CN103619349A - 灭活登革热病毒疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了含有纯化的灭活登革热病毒的免疫原性组合物的制剂及其生产方法。

Description

灭活登革热病毒疫苗

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年5月26日提交的美国临时申请61/490,205和2011年12月15日提交的61/570,966的较早申请日的权利，所述申请的公开内容并入本文。

依照37 C.F.R. § 1.71(E)的版权通告

本专利文件的部分公开内容含有受到版权保护的材料。版权所有者不反对专利文件或专利公开内容中使用的提交到专利与商标局(Patent and Trademark Office)的专利文件或记录中出现的任何复制件，但除此之外保留所有版权权利。

背景

登革热是通过蚊子传播的人类急性病毒性疾病。其为全球热带和亚热带的地方性疾病，每年估计有100,000,000例发生。虽然比较罕见，但是登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)在儿童中是主要的致死原因。目前，还没有保护免于登革热的疫苗，而通过控制蚊子媒介来防病的试图也被证明基本无效。因此，仍然需要安全和有效的疫苗来保护免于由登革热病毒导致的疾病。

简述

本发明公开内容涉及配制引发针对登革热病毒的免疫应答的组合物。

附图简述

图1是泊洛沙姆表面活性剂α-羟基-ω-羟基聚(氧乙烯)聚(氧丙烯)聚(氧乙烯)三嵌段共聚物的通式的图示说明。

图2A和B是说明包含纯化的灭活登革热病毒的免疫原性组合物的纯化和灭活的示例性过程的流程图。图2C和D是说明纯化和灭活的可替代过程的流程图。

图3A和B是说明包含纯化的灭活登革热病毒的免疫原性组合物的配制的示例性过程的流程图。

图4A-B是说明配制包含纯化的灭活登革热病毒的免疫原性组合物之后产物表征的代表性结果的表。

图5A-C是说明冻干和重构之后产物表征的代表性结果的表。

图6A和B是稳定性特征的图示代表(A：固有荧光280/320；B：ELISA)。

详述

介绍

本公开内容涉及配制免疫原性组合物。具体而言，本公开内容涉及配制组合物，诸如原料疫苗制品(bulk vaccine preparation)和免疫原性组合物，其含有一株或多株纯化的灭活登革热病毒。本文公开的配制方法增加了含有纯化的灭活登革热病毒的免疫原性组合物的回收率和稳定性，促进它们的产生、储存和分配。

本公开内容的第一个方面涉及组合物，其包含一种或多种纯化的灭活登革热病毒与缓冲剂和表面活性剂的组合。有利地，此类组合物是适合于配制成免疫原性组合物(例如，防止由于登革热病毒的感染和/或疾病的疫苗)的灭活登革热病毒的原料制品(bulk preparation)。例如，与不包含表面活性剂的制剂相比，添加选择的表面活性剂增强了抗原性保存的灭活登革热病毒的回收率。含有表面活性剂的纯化的灭活登革热病毒的制剂具有减少(例如，在冻干、储存和重构过程中)灭活病毒的非特异性吸附和/或聚集的有利特性。

本文公开的组合物可以包含一种或多于一种血清型的登革热病毒。通常，该组合物包括来自多于一种血清型的多种登革热病毒，即登革热血清型1、登革热血清型2、登革热血清型3和/或登革热血清型4(分别为DEN-1、DEN-2、DEN-3、和/或DEN-4)。例如，组合物可以包含来自不同血清型的登革热病毒中的两种、三种或四种不同的病毒。在一个具体实例中，该组合物包括四种不同的纯化的灭活登革热病毒，每种不同的血清型能够引发对于每种不同血清型的登革热病毒特异性的免疫应答。因此，该组合物有利地包含四种不同的纯化的灭活登革热病毒，其引起针对所有DEN-1、DEN-2、DEN-3 和DEN-4的免疫应答。一种或多种病毒可以选自野生型病毒(即，从天然存在的分离株的强毒病毒繁殖或者对应于天然存在的分离株的强毒病毒)，或者一种或多种病毒可以选自减毒病毒。选择的病毒可以是重组病毒。例如，重组病毒可以是嵌合病毒，例如，具有来自登革热病毒的核酸和来自另一种黄病毒(诸如不同登革热病毒、黄热病病毒或日本脑炎病毒)的核酸的病毒。通常，嵌合病毒包括登革热M和登革热E蛋白中的一种或两种。单一组合物可以以任何组合包含一种或多种野生型病毒、一种或多种减毒病毒、一种或多种重组病毒、和/或一种或多种嵌合病毒。

可以单独或组合使用化学、物理和/或辐射灭活剂灭活纯化的灭活登革热病毒。可以通过暴露于甲醛、β-丙内酯(BPL)、过氧化氢、紫外线辐射和γ辐射或这些技术的任何组合灭活纯化的灭活登革热病毒。

通常，单次人剂量的免疫原性组合物含有至少0.1 µg、0.2 µg、至少0.25µg、至少0.3µg、至少0.33µg、至少0.4 µg、至少0.5 µg、至少1.0 µg、或至少2.0 µg、或至少3.0 µg、或至少5.0µg、或至少10.0 µg (或0.1和10.0 µg之间的任何量)的每种血清型的病毒。通常，单次人剂量的免疫原性组合物含有不超过100 μg的每种血清型的病毒，例如，不超过90 μg、或不超过80 μg、或不超过75 μg、或不超过70μg、或不超过60 μg、或不超过50 μg、或不超过40 μg、或不超过30μg、或不超过20μg、或不超过10μg(或10和100 µg之间的任何量)的每种血清型的病毒。例如，单次人剂量的免疫原性组合物可以包括0.1至10 µg，或约0.25至5 µg，例如，在0.05至2 ml的体积中，诸如0.5至1.5 ml的体积中进行施用。

在某些实施方案中，将一种或多种纯化的灭活登革热病毒吸附到铝盐(“alum”)，诸如氢氧化铝、磷酸铝或羟基磷酸铝上。当包括多种登革热病毒时，每种都可以吸附到相同铝盐上，或者不同病毒可以吸附到不同铝盐上。因此，在一个方面，本公开内容涉及含有吸附(例如，预吸附)到铝盐上的至少一种纯化的灭活登革热病毒与缓冲剂和表面活性剂的组合的免疫原性组合物。

在本文公开的免疫原性组合物(和由其制备成品免疫原性组合物的原料制品)的背景下，选择表面活性剂以适合用于施用于受试者，特别是人受试者。在某些实施方案中，选择表面活性剂适合用于肠胃外施用，例如，用于肌内、皮下、经皮或皮内施用。

适合用于本文公开的登革热组合物的示例性表面活性剂包括泊洛沙姆表面活性剂，以及适合用于施用于人受试者的其他表面活性剂。因此，合适的表面活性剂(除了泊洛沙姆表面活性剂以外)可以选自：聚山梨醇酯表面活性剂、辛苯昔醇(octoxinol)表面活性剂、聚多卡醇表面活性剂、聚氧乙烯硬脂酸酯表面活性剂、聚氧乙烯蓖麻油表面活性剂、N-辛基葡糖苷表面活性剂、聚乙二醇15羟基硬脂酸酯和它们的组合。在某些实施方案中，泊洛沙姆表面活性剂特别适合用于其中一种或多种纯化的灭活登革热病毒没有吸附到铝盐上的制剂。

泊洛沙姆表面活性剂是聚乙二醇-聚丙二醇线性共聚物。商业上，这些通常被称为普朗尼克表面活性剂。在某些实施方案中，泊洛沙姆表面活性剂选自聚乙二醇-聚乙二醇共聚物，其平均分子量为至少约1000 kD，并且平均分子量不超过约15,000 kD。在一个具体实施方案中，免疫原性组合物用聚乙二醇-聚丙二醇共聚物泊洛沙姆188来配制，其以商标Pluronic™ F 68、Lutrol™ F 68和Kolliphor™ P188进行商业销售，其平均分子量为8600 kD，聚氧丙烯分子量为1800 g/摩尔，并且聚氧乙烯含量为80％。

组合物(原料制品和免疫原性组合物)还包括一种或多种缓冲剂。登革热病毒在酸性条件下失去免疫原性，因此选择缓冲剂以保持pH接近或高于中性。通常选择一种或多种缓冲剂以维持组合物的pH等于或高于pH 6.4，优选高于6.8，且最优选高于pH 7.0，例如等于pH7.4或约pH7.4。考虑到某些额外组分(例如，某些佐剂)可能需要调节缓冲剂的量或选择缓冲剂，在配制的免疫原性组合物的其他组分的背景下，选择缓冲剂以维持所需pH。在一个实施方案中，缓冲剂包括磷酸钠和磷酸钾中的一种或两种。在另一个实施方案中，缓冲剂包括三(羟甲基)氨基甲烷。(“Tris”)。

原料制品和免疫原性组合物还可以包括额外组分，诸如一种或多种矿物盐，例如，以便在所需范围内改变或维持涨度。最通常，该盐是矿物盐，诸如氯化钠。有利地以维持配制的组合物等于或接近等渗所需的量添加此类盐。精确量取决于制剂中的其他组分，最特别取决于一种或多种缓冲剂的选择而不同，并且可以由本领域普通技术人员在不进行过多实验的情况下来确定。

本文公开的原料制品和免疫原性组合物还可以包括一种或多种赋形剂，以便在溶液中和/或在加工(例如，冻干)过程中增强纯化的灭活登革热病毒的结构和/或免疫学稳定性(或改变制剂的其他性能，诸如涨度)。在一些实施方案中，赋形剂包括玻璃形成糖或多元醇。在某些实施方案中，玻璃形成糖或多元醇选自：蔗糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇、棉子糖、乳糖醇、山梨醇和乳糖酸、葡萄糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖、乳果糖、麦芽糖、乳糖、异麦芽糖、麦芽糖醇、帕拉金糖醇(palatinit)、水苏糖、松三糖、葡聚糖或它们的组合。在一个具体实施方案中，赋形剂包括蔗糖。任选地，糖或多元醇可以与氨基酸，诸如甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、赖氨酸和/或谷氨酰胺组合使用。

在某些实施方案中，组合物是液体制剂，例如溶液或悬浮液。在其他实施方案中，组合物是冻干制备的，并且在施用前重悬浮。例如，免疫原性组合物可以配制在等渗液体制剂中用于通过注射施用。

在某些实施方案中，免疫原性组合物配制用于施用于人受试者。对于施用于人受试者，可以将免疫原性组合物配制为至少0.05 ml和不超过2 ml的单次剂量，诸如0.5至1.5 ml的单次剂量。

任选地，本文公开的免疫原性组合物可以包括佐剂。在一些实施方案中，例如，其中纯化的灭活登革热病毒吸附到铝盐上的实施方案中，铝盐充当佐剂。在其他实施方案中，佐剂是不含铝的佐剂。无论是否与铝盐组合，例如，吸附到铝盐上，佐剂都可以包括一种或多种免疫刺激性组分。免疫刺激性组分可以包括以下中的一种或多种：油和水乳剂、脂质体、脂多糖、皂苷和寡核苷酸，如下文更详细地描述。

本公开内容的另一个方面涉及用于配制包含一种或多种纯化的灭活登革热病毒的原料抗原制品和免疫原性组合物的方法。此类方法包括：提供包含缓冲剂和表面活性剂的溶液；并且将一种或多种纯化的灭活登革热病毒与溶液混合。在一些实施方案中，将一种或多种纯化的灭活登革热病毒吸附到铝盐上(例如，以产生预吸附的灭活的登革热病毒的原料制品)，然后与溶液混合。通常，将单一株的纯化的灭活登革热病毒吸附到铝盐(例如氢氧化铝、磷酸铝或羟基磷酸铝)上，以产生预吸附的单一原料。为了产生多价免疫原性组合物，然后以所需比例(例如，基于重量1:1:1:1，或基于相对免疫原性进行调整)将个别单一原料与含有缓冲剂和表面活性剂的溶液组合。

通常，将一种或多种纯化的灭活登革热病毒添加至适合(在最终制剂中)用于肠胃外施用的溶液。在一些实施方案中，溶液是等渗溶液。在一些实施方案中，溶液还包括一种或多种赋形剂，诸如盐和/或玻璃形成的糖或多元醇。

在一个实施方案中，例如，以连续顺序，将玻璃形成糖或多元醇、缓冲剂、盐和表面活性剂(如上面所讨论的)添加至注射用水(例如，无菌、无内毒素的水)。将如上所讨论的一种或多种纯化的灭活登革热病毒添加至制备的溶液中。

在一些实施方案中，该方法然后包括冻干含有一种或多种纯化灭活的登革热病毒的溶液(例如，原料制品)，以产生冻干的组合物。在包括冻干免疫原性组合物(例如，用于储存和/或分配)的实施方案中，在施用之前，冻干组合物通常悬浮在合适量，例如，0.05-2 ml，通常0.5至1.5 ml，例如，0.5或1.0或1.5 ml的药学可接受的溶液(诸如注射用水)中。任选地，药学可接受的溶液包括如上文所公开的至少一种免疫刺激性组分。

在另一个方面，本公开内容涉及用于通过配制如上所述的一种或多种灭活登革热病毒而减少一种或多种纯化的灭活登革热病毒或含有其的组合物的非特异性吸附和/或聚集的方法。

在又另一个方面，本公开内容涉及用于通过配制如上所述的一种或多种灭活登革热病毒而增强抗原性保存的一种或多种灭活登革热病毒或含有其的组合物的回收率。

术语

除非另有解释，本文使用的所有科技术语与本公开内容所属领域的技术人员通常理解的意义相同。分子生物学常见术语的定义可见Benjamin Lewin, Genes V, Oxford University Press出版, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew等人(编), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.出版, 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 以及Robert A. Meyers (编), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.出版, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)。

除非上下文明确另有说明，单数术语“一个(一种)”(“a”、“an”和“the”)包括复数指示物。类似地，单词“或”意味着包含“和”，除非上下文明确另有说明。术语“多个(多种)”是指两个(种)或更多个(种)。还应当理解，给出的核酸或多肽的所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子质量数值都是近似值，仅用于描述目的。此外，就物质(诸如抗原)浓度或水平给出的数值限制是近似的。因此，当浓度被指明是至少(例如) 20 µg时，是指浓度应理解为至少接近(或者“大约”或“～”) 20 µg。

虽然与本文描述的方法和材料类似或等同的那些方法和材料可以用于实施或测试本公开内容，以下描述了合适的方法和材料。术语“包含”意味着“包括”。因此，除非上下文另有要求，单词“包含”(“comprises”及其变形，诸如“comprise”和“comprising”)理解为表示含有所述化合物或组合物(例如核酸、多肽、抗原)或者步骤，或者一组化合物或步骤；但不排除任何其他化合物、组合物、步骤或化合物、组合物或步骤的组。缩写“e.g.”来自拉丁文exempli gratia，用于本文表示非限制性的实例。因此，缩写“e.g.”是术语“for example(例如)”的同义词。

为了协助对本公开内容各个实施方案的理解，提供以下术语解释。在本公开内容的背景下可以给出其他术语和解释。

灭活登革热病毒的“原料制品”在本文中是指关于纯化和灭活的最终抗原形式期望施用于受试者的登革热病毒。原料制品或原料制剂可以进一步处理，例如，通过稀释、浓缩，诸如通过冻干和再悬浮，和/或作为免疫原性组合物或疫苗包装进，例如，多剂量或单剂量小瓶或注射器中用于施用。

术语“纯化”(例如关于病原体或含有病原体诸如登革热病毒的组合物)是指从组合物中除去那些不希望有的组分的过程。纯化是一个相对术语，不要求不需要的组分全部都被从组合物中除去。在疫苗生产的背景下，纯化包括诸如离心、透析、离子交换层析和大小排阻层析、亲和纯化或沉淀的过程。因此，术语“纯化的”不要求绝对纯；而是一个相对术语。因此，例如纯化病毒制品是其中病毒比它通常环境(例如它天然情况下在其中复制的细胞或细胞群或者人工环境)中更富集的制品。基本纯的病毒制品可以纯化，从而使得所需病毒或病毒组分代表制品中总蛋白含量的至少50％。某些实施方案中，基本纯的病毒代表制品中总蛋白含量的至少60％、或至少70％，诸如至少80％、至少85％、至少90％、或者至少95％或以上。或者，病毒制品的纯化可以评估为制剂中污染物诸如宿主细胞蛋白的减少。因此，基本上纯的病毒(例如，纯化的灭活登革热病毒)的制品通常包括少于30%或少于25％的残余宿主细胞蛋白。例如，包含纯化的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物可以包括少于20％的残余宿主细胞蛋白，或甚至少于15％或10％或更少(例如，基于wt/wt进行测量)的残余宿主细胞蛋白。

术语“灭活的”在登革热病毒疫苗的背景下意味着抗原组分(例如病毒)不能在体内或体外复制。例如，术语“灭活的”涵盖已经在例如体外复制，然后利用化学或物理手段杀死，从而使得再不能复制的病毒。该术语还可以包括通过进一步加工(例如裂解、分级等)产生的抗原以及通过重组手段在例如细胞培养中产生的组分。

“佐剂”是与在所述试剂不存在的情况下施用抗原相比，能够增强抗原特异性免疫应答产生的试剂。常见佐剂包括含有铝的佐剂，其包含抗原可以吸附其上的矿物质悬液(或矿物盐，诸如氢氧化铝、磷酸铝、羟基磷酸铝)。其他佐剂包括促进产生增强的抗原特异性免疫应答的一种或多种免疫刺激性组分。免疫刺激性组分包括油和水乳剂，诸如油包水和水包油型(及其变体，包括复乳剂和可逆乳剂)、糖脂、脂多糖、免疫刺激性核酸(诸如CpG寡核苷酸)、脂质体、Toll样受体激动剂(特别是，TLR2、TLR4、TLR7/8和TLR9激动剂)和这些组分的各种组合。佐剂可以包括免疫刺激性组分的组合。

“免疫原性组合物”是适合(例如，在试验设置中)施用于人或动物受试者的物质组合物，其能够引发例如针对病原体，诸如登革热病毒的特异性免疫应答。因此，免疫原性组合物包含一或多种抗原(例如其整个纯化的病毒或免疫亚单位，例如多肽)或抗原表位。免疫原性组合物还可以包含一或多种其他能够引发或增强免疫应答的组分，诸如赋形剂、载体和/或佐剂。某些情况下，施用免疫原性组合物以便引发免疫应答以保护受试者免于病原体引起的症状或状况。某些情况下，在受试者暴露于病原体(例如登革热病毒)后，通过抑制病原体的复制来防止(或者治疗，例如减少或改善)病原体所导致的症状或疾病。在本公开内容的背景下，术语免疫原性组合物理解为涵盖这样的组合物，所述组合物是为了引发针对登革热的保护性或缓解性免疫应答的目的而施用于受试者或受试者群体(即疫苗组合物或疫苗)。

“免疫应答”是免疫系统的细胞，诸如B细胞、T细胞或单核细胞对刺激的应答。免疫应答可以是导致产生特异抗体(诸如抗原特异性中和抗体)的B细胞应答。免疫应答也可以是T细胞应答，诸如CD4+应答或CD8+应答。某些情况下，应答对特定抗原是特异的(即，“抗原特异性应答”)。如果所述抗原来源于病原体，则抗原特异性应答是“病原体特异性应答”。“保护性免疫应答”是抑制病原体的有害功能或活性、减少病原体感染或者减轻病原体感染所造成的症状(包括死亡)的免疫应答。保护性免疫应答可以通过噬斑减少试验或者ELISA中和分析法中病毒复制或噬斑形成受到的抑制来测量，或者通过体内测量对病原体攻击的抗性来测量。

“受试者”是活的多细胞脊椎动物生物体。在本公开内容的背景下，受试者可以是实验受试者，诸如非人动物，例如小鼠、棉田鼠或非人灵长动物。可替代地，受试者可以是人受试者。

“缓冲剂”是单独或组合地增加当添加酸或碱时溶液维持pH或抵抗pH变化的能力的化合物或组合物。术语缓冲剂包括各种各样的化合物和组合物，通常，是弱酸或弱碱，当分别与它们的共轭碱或酸存在时，其可以用来将pH维持在所需值或在所需范围内。

“表面活性剂”或表面活性剂是特征在于亲水性头部和疏水性尾部的两亲性分子。当被吸附在液体表面上时，表面活性剂的作用是降低液体的表面张力，两种液体之间的界面张力，或液体和固体之间的张力。表面活性剂可以充当去污剂、润湿剂、乳化剂、发泡剂和/或分散剂。

本文公开的组合物包含一或多种纯化的灭活登革热病毒抗原。在各个方面，组合物是制备的灭活登革热病毒的原料制品，例如在液体制剂中，在选择规模的固体(例如，冻干)制品，或者配制用于施用于受试者(通常是人受试者)的免疫原性组合物。例如，原料制品(无论液体或固体)和/或免疫原性组合物可以包含单一株的登革热病毒(即单价组合物，诸如单价原料制品或单价免疫原性组合物)，或者它们可以含有多于一株登革热病毒(即多价组合物，诸如多价原料制品或多价免疫原性组合物)。通常，多价组合物含有选自不同血清型的病毒株。因为有四种可以引起疾病的登革热病毒血清型，即登革热1型(DEN-1)、登革热2型(DEN-2)、登革热3型(DEN-3)和登革热4型(DEN-4)，而且因为交叉反应性非中和抗体倾向导致更严重形式的登革热疾病，为了保证保护免于四种血清型中任何一种引起的疾病，可以给每种血清型选择一个代表包括到原料制品(bulk preparation)和最终疫苗中。因此，在一个实施方案中，免疫原性组合物是包含选自登革热病毒四种血清型的每一种的病毒株的四价组合物。

用作抗原的病毒可以选自基本上一株或多株任何登革热病毒。例如，可以基于与血清型给定(例如共有)序列的一致性给每个血清型选择病毒株，所述给定序列是诸如DEN-1共有序列、DEN-2共有序列、DEN-3共有序列或DEN-4共有序列。此类病毒可以是天然存在的或合成的。例如，可以选择与疫苗要施用的区域或群体中流行的病毒株(例如，天然存在或“野生型” 病毒株)有关的病毒株。另一个选择是根据可得性或以前的经验方便地选择每种血清型的病毒株。例如，美国专利号6,254,873中描述了示例性病毒株，该专利通过引入并入本文。其他合适的病毒株在例如美国专利号7,226,602中描述，该专利也通过引入并入本文。在例如VBRC病毒基因组数据库 (http://athena.bioc.uvic.ca/organisms/Flaviviridae/Dengue/Curated_genes)和登革热病毒数据库(http://www.broad.mit.edu/annotation/viral/Dengue/ProjectInfo.html) 中可以找到其他病毒株。

在纯化的灭活登革热病毒疫苗的背景下，可以使用强毒株或减毒株。通常强毒株在宿主细胞内可以繁殖到更高滴度，有助于商业规模生产。但是，强毒株需要在操作时特别注意以防止参与生产的人员被感染。减毒株，例如通过适应在培养细胞中产生、选择减弱的毒性和/或在登革热的蚊子媒介中复制下降而建立起来的减毒株，需要较少的预防措施但可能很难制备。适合在含有灭活登革热病毒的免疫原性组合物的情况下使用的示例性减毒株在WO 2000/057907和美国专利号6,638,514, 以及WO 2000/058444和US 6,613,556、WO 2002/066621 (美国公开号2004052818), WO 2000/057904 (美国专利号6,528,065、WO 2000/057908、WO 2000/057909 (美国专利号No. 6,511,667)；WO 2000/057910 (美国专利号6,537,557)、WO 2002/095075 (例如，美国专利号7,226,602)和WO 2002/102828 (美国专利号7,569,383)中描述，这些专利均通过引用并入本文。

嵌合“登革热”病毒也适用于本文公开的制剂的背景下。此类嵌合病毒通常表达登革热病毒包膜蛋白，例如，使用不同登革热病毒或不同黄病毒，诸如黄热病病毒或日本脑炎病毒的核酸骨架。嵌合登革热病毒的实例可见，例如，WO 98/37911 (美国专利号6,696,281；6,962,708)、WO 96/40933和WO 2001060847 (美国专利号7,094,411；7,641,909；8,025,887)和EP1159968。用于产生此类嵌合登革热病毒的方法也可见WO 03/101397。出于提供适合用于本文公开的制剂和方法的背景下使用的示例性嵌合登革热病毒的目的，这些公开的申请和专利的公开内容通过引用并入本文。

因此，所选一种或多种病毒株一般从可供在适合生产人使用材料的细胞(例如，认证为不含病原体的细胞)中复制的大量病毒株中进行选择。例如，可以对病毒株进行筛选来鉴定那些能够在所选细胞系中生长至最高滴度的病毒，例如至少大约5x10⁶ pfu/ml的滴度，优选至少1x10⁷ pfu/ml或更高的滴度；(ii)选择登革热病毒中那些在所选细胞系中能够生长至最高滴度的病毒株；和(iii)通过再在所选细胞系中传代一次到几次使那些选择的病毒株进一步适应提高生长。选择的病毒(例如，从登革热病毒四种血清型中选择的)可以通过另外的细胞培养传代或者通过基因操纵使之进一步适应生长至高滴度，从而制备高滴度主病毒株和生产种子批次。

产生一种或多种登革热病毒的方法是本领域已知的，并且在以下中详细描述足以指导本领域普通技术人员，例如，公开的PCT申请号WO 2010/094663、美国公开号2011318407。用于在无血清条件下产生病毒的方法也可见，例如，美国公开号20060183224。这些公开的专利申请的公开内容通过引用并入本文，以提供关于繁殖和纯化用于包括在本文公开的原料制品和免疫原性组合物中的登革热病毒的其他细节。类似地，用于灭活登革热病毒以产生纯化的灭活登革热病毒的方法是本领域众所周知的，并且包括暴露于化学、物理和/或辐射剂。合适的方法包括，例如，暴露于甲醛、β-丙内酯(BPL)、过氧化氢、紫外线辐射和γ辐射或它们的组合。此类方法的细节可见，例如，公开的PCT申请号WO 2010/094663(美国公开号2011318407)，和美国公开号20070031451，其出于说明灭活登革热病毒的示例性方法的目的通过引用并入本文。

用于纯化登革热病毒的示例性程序描述于图2A-D的流程图中。为了产生适合于商业用途的量的登革热病毒，易感细胞系生长在合适培养基中的体外培养物中。通常，细胞是哺乳动物细胞，诸如肾或肺上皮细胞。存在几种合适的细胞系，例如，非洲绿猴肾细胞，诸如Vero细胞、MRC-5细胞、MDCK细胞和FRhL-2细胞。可替代地，可以使用昆虫细胞，特别是蚊子细胞，诸如白纹伊蚊细胞系C6/36。细胞可以培养在含血清培养基或无动物成分的培养基(AF培养基)中。任选地，培养基最初或定期补充添加剂，诸如葡萄糖、氨基酸、合成的生长因子或其他蛋白。将细胞扩增，通常是通过一系列渐增的容器大小(例如，175 cm²烧瓶；CF₂ (1200 cm²)；CF₁₀ (6000 cm²)；CF₄₀ (50L生物反应器)；200 L生物反应器)。在较大容器大小，通常采用悬浮的微载体用于细胞结合。任选地，通过灌注提供培养基，或者可以定期为培养物进料。在某些实施方案中，细胞是Vero细胞，其可以在商业规模生物反应器中进行培养。

将细胞按比例生长至所需密度，并且用病毒感染(例如，选择以提供DEN-1、DEN-2、DEN-3和/或DEN-4的抗原决定簇的病毒株)。用选择的病毒以合适的MOI(例如，0.01-0.1 MOI，例如0.05 MOI)感染细胞。当采用含有血清的培养基用于预培养和/或感染时，可以将培养基替换为AF培养基，以减少在收获和纯化阶段过程中外来蛋白含量。例如，在1至4天、例如约2天的初始感染阶段之后，将培养基替换为AF培养基。任选地，AF培养基最初或定期补充葡萄糖、氨基酸等。在合适期间病毒生长(例如，最少6天和8天)之后，从细胞收获病毒。任选地，可以在感染后约6天后开始，以一定时间间隔(例如2天的时间间隔)增量收获病毒。收获可以有利地继续几天、例如高达第10天，诸如直到第12天或第14天或更长时间的期间。

澄清含有病毒的培养基，通常通过一系列渐降的孔径(例如，8µ、0.6µ、0.45µ、0.2µ)。合适的商业可获得的滤器和过滤装置是本领域众所周知的，并且可以由技术人员来选择。示例性过滤装置包括，例如，Millipore™ Millistak™ D0HC和Sartobran™ P过滤装置。任选地，如果需要，澄清的病毒收获物可以储存在-70℃。

然后浓缩病毒悬浮液(例如，20-50x或更多，诸如30x或40x)，并且将培养基替换为合适的缓冲液(例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS)，125 mM柠檬酸盐，pH 7.6 )，例如，通过超滤和渗滤。在该阶段和在整个纯化中选择的缓冲剂被选择来在加工过程中维持pH、减少聚集和保存病毒的抗原性。本文所示的缓冲剂仅为实例，并且可以由本领域技术人员出于所示目的选择可替代的缓冲剂。初始浓缩和缓冲液替换随后为进一步过滤和大小排阻层析(SEC)，使用，例如，Sephacryl S-400HR或Sepharose 4 FF树脂。任选地，在进一步处理之前，在浓缩步骤之前或之后，将澄清的病毒悬浮液通过暴露于UV辐射(100-500 J/m²之间，例如200 J/m²)而灭活。

任选地，所述大小排阻层析法步骤随后为一个或多个步骤，以去除残留核酸，诸如细胞DNA。出于该目的，一种合适的方法是膜层析，例如，Sartobind-Q膜层析法(以负模式)和过滤。通常优选将残余DNA降低到少于或等于100 pg DNA/µg蛋白(或降低到少于100 pg/剂量)。

有利地，在该阶段，在灭活之前，可以将选择用于包含在原料制品和/或免疫原性组合物中的表面活性剂诸如如本文公开的泊洛沙姆表面活性剂添加至缓冲液。或者，可以在灭活之后将表面活性剂添加至缓冲液。然后通过本领域已知的任何一种或多种方法，包括通过化学灭活和/或通过辐射将病毒灭活。化学灭活，例如，通过甲醛，β-丙内酯(BPL)或通过过氧化氢已经在本领域中描述用于登革热病毒的灭活，并且可以用来在本文公开的制剂的背景下提供纯化的灭活登革热病毒。例如，通过在室温暴露于甲醛(约100 µg/ml)通常7至10天之间的期间而将该病毒灭活。任选地，将悬浮液在灭活过程期间的中间时间点，诸如第2天、第3天、第4天、或第5天过滤(例如，0.22µ)，以去除聚集物并改善甲醛暴露。灭活的化学方式可以单独或组合使用。可替代地，或与一种或多种化学方式组合，该病毒可以通过辐射(例如UV或γ辐射)灭活。然后去除或中和甲醛或其他化学灭活化合物(例如，在甲醛的情况下，用亚硫酸氢钠)。可以采用超滤/渗滤以去除化学灭活剂，然后将纯化的病毒置于合适的缓冲液中用于随后配制。然后将纯化的灭活登革热病毒最终无菌过滤以产生灭活登革热病毒的原料制品。任选地，将蔗糖添加至原料制品的最终制剂中。如果期望，最终的原料制品可以储存在，例如，-70℃。

如本文所述，配制选择的纯化灭活病毒以产生原料制品和免疫原性组合物，所述原料制品和免疫原性组合物是稳定且具有免疫原性，并且可以以商业规模生产，而在冻干和重构过程中不具有以前获得的方法和制剂观察到的显著损失。上述方法可以导致纯化的灭活登革热病毒制品是至少70％、通常至少80％的登革热病毒材料。该制品含有少于25％，并且通常少于20％宿主细胞蛋白。此外，根据上述方法，纯化的灭活登革热病毒的回收率得到显著增强，从而使得大于90％(或大于95％)的病毒材料被回收在最终制品中。即，在灭活纯化的原料的最终0.2µ过滤之后观察到少于10％或甚至少于5％病毒材料的损失。因此，本公开内容尤其提供了用于减少纯化的灭活登革热病毒的非特异性吸附和/或聚集中的至少一种的方法和用于根据公开的方法通过配制的灭活登革热病毒而增强抗原性保存的灭活登革热病毒的回收率的方法。

在某些实施方案中，在与溶液混合之前，将一种或多种纯化的灭活登革热病毒吸附到铝盐上，以产生预吸附的灭活登革热病毒的原料制品。将登革热病毒与铝盐在溶液中组合，并允许与铝颗粒接触一定时间，所述时间允许灭活病毒吸附至铝颗粒。合适的铝盐包括氢氧化铝、磷酸铝、羟基磷酸铝和硫酸铝钾。通常，将每种选择的病毒独立地吸附至铝上以允许经验性优化病毒：铝比例。在一个有利的实例中，将每种选择的登革热病毒单独吸附至氢氧化铝上以产生铝盐吸附的单一原料，然后用免疫原性组合物的其他组分进行配制。可替代地，将每种选择的登革热病毒吸附至磷酸铝或另一种药学可接受的铝盐上。如果需要，可以以所需比例组合纯化的灭活登革热病毒，然后作为混合物吸附至选择的铝盐上。可替代地，可以如下所述将纯化的灭活登革热病毒重悬浮在含有选择的铝盐的溶液中，而不是预吸附到铝盐上。

在本文公开的制剂的背景下，其中混合纯化的灭活登革热病毒(任选预吸附到铝盐上)的溶液含有缓冲剂。即，如下所讨论，所述溶液是能够抵抗否则可能由将其他组分添加至制剂或用于施用的免疫原性组合物的最终制品引起的pH变化的缓冲溶液。

登革热病毒对酸性pH敏感，在酸性pH下，重要的免疫表位可能丢失，减少了纯化的灭活病毒抗原引发免疫应答的能力。因此，选择缓冲剂以维持pH等于或接近中性或等于微碱性pH。为了改善在一些制剂中的最终pH，选择缓冲剂以促进初始制剂中的pH(例如，在添加某些组分诸如可以具有酸性pH的佐剂之前)高于施用于受试者的最终组合物中期望的pH。因此，选择缓冲剂(或缓冲剂的组合)以维持pH等于或高于pH 6.4。更优选地，选择缓冲剂以保持pH等于或高于pH 6.8，最优选地，选择缓冲剂以保持pH等于或高于中性，例如，等于或接近7.4的生理pH，并且在一些情况下等于或高于pH 7.5，诸如等于或高于pH 8.0，或甚至pH 8.5。

合适的缓冲剂包括碳酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、葡糖酸盐和酒石酸盐缓冲剂、以及更复杂的有机缓冲剂。在某些实例中，缓冲剂包括含有磷酸钠和/或磷酸钾的磷酸盐缓冲剂。通常，此类缓冲剂或系统包括磷酸钠和磷酸钾两者，其比例选择以实现所需pH。在另一个实例中，缓冲剂含有配制以实现所需pH的三(羟甲基)氨基甲烷或“Tris”。配制缓冲剂至所需pH的方法是本领域技术人员众所周知的，并且可以基于所需pH在不需要过多实验的情况下确定合适组成。

在本文公开的原料制品和免疫原性组合物的配制中，含有一种或多种纯化的灭活登革热病毒的溶液还包括表面活性剂。许多表面活性剂是本领域已知的，并且可以用于药物制剂中。选择本文公开的制剂的背景下的表面活性剂以保留纯化的灭活登革热病毒的免疫学特性(例如，构象和免疫表位)，同时增强制剂的稳定性和增强回收率，例如，通过减少病毒的非特异性吸附和/或聚集。

表面活性剂是两亲性分子，具有主要亲水性的“头部”和疏水性“尾部”。表面活性剂可以根据它们的头部和尾部部分的组成进行分类。基于它们头部部分的特征，表面活性剂可分为：非离子型(不带电荷)或离子型(带电荷)。离子表面活性剂可分为阴离子型(带负电荷)、阳离子型(带正电荷)和两性型，例如，两性离子型(2个带相反电荷的基团)。表面活性剂可以根据它们尾部部分的组成进行分类。合适的表面活性剂包括具有烃(例如芳烃、烷烃、烯烃、环烷烃和炔烃)尾部；烷基醚尾部、乙氧基化(聚环氧乙烷)尾部；丙氧基化(聚环氧丙烷)尾部的表面活性剂。

在某些实施方案中，选择的表面活性剂是两性离子型表面活性剂。在一个实施方案中，表面活性剂是可注射的表面活性剂。在即用制剂的背景下，一种合适种类的表面活性剂包括泊洛沙姆表面活性剂。如图1图示说明，泊洛沙姆是由中央聚氧丙烯(聚环氧丙烷)疏水链和侧翼的两个聚氧乙烯(聚环氧乙烷)亲水链构成的非离子型三嵌段共聚物。泊洛沙姆也已知为商品名Pluronics™，并且这些中的某些以商品名Lutrol™或Kolliphor™进行销售。泊洛沙姆表面活性剂特别适用于其中一种或多种纯化的灭活登革热病毒没有吸附到铝盐上的制剂。

在某些实施方案中，泊洛沙姆表面活性剂选自室温下为固体形式的聚乙二醇-聚乙二醇共聚物，例如平均分子量为至少约4500 kD，并且平均分子量不超过约15,000 kD。例如，泊洛沙姆表面活性剂可以选自Pluronic™ F108、Pluronic™ F127、Pluronic™ F188、Pluronic™ F38、Pluronic™ F68、Pluronic™ F77、Pluronic™ F87、Pluronic™ F88、和Pluronic™ F98。各种Pluronic™表面活性剂也以商品名Lutrol™ (现在为Kolliphor™)进行销售。在一个具体实施方案中，免疫原性组合物用聚乙二醇-聚丙二醇共聚物来配制，其称为Pluronic™ F 68或Lutrol™ F 68 (Kolliphor™ P188)，其平均分子量为8600 kD，聚氧丙烯分子量为1800 g/摩尔，并且聚氧乙烯含量为80％。或者，可以采用在室温下为膏状或液体形式的泊洛沙姆表面活性剂，例如，分子量至少约1000 kD，诸如Pluronic™ L 10、Pluronic™ L 101、Pluronic™ L 121、Pluronic™ L 31、Pluronic™ L 35、Pluronic™ L 43、Pluronic™ L 44、Pluronic™ L 61、Pluronic™ L 62、Pluronic™ L 64、Pluronic™ L 81、Pluronic™ L 92、Pluronic™ P 103、Pluronic™ P 104、Pluronic™ P 105、Pluronic™ P 123、Pluronic™ P 65、Pluronic™ P 84 或Pluronic™ P 85。

在本文公开的制剂的背景下，除了上述泊洛沙姆表面活性剂以外，合适表面活性剂的其他实例包括选自以下的表面活性剂：泊洛沙姆、聚乙二醇15羟基硬脂酸酯、聚山梨醇酯、辛苯昔醇、聚多卡醇、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、N-辛基-葡糖苷和它们的组合。

可以以至少0.0001％和高达1.0％的量将表面活性剂可以添加至制剂中。例如，可以以至少0.0005％和高达0.5％，诸如0.001至0.2%，例如，以0.0005%、或0.001%、或0.005%、或0.01%、或0.025%、或0.05%、或0.1%、或0.2%、或0.3%、或0.4%、或0.5%、或高达1.0%(或任何中间量)的浓度添加表面活性剂。这些浓度作为初始制剂中的重量/体积给出。但可以理解，在下面讨论的实施方案中(其中将组合物冻干和/或冻干和重悬浮)，可以根据待施用于受试者的最终制剂的浓度或稀释倍数基于重量/重量(对于固体组合物)重新计算和/或调整精确量。

通常，最终量计算在允许每日暴露(PDE)之内。例如，对于Pluronic™ F68，接受的PDE是注射150 µg/每剂量。因此，最终制剂中的浓度可以根据待施用以实现可接受的PDE的体积而变化。

在一些实施方案中，本文公开的制剂包括额外的药学可接受的组分来改变溶液的涨度、粘度、稳定性、同质性等。

例如，溶液(和因此，制剂)可以包括一种或多种盐。最通常，该盐是氯化钠。然而，如其他药学可接受的盐和离子一样，也可以使用其他矿物盐和离子，例如，钾、钙、镁、锰、锌的盐。药学可接受的盐和它们的选择是充分讨论的，例如，Pharmaceutical Salts:Properties, Selection, and Use, 修订第二版, P. Heinrich Stahl (编辑), Camille G. Wermuth (编辑), Wiley, 2011。

在一些实施方案中，溶液含有至少一种额外的赋形剂或载体。例如，溶液(和因此，制剂)可以包括至少一种糖或多元醇(或它们的组合)，包括碳水化合物和非碳水化合物多元醇，例如玻璃形成的糖和多元醇。通常选择赋形剂以便在不明显损失免疫的重要表位的情况下保存灭活登革热病毒。合适的赋形剂的实例包括糖、糖醇和碳水化合物衍生物。

碳水化合物包括，但不限于，单糖、二糖、三糖、寡糖和它们对应的糖醇、多羟基化合物，诸如碳水化合物衍生物和化学修饰的碳水化合物、羟乙基淀粉和糖共聚物。天然和合成的碳水化合物都适合使用。合成的碳水化合物包括，但不限于，糖苷键被硫醇或碳键替代的那些碳水化合物。可以使用碳水化合物的D和L型两者。碳水化合物可以是非还原性或还原性的。当使用还原性碳水化合物时，优选添加美拉德反应(Maillard reaction)的抑制剂。

适合用于本发明中的还原性碳水化合物是本领域已知的那些，包括，但不限于，葡萄糖、麦芽糖、乳糖、果糖、半乳糖、甘露糖、麦芽酮糖和乳果糖。非还原性碳水化合物包括，但不限于，选自糖醇和其他直链多元醇的多羟基化合物的非还原性糖苷。其他有用的碳水化合物包括棉子糖、水苏糖、松三糖、葡聚糖、蔗糖、纤维二糖、甘露二糖和糖醇。糖醇糖苷优选为单糖苷，特别是通过还原二糖诸如乳糖、麦芽糖、乳果糖和麦芽酮糖获得的化合物。

通常，赋形剂选自碳水化合物(或其衍生物)，包括葡萄糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖、乳果糖、乳糖酸、蔗糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、异麦芽糖、甘露糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、山梨醇、帕拉金糖醇、海藻糖、棉子糖、水苏糖、松三糖、甘露糖或葡聚糖、或它们的组合。在某些实例中，玻璃形成糖或多元醇选自：蔗糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇、棉子糖、乳糖醇、山梨醇和乳糖酸、葡萄糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖、乳果糖、麦芽糖、乳糖、异麦芽糖、麦芽糖醇、帕拉金糖醇、水苏糖、松三糖、葡聚糖或它们的组合。在一个具体实施方案中，赋形剂是蔗糖。

包括在溶液中的糖或多元醇的浓度可以为1％至50％重量/体积，诸如1-10%(例如1-5%、3-7%、5-10%、或任何中间间隔)，或10-15%、15-20%、20-25% 或25-50%，最优选小于或等于5%或小于或等于10% (w/v)。

可替代地，或此外，赋形剂可以包括氨基酸，诸如甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、赖氨酸和谷氨酰胺，尽管可以包括任何氨基酸或氨基酸的组合、肽、水解蛋白或蛋白诸如血清白蛋白。

示例性的制剂组合物提供在表1中。

缓冲剂	pH (+/1 0.1)
		5 mM Na/K2PO4, 50 mM NaCl	7.6
5 mM Na/K2PO4, 50 mM NaCl, 0.1%泊洛沙姆 188, 3%蔗糖	7.6
		10 mM Na/K2PO4, 0.1%泊洛沙姆 188, 3%蔗糖	7.6
5 mM K/K2PO4, 10 mM柠檬酸盐, 0.1%泊洛沙姆 188, 3%蔗糖	7.6
		PBS, 125 mM柠檬酸盐	7.6
5 mM Tris, 5 mM马来酸盐, 0.1%泊洛沙姆 188, 3%蔗糖	7.5
		5 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.1%泊洛沙姆 188, 3%蔗糖	8.0
5 mM Tris, 5 mM马来酸盐, 50 mM NaCl0.1%泊洛沙姆 188, 3%蔗糖	7.5
		10 mM Na/K2PO4, 0.1%泊洛沙姆 188, 1%山梨糖醇	7.6
10 mM K/K2PO4, 0.4%组氨酸, 0.1%泊洛沙姆 188, 1%山梨糖醇	7.6

在一个有利的实施方案中，缓冲剂包含5mM Tris，50 mM NaCl，任选地包含表面活性剂，例如，泊洛沙姆188和糖，例如蔗糖。尽管如此，将理解的是，本文提供的缓冲剂实例并不旨在由特定组分或由作为实例提供的具体组合进行限制。

通常，通过将各种组分添加至不含内毒素的水(例如，无菌水)中而制备其中配制一种或多种纯化的灭活登革热病毒的溶液。例如，通过将以下组分添加至不含内毒素的水中而制备其中添加一种或多种纯化的灭活登革热病毒的溶液：玻璃形成糖或多元醇；缓冲剂；盐；和表面活性剂。在一个实施方案中，以以下顺序依次添加组分：玻璃形成糖或多元醇；缓冲剂；盐；和表面活性剂。组分可以是无菌的，和/或溶液可以是灭菌的，例如，通过过滤或其他方便的方法。在一种或多种纯化的灭活病毒是含有包括在最终制剂中的一种或多种组分的溶液时，可以将所述量调整至最终原料制品或免疫原性组合物的选择浓度。

额外药学可接受的载体和赋形剂也可以包括在制剂中，此类载体和赋形剂是本领域众所周知的，并且描述于，例如，Remington ’ s Pharmaceutical Sciences, E.W. Martin, Mack Publishing Co., Easton PA，第5版。

在某些实施方案中，将纯化的灭活登革热病毒添加至含有如上所述的缓冲剂和表面活性剂(和任选的额外组分)的溶液中之后，配制的免疫原性组合物作为液体储存，例如，在室温下，在0-4℃，或低于0℃，诸如在-20℃或约-20℃，或在约-70℃至-80℃。

可替代地，将配制的组合物干燥，例如通过冻干以产生干燥的或冻干的组合物。干燥(通过从制剂蒸发溶剂)可以通过冻干来完成。冻干在真空下在溶剂/溶质混合物上进行，导致溶剂的升华，并且留下一种或多种干燥溶质，包括一种或多种纯化的灭活登革热病毒和制剂的其他组分。小于100 µbar的任何压力可能是合适的。通常至少约500 mBar的真空足以促进溶剂的有效蒸发，并且至少约6 mBar的真空足以促进溶剂的有效升华。尽管压力可以进一步降低，但是这样做对干燥速率的影响很小，并且在非常低的压力条件下，升华效率降低。尽管去除溶剂可以简单地通过将液体样品置于真空室中而进行，但是发泡或起泡可以导致产品损失，以及产品同质性或免疫原性的降低。为了防止发泡或起泡，配制的免疫原性组合物首先可以冷冻，然后通过在真空下升华，即，通过冻干或冷冻干燥去除溶剂。一种示例性程序描述在实施例3中。

因此，在某些实施方案中，本公开内容提供灭活的登革热病毒的冻干制品，其含有至少一种纯化的灭活登革热病毒和表面活性剂，诸如上面公开的表面活性剂，例如泊洛沙姆表面活性剂等。在一些情况下，冻干制品含有铝盐，诸如氢氧化铝或磷酸铝。例如，可以将一种或多种纯化的灭活登革热病毒吸附到铝盐上。冻干制品还可以包括至少一种充当缓冲剂的组分，和/或玻璃形成糖和玻璃形成多元醇中的至少一种。本领域普通技术人员基于上述公开内容将认识到进一步的实施方案和替代方案。

在其中配制的组合物是干燥的实施方案中，通常在施用(例如，作为可注射的液体)前将干燥组合物悬浮在药学可接受的溶剂中。选择其中混合纯化的灭活登革热病毒的溶液以适合用于药物施用于人受试者。通常，选择溶液为对于肠胃外施用(例如，通过肌内、皮下、经皮或皮内施用)是可接受的。例如，将干燥组合物悬浮在注射用水，例如，无菌、无内毒素水中。或者，溶剂可以是水溶剂和有机溶剂的混合物。在一些实施方案中，重悬浮的免疫原性组合物是等渗的。或者，如果重悬浮的免疫原性组合物不是等渗的，则可以在施用之前例如通过添加盐或其他赋形剂将涨度调节至等渗或接近等渗。本领域普通技术人员将理解，在冻干之前和任选之后，在相关情况下，可以根据方便选择和调整体积。根据例如冻干之前和悬浮之后的制剂免疫原性组合物的相对体积，制备用于施用的最终组合物可以是较小或较大体积，并且因此可以比本文例举的制剂浓度更高或更低。此类浓度的调整可以在无需过多实验的情况下容易地计算以满足偏好。

通常，每剂量免疫原性组合物中的病毒量要选择为在典型患者中能够诱发免疫保护性应答(一个或多个剂量之后)、但没有明显有害副作用的量。该背景下的免疫保护性不需要是完全保护免于感染，它是指保护免于症状或疾病，尤其是与病毒相关的严重疾病。抗原的量可以根据所采用的特定免疫原而变化。抗原含量可以在纯化或部分纯化的病毒抗原的μg总蛋白含量的方面或通过免疫学方法，例如，ELISA或通过定量免疫印迹法诸如放射免疫扩散来测量。通常，可以预期每个人用剂量包含0.01-100μg灭活病毒，诸如至少约0.1μg(例如0.1、0.2、0.25、0.3、0.33、0.4、或0.5 µg)到不超过约50μg，例如约0.25 μg到约30μg，诸如约0.25 µg、0.33 µg、0.5 µg、1 μg、约2μg、约2.5 µg、约3 µg、约4 µg、约5μg、或约10 μg (或0.1到10.0 µg之间的任何量)的每种血清型病毒。通常，单次人剂量的免疫原性组合物含有不超过约100 μg，例如，不超过约90 μg、或不超过约80 μg、或不超过约75 μg、或不超过约70μg、或不超过约60 μg、或不超过约50 μg、或者不超过40 μg、或不超过30μg、或不超过20μg、或不超过10μg(或10和100 µg之间的任何量)的每种血清型病毒。例如，单次人剂量的免疫原性组合物可以包括0.10至10 µg，或0.25至5 µg/每人剂量，或上述个体参数定义的任何其他范围。

基于受试者群体(例如婴儿)选择免疫原性组合物中使用的量。特定组合物中的最佳量可以通过标准研究来确定，所述标准研究包括观察受试者中的抗体效价和其他应答。首次接种疫苗后，受试者可以在合适的间隔后(例如大约4周后)接受一次或多次额外的剂量。通常在至少两个剂量的本文所述的免疫原性组合物之后可以导致免疫保护，并且在一些情况下在适当间隔后递送的两个或三个或更多个剂量之后导致免疫保护。

在一些实施方案中，免疫原性组合物包括至少一种免疫刺激性组分或佐剂。在一些情况下，佐剂包括矿物盐，诸如铝(alum)盐，例如硫酸铝钾、磷酸铝或氢氧化铝。当铝存在时，该量通常为约100μg至1mg，诸如约100μg，或约200μg至约750μg，诸如约500μg/每剂量。如上所讨论，在其中采用铝盐的制剂中，可以在配制到本文公开的组合物中之前将一种或多种纯化的灭活登革热病毒预先吸附到铝盐上。可替代地，铝盐可以包括在其中冻干的免疫原性组合物被重悬浮或添加至液体组合物中的液体中。除了铝盐以外，也可以采用钙盐，例如，作为微粒佐剂。

可替代地或此外(例如，除了铝盐以外)，其中重悬浮干燥制剂的液体可以包括免疫刺激性组分。也可以在施用之前(例如，制备在两个小瓶和/或注射器或其他容器中，并且在施用之前混合)，将免疫刺激性组分添加至液体制剂中。例如，当免疫原性组合物配制用于肌内施用时，有利地选择包含3D-MPL、角鲨烯(例如QS21)、脂质体、和/或油和水乳剂中的一种或多种的佐剂。

适合与纯化灭活登革热病毒抗原组合使用的一种佐剂是无毒的细菌脂多糖衍生物。合适的脂质A无毒衍生物的实例是单磷酰脂质A或更具体而言是3-脱酰基单磷酰脂质A(3D-MPL)。3D-MPL由GlaxoSmithKline Biologicals N.A.以名称MPL销售，在本文件中称为MPL或3D-MPL。参见例如，美国专利号4,436,727; 4,877,611; 4,866,034和4,912,094。3D-MPL主要促进具有IFN-γ(Th1)表型的CD4+T细胞应答。3D-MPL可以根据GB2220211 A中公开的方法生产。从化学上来说，它是具有3、4、5或6个酰基化链的3-脱酰基单磷酰脂质A的混合物。在本发明的组合物中，可以使用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL的颗粒大小使它能够经0.22μm滤器过滤除菌。WO94/21292中描述了此类制品。

在每个人剂量的免疫原性组合物中可以使用1-50µg的量的脂多糖，诸如3D-MPL。此类3D-MPL可以以以下水平使用：约25µg，例如20-30μg，合适地21-29μg或22-28μg或23-27μg或24-26μg，或者25μg。另一个实施方案中，人剂量的免疫原性组合物包含以下水平的3D-MPL，约10μg，例如5-15μg，合适地6-14μg，例如7-13μg或8-12μg或9-11μg，或者10μg。在进一步实施方案中，人剂量的免疫原性组合物包含以下水平的3D-MPL，约5μg，例如1-9μg，或2-8μg，或者合适地3-7μg或4-μg，或者5μg。

在其他实施方案中，脂多糖可以是如美国专利号6,005,099和欧洲专利号0 729 473 B1中描述的β(1-6)葡萄糖胺二糖。本领域技术人员根据这些文献中的教导，很容易制备出各种脂多糖，诸如3D-MPL。不管怎样，这些文献均通过引用并入本文。除了以上提到的免疫刺激剂(与LPS或MPL或3D-MPL结构相似的)，是以上MPL结构一部分的酰基化单糖和二糖衍生物也是合适的佐剂。在其他实施方案中，佐剂是脂质A的合成衍生物，其中的某些被描述为TLR-4激动剂，包括但不限于：OM174(2-脱氧-6-o-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二酰基氧基十四酰基氨基]-4-o-膦酰基-β-D-吡喃葡萄糖基]-2-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-α-D -吡喃葡萄糖基二氢磷酸酯) (WO 95/14026)；OM 294 DP (3S，9R)-3--[(R)-十二酰基氧基十四酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]癸烷-1，10-二醇1，10-双(二氢磷酸酯)( WO 99/64301 和 WO 00/0462)；和OM 197MP-Ac DP(3S-，9R)-3-[(R)-十二酰基氧基十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]癸烷-1，10-二醇，1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(WO 01/46127)。

可以与一种或多种纯化灭活登革热病毒一起用于免疫原性组合物的其他免疫刺激性组分，例如单独或者与3D-MPL或本文描述的另一种佐剂组合使用的其他免疫刺激性组分是皂苷，诸如QS21。

Lacaille-Dubois, M和Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386)提供了关于皂苷的教导。皂苷是广泛分布在植物和海洋动物界的类固醇或三萜糖苷。皂苷的特点是在水中形成摇动后发泡的胶态溶液并能沉淀胆固醇。当皂苷靠近细胞膜时，它们能够在膜上产生孔样结构导致膜破裂。红细胞溶血即是该现象的一个实例，这是某些但并非全部皂苷的属性。

皂苷已知可以作为用于全身性施用的疫苗中的佐剂。各种皂苷的佐剂和溶血活性在本领域中已有广泛研究(Lacaille-Dubois和Wagner，同前)。例如，Quil A (来源于南美树种莫利那肥皂草皂树(Quillaja Saponaria Molina)的树皮)及其级分在US 5,057,540和“Saponins as vaccine adjuvants”, Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55；以及EP 0 362 279 B1中有描述。包含Quil A级分的颗粒结构，被称为免疫刺激复合物(Immune Stimulating Complexes，ISCOMS))是溶血性的，已被用于疫苗制备(Morein, B., EP 0 109 942 B1; WO 96/11711; WO 96/33739)。溶血皂苷QS21和QS17(Quil A的HPLC纯化级分)被描述为强力的全身性佐剂，它们的生产方法在美国专利号5,057,540和EP 0 362 279 B1中公开，所述专利通过引用并入本文。被用于全身性疫苗接种研究的其他皂苷包括来源于其他植物物种，诸如丝石竹属(Gypsophila)和肥皂草属(Saponaria)的皂苷(Bomford等人，Vaccine, 10(9):572-577, 1992)。

QS21是来源于莫利那肥皂草皂树皮的HPLC纯化的无毒级分。美国专利号5,057,540中公开了生产QS21的方法。含有QS21的非反应性佐剂制剂在WO 96/33739中有描述。以上提到的文献通过引用并入本文。所述免疫活性皂苷，诸如QS21，在每个人剂量的免疫原性组合物中可以按照1到50μg之间的量使用。有利地是QS21以以下水平使用，约25μg，例如20-30μg，合适地21-29μg或22-28μg或23-27μg或24-26μg，或者25μg。另一个实施方案中，人剂量的免疫原性组合物包含以下水平的QS21，约10μg，例如5至15μg，合适地6-14μg，例如7-13μg或8-12μg或9-11μg，或者10μg。在进一步实施方案中，人剂量的免疫原性组合物包含以下水平的QS21，约5μg，例如1-9μg或2-8μg，或者合适地3-7μg或4-6μg，或者5μg。此类包含QS21和胆固醇的制剂已被证实当与抗原一起配制时是成功的Th1刺激佐剂。因此，例如，一种或多种纯化灭活登革热病毒可以适合与包含QS21和胆固醇组合的佐剂一起用于免疫原性组合物中。

其他可以使用的TLR4配体是烷基葡萄糖胺磷酸酯(AGPs)，诸如WO 98/50399或美国专利号6,303,347 (还公开了AGPs的制备过程)中公开的那些，合适的是RC527或RC529或者美国专利号6,764,840中公开的AGPs的药学可接受盐。某些AGPs是TLR4激动剂，某些是TLR4拮抗剂。两种都被认为可以作为佐剂使用。

其他能够经由TLR-4引起信号传导应答(Sabroe等人，JI 2003 p1630-5)的合适的TLR-4配体是例如，来自革兰氏阴性细菌的脂多糖及其衍生物或者它们的片段，特别是LPS的无毒衍生物(诸如3D-MPL)。其他合适的TLR激动剂是：热休克蛋白(HSP)10、60、65、70、75或90；表面活性蛋白A、透明质酸寡糖、硫酸肝素片段、纤连蛋白片段、纤维蛋白原肽和b-防御素-2以及胞壁酰二肽(MDP)。在一个实施方案中，TLR激动剂是HSP 60、70或90。其他合适的TLR-4配体在WO 2003/011223和WO 2003/099195中有描述，诸如WO2003/011223的第4-5页或者WO2003/099195的第3-4页公开的化合物I、化合物II和化合物III，特别是WO2003/011223 中公开为ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057、ER804058、ER804059、ER804442、ER804680和ER804764的那些化合物。例如一种合适的TLR-4配体是ER804057。

其他TLR激动剂也可以作为佐剂使用。术语“TLR激动剂”是指这样的试剂，所述试剂能够作为直接配体或者通过产生内源或外源配体间接引起经由TLR信号传导途径的信号传导应答。这些天然或合成TLR激动剂可以作为替代的或额外的佐剂使用。Kaisho & Akira, Biochimica et Biophysica Acta 1589:1-13, 2002中提供了TLRs作为佐剂受体的简短综述。这些潜在的佐剂包括，但不限于TLR2、TLR3、TLR7、TLR8和TLR9的激动剂。相应地，在一个实施方案中，佐剂和免疫原性组合物进一步包含选自TLR-1激动剂、TLR-2激动剂、TLR-3激动剂、TLR-4激动剂、TLR-5激动剂、TLR-6激动剂、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、TLR-9激动剂或它们的组合的佐剂。

在本发明的一个实施方案中，使用了能够经由TLR-1引起信号传导应答的TLR激动剂。能够经由TLR-1引起信号传导应答的合适的TLR激动剂选自：三酰基化脂肽(LPs)；酚溶性调节蛋白；结核分枝杆菌LP；模拟细菌脂蛋白乙酰化氨基端的S-(2，3-双(棕榈酰基氧基)-(2-RS)-丙基)-N-棕榈酰基-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH，三盐酸(Pam3Cys)LP；和来自伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)的OspA LP。

在替代实施方案中，使用了能够经由TLR-2引起信号传导应答的TLR激动剂。能够经由TLR-2引起信号传导应答的合适的TLR激动剂是来自结核分枝杆菌、伯氏疏螺旋体或苍白螺旋体的脂蛋白、肽聚糖、细菌脂肽；来自包括金黄色葡萄球菌的种的肽聚糖；脂磷壁酸、甘露糖醛酸、奈瑟氏菌孔蛋白、细菌纤毛、耶尔森氏菌毒力因子、CMV病毒粒、麻疹病毒血凝素以及来自酵母的酵母聚糖中的一种或多种。

在替代实施方案中，使用了能够经由TLR-3引起信号传导应答的TLR激动剂。能够经由TLR-3引起信号传导应答的合适的TLR激动剂是双链RNA(dsRNA)或聚肌胞苷酸(Poly IC)，后者是与病毒感染相关联的分子核酸模式。

在替代实施方案中，使用了能够经由TLR-5引起信号传导应答的TLR激动剂。能够经由TLR-5引起信号传导应答的合适的TLR激动剂是细菌鞭毛蛋白。

在替代实施方案中，使用了能够经由TLR-6引起信号传导应答的TLR激动剂。能够经由TLR-6引起信号传导应答的合适的TLR激动剂是分枝杆菌脂蛋白、二酰基化LP和酚溶性调节蛋白。其他TLR6激动剂在WO 2003/043572中有描述。

在替代实施方案中，使用了能够经由TLR-7引起信号传导应答的TLR激动剂。能够经由TLR-7引起信号传导应答的合适的TLR激动剂是单链RNA(ssRNA)、洛索立宾(loxoribine，位置N7和C8的鸟嘌呤核苷类似物)或咪唑并喹啉化合物或其衍生物。在一个实施方案中，TLR激动剂是咪喹莫特(imiquimod)。其他TLR7激动剂在WO 2002/085905中有描述。

在替代实施方案中，使用了能够经由TLR-8引起信号传导应答的TLR激动剂。能够经由TLR-8引起信号传导应答的合适的TLR激动剂是单链RNA(ssRNA)、具有抗病毒活性的咪唑并喹啉分子，例如雷西莫特(resiquimod，R848)。雷西莫特也能被TLR-7识别。其他可以使用的TLR-8激动剂包括WO 2004/071459中描述的那些。

在替代实施方案中，使用了能够经由TLR-9引起信号传导应答的TLR激动剂。在一个实施方案中，能够经由TLR-9引起信号传导应答的TLR激动剂是HSP90。替代地，能够经由TLR-9引起信号传导应答的TLR激动剂是细菌或病毒DNA，含有未甲基化的CpG核苷酸的DNA，在特定序列背景下被称为CpG基序。含有CpG的寡核苷酸诱发占优势的Th1应答。这些寡核苷酸是众所周知的，在例如WO 96/02555、WO 99/33488以及美国专利号6,008,200 和 5,856,462中有描述。合适地，CpG核苷酸是CpG寡核苷酸。用于本发明的免疫原性组合物中的合适寡核苷酸是含有CpG的寡核苷酸，任选含有被至少3个，合适的是至少6个或更多个核苷酸隔开的两个或更多个二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸和后面的鸟嘌呤核苷酸。本发明的CpG寡核苷酸通常是脱氧核苷酸。在特定实施方案中，寡核苷酸中的核苷酸间键是二硫代磷酸酯，或者合适的是硫代磷酸酯键，虽然磷酸二酯和其他核苷酸间键也在本发明的范围内。还包含在本发明范围内的是具有混合的核苷酸间键的寡核苷酸。生产硫代磷酸寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法在美国专利号5,666,153、5,278,302和WO 95/26204中有描述。

另一类用于具有一种或多种纯化灭活登革热病毒的制剂中的佐剂包括基于OMP的免疫刺激性组合物。基于OMP的免疫刺激性组合物尤其适合作为粘膜佐剂，例如用于鼻内施用。基于OMP的免疫刺激性组合物是一类来自革兰氏阴性细菌(诸如，但不限于奈瑟氏菌)的外膜蛋白(OMPs，包括某些孔蛋白)制品(参见例如Lowell等人, J. Exp. Med. 167:658, 1988; Lowell等人, Science 240:800, 1988; Lynch等人, Biophys. J. 45:104, 1984; Lowell, "New Generation Vaccines" 第2版, Marcel Dekker, Inc., New York, Basil, Hong Kong, page 193, 1997; 美国专利号5,726,292; 美国专利号4,707,543)，其可以作为载体或用在免疫原(诸如细菌或病毒抗原)组合物中。某些基于OMP的免疫刺激组合物可以称为“蛋白体(Proteosomes)”，它们是疏水的并且人可以安全使用。蛋白体有能力自动组装成约20 nm到约800 nm的囊泡或囊泡样OMP簇，并与蛋白抗原(Ags)，特别是含有疏水部分的抗原非共价地合并、协作、关联(例如静电地或者疏水地)，或以其他方式合作。任何导致产生处于囊泡或囊泡样形式中的外膜蛋白组分的制备方法，包括多分子膜结构或者一或多个OMPs构成的熔融球状OMP组合物，都包含在蛋白体的定义中。蛋白体可以按照例如现有技术(参见例如美国专利号5,726,292或美国专利号5,985,284)的描述制备。蛋白体还可以含有来自制备OMP孔蛋白的细菌(例如奈瑟氏菌)的内源脂多糖或脂肪寡糖(分别是LPS或LOS)，其中脂多糖或脂肪寡糖只占整个OMP制品的2％以下。

蛋白体主要由化学提取的脑膜炎奈瑟氏菌的外膜蛋白(OMPs)(主要是孔蛋白A和B以及4型OMP)组成，利用去污剂保持在溶液中(Lowell GH. Proteosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines.: Levine MM, Woodrow GC, Kaper JB, Cobon GS, eds, New Generation Vaccines. New York: Marcel Dekker, Inc. 1997; 193-206)。蛋白体可以与多种抗原通过例如渗滤或常规透析过程配制，所述抗原诸如来自病毒来源的纯化或重组蛋白，包括本文公开的PreF多肽。逐渐去除去污剂使得形成直径约100-200nm的颗粒状疏水复合物(Lowell GH. Proteosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines. In: Levine MM, Woodrow GC, Kaper JB, Cobon GS, eds, New Generation Vaccines. New York: Marcel Dekker, Inc. 1997; 193-206)。

本文使用的“蛋白体：LPS或Protollin”是指混合蛋白体制品，例如通过外源添加至少一种脂多糖来提供OMP-LPS组合物(其可以作为免疫刺激性组合物)。因此OMP-LPS组合物可以由Protollin的两种基本组分构成，所述组合物包含(1)由革兰氏阴性菌，诸如脑膜炎奈瑟氏菌制备的蛋白体的外膜蛋白制品(例如Projuvant)，和(2)一种或多种脂多糖的制品。脂肪寡糖可以是内源的(例如OMP蛋白体制剂天然含有的)，可以与来自外源制备的脂肪寡糖(例如由与OMP制品不同的培养物或微生物制备的)的OMP制品混合或组合，或者可以是其组合。这些外源加入的LPS可以与OMP制品来自相同的革兰氏阴性细菌，或者来自不同的革兰氏阴性细菌。Protollin也应被理解为任选包含脂质、糖脂、糖蛋白、小分子等，以及它们的组合。Protollin可以按照例如美国专利申请公开号2003/0044425中的描述进行制备。

不同佐剂的组合，诸如以上提到的佐剂的组合，也可以与一种或多种纯化灭活登革热病毒一起用于组合物。例如，如已经提到的，QS21可以与3D-MPL一起配制。QS21: 3D-MPL的比率一般在1∶10到10∶1的水平；诸如1∶5到5∶1，常常基本是1∶1。通常，比率在2.5:1到1:1 3D-MPL∶QS21的范围内。任选地，此类组合可以是脂质体形式。

另一种组合佐剂制剂包含3D-MPL和铝盐，诸如氢氧化铝。当组合配制时，这种组合可以增强抗原特异性Th1免疫应答。

某些实施方案中，佐剂包含油和水乳剂，例如水包油乳剂。水包油乳剂的一个实例是在水性载体中包含可代谢油(诸如角鲨烯)和表面活性剂(诸如山梨醇三油酸酯(Span 85^TM)或聚环氧乙烷山梨醇单油酸酯(Tween 80^TM)或其组合。水性载体可以是例如磷酸盐缓冲盐水。某些实施方案中，水包油乳剂不含有任何其他免疫刺激剂(特别是不含有无毒脂质A衍生物，诸如3D-MPL；或皂苷，诸如QS21)。某些实施方案中，水包油乳剂含有母生育酚(诸如生育酚)，例如α-生育酚。此外，水包油乳剂可以含有卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。

本发明的另一个实施方案中，提供了疫苗组合物，所述疫苗组合物包含抗原或抗原组合物，和包含水包油乳剂的佐剂组合物，以及任选的一或多种额外的免疫刺激剂，其中所述水包油乳剂包含0.5-10mg可代谢油(合适的有角鲨烯)、0.4-4mg乳化剂和任选地0.5-11mg母生育酚(合适的有生育酚，诸如α-生育酚)。

在一个特定实施方案中，佐剂制剂包含制备成乳剂，诸如水包油乳剂形式的3D-MPL。某些情况中，乳剂的小颗粒直径大小如WO 94/21292中公开的低于0.2μm。例如，3D-MPL颗粒小到足以经0.22微米膜过滤除菌(如欧洲专利号0 689 454中描述的)。替代地，3D-MPL可以制备成脂质体制剂。任选地，含有3D-MPL(或其衍生物)的佐剂还包含其他免疫刺激性组分。

选择的佐剂在免疫原性组合物施用的群体中是安全有效的。对于成年和老年群体，制剂含有的佐剂组分通常比婴儿制剂中的多。当含有纯化灭活登革热病毒的免疫原性组合物是配制施用于婴儿时，要确定佐剂的剂量在婴儿受试者中是有效并且相对没有反应性的。通常，婴儿制剂中的佐剂剂量比为施用于成年人(例如65岁及以上的成年人)设计的制剂中使用的量少(例如剂量可能是待施用于成年人的制剂中提供的剂量的一部分)。例如，3D-MPL在每剂量中的量通常在1μg-200μg的范围，诸如10-100μg或者10μg-50μg。婴儿剂量一般在该范围的较低一端，例如约1μg-约50μg，诸如从约2μg，或约5μg，或约10μg到约25μg或约50μg。通常，当制剂中使用QS21时，范围是相当的(并且根据以上指出的比率)。对于油和水乳剂(例如水包油乳剂)的情况，提供给儿童或婴儿的佐剂剂量可以是施用于成年人受试者的剂量的一部分。

因此，配制的免疫原性组合物(包括任何佐剂)适用于施用于人受试者，并且将具有所需免疫原性特性以及可接受的安全性和反应原性。通常，将配制的免疫原性组合物配制在至少0.05 ml和不超过2 ml，诸如0.5至1.5 ml的单一剂量中。例如，单一剂量可以是0.5至0.5 ml、或0.1至2 ml、或0.5至1.5 ml的量中，诸如在0.05 ml、0.06 ml、0.07 ml、0.075 ml、0.08 ml、0.09 ml、0.1 ml.、0.2 ml、0.25 ml、0.3 ml、0.33 ml、0.4 ml、0.5 ml、0.6 ml、0.66 ml、0.7 ml、0.75 ml、0.8 ml、0.9 ml、1.0 ml、1.25 ml、1.33 ml、1.5 ml 或2 ml或任何中间体积的量中。

虽然组合物可以通过多种不同途径施用，最常用的是将免疫原性组合物经肌内、皮下或皮内施用途径进行递送。通常，可以经皮下、皮内或者肌内以足够产生中和抗体和保护作用的剂量施用疫苗。疫苗的施用方式与剂量制剂相容，用量是预防和/或治疗有效的。待施用的量通常在每剂量每株灭活病毒0.05-100μg范围内，取决于待治疗的受试者、受试者的免疫系统合成抗体的能力，以及希望达到的保护程度。待施用疫苗的准确量可能取决于医务人员的判断，对每个受试者可能是独特的。

疫苗可以以单次剂量方案给予，或者优选以多个剂量方案给予，即疫苗接种的主要过程是1-10个独立的剂量，之后根据维持和/或加强免疫应答的需要在随后的时间间隔给予其他剂量，例如1-4个月给予第二个剂量，并且如果需要，在几个月或几年后给予随后的剂量。剂量方案还至少部分由个体的需要决定并取决于医务人员的判断。合适的免疫接种方案的实例包括：第一剂量，之后在第7天到6个月之间给予第二剂量，以及任选在首次接种后1个月到2年之间给予第三剂量；或者其他足够引发赋予保护性免疫力所期望的病毒中和抗体效价的方案，例如选择以对应已建立的儿科疫苗接种方案。可以合理地预期在包含1到3次接种的主要免疫过程后，用灭活病毒疫苗产生针对登革热的保护性免疫力。可以通过以特定间隔(例如每两年)给予的加强剂量补充这些，所述间隔被设计用来维持满意水平的保护性免疫力。

以下实施例仅供阐明某些特定特征和/或实施方案。这些实施例不应被理解为使发明限于所描述的特定特征或实施方案。本领域技术人员将理解的是，仅仅提供量，例如体积，作为实例，并且规模可以根据操作者的选择进行改变(增加或减少)。类似地，在纯化中使用的部件，例如，滤器、柱，并非意在以任何方式限制或排斥，并且可以根据操作者的判断替换为其他部件来实现相同的目的。

实施例

实施例 1 ：用于产生纯化的灭活登革热病毒的纯化方法

登革热病毒在Vero细胞中生长，并且基本上如WO 2010/094663中所述进行纯化。例如，登革热病毒在Vero细胞中、例如在无动物成分的培养基中生长。通常，将细胞保持在固定的预培养阶段(例如，在T型烧瓶或细胞工厂中)，在无动物成分(AF)培养基中，诸如从Invitrogen可商业获得的VPSFM培养基。然后将细胞扩增在生物反应器中，通常结合到微载体(诸如Cytodex 1)，并且通过灌注或批处理模式培养。一旦细胞已经达到合适密度，在含有血清的培养基(例如，1.5％)或AF培养基中用病毒以合适MOI (例如，0.01-0.1，例如0.05)感染细胞。当采用含有血清的培养基时，在初始感染阶段(通常约2天)后，该培养基通常替换为AF培养基。任选地，AF培养基最初或定期补充葡萄糖、氨基酸等。

在合适期间病毒生长(例如，最少6天和8天)之后，从细胞收获病毒。任选地，可以在感染后约6天后开始，以一定时间间隔(例如2天的时间间隔)增量收获病毒。

示例性纯化方法示意性地显示在图2A中。修改的纯化方法示意性地显示在图2B中。尽管基本上类似于图2的方法，但是该方法包括以下修改。用甲醛灭活之后，去除通过添加亚硫酸氢钠中和原料中的游离福尔马林的步骤。去除亚硫酸氢钠中和显著增加了随后过滤步骤中的得率。通过渗滤步骤去除游离的福尔马林。

替代纯化方法显示在图2C和D中。收获之后，澄清含有病毒的培养基，通常通过一系列渐降的孔径(例如，8µ、0.6µ、0.45µ、0.2µ)。然后将病毒悬浮液浓缩，培养基更换为缓冲液，例如，通过超滤和渗滤，随后进一步过滤和大小排阻层析(SEC)，使用，例如，Sephacryl s-400HR或Sepharose 4 FF树脂。任选地，在进一步处理之前，在浓缩步骤之前或之后，将澄清的病毒悬浮液通过暴露于UV辐射(100-500 J/m²之间，例如200 J/m²)而灭活。任选地，所述大小排阻层析法步骤之后为一个或多个步骤，例如，Sartobind-Q膜层析(以负模式)，和过滤以去除残留DNA。通常优选将残余DNA降低到少于或等于100 pg DNA/µg蛋白(或降低到少于100 pg/剂量)。

然后通过在室温暴露于甲醛(约100 µg/ml)通常7至10天之间的期间而将该病毒灭活。任选地，将悬浮液在中间时间点，诸如第2天、第3天、第4天、或第5天过滤(例如，0.22µ)，以去除聚集物并改善甲醛暴露。灭活之后，可以将泊洛沙姆表面活性剂添加到缓冲剂，然后超滤/渗滤以去除甲醛，然后将纯化的灭活登革热病毒置于适于储存的缓冲液中。然后将纯化的灭活登革热病毒最终无菌过滤，然后作为灭活登革热病毒的原料制品进行储存。任选地，将蔗糖添加至原料制品的最终制剂中。

实施例 2 ：示例性免疫原性组合物的制剂

在不同条件下评价纯化的灭活登革热病毒的制剂来解决在储存、冻干和后续处理过程中产物的损失问题。在灭活登革热病毒(每株3.3 µg/ml)的原料制品的配制中评价以下变量：磷酸盐缓冲液(pH 8.5)浓度(5、15、30mM)、泊洛沙姆表面活性剂浓度(0、0.001%、0.2%)，在5％蔗糖存在的情况下，注射用水中的25 mM NaCl。将原料冻干并重构在0.625 ml悬浮溶液中。配制方法示意性地显示在图3A中。替代配制方法显示在图3B中，其中用Tris缓冲液替代磷酸盐缓冲液，并且将冻干之前生成单一剂量的单位体积从1.0 ml降低到0.5 ml。将被理解的是，体积调整和缓冲液改变是独立变量，并且一种或两种改变可以单独或串联进行。

在4℃和37℃孵育后7天之后，评价干燥饼的稳定性。评价干燥产物的饼方面和残余湿度。然后在NaCl或在不同缓冲液中重构冻干饼，以评价pH稳定性。使用1.5 ml的冻干前体积，导致用0.625ml重悬浮溶液重构之后2.4倍浓度系数。通过固有荧光280/320nm、氮含量、Elisa、动态光散射、浊度测定、pH和重量摩尔渗透压浓度分析所得悬浮的免疫原性组合物的饼质量。

示例性结果显示在图4A-B中。

这些结果表明，在0.001%至0.2%表面活性剂(Lutrol™)的浓度，产生了蛋白完全回收在所有测试的悬浮溶液中。这与在表面活性剂不存在的情况下蛋白含量的损失形成对比。不被理论所束缚，据信在表面活性剂不存在的情况下蛋白的损失是由于在小瓶上的非特异性吸附，可以通过添加合适的表面活性剂而防止这一点。在0.2％的浓度，表面活性剂也防止了病毒颗粒的聚集。

缓冲液浓度和悬浮溶液的组成对初始产物回收率没有任何影响。

通过ELISA的免疫学评价表明，在冻干和重构之后保存了灭活登革热病毒的免疫表位。关于冻干和重构的进一步细节提供在实施例3中。

实施例 3 ：冻干原料制品和重构为免疫原性组合物

按照以下说明，如上所述将纯化的灭活登革热病毒配制成原料制品，并且显示在图3B中：5％蔗糖，1-31 mM Tris缓冲液，15 mM NaCl，0.015-0.2%泊洛沙姆188，对于四种病毒株中的每一种使用1.25 µg/株的纯化的灭活登革热病毒。对于冻干，将原料制品分散为0.5 ml等分试样。然后以以下74小时冷冻干燥循环将原料制品进行冻干：在1个大气压(Arm.)下经1小时冷冻到≤ -52℃；如下在45 µbar初始干燥：1)经3小时从-52℃冷却至-32℃；2)32℃ 32小时；3)以1℃增量连续下降温度，下降10分钟，随后为2小时25分钟的维持期间(共7小时55分钟)；4)-28℃持续9小时；二次干燥如下：在45 µbar下经9小时温度从-28℃增加至37℃，随后在27 µbar下37℃持续12小时。然后将冻干样品平衡至2℃至8℃以完成循环。在再水化或以冻干形式37℃ 1个月或-20℃ 3个月或4℃ 5个月之后将所得冻干产物(“饼”)在室温孵育24小时以评价稳定性。

在选择的缓冲液中重构到0.625 ml中之后，免疫原性组合物中的所得浓度如下：4％蔗糖，0.8-24.8 mM磷酸盐，12 mM NaCl，0.012-0.16%泊洛沙姆188，2.0 µg的纯化的灭活登革热病毒。通过以下评价方法来测定所得免疫原性组合物的质量、稳定性和免疫原性：固有荧光、DLS、浊度测定、pH和重量摩尔渗透压浓度分析和ELISA。代表性结果显示在图5A-C中。图6A和6B图示说明在表面活性剂的存在和不存在的情况下将冻干制品重构在缓冲液中之后的稳定性特征(分别为固有荧光和ELISA)。所有数据均在预期值，与无表面活性剂的制剂相比，含表面活性剂的制剂的回收率明显增加。在测试范围内没有观察到缓冲液(Tris)浓度的影响。在各种重构缓冲液中获得了类似的结果(例如，为了获得适合于与不同佐剂施用的液体免疫原性组合物)。这些结果证明，在泊洛沙姆表面活性剂和将pH维持在等于或高于中性的缓冲液存在的情况下冻干和重构导致了在各种缓冲液组合物中的有利的稳定性和免疫原性。

Claims (119)

1.灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其包含：

一种或多种纯化的灭活登革热病毒；

缓冲剂；和

泊洛沙姆表面活性剂。

2.权利要求1的免疫原性组合物，进一步包含佐剂。

3.权利要求2的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含铝盐。

4.权利要求3的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含氢氧化铝和磷酸铝中的至少一种。

5.权利要求3或4的免疫原性组合物，进一步包含至少一种额外的免疫刺激性组分。

6.权利要求5的免疫原性组合物，其中所述至少一种额外的免疫刺激性组分包含油和水乳剂、脂质体、脂多糖、皂苷、和寡核苷酸中的一种或多种。

7.权利要求2的免疫原性组合物，其中所述佐剂是不含铝的佐剂。

8.权利要求7的免疫原性组合物，其中所述不含铝的佐剂包含选自以下的一种或多种免疫刺激性组分：油和水乳剂、脂质体、脂多糖、皂苷和寡核苷酸。

9.灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其包含：

吸附到铝盐上的至少一种纯化的灭活登革热病毒；

缓冲剂；和

表面活性剂。

10.权利要求9的免疫原性组合物，进一步包含至少一种额外的免疫刺激性组分。

11.权利要求10的免疫原性组合物，其中所述免疫刺激性组分包含油和水乳剂、脂质体、脂多糖、皂苷、和寡核苷酸中的一种或多种。

12.权利要求6、8和11中任一项的免疫原性组合物，其中所述一种或多种免疫刺激性组分包含3-脱酰基单磷酰脂质A(3D-MPL)。

13.权利要求5、6、7、8、10、11、和12中任一项的免疫原性组合物，其中所述一种或多种免疫刺激性组分包含QS21。

14.权利要求6、8、10、11、12、和13中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫刺激性组分包含DNA寡核苷酸，所述DNA寡核苷酸包含至少一个未甲基化的CpG。

15.权利要求6、8、10、11、12、13、和14中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫刺激性组分包含脂质体。

16.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述表面活性剂适合用于肌内、皮下、经皮或皮内施用。

17.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述表面活性剂选自泊洛沙姆、聚乙二醇15羟基硬脂酸酯、聚山梨醇酯、辛苯昔醇、聚多卡醇、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、N-辛基-葡糖苷和它们的组合。

18.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述表面活性剂是泊洛沙姆。

19.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述泊洛沙姆表面活性剂的分子量为至少4500kD。

20.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述泊洛沙姆表面活性剂的分子量为不超过15,000 kD。

21.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述表面活性剂以至少0.001% (w/v)的量存在。

22.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述表面活性剂以不超过1.0% (wt/v)的量存在。

23.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含多种纯化的灭活登革热病毒。

24.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述多种纯化的灭活登革热病毒是不同血清型的。

25.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述多种纯化的灭活登革热病毒包含引起对DEN-1、DEN-2、DEN-3 和DEN-4中每种的免疫应答的多种病毒。

26.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中至少一种纯化的灭活登革热病毒是减毒的登革热病毒。

27.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中至少一种纯化的灭活登革热病毒是重组的登革热病毒。

28.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中至少一种纯化的灭活登革热病毒是嵌合病毒，所述嵌合病毒包含第一种登革热病毒核酸和第二种黄病毒核酸。

29.权利要求28的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述第二种黄病毒选自：第二种登革热核酸、黄热病病毒和日本脑炎病毒。

30.权利要求28或29的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述嵌合的纯化的灭活登革热病毒包含编码登革热M和登革热E蛋白中的一种或两种的核酸。

31.权利要求1-25中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中至少一种纯化的灭活登革热病毒是野生型登革热病毒。

32.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述一种或多种纯化的灭活登革热病毒各自以至少0.1 µg和不超过100 µg/单次人剂量的量存在。

33.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述一种或多种纯化的灭活登革热病毒各自以至少0.25 µg和不超过10 µg/人剂量的量存在。

34.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述缓冲剂包含磷酸钠和磷酸钾中的一种或多种。

35.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述缓冲剂包含三(羟甲基)氨基甲烷。

36.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述缓冲剂将液体组合物中的pH维持在pH 6.4或高于pH 6.4。

37.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述缓冲剂将液体组合物中的pH维持在pH 6.8或高于pH 6.8。

38.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述缓冲剂将液体组合物中的pH维持在pH 7.0或高于pH 7.0。

39.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，进一步包含玻璃形成糖和玻璃形成多元醇中的至少一种。

40.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述玻璃形成糖或多元醇选自：蔗糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇、棉子糖、乳糖醇、山梨醇和乳糖酸、葡萄糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖、乳果糖、麦芽糖、乳糖、异麦芽糖、麦芽糖醇、帕拉金糖醇、水苏糖、松三糖、葡聚糖或它们的组合。

41.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述玻璃形成糖或多元醇包含蔗糖。

42.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述组合物是冻干固体。

43.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述组合物是液体。

44.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述组合物是等渗溶液。

45.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物配制用于施用于人受试者。

46.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物配制在至少0.05 ml和不超过2 ml的单次人剂量中。

47.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物配制在0.5 ml至1.5 ml的单次人剂量中。

48.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述一种或多种纯化的灭活登革热病毒被化学灭活剂、物理灭活剂和辐射灭活剂中的至少一种所灭活。

49.前述权利要求中任一项的灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物，其中所述一种或多种纯化的灭活登革热病毒通过暴露于甲醛、β-丙内酯(BPL)、过氧化氢、紫外线辐射和γ辐射中的至少一种而灭活。

50.灭活登革热病毒的冻干制品，其包含：

至少一种纯化的灭活登革热病毒；

和

泊洛沙姆表面活性剂。

51.权利要求50的冻干制品，进一步包含铝盐。

52.权利要求51的冻干制品，其中所述制品包含氢氧化铝和磷酸铝中的至少一种。

53.权利要求51或52的冻干制品，其中至少一种纯化的灭活登革热病毒吸附到铝盐上。

54.权利要求50-53中任一项的冻干制品，其中所述表面活性剂选自泊洛沙姆、聚乙二醇15羟基硬脂酸酯、聚山梨醇酯、辛苯昔醇、聚多卡醇、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、N-辛基-葡糖苷和它们的组合。

55.权利要求50-54中任一项的冻干制品，其中所述表面活性剂是泊洛沙姆。

56.权利要求55的冻干制品，其中所述泊洛沙姆表面活性剂的分子量为至少4500kD。

57.权利要求55的冻干制品，其中所述泊洛沙姆表面活性剂的分子量为不超过15,000 kD。

58.权利要求50-57中任一项的冻干制品，其中所述表面活性剂以至少0.001% (w/v)的量存在。

59.权利要求50-58中任一项的冻干制品，其中所述表面活性剂以不超过1.0% (wt/v)的量存在。

60.权利要求50-59中任一项的冻干制品，其中所述免疫原性组合物包含多种纯化的灭活登革热病毒。

61.权利要求60的冻干制品，其中所述多种纯化的灭活登革热病毒是不同血清型的。

62.权利要求60或61的冻干制品，其中所述多种纯化的灭活登革热病毒包含引起对DEN-1、DEN-2、DEN-3 和DEN-4中每种的免疫应答的多种病毒。

63.权利要求50-62中任一项的冻干制品，其中所述至少一种纯化的灭活登革热病毒以至少0.1µg和不超过100µg/单次人剂量的量存在。

64.权利要求50-63中任一项的冻干制品，其中所述至少一种纯化的灭活登革热病毒以至少0.25 µg和不超过10 µg/人剂量的量存在。

65.权利要求50-64中任一项的冻干制品，进一步包含至少一种充当缓冲剂的组分。

66.权利要求50-65中任一项的冻干制品，进一步包含玻璃形成糖和玻璃形成多元醇中的至少一种。

67.权利要求66中任一项的冻干制品，其中所述玻璃形成糖或多元醇选自：蔗糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇、棉子糖、乳糖醇、山梨醇和乳糖酸、葡萄糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖、乳果糖、麦芽糖、乳糖、异麦芽糖、麦芽糖醇、帕拉金糖醇、水苏糖、松三糖、葡聚糖或它们的组合。

68.配制灭活登革热病毒的原料制品或免疫原性组合物的方法，其包括：

提供包含缓冲剂和表面活性剂的溶液；和

将所述溶液与一种或多种纯化的灭活登革热病毒混合。

69.权利要求68的方法，其包括在与所述溶液混合之前，将所述一种或多种纯化的灭活登革热病毒吸附到铝盐上。

70.权利要求69的方法，其中所述铝盐包含氢氧化铝和磷酸铝中的至少一种。

71.权利要求68-70中任一项的方法，其包括将多种纯化的灭活登革热病毒中每一种吸附到铝盐上以产生预吸附的单一原料，并且将所述多种预吸附的单一原料与所述溶液混合。

72.权利要求68-71中任一项的方法，其中所述溶液适合用于肠胃外施用。

73.权利要求68-72中任一项的方法，其中所述溶液是等渗的。

74.权利要求68-73中任一项的方法，其中所述溶液进一步包含玻璃形成糖；玻璃形成多元醇；和盐中的一种或多种。

75.权利要求68-74中任一项的方法，其中提供所述溶液包括将以下添加至不含内毒素的水中：

玻璃形成糖或多元醇；

缓冲剂；

盐；和

表面活性剂。

76.权利要求75的方法，其中依次添加每种组分。

77.权利要求68-76中任一项的方法，其中所述缓冲剂包含选自磷酸钠、磷酸钾和三(羟甲基)氨基甲烷的至少一种组分。

78.权利要求68-77中任一项的方法，其中所述缓冲剂选自表1。

79.权利要求68-78中任一项的方法，其中所述缓冲剂将所述原料制品或免疫原性组合物的pH维持在pH 6.4或高于pH 6.4。

80.权利要求68-79中任一项的方法，其中所述缓冲剂将所述原料制品或免疫原性组合物的pH维持在pH 6.8或高于pH 6.8。

81.权利要求68-80中任一项的方法，其中所述缓冲剂将所述原料制品或免疫原性组合物的pH维持在pH 7.0或高于pH 7.0。

82.权利要求68-81中任一项的方法，其中所述表面活性剂适合用于肌内、皮下、经皮或皮内施用。

83.权利要求68-82中任一项的方法，其中所述表面活性剂选自泊洛沙姆、聚乙二醇15羟基硬脂酸酯、聚山梨醇酯、辛苯昔醇、聚多卡醇、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、N-辛基-葡糖苷和它们的组合。

84.权利要求68-83中任一项的方法，其中所述表面活性剂是泊洛沙姆。

85.权利要求68-84中任一项的方法，其中所述泊洛沙姆表面活性剂的分子量为至少4500kD。

86.权利要求50-85中任一项的方法，其中所述泊洛沙姆表面活性剂的分子量为不超过15,000kD。

87.权利要求68-86中任一项的方法，其中所述表面活性剂以至少0.001% (w/v)的量存在于所述原料制品或免疫原性组合物中。

88.权利要求68-87中任一项的方法，其中所述表面活性剂以不超过1.0% (w/v)的量存在于所述原料制品或免疫原性组合物中。

89.权利要求74-86中任一项的方法，其中所述玻璃形成糖或多元醇选自：蔗糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇、棉子糖、乳糖醇、山梨醇和乳糖酸、葡萄糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖、乳果糖、麦芽糖、乳糖、异麦芽糖、麦芽糖醇、帕拉金糖醇、水苏糖、松三糖、葡聚糖或它们的组合。

90.权利要求74-89中任一项的方法，其中所述玻璃形成糖或多元醇包含蔗糖。

91.权利要求74-90中任一项的方法，其中所述盐包含矿物盐。

92.权利要求74-91中任一项的方法，其中所述矿物盐包含氯化钠。

93.权利要求68-92中任一项的方法，其中所述原料制品或免疫原性组合物包含多种纯化的灭活登革热病毒。

94.权利要求68-93中任一项的方法，其中所述多种纯化的灭活登革热病毒是不同血清型的。

95.权利要求68-94中任一项的方法，其中所述多种纯化的灭活登革热病毒包含引起对DEN-1、DEN-2、DEN-3 和DEN-4中每种的免疫应答的多种病毒。

96.权利要求68-95中任一项的方法，其中所述至少一种纯化的灭活登革热病毒是减毒的登革热病毒。

97.权利要求68-96中任一项的方法，其中所述至少一种纯化的灭活登革热病毒是重组登革热病毒。

98.权利要求68-97中任一项的方法，其中至少一种纯化的灭活登革热病毒是嵌合病毒，所述嵌合病毒包含第一种登革热病毒核酸和第二种黄病毒核酸。

99.权利要求98中任一项的方法，其中所述第二种黄病毒选自：第二种登革热核酸、黄热病病毒和日本脑炎病毒。

100.权利要求98或99的方法，其中所述嵌合的纯化灭活登革热病毒包含编码登革热M和登革热E蛋白中的一种或两种的核酸。

101.权利要求68-95中任一项的方法，其中至少一种纯化的灭活登革热病毒是野生型登革热病毒。

102.权利要求68-96中任一项的方法，其中一种或多种纯化的灭活登革热病毒各自以至少0.1µg和不超过100 µg的量存在。

103.权利要求68-102中任一项的方法，其中一种或多种纯化的灭活登革热病毒各自以至少0.25 µg和不超过10 µg的量存在。

104.权利要求68-103中任一项的方法，其中所述纯化的灭活登革热病毒被化学灭活剂、物理灭活剂和辐射灭活剂中的至少一种所灭活。

105.权利要求68-104中任一项的方法，其中所述纯化的灭活登革热病毒通过暴露于甲醛、β-丙内酯(BPL)、过氧化氢、紫外线辐射和γ辐射中的至少一种而灭活。

106.权利要求68-105中任一项的方法，进一步包括冻干包含至少一种纯化的灭活登革热病毒的溶液以产生冻干的组合物。

107.权利要求106的方法，进一步包括在药学可接受的溶液中重悬浮所述冻干组合物。

108.权利要求107的方法，其中所述药学可接受的溶液为注射用水。

109.权利要求107的方法，其中所述药学可接受的溶液包含至少一种佐剂。

110.权利要求109的方法，其中所述佐剂包含铝盐、油和水乳剂、脂多糖、皂苷、和寡核苷酸中的一种或多种。

111.权利要求110的方法，其中所述脂多糖包含3-脱酰基单磷酰脂质A(3D-MPL)。

112.权利要求110或111的方法，其中所述皂苷包含QS21。

113.权利要求110-112中任一项的方法，其中所述寡核苷酸是DNA寡核苷酸，所述DNA寡核苷酸包含至少一个未甲基化的CpG。

114.权利要求110-113中任一项的方法，其中所述佐剂包含脂质体。

115.权利要求68-113中任一项的方法，其中所述免疫原性组合物适合用于施用于人受试者。

116.权利要求68-115中任一项的方法，其中所述免疫原性组合物配制在至少0.05 ml和不超过2 ml的单次剂量中。

117.权利要求68-116中任一项的方法，其中所述免疫原性组合物配制在0.5 ml至1.5 ml的单次剂量中。

118.用于减少纯化的灭活登革热病毒的非特异性吸附和/或聚集中至少一种的方法，包括根据权利要求68-117中任一项的方法配制所述灭活登革热病毒。

119.用于增强抗原性保存的灭活登革热病毒的回收率的方法，包括根据权利要求68-118中任一项的方法配制所述灭活登革热病毒。

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