150mM NaCl，约pH 7.4中的范围为5-50μg的抗原、PTH佐剂(具有约0.56mg/mL元素铝，包含2mM磷酸钠缓冲液，在约pH 7.5)。

在另一个实施方案中，单价PcpA组合物每剂可包含，在约：10mM Tris HCl和约150mM NaCl，约pH 7.4中的范围为5-50μg的抗原、PTH佐剂(具有约0.56mg/mL元素铝，包含2mM磷酸钠缓冲液，在约pH 7.5)。

在另一个实施方案中，二价制剂组合物每剂可包含，在约：10mM Tris HCl和约150mM NaCl，约pH 7.4中的各范围为5-50μg/剂量的两种蛋白(选自下述：PhtD、PlyD1或PcpA)、PTH佐剂(具有约0.56mg/mL元素铝，包含2mM磷酸钠缓冲液，在约pH 7.5)。

在又一个实施方案中，三价制剂组合物每剂可包含，在约：10mM Tris HCl和约150mM NaCl，约pH 7.4中的各范围为5-50μg/剂量的三种蛋白(PhtD、PlyD1、PcpA)、PTH佐剂(具有约0.56mg/mL元素铝，包含2mM磷酸钠缓冲液，在约pH 7.5)。

在另一实例中，组合物包含山梨糖醇或蔗糖，其关于稳定性已显示提供益处(参见下文)。这些组分的量可为例如5-15％、8-12％或10％山梨糖醇或蔗糖。下文描述其中这些组分以10％存在的具体实例。在一个优选的实施方案中，组合物包含10％山梨糖醇或10％蔗糖。

本发明亦包括鉴定可用于产生包含具有改进性质的肺炎链球菌蛋白(例如，PcpA、PhtX(例如，PhtD)、解毒的肺炎链球菌溶血素)的组合物的赋形剂的方法。这些方法涉及筛查测定(例如在下文进一步描述的那些)，该测定有助于引起组合物中一种或多种蛋白组分稳定性增加的条件的鉴定。这些方法包括如下文进一步描述的稳定性测定。另外，本发明包括使用用于鉴定所需制剂的其他测定，包括溶解度、免疫原性和粘度测定。

根据本发明的一个实施方案，可通过以下方法制备组合物：(i)将氢氧化铝佐剂用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、羧酸盐、二膦酸盐或者两种或更多种这些化合物的混合物处理，和(ii)将处理的氢氧化铝佐剂与免疫原性PcpA多肽和/或免疫原性PhtX多肽混合。在优选的实施方案中，免疫原性PhtX多肽是PhtD。

本发明包含一种或多种肺炎链球菌多肽的免疫原性组合物(例如疫苗)可用于预防和/或治疗肺炎链球菌感染。本发明的预防和治疗方法涉及用一种或多种公开的免疫原性多肽在例如进行治疗本身、在预防随后的感染或在产生用于在被动免疫中随后使用的抗体中接种。

本发明的免疫原性组合物在预防或治疗与肺炎链球菌感染有关或由肺炎链球菌感染引起的疾病、病症、病况或症状的方法中有用。术语疾病、病症和病况本文可交换地使用。特别地，预防和治疗方法包括将治疗有效量的药物组合物给予受试者。在特定实施方案中，提供用于预防或治疗肺炎链球菌的方法。

本文使用的预防疾病或病症旨在意指，将治疗有效量的本发明的药物组合物给予受试者以便保护受试者免于发生与肺炎链球菌相关的特定疾病或病症。

治疗疾病或病症旨在将治疗有效量的本发明的药物组合物给予受肺炎链球菌引起的疾病折磨或暴露于肺炎链球菌的受试者，其中目的是为了治愈、愈合、缓和、缓解、改变、补救、减轻、改善或影响病况或疾病的症状。

治疗有效量指，对给定的病况和给药方案提供治疗作用的量。治疗有效量可由普通技术医务人员基于患者特征(年龄、体重、性别、病况、并发症、其他疾病等)确定。治疗有效量将另外受组合物的给药途径影响。

亦公开了一种降低受试者中肺炎球菌性疾病风险的方法，其包括给予受试者包含一种或多种公开的免疫原性多肽的免疫原性组合物。肺炎球菌性疾病(即，有症状的感染)包括，例如窦感染、中耳炎、支气管炎、肺炎、脑膜炎、溶血性尿毒症和菌血症(败血症)。这些感染的任何一种或多种的风险可通过本文所述的方法降低。优选的方法包括一种降低受试者中的浸润性肺炎球菌性疾病和/或肺炎风险的方法，其包括给予受试者包含免疫原性PcpA多肽和免疫原性PhtX(例如，PhtD)多肽的免疫原性组合物。在其他优选的方法中，组合物还包含解毒的肺炎链球菌溶血素(例如，PlyD1)。

本公开亦提供引起哺乳动物中的免疫反应的方法，所述方法是通过将免疫原性组合物或其制剂给予受试者。这可通过将药学上可接受的组合物制剂给予受试者来达到将免疫原性多肽和/或佐剂暴露于受试者的免疫系统实现。给药可一次发生或可多次发生。在一个实例中，一次或多次给药可作为所谓的“初始-加强”方案的一部分发生。其他给药系统可包括延时释放、延迟释放或持续释放递送系统。

免疫原性组合物可以包含免疫原性组合物和佐剂或复溶溶液的药盒形式呈现，复溶溶液包含一种或多种药学上可接受的稀释剂以促进用于使用常规或其他设备给予哺乳动物的组合物的复溶。这种药盒可任选包括用于给予液体形式的组合物的设备(例如皮下注射器、微针阵列(microneedle array))和/或使用说明书。

本文公开的组合物和疫苗亦可结合到各种递送系统中。在一个实例中，可将组合物应用于“微针阵列”或“微针贴片(microneedle patch)”递送系统用于给药。这些微针阵列或贴片通常包含与基底材料连接的多个针样凸出物并用干燥形式的疫苗包被。当应用于哺乳动物的皮肤时，针样凸出物穿透皮肤并实现疫苗的递送，实现受试哺乳动物的免疫。

定义

本文使用的术语“抗原”指，当导入哺乳动物中时能够起始并介导相应的免疫体(抗体)形成或可被主要组织相容性复合体(MHC)结合并呈递给T细胞的物质。抗原可拥有多个抗原决定簇使得将哺乳动物暴露于抗原可产生多种具有不同特异性的相应抗体。抗原可包括但不限于蛋白、肽、多肽、核酸及其片段、变体和组合。

术语“免疫原”是能够诱导获得性免疫反应的物质。

术语肽、蛋白和多肽本文可交换地使用。

“分离的”多肽是已从其天然环境中移除的多肽。例如，分离的多肽是已从胞质或从细胞膜中移除的多肽，并且其天然环境的许多多肽、核酸和其他细胞物质不再存在。“可分离的”多肽是可从特定来源分离的多肽。“纯化的”多肽是至少60％不含、优选至少75％不含并最优选至少90％不含与其天然缔合的其他组分的多肽。在其中它们天然产生的生物体外产生的多肽(例如通过化学或重组方法)，按照定义被认为是分离和纯化的，因为它们从未在天然环境中存在。

本文使用的多肽“片段”优选具有至少约40个残基或60个残基，并优选至少约100个残基长度。肺炎链球菌多肽片段可通过本领域技术人员已知的方法产生。

术语“抗体”包括未纯化或部分纯化形式(即杂交瘤上清液、腹水、多克隆抗血清)或纯化形式的完整抗体或片段抗体。“纯化的”抗体是与至少约50％的与其最初一起存在的蛋白(即作为杂交瘤上清液或腹水制备物的一部分)分离的抗体。

除非上下文中另外清楚规定，否则说明书和所附的权利要求中使用的单数形式包括复数指示物。因此，例如，提及片段可包括片段的混合物，和提及药物载体或佐剂可包括两种或更多种这样的载体或佐剂的混合物。

本文使用的受试者或宿主意指个体。

任选的或任选地意指，随后描述的事件或情况可或可不发生，而且说明书包括其中事件或情况发生的实例和其中它不发生的实例。例如，短语“任选地，组合物可包含组合”意指，组合物可包含不同分子的组合或可不包含组合，使得说明书包括组合和不存在组合(即，组合的单个成员)两者。

范围可在本文中表示为从约一个特定值和/或至约另一特定值。当表示这样的范围时，另一方面包括从一个特定值和/或至另一个特定值。类似地，当通过使用在前的约或大约将值表示为近似值时，应当理解，特定值形成另一方面。另外应当理解，各范围的端点相对于另一端点是显著的并独立于另一端点。

当本文使用的术语预防与对给定病况的给定治疗有关(例如预防肺炎链球菌感染)时，意在表达治疗的受试者根本不发展临床上可观察的病况水平，或与不存在治疗的他/她相比发展更缓慢和/或至较轻的程度。这些术语不仅限于其中受试者不经历任何病况方面的情况。例如，如果在患者暴露于预期产生给定病况表现的刺激期间给予治疗，并且该治疗导致受试者与不给予时的预期相比经历较少和/或更温和的病况症状，那么声称治疗已预防病况。通过引起受试者呈现仅有的温和明显感染症状，治疗可“预防”感染；这不意指必须没有任何细胞为感染的微生物所渗透。

类似地，与具有给定治疗的感染风险有关的本文使用的降低(例如，降低肺炎链球菌感染的风险)，指与对照或不存在治疗(例如，给予免疫原性多肽)时感染所发展的基础水平相比，受试者发展感染更缓慢或至较轻的程度。感染风险的降低可引起受试者呈现仅有的温和明显感染症状或延缓感染的症状；这不意指必须没有任何细胞为感染的微生物所渗透。

本公开内引用的所有参考文献通过引用以其整体结合到本文中。

实施例

以上公开大体上描述了本发明。通过参考下述具体实施例可获得更完整的理解。描述的这些实施例仅用于例证的目的并不旨在限制本发明的范围。形式的改变和等价替代预期为可表明或提出权宜的情况。虽然本文已使用特定的术语，但是这样的术语旨在描述性的意思而不是限制的目的。

在本公开和这些实施例中使用但未明确描述的分子遗传学、蛋白质生物化学、免疫学和发酵技术方法，在科学文献中被充分报道并完全在本领域技术人员的能力内。

实施例1A

重组PcpA和PhtD多肽

本实施例描述PcpA蛋白和PhtD蛋白的重组制备。简言之，将来自肺炎链球菌(菌株14453(小鼠-强毒荚膜血清型6B菌株)，在1997年6月27日作为ATCC 55987保藏)的两种重组来源的蛋白抗原PhtD(WO2009/012588)和PcpA(WO 2008/022302)在大肠杆菌（E.coli)中重组表达，常规纯化方案后通过系列柱层析分离并纯化。

使用AccuPrime高保真性聚合酶(Invitrogen)以及引物Spn0211和Spn0213，从肺炎链球菌14453基因组PCR扩增phtD基因(但不包括其天然信号肽)。Spn0211和Spn0213分别将NocI和XhoI限制性位点导入到5’和3’端中(参见表2)。使用QIA快速PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物并在琼脂糖凝胶上运行来确定大小。将PCT产物和pET28a(+)载体(Novagen)两者用NcoI和XhoI消化并随后使用QIAEX凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中纯化。使用T4DNA连接酶(Invitrogen)将消化的载体与基因连接在一起。将连接混合物转化到化学感受态的大肠杆菌DH5α中并通过接种在包含50μg/ml卡那霉素的Luria琼脂上，挑选阳性克隆。将来自质粒克隆pBAC27的DNA分离，并通过测序确认为正确的。

然后通过电穿孔将质粒(pBAC27)导入到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。在大约37℃培养转化的菌株并通过加入1mM IPTG来诱导蛋白表达。通过SDS-PAGE分析，由正确大小(即，大约91.9kDa)的诱导蛋白条带的存在证实基因产物的表达。

表2

引物名/号	序列5’→3’
		Spn0211	CTAGCCATGGGATCCTATGAACTTGGTCGTCACCAAG
Spn0213	AGTCCTCGAGCTACTGTATAGGAGCCGGTTG

pBAC27多肽的预测氨基酸序列如下：

MGSYELGRHQAGQVKKESNRVSYIDGDQAGQKAENLTPDEVSKREGINAEQIVIKITDQGYVTSHGDHYHYYNGKVPYDAIISEELLMKDPNYQLKDSDIVNEIKGGYVIKVDGKYYVYLKDAAHADNIRTKEEIKRQKQEHSHNHNSRADNAVAAARAQGRYTTDDGYIFNASDIIEDTGDAYIVPHGDHYHYIPKNELSASELAAAEAYWNGKQGSRPSSSSSYNANPVQPRLSENHNLTVTPTYHQNQGENISSLLRELYAKPLSERHVESDGLIFDPAQITSRTARGVAVPHGNHYHFIPYEQMSELEKRIARIIPLRYRSNHWVPDSRPEQPSPQSTPEPSPSLQPAPNPQPAPSNPIDEKLVKEAVRKVGDGYVFEENGVSRYIPAKDLSAETAAGIDSKLAKQESLSHKLGAKKTDLPSSDREFYNKAYDLLARIHQDLLDNKGRQVDFEVLDNLLERLKDVSSDKVKLVDDILAFLAPIRHPERLGKPNAQITYTDDEIQVAKLAGKYTTEDGYIFDPRDITSDEGDAYVTPHMTHSHWIKKDSLSEAERAAAQAYAKEKGLTPPSTDHQDSGNTEAKGAEAIYNRVKAAKKVPLDRMPYNLQYTVEVKNGSLIIPHYDHYHNIKFEWFDEGLYEAPKGYSLEDLLATVKYYVEHPNERPHSDNGFGNASDHVRKNKADQDSKPDEDKEHDEVSEPTHPESDEKENHAGLNPSADNLYKPSTDTEETEEEAEDTTDEAEIPQVENSVINAKIADAEALLEKVTDPSIRQNAMETLTGLKSSLLLGTKDNNTISAEVDSLLALLKESQPAPIQ(SEQID No：5)

使用Accuprime Taq DNA聚合酶(Invitrogen)和设计用于简化克隆的参入限制性内切核酸酶位点的PCR引物(参见表3)，从肺炎链球菌14453基因组中PCR扩增pcpA基因(但不包括信号序列和胆碱结合结构域)。将pET-30a(+)(Novagen)的质粒DNA纯化为低拷贝质粒，并通过用NdeI和XhoI消化后凝胶纯化来制备其用作克隆载体。所产生的1335碱基对片段是侧翼为XhoI(3’端)和NdeI(5’端)限制性位点的pcpA(不具有信号序列和胆碱结合结构域)。清洁扩增片段，用NdeI和XhoI消化，然后凝胶纯化并连接到pET-30a(+)载体中。通过测序证实插入并将新质粒命名为pJMS87。

表3(引物)

pJMS87多肽的预测氨基酸序列如下：

MADTPSSEVIKETKVGSIIQQNNIKYKVLTVEGNIGTVQVGNGVTPVEFEAGQDGKPFTIPTKITVGDKVFTVTEVASQAFSYYPDETGRIVYYPSSITIPSSIKKIQKKGFHGSKAKTIIFDKGSQLEKIEDRAFDFSELEEIELPASLEYIGTSAFSFSQKLKKLTFSSSSKLELISHEAFANLSNLEKLTLPKSVKTLGSNLFRLTTSLKHVDVEEGNESFASVDGVLFSKDKTQLIYYPSQKNDESYKTPKETKELASYSFNKNSYLKKLELNEGLEKIGTFAFADAIKLEEISLPNSLETIERLAFYGNLELKELILPDNVKNFGKHVMNGLPKLKSLTIGNNINSLPSFFLSGVLDSLKEIHIKNKSTEFSVKKDTFAIPETVKFYVTSEHIKDVLKSNLSTSNDIIVEKVDNIKQETDVAKPKKNSNQGVVGWVKDKG(SEQ ID No：7)

将化学感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞用质粒pJMS87 DNA转化。通过SDS-PAGE分析，由正确大小(即，大约49.4kDa)的诱导蛋白条带的存在证实基因产物的表达。

因为克隆的PcpA多肽缺失信号序列和胆碱-结合结构域，所以其氨基酸序列与全长PcpA蛋白的氨基酸27-470相关联。在所有研究的菌株中，该区是极其保守的，仅具有8个可变位置。最偏离的序列对享有98.7％同一性。

通过载体NTi对重组PcpA蛋白和重组PhtD蛋白预测的等电点分别是7.19和5.16。

在下述血清型中各自检测pcpA基因和phtD基因：1、2、3、4、5、6A、6B、6C、7、7F、9N、9V、11A/B、11A/D/F、12F/B、14、15B、15B/C、16、18C、19A、19F、22、23、23B、23F、33F、34、35B。许多这些血清型不被目前市售的肺炎球菌缀合疫苗PCV7所涵盖。

使用标准方法，表达、分离和纯化重组蛋白产物。

使用标准方法，通过将分离的纯化蛋白与佐剂(例如，氢氧化铝佐剂(例如Alhydrogel 852％)或AlPO₄)在Tris缓冲盐水(pH 7.4)中配制，制备各重组蛋白的有佐剂的单价组合物。将配制的物质转移到玻璃小瓶中并在2℃-8℃保存。通过将所需浓度的各有佐剂的单价制剂等分到容器中并在章动器上室温混合大约0.5小时，制备PhtD和PcpA两者的有佐剂的二价组合物。然后将所需的制剂体积等分到具有橡皮塞和铝盖的无菌3mL玻璃小瓶中。备选地，通过将所需浓度的各分离的纯化蛋白一起混合，然后与佐剂在Tris缓冲盐水(pH 7.4)中配制混合物，制备二价组合物。

实施例1B

本实施例描述表面修饰的佐剂和具有该佐剂的制剂的制备。通过将氢氧化铝佐剂(Alhydrogel^TM，Brenntag)用磷酸盐处理，制备表面修饰的佐剂。使用的氢氧化铝佐剂是湿凝胶悬浮液，其根据制造商耐受再高压灭菌但如果冷冻则损坏。根据制造商，当pH维持在5-7时，佐剂具有正电荷并可吸附带负电荷的抗原(例如，当在中性pH下保持时具有酸性等电点的蛋白)。

a)磷酸盐处理AlO(OH)-将AlO(OH)的水性悬浮液(大约20mg/mL)与磷酸盐缓冲液的贮存液(大约400mol/L)混合，并用约pH7.4的10mM Tris-HCL缓冲液(Sigma Aldrich)稀释，以制备具有大约13mg/mL AlOOH/200mM PO4的磷酸盐处理的AlO(OH)悬浮液(本文称为“PTH”)。然后在室温将该悬浮液混合大约30分钟至24小时。

b)抗原吸附-将重组来源的PcpA和PhtD抗原(如在实施例1A中所述表达、分离和纯化)单独吸附于磷酸盐处理的AlO(OH)。

制备包含各抗原约0.2-0.4mg/mL的纯化抗原(即rPcpA或rPhtD)和0.56mg元素铝/ml/PTH悬浮液的PO4mM的混合物。备选地，使用标准方法制备在Tris缓冲盐水(pH 7.4)中包含纯化的抗原与氢氧化铝佐剂(如852％)或AlPO4的混合物。将混合物在定轨摇床中室温混合约30分钟至24小时以促进抗原与佐剂的缔合。类似的吸附物制备了多次，典型的预吸附组合物是：蛋白(PhtD或PcpA)：0.2-0.4mg/ml、磷酸盐：2-2080mM(优选2-20mM)和AlO(OH)：1.25mg/ml(0.56mg的元素Al/ml)。将制备的吸附抗原的样品在约2℃-8℃储存直至使用。备选地，通过使用磷酸盐处理的氢氧化铝佐剂贮存液将抗原辅佐在一起(以制备二价制剂)。

c)制备二价制剂-将吸附于PTH的PhtD和吸附于PTH的PcpA的中间散装物批次(单价制剂)共混并在定轨摇床中室温一起混合约30分钟以制备二价制剂。典型的预吸附制剂组合物是：0.05mg/ml的各蛋白(rPhtD、rPcpA)、磷酸盐：2-20mM和1.25mg/mL AlO(OH)(0.56mg的元素Al/ml)。

实施例2

用与不同剂量的PcpA和PhtD配制的二价组合物评估抗原干扰和体液反应

本实施例描述多组分组合物在动物中的免疫原性分析。(如实施例1中所述)使用纯化的PhtD和PcpA蛋白、氢氧化铝佐剂85 2％，25.52mg/mL)、Tris缓冲盐水(10mM Tris-HCl pH7.4/150mM NaCl)，制备制剂。将制剂在章动器上混合大约30分钟并分配到玻璃小瓶中。

将多组的10只雌性小鼠(Balb/c K-72小鼠(Charles River)，6-8周龄)用合适的制剂以3周间隔皮下(SC)免疫3次：

A.Tris缓冲盐水pH7.4中的(5μg/mL的PcpA+1.3mg/mLAlOOH)

B.Tris缓冲盐水pH7.4中的(12.5μg/mL的PcpA+1.3mg/mLAlOOH)

C.Tris缓冲盐水pH7.4中的(25μg/mL的PcpA+1.3mg/mLAlOOH)

D.Tris缓冲盐水pH7.4中的(5μg/mL的PhtD+1.3mg/mLAlOOH)

E.Tris缓冲盐水pH7.4中的(12.5μg/mL的PhtD+1.3mg/mLAlOOH)

F.Tris缓冲盐水pH7.4中的(25μg/mL的PhtD+1.3mg/mLAlOOH)

G.Tris缓冲盐水pH7.4中的(5μg/mL的PcpA+5μg/mL PhtD+1.3mg/mL AlOOH)

H.Tris缓冲盐水pH7.4中的(5μg/mL的PcpA+12.5μg/mL PhtD+1.3mg/mL AlOOH)

I.Tris缓冲盐水pH7.4中的(5μg/mL的PcpA+25μg/mL PhtD+1.3mg/mL AlOOH)

J.Tris缓冲盐水pH7.4中的(12.5μg/mL的PcpA+5μg/mL PhtD+1.3mg/mL AlOOH)

K.Tris缓冲盐水pH7.4中的(12.5μg/mL的PcpA+12.5μg/mLPhtD+1.3mg/mL AlOOH)

L.Tris缓冲盐水pH7.4中的(12.5μg/mL的PcpA+25μg/mLPhtD+1.3mg/mL AlOOH)

M.Tris缓冲盐水pH7.4中的(25μg/mL的PcpA+5μg/mL PhtD+1.3mg/mL AlOOH)

N.Tris缓冲盐水pH7.4中的(25μg/mL的PcpA+12.5μg/mLPhtD+1.3mg/mL AIOOH)

O.Tris缓冲盐水pH7.4中的(25μg/mL的PcpA+25μg/mL PhtD+1.3mg/mL AlOOH)

在第一次免疫前2天以及第一、第二和第三次免疫后，从所有动物中取样品出血。将来自个体小鼠的血液样品以9,000rpm离心5分钟并将回收的血清在-20℃储存。

在合并的前出血(prebleed)以及第一、第二和第三次免疫后收集的血清中通过终点稀释ELISA测量总抗原-特异性IgG效价，和各组的几何平均效价在图1中示出。前出血中的抗体效价低于检测限(＜100)，而两种PhtD和PcpA单价制剂在所有组中对两者抗原的最后出血效价都是高的，与从之前研究中观察到的结果一致。PhtD和PcpA-特异性抗体ELISA效价在表4中概述。

表4

用单价或二价制剂免疫的多组小鼠的PcpA和PhtD-特异性ELISA效价

*从个体小鼠测定最后出血抗-PcpA和PhtD效价开以几何平均值呈现。

ELISA数据的统计分析研究，与由单价PhtD制剂引起的抗-PhtD反应相比，PcpA浓度对由二价制剂引起的抗-PhtD反应(第三次免疫后)的影响。类似地，亦评估与由单价PcpA制剂引起的抗-PcpA反应相比，PhtD浓度对由二价制剂引起的抗-PcpA反应(第三次免疫后)的影响。关于抗-PcpA IgG效价，当将由单价PcpA制剂引起的反应与由二价制剂引起的反应相比时，未观察到统计上显著的差异(9/9组)。因此，在任何研究剂量下未观察到统计上显著的与PhtD的正或负相互作用。关于抗-PhtD效价，在由二价制剂引起的抗-PhtD效价(即，反应)与由相应的单价PhtD制剂引起的抗-PhtD效价之间的大多数比较中，未观察到统计上显著的抑制(7/9组)。观察到两个例外，每个显示抗-PhtD效价两倍的降低：(i)包含1μg/剂量的PcpA和2.5μg/剂量的PhtD的二价制剂与2.5μg/剂量的PhtD单价制剂相比(p＝0.034)；和(ii)包含1μg/剂量的PcpA和5.0μg/剂量的PhtD的二价制剂与5.0μg/剂量的PhtD单价制剂相比(p＝0.027)。对于1μg/剂量的PhtD与较高剂量的PcpA(即2.5μg和5μg)，均未观察到统计显著性。然而，该两倍的降低在模型的可变性范围内，并因此不反映显著水平的干扰。

二价组合物中各抗原(PcpA、PhtD)的最优浓度通过统计分析确定为25μg/mL(即5μg/剂量)。具有该浓度抗原(即25μg/mL的PcpA或PhtD)的单价组合物亦引起最高的抗原特异性IgG效价。

实施例3

3次肌内注射二价疫苗后大鼠中的免疫原性研究

本实施例描述多组分疫苗在另一动物物种(即，大鼠)中的安全性和免疫原性分析。

将对照、具有或不具有佐剂的二价疫苗组合物或者有佐剂的单价PcpA疫苗组合物以3周间隔在第0、21和42天向四组(每种性别20只)Wistar Crl：WI(Han)大鼠提供3次IM注射(参见下文表5中的研究设计)。在最后给药后的第2或15天对动物进行尸体解剖。如实施例1中所述制备组合物。用于制备有佐剂的组合物的佐剂是氢氧化铝Brenntag)。关于研究设计的概述，参见表5。

表5(研究设计)

至少每天两次进行发病率/死亡率检查，并每天进行临床检查。没有过早死亡、不良临床体征、对体重、食物消耗、临床化学或眼科学的影响被认为与治疗相关。

通过ELISA分析血清的PhtD和PcpA特异性IgG抗体效价。结果在图2a-d中示出。尽管无佐剂组中的反应更可变，所有处理的动物还是显示稳健的抗-PcpA和抗-PhtD反应。有佐剂的单价PcpA疫苗引起的免疫反应与有佐剂的二价疫苗等价，表明在二价制剂中不存在PhtD的免疫干扰。

二价和PcpA单价疫苗组合物在所有动物中各自诱导免疫反应。根据此处的结果，二价和PcpA单价疫苗组合物在大鼠中是免疫原性的。有佐剂的组合物比无佐剂的组合物更具免疫原性。

实施例4

评估用不同的基于铝的佐剂配制的二价组合物的免疫原性

本实施例描述用不同的基于铝的佐剂配制的多组分组合物的免疫原性分析。

在一个研究中，将重组PhtD和PcpA(如实施例1中所述制备和纯化)与新鲜氢氧化铝佐剂已在2-8℃孵育大约6个月的老化的氢氧化铝佐剂Brenntag)、用各种浓度的磷酸基PO₄(2mM、10mM和20mM)处理的氢氧化铝佐剂Brenntag)或AlPO₄ Brenntag)配制。如实施例1中所述制备制剂。将多组抵达6-8周龄的5(或4)只雌性Balb/c小鼠(Charles River)用合适的制剂以3周间隔肌内(IM)免疫3次。给予各组的具体制剂在表6中示出。

最后出血后的PhtD和PcpA-特异性抗体ELISA效价在表6中概述。用PcpA和/或PhtD蛋白免疫的小鼠在免疫后产生抗原-特异性抗体反应。在用二价制剂(具有新鲜或老化的AlOOH或者用磷酸盐(在使用的三种浓度的任一种下)预处理)免疫的动物中未观察到抗-PhtD和抗-PcpA效价中的显著差异。当与包含AlOOH或含有PO₄的AlOOH佐剂的制剂相比时，使用以AlPO₄(其比AlOOH免疫原性低)配制的二价组合物免疫引起明显更低的抗-PhtD IgG效价。在比较用氢氧化铝佐剂和AlPO₄佐剂配制的二价组合物的其他研究中证实了这些结果。

总计，使用重组PcpA和PhtD两者作为与基于铝的佐剂(氢氧化铝佐剂、用各种浓度的PO₄处理的氢氧化铝佐剂、AlPO₄)配制的免疫原，完成四组研究。在范围是1-5μg/剂量的各种剂量下给予两种抗原。在合并的前出血和三次IM或SC免疫后收集的血清中测定特异性PcpA和PhtD抗体效价。前出血中的抗体效价低于检测限(＜100)，而最后出血效价对于抗-PcpA范围是124827-204800，对于抗-PhtD是36204-97454。

总之，根据此处的结果，用任何测试的佐剂配制的组合物是免疫原性的。与用AlPO₄制剂免疫相比，用与氢氧化铝佐剂(即氢氧化铝佐剂和用磷酸盐处理的氢氧化铝佐剂)配制的重组PhtD和PcpA蛋白免疫对PcpA和PhtD两者产生明显更高的抗原-特异性抗体反应(IgG效价)。

表6

用安慰剂或二价疫苗制剂免疫的多组小鼠的PcpA和PhtD-特异性ELISA效价

*从个体小鼠测定最后出血抗-PcpA和PhtD效价并以几何平均值呈现。

实施例5

用肺炎链球菌菌株14453、MD或941192攻击后的存活

本实施例描述多组分疫苗在小鼠鼻内攻击模型中针对致命肺炎球菌攻击的保护能力。

使用鼻内(IN)攻击模型，评价重组PhtD和PcpA的二价制剂。在该模型中，将多组雌性CBA/j小鼠(N＝15/组)用二价组合物肌内(IM)免疫，该二价组合物包含在TBS中与佐剂(用2mM PO₄处理的AlOOH(65μg/剂量))配制的5μg/剂量的各纯化重组PhtD和PcpA蛋白。注射体积为50μL/剂量。作为阴性对照，注射包含铝佐剂的PBS安慰剂。开始研究后第0、3和6周IM免疫动物。在第9周，鼻内给予动物致死剂量(大约106CFU)的PBS悬液中的肺炎链球菌菌株MD、菌株14453或941192(40μL攻击体积/小鼠)。在第一次注射前4天(在第0周免疫前)和攻击前4天，从所有动物中取样品出血。通过抗体ELISA测定，分析血清的总PhtD和PcpA-特异性IgG反应。

攻击后，每天监控小鼠的死亡率。使所有存活的小鼠攻击后11天安乐死。使用Fisher的单侧精确检验，通过比较免疫组与安慰剂对照中的存活确定保护(p值＜0.05被认为显著)。研究的结果(以％存活记录)在下文图3和表7中示出。

表7

用二价疫苗或安慰剂免疫的小鼠的存活结果

*使用Fisher精确检验相对安慰剂组计算p值；攻击后11天与安慰剂组的不同

在IN攻击模型中，用组合的重组PhtD和PcpA蛋白免疫，产生针对3种不同的肺炎链球菌菌株的致命IN攻击的保护。在已用14453菌株或MD菌株攻击的各组中观察到的保护是统计上显著的。用941192菌株攻击的组亦具有高的％存活，但鉴于阴性对照组(单独用佐剂免疫)中观察到的存活百分比，该保护不被认为统计上显著。

实施例6

使用不同给药途径(皮下或肌内)攻击后的体液反应和存活

(使用两个不同批次的各rPhtD和rPcpA)制备PhtD和PcpA的二价组合物，并与用2mM磷酸盐预处理的氢氧化铝佐剂(AlOOH)配制(根据与该申请同时提交的专利申请中描述的方法)。在小鼠主动免疫鼻内攻击模型(基于在Zhang Y.A.等，Infect.Immunol.69：3827-3836中描述的模型)中评价制备的制剂。更具体而言，将抵达6-8周龄的16组的6只雌性CBA/j小鼠(Charles River)用合适的制剂以3周间隔肌内或皮下免疫3次：

A.PcpA批次A，PhtD批次C，无佐剂，皮下(25μg/ml/蛋白)

B.PcpA批次B，PhtD批次C，无佐剂，皮下(25μg/ml/蛋白)

C.PcpA批次A，PhtD批次D，无佐剂，皮下(25μg/ml/蛋白)

D.PcpA批次B，PhtD批次D，无佐剂，皮下(25μg/ml/蛋白)

E.PcpA批次A，PhtD批次C+2mM磷酸盐处理的AlOOH，皮下(25μg/ml/蛋白)

F.PcpA批次B，PhtD批次C+2mM磷酸盐处理的AlOOH，皮下(25μg/ml/蛋白)

G.PcpA批次A，PhtD批次D+2mM磷酸盐处理的AlOOH，皮下(25μg/ml/蛋白)

H.PcpA批次B，PhtD批次D+2mM磷酸盐处理的AlOOH，皮下(25μg/ml/蛋白)

I.PcpA批次A，PhtD批次C，无佐剂，肌内(100μg/ml/蛋白)

J.PcpA批次B，PhtD批次C，无佐剂，肌内(100μg/ml/蛋白)

K.PcpA批次A，PhtD批次D，无佐剂，肌内(100μg/ml/蛋白)

L. PcpA批次B，PhtD批次D，无佐剂，肌内(100μg/ml/蛋白)

M.PcpA批次A，PhtD批次C+2mM磷酸盐处理的AlOOH，肌内(100μg/ml/蛋白)

N.PcpA批次B，PhtD批次C+2mM磷酸盐处理的AlOOH，肌内(100μg/ml/蛋白)

O.PcpA批次A，PhtD批次D+2mM磷酸盐处理的AlOOH，肌内(100μg/ml/蛋白)

P.PcpA批次B，PhtD批次D+2mM磷酸盐处理的AlOOH，肌内(100μg/ml/蛋白)

给予的二价制剂分别包含5μg/剂量的各抗原(即PhtD和PcpA)并在TBS pH 7.4中与佐剂(用2mM磷酸盐预处理的1.3mg/mLAlO(OH))配制。第三次(最后)出血后4天，给予小鼠致死剂量1×10⁶CFU)的肺炎链球菌菌株MD。

第一、第二和第三次免疫前一天以及第三次免疫后三周，从所有动物中取样品出血。将来自个体小鼠的血液样品以9,000rpm离心5分钟并将回收的血清在-20℃储存。

通过终点稀释ELISA和定量ELISA测量总抗原-特异性IgG效价，各组的几何平均效价在图4a-4b中示出。存活结果在图5中概述。

由不同批次的PcpA和PhtD引起的抗-PcpA和抗-PhtD IgG效价之间没有统计差异。在皮下给予有佐剂的制剂时观察到有优势；更具体而言，肌内给予的制剂比皮下给予的制剂免疫原性低。此外，无佐剂的制剂比有佐剂的制剂免疫原性低。

关于存活，测试制剂赋予针对致命肺炎链球菌攻击的保护(在用100μg//ml的各PhtD和PcpA与预处理的AlO(OH)的制剂免疫的组中观察到100％存活)。肌内免疫的组与皮下免疫的组之间在％存活方面无显著差异。用两个PhtD批次免疫的组的％存活无显著不同，而用两个PcpA批次免疫的组的％存活显著不同(批次B提供明显更高的存活)。与无佐剂的制剂相比，PcpA批次B在有佐剂的制剂中亦提供明显更高的％存活。与无佐剂的制剂相比，在有佐剂的制剂中未观察到其他统计优势。

在本研究中，发现用于攻击小鼠的特定批次的细菌毒力低于之前使用的该细菌菌株的批次。在单独的研究中(亦使用鼻内攻击模型)，用Tris-HCl盐水，150mM，pH＝7.4中的100ug.mL的各PhtD和PcpA+1.3mg/mL AlO(OH)“85”2％，25.08mg/mL)免疫，大约80％(p值0.011)的小鼠存活于致命肺炎链球菌攻击。

实施例7

本实施例描述兔PhtD和PcpA抗血清的制备。使用加His标签的PhtD、加His标签的PcpA与重组PhtD和PcpA，通过标准方法学在兔中产生抗血清。血清中的PhtD和PcpA特异性抗体的测量由ELISA确定。如在表8中所示，作为PhtD的实例，除前出血(接种疫苗前)血清外，在所有免疫的兔血清中检测到高效价的PhtD特异性抗体。加His标签的PhtD和PhtD蛋白两者在兔中都有免疫原性，并且抗血清具有高效价的PhtD特异性抗体。对His-PcpA和PcpA蛋白观察到类似的结果(数据未显示)。

表8：PhtD兔抗血清的产生

研究	兔	免疫	出血	ELISA效价
					1	7	加His标签的PhtD	前出血	＜100
1	7	加His标签的PhtD	最后出血	409，600
					1	8	加His标签的PhtD	前出血	＜100

1	8	加His标签的PhtD	最后出血	819，200
					8	3	PhtD	前出血	＜100
8	3	PhtD	最后出血	819，200
					8	4	PhtD	前出血	＜100
8	4	PhtD	最后出血	409，600

实施例8

本实施例描述人PhtD和PcpA特异性抗体的制备。使用亲和层析从正常合并的成人血清中纯化人多克隆抗体。使用与纯化的重组抗原蛋白(PhtD或PcpA)共价偶联的CNBr-活化琼脂糖树脂，制备亲和层析柱。将人AB血清(Sigma)与亲和柱结合，然后洗涤亲和柱，用甘氨酸-HCl缓冲液洗脱特异性抗体。

通过超滤浓缩合并的洗脱流分并将缓冲液交换为PBS，获得最终纯化的抗体。通过经过0.22-μm注射过滤器过滤，使抗体溶液无菌。使用UV光谱测定总蛋白浓度。使用来自Charles River Laboratories的Endosafe PTS Reader测定最终抗体制品的外毒素水平。通过SDS-PAGE、蛋白质印迹和抗体ELISA分析测定纯化抗体的纯度、特异性和交叉反应性。除非另有说明，每批次从100mL的人AB血清中纯化。

实施例9

使用抗-phtD和抗-PcpA的表面可接近性抗体FACS测定

本实施例描述抗-PhtD和抗-PcpA抗体的结合能力分析。在完全培养基或缺失Mn2+的培养基中将培养物从冻存物培养至OD450 0.4-0.6。洗涤细菌并在PBS中用不同浓度的人亲和纯化抗体孵育。将抗PspA的人纯化单克隆抗体用作阳性对照。使用第二抗体FITC缀合的抗-人IgG检测与细菌结合的抗体，并使用流式细胞术评价。类似地，使用抗-PhtD和抗-PcpA特异性兔血清。使用第二抗体FITC缀合的抗-兔IgG检测与细菌结合的抗体，并使用流式细胞术评价。

当检测到荧光信号时，作为定量测定读出，细菌得分阳性。作为测量与细菌表面结合的抗体量的方法，分析平均荧光强度(MFI)。

进行表面可接近性测定(‘SASSY’)以测定抗原-特异性兔血清和纯化的人抗体与活的、完整的肺炎链球菌的结合能力。

纯化的人抗体以及兔PhtD-抗血清和PcpA-抗血清(如实施例7和8中所述制备)结合活的肺炎链球菌表面上的蛋白。除了对PcpA阴性的菌株D39外，PhtD和PcpA兔抗血清两者与所有测试的肺炎链球菌菌株(包括实验室分离菌和临床分离菌)结合。然而，这与通过PCR扩增pcpA基因发现菌株D39(一种实验室菌株)是pcpA-阴性的一致。在PcpA的情况下，当细菌在缺失Mn2+但增加Zn2+的条件中培养时，尤其发生识别。同时，数据证实，针对重组蛋白产生或通过天然感染产生的抗体识别天然蛋白，并且在各种各样的临床分离菌上的表位是保守的。数据亦表明PcpA和PhtD两者是高度表面可接近的(图6，数据未示出)。将兔免疫前血清用作阴性对照。

为了确定是否人纯化的PhtD和PcpA抗血清对结合肺炎链球菌具有任何累加效应，将10EU/ml抗-PhtD抗体加入到包含增加量的抗-PcpA抗血清的各样品中。通过MFI测量与细菌结合的总抗体量(图7)。抗-PcpA抗体能够呈剂量依赖方式与活的肺炎链球菌结合。加入抗-PhtD抗体引起样品的MFI一致的增加，证实针对多种表面蛋白的抗体可同时结合，而且这引起与细菌表面上结合的抗体的总量的增加。

将纯化的人抗-PcpA抗体，与或不与纯化的人抗-PhtD抗体，以不同浓度与活的已在Mn2+缺陷培养基中培养的肺炎链球菌菌株WU2一起孵育。使用FITC-山羊-抗-人IgG检测与细菌表面结合的抗体。平均荧光强度(MFI)在图7中示出。抗体效价在抗-PcpA EU/ml(抗-PcpA和抗-PcpA+抗-PhtD样品)或抗-PhtD EU/ml(抗-PhtD样品)中示出。

用抗-PhtD和抗-PcpA兔血清以及纯化的人抗体的表面可接近性实验表明，PcpA和PhtD两者是表面可接近的。此外，人抗-PcpA和抗-PhtD抗体可同时结合，并因此增加与细菌结合的抗体总量。

实施例10

本实施例描述由多价组合物提供的被动保护分析。

在本研究中，将与AlPO₄配制的重组PhtD和PcpA的二价组合物用于肌内(i.m.)免疫两只新西兰白兔(Charles River)，以获得抗-PcpA/抗-PhtD多克隆血清。对各兔肌内注射AlPO₄(3mg/ml)中的10μg/剂量的rPcpA和10μg/剂量的rPhtD(20μg总蛋白，500μl总注射体积/兔)。用AlPO₄中的10μg/剂量的rPcpA和10μg/剂量的rPhtD以3周间隔提供两次随后的免疫。第一次和第二次免疫后收集样品出血。最后免疫后三周收集最后出血。在凝胶分离管中收集血液，使其凝固并通过离心获得血清，合并并在约-20℃储存。评估两只兔子的PhtD和PcpA-特异性总IgG抗体效价。通过ELISA，来自实验中使用的一只兔子的血清具有下述效价：PhtD 204，800和PcpA102，400。

将重组PhtD蛋白和/或重组PcpA蛋白加入特定血清样品中以竞争抑制(阻断)血清中存在的相应抗体。作为对照，两种重组蛋白都不加入特定血清样品中。使用基于较早公布的模型(Briles DE等，J.Infect Dis.2000年12月)的一种被动保护小鼠模型，然后将各种稀释的血清样品给予用肺炎链球菌攻击的小鼠。为了鉴定Probit剂量反应曲线，将给予的每log稀释血清所观察到的％存活用曲线图表示(参见图8)。对于各血清样品，计算ED50(对50％存活有效的log稀释)。使用统计模型，评估阻断和未阻断血清样品之间在ED50上的差异(参见下文表9)。

表9

蛋白阻断组与未阻断组之间的统计比较

*：Fisher精确检验

竞争性抑制在包含PcpA和PhtD特异性抗体两者的血清中的PcpA抗体显著降低ED50(即，对50％存活有效的log血清稀释)，且该差异与未阻断血清的ED50相比是统计上显著的。竞争性抑制在包含PcpA和PhtD特异性抗体的血清中的PhtD抗体亦降低ED50(虽然不是统计上显著的)。关于其中PcpA和PhtD抗体两者受竞争性抑制(通过以蛋白/血清比1∶10向血清中加入各PhtD和PcpA蛋白)的血清样品，仅对于所用的最高稀释，通过Fisher精确检验获得具有统计显著性的低％存活，并因此ED50不可测定。

总之，PhtD和PcpA抗体两者有助于针对二价制剂产生的血清引起的被动保护。针对二价制剂产生的血清所提供的保护通过竞争性抑制PhtD和PcpA抗体两者而被阻断，且该结果与当仅一种抗体(PhtD或PcpA)被竞争性抑制时获得的结果显著不同。在相同的被动保护模型中使用PhtD和PcpA蛋白与兔三价超免疫血清(使用包含PhtD、PcpA和PlyD1的三价组合物产生)，获得类似的结果。在该研究中，PhtD与PcpA蛋白一起能够阻断三价超免疫血清的保护潜能。来自该被动保护模型的这些结果暗示，各蛋白-特异性抗体的贡献是累加的。

实施例11

铝浓度对疫苗制剂免疫原性的影响

本实施例描述与磷酸盐预处理的AlO(OH)和不同浓度的元素铝配制的多组分组合物的免疫原性分析。

将雌性Balb/c小鼠用于评估由有佐剂的三价制剂引起的免疫反应。为了制备三价制剂，如实施例1中所述，将重组PhtD、PcpA和无酶活性的肺炎链球菌溶血素突变体(PlyD1，如在PCT/CA/2009/001843的SEQ ID NO：44和本文的SEQ ID NO：9中所示)与含有PO₄(2mM)的AlO(OH)配制。在开始研究前，将制备的制剂样品在2-8℃储存。将多组Balb/c小鼠用合适的制剂以3周间隔肌内(IM)免疫3次：

A.无佐剂(三价，TBS pH＝7.4中的50μg/mL的PcpA和PhtD以及100μg/mL的Ply突变体)

B.三价，Tris盐水pH＝7.4中的50μg/mL的PcpA和PhtD以及100μg/mL的Ply突变体+0.56mg Al/mL PTH，P∶Al摩尔比＝0.1(0.56mg Al/mL用2mM PO4处理的AlO(OH))

C.三价，Tris盐水pH＝7.4中的50μg/mL的PcpA和PhtD以及100μg/mL的Ply突变体+0.28mg Al/mL PTH，P∶Al摩尔比＝0.1(0.28mg Al/mL用1mM PO4处理的AlO(OH))

D.三价，Tris盐水pH＝7.4中的50μg/mL的PcpA和PhtD以及100μg/mL的Ply突变体+1.12mg Al/mL PTH，P∶Al摩尔比＝0.1(1.12mg Al/mL用4mM PO4处理的AlO(OH))

E.三价，Tris盐水pH＝7.4中的50μg/mL的PcpA和PhtD以及100μg/mL的Ply突变体+1.68mg Al/mL PTH，P∶Al摩尔比＝0.1(1.68mg Al/mL用6mM PO4处理的AlO(OH))。

第一、第二和第三次免疫后收集血清。通过定量ELISA测量总抗原-特异性IgG效价并计算各组的几何平均效价(+/-SD)。获得的总IgG效价的概况在图9中示出。

所有有佐剂的组(B、C、D和E)比无佐剂的组(A)产生明显更高的针对所有三种抗原的效价(p＜0.001)。关于各抗原，当用具有0.56mg元素铝/mL的PTH为佐剂时，效价水平最大(且在PhtD的情况下，用铝0.56mg/mL和两个较高的浓度引起的效价之间的差异是统计上显著的)。类似地，关于各抗原，当用具有0.28mg元素铝/mL的PTH为佐剂时，效价水平较低(且在PcpA的情况下，差异是统计上显著的)。这些发现是出乎意料的。预期抗体(IgG)效价与铝浓度成比例增加(如在Little S.F.等，Vaccine，25：2771-2777(2007)中报道)。出乎意料地，即使各抗原的浓度保持不变，随着铝浓度增加，效价降低而不是达到稳定(且关于PhtD，其是统计上显著的)。

实施例12

本实施例描述有佐剂的疫苗制剂在各种条件下的稳定性评价。将许多PTH吸附的疫苗制剂在5℃、25℃、37℃孵育5天(即，在热加速条件下)。

为了评价4种不同的PcpA疫苗制剂(在AlO(OH)或PTH中配制)的稳定性，将各制剂在37℃孵育6周，然后通过RP-HPLC评估。获得的稳定性结果在表10中概述。孵育期间(在37℃)后，来自未处理的AlO(OH)的回收减少了几乎50％，而在包含PTH的制剂中观察到很少至没有的降解。

表10

在37℃孵育6周后PcpA的％回收(RP-HPLC)

为了评价单价和二价制剂(用AlO(OH)或PTH配制)中的PcpA和PhtD的稳定性，如实施例1中所述，使用AlO(OH)或含2mM磷酸盐的磷酸盐处理的AlO(OH)制备制剂，然后将样品在各种温度(即5℃、25℃、37℃或45℃)下孵育约16周。然后通过RP-HPLC评估抗原浓度。获得的稳定性结果在图10a-f中示出。如图所示，与用未处理的AlO(OH)为佐剂的制剂相比，用磷酸盐处理的AlO(OH)为佐剂的制剂中的PcpA和PhtD的降解速率，尤其在加速(应激)条件(例如25、37、45℃)下显著降低。

为了评价多价制剂(用AlO(OH)或PTH配制)中的PcpA和PhtD抗原性的抗原性稳定性，如实施例1中所述制备二价制剂(100μg/mL)，然后将样品在约37℃孵育大约12周。通过定量ELISA夹心测定评价各制剂在零时和12周孵育期间后的抗原性。结果在图11中示出。与用AlO(OH)的制剂相比，当用PTH配制时，在37℃12周孵育期间后，PcpA和PhtD两者的抗原性明显更高。

实施例13

本实施例描述各种赋形剂对许多制剂稳定性的影响的评价

在各种浓度下进行18种GRAS(一般公认安全)化合物的筛查。将一个测定用于筛查增加待评价的各蛋白(即，PcpA、PhtD和解毒的肺炎链球菌溶血素突变体(PlyD1，如描述于PCT/CA/2009/001843：Modified PLY Nucleic Acids and Polypeptides(修饰的PLY核酸和多肽)的SEQ ID NO：44))热稳定性的化合物。

大体上如实施例1中对PhtD和PcpA所述以及如在PCT/CA/2009/001843(如SEQ IDNO：44)中对PlyD1(关于其序列，本文记录为SEQ ID NO：9)所述，将各蛋白抗原在大肠杆菌中重组表达，并在常规纯化方案后，通过系列柱层析纯化。所有3种抗原的蛋白纯度通常高于90％，如通过RP-HPLC和SDS-PAGE评价。在包含150mM氯化钠的10mM Tris，pH 7.4中以大约1mg/mL供应蛋白散装物(bulk)。将各蛋白用10mM tris缓冲盐水，pH 7.5(TBS)中的合适赋形剂溶液(以表11中记录的浓度)稀释至所需浓度(100μg/mL PcpA、100μg/mL PhtD、200μg/mL PlyD1)，并将PTH加入蛋白溶液中来实现终浓度为0.6mg元素Al/mL。亦测定对照样品(没有合适的赋形剂)。将Orange，5000X(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)用DMSO(Sigma)稀释至500X，并接着加入到有佐剂的蛋白溶液中。在所有情况下，SYPRO-Orange的最优稀释为从5000X的商业贮存液至10X。

使用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)仪器(Mx3005p QPCRSystems，Stratagene，LaJolla，CA)，在96孔聚丙烯板(Stratagene，La Jolla，CA)中进行测定。将大约100μL的样品体积加入各孔中，然后用光学盖条(Stratagene，La Jolla，CA)盖住板以防止样品蒸发。将板在配备96孔板转子的Contifuge Stratos离心机(Heraeus Instruments，England)中以200g室温离心1分钟。然后将板以每分钟1℃从25℃加热至96℃。分别在492nm和610nm设置荧光激发和发射过滤器。对于各样品，在25℃和然后每增加1℃获得荧光读数(在610nm发射，在492nm激发)。

使用荧光最小值的一阶导数对应的温度，获得热转变(熔化温度，Tm)。使用与RT-PCR系统一起提供的MxPro软件，从熔化曲线(或解离曲线)中计算负一阶导数迹线的最小值。Tm定义为热熔化的中点并代表其中天然和非天然形式的蛋白自由能相等的温度。以下式评估各赋形剂的作用：ΔTm＝Tm(具有蛋白+化合物的样品)-Tm(蛋白对照样品)。获得的结果概述在表11中记录。该测定的灵敏度是+/-0.5℃。

多元醇、单糖和二糖呈浓度依赖的方式增加有佐剂的PlyD1的Tm，其中在高浓度的糖下观察到最大的稳定化(即，Tm增加约4℃)。除了精氨酸减少了PhtD的Tm约2℃外，对于各PcpA和PhtD检测到类似的结果。发现下述赋形剂有效增加所有三种蛋白的热稳定性：山梨糖醇(20％，10％)、海藻糖(20％)、葡萄糖(20％，10％)、蔗糖(10％，5％)和10％乳糖。

亦研究筛查测定中鉴定的数种赋形剂对应激条件下储存的PcpA物理稳定性和抗原性的影响，以观察与较早观察的热稳定性作用的任何相关性。将PcpA蛋白用图中所述的合适赋形剂溶液(10mM Tris缓冲液pH 7.4中的10％山梨糖醇、10％蔗糖、10％海藻糖)稀释至所需的浓度(例如，约100μg/mL)，并向蛋白溶液中加入PTH以实现终浓度为0.6mg元素Al/mL。该研究中亦包括对照样品(没有赋形剂)。将样品在50℃储存3天时间。通过RP-HPLC评价蛋白降解并通过定量夹心ELISA评估抗原性。结果在图12A和12B中示出。

在配备二极管阵列UV检测器的Agilent 1200 HPLC系统中通过RP-HPLC测量完整蛋白的浓度。使样品在PBS/Zwittergent缓冲液中37℃从佐剂脱附5小时，使用ACE C4柱(Advanced Chromatography Technologies，Aberdeen，UK)以及缓冲液A(水中的0.1％TFA)和缓冲液B(CAN中的0.1％TFA)的流动相梯度，以1ml/min的流速使用每分钟0.75％的缓冲液B梯度在30分钟内分离。通过210nm的UV吸光度监控蛋白并针对用外部标准品产生的5点线性标准曲线定量。

将定量抗原夹心ELISA用于评价PcpA制剂在零时和50℃孵育3天后的抗原性。将兔IgG抗-PcpA血清用于抗原捕获，并将很好表征的单克隆抗-PcpA用于检测。简言之，将96孔板用兔抗-PhtD IgG以2μg/mL的浓度在0.05M Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液中室温(RT)包被18小时，用1％BSA/PBS RT封闭1小时，然后在PBS/0.1％Tween20(WB)的洗涤缓冲液中洗涤2次。将2倍稀释的测试样品、内部对照和已知浓度的纯化的PcpA参比标准品在0.1％BSA/PBS/0.1％Tween 20(SB)中制备，加入孔中并在RT孵育1小时后，在WB中洗涤5次。将检测第一mAb在SB中稀释至0.1μg/mL的浓度，并在RT孵育1小时后，在WB中洗涤5次，加入以1/40K在SB中稀释的F(ab’)2驴抗-小鼠IgG(H+L)特异性。在WB中洗涤5次后，将TMB/H₂O₂底物加入孔中，并在RT孵育10分钟。通过加入1MH₂SO₄终止反应。将ELISA板在板读数仪(SpectraMax，M5，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)中在A450/540nm读数，并使用软件SoftMax PRO，使用4-参数计算术，从标准曲线中通过外推法计算测试样品数据。

如图12A中所示，来源于RP-HPLC的数据显示，增加有佐剂的PcpA Tm的那些赋形剂亦在50℃在3天期间降低蛋白的降解速率。如由PcpA蛋白随时间推移的百分比回收所确定的最大稳定性由10％山梨糖醇提供(如在图12A中所示)。有佐剂的PcpA的抗原性亦被这些赋形剂保留(如在图12B中所示)。与RP-HPLC结果很好相关，山梨糖醇似乎比蔗糖或海藻糖保留抗原性至更高的程度。

当与不具有赋形剂的对照样品相比时，10％山梨糖醇、10％蔗糖或10％海藻糖的加入在50℃显著降低PcpA的速率常数，并增加其半寿期(表12)。与对照相比，9.0的缓冲pH降低蛋白的Tm，但在50℃加速降解(即，增加速率常数)(表12)。总之，这些结果表明，由该测定检测的热稳定性、由RP-HPLC检测的物理稳定性与由ELISA检测的抗原性之间相关性好。

鉴于这些研究中获得的结果，山梨糖醇、蔗糖、葡萄糖、乳糖和/或海藻糖是可被PcpA、PhtD和解毒的肺炎链球菌溶血素蛋白(例如，PlyD1)的单价和多价(例如，二价、三价)制剂包含以增加物理稳定性的赋形剂实例。

表11

GRAS赋形剂对Tm的影响(如通过在温度范围内监控荧光发射评估)。增加热稳定性的化合物提供正Tm差值。

表12

来自在50℃孵育的制剂的稳定性数据的速率常数值

通过使用零级动力学方程(1)[A_t]＝-kt+[A₀]，拟合图12A中呈现的RP-HPLC稳定性数据，计算在50℃孵育的制剂的速率常数，其中A_t是给定时间的抗原浓度，A₀是初始蛋白浓度(μg/mL)，t是时间(天)。对于使用方程(1)的数据线性拟合，记录了R²。

实施例14

进行pH对与或不与铝佐剂配制的三种不同抗原的稳定性的影响。将一个测定用于评价pH对待评价各蛋白(即，PcpA、PhtD和解毒的肺炎链球菌溶血素突变体(PlyD1，如描述于PCT/CA/2009/001843：Modified PLY Nucleic Acids and Polypeptides (修饰的PLY核酸和多肽)的SEQ ID NO：44和记录于本文序列表的SEQ ID NO：9))热稳定性影响。

大体上如实施例1中对PhtD和PcpA所述以及如在PCT/CA/2009/001843中对PlyD1所述，将各蛋白抗原在大肠杆菌中重组表达，并在常规纯化方案后，通过系列柱层析纯化。所有3种抗原的蛋白纯度通常高于90％，如通过RP-HPLC和SDS-PAGE评价。在包含150mM氯化钠的10mM Tris，pH 7.4中以大约1mg/mL供应蛋白散装物。将各蛋白用合适的缓冲溶液(即，10mM Tris缓冲液(pH 7.5-9.0)、10mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0-7.0)和10mM醋酸盐缓冲液(pH5.0-5.5))稀释至所需浓度(100μg/mL PcpA、100μg/mLPhtD、200μg/mL PlyD1)，并将铝佐剂(即，氢氧化铝(Alhydrogel，Brenntag Biosector，Denmark)或磷酸铝(Adju-Phos，Brenntag Biosector，Denmark)或用2mM磷酸盐预处理的氢氧化铝(PTH))加入蛋白溶液中来实现终浓度为0.6mg元素Al/mL。亦测定对照样品(没有合适的赋形剂)。将Orange，5000X(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)用DMSO(Sigma)稀释至500X，并接着加入到有佐剂的蛋白溶液中。在所有情况下，SYPRO-Orange的最优稀释为从5000X的商业贮存液至10X。

使用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)仪器(Mx3005p QPCR Systems，Stratagene，LaJolla，CA)，在96孔聚丙烯板(Stratagene，La Jolla，CA)中进行测定。将大约100μL的样品体积加入各孔中，然后用光学盖条(Stratagene，La Jolla，CA)盖住板以防止样品蒸发。将板在配备96孔板转子的Contifuge Stratos离心机(Heraeus Instruments，England)中以200g室温离心1分钟。然后将板以每分钟1℃从25℃加热至96℃。分别在492nm和610nm设置荧光激发和发射过滤器。对于各样品，在25℃和然后每增加1℃获得荧光读数(在610nm发射，在492nm激发)。

使用荧光最小值的一阶导数对应的温度，获得热转变(熔化温度，Tm)。使用与RT-PCR系统一起提供的MxPro软件，从熔化曲线(或解离曲线)中计算负一阶导数迹线的最小值。Tm定义为热熔化的中点并代表其中天然和非天然形式的蛋白自由能相等的温度。获得的结果概述记录在图13中。该测定的灵敏度是+/-0.5℃。

对于大部分蛋白，溶液pH决定蛋白上的电荷类型和总电荷，并因此可影响静电相互作用和总体稳定性。对于有佐剂的蛋白，溶液pH和缓冲剂种类对铝佐剂表面上的微环境pH具有强影响，其可最终影响吸附于铝佐剂的蛋白的降解速率。

在研究的pH范围中，所有3种蛋白为90-100％吸附于氢氧化铝。在磷酸铝中，PcpA的吸附高于80％，而PhtD和PlyD1(各为酸性蛋白)在超过pH5时极小量地吸附于佐剂(数据未显示)。

图13显示当与佐剂配制时和在无佐剂的对照中，pH对3种抗原的每一种的影响。无佐剂的抗原呈现其独特的pH稳定性特征。PcpA在6.0-9.0的宽pH范围上显示稳定的Tm值，随着pH从6.0降至5.0，其具有降低的Tm值。在另一方面，无佐剂的PhtD和PlyD1的热稳定性在酸性pH下出现最大化(参见图13)。由于加入铝佐剂，无佐剂的蛋白的热稳定性特征显著改变。与无佐剂的对照相比，氢氧化铝似乎在相对高和低的pH值下降低所有3种蛋白的稳定性，显示钟形曲线，随着pH从5增加至9，在接近中性pH下具有最大稳定性。这些数据显示，与未处理的AlOOH相比，用2mM磷酸盐预处理AlOOH显著改善所有3种抗原在高和低pH下的稳定性(图13A-C)。通过本方法，在pH 6.0-7.5的范围内未观察到显著变化。

与无佐剂的对照相比，当磷酸铝用作佐剂时，在PcpA和PlyD1的Tm对pH图上未观察到大的变化(图13A和13C)。在PhtD以AP为佐剂的的情况中，与无佐剂的对照相比，在小于6的pH下观察到Tm的显著降低(图13B)。

实施例15

本实施例描述多组分制剂中的各种抗原组合效果的评价。

将三种单独的肺炎链球菌抗原以单价、二价和三价形式配制，并使用IN攻击模型评价(大体上如之前实施例中所述)。使用次最优剂量的纯化重组PcpA、PhtD和PlyD1(一种解毒的肺炎链球菌溶血素)在TBS中与佐剂(用2mM PO₄处理的AlOOH(0.56μg Al/剂量))pH7.4制备单价、二价和三价制剂。选择已显示诱导有限或无保护作用的次最优剂量的各抗原以便检测累加效应。大体上如较早所述，将各蛋白抗原在大肠杆菌中重组表达，常规纯化方案后通过系列柱层析纯化。所有三种抗原的蛋白纯度通常高于90％，如通过RP-HPLC和SDS-PAGE评价。将多组(n＝26)雌性CBA/J小鼠(n＝15/组)用合适的制剂(50μL)以各免疫之间的3周间隔肌内免疫3次。

最后免疫后3周，给予小鼠致死剂量的肺炎链球菌菌株14453，血清型6B(1.5×10⁶cfu/小鼠)，并观察存活和健康2周。计算存活结果(在下文表13中概述)并通过Fisher精确检验进行统计分析。通过定量ELISA测量总抗原-特异性IgG效价(来自各免疫后收集的血清)，并计算各组的几何平均效价(+/-SD)。获得的总IgG效价的概述在图14中示出。

表13

即使在非常低的剂量下(和尽管低的抗体效价)，PcpA单价制剂还是保护性的。与PcpA单价制剂相比，三价制剂提供类似的保护水平。与PhtD和PlyD1单价制剂相比，三价制剂提供明显更高的保护。与二价制剂相比，三价制剂引起较高的存活百分比(并且与二价制剂(0.0067∶0.027；PcpA∶PhtD)相比，关于两种三价制剂(0.0067∶0.027∶0.5；0.0067∶0.027∶0.166；PcpA∶PhtD∶PlyD1)，差异是统计上显著的，p＝0.043)。在PcpA和PhtD分别为0.0067和0.027μg时，二价制剂不是保护性的，当作为单价制剂给予时，该剂量对于PcpA是保护剂量。然而，因为这两组之间在存活方面的差异不是统计上显著的，所以在单价/二价制剂之间观察到的差异是由于测定变化性。

计算各PcpA和PhtD在二价制剂(0.0067∶0.027；PcpA∶PhtD)和三价制剂中保护至少60％的小鼠免受致死攻击的半数有效剂量(ED60)(参见下文表14)。对于各PcpA和PhtD，与相应的二价制剂相比，ED60在三价制剂中降低。通过这些结果，加入PlyD1对二价制剂(即，PcpA+PhtD)具有平均2倍剂量节约效应。

这些数据显示，与二价制剂相比，用三价制剂免疫引起更好的保护。在三价制剂中包含PlyD1不对总体保护具有抑制作用。

表14

实施例16

本实施例描述引起最高水平抗体反应的最小有效抗原剂量的评价。

根据进行的单价研究，绘制每抗原剂量的总抗原-特异性IgG效价(如通过ELISA测量)图以评价引起最高效价的最小有效抗原剂量。代表性的图在图15A、B、C中示出。对于PcpA，估计的最小抗原剂量被测定为0.196μg/小鼠(0.147，95％低；0.245，95％高)，和对于PhtD，估计的最小抗原剂量被测定为0.935μg/小鼠(0.533，95％低；1.337，95％高)，其提供的PcpA∶PhtD比为1∶4。PlyD1的最小抗原剂量估计为＞5μg/小鼠。因为在进行的二价和三价研究中(例如，在实施例15中)在任何评价的比例下未检测到抗原之间的免疫干扰，所以在多组分组合物中可使用1∶1∶1的PcpA∶PhtD∶PlyD1比。

参考文献

1.Henrichsen J.Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae(6种新识别的肺炎链球菌类型).

2.Park IH，Pritchard DG，Cartee R等2007.Discovery of a new capsularserotype(6C)within serogroup 6 of Streptococcus pneumoniae(肺炎链球菌血清群6内的一种新荚膜血清型(6C)的发现).J.Clin.Microbiol.45，1225-1233.

3.World Health Organization.2007.Pneumococcal conjugate vaccine forchildhood immunization-WHO position paper(用于儿童期免疫的肺炎球菌缀合疫苗-WHO意见书).Wkly Epidemiol.Rec.82，93-104.

4.Plotkin，S.A.和Orenstein W.A.vaccines.主编W.B.Saunders Company，第三版1999

5.Fedson，D.S.等，(1999)，The burden of Pneumococcal disease amongadults in developed and developing countries：what is known and what is notknown(肺炎球菌性疾病在发达国家和发展中国家成人中的负担：什么是已知的和什么是未知的).Vaccine 17，S11-S18.

6.Klein，D.L.(1999)Pneumococcal disease and the role of conjugatevaccines(肺炎球菌性疾病和缀合疫苗的作用).Microb.Drug Resist.，5，147-157.

7.Rahav，G.，等，(1997)Invasive Pneumococcal infection：A comparisonbetween adults and children(侵袭性肺炎球菌感染：成人与儿童之间的比较).Medicine76，295：303.

8.World Health Organization Bulletin 2004.Global estimate of theincidence of clinical pneumonia among children under five years of age(临床肺炎在五岁以下儿童中的发病率的全球估计).2004年12月，82(12).

9.Siber GR，Klugman KP，Makela PH.Pneumococcal vaccines：The Impact ofConjugate Vaccine(肺炎球菌疫苗：缀合疫苗的影响).Washington DC：ASM Press；2008

10.(package insert)(说明书).Wyeth PharmaceuticalsInc.Philadelphia，PA.2006

11.Clinical and Vaccine Immunology，2007年6月，第792-795页；Pediatr.Infect.Dis.J.16(4增刊)：S97-S102.

12.WHO(2005).Guidelines on nonclinical evaluations vaccines(非临床评价疫苗指南).Technical report series No.927(技术报告序列号927)。

序列表

<110>赛诺菲巴斯德有限公司

<120>免疫原性组合物

<130>APL-10-03-PCT

<150>US 61/289236

<151>2009-12-22

<150>US 61/325660

<151>2010-04-19

<160>10

<170>PatentIn版本3.5

<210>1

<211>838

<212>PRT

<213>肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)

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<210>6

<211>2463

<212>DNA

<213>肺炎链球菌

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atgggatcct atgaacttgg tcgtcaccaa gctggtcagg ttaagaaaga gtctaatcga 60

gtttcttata tagatggtga tcaggctggt caaaaggcag aaaatttgac accagatgaa 120

gtcagtaaga gagaggggat caacgccgaa caaattgtta tcaagattac ggatcaaggt 180

tatgtgacct ctcatggaga ccattatcat tactataatg gcaaggttcc ttatgatgcc 240

atcatcagtg aagaacttct catgaaagat ccgaattatc agttgaagga ttcagacatt 300

gtcaatgaaa tcaagggtgg ctatgtgatt aaggtagacg gaaaatacta tgtttacctt 360

aaagatgcgg cccatgcgga caatattcgg acaaaagaag agattaaacg tcagaagcag 420

gaacacagtc ataatcataa ctcaagagca gataatgctg ttgctgcagc cagagcccaa 480

ggacgttata caacggatga tgggtatatc ttcaatgcat ctgatatcat tgaggacacg 540

ggtgatgctt atatcgttcc tcacggcgac cattaccatt acattcctaa gaatgagtta 600

tcagctagcg agttagctgc tgcagaagcc tattggaatg ggaagcaggg atctcgtcct 660

tcttcaagtt ctagttataa tgcaaatcca gttcaaccaa gattgtcaga gaaccacaat 720

ctgactgtca ctccaactta tcatcaaaat caaggggaaa acatttcaag ccttttacgt 780

gaattgtatg ctaaaccctt atcagaacgc catgtagaat ctgatggcct tattttcgac 840

ccagcgcaaa tcacaagtcg aaccgccaga ggtgtagctg tccctcatgg taaccattac 900

cactttatcc cttatgaaca aatgtctgaa ttggaaaaac gaattgctcg tattattccc 960

cttcgttatc gttcaaacca ttgggtacca gattcaagac cagaacaacc aagtccacaa 1020

tcgactccgg aacctagtcc aagtctgcaa cctgcaccaa atcctcaacc agctccaagc 1080

aatccaattg atgagaaatt ggtcaaagaa gctgttcgaa aagtaggcga tggttatgtc 1140

tttgaggaga atggagtttc tcgttatatc ccagccaagg atctttcagc agaaacagca 1200

gcaggcattg atagcaaact ggccaagcag gaaagtttat ctcataagct aggagctaag 1260

aaaactgacc tcccatctag tgatcgagaa ttttacaata aggcttatga cttactagca 1320

agaattcacc aagatttact tgataataaa ggtcgacaag ttgattttga ggttttggat 1380

aacctgttgg aacgactcaa ggatgtctca agtgataaag tcaagttagt ggatgatatt 1440

cttgccttct tagctccgat tcgtcatcca gaacgtttag gaaaaccaaa tgcgcaaatt 1500

acctacactg atgatgagat tcaagtagcc aagttggcag gcaagtacac aacagaagac 1560

ggttatatct ttgatcctcg tgatataacc agtgatgagg gggatgccta tgtaactcca 1620

catatgaccc atagccactg gattaaaaaa gatagtttgt ctgaagctga gagagcggca 1680

gcccaggctt atgctaaaga gaaaggtttg acccctcctt cgacagacca tcaggattca 1740

ggaaatactg aggcaaaagg agcagaagct atctacaacc gcgtgaaagc agctaagaag 1800

gtgccacttg atcgtatgcc ttacaatctt caatatactg tagaagtcaa aaacggtagt 1860

ttaatcatac ctcattatga ccattaccat aacatcaaat ttgagtggtt tgacgaaggc 1920

ctttatgagg cacctaaggg gtatagtctt gaggatcttt tggcgactgt caagtactat 1980

gtcgaacatc caaacgaacg tccgcattca gataatggtt ttggtaacgc tagtgaccat 2040

gttcgtaaaa ataaggcaga ccaagatagt aaacctgatg aagataagga acatgatgaa 2100

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tcagcagata atctttataa accaagcact gatacggaag agacagagga agaagctgaa 2220

gataccacag atgaggctga aattcctcaa gtagagaatt ctgttattaa cgctaagata 2280

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tag 2463

<210>7

<211>445

<212>PRT

<213>肺炎链球菌

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<212>PRT

<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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Claims

1.一种免疫原性组合物，其包含分离的免疫原性肺炎链球菌PcpA多肽和分离的免疫原性肺炎链球菌PhtD多肽。

2.一种用于在受试者中针对由肺炎链球菌感染引起的疾病赋予保护的免疫原性组合物，其包含分离的免疫原性肺炎链球菌PcpA多肽和分离的免疫原性肺炎链球菌PhtD多肽。

3.权利要求1或2的组合物，其中所述组合物包含分离的免疫原性肺炎链球菌PcpA多肽和分离的免疫原性肺炎链球菌PhtD多肽的融合蛋白。

4.权利要求3的组合物，其中所述PhtD多肽的氨基酸序列在一个或多个保守氨基酸取代存在或不存在下具有在SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列。

5.权利要求3的组合物，其中所述PhtD多肽是重组产生的。

6.权利要求5的组合物，其中所述重组产生的PhtD多肽是缺失信号肽序列的N端截短物。

7.权利要求3的组合物，其中所述PhtD蛋白包含在一个或多个保守氨基酸取代存在或不存在下具有在SEQ ID NO: 5中所示的氨基酸序列的多肽。

8.权利要求1-7中任一项的组合物，其中所述PcpA多肽是重组产生的。

9.权利要求8的组合物，其中所述PcpA多肽是缺失信号肽序列的N端截短物。

10.权利要求1的组合物，其中所述PcpA多肽的氨基酸序列在一个或多个保守氨基酸取代存在或不存在下具有在SEQ ID NO: 2中所示的氨基酸序列。

11.权利要求1的组合物，其中所述PcpA多肽的氨基酸序列在一个或多个保守氨基酸取代存在或不存在下具有在SEQ ID NO: 7中所示的氨基酸序列。

12.一种免疫原性组合物，其包含在一个或多个保守氨基酸取代存在或不存在下具有在SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列的分离多肽和在一个或多个保守氨基酸取代存在或不存在下具有在SEQ ID NO: 2中所示的氨基酸序列的分离多肽。

13.一种免疫原性组合物，其包含在一个或多个保守氨基酸取代存在或不存在下具有在SEQ ID NO: 5中所示的氨基酸序列的分离多肽和在一个或多个保守氨基酸取代存在或不存在下具有在SEQ ID NO: 7中所示的氨基酸序列的分离多肽。

14.一种免疫原性组合物，其包含在一个或多个保守氨基酸取代存在或不存在下具有在SEQ ID NO: 2中所示的氨基酸序列的分离多肽和在一个或多个保守氨基酸取代存在或不存在下具有在SEQ ID NO: 5中所示的氨基酸序列的分离多肽。

15.权利要求3的组合物，其包含：

5-100 μg/剂量的PhtD多肽和

5-100 μg/剂量的PcpA多肽。

16.权利要求1-15中任一项的组合物，其中所述组合物另外包含肺炎链球菌溶血素。

17.权利要求16的组合物，其中所述肺炎链球菌溶血素是解毒的。

18.权利要求17的组合物，其中所述解毒的肺炎链球菌溶血素是在野生型序列的位置65、293和428上包含氨基酸取代的突变体肺炎链球菌溶血素蛋白。

19.权利要求18的组合物，其中三个氨基酸取代包含T₆₅→C、G₂₉₃→C和C₄₂₈→A。

20.权利要求18的组合物，其中所述组合物包含5-100 μg/剂量的所述肺炎链球菌溶血素。

21.权利要求1-20中任一项的组合物，其中所述组合物另外包含佐剂。

22.权利要求21的组合物，其中所述佐剂选自：氢氧化铝、磷酸铝和磷酸盐处理的氢氧化铝。

23.一种疫苗药盒，其包含权利要求1-20中任一项的免疫原性组合物和用于伴随或序贯给药的佐剂。

24.一种疫苗，其包含权利要求1-22中任一项的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂。

25.一种用于制备权利要求24的疫苗的方法，其包括将权利要求1-22中任一项的免疫原性组合物与药学上可接受的赋形剂混合的步骤。

26.权利要求1-22中任一项的免疫原性组合物或权利要求24的疫苗在制备用于针对由肺炎链球菌感染引起的疾病免疫受试者的药物中的用途，其中给予受试者免疫有效量的免疫原性组合物或疫苗。

27.权利要求26的免疫原性组合物或疫苗的用途，其中所述受试者是人婴儿和所述疾病是脑膜炎和/或菌血症。

28.权利要求26的免疫原性组合物或疫苗的用途，其中所述受试者是人婴儿和所述疾病是肺炎和/或结膜炎。

29.权利要求26的免疫原性组合物或疫苗的用途，其中所述受试者是人婴儿和所述疾病是中耳炎。

30.权利要求26的免疫原性组合物或疫苗的用途，其中所述疾病是肺炎或浸润性肺炎球菌性疾病。

31.权利要求1-22的免疫原性组合物在制备用于治疗或预防由肺炎链球菌感染引起的疾病的药物中的用途。

32.权利要求1-22中任一项的免疫原性组合物或权利要求24的疫苗在制备用于引起哺乳动物中的针对肺炎链球菌的保护性免疫反应的药物中的用途，其中给予所述哺乳动物免疫有效量的所述免疫原性组合物或所述疫苗。

33.权利要求1-22中任一项的组合物在制备用于预防受试者中由肺炎链球菌引起的疾病或降低其严重性的药物中的用途，其中给予受试者免疫有效量的组合物。

34.权利要求2的组合物，其另外包含至少一种用于针对由肺炎链球菌感染引起的疾病赋予保护的另外的抗原性组分。

35.权利要求1的组合物，其中所述分离的多肽各以不损害所述多肽各自免疫原性的量存在。

36.权利要求1的组合物在制备用于引起哺乳动物中的免疫反应的药物中的用途。

37.权利要求1的组合物在制备用于引起哺乳动物中的免疫反应以保护免受肺炎球菌感染的药物中的用途。

38.特异性结合与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 5有至少80% 同一性的多肽的抗体和特异性结合与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 7有至少80% 同一性的多肽的抗体在制备用于治疗或预防受试者中的链球菌属细菌物种感染的药物中的用途。

39.权利要求21的免疫原性组合物，其包含水包油佐剂乳剂；

所述水包油佐剂乳剂包含至少：鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子表面活性剂和疏水性非离子表面活性剂，其中所述乳剂是热可逆的且其中90%体积的油滴具有小于200 nm的尺寸。

40.权利要求3的组合物，其中所述组合物包含1 μg/剂量-10 μg/剂量的各PhtD多肽和PcpA多肽。

41.权利要求3的组合物，其中所述组合物包含10 μg/剂量-100 μg/剂量的各PhtD多肽和PcpA多肽。

42.权利要求41的组合物，其中所述组合物包含10 μg/剂量的各PhtD多肽和PcpA多肽。

43.权利要求41的组合物，其中所述组合物包含25 μg/剂量的各PhtD多肽和PcpA多肽。

44.权利要求41的组合物，其中所述组合物另外包含10 μg/剂量-100 μg/剂量的肺炎链球菌溶血素。

45.权利要求42或43中任一项的组合物，其中所述组合物另外包含肺炎链球菌溶血素。

46.权利要求44或45的组合物，其中所述肺炎链球菌溶血素是在野生型序列的位置65、293和428上包含氨基酸取代的突变体肺炎链球菌溶血素蛋白。

47.权利要求46的组合物，其中三个氨基酸取代包含T₆₅→C、G₂₉₃→C和C₄₂₈→A。

48.权利要求41的组合物，其中所述组合物包含50 μg/剂量的各PhtD多肽和PcpA多肽。

49.权利要求21的组合物，其包含一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中相对于没有一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，一种或多种药学上可接受的赋形剂增加免疫原性PcpA多肽的热稳定性。

50.权利要求21的组合物，其包含一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中相对于没有一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，一种或多种药学上可接受的赋形剂增加免疫原性PhtX多肽的热稳定性。

51.权利要求21的组合物，其包含一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中相对于没有一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，一种或多种药学上可接受的赋形剂增加免疫原性解毒的肺炎链球菌溶血素多肽的热稳定性。

52.权利要求49、50或51的组合物，其中相对于没有一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物，一种或多种药学上可接受的赋形剂使多肽的热稳定性增加0.5℃以上。

53.权利要求49、50或51的组合物，其另外包含佐剂。

54.权利要求53的组合物，其中所述佐剂包含铝化合物。

55.权利要求49、50或51的组合物，其中所述组合物为液体形式。

56.权利要求49、50或51的组合物，其中所述组合物是干粉形式、冷冻干燥的、喷雾干燥的或泡沫干燥的。

57.权利要求49、50或51的组合物，其中所述一种或多种药学上可接受的赋形剂选自：缓冲剂、张度剂、简单碳水化合物、糖、碳水化合物聚合物、氨基酸、寡肽、多氨基酸、多元醇及其醚、洗涤剂、脂质、表面活性剂、抗氧化剂、盐或者它们的组合。

58.权利要求57的组合物，其中所述缓冲剂选自Tris-HCL、具有NaCl的Tris-HCL和HEPES，并且浓度为5-100mM。

59.权利要求57的组合物，其中所述糖选自浓度为1-30%的山梨糖醇、海藻糖和蔗糖。

60.权利要求57的组合物，其中所述一种或多种赋形剂包含在表11中列出的一种或多种赋形剂。

61.权利要求49、50或51的组合物，其中所述组合物包含山梨糖醇。

62.权利要求49、50或51的组合物，其中所述组合物包含5-100 μg/剂量的多肽和2-20%山梨糖醇，pH 5.5-8.5。