CN102939105B - 免疫原性组合物和相关的方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及用于在免疫原性组合物中使用的佐剂，所述组合物包含至少一种抗原和已用磷酸盐、羧酸盐、碳酸盐、硫酸盐、二膦酸盐或者这些化合物中两种或更多种的混合物处理的含有氢氧基的铝化合物，亦提供使用这些组合物用于预防和治疗疾病的方法。

Description

免疫原性组合物和相关的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年12月22日提交的美国序号61/289,077、2009年12月22日提交的美国序号61/289,236和2010年4月19号提交的美国序号61/325,615的优先权，其通过引用以其整体结合到本文中。

发明领域

本发明涉及免疫学领域，特别地，涉及佐剂及其在免疫中的用途。

背景技术

佐剂是掺入疫苗制剂中以增强疫苗抗原免疫原性的物质。铝盐(例如磷酸铝和氢氧化铝)是现今在人和兽用疫苗中使用的最常用佐剂。虽然许多包含铝的佐剂是可得的，但是对于任何一种特定的疫苗制剂，由其提供的佐剂/抗原效果可能不是最优的。

两种方法已一般被用于制备具有铝化合物的疫苗和类毒素-在存在抗原下原位沉淀铝化合物和将抗原吸附到预形成的铝凝胶上。在铝佐剂的原位沉淀或到预形成的铝凝胶上期间，在铝佐剂上吸附抗原取决于抗原的物理和化学特性、使用的铝佐剂类型和吸附条件。可影响抗原在铝佐剂上的吸附的因素包括静电力、疏水相互作用、范德瓦尔斯力、氢结合、pH、温度、凝胶颗粒尺寸和反应混合物的离子强度。通常，抗原通过静电吸引(即，佐剂和抗原具有相反的电荷)和/或配体交换(例如，抗原上的磷酸基置换佐剂表面上的氢氧基)吸附于铝佐剂(Seeber SJ, 等 Vaccine 1991；9:201-3；Iyer S. 等, Vaccine 2004；29:1475-9)。

氢氧化铝在其脱氢、结晶形式化学上是偏氢氧化铝[AlO(OH)]，但在其水相通过获得另外的水分子，它变成氢氧化铝[Al(OH)₃] (Hem S.L. 等 2007 Vaccine 25:4985-4986)。偏氢氧化铝具有11的零电荷点(PZC)，因此它在pH 7.4下带正电荷。该正电荷使得偏氢氧化铝对于带负电荷的抗原(例如酸性蛋白)是好的吸附剂。

在一个研究中，发现用磷酸阴离子预处理氢氧化铝佐剂改变佐剂的表面电荷特性，使得碱性蛋白(溶菌酶，即p.+11.1)可被吸附。发现磷酸阴离子降低佐剂的正ζ电位(mV)，且佐剂表面电荷的该改变将佐剂和溶菌酶之间的静电力从排斥变化为吸引，使得蛋白被佐剂吸附(Rinella Jr. J.V., 等, Vaccine 1996；14(第4期):298-300)。

可以单层吸附于佐剂的抗原最大量被称为“吸附能力”和吸附力的强度被称为“吸附系数”(Jendrick 等,Vaccine 2003； 21:3011-8)。吸附能力对疫苗免疫原性的影响研究表明吸附的抗原剂量百分比与制剂的免疫原性不相关(Chang M-F. 等, Vaccine 2001；19:2884-9；Romero Mendez IZ 等 Vaccine 2007；25(5):825-33)。与此相反，一个研究显示抗原与包含铝的佐剂的吸附系数与由制剂引起的免疫反应之间相关(Hansen 等,Vaccine 2007；25:6618-6624)。

吸附可影响蛋白的结构和稳定性。来自关于吸附于包含铝的佐剂的影响的研究结果不完全一致：在一个研究中，吸附到Alhydrogel^®或Adju-Phos^®上后，去稳定化三种蛋白(牛血清白蛋白(BSA)、溶菌酶和卵白蛋白)；在另一研究中，通过吸附到氢氧化铝上，稳定化BSA和β-乳球蛋白(BLG)的结构(Jones L.S. 等, J. Biol Chem 2005；280(14):13406-13414；Zheng Y. 等, Spectroscopy 2007；21(5-6):257-268)。用于稳定化具有铝盐佐剂的疫苗组合物液体制剂储存的方法包括冻干、冷冻和冷冻干燥，但经常引起佐剂团聚、免疫原浓度降低和免疫原性损失(例如，Maa 等, (2003) J. Pharm.Sci. 92:319-332；Diminsky 等 (1999) Vaccine 18:3-17；Alving 等 (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690:265-275；和Warren 等 (1986) Ann Rev Immunol. 4:369-388，所有的这些通过引用结合)。甚至对于在冷藏条件(例如2℃-8℃)下保持的那些制剂，吸附的抗原可能化学上不稳定，因此，随时间推移可经历水解和破碎。因此，需要一种用于解决这些问题(例如，化学不稳定性、抗原浓度降低)的生产包含铝盐佐剂的疫苗组合物的方法。

发明概述

本发明涉及制备抗原稳定性增加的包含至少一种抗原和含有氢氧基的铝化合物的免疫原性组合物的方法。该方法包括：(a) 将含有氢氧基的铝化合物用选自以下的化合物处理：(i) 磷酸盐、(ii) 羧酸盐、(iii) 碳酸盐、(iv) 硫酸盐、(v) 二膦酸盐和(vi)(i)-(v)中两种或更多种的混合物；和(b) 将步骤(a)中的制备物与至少一种抗原混合。可将铝化合物备选地用氟化物处理。相对于其中抗原与未处理的含有氢氧基的铝化合物混合的组合物，将抗原与处理的含有氢氧基的铝化合物混合增加抗原的稳定性。

亦提供包含至少一种抗原和已用磷酸盐、羧酸盐、碳酸盐、硫酸盐、二膦酸盐、氟化物或者这些化合物中两种或更多种的混合物处理的含有氢氧基的铝化合物的免疫原性组合物以及使用这些组合物用于预防和治疗疾病的方法。

在一个实例中，根据公开的方法，制备包含肺炎链球菌蛋白PcpA和已用选择的化合物之一(例如，磷酸盐)处理的含有氢氧基的铝化合物的组合物。组合物亦可包含来自多组氨酸三联体家族的肺炎链球菌蛋白(PhtX：PhtA、PhtB、PhtD、PhtE)和/或解毒的肺炎链球菌溶血素。

本发明提供数个优势。例如，本发明的组合物是免疫原性的并具有改善的稳定性。本发明的其他特征和优势从下述详述、附图和权利要求中将显而易见。

附图概述

参考附图，从下述描述将进一步理解本发明。

图1a-f. 多价制剂(用AlO(OH)或磷酸盐处理的AlO(OH) (PTH)配制)中的PcpA和PhtD的稳定性。使用AlO(OH)或具有终浓度为2mM磷酸盐的PTH制备制剂，然后在各种温度(即5℃、25℃、37℃或45℃)下孵育30周。然后通过RP-HPLC评估完整的抗原浓度。

图2.通过ELISA评价的PhtD和PcpA在应激条件下的稳定性。将100 μg/mL的二价制剂在37℃孵育12周，并通过ELSIA评价抗原性。

图3是关于本发明抗原(Prt1、Prt2和Prt3)和铝化合物的配制过程概况的图示。

图4a，4b，4c. 将Balb/c小鼠用于评估由用几种不同佐剂之一配制的二价疫苗组合物引起的免疫反应(实施例4)。使用纯化的重组PhtD和PcpA蛋白制备制剂(如在实施例1中所述)。通过终点稀释ELISA测量总抗原-特异性IgG效价(图4a)并计算各组的几何平均效价(+/- SD)。计算抗原-特异性IgG1 (图4b)和IgG2效价(图4c)以评估IgG1/2a亚类。结果的概述描绘在该图中。

图5. 描绘通过终点稀释ELISA测量的总抗原-特异性IgG效价和各组的几何平均效价(+/- SD)。在该研究中(实施例6)，将Balb/c小鼠用于评估由新鲜制备的和老化的有佐剂的二价制剂引起的免疫反应。将重组PhtD和PcpA与AlOOH或含有PO₄ (2 mM)的AlOOH配制。该研究中使用的老化的制剂在第一次免疫前已储存大约6个月(约2℃-8℃)。该研究中使用的新鲜制备的制剂在第一次免疫的一周内制备。将多组小鼠用合适的制剂以3周间隔肌内(IM)免疫3次。

图6 描绘各免疫小鼠组的存活百分比(实施例6)。在该研究中，使用鼻内攻击模型评价重组PhtD和PcpA的二价制剂。将免疫的动物用致死剂量的肺炎链球菌菌株(MD、14453或941192)攻击。

图7. 描绘通过定量ELISA测量的总抗原-特异性IgG效价和各组的几何平均效价(+/- SD)。在该研究中(实施例6)，将Balb/c小鼠用于评估由新鲜制备的和老化的有佐剂的二价制剂引起的免疫反应。为了制备二价制剂，将重组PhtD和PcpA与用PO₄ (2 mM)处理的AlOOH配制。老化的制剂在开始研究前已在2-8℃或37℃储存大约6-7个月。该研究中使用的新鲜制备的制剂在第一次免疫的一周内制备。将多组小鼠用合适的制剂以3周间隔肌内(IM)免疫3次。

图8. 描绘通过定量ELISA测量的总抗原-特异性IgG效价和各组的几何平均效价(+/- SD)。在该研究中(实施例8)，将Balb/c小鼠用于评估由具有磷酸盐预处理的AlO(OH)和不同浓度的元素铝的多价制剂引起的免疫反应。

图9. 不同批次的AlOOH (A)、PTH (B)和AlPO₄ (C)的X-射线衍射图。

图10. 不同批次的PTH、AlOOH (Alhydrogel^®)和AlPO₄ (Adjuphos^®)的TEM分析。

图11. pH对有佐剂的蛋白的物理稳定性的影响。将PcpA (A)、PhtD (B)和PlyD1 (C)用不同pH值的氢氧化铝或磷酸铝辅佐(adjuvant)，并通过荧光迹线的导数分析获得Tm值。

图12A 在10%山梨糖醇 (■)、10%海藻糖 (●)、10%蔗糖 (Δ)、TBS pH 9.0 (♦)和TBS pH 7.4 (○)存在下，通过RP-HPLC研究赋形剂对PcpA (在50℃储存3天)稳定性的影响。

图12B 在10%山梨糖醇、10%海藻糖、10%蔗糖、TBS pH 9.0和TBS pH 7.4存在下，通过定量夹心ELISA研究赋形剂对PcpA (在50℃储存3天)抗原性的影响。将制剂在50℃储存3天。对于各制剂，在零时(白条)和三天储存后(黑条)评价抗原性。

发明详述

本发明涉及制备包含抗原和含有氢氧基的铝化合物的免疫原性组合物的稳定制剂的方法。该方法包括以足以稳定抗原的量加入铝化合物离子，例如磷酸盐、碳酸盐、羧酸盐、硫酸盐、二膦酸盐或氟化物的离子，或者这些离子的混合物。亦提供包含抗原和含有氢氧基的铝化合物的免疫原性组合物以及使用这些组合物用于预防和治疗特定疾病的方法。

本文使用的术语“抗原”指，当导入哺乳动物中时，能够起始并介导相应的免疫体(抗体)形成的物质。抗原可拥有多个抗原决定簇，使得将抗原暴露于哺乳动物可产生多种具有不同特异性的相应抗体。

抗原可包括但不限于蛋白、肽、多肽、核酸及其片段、变体和组合。抗原亦可包括较大的组分，例如细胞、细菌、病毒和其他微生物的全部或部分，以及这些组分的部分或组合。细菌和病毒(尤其是造成哺乳动物中疾病的那些)是可用于本发明中的抗原来源。细菌抗原包括来源于细胞外表面、来自细胞内部或来自鞭毛的蛋白或多糖。其他抗原可为由感染的细胞分泌或在细胞死亡或破碎时释放的那些。这样的抗原的实例包括白喉、破伤风和肉毒毒素(botulism toxin)。可结合到本发明实践中的特定抗原实例包括但不限于，白喉抗原、破伤风抗原、人乳头瘤病毒抗原、炭疽抗原、大肠杆菌(E.coli)抗原、狂犬病抗原和流感抗原、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)抗原、C型脑膜炎球菌抗原、A型脑膜炎球菌抗原、HIV抗原、疟疾抗原、单纯疱疹病毒抗原、麻疹抗原、麻疹-腮腺炎-风疹抗原、黄热抗原、水痘抗原、日本脑炎病毒抗原、登革热抗原、轮状病毒抗原、艰难梭菌(C.difficile)抗原、牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)抗原和衣原体抗原(例如，沙眼衣原体(C. trachomatis)、肺炎衣原体(C.pneumonaie))。

本发明中使用的抗原可为抗原的天然存在的形式，如来源于其天然来源。由于毒性，可将抗原转化为保留引起针对天然抗原的免疫反应能力的较少毒性形式或片段。白喉类毒素和破伤风类毒素是一般由化学处理(例如，甲醛)产生的天然抗原的解毒形式的实例。其他用于消除抗原毒性的方法是本领域公知的，并例如包括蛋白抗原的酶促消化/片段化、变性(通常通过热或化学处理)、缀合、化学修饰和遗传解毒。适合于本发明中使用的肺炎链球菌的解毒肺炎链球菌溶血素蛋白包括WO2010/071986中描述的那些。用于本发明中使用的优选的解毒肺炎链球菌溶血素蛋白是PlyD1 (SEQ ID NO: 9)。

本发明中使用的抗原亦可为融合蛋白的形式。本文使用的融合多肽包含在N或C末端与任何其他多肽(下文称为肽尾)融合的本发明的多肽或多肽衍生物。获得这种融合多肽的简便方法是通过翻译框内融合的多核苷酸序列(即杂合基因)。将编码融合多肽的杂合基因插入到用于转化或转染宿主细胞的表达载体中。备选地，将编码多肽或多肽衍生物的多核苷酸序列插入到其中已经存在编码肽尾的多核苷酸的表达载体中。这样的载体及其使用说明市售可得，例如来自New England Biolabs的pMal-c2或pMal-p2系统(其中肽尾是麦芽糖结合蛋白)、Pharmacia的谷胱甘肽-S-转移酶系统或从Novagen获得的His-标签系统。这些和其他表达系统为进一步纯化本发明的多肽和衍生物提供便利的方法。

融合多肽的一个有利的实例是以下的融合多肽：其中本发明的多肽或同源物或片段与具有佐剂活性的多肽(例如霍乱毒素或大肠杆菌热不稳定毒素的亚基B)融合。另一有利的融合是以下融合多肽：其中多肽、同源物或片段与强T-细胞表位或B-细胞表位融合。这样的表位可为本领域中已知的表位，或在本发明的另一多肽中基于计算机辅助分析可能的T-或B-细胞表位已被鉴定的表位。与本发明的该方面一致的是包含来自SEQ ID NO: 1、2、5、7、9或10或者其同源物或片段的T-或B-细胞表位的融合多肽，其中该表位来源于所述多肽或同源物或片段的多种变体，各变体与另一变体不同在于多肽内其表位的位置和序列。为了实现融合，将本发明的多肽与具有至少一个T-或B-细胞表位的多肽的N或优选C末端融合。T-或B-细胞表位亦可被内部地插入本发明多肽的氨基酸序列内。

本发明的抗原可为与抗原缀合的载体蛋白，例如细菌多糖。通过本领域中存在的任何已知方法可进行这些多糖的缀合，例如WO2008/143709。

如上文所述，术语“抗原”可包括但不限于蛋白、肽、多肽、核酸及其片段、变体和组合。本文交换地使用术语“多肽”、“肽”和“蛋白”来指氨基酸残基的聚合物。

用于本发明中使用的抗原可使用本领域技术人员已知的多种方法产生。例如，可使用标准纯化技术直接自天然来源分离抗原。备选地，可使用已知技术重组产生抗原。重组产生的抗原和目标抗原的变体或片段可用于本发明。

用于本文使用的抗原亦可通过化学聚合物合成(例如固相肽合成)合成。这样的方法是本领域技术人员已知的。

包含多肽的抗原变体和片段亦被本发明所涵盖。“变体”指实质上类似的序列。本发明氨基酸或核苷酸序列的变体将通常与参比序列具有至少约65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的序列同一性。在特定实施方案中，本发明抗原性多肽的变体将保留全长多肽的生物活性并因此是免疫原性的。用于产生变体序列的方法是本领域公知的，如同用于确定多肽或多核苷酸序列的百分比同一性的方法。

术语“片段”指包含具体数量的连续氨基酸或核苷酸残基的多肽或多核苷酸部分。在特定实施方案中，本发明免疫原性多肽的片段可保留全长多肽的生物活性并因此是免疫原性的。多核苷酸的片段可编码保留蛋白生物活性并因此是免疫原性的蛋白片段。本发明多肽和多核苷酸的片段可为任何长度，前提是它们具有所需的特性(例如免疫原性)。用于产生多肽或多核苷酸片段的方法是本领域已知的。

来自肺炎链球菌的本发明抗原可选自(但不限于)多组氨酸三联体家族(PhtX：PhtA、B、D、E)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、LytX家族、肺炎链球菌溶血素 (Ply)、PspA、PsaA和PcpA。

PcpA多肽包含全长PcpA氨基酸序列(存在或不存在信号序列)、其片段及其变体。适合于本文所述的组合物中使用的PcpA多肽包括例如来自肺炎链球菌菌株B6的GenBank登录号CAB04758、来自肺炎链球菌菌株TIGR4的GenBank登录号NP_和来自肺炎链球菌菌株R6的GenBank登录号NP_359536的那些，和来自肺炎链球菌菌株14453的那些。肺炎链球菌14453基因组中的全长PcpA的氨基酸序列是SEQ ID NO: 2。优选的PcpA多肽是SEQ ID NO:7。

适合于本发明组合物的PhtX多肽包含全长PhtA、PhtB、PhtD或PhtE氨基酸序列(存在或不存在信号序列)、其免疫原性片段、其变体及其融合蛋白。适合于本文所述的组合物中使用的PhtD多肽包括例如尤其GenBank登录号AAK06760、YP816370和NP35851的那些。肺炎链球菌14453基因组中的全长PhtD的氨基酸序列是SEQ ID NO: 1。优选的PhtD多肽(来源于肺炎链球菌14453基因组)是SEQ ID NO: 5。

肺炎链球菌溶血素(Ply)是涉及肺炎球菌发病机制的多个步骤(包括抑制纤毛搏动和破坏上皮细胞之间的紧密连接)的溶细胞-活化毒素(Hirst 等 Clinical andExperimental Immunology (2004))。数种肺炎链球菌溶血素是已知的，且(解毒后)适合于本文所述的组合物中使用，包括例如尤其GenBank登录号Q04IN8、P0C2J9、Q7ZAK5和ABO21381。在一个实施方案中，Ply具有SEQ ID NO: 10中所示的氨基酸序列。

本发明的肺炎链球菌溶血素多肽优选是解毒的；即，与由肺炎链球菌产生并释放的成熟野生型肺炎链球菌溶血素蛋白相比，它们没有或具有降低的毒性。本发明的肺炎链球菌溶血素多肽可被例如化学(例如，使用甲醛处理)或遗传(例如，以突变形式重组产生)解毒。用于本发明中使用的解毒的肺炎链球菌溶血素的优选实例公开于PCT公布号WO2010/071986。如该篇申请中所公开，解毒的肺炎链球菌溶血素可为在野生型序列的位置65、293和428上包含氨基酸取代的突变体肺炎链球菌溶血素蛋白。在优选的解毒的肺炎链球菌溶血素蛋白中，三个氨基酸取代包含T₆₅→C、G₂₉₃→C和C₄₂₈→A。优选的免疫原性并解毒的肺炎链球菌溶血素多肽是SEQ ID NO: 9。

本文使用的“免疫原性”指，当给予受试者时，物质诱导免疫反应的能力(例如，细胞免疫原-特异性免疫反应和/或体液抗体反应)。本文使用的和本领域中定义的“抗原性”是抗体识别并结合蛋白(例如，抗原)的能力。

本文使用的术语“佐剂”指连同抗原一起给予受试者以增强抗原免疫原性的物质。

铝盐佐剂(或化合物)是本发明的实践中使用的佐剂之一。尤其使用氢氧化铝(例如，结晶偏氢氧化铝AlO(OH)和氢氧化铝Al(OH)₃)。氢氧化铝是包含Al³⁺离子和氢氧基(-OH)的铝化合物。当产生的混合物是包含氢氧基的铝化合物时，亦可使用氢氧化铝与其他铝化合物(例如羟基磷酸盐或羟基硫酸盐)的混合物。具有铝盐佐剂的组合物不应该暴露于极端温度(即低于冰点(0℃)或极其热(例如，≥ 70℃))是本领域公知的，因为这样的暴露可不利地影响吸附的抗原和佐剂两者的稳定性和免疫原性。

在特定实施方案中，铝佐剂是偏氢氧化铝(例如，Alhydrogel ^®)。

在本发明一个具体实施方案中，将含有氢氧基的铝化合物(例如，氢氧化铝佐剂)用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、羧酸盐、二膦酸盐或氟化物或者这些化合物中两种或更多种的混合物处理。通过以这种方式处理铝化合物，铝化合物中的许多氢氧基(-OH)被对其进行处理所用的相应离子置换(例如，磷酸基(PO₄))。该置换降低铝化合物的PZC和化合物微环境的pH。以足够的量加入磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、羧酸盐、二膦酸盐或氟化物离子来降低微环境的pH至使抗原稳定的水平(即，抗原水解的速率降低)。必要的量将取决于许多因素，例如所涉及的抗原、抗原的等电点、抗原的浓度、抗原与佐剂之间的相互作用力、使用的辅佐方法和制剂中存在的任何另外抗原的量和性质。疫苗领域的本领域技术人员能够评估相关的因素并确定加入铝化合物中以增加抗原稳定性的磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、羧酸盐、二膦酸盐、氟化物的浓度(并因此，可制备相应的制剂和组合物)。例如，可进行滴定研究(即，加入增加浓度的磷酸盐等至铝化合物中)。

适合使用的磷酸盐化合物包括与磷酸相关的任何化合物(例如，磷酸的无机盐和有机酯)。磷酸盐是包含磷酸根离子(PO₄ ^3-)、磷酸氢根离子(HPO₄ ^2-)或磷酸二氢根离子(H₂PO^4-)连同任何阳离子的无机化合物。磷酸酯是其中磷酸的氢被有机基团置换的有机化合物。可代替磷酸盐使用的化合物实例包括阴离子氨基酸(例如，谷氨酸、天冬氨酸)和磷脂。

适合使用的羧酸盐化合物包括羧酸的任何有机酯、盐和阴离子(例如，苹果酸、乳酸、富马酸、戊二酸、EDTA和EGTA)。适合使用的硫阴离子包括包含硫酸基(SO₄基)的任何化合物，例如硫酸的盐或酯(例如硫酸钠、硫酸铵、亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、硫代硫酸盐)。适合使用的二膦酸盐化合物实例包括氯膦酸盐、帕米膦酸盐、替鲁膦酸盐和阿伦膦酸盐。

在本发明一个优选实施方案中，将磷酸基以盐的形式加入氢氧化铝佐剂中。优选地，磷酸根离子由包含磷酸二钠一钠的缓冲溶液提供。

在本发明的优选实践中，如本文所例示，将铝化合物(例如偏氢氧化铝)用磷酸盐处理(例如，通过如实施例中所述的方法)。在该方法中，将偏氢氧化铝的水性悬浮液(大约20 mg/mL)与磷酸缓冲溶液(例如，大约400 mmol/L)混合。优选的终磷酸基浓度为约2 mM-20mM。然后将混合物用缓冲剂(例如，Tris-HCl、具有盐水的Tris-HCl、HEPES)稀释以制备偏氢氧化铝与磷酸基(PO₄)的悬浮液。优选地，缓冲剂是10 mM Tris-HCl和150 mM NaCl，pH为约7.4。然后将悬浮液在室温混合大约24小时。优选地，元素铝在终悬浮液中的浓度在约0.28 mg/mL-1.68 mg/mL的范围内。更优选地，元素铝的浓度为约0.56 mg/mL。

然后可将抗原(单独或组合地)吸附于处理的氢氧化铝。优选地，将大约0.2-0.4mg/mL的抗原与处理的偏氢氧化铝的悬浮液混合(例如，在室温或在2–8℃，在定轨混合器中，大约30分钟或大约12-15小时或大约24小时)。

在一个实例中，然后可将PcpA、PhtX (例如，PhtD)和肺炎链球菌溶血素的解毒突变体的免疫原性多肽(单独或组合地)吸附于处理的氢氧化铝。优选地，将大约0.2-0.4 mg/mL的各抗原与处理的氢氧化铝佐剂的悬浮液混合(例如，在室温或在2–8℃，在定轨混合器中，大约30分钟或大约12-15小时或大约24小时)。

使用本领域已知的标准方法，可评估抗原吸附的百分比。例如，可移除并离心(例如，以10,000rpm)抗原/佐剂制备物的等分试样，以从佐剂悬液(上清液)中分离未吸附的蛋白(沉淀)。可使用二辛可宁酸蛋白测定(BCA)或反相高效液相色谱(RP-HPLC)测定上清液中的蛋白浓度。如下计算吸附百分比：%A=100-([PrSN] × 100/[PrCtr])，其中[PrSN]是上清液中蛋白的浓度，[PfCtr]是相应的无佐剂的对照中的浓度。在优选的实施方案中，%吸附范围为约70%-约100%。在更优选的实施方案中，%吸附为至少约70%。

当在常规冷藏温度(例如约2℃-约8℃)长期储存时，公开的制剂是稳定的。制剂显示很少或无颗粒团聚、抗原浓度无显著降低或抗原降解速率降低并保留显著水平的免疫原性和/或抗原性至少6个月或12个月，优选18个月。短语“抗原浓度无显著降低”旨在意指组合物保留至少50%、60%或70%的最初抗原浓度，更优选至少约80%、85%或90%的最初抗原浓度，更优选至少约91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的初次配制时呈现的抗原浓度。抗原浓度可例如通过基于RP-HPLC、SDS-PAGE或ELISA的方法测量。

稳定制剂或包含稳定制剂的免疫原性组合物维持实质程度的结构完整性(例如，维持实质量的最初抗原浓度等)。

可通过测量例如呈现的抗原浓度(例如，通过RP-HPLC)或通过利用例如SDS-PAGE分析评估抗原降解，来评估稳定性。可将制剂中的抗原浓度与用相同但未处理(例如未用磷酸盐或碳酸盐离子处理)的铝化合物制备的制剂浓度比较。稳定性预测和/或比较工具包括例如Stability System™ (ScienTek Software, Inc.)，其使用Arrhenius Treatment预测储存温度(2℃-8℃)下的速率常数。用于测量抗原浓度和免疫原性的标准测定是本领域已知的并在实施例中描述。可通过例如用引起疾病的对应于制剂中存在的特定抗原的病原体或毒素攻击后评价免疫和未免疫的受试者的存活率，评估保护功效。

相对于用相应的未处理的含有氢氧基的铝化合物辅佐，通过将这些多肽(单独或组合地)用处理的含有氢氧基的铝化合物辅佐，可改善例如肺炎链球菌蛋白(例如PcpA、PhtX (例如，PhtD)和肺炎链球菌溶血素(例如，解毒的肺炎链球菌溶血素，PlyD1))的稳定性。当用氢氧化铝佐剂(AlO(OH))辅佐时，这些多肽的降解速率高(如在下文实施例中讨论)。发明人发现，相对于将这些多肽(例如，PcpA、PhtD)用相应的未处理的铝化合物辅佐，将它们用已用磷酸盐(或例如，碳酸盐、硫酸盐、羧酸盐、二膦酸盐或者这些化合物中两种或更多种的混合物)预处理的含有氢氧基的铝化合物(例如，氢氧化铝)辅佐，可增加这些多肽的稳定性(例如，通过减少抗原降解)。因此，本文提供包含免疫原性PcpA多肽和/或免疫原性PhtX多肽(例如，PhtD)和/或肺炎链球菌溶血素(例如，解毒的肺炎链球菌溶血素；PlyD1(SEQ ID NO:9))和已用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、羧酸盐、二膦酸盐或者这些化合物中两种或更多种的混合物处理的含有氢氧基的铝化合物的组合物制剂，其中相对于其中多肽吸附于未处理的含有氢氧基的铝化合物的组合物，该处理增加免疫原性多肽的稳定性。在优选的实施方案中，将铝化合物用磷酸盐处理。亦提供用这种处理的铝化合物为佐剂的多价组合物，其包含PcpA和PhtX (例如，PhtD)的免疫原性多肽或者包含肺炎链球菌溶血素(例如，解毒的肺炎链球菌溶血素；PlyD1)、PcpA和PhtX (例如，PhtD)多肽。

免疫原性组合物优选为液体形式，但其可为冻干的(按照标准方法)或泡沫干燥的(如在WO2009012601，Antigen-Adjuvant Compositions and Methods (抗原-佐剂组合物和方法)中所述)。根据本发明的一个实施方案，组合物为液体形式。可将免疫剂量配制成0.5-1.0 ml的体积。液体制剂可为适合给药的任何形式，包括例如溶液剂或混悬剂。因此，组合物可包含可被缓冲的液体介质(例如盐水或水)。

制剂(和组合物)的pH优选为约6.4-约8.4。更优选地，pH为约7.4。制剂的例示性pH范围为5-10，(例如5-9、5-8、5.5-9、6-7.5或6.5-7)。pH可通过使用缓冲剂维持。

本发明免疫原性组合物的药物制剂亦可任选包含一种或多种本领域公知的赋形剂(例如稀释剂、增稠剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、佐剂、洗涤剂和/或免疫刺激剂)。合适的赋形剂将与抗原和本领域已知的铝佐剂相容。稀释剂的实例包括粘合剂、崩解剂或分散剂，例如淀粉、纤维素衍生物、苯酚、聚乙二醇、丙二醇或甘油。药物制剂亦可包含一种或多种活性成分，例如抗微生物剂、抗炎剂和麻醉剂。洗涤剂的实例包括Tween (聚山梨醇酯)，例如Tween 80。优选地，在与一种或多种药学上可接受的赋形剂结合之前，纯化吸附于处理的铝化合物的抗原。

本发明的一个实施方案的组合物可通过以下方法制备：(i) 将含有氢氧基的铝化合物用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、羧酸盐、二膦酸盐或者这些化合物中两种或更多种的混合物处理，和(ii) 将处理的铝化合物与至少一种抗原混合。在优选的实施方案中(如实施例中所述)，抗原单独或组合地包括(但不限于)，PcpA、PhtX (例如，PhtD)和解毒的肺炎链球菌溶血素(例如，PlyD1，SEQ ID NO: 9)。

亦提供包含用根据本发明(例如，用磷酸盐)处理的含有氢氧基的铝化合物(例如氢氧化铝) (单独或组合地)辅佐的PcpA、PhtX (例如，PhtD)和/或解毒的肺炎链球菌溶血素以及包含一种或多种对组合物提供有益性质(例如，增加组合物的一种或多种蛋白的稳定性)的药学上可接受的赋形剂的制剂。在一个实例中，制剂包含磷酸盐处理的氢氧化铝(PTH)。本发明的组合物中可包含的化合物或赋形剂包括例如，缓冲剂(例如，甘氨酸、组氨酸)；张度剂(例如，甘露糖醇)；碳水化合物(例如糖或糖醇(例如山梨糖醇、海藻糖或蔗糖；1-30%))或碳水化合物聚合物(例如葡聚糖)；氨基酸，寡肽或多氨基酸(多达100 mM)；多元醇(例如，甘油，且浓度多达20%)；洗涤剂，脂质或表面活性剂(例如Tween 20、Tween 80或pluronics，具有多达0.5%的浓度)；抗氧化剂；盐(例如氯化钠、氯化钾、氯化镁或醋酸镁，多达150 mM)或者它们的组合。

可被使用的赋形剂的实例包括在表13和下文实施例中列出的那些。在各种实例中，赋形剂可为引起热稳定性增加(例如，至少0.5(例如0.5-5、1-4或2-3))的那些，如通过例如下文所述的测定(例如，SYPRO Orange的外部荧光)测量。

例示性的赋形剂和缓冲剂包括山梨糖醇(例如，4-20%，5-10%)，(参见表13)。这些赋形剂可以表13中所列的浓度使用。备选地，该量可变化于例如0.1-10倍，如本领域所理解。亦可包含本领域已知的其他碳水化合物、糖醇、表面活性剂和氨基酸。

可单独或组合地使用赋形剂和缓冲剂。这种组合物的pH可为，例如5.5-8.0或6.5-7.5，并可将组合物以液体或冻干形式储存在例如2-8℃。在组合物的变化中，可将山梨糖醇用蔗糖(例如，4-20%或5-10%)或海藻糖 (例如，4-20%或5-10%)替换。组合物的其他变化亦是可能的并涉及使用本文所列的其他组分。基于上文，PcpA、PhtD和解毒的肺炎链球菌溶血素的例示性制剂(单独或组合地)包含10%山梨糖醇，pH 7.4。

在一个实施方案中，单价PlyD1 (SEQ ID NO: 9)组合物每剂可包含，在约：10mMTris HCl和约150mM NaCl，约pH 7.4中的范围为5-50μg的抗原、PTH佐剂(具有约0.56 mg/mL元素铝，包含2mM 磷酸钠缓冲液，在约pH 7.5)。在优选的实例中，PlyD1范围为25-50μg/剂量。

在另一个实施方案中，单价PhtD组合物每剂可包含，在约：10mM Tris HCl和约150mM NaCl，约pH 7.4中的范围为5-50μg的抗原、PTH佐剂(具有约0.56 mg/mL元素铝，包含2mM 磷酸钠缓冲液，在约pH 7.5)。在优选的实例中，PlyD范围为25-50μg/剂量。

在另一个实施方案中，单价PcpA组合物每剂可包含，在约：10mM Tris HCl和约150mM NaCl，约pH 7.4中的范围为5-50μg的抗原、PTH佐剂(具有约0.56 mg/mL元素铝，包含2mM 磷酸钠缓冲液，在约pH 7.5)。在优选的实例中，PcpA范围为25-50μg/剂量。

在另一个实施方案中，二价制剂组合物每剂可包含，在约：10mM Tris HCl和约150mM NaCl，约pH 7.4中的范围各为5-50μg/剂量的两种蛋白(选自下述：PhtD、PlyD1或PcpA)、PTH佐剂(具有约0.56 mg/mL元素铝，包含2mM 磷酸钠缓冲液，在约pH 7.5)。在特定实例中，两种抗原以1:1抗原/剂量比存在。在又一个实施方案中，三价制剂组合物每剂可包含，在约：10mM Tris HCl和约150mM NaCl，约pH 7.4中的范围各为5-50μg/剂量的三种蛋白(PhtD、PlyD1、PcpA)、PTH佐剂(具有约0.56 mg/mL元素铝，包含2mM 磷酸钠缓冲液，在约pH7.5)。在特定实例中，三种抗原各自的量(抗原/剂量)是以约1:1:1的比例。

在另一实例中，组合物包含山梨糖醇或蔗糖，其关于稳定性已显示提供益处(参见下文)。这些组分的量可为例如5-15%、8-12%或10%山梨糖醇或蔗糖。下文描述其中这些组分以10%存在的具体实例。在一个优选的实施方案中，组合物包含10%山梨糖醇或10%蔗糖。

本发明的免疫原性组合物在预防或治疗与特定抗原有关的疾病、病症、病况或症状的方法中有用。术语疾病、病症和病况本文将交换地使用。特别地，预防和治疗方法包括将治疗有效量的药物组合物给予受试者。在特定实施方案中，提供用于预防或治疗肺炎链球菌的方法。

本文使用的预防疾病或病症旨在意指，将治疗有效量的本发明的药物组合物给予受试者以便保护受试者免于发生与抗原相关的特定疾病或病症。

治疗疾病或病症旨在将治疗有效量的本发明的药物组合物给予受疾病折磨或暴露于引起疾病的病原体的受试者，其中目的是为了治愈、愈合、缓和、缓解、改变、补救、减轻、改善或影响病况或疾病的症状。

治疗有效量指，对给定的病况和给药方案提供治疗作用的量。治疗有效量可由普通技术医务人员基于患者特征(年龄、体重、性别、病况、并发症、其他疾病等)确定。治疗有效量将另外受组合物的给药途径影响。

本发明的组合物可通过本领域已知的多种方法给予受试者。用于将组合物给予受试者的任何方法可在本发明的实践中使用。

定义

术语“包含”涵盖“含有”以及“由…组成”(例如，组合物“包含”X可仅由X组成或可包含另外的某物，例如，X+Y)。术语“实质上”不排除“完全地”(例如“实质上不含”Y的组合物可完全不含Y)。

与数值x有关的术语“约”意指，例如x± 10%。

术语“免疫原”是能够诱导获得性免疫反应的物质。

术语“受试者”涵盖以下物种，例如哺乳动物(例如人或动物(例如小鼠、狗、猫、马、绵羊、猪等))、鸟类。

除非特别说明，否则包括将两种或更多种组分混合的步骤的方法不要求任何具体的混合次序。因此组分可以任何次序混合。当有三种组分时，那么可将两种组分彼此混合，接着可将组合与第三种组分混合等。

应认识到，可电离基可以本文所示的中性形式存在，或可以带电荷的形式存在，例如取决于pH。

本公开内引用的所有参考文献通过引用以其整体结合到本文中。

实施例

以上公开大体上描述了本发明。通过参考下述具体实施例可获得更完整的理解。描述这些实施例仅用于例证的目的而不旨在限制本发明的范围。形式的改变和等价替代预期为可表明或提出权宜的情况。虽然本文已使用特定的术语，但是这样的术语旨在描述性的意思而不是限制的目的。

在本公开和这些实施例中使用但未明确描述的分子遗传学、蛋白质生物化学、免疫学和发酵技术方法，在科学文献中被充分报道并完全在本领域技术人员的能力内。

实施例1

本实施例描述表面修饰的佐剂和具有该佐剂的制剂的制备。通过将氢氧化铝佐剂(Alhydrogel^™, Brenntag)用磷酸盐处理，制备表面修饰的佐剂。使用的氢氧化铝佐剂是湿凝胶悬浮液，其根据制造商耐受再高压灭菌但如果冷冻则损坏。根据制造商，当pH维持在5-7时，佐剂具有正电荷并可吸附带负电的抗原(例如，当在中性pH下保持时具有酸性等电点的蛋白)。

a) 磷酸盐处理AlO(OH)-将AlO(OH)的水性悬浮液(大约20 mg/mL)与磷酸盐缓冲液的贮存液(大约400 mmol/L)混合，并用约pH 7.4的10 mM Tris-HCL缓冲液(SigmaAldrich)稀释，以制备具有大约13 mg/mL AlOOH/200 mM PO₄的磷酸盐处理的AlO(OH)悬浮液(本文称为“PTH”)。然后在室温将该悬浮液混合大约30分钟至24小时。

b) 重组制备PcpA蛋白和PhtD蛋白-简言之，将来自肺炎链球菌(血清型6菌株14453，在1997年6月27日作为ATCC 55987保藏)的两种重组来源的蛋白抗原PhtD (WO2009/012588)和PcpA (WO 2008/022302)在大肠杆菌中重组表达，常规纯化方案后通过系列柱层析分离并纯化。

更具体而言，使用AccuPrime高保真性聚合酶(Invitrogen)以及引物Spn0211和Spn0213，从肺炎链球菌14453基因组(血清型6菌株，在1997年6月27日作为ATCC 55987保藏，小鼠-强毒荚膜血清型6B菌株)PCR扩增phtD基因(但不包括其天然信号肽)。Spn0211和Spn0213分别将NocI和XhoI限制性位点导入到5’和3’端中(参见表1)。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物，并在琼脂糖凝胶上运行来确定大小。将PCT产物和pET28a(+)载体(Novagen)两者用NcoI和XhoI消化，并随后使用QIAEX凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中纯化。使用T4 DNA连接酶(Invitrogen)将消化的载体与基因连接在一起。将连接混合物转化到化学感受态大肠杆菌DH5α中，并通过接种在包含50µg/ml卡那霉素的Luria琼脂上，挑选阳性克隆。将来自质粒克隆pBAC27的DNA分离，并通过测序确认为正确的。

然后通过电穿孔将质粒(pBAC27)导入到大肠杆菌BL21 (DE3)细胞中。在大约37℃培养转化的菌株并通过加入1mM IPTG来诱导蛋白表达。通过SDS-PAGE分析，由正确大小(即，大约91.9 kDa)的诱导蛋白条带的存在证实基因产物的表达

表1

。

pBAC27多肽的预测氨基酸序列如下：

使用Accuprime Taq DNA聚合酶(Invitrogen)和设计用于简化克隆的参入限制性内切核酸酶位点的PCR引物(参见表2)，从肺炎链球菌14453基因组中PCR扩增pcpA基因(但不包括信号序列和胆碱结合结构域)。将pET-30a(+) (Novagen)的质粒DNA纯化为低拷贝质粒，并通过用NdeI和XhoI消化后凝胶纯化来制备其用作克隆载体。所产生的1335碱基对片段是侧翼为XhoI (3’端)和NdeI (5’端)限制性位点的pcpA (不具有信号序列和胆碱结合结构域)。清洁扩增片段，用NdeI和XhoI消化，然后凝胶纯化并连接到pET-30a(+)载体中。通过测序证实插入并将新质粒指定为pJMS87。

表2(引物)

pJMS87多肽的预测氨基酸序列如下：

将化学感受态大肠杆菌BL21 (DE3)细胞用质粒pJMS87 DNA转化。通过SDS-PAGE分析，由正确大小(即，大约49.4 kDa)的诱导蛋白条带的存在证实基因产物的表达。

因为克隆的PcpA多肽缺失信号序列和胆碱-结合结构域，所以其氨基酸序列与全长PcpA蛋白的氨基酸27-470相关联。在所有研究的菌株中，该区是极其保守的，仅具有8个可变位置。最偏离的序列对享有98.7% 同一性。

通过载体NTi对重组PcpA蛋白和重组PhtD蛋白预测的等电点分别是7.19和5.16。

c) 抗原吸附-将来自肺炎链球菌(血清型6菌株14453，在1997年6月27日作为ATCC55987保藏)的两种重组来源的蛋白抗原PhtD (WO2009/012588)和PcpA (WO 2008/022302)单独吸附于磷酸盐处理的AlO(OH)。

制备包含约0.2-0.4 mg/mL的纯化抗原(即rPcpA或rPhtD)和0.56 mg元素铝/ml/PTH悬液的PO4 mM的混合物。备选地，使用标准方法在Tris缓冲盐水(pH 7.4)中制备包含纯化的抗原与氢氧化铝佐剂(如Alhydrogel^® 85 2%)或AlPO4的混合物。将混合物在定轨混合器中室温混合约30分钟至24小时以促进抗原与佐剂的缔合。类似的吸附物制备了多次，典型的预吸附组合物是：蛋白 (PhtD或PcpA)：0.2-0.4 mg/ml、磷酸盐：2-80 mM (优选2-20mM)和AlO(OH)：1.25 mg/ml (0.56mg的元素Al/ml)。将制备的吸附抗原的样品在约2℃-8℃储存直至使用。备选地，通过使用磷酸盐处理的氢氧化铝佐剂贮存液将抗原辅佐在一起(以制备二价制剂)。

d) 制备二价制剂-将吸附于PTH的PhtD和吸附于PTH的PcpA的中间散装物批次(单价制剂)共混并在定轨混合器中室温一起混合约30分钟以制备二价制剂。典型的预吸附制剂组合物是：0.05 mg/ml的各蛋白(rPhtD、rPcpA)、磷酸盐：2-80 mM (优选2-20 mM，更优选2 mM)和1.25 mg/mL AlO(OH) (0.56mg的元素Al/ml)。

实施例2

本实施例描述有佐剂的疫苗制剂在各种条件下的稳定性评价。将许多PTH吸附的疫苗制剂在5℃、25℃、37℃下孵育5天(即，在热加速条件下)。

为了评价4种不同的PcpA疫苗制剂(在AlO(OH)或PTH中配制)的稳定性，将各制剂在37℃孵育6周，然后通过RP-HPLC评估。获得的稳定性结果在表3中概述。孵育期间(在37℃)后，来自未处理的AlO(OH)的回收减少了几乎50%，而在包含PTH的制剂中观察到很少至没有的降解

表3

在37℃孵育6周后PcpA的%回收(RP-HPLC)

。

为了评价单价和二价制剂(用AlO(OH)或PTH配制)中的PcpA和PhtD的稳定性，如实施例1中所述，使用AlO(OH)或含2mM磷酸盐的磷酸盐处理的AlO(OH)制备制剂，然后将样品在各种温度(即5℃、25℃、37℃或45℃)下孵育约16周。然后通过RP-HPLC评估抗原浓度。获得的稳定性结果在图1a-f中示出。如图所示，与用未处理的AlO(OH)为佐剂的制剂相比，用磷酸盐处理的AlO(OH)为佐剂的制剂中的PcpA和PhtD的降解速率，尤其在加速(应激)条件(例如25、37、45℃)下显著降低。

为了评价多价制剂(用AlO(OH)或PTH配制)中的PcpA和PhtD抗原性的稳定性，如实施例1中所述制备二价制剂(100 µg/mL)，然后将样品在约37℃孵育大约12周。通过定量ELISA夹心测定评价各制剂在零时和12周孵育期间后的抗原性。结果在图2中示出。与用AlO(OH)的制剂相比，当用PTH配制时，在37℃ 12周孵育期间后，PcpA和PhtD两者的抗原性明显更高。

实施例3

本实施例描述用预处理的铝佐剂制备的多价制剂的稳定性分析。

为了制备10X磷酸盐处理的氢氧化铝(PTH) (其中磷酸盐(P)：铝(Al)的比= 0.1)，将AlO(OH)佐剂的贮存悬浮液(Al=10.9mg/ml, Alhydrogel “85” 2%, Brenntag)与500 mM磷酸盐缓冲液pH 7.4的贮存液(无水Na₂HPO₄, JT Baker 和 NaH₂PO₄, EM science)共混，并用TBS缓冲液(10 mM Tris-HCl (Trisma碱, JT Baker) pH 7.4/150 mM NaCl (EMDChemicals))稀释至终浓度为5.6 mg Al/ml。将该制备物在定轨混合器中室温混合大约17小时。磷与铝的摩尔比为0.1。类似地制备P:Al摩尔比为0.5和1.0的PTH贮存液。

将来自肺炎链球菌(血清型6菌株14453，在1997年6月27日作为ATCC 55987保藏)的三种重组来源的蛋白抗原PhtD (WO2009/012588)、PcpA (WO 2008/022302)和遗传解毒的、无酶活性的肺炎链球菌溶血素突变体(PCT/CA/2009/001843)在大肠杆菌中重组表达，常规纯化方案后通过系列柱层析纯化。通过将蛋白贮存液与PTH悬浮液(或，对于对照制剂，未处理的AlO(OH) (Alhydrogel “85”2%, Brenntag))以及合适量的TBS缓冲液在定轨混合器中室温混合约30分钟，三种蛋白抗原以约300 μg/mL被单独吸附(3X中间散装物)。通过将等体积的3X中间散装物共混来制备最终的三价制剂(参见图3，其提供用于实验室规模批次的生产过程的简化描绘)。

稳定性

在正常和应激条件下评价稳定性。将制剂在5、25、37和45℃孵育并通过RP-HPLC和SDS-PAGE评价化学完整性。获得的关于AlO(OH)或PTH (P:Al=0.1)中三价制剂的稳定性数据的概况在表4中示出，如由在5℃和25℃孵育8周后通过RP-HPLC的完整蛋白浓度(T=0时的%)评价。当用未处理的AlO(OH)为佐剂时，3种蛋白每种都不稳定，如由在5℃和25℃两者孵育后蛋白浓度的显著降低所示。与此相反，与用未处理的AlO(OH)为佐剂的制剂相比，用PTH (P:Al=0.1)为佐剂的蛋白在孵育阶段期间(当在5℃储存时)经历最少的降解并在25℃储存时经历明显更低的降解

表4. 三价制剂的稳定性概况，如在5℃和25℃孵育8周后通过RP_HPLC评价

。

吸附

为了评估吸附于佐剂的各抗原的百分比，将制剂样品(具有100 μg/ml的各蛋白并用具有不同P:Al摩尔比的PTH为佐剂)以4000 × g离心约5分钟，并测定上清液中的各蛋白的浓度。通过载体NTi预测各抗原的等电点(如实施例1中所述)。表5示出各种测试的制剂中各抗原的%吸附的概况。结果表明，随着P:Al增加，酸性抗原(等电点 <7.0)的吸附降低。关于PcpA (中性抗原)，P:Al为0.5时%吸附没有变化，P:Al为1.0时%吸附仅降低了1%。在本实施例使用的Al浓度下(0.56mg/mL)，当P:Al摩尔比为0.1时，获得所有3种抗原的最优吸附(>90%)。在较高P:Al比下酸性抗原与PTH的吸附可通过增加制剂中佐剂的浓度改善(例如，至管理机构允许的最大Al浓度(例如，0.85 mg 铝/疫苗剂量(FDA)))。

表5.蛋白抗原与在不同P:Al比下制备的PTH的吸附百分比(%A)。PTH浓度为0.56mg Al/ml；各抗原的浓度为100 μg/ml

。

实施例4

磷酸盐处理对疫苗制剂免疫原性的影响

本实施例描述多组分疫苗在动物模型中的免疫原性分析。免疫Balb/c雌性小鼠以评估由用数种不同的佐剂之一配制的二价疫苗组合物引起的免疫反应。使用纯化的重组PhtD和PcpA蛋白，(如实施例1中所述)制备制剂。将制剂在Nutator上混合大约30分钟并分配到玻璃小瓶中。将多组小鼠用合适的制剂以3周间隔肌内(IM)免疫3次。使用的具体制剂如下：

A. TBS pH=7.4中的100 μg/mL的各PhtD和PcpA，无佐剂的

B. Tris盐水 pH=7.4中的100 μg/mL的各PhtD和PcpA + 1.3 mg/mL AlOOH(Alhydrogel “85” 2%, 25.08 mg/ml)

C. TBS pH=7.4中的100 μg/mL的2种蛋白的每种 + 用2 mM磷酸盐，pH 7.4预处理的1.3 mg/mL AlOOH。

在每次免疫前和最后免疫后3周收集血清。通过终点稀释ELISA测量总抗原-特异性IgG效价并计算各组的几何平均效价(+/- SD)。获得的总IgG效价的概况在下文表6中示出

表6

组合的抗-PcpA和抗-PhtD总IgG效价几何平均值

。

亦计算抗原-特异性IgG1和IgG2a效价以评估IgG1/2a亚类。结果的概况描绘在图4a、4b和4c中。

用AlO(OH)或磷酸盐处理的AlO(OH)配制的有佐剂的二价组合物引起的IgG抗体效价(IgG、IgG2a和总IgG)是可比较的(即，没有显著不同)并显著高于无佐剂的制剂。基于IgG1/2a亚类，用AlO(OH)配制的组合物和用磷酸盐处理的AlO(OH)配制的组合物各都引起Th2类型的免疫反应(即，IgG1在小鼠血清中是主要的IgG亚型)。

实施例5

磷酸盐处理对疫苗制剂免疫原性的影响

本实施例描述用不同的基于铝的佐剂配制的多组分组合物的免疫原性分析。

将Balb/c雌性小鼠用于评估由用数种不同的佐剂之一配制的二价疫苗组合物引起的免疫反应。在本研究中，将重组PhtD和PcpA (如实施例1中所述制备和纯化)与AlO(OH)或用不同磷酸盐摩尔浓度(2 mM、10 mM和20 mM)的PO₄处理的AlO(OH)或AlPO4 (Adjuphos^™，购自Brenntag)配制。如实施例1中所述制备制剂。在本研究中使用两批的各AlO(OH)制剂：制备一批然后老化(即，在约2-8℃孵育大约6个月)和在第一次免疫的一周内制备第二批(即，新鲜制备的制剂)。

将多组抵达6-8周龄的5 (或4)只雌性Balb/c小鼠(Charles River)用合适的制剂以3周间隔肌内(IM)免疫3次。给予各组的具体制剂在表7中示出。

最后出血后的PhtD和PcpA-特异性抗体ELISA效价在表7中概述。用PcpA和/或PhtD蛋白免疫的小鼠在免疫后产生抗原-特异性抗体反应。在用包含新鲜或老化的AlO(OH)的二价制剂或用包含用磷酸盐(在使用的三种浓度任一种下)预处理的AlO(OH)的制剂免疫的动物中未观察到抗-PhtD和抗-PcpA效价的显著差异。当与包含AlO(OH)或含有PO₄的AlO(OH)佐剂的制剂相比时，用与AlPO₄ (其比AlO(OH)免疫原性低)配制的二价组合物免疫引起明显更低的抗-PhtD IgG效价。

表7

用安慰剂或二价疫苗制剂免疫的多组小鼠的PcpA和PhtD-特异性ELISA效价

* 从个体小鼠中测定最后出血抗-PcpA和PhtD效价并以几何平均值呈现。

实施例6

磷酸盐处理对疫苗制剂免疫原性和稳定性的影响

本实施例描述用不同的基于铝的佐剂配制的多组分组合物的免疫原性分析。

将Balb/c雌性小鼠用于评估由新鲜和老化的有佐剂的二价制剂引起的免疫反应。为了制备二价制剂，如实施例1中所述，将重组PhtD和PcpA与AlO(OH)或包含PO₄ (2 mM)的AlO(OH)配制。研究中使用的老化制剂在第一次免疫前已在约2℃-8℃储存大约6个月。研究中使用的新鲜制备的制剂在第一次免疫的一周内制备。将多组小鼠用合适的制剂以3周间隔肌内(IM)免疫3次。

在每次免疫前和最后免疫后3周收集血清。通过终点稀释ELISA测量总抗原-特异性IgG效价并计算各组的几何平均效价(+/- SD)。获得的总IgG效价的概况在图5中示出。

由AlO(OH)和磷酸盐处理的AlO(OH)制剂两者引起的α-PhtD和α-PcpA效价无统计差异(其与实施例5中示出的研究获得的结果类似)。然而，用AlO(OH)或PTH为佐剂的老化制剂比其新鲜制备的制剂引起更高的抗原特异性IgG效价，这与其中具有AlO(OH)的新鲜或老化二价制剂引起的抗-PhtD和抗-PcpA效价无统计差异的实施例5研究相反。在本研究中，老化和新鲜制备的制剂两者在引起的效价方面所观察到的差异最有可能由于老化和新鲜制备的制剂用不同批次的AlO(OH) (Alhydrogel^™)制备。

使用以用2 mM磷酸盐处理的AlO(OH) (Alhydrogel, Brenntag)为佐剂的新鲜制备和老化的二价制剂进行随后的研究。使用相同批次的Alhydrogel分别制备新鲜制备和老化的制剂。将制备的制剂样品在2-8℃或37℃储存大约6-7个月后开始研究。通过定量ELISA测量总抗原-特异性IgG效价，获得的总IgG效价的概况在图8中示出。新鲜制备的二价有佐剂的制剂和在2-8℃已老化6个月的二价有佐剂的制剂两者在α-PcpA和α-PhtD ELISA效价方面无统计差异。磷酸盐预处理的AlO(OH)制剂所经受的储存条件不不利地影响免疫原性，并因此用磷酸盐预处理的AlO(OH)为佐剂的制剂在测试条件下是稳定的。

实施例7

磷酸盐处理对疫苗制剂的免疫原性和保护的影响

本实施例描述多组分疫苗在小鼠鼻内攻击模型(其为基于较早描述(Zhang, Y.A,等 Infect. Immun. 69:3827-3836)的主动免疫模型)中针对致命肺炎球菌攻击的保护能力。

如实施例1A和1B中所述，制备rPhtD和rPcpA的二价组合物，其包含在TBS中与佐剂(用2 mM PO4处理的AlOOH (65μg/剂量))配制的5μg/剂量的各纯化重组PhtD和PcpA蛋白。在该研究中，将多组雌性CBA/j小鼠(每组N = 15)用合适的制剂以3周间隔肌内(IM)免疫3次。注射体积为50μL/剂量。作为阴性对照，注射包含铝佐剂的PBS安慰剂。

在约9周，鼻内给予动物致死剂量(大约106 CFU)的PBS悬浮液中的肺炎链球菌菌株MD、菌株14453或941192 (40 μL攻击体积/小鼠)。在第一次注射前4天(在0周免疫前)和攻击前4天，从所有动物中取样品出血。通过抗体ELISA测定，分析血清的总PhtD和PcpA-特异性IgG反应。

攻击后，每天监控小鼠的死亡率。使所有存活的小鼠攻击后11天安乐死。使用Fisher单侧精确检验，通过比较免疫组与安慰剂对照中的存活确定保护(p值 <0.05被认为显著)。研究的结果(以%存活记录)在下文图7和表8中示出。

表8

用二价疫苗或安慰剂免疫的小鼠的存活结果

* 使用Fisher精确检验相对安慰剂组计算p值；攻击后11天与安慰剂组的不同。

在IN攻击模型中，用组合的重组PhtD和PcpA蛋白免疫，产生针对3种不同的肺炎链球菌菌株致命IN攻击的保护。在已用14453菌株或MD菌株攻击的各组中观察到的保护是统计上显著的。用941192菌株攻击的组亦具有高的%存活，但鉴于阴性对照组(单独用佐剂免疫)中观察到的存活百分比，该保护不被认为统计上显著。

实施例8

铝浓度对疫苗制剂免疫原性的影响

本实施例描述用磷酸盐预处理的AlO(OH)和不同浓度的元素铝配制的多组分组合物的免疫原性分析。

将雌性Balb/c小鼠用于评估由有佐剂的三价制剂引起的免疫反应。为了制备三价制剂，如实施例1中所述，将重组PhtD、PcpA和无酶活性的肺炎链球菌溶血素突变体(各来源于肺炎链球菌)与含有PO₄ (2 mM)的AlO(OH)配制。将制备的制剂样品在开始研究前在2-8℃储存。将多组Balb/c小鼠用合适的制剂以3周间隔肌内(IM)免疫3次：

A. 无佐剂的(三价，TBS pH=7.4中的50 μg/mL的PcpA和PhtD以及100 μg/mL的Ply突变体)

B. 三价，Tris盐水 pH=7.4中的50 μg/mL的PcpA和PhtD以及100 μg/mL的Ply突变体 + 0.56 mg Al/mL PTH，P:Al摩尔比= 0.1 (0.56 mg Al/mL 用2mM PO4处理的AlO(OH))

C.三价，Tris盐水 pH=7.4中的50 μg/mL的PcpA和PhtD以及100 μg/mL的Ply突变体 + 0.28 mg Al/mL PTH，P:Al摩尔比= 0.1 (0.28 mg Al/mL 用1mM PO4处理的AlO(OH))

D. 三价，Tris盐水 pH=7.4中的50 μg/mL的PcpA和PhtD以及100 μg/mL的Ply突变体 + 1.12 mg Al/mL PTH，P:Al摩尔比= 0.1 (1.12 mg Al/mL 用4mM PO4处理的AlO(OH))

E. 三价，Tris盐水 pH=7.4中的50 μg/mL的PcpA和PhtD以及100 μg/mL的Ply突变体 + 1.68 mg Al/mL PTH，P:Al摩尔比= 0.1 (1.68 mg Al/mL 用6mM PO4处理的AlO(OH))。

第一、第二和第三次免疫后收集血清。通过定量ELISA测量总抗原-特异性IgG效价并计算各组的几何平均效价(+/- SD)。获得的总IgG效价的概况在图9中示出。

所有有佐剂的组(B、C、D和E)比无佐剂的组(A)产生明显更高的针对所有三种抗原的效价(p<0.001)。关于各抗原，当用具有0.56 mg元素铝/mL的PTH为佐剂时，效价水平最大(且在PhtD的情况下，用铝0.56 mg /mL和两个较高的浓度引起的效价之间的差异是统计上显著的)。类似地，关于各抗原，当用具有0.28 mg元素铝/mL的PTH为佐剂时，效价水平较低(且在PcpA的情况下，差异是统计上显著的)。这些发现是出乎意料的。预期抗体 (IgG)效价与铝浓度成比例增加(如在Little S.F. 等, Vaccine, 25:2771-2777 (2007)中报道)。出乎意料地，即使各抗原的浓度保持不变，随着铝浓度增加，效价降低而不是达到稳定(且关于PhtD，其是统计上显著的)。

实施例9

佐剂生理化学表征

本实施例描述许多不同的佐剂样品的生理化学表征。使用来自许多不同的10XPTH贮存液样品(如实施例1和3中所述制备的各样品)进行表征测试。亦在表征测试中使用多批氢氧化铝佐剂(Alhydrogel, Brenntag)的样品和一批AlPO₄ (Adjuphos, Brenntag)的样品。

在不同天由不同的操作者生产不同的PTH贮存液(批产物)。测量各批产物中Al和P的含量以评价一致性。测量的Al:P摩尔比在表9中示出

表9：不同批次的PTH中的Al:P摩尔比

。

零电荷点(PZC)

使用Zetasizer Nano-ZS, Nano series (Malvern Instruments)，测量五种不同的10X PTH样品、两批氢氧化铝佐剂(Alhydrogel, Brenntag)的样品和一批AlPO₄(Adjuphos, Brenntag)的样品的PZC。通过手动或与Zetasizer连接的自动滴定器(MultiPurpose Titrator, Malvern Instruments)制备样品。在PZC的范围内(+/- 2个pH单位)，ζ电位与pH之间的关系是线性的，因此，通过读出线性回归与x轴相交的pH可确定PZC。获得的结果概述在表6中示出。

PZC可定义为铝佐剂表面净电荷为零时的pH值。通过表面氢氧基的两性解离或通过吸附来自水性环境的H+或HO-，使氢氧化铝佐剂的表面带电荷，且离子例如磷酸根、硫酸根和碳酸根的存在可影响PZC。如在表6中所示，由于用磷酸盐预处理，AlOOH的PZC显著降低。对于分析的所有六批次的PTH，观察到PZC的变异性很小(RSD 2.9%)，表明在本研究中分析的PTH批产物中的一致性和可比性。

测试两个不同的AlOOH批次，两者的PZC低于文献中对于市售AlOOH报道的值(约11)约1.3个单位。Adjuphos的零电荷点在文献中报道的磷酸铝佐剂的可接受值内(GuptaR. Aluminum compound as vaccine adjuvants(作为疫苗佐剂的铝化合物). Adv Drug Deliv Rev. 1998年7月6日；32(3):155-172.)。

粒径

使用连接Hydro 2000S样品色散单元的Mastersizer 2000 (MalvernInstruments)，通过激光衍射粒度测定法测量粒径。将结果按体积处理且典型地用于表征的数据是d(0.5) (即低于该值按体积分布有50%的粒子的直径(d(0.1)和d(0.9)分别对应于10%和90%))。获得的结果的概述在表10中示出

表10: 对于PTH、AlOOH和AlPO4批产物获得的PZC和粒径结果

。

粒径对于铝佐剂的作用机制是重要的参数，因为铝佐剂能够将可溶性蛋白抗原转化为更容易被树突细胞吞噬的颗粒。为了最优的辅佐性，通常推荐铝佐剂的粒径小于10μm(Vaccine, 2005年2月18日；23(13):1588-95)。粒径测量亦可在批生产中用于监控一致性。

对于所有6批次PTH获得的粒径都小于10 μm的上限值。PTH的平均粒径是4.4 μm，具有14%的RSD。测试的Alhydrogel批产物和测试的Adjuphos批产物的粒径亦小于10 μm。然而Alhydrogel批产物比测试的PTH批产物显示更大的粒径和更大的变异性(表7)。

蛋白吸附能力 (rHSA)

通过用增加浓度的模型蛋白rHSA (Recombumin^®, Novozymes)以范围为0-2500 μg/ml的浓度滴定佐剂样品，实施吸附等温线。rHSA的等电点为大约5，且它与氢氧化铝佐剂主要通过静电相互作用结合。将管在Nutator混合器中室温混合2小时，然后在2-8度孵育过夜。然后将样品以4000 × g离心5分钟。收集上清液并通过Micro BCA测定试剂盒定量蛋白。使用线性化朗缪尔公式：CE/MA=(CE/Ac) + (1/CE K)计算吸附能力，其中CE：平衡中的浓度(上清液浓度)；MA：每吸附剂质量所吸附的蛋白质量；K：吸附系数；Ac：吸附能力。对于AlOOH、PTH和AlPO₄获得的计算的吸附等温线的概况在表11中示出

表11: 对于不同批次的10X PTH和AlOOH获得的吸附能力

。

正如预期的，与AlOOH批次相比，PTH批次具有降低的吸附等温线。关于测试的AlPO₄批次，观察到非常少的rHSA吸附，因此吸附能力不可计算。

结晶度

通过X-射线衍射评价不同佐剂样品的结晶度。在Thermo ARL X’TRA X-射线衍射仪中进行各佐剂的X-射线衍射图。因为来自TBS的盐的存在干扰铝佐剂的衍射图，所以通过离心并在MilliQ水中重悬，将样品洗涤5次。将样品在室温下空气干燥并如之前报道(GuptaR. Aluminum compound as vaccine adjuvants(作为疫苗佐剂的铝化合物). Adv Drug Deliv Rev. 1998年7月6日；32(3):155-172.)以1°/min的扫描速率从5-70°检查(Siemens,Madison, WI)。

当通过XRD分析时，市售来源的AlOOH呈现不同程度的结晶度。AlOOH通常在12.6、27.5、38.2、48.4和64.4° 2θ显示宽的反射，其对应于6.46、3.18、2.35、1.86、1.44和1.31 Å的d-间距(图5)。那些是鉴定矿物水铝矿(AlOOH的结晶相)的指纹带。由此而论，XRD可用作AlOOH的鉴定测试。在另一方面，AlPO₄对于X-射线是无定形的并因此不能通过XRD鉴定。在AlPO₄的衍射图中通常观察到单宽峰(参见图10)。

分析的所有6个PTH批次呈现与AlOOH的衍射图无法区分的衍射图，显示上述水铝矿的指纹反射带。这些结果表明，加入磷酸盐以产生PTH不改变AlOOH的晶体结构。

XRD亦可用于测定给定佐剂样品的结晶度。结晶度通常通过半高(WHH)的衍射带监控并据报道与佐剂的蛋白吸附能力直接相关(Seeber S J；White J L；Hem S L.Predicting the adsorption of protein by aluminium-containing adjuvants(通过包含铝的佐剂预测蛋白的吸附). Vaccine. 1991(3):201-3.)。所有分析的批次在12.6° 2θ的反射带的WWH在表12中示出。在PTH批次中观察到很少的变化，表明类似的结晶度。另外，与AlOOH相比，PTH批呈现较低的结晶度(参见表12)

表12: 不同批次的PTH的结晶度，如通过12.6° 2θ反射带的WHH评价

。

形态学

进行佐剂的显微镜检查。将一滴样品(5 μl)直接放在辉光放电碳包被的400目铜载网上。2分钟后用滤纸吸干网格。在Hitachi H7000透射式电子显微镜中在75 Kv检测样品并在AMT 60XR CCD相机中采集。

氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂由形成各种尺寸的聚集体的小初级粒子组成。氢氧化铝佐剂的初级粒子显示为约10 nm的纤维，其形成直径范围为1-20 μm的聚集体。在另一方面，磷酸铝初级粒子是约50 nm的板样结构，其形成与氢氧化铝佐剂的聚集体类似尺寸的聚集体(参见图13)。

虽然PTH由用磷酸根离子处理AlOOH引起，但是PTH呈现与AlOOH无法区分的显微特征，表明加入磷酸盐不改变AlOOH的结构(参见图12)。所有PTH批次显示类似的形态学，表明分析的批产物之间的一致性和可比性。

实施例10

pH的影响

进行pH对与或不与铝佐剂配制的3种不同抗原物理稳定性的影响。将一个测定用于评价pH对待评价各蛋白(即，PcpA、PhtD和解毒的肺炎链球菌溶血素突变体(PlyD1，如描述于PCT/CA2009/001843：Modified PLY Nucleic Acids and Polypeptides (修饰的PLY核酸和多肽)的SEQ ID NO: 44和记录于本文序列表中的SEQ ID NO: 9))热稳定性的影响。

大体上如实施例1中对于PhtD和PcpA所述以及如在PCT/CA/2009/001843中对于PlyD1所述，将各蛋白抗原在大肠杆菌中重组表达，并在常规纯化方案后，通过系列柱层析纯化。所有3种抗原的蛋白纯度通常高于90%，如通过RP-HPLC和SDS-PAGE评价。在包含150mM氯化钠的10 mM Tris，pH 7.4中以大约1 mg/mL供应蛋白散装物。将各蛋白用合适的缓冲溶液(即，10 mM Tris缓冲液(pH 7.5-9.0)、10 mM 磷酸盐缓冲液(pH 6.0-7.0)和10 mM醋酸盐缓冲液(pH 5.0-5.5))稀释至所需浓度(100 µg/mL PcpA、100 µg/mL PhtD、200 µg/mLPlyD1)，并将铝佐剂(即，氢氧化铝(Alhydrogel，Brenntag Biosector，Denmark)或磷酸铝(Adju-Phos，Brenntag Biosector，Denmark)或PTH)加入蛋白溶液中来实现终浓度为0.6mg元素Al/mL。亦测定对照样品(没有合适的佐剂)。将SYPRO^® Orange，5000X (Invitrogen,Inc., Carlsbad, CA)用DMSO (Sigma)稀释至500X，并接着加入到有佐剂的蛋白溶液中。在所有情况下，SYPRO-Orange的最优稀释为从5000X的商业贮存液至10X。

使用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)仪器(Mx3005p QPCR Systems, Stratagene,La Jolla, CA)，在96孔聚丙烯板(Stratagene, La Jolla, CA)中进行测定。将大约100 µL的样品体积加入各孔中，然后用光学盖条 (Stratagene, La Jolla, CA)盖住板以防止样品蒸发。将板在配备96孔板转子的Contifuge Stratos 离心机 (Heraeus Instruments,England)中以200g 室温离心1分钟。然后将板以每分钟1℃从25℃加热至96℃。分别在492nm和610 nm设置荧光激发和发射过滤器。对于各样品，在25℃和然后每增加1℃采集荧光读数(在610 nm发射，在492 nm激发)。

使用荧光最小值的一阶导数对应的温度，获得热转变(熔化温度，Tm)。使用与RT-PCR系统一起提供的MxPro软件，从熔化曲线(或解离曲线)中计算负一阶导数迹线的最小值。Tm定义为热熔化的中点并代表其中天然和非天然形式的蛋白自由能相等的温度。获得的结果概述记录在图11中。该测定的灵敏度是+/- 0.5℃。

对于大部分蛋白，溶液pH决定蛋白上的电荷类型和总电荷，并因此可影响静电相互作用和总体稳定性。对于有佐剂的蛋白，溶液pH和缓冲剂种类对铝佐剂表面上的微环境pH具有强影响，其可最终影响吸附于铝佐剂的蛋白的降解速率。

在研究的pH范围中，所有3种蛋白为90-100%吸附于氢氧化铝。在磷酸铝中，PcpA的吸附高于80%，而PhtD和PlyD1 (各为酸性蛋白)在超过pH 5时极小量地吸附于佐剂(数据未显示)。

图11显示当与佐剂配制时和在无佐剂的对照中，pH对3种抗原的每种的影响。无佐剂的抗原呈现其独特的pH稳定性特征。PcpA在6.0-9.0的宽pH范围上显示稳定的Tm值，随着pH从6.0降至5.0，其具有减少的Tm值。在另一方面，无佐剂的PhtD和PlyD1的热稳定性在酸性pH下出现最大化(参见图11)。由于加入铝佐剂，无佐剂的蛋白的热稳定性特征显著改变。与无佐剂的对照相比，氢氧化铝似乎在相对高和低的pH值下降低所有3种蛋白的稳定性，显示钟形曲线，随着pH从5增加至9，在接近中性pH下具有最大稳定性。这些数据显示，与未处理的AlOOH相比，用2mM磷酸盐预处理AlOOH显著改善所有3种抗原在高和低pH下的稳定性(图11 A-C)。在pH 6.0-7.5的范围内未观察到显著差异。

与无佐剂的对照相比，当磷酸铝用作佐剂时，在PcpA和PlyD1的Tm对pH图上未观察到大的变化(图11A和11C)。在PhtD用AP佐剂的情况中，与无佐剂的对照相比，在小于6的pH下观察到Tm的显著降低(图11B)。

实施例11

各种赋形剂对许多制剂稳定性的影响

在各种浓度下进行18种GRAS (一般公认安全)化合物的筛查。将一个测定用于筛查增加待评价的各蛋白(即，PcpA、PhtD和解毒的肺炎链球菌溶血素突变体(PlyD1，如描述于PCT/CA/2009/001843：Modified PLY Nucleic Acids and Polypeptides (修饰的PLY核酸和多肽)的SEQ ID NO: 44))热稳定性的化合物。

大体上如实施例1中对PhtD和PcpA所述以及如在PCT/CA/2009/001843 (如SEQ IDNO: 44)中对PlyD1 (关于其序列，本文记录为SEQ ID NO:9)所述，将各蛋白抗原在大肠杆菌中重组表达，并在常规纯化方案后，通过系列柱层析纯化。所有3种抗原的蛋白纯度通常高于90%，如通过RP-HPLC和SDS-PAGE评价。在包含150 mM氯化钠的10 mM Tris，pH 7.4中以大约1 mg/mL供应蛋白散装物(bulk)。将各蛋白用10 mM tris缓冲盐水，pH 7.5 (TBS)中的合适赋形剂溶液(以表11中记录的浓度)稀释至所需浓度(100 µg/mL PcpA、100 µg/mLPhtD、200 µg/mL PlyD1)，并将PTH加入蛋白溶液中来实现终浓度为0.6mg元素Al/mL。亦测定对照样品(没有合适的赋形剂)。将SYPRO^® Orange，5000X (Invitrogen, Inc.,Carlsbad, CA)用DMSO (Sigma)稀释至500X，并接着加入到有佐剂的蛋白溶液中。在所有情况下，SYPRO-Orange的最优稀释为从5000X的商业贮存液至10X。

使用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)仪器(Mx3005p QPCR Systems, Stratagene,La Jolla, CA)，在96孔聚丙烯板(Stratagene, La Jolla, CA)中进行测定。将大约100 µL的样品体积加入各孔中，然后用光学盖条 (Stratagene, La Jolla, CA)盖住板以防止样品蒸发。将板在配备96孔板转子的Contifuge Stratos 离心机 (Heraeus Instruments,England)中以200g 室温离心1分钟。然后将板以每分钟1℃从25℃加热至96℃。分别在492nm和610 nm设置荧光激发和发射过滤器。对于各样品，在25℃和然后每增加1℃获得荧光读数(在610 nm发射，在492 nm激发)。

使用荧光最小值的一阶导数对应的温度，获得热转变(熔化温度，Tm)。使用与RT-PCR系统一起提供的MxPro软件，从熔化曲线(或解离曲线)中计算负一阶导数迹线的最小值。Tm定义为热熔化的中点并代表其中天然和非天然形式的蛋白自由能相等的温度。以下式评估各赋形剂的作用：ΔTm = Tm (具有蛋白+化合物的样品)-Tm (蛋白对照样品)。获得的结果概述在表13中记录。该测定的灵敏度是+/- 0.5℃。

多元醇、单糖和二糖呈浓度依赖的方式增加有佐剂的PlyD1的Tm，其中在高浓度的糖下观察到最大的稳定化(即，Tm增加约4℃)。除了精氨酸减少了PhtD的Tm约2℃外，对于各PcpA和PhtD检测到类似的结果。发现下述赋形剂有效增加所有三种蛋白的热稳定性：山梨糖醇(20%，10%)、海藻糖(20%)、葡萄糖(20%，10%)、蔗糖(10%，5%)和10% 乳糖。

亦研究筛查测定中鉴定的数种赋形剂对应激条件下储存的PcpA物理稳定性和抗原性的影响，以观察与较早观察的热稳定性作用的任何相关性。将PcpA蛋白用图中所述的合适赋形剂溶液(10 mM Tris 缓冲液 pH 7.4中的10% 山梨糖醇、10%蔗糖、10%海藻糖)稀释至所需的浓度(例如，约100 μg/mL)，并向蛋白溶液中加入PTH以实现终浓度为0.6 mg元素Al/mL。该研究中亦包括对照样品(没有赋形剂)。将样品在50℃储存3天时间。通过RP-HPLC评价蛋白降解并通过定量夹心ELISA评估抗原性。结果在图13A和13B中示出。

在配备二极管阵列UV检测器的Agilent 1200 HPLC系统中通过RP-HPLC测量完整蛋白的浓度。使样品在PBS/Zwittergent缓冲液中37℃从佐剂脱附5小时，使用ACE C4柱(Advanced Chromatography Technologies, Aberdeen, UK)以及缓冲液A (水中的0.1%TFA)和缓冲液B (CAN中的0.1% TFA)的流动相梯度，以1 ml/min的流速使用每分钟0.75%的缓冲液B梯度在30分钟内分离。通过210nm的UV吸光度监控蛋白并针对用外部标准品产生的5点线性标准曲线定量。

将定量抗原夹心ELISA用于评价PcpA制剂在零时和50℃孵育3天后的抗原性。将兔IgG 抗-PcpA血清用于抗原捕获，并将很好表征的单克隆抗-PcpA用于检测。简言之，将96孔板用兔抗-PhtD IgG以2 μg/mL的浓度在0.05M Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液中室温(RT)包被18小时，用1% BSA/PBS RT封闭1小时，然后在PBS/0.1% Tween 20 (WB)的洗涤缓冲液中洗涤2次。将2倍稀释的测试样品、内部对照和已知浓度的纯化的PcpA参比标准品在0.1% BSA/PBS/0.1% Tween 20 (SB)中制备，加入孔中并在RT孵育1小时后，在WB中洗涤5次。将检测第一mAb在SB中稀释至0.1 μg/mL的浓度，并在RT孵育1小时后，在WB中洗涤5次，加入以1/40K在SB中稀释的F(ab’)2驴抗-小鼠IgG (H+L)特异性。在WB中洗涤5次后，将TMB/H₂O₂底物加入孔中，并在RT孵育10分钟。通过加入1M H₂SO₄终止反应。将ELISA板在板读数仪(SpectraMax,M5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)中在A450/540 nm读数，并使用软件SoftMaxPRO，使用4-参数计算术，从标准曲线中通过外推法计算测试样品数据。

如图12A中所示，来源于RP-HPLC的数据显示，增加有佐剂的PcpA Tm的那些赋形剂亦在50℃在3天期间降低蛋白的降解速率。如由PcpA蛋白随时间推移的百分比回收所确定的最大稳定性由10% 山梨糖醇提供(如在图12A中所示)。有佐剂的PcpA的抗原性亦被这些赋形剂保留(如在图12B中所示)。与RP-HPLC结果很好相关，山梨糖醇似乎比蔗糖或海藻糖保留抗原性至更高的程度。

当与不具有赋形剂的对照样品相比时，10% 山梨糖醇、10% 蔗糖或10% 海藻糖的加入在50℃显著降低PcpA的速率常数，并增加其半寿期(表14)。与对照相比，9.0的缓冲pH降低蛋白的Tm，但在50℃加速降解(即，增加速率常数) (表14)。总之，这些结果表明，由该测定检测的热稳定性、由RP-HPLC检测的物理稳定性与由ELISA检测的抗原性之间相关性好。

鉴于这些研究中获得的结果，山梨糖醇、蔗糖、葡萄糖、乳糖和/或海藻糖是可被用PTH辅佐的PcpA、PhtD和解毒的肺炎链球菌溶血素蛋白(例如，PlyD1)的单价和多价(例如，二价、三价)制剂包含以增加物理稳定性的赋形剂实例。

表11

GRAS赋形剂对Tm的影响(如通过在温度范围内监控荧光发射评估)。增加热稳定性的化合物提供正Tm差值

。

表12

来自在50℃孵育的制剂的稳定性数据的速率常数值

通过使用零级动力学方程(1) [A_t]=-kt + [A₀]，拟合图12A中呈现的RP-HPLC稳定性数据，计算在50℃孵育的制剂的速率常数，其中A_t是给定时间的抗原浓度，A₀是初始蛋白浓度(μg/mL)，t是时间(天)。对于使用方程(1)的数据线性拟合，记录了R²。

Claims (44)

1.一种包含至少一种抗原的免疫原性组合物，所述至少一种抗原选自肺炎链球菌胆碱结合蛋白A PcpA和肺炎链球菌组氨酸三联体蛋白D PhtD，其中所述至少一种抗原吸附于偏氢氧化铝，所述偏氢氧化铝已用磷酸盐处理，

其中，相对于其中至少一种抗原吸附于未处理的偏氢氧化铝的组合物，所述处理增加至少一种吸附抗原的稳定性。

2.权利要求1的免疫原性组合物，其中元素铝的浓度为0.28 mg/ml-1.68 mg/ml。

3.权利要求1的组合物，其中所述至少一种抗原是蛋白或多糖，或蛋白多糖缀合物。

4.权利要求1的组合物，其中元素磷的浓度为2.0 mM-80.0 mM。

5.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含缓冲剂。

6.权利要求1的组合物，其中所述组合物的pH为6.4-8.4。

7.权利要求6的组合物，其中所述组合物的pH为7.4。

8.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含超过一种抗原。

9.权利要求1的组合物，其中超过一种抗原吸附于偏氢氧化铝。

10.一种用于制备免疫原性组合物的方法，其包括：(a) 将偏氢氧化铝用磷酸盐处理；和(b) 将步骤(a)中的制备物与PcpA和PhtD中的至少一种混合，其中，相对于其中至少一种抗原与未处理的偏氢氧化铝混合的组合物，将步骤(a)中的制备物与至少一种抗原混合增加至少一种抗原的稳定性。

11.权利要求10的方法，其中所述偏氢氧化铝的浓度为0.28 mg/mL-1.68 mg/mL。

12.权利要求10的方法，其中所述抗原是蛋白或多糖。

13.权利要求10的方法，其中磷酸盐的浓度为2.0 mM-80.0 mM。

14.权利要求10的方法，其中所述组合物另外包含缓冲剂。

15.权利要求10的方法，其中所述组合物的pH为6.4-8.4。

16.权利要求15的方法，其中所述组合物的pH为7.4。

17.权利要求10的方法，其中所述组合物包含超过一种抗原。

18.权利要求10的方法，其中超过一种抗原吸附于佐剂。

19.权利要求17的方法，其中所述至少一种抗原是PcpA或PhtD。

20.权利要求19的方法，其中一种抗原是PcpA和第二种抗原是PhtD。

21.权利要求20的方法，其中所述组合物另外包含解毒的肺炎链球菌溶血素PlyD1。

22.一种包含吸附于偏氢氧化铝的PcpA的免疫原性组合物，所述偏氢氧化铝已用磷酸盐处理，其中，相对于其中PcpA吸附于未处理的偏氢氧化铝的组合物，所述处理增加PcpA的稳定性。

23.权利要求22的免疫原性组合物，其中所述组合物另外包含至少一种另外的抗原。

24.权利要求22的免疫原性组合物，其中所述组合物另外包含PhtD。

25.权利要求24的免疫原性组合物，其中所述组合物另外包含PlyD1。

26.一种包含吸附于偏氢氧化铝的PhtD的免疫原性组合物，所述偏氢氧化铝已用磷酸盐处理，其中，相对于其中PhtD吸附于未处理的偏氢氧化铝的组合物，所述处理增加PhtD的稳定性。

27.权利要求26的组合物，其中所述组合物另外包含至少一种另外的抗原。

28.权利要求27的组合物，其中所述组合物另外包含PlyD1。

29.权利要求1、22或26中任一项的免疫原性组合物在制备用于预防或治疗受试者中的与肺炎链球菌感染有关的疾病的药物中的用途。

30.权利要求1、22、或26中任一项的免疫原性组合物，其用于引起受试者中的免疫反应。

31.一种疫苗，其包含权利要求1的组合物和药学上可接受的赋形剂。

32.一种包含至少一种抗原的免疫原性组合物的稳定制剂，所述至少一种抗原选自PcpA和PhtD，其中所述至少一种抗原吸附于偏氢氧化铝，所述偏氢氧化铝已用磷酸盐处理，其中，相对于其中至少一种抗原吸附于未处理的偏氢氧化铝的组合物，所述处理增加至少一种吸附抗原的稳定性。

33.权利要求32的制剂，其中所述制剂为液体形式。

34.权利要求33的制剂，其另外包含Tris缓冲盐水和Tween 80。

35.权利要求32的制剂，其中所述偏氢氧化铝浓度为0.28 mg/ml-1.69 mg/ml。

36.一种包含分离的免疫原性肺炎链球菌PcpA多肽和偏氢氧化铝的免疫原性组合物，所述偏氢氧化铝已用磷酸盐处理，其中，相对于其中PcpA多肽与未处理的偏氢氧化铝组合的组合物，所述处理增加PcpA多肽的稳定性。

37.一种用于在受试者中针对由肺炎链球菌引起的疾病赋予保护的免疫原性组合物，其包含分离的免疫原性肺炎链球菌PcpA多肽和偏氢氧化铝，所述偏氢氧化铝已用磷酸盐处理，其中，相对于其中PcpA多肽与未处理的偏氢氧化铝组合的组合物，所述处理增加PcpA多肽的稳定性。

38.一种包含分离的免疫原性肺炎链球菌PhtD多肽、至少一种另外的肺炎链球菌多肽和偏氢氧化铝的免疫原性组合物，所述偏氢氧化铝已用磷酸盐处理，其中，相对于其中至少一种抗原与未处理的偏氢氧化铝组合的组合物，所述处理增加PhtD多肽的稳定性。

39.一种用于在受试者中针对由肺炎链球菌引起的疾病赋予保护的免疫原性组合物，其包含分离的免疫原性肺炎链球菌PhtD多肽、至少一种另外的肺炎链球菌多肽和偏氢氧化铝，所述偏氢氧化铝已用磷酸盐处理，其中，相对于其中PhtD多肽与未处理的偏氢氧化铝组合的组合物，所述处理增加PhtD多肽的稳定性。

40.权利要求36或37的组合物，其中所述组合物另外包含至少一种另外的肺炎链球菌抗原。

41.权利要求40的组合物，其中所述组合物包含PlyD1。

42.权利要求38或39的组合物，其中所述组合物另外包含至少一种另外的肺炎链球菌抗原。

43.权利要求42的组合物，其中所述组合物另外包含PlyD1。

44.权利要求38或39的组合物，其中所述组合物另外包含PcpA的免疫原性多肽。