RU2358763C2 - Композиции иммуноглобулина и способ их получения - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области медицины и касается композиции иммуноглобулина и способа их получения. Сущность изобретения включает стабильную водную фармацевтическую композицию, содержащую в качестве иммуноглобулина моноклональное антитело натализумаб, фосфатный буфер, полисорбат и хлорид натрия, рН 6,0±0,5. Преимущество изобретения заключается в получении стабильной водной формы натализумаба. 7 н. и 24 з.п. ф-лы.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к стабильным, концентрированным композициям белков или антител, таким как натализумаб, у которых сохраняется активность антитела и которые также могут вводиться в небольшом объеме субъекту с состояниями различной тяжести, нуждающемуся в этом.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Композиции антител и белков известны в области техники. Однако получение белковых композиций, таких как композиции антител, которые являются химически и биологически стабильными, чревато сложностями. Получение композиций, которые также не только стабильны, но и могут сохранять небольшой объем (т.е. позволяя инъекцию небольшого объема) даже с повышенной концентрацией белка, такого как антитело, также является проблематичным. Существует необходимость в таких композициях. Например, концентрированные количества белка в фиксированном объеме, который также является стабильным, будут особенно полезными пациентам с меняющейся массой. Введение жидкостей пациентам с меняющейся массой может, например, иметь побочные реакции. Разработке таких композиций препятствуют сами белки или антитела, которые имеют высокую склонность к агрегации и осаждению.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следовательно, несмотря на то, о чем ранее сообщалось в литературе, существует необходимость в улучшенных способах получения композиций белков и/или антител. Также существует необходимость в стабильных композициях с большими концентрациями антитела или белка, у которых сохраняется активность антитела или белка. Также необходимы стабильные композиции концентрированного белка, которые сохраняют фиксированный объем. Заявители описывают в настоящем описании стабильные композиции, которые далее могут быть использованы для получения композиций антител, особенно композиций с высокими концентрациями антител, которые не осаждаются и являются стабильными при хранении при рекомендованной температуре. Высококонцентрированные и стабильные композиции антител существенно помогут врачам в лечении субъектов с меняющейся массой.

Один аспект изобретения обеспечивает стабильную водную фармацевтическую композицию, включающую иммуноглобулин (или другой белок), фосфатный буфер, полисорбат и хлорид натрия. Предпочтительно полисорбатом является полисорбат 80, предпочтительно в количестве от около 0,001% до около 2,0% (мас/об). Наиболее предпочтительно полисорбат присутствует в количестве около 0,02%. В другом варианте воплощения изобретения иммуноглобулин или другой белок присутствует в композиции в количестве от около 0,1 мг/мл до около 200 мг/мл. Предпочтительно композиция забуферена до рН от около 3,0 до около 7,0 и наиболее предпочтительно около 6,0±0,5. Композиция является предпочтительно изотонической. Композиция может дополнительно содержать гистидин. Предпочтительно гистидином является L-гистидин.

В другом аспекте изобретения иммуноглобулином в вышеуказанной композиции является антитело к альфа-4 интегрину, такое как натализумаб или другое гуманизированное антитело или моноклональное антитело. Такое антитело может присутствовать в стандартном количестве или в концентрированном количестве, например, около 15 мг/мл или более. Предпочтительно, натализумаб присутствует в количестве от около 20 мг/мл до около 150 мг/мл. В случаях, когда композиция присутствует в концентрации от около 15 мг/мл или более, такая композиция сохраняется в фиксированной объеме, например около 125 мл.

Следующей целью изобретения является обеспечение способа лечения пациента с состояниями различной тяжести, терапевтическим количеством иммуноглобулина, включающего введение композиции, как описано выше в данном описании, где состояние лечат введением композиции. Следующим аспектом изобретения является то, что состояние является таковым, которое опосредовано альфа-4 интегрином, и в таких условиях иммуноглобулин является таковым, который распознает и связывается с альфа-4-интегрином, таким как натализумаб.

Следующий аспект изобретения обеспечивает композицию, включающую фосфат натрия, полисорбат, белок и NaCl с pH 6,0±0,5, где композиция является стабильной при хранении при 5-8°C в течение длительного периода времени.

Другой аспект изобретения обеспечивает способ получения стабильной композиции, содержащей белок, включающей смешивание фосфата натрия, хлорида натрия, полисорбата и белка и доведение рН смеси фосфорной кислотой до около pH 6,0±0,5.

Белок может быть лиофилизирован в композиции по настоящему изобретению. Полисорбатом является предпочтительно полисорбат 80k, присутствующий в количестве около 0,02% (мас/об), и белком является предпочтительно натализумаб. Композиция, кроме того, может включать гистидин.

Предпочтительно, белок лиофилизирован в растворе, содержащем 5 мМ гистидина, 20 мг/мл сахарозы и 0,02% полисорбата 80 при pH 6, и белком является натализумаб в концентрации 20 мг/мл.

Следующей задачей изобретения является обеспечение изделия, включающего контейнер, содержащий стабильную композицию, описанную выше и в этом документе.

Другой аспект изобретения обеспечивает способ лечения пациента с состояниями различной тяжести, включающий одновременное или последовательное введение пациенту терапевтически эффективной комбинации композиции, описанной выше и в этом документе, и соединения или лечения, эффективного в отношении состояния.

Следующей задачей изобретения является обеспечение применения любой из стабильных композиций, описанных в данном описании, для получения лекарственного препарата для лечения состояния, где лекарственный препарат является эффективным для лечения указанного состояния. Этот лекарственный препарат может, кроме того, включать второе соединение или терапию для лечения состояния.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ВОПЛОЩЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Определения

Под названием «белок» понимают включая, но не ограничиваясь, иммуноглобулины, ферменты, рецепторы и их фрагменты. Хотя обсуждение композиции обеспечено преимущественно в отношении антитела или иммуноглобулина, другие белки рассматриваются как взаимозаменяемые в описанных композициях.

Под названием «иммуноглобулин» понимают включая, но не ограничиваясь, антитела или фрагменты антитела (такие как scFv, Fab, Fc, F(ab')₂) и другие, созданные методами генной инженерии, части антител. В зависимости от аминокислотной последовательности постоянного домена их тяжелых цепей иммуноглобулины могут быть отнесены к различным классам. Существуют пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Некоторые из них могут быть далее поделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, и IgG4; IgA1 и IgA2. Постоянные домены тяжелых цепей, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются альфа (α), дельта (δ), эпсилон (ε), гамма (γ) и мю (µ), соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. Предпочтительно, иммуноглобулин распознает и связывается с альфа-4 интегрином.

Термин «антитело» используется в широком смысле и, в частности, охватывает моноклональные антитела (включая антитела агонисты и антагонисты), композиции антител с политипной специфичностью и фрагменты антител (например, Fab, F(ab')2, scFv и Fv), при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность. «Антитело» включает поликлональные антитела, моноклональные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, приматизированные® антитела и других антитела, полученные с помощью генно-инженерных технологий.

Термин «моноклональное антитело», как используется в данном описании, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, направленными в отношении одного антигенного участка. Более того, в противоположность препаратам обычных (поликлональных) антител, которые обычно включают различные антитела, направленные относительно различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено относительно отдельной детерминанты на антигене. В добавление к их специфичности моноклональные антитела являются предпочтительными в том, что они синтезируются системами экспрессии клеток млекопитающих или трансгенными способами, не загрязняясь другими иммуноглобулинами. Например, моноклональные антитела для использования в соответствии с настоящим изобретением могут экспрессироваться у коз, как описано у Behboodi, et al. (2002) Transgenic cloned goats and the production of therapeutic proteins. In Principles of Cloning. Elsevier Science (USA); и Meade et al. (1999). Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animals in Gene expression systems: using nature for the art of expression. J. M. Fernandez и J. P. Hoeffler ed., Academic Press. Определение «моноклональный» указывает характер антитела, как полученного из преимущественно гомогенной популяции антител и не должно истолковываться как требующий продукции антитела любым определенным способом. Например, моноклональные антитела для использования в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены способами, описанными в Shepherd et al, Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (Oxford University Press, 2000).

Термин «моноклональные антитела» также включает «химерные» антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, полученных от определенного вида или принадлежащих к определенному классу или подклассу антител, тогда как остальная часть цепи(ей) является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, полученных от других видов или принадлежащим к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность. Например, способность связываться с альфа-4 интегрином. «Моноклональные антитела» также могут быть выделены из библиотек антител фагов с использованием методик, описанных, например, в Clackson et al, 1991 Nature 352: 624-628 и Marks et al, 1991 J. Mol. Bioh, 222: 581-597. «Гуманизированные» формы нечеловеческих (например, мышиных, кроличьих, бычьих, лошадиных, свиных и подобных) антител представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антигенсвязывающие последовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. В большей части гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитела реципиента), в которых остатки от участка, определяющего комплиментарность (CDR) реципиента, заменены остатками из CDR нечеловеческих видов (донорские антитела), таких как мышь, крыса или кролик, имеющих желаемую специфичность, аффинность и емкость. В некоторых случаях остатки каркаса Fv человеческого иммуноглобулина замещены соответствующими нечеловеческими остатками. Более того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не обнаруживаются ни в антителе реципиента, ни во вносимом CDR или каркасной последовательности. Такие модификации делают для дальнейшего повышения качества и оптимизации действия антитела. В общем гуманизированные антитела будут включать по существу все из по меньшей мере, одного и обычно двух, изменяющихся доменов, в которых все или по существу все из участков CDR соответствуют таковым нечеловеческого иммуноглобулина и все или по существу все участки FR являются таковыми обобщающей последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело оптимально также будет включать по меньшей мере часть константного участка иммуноглобулина (Fc), обычно человеческого иммуноглобулина.

Выражение «линейные антитела» также включено в общий термин «антитело» и является парой тандема сегментов Fd (VH-CH1-VH-CH1), которые образуют пару антигенсвязывающих участков. Линейные антитела могут быть биспецифическими или моноспецифическими.

«Вариантное антитело» (также включенное в общий термин «антитело») представляет собой молекулу, которая отличается в аминокислотной последовательности от аминокислотной последовательности «родительского» антитела посредством добавления, удаления и/или замещения одного или более аминокислотных остатка(ов) в последовательности родительского антитела. В предпочтительном варианте воплощения изобретения вариант включает одно или более замещения(й) аминокислот в одном или более гипервариабельном участке(ах) родительского антитела. Например, вариант может включать, по меньшей мере, одно замещение, например, от около одного до около десяти, и предпочтительно от около двух до около пяти, в одном или более гипервариабельных участках родительского антитела. Обычно вариант будет иметь аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 75%-ную идентичность аминокислотной последовательности с последовательностями вариабельных доменов тяжелых или легких цепей родительского антитела, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%-ную, более предпочтительно, по меньшей мере, 85%-ную, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%-ную, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95%-ную. Идентичность или гомология в отношении этой последовательности определяется в данном документе как процентное отношение аминокислотных остатков последовательности-кандидата, которое идентично остаткам родительского антитела, после распрямления последовательностей и вставки промежутков, если необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательности. Ни одно из N-концевых, C-концевых или внутренних удлинений, удалений или вставок в последовательность антитела не должно толковаться как влияющее на идентичность или гомологию последовательности.

Для анализа таких свойств необходимо сравнить Fab форму варианта с Fab формой родительского антитела или форму антитела полной длины с формой полной длины родительского антитела, например, так как было обнаружено, что вид антитела влияет на его активность в исследованиях биологической активности, описанных в этом описании. Интересующим вариантным антителом является таковое, которое проявляет, по меньшей мере, около 10-кратное, предпочтительно, по меньшей мере, 20-кратное, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, около 50-кратное увеличение биологической активности по сравнению с родительским антителом. «Родительским» является таковое, которое закодировано аминокислотной последовательностью, используемой для получения варианта. Предпочтительно, родительское антитело имеет участок человеческой сети и имеет постоянный участок(ки) человеческого антитела. Например, родительским антителом может быть гуманизированное или человеческое антитело.

«Выделенное антитело» представляет собой такое, которое было идентифицировано и выделено и/или извлечено из компонента его естественной окружающей среды. Загрязняющими компонентами его естественной окружающей среды являются вещества, которые вмешиваются в диагностическое или лечебное применение антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворы. В предпочтительных вариантах воплощения изобретения антитело очищено (1) до более чем 95% по массе антитела, что определяют методом Лоури, и наиболее предпочтительно более чем до 99% по массе, (2) до степени, достаточной для получения, по меньшей мере, 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности при использовании секвенатора с выдавливающей чашей, или (3) до гомогенности по SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием голубого Кумасси или, предпочтительно, серебряного красителя. Выделенные антитела включают антитела in situ в рекомбинантной клетке, поскольку, по меньшей мере, один компонент естественной окружающей среды антитела не будет присутствовать. Обычно, однако, выделенное антитело получают, по меньшей мере, одной стадией очистки.

«Фрагменты антитела» включают часть интактного антитела, обычно антигенсвязывающий или вариабельный участок интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2, и Fv; диатела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител; и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. «Одноцепочечные Fv» или фрагменты антител «sFv» включают домены антител VH и VL, где эти домены присутствуют в одной полипептидной цепочке. Обычно полипептид Fv, кроме того, включает полипептидное связующее звено между доменами VH и VH, которое позволяет sFv образовывать желаемую структуру для связывания антигена.

Термин «диатела» относится к небольшим фрагментам антител с двумя антигенспецифическими участками, такие фрагменты включают вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в той же самой полипептидной цепочке (VH-VL). При использовании связующего звена, которое является слишком коротким, чтобы позволить образовать пару между двумя доменами на одной цепи, домены вынуждены образовывать пару с комплиментарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих участка. Путь введения антител находится в соответствии с известными методами и хорошо известен и может включать, например, инъекцию или инфузию внутривенным, интраперитонеальным, внутримозговым, внутримышечным, внутриглазным, внутриартериальным путями или введением в место повреждения, или посредством систем с замедленным высвобождением. Антитела могут вводиться непрерывно инфузией или болюсной инъекцией. Терапевтические композиции антител обычно помещают в контейнер, имеющий стерильный порт для эксплуатации, например пакет или флакон с внутривенным раствором, имеющим заглушку, прокалываемую подкожной инъекционной иглой. «Фармацевтически приемлемые» эксципиенты (например, растворители, добавки) представляют собой таковые, которые могут приемлемо вводиться субъекту млекопитающему для получения эффективной дозы применяемого активного ингредиента. «Стабильной» композицией является таковая, в которой белок преимущественно сохраняет свою физическую стабильность, и/или химическую стабильность, и/или биологическую активность при хранении. Под «стабильной» также обозначают композицию, которая проявляет небольшие или не проявляет признаков нестабильности, включая агрегацию и/или дезамидирование. Например, композиции, обеспечиваемые настоящим изобретением, могут оставаться стабильными в течение, по меньшей мере, двух лет при хранении, как указано, при температуре 5-8°C.

Различные аналитические методики для измерения стабильности белка доступны в области техники и описаны в Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301 (Vincent Lee ed., New York, N.Y., 1991) и Jones, 1993 Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90, например. Стабильность может быть измерена при выбранной температуре в течение выбранного периода времени, как показано представленными примерами. Хранение стабильных композиций, если это предпочтительно, допустимо в течение, по меньшей мере, 6 месяцев, более предпочтительно 12 месяцев, более предпочтительно 12-18 месяцев и более предпочтительно в течение 2 лет или более.

Белок, такой как антитело или его фрагмент, «сохраняет свою физическую стабильность» в фармацевтической композиции, если он не проявляет признаков агрегации, осаждения, дезамидирования и/или разложения при визуальной оценке цвета и/или прозрачности, или оценкой по светорассеянию УФ или хроматографией с вытеснением по размеру.

Белок «сохраняет свою химическую стабильность» в фармацевтической композиции, если химическая стабильность в заданное время является таковой, что белок расценивается как все еще сохраняющий свою биологическую активность. Химическая активность может быть оценена определением и количественной оценкой химически измененных форм белка. Химическое изменение может включать модификации размера (например, усечение), которое может быть оценено с использованием хроматографии с вытеснением по размеру, SDS-PAGE и/или масс-спектрометрией с ионизацией лазерной десорбцией в матрице с времяпролетным масс-анализом (MALDI/TOF MS), например. Другие типы химических изменений включают изменения заряда (например, появляющиеся как результат дезамидирования), которые могут быть оценены, например, ион-обменной хроматографией. Антитело «сохраняет свою биологическую активность» в фармацевтической композиции, если биологическая активность антитела в заданное время находится в пределах 10% (с ошибками анализа) биологической активности, проявляемой в момент времени, когда фармацевтическую композицию получали, что определяли в анализе связывания антигена, например.

Под «изотоническим» подразумевают, что интересующая композиция имеет преимущественно такое же осмотическое давление, как человеческая кровь. Изотонические композиции обычно имеют осмотическое давление от около 250 до 350 мОсм. Изотоничность может быть измерена с использованием осмометра типа давления пара или замораживания льда, например.

Как используется в данном описании, «буфер» относится к буферному раствору, который противодействует изменениям рН действием его кислотно-основных связанных компонентов. Буфер по настоящему изобретению имеет рН в диапазоне от около 3,0 до около 7,5; предпочтительно от около pH 4,0 до около 7,0; более предпочтительно от около pH 5,0 до около 6,5; и наиболее предпочтительно имеет pH около 6,0±0,5. pH любого значения между вышеуказанными диапазонами также рассматривается.

В фармакологическом смысле, в контексте настоящего изобретения, «терапевтически эффективное количество» антитела относится к количеству, эффективному для предотвращения или лечения расстройства, для лечения которого антитело является эффективным. «Расстройством» является любое состояние, на которое окажет благотворное влияние лечение антителом или белком. Оно включает острые или хронические расстройства или заболевания, включая такие патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающее к рассматриваемому расстройству.

«Лечение» относится и к терапевтическому лечению, и к профилактическим или превентивным мерам. Нуждающиеся в лечении включают таковых, которые уже имеют расстройство, а также таковых, у которых расстройство предотвращают.

«Консервант» представляет собой соединение, которое может быть включено в композицию, чтобы существенно уменьшать в ней бактериальное действие, таким образом способствуя получению композиции для множественного использования, например. Примеры потенциальных консервантов включают хлорид октадецилдиметилбензинаммония, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония (смесь хлоридов алкилбензилдиметиламмония, в которых алкильные группы являются длинноцепочечными соединениями), и хлорид бензэтония. Другие типы консервантов включают ароматические спирты, такие как фенол, бутиловый и бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен, катехол, резорцинол, циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол.

Под «пациентом» или «субъектом» подразумевают включение любого млекопитающего. «Млекопитающее», которое подвергается лечению, относится к любому животному, классифицированному как млекопитающее, включая, но не ограничиваясь, людей, домашних и сельскохозяйственных животных и животных из зоопарка, спортивных и комнатных, таких как собаки, лошади, кошки, коровы и подобные. Предпочтительно, млекопитающим является человек.

Под «Antegren®» обозначают включение антитела, также известного как AN100226 (кодовый номер антитела) или натализумаб (название USAN). Натализумаб представляет собой рекомбинантное, гуманизированное антитело к альфа-4 интегрину. Предпочтительно заболеванием или состоянием, подвергаемым лечению у млекопитающего, является таковое, когда вводят терапевтически эффективную дозу натализумаба.

«Стабильной» обозначают композицию, которая проявляется мало или не проявляет вообще признаков нестабильности, включая агрегацию и/или дезамидирование. Кроме того, «стабильная» также может относится к композиции, которая не проявляет каких-либо признаков нестабильности в течение более чем или ровно двух лет, при хранении, как указано.

2. Общее описание

В описании ниже и в следующих примерах описаны композиции для стабильных композиций антител. Определенные описанные стабильные композиции имеют высокие концентрации антител, но сохраняют фиксированный объем, где антитела в таких композициях являются стабильными и антитела не осаждаются из раствора или не агрегируют. Белки, иные чем антитела, также рассматриваются для композиций с высокой концентрацией.

Антитела обычно вводятся субъекту (например, человеку) в концентрации от около 0,01 мг/мл до около 200 мг/мл. Более типично, антитела варьируются в концентрации от около 0,1 мг/мл до около 150 мг/мл. Однако существуют обстоятельства, при которых более высокие концентрации необходимо вводить пациенту, например, от около 15 мг/мл до около 200 мг/мл, более предпочтительно от около 15 мг/мл до 150 мг/мл, более предпочтительно от около 20 мг/мл до около 50 мг/мл, и наиболее предпочтительно от около 20 мг/мл и любое целое значение между этими показателями.

Композиции антител могут вводиться млекопитающему, нуждающемуся в лечении белком, в соответствии с известными методами. Такие методы включают, но не ограничиваются, внутривенное введение в виде болюса или непрерывной инфузии в течение периода времени, внутримышечного, интраперитонеального, внутриспинномозгового, подкожного, внутрисуставного, интрасиновиального, интратекального, перорального, местного или ингаляционного путей. В предпочтительных вариантах воплощения изобретения композицию антитела вводят млекопитающему внутривенным введением.

Соответствующая доза белка будет зависеть, например, от состояния, подвергаемого лечению, тяжести и течения состояния, того, вводится ли белок с превентивной или терапевтической целью, предшествующей терапии, клинической истории пациента и ответа на белок, типа используемого белка и выбора лечащего врача. Белок соответственно вводят пациенту в один момент или в течение ряда введений и может вводиться пациенту в любое время после постановки диагноза. Белок может вводиться в виде единственного лечения или в сочетании с другими лекарственными средствами или лечением, применимым в лечении рассматриваемого состояния. Как используется в данном описании, два (или более) агента можно вводить в комбинации, когда два агента вводят одновременно или вводят независимо таким образом, что агенты буду действовать одновременно.

В применении способов по настоящему изобретению соединения по настоящему изобретению могут использоваться отдельно, или в комбинации, или в комбинации с другими терапевтическими агентами. В определенных предпочтительных вариантах воплощения соединения по настоящему изобретению могут вводиться совместно с другими соединениями, обычно предписываемыми для таких состояний в соответствии с общепринятой медицинской практикой. Например, композиции по настоящему изобретению могут вводиться в комбинации с другими терапевтическими агентами или физическими методами лечения для лечения ревматоидного артрита, рассеянного склероза и болезни Крона.

2.1. Способ получения композиции антител

Способ может быть изменен, как известно специалисту в области техники, но обычно следует методике, такой как следующая. Получали ампулу из банка рабочих клеток, которая содержала клетки, которые производили интересующие антитело или белок. Получали инокулят. Культивировали или ферментировали клетки с дополнительной подкормкой, как необходимо. Собирали/очищали клетки центрифугированием и/или фильтрацией. Это можно было сделать, например, концентрированием клеток в 10 раз через спирально уложенный фильтр. Фильтровали через 0,2 мкм промежуточный фильтр, после фильтрации следовала очистка с помощью Protein A Sepharose Fast Flow® (т.е. афинная хроматография) и обратная элюция. Композицию, содержащую антитело, затем обрабатывали при pH 3,6-3,7. Далее смесь подвергали вирусной фильтрации, затем выполняли стадию концентрирования/диафильтрации. Далее композиция могла быть очищена с помощью DEAE Sepharose Fast Flow® (анионообмен). Эту стадию можно повторить несколько раз. С этого момента композицию далее концентрировали стадией очистки с использованием системы Sephacryl S300HR® (т.е. гель-хроматография), где используемым буфером является фосфат/NaCl. Композицию, содержащую антитела, можно было далее концентрировать для получения композиций с высокой концентрацией (например, 20 мг/мл или более), если желательно. Композицию, содержащую антитела, затем далее буферировали и концентрацию доводили добавлением 0,02% (мас./об.) полисорбата 80. Эту композицию затем подвергали конечной фильтрации с использованием фильтра 0,2 мкм, и ее можно было распределить на этой стадии в 100 мл-10 л полипропиленовые бутыли. Таким образом полученные антитела или иммуноглобулины затем могли быть подвергнуты контролю качества (КК) и реализованы с гарантией качества (ГК). Вышеуказанное может быт сделано, например, для натализумаба, как схематически представлено ниже:

200 л материала (5,0 мг/мл)	2000 л материала (5,0, 20 мг/мл)
Ампула из банка рабочих клеток	Ампула из банка рабочих клеток
Получение инокулята	Получение инокулята
Ферментирование	Ферментирование (дополнительная питательная среда)
Сбор/очистка фильтрацией: 10х концентрирование через спирально уложенный фильтр	Сбор/очистка центрифугированием и фильтрацией: 10х концентрирование через спирально уложенный фильтр
Фильтрация 0,2 мкм промежуточного продукта	Фильтрация 0,2 мкм промежуточного продукта
Очистка с помощью Protein A Sepharose Fast Flow® (афинная хроматография) (прямая элюция)	Очистка с помощью Protein A Sepharose Fast Flow® (афинная хроматография) (обратная элюция)
Обработка рН 3,7-3,8	Обработка рН 3,6-3,7
--	Вирусная фильтрация
Концентрирование/диафильтрация	Концентрирование/диафильтрация
Очистка с помощью DEAE Sepharose Fast Flow® (анионобменная хроматография) (одиночный цикл)	Очистка с помощью DEAE Sepharose Fast Flow® (анионобменная хроматография) (множественные циклы)
Концентрирование	Концентрирование
Очистка с помощью Sephacryl S300HR® (гель-хроматография) (текущий буфер: гистидин/NaCl)	Очистка с помощью Sephacryl S300HR® (гель-хроматография) (текущий буфер: фосфат/NaCl)
--	(Дополнительное концентрирование до 20 мг/мл)
Буфер и доведение концентрации фосфатом/NaCl, 0,02% (мас./об.) полисорбата 80	Буфер и доведение концентрации (добавление 0,02% (мас./об.) полисорбата 80
Окончательная фильтрация 0,2 мкм и распределение (100 мл-1 л полипропиленовые бутыли)	Окончательная фильтрация 0,2 мкм и распределение (100 мл-10 л полипропиленовые бутыли)
Выполнение КК и реализация с ГК очищенной партии AN100226	Выполнение КК и реализация с ГК очищенной партии AN100226

2.2. Композиция антител

В одном аспекте изобретения иммуноглобулин рецептируют в концентрациях около 1,7, 5,0, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0, 30,0, 40,0 или 50,0 мг/мл в 10 мМ фосфата натрия, 140 мМ NaCl (pH 6,0±0,5) и 0,02% полисорбата 80. Если необходимо, уровень pH доводят до 6,0±0,5 фосфорной кислотой.

Один пример различных композиций показан ниже.

Количественная композиция: композиция фосфатного буфера

Компонент	Функция	Единица композиции (на мл) 1,7 мг/мл	Единица композиции (на мл) 5,0 мг/мл	Единица композиции (на мл) 20 мг/мл
Активный ингредиент:
Гуманизированное моноклональное антитело анти-α4-интегрин	Активный	1,7 мг	5,0 мг	20 мг
Другие ингредиенты:
Фосфат натрия, USP	Буфер и тоничность	1,4 мг	1,4 мг	1,4 мг
Хлорид натрия, USP	Буфер и тоничность	8,2 мг	8,2 мг	8,2 мг
Фосфорная кислота, NF	Доведение pH до 6,0±0,5	QS	QS	QS
Полисорбат 80, NF	Ингибирует агрегацию белка	0,2 мг	0,2 мг	0,2 мг
Вода для инъекций, USP	Разбавитель	QS до 1 мл	QS до 1 мл	QS до 1 мл

Любая из вышеуказанных композиций является оптимально разлитой в асептический флакон. Такими флаконами могут быть, например, нейтральные стеклянные флаконы типа I EP (например, 5,0 или 20 мл укупориваемые флаконы) с пробками из серого бутилкаучука Helvoet Pharma V9145/FM 157/1 с алюминиевыми колпачками. Однако, другие подходящие асептические флаконы также рассматриваются. Например, композиции могут быть разлиты в бутыли как указано ниже:

БУТИЛИРОВАНИЕ
Составление смеси буфера фосфата/хлорида натрия/полисорбата 80, если необходимо
Стерилизация флаконов, пробок и производственного оборудования
Разведение буфером фосфат/хлорид натрия/полисорбат 80 антитела до 1,7 или 50 мг/мл, как требуется
Стерильная фильтрация
Асептическое заполнение и укупоривание флаконов Герметизация
Тестирование для реализации

Точнее, натализумаб полученный, например, методикой, обсуждаемой выше, может быть бутилирован, как указано ниже. Лекарственный продукт натализумаб 200 л и 2000 л может быть заполнен на полностью автоматизированной заполняющей линии, снабженной каналом для мытья, стерилизации и апирогенизации флаконов. Пробки, герметизирующий слой и заполняющее оборудование промывают и стерилизуют перед использованием. Этот способ позволяет проводить крупномасштабные обрабатывающие операции, согласующиеся с объемами, получаемыми при ферментировании 2000 л.

При необходимости композиционный буфер, около 10 мМ фосфата, около 140 мМ NaCl, pH 6,0±0,5, около 0,02% полисорбата 80, может быть введен в смесь набора класса 10000 и использоваться для разведения партии лекарственного продукта до конечной концентрации. Заданные значения концентрации, рН и плотности в ходе процесса предпочтительно достигают до фильтрации.

Натализумаб или другой иммуноглобулин в форме композиции может быть стерильно профильтрован через 0,2 мкм фильтр Millipak в уравнительный бак из нержавеющей стали, стерильный внутри. Заполнение, закупоривание пробкой и герметизация натализумаба являются полностью автоматизированными. Собирают образцы в ходе процесса для контроля стерильности партии; исследования заполненной массы и свободного пространства проверяют на всем протяжении процедуры заполнения. Заполненный лекарственный продукт хранят при охлаждении до около 2-8°C.

Заполнение проводят внутри лицензированных стерильных боксов класса 100. Заполняющая линия утверждена для обеспечения полного объема в рамках ожидаемых допустимых отклонений для объемов заполнения 5,0 мл и 20 мл. Всесторонний контроль окружающей среды проводят на всем протяжении процедуры заполнения и оценивают для подтверждения непрерывного соответствия этому стандарту. Контроль среды боксов производят ежеквартально для поддержания асептических процедур заполнения.

Альтернативно, 200 л полученного вещества лекарственного средства может быть бутилировано в соответствии со следующим примером. Флаконы, заполняющие иглы, фильтрующее устройство и трубы получали и стерилизовали перед использованием. Пробки могут быть получены от поставщика. Затем пробки стерилизовали перед заполнением.

Лекарственный продукт натализумаба или другого белка фасовали на полуавтоматической линии заполнения из приготовленной партии компонентов, с автоматизированным заполнением, немедленным закупориванием и последующей процедурой герметизации. Эта процедура является соответствующей для операций с партией малого объема.

Окончательный объем раствора затем стерильно фильтровали через 0,2 мк фильтр Millipak в стерильный стеклянный приемный сосуд в условиях окружающей среды класса 100. Текущая проверка и оценка в ходе процесса гарантировали, что допустимое отклонение наполнения остается в пределах ±2%. Флаконы закупоривали и герметизировали немедленно. Заполненный лекарственный продукт предпочтительно хранили охлажденным при 2-8°C.

Стеклянный приемный сосуд может быть представлен любым количеством сосудов, но может, например, быть 5,0 или 20 мл нейтральным стеклянным заполняемым флаконом типа I (EP), например, Epsom Glass или AMILCO, или 5,0 мл или 20 мл боросиликатным стеклянным заполняемым флаконом USP типа I, например, Kimble или Wheaton. Для таких флаконов могут быть использованы любые подходящие средства укупорки. Укупорочные средства флаконов включают, но не ограничены, 13 мм пробку из серого бутилкаучука Helvoet Pharma V9145/FM 157/1 или 13 мм и 20 мм пробку из серого бутилкаучука Helvoet Pharma V9145/FM 157/1 или 13 мм или 20 мм пробку из серого бутилкаучука West 4432/50. Закупоренные каучуком бутыли затем герметизировали, обычно используя алюминиевый обжимной колпачок, такой как производимый West.

Хотя настоящее изобретение описано детально со ссылками на примеры ниже, понятно, что различные модификации могут быть сделаны без отклонения от общей тенденции изобретения, и они легко понятны специалисту в области техники.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Выбор полисорбата 80

Обычным способом введения натализумаба является внутривенный. Для внутривенного введения требуется, чтобы окончательная композиция была изотонической. Исходно выбрали композицию AN 100226 (натализумаб), 5 мг/мл в 50 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCL pH 6,0 (Композиция #1). Во время исследования II фазы наблюдали осаждение белка антитела во время разведения и введения натализумаба в клинический дозирующий прибор. Полисорбат 80 вводили в композицию (Композиция #2) для устранения наблюдаемого осаждения белка. Предпочтительно полисорбат для использования в настоящем изобретении содержал мало перекиси, т.е. полисорбат от Sigma, номер продукта P6479, номер серии 071K7283.

Двумя факторами, о которых было сказано, что они ускоряют осаждение антител AN100226, являются присутствие следовых уровней силиконового масла и денатурация на границе воздух-жидкость. Силиконовое масло попадает в продукт при использовании стандартных смазанных полипропиленовых шприцев, снабженных силицированными каучуковыми пробками. Введение силиконового масла является достаточным для того, чтобы вызвать явное осаждение антител в композиции #1 при легком перемешивании и хранении при комнатной температуре. Агрегация, дезамидирование и последующее осаждение, вызываемые денатурацией на границе раздела воздух-жидкость, становятся более явно проблематичными, когда лекарственный препарат отправляют в другие клинические объекты. Обе причины осаждения белка устраняли добавлением полисорбата 80 в концентрации 0,02% (мас./об.).

Композиция #2 показала сравнимую стабильность с композицией гистидин/NaCl (композиция #1) во всех исследованиях характеристик белка, обеспечив при этом увеличенную стабильность при транспортировке и переноске лекарственного продукта в клинических условиях.

Добавление полисорбата 80 к композиции также преодолевает проблему осаждения или агрегации антител при получении композиций с более высоким содержанием белка. Начальные работы были сосредоточены на агрегации, индуцированной перемешиванием при высоких концентрациях белка, включая 50 мг/мл. Подвергая материал перемешиванию с использованием смесителя типа вортекс, определяли агрегированные образцы посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии с вытеснением по размеру (SEC-ВЭЖХ). Такая модель показала, что полисорбат 80 является эффективным ингибитором агрегации, тогда как сахароза и другие буферные компоненты имели небольшой полезный эффект.

Эффективность добавления 0,02% (мас./об.) полисорбата 80 в предотвращении осаждения, индуцированного агрегацией, при концентрации белка 5 мг/мл оценивали после добавления 10 мкл 10% раствора полисорбата 80 во флаконы натализумаба (серия AN100226-0003). Флаконы встряхивали на боку вместе с несколькими флаконами натализумаба в композиции #1 при 150 об/мин в горизонтальной плоскости. После 3 часов такой обработки при комнатной температуре флаконы композиции #1 содержали большое количество частиц и казались мутными, тогда как флаконы с 0,02% (мас./об.) полисорбата 80 оставались прозрачными и свободными от частиц.

Предположили, что наблюдаемая агрегация может быть вызвана границей раздела воздух-поверхность, так как флаконы, полностью заполненные AN100226 в отсутствие полисорбата 80, встряхивали в течение более продолжительных периодов времени без индукции дополнительного образования частиц.

Проводили оценку способности 0,02% (мас./об.) полисорбата 80 ингибировать осаждение белка, которому способствуют следовые количества силикона. Флакон натализумаба (серия AN100226-0003) доводили до 0,02% (мас./об.) полисорбата 80 и втягивали в коммерчески доступный, смазанный, 60 мл полипропиленовый шприц. Веществу позволяли постоять в течение нескольких часов при комнатной температуре. Визуальная оценка подтвердила, что не появляется осаждения. Затем вещество фильтровали через 0,2 мкм фильтр в 5-мл флакон, оценивали и обнаруживали практически свободным от частиц в течение нескольких дней, тогда как флаконы, обработанные подобным образом в отсутствие полисорбата 80 (Композиция #1), содержали большое количество частиц.

Пример 2

Выбор фосфатного буфера

При исследовании высвобождения гистидинового плацебо (содержащего 0,02% мас./об. полисорбата 80) были определены новые следовые примеси. Эти примеси происходили из разложения полисорбата 80, очевидно, посредством реакции окисления, включающей ионы металла и гистидин. Для активного лекарственного продукта натализумаба такие следовые примеси определяли только после хранения при повышенной температуре (например, 25 и 40°C). Следовательно, было принято решение модифицировать плацебо и использовать фосфат для замещения гистидина в буфере. Партия гистидина, используемая в продукте плацебо, была иной, чем используемая для активного лекарственного продукта натализумаба серий AN100226-004 и AN100226-005. Вклад источника гистидина в разложение полисорбата 80 обсуждается более детально ниже.

Во время исследования плацебо следовые примеси были обнаружены в плацебо гистидин/NaCl/0,02% (мас./об.) полисорбат 80 (Композиция #2). Такие примеси определяли по их поглощению в низких длинах волн ультрафиолетового спектра. Определяли профили поглощения от 200 до 400 нм для плацебо, хранящегося при 5, 25, и 40°C в течение одного месяца. Полученные данные показывают, что примеси повышаются как функция температуры.

Способ ВЭЖХ с вытеснением по размеру, используемый для наблюдения за агрегацией антител, модифицировали для повышения чувствительности для определения следовых примесей путем повышения нагрузки колонки в 5 раз до 100 мкл, и образец наносили неразведенным, а не разведенным в 10 раз. Кроме того, поглощение отслеживали при 260 нм для отражения максимума поглощения примесей. Способ обеспечивает средство для оценки присутствия таких следовых примесей и в плацебо, и в продукте, так как антитела появляются гораздо раньше в профиле элюции.

Окончательные лекарственные продукты плацебо и натализумаба, рецептированные в композиции #1 и #2, анализировали методом SEC-ВЭЖХ, описанным выше. Анализ плацебо в композиции #1, снабженной полисорбатом 80 до 0,02% (мас./об.), проводили непосредственно перед хроматографией. Он показал поглощение УФ полисорбатом 80, гистидином и солью в отсутствие следовых примесей. Широкий пик на 16 минутах ассоциирован с полисорбатом, тогда как пики на приблизительно 26-27 минутах обусловлены гистидином и солью. Плацебо гистидин/NaCl/0,02% (мас./об.) полисорбат 80 (Композиция #2) при хранении при 5°C в течение двух месяцев показало значительное увеличение поздних пиков элюции, которые подразумевали вклад полисорбата 80 в продукцию таких примесей. Кроме того, элюирование на 16 минутах пропадало, показывая, что полисорбат 80 разрушался.

AN 100226, хранящийся в виде партии лекарственного вещества в течение приблизительно 5 месяцев при 5°C в виде композиции #1, анализировали после добавления полисорбата 80 до 0,02% (мас./об.) сразу перед хроматографией. Антитела элюировали на 16-18 минутах с использованием этих условий избыточной нагрузки. Остаток профиля походил на плацебо с пиком полисорбата 80. Двухмесячную стабильность образцов партии натализумаба #AN100226-0004 также анализировали таким способом. Профиль элюции для образца натализумаба 5°C показал отсутствие любых дополнительных пиков, и сравнимые уровни пиков гистидина/соли на 26-27 минутах. Следовые примеси определяли через два месяца для образца 25°C, и повышенные уровни присутствовали для двухмесячного образца 40°C. Таким образом, такие загрязнения не определяли в клинических поставках, которые хранили при 5°C. Появление этих следовых загрязнений проявляется гораздо более быстро в плацебо, чем в натализумабе.

Во избежание образования таких примесей в плацебо гистидин заменяли неорганическими буферными компонентами в композиции плацебо. Продукт плацебо для клинических исследований представляет собой стерильный изотонический фосфатный буферный раствор с 0,02% (мас./об.) полисорбата 80 при pH 6,0. Было продемонстрировано, что замещение гистидина фосфатом значительно уменьшает скорость разложения полисорбата 80. 100 мкл композиции плацебо фосфат/NaCl/0,02% (мас./об.) полисорбат 80 анализировали ВЭЖХ с вытеснением по размеру, контролируя при 260 нм в момент времени ноль и через 3 дня при 60°C. Небольшие изменения наблюдали в профиле SEC-ВЭЖХ (ВЭЖХ с вытеснением по размеру) как результат такой инкубации. Профиль SEC-ВЭЖХ для композиции гистидин/NaCl/0,02% (мас./об.) полисорбат 80 спустя только два дня при 60°C показал значительный уровень следовых примесей, относящихся к разложению полисорбата 80. Полученные данные демонстрируют, что разложение полисорбата 80 значительно затрудняется замещением гистидина фосфатом в композиции плацебо.

Пример 3

Композиция натализумаба со смешанными полисорбатом 80 и гистидином

Считают, что механизм, посредством которого эти следовые примеси образуются, происходит посредством окисления полисорбата, катализируемого металлом (см. Donbrow et al., 1978 J. Pharmaceutical Sciences, 67(12): 28). Donbrow описывает, что автоокисление при хранении появляется у различных типов полисорбата (например, полисорбат 20). Свет, температура и ионы металлов также влияют на автоокисление. Donbrow et al. (1978). Было подтверждено, что для этой реакции, для протекания со значительной скоростью, требуются и гистидин, и полисорбат 80. Ajinomoto является единственным поставщиком гистидина, используемого для композиций. Однако наблюдали значительную разницу в скорости реакции между партиями, поставленными Ajinomoto.

Дополнительным фактором, который играет роль в ускорении реакции, является присутствие металла. Это было продемонстрировано протеканием реакции при 60°C в течение пяти дней в стеклянном сосуде с 50 мМ гистидина (Партия No. R016A00S) и 2% (мас./об.) полисорбата 80. В таких условиях минимальные уровни примесей образовывались для этой партии гистидина. Затем реакционную смесь разделяли на три сосуда: (1) первый сосуд оставался как контроль; (2) ко второму сосуду добавляли серую бутиловую крышку контейнера (пробку); и (3) к третьему сосуду добавляли иглу из нержавеющей стали. Эти реакции затем протекали в течение четырех дней при 60°C и их анализировали УФ-сканированием от 200 до 400 нм. Реакция прогрессировала далее в течение такого периода времени в присутствие иглы.

Пример 4

Исследование примесей - испытание на предельное содержание в одной дозе у мышей

Потенциальную токсичность этих примесей оценивали в испытании на предельное содержание в одной дозе у мышей. Использовали образцы плацебо гистидина и натализумаба в композиции #2, хранившиеся при 40°C в течение шести недель, так как эти образцы обеспечивали наибольшее количество примесей. Не было признаков токсичности из-за примесей. Предварительные данные представлены в неклинической части заявления.

Определяли профили SEC-ВЭЖХ для 100 мкл инъекций образцов, используемых в испытании на предельное содержание в одной дозе у мышей. Образец натализумаба в композиции #1, дополненный полисорбатом 80 перед анализом, имел небольшой уровень поглощения при 260 нм в элюате после 20 минут. Пик элюции на 34 минуте обнаруживали в этой партии натализумаба без добавления полисорбата 80 и, следовательно, это не указывает на разложение полисорбата 80. Наоборот, плацебо в композиции #2, хранящейся при 40°C в течение шести недель, показал полное разложение, так как общая площадь под кривой была 12,8 миллион мВ•секунд. Образец натализумаба в композиции #2 и хранившийся при 40°C в течение шести недель имел менее полное разложение. Анализ подтвердил, что образцы, хранящиеся при 40°C и тестируемые в испытании на предельное содержание в одной дозе у мышей, содержали большое количество разложившегося полисорбата 80.

Пример 5

Установление спецификации примесей

Для оценки, способен ли все еще частично разложившийся полисорбат 80 предотвращать агрегацию антител, композицию #2 нагревали до 60°C в течение 3 дней в присутствии иглы для преобразования всего полисорбата 80 в максимальный уровень примесей. При помощи SEC-ВЭЖХ c обращенной фазой подтверждали, что в реакции весь полисорбат 80 разложился. Полученное вещество разводили один к одному 10 мг/мл раствором AN100226 в композиции #2, приводя к раствору, содержащему 0,01% (мас./об.) полисорбата 80 и 50% максимального уровня разложившегося полисорбата 80. Такие растворы антител подвергали встряхиванию и воздействию силицированных шприцев в течение нескольких часов; агрегация антител была предотвращена. Контрольный образец, подвергнутый таким же условиям, но без полисорбата 80, показал значительное осаждение.

Из этой работы заключили, что поскольку не более чем 50% полисорбата 80 разложилось, это вещество может обеспечивать соответствующее окружение для предотвращения агрегации антител.

Хотя очень небольшое разложение полисорбата наблюдалось в активном лекарственном продукте, было проведено наблюдение за структурой изоэлектрофокусировки (IEF) для подтверждения, что эта композиция не подвергает риску антитела. Определяли профили IEF для временных точек стабильности шести недель для 5, 25 и 40°C условий хранения. Образцы 5 и 25°C были сравнимы с эталонным стандартом, с отсутствием какого-либо изменения в общем заряде белка. Образец 40°C показал сдвиг к более кислым видам, типичным для этого продукта в жидкой композиции, как в присутствии, так и в отсутствии полисорбата 80.

Для установления взаимоотношений между степенью деградации полисорбата 80 и площадью пика из SEC-ВЭЖХ оценивали ряд разведений для шести концентраций разложившегося полисорбата 80 от 0 до 50%. Композицию #2 нагревали до 60°C в течение 3 дней с иглой и подтверждали 100% разложение по ВЭЖХ SEC и с обращенной фазой. Затем реакционную смесь разводили очищенной партией

AN100226 в композиции #1, заново добавляли 0,02% (мас./об.) полисорбата 80 и анализировали SEC-ВЭЖХ. Профили SEC наблюдали при 260 нм.

Данные из этого ряда разведений наносили на график по общей площади пика, объединенной (мкВ•секунд) для профиля поглощения после приблизительно 24 минут как функцию соотношения разложившегося полисорбата 80. Этот график показывает, что площадь менее чем 5 миллионов мкВ•секунд представляет собой около 50% потерю полисорбата 80 до разложившихся продуктов. Существует прямое взаимоотношение между количеством окисленного добавленного полисорбата 80 и площади пика для пиков, элюировавших в поздней области хроматограммы.

Предварительный предел для этих следовых примесей в натализумабе был установлен на основании испытаний на предельное содержание одной дозы у мышей, данных растворимости антител с 50% разложившимся полисорбатом 80 и оценок разложения полисорбата 80. Способ был включен в текущую программу стабильности и предел был установлен. Если дополнительные партии производятся с гистидином, эти пределы будут применяться также во время высвобождения.

Предел: общая площадь под пиками после приблизительно 24 минут не превосходит 4 x 106 мкВ•секунд.

Пример 6

1,7 мг/мл композиция натализумаба

1,7 мг натализумаба
1,4 мг фосфата натрия, USP
8,2 мг хлорида натрия, USP
0,2 мг полисорбата 80, NF

Доведение pH до 6,0±0,5 фосфорной кислотой (NF). QS до 1 мл. Предпочтительное хранение при 5-8°C.

Пример 7

5,0 мг/мл композиция натализумаба

5,0 мг натализумаба
1,4 мг фосфата натрия, USP
8,2 мг хлорида натрия, USP
0,2 мг полисорбата 80, NF

Доведение pH до 6,0±0,5 фосфорной кислотой (NF). QS до 1 мл. Предпочтительное хранение при 5-8°C.

Пример 8

20 мг/мл композиция натализумаба

20,0 мг натализумаба
1,4 мг фосфата натрия, USP
8,2 мг хлорида натрия, USP
0,2 мг полисорбата 80, NF

Доведение pH до 6,0±0,5 фосфорной кислотой (NF). QS до 1 мл. Предпочтительное хранение при 5-8°C.

Пример 9

50,0 мг/мл композиция натализумаба

50,0 мг натализумаба
1,4 мг фосфата натрия, USP
8,2 мг хлорида натрия, USP
0,2 мг полисорбата 80, NF

Доведение pH до 6,0±0,5 фосфорной кислотой (NF). QS до 1 мл. Предпочтительное хранение при 5-8°C.

Пример 10

5,0 мг/мл композиция натализумаба

5,0 мг/мл натализумаба
140 мМ NaCl
0,02% полисорбата 80 (мас./об.)
10 мМ фосфата натрия

Доведение pH до 6,0±0,5 фосфорной кислотой. Оптимально хранение композиции при около 5°C до около 8°C.

Пример 11

10 мг/мл композиция натализумаба

10,0 мг натализумаба
1,4 мг фосфата натрия, USP
8,2 мг хлорида натрия, USP
0,2 мг полисорбата 80, NF

Доведение pH до 6,0±0,5 фосфорной кислотой (NF). QS до 1 мл. Предпочтительное хранение при 5-8°C.

Пример 12

10 мг/мл композиция натализумаба

10,0 мг натализумаба
1,4 мг фосфата натрия, USP
8,2 мг хлорида натрия, USP
0,1 мг полисорбата 80, NF

Доведение pH до 6,0±0,5 фосфорной кислотой (NF). QS до 1 мл. Предпочтительное хранение при 5-8°C.

Пример 13

20 мг/мл композиция натализумаба

20,0 мг/мл натализумаба
140 мМ NaCl
0,02% полисорбата 80 (мас./об.)
10 мМ фосфата натрия

Доведение pH до 6,0±0,5 фосфорной кислотой и доведение объема до 125 мл. Оптимально хранить композицию при от около 5°C до около 8°C.

Пример 14

Лиофилизированная композиция натализумаба

Дополнительные жидкие композиции антитела в высокой концентрации от 20-200 мг/мл могут состоять из фосфата или другого подходящего буфера (такого как гистидин, цитрат, ацетат или сукцинат) в диапазоне концентраций от 2 до 50 мМ, для получения буферизации в диапазоне рН от 3,0 до 7,0. Наиболее предпочтительно pH составляет 6,0,+/-0,5. Полиолы (такие как сорбит и маннит), дисахариды (такие как сахароза или трегалоза) и аминокислоты (такие как глицин) могут быть добавлены в различных количествах с хлоридом натрия для поддержания стабильности и обеспечения изотонического раствора. Использование поверхностно-активных веществ, таких как, но не ограничиваясь, полисорбаты, добавляет стабильности, когда используются в диапазоне от 0,001 до 2%. Для получения жидкой композиции натализумаб концентрировали до 65 мг/мл в 10 мМ фосфата натрия, 140 мМ хлорида натрия, pH 6, с около 0,06% полисорбата 80. Полученный раствор был слегка опалесцирующим, но без частиц. Образец содержал более чем 99% мономера без высокомолекулярных агрегатов или низкомолекулярных видов по SEC.

Обеспечивают стабильную лиофилизированную фармацевтическую композицию. Так как фосфатный буфер претерпевает изменения рН при замораживании, необходимо заменить фосфат другим буфером. Этот буфер может состоять из гистидина, цитрата или сукцината со способностью буферизовать в диапазоне рН от 3,0 до 7,0, наиболее предпочтительно в диапазоне 6,0 +/- 0,5.

Применение полиолов (таких как маннит) и сахаров (таких как сахароза) является необходимым для обеспечения крио- и лиозащиты. Такие полиолы могут быть использованы отдельно или в комбинации для обеспечения стабильности и установления тоничности. Дополнительно, применение аминокислот (таких как глицин), на уровне 10-1000 мМ может использоваться для предотвращения агрегации.

Поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты или полоксамеры, могут быть использованы на уровне от 0,001 до 2,0% для обеспечения стабильности перед лиофилизацией и после восстановления и для обеспечения более быстрого времени восстановления.

Белок после окончательной стадии очистки может быть обработан с использованием ультрафильтрации для концентрирования и диафильтрации для замены буфера. Белок также может быть обработан с использованием колоночной хроматографии для замены буфера. Некоторые комбинации этих методик также могут быть использованы.

Кроме того, конечная желаемая концентрация белка может быть получена путем заполнения в концентрации белка и вспомогательного вещества, меньшей, чем желательно, и восстановления в более маленьком объеме. Например, 2,5 мл заполненного объема 40 мг/мл раствора может быть использовано с последующим восстановлением 1 мл для получения раствора 100 мг/мл.

Например натализумаб, в концентрации 20 мг/мл, лиофилизировали в растворе, содержащем 5 мМ гистидина, 20 мг/мл сахарозы и 0,02% полисорбата 80, pH 6. Раствор заполняли по 5 мл на флакон в 10 мл флаконы из боросиликатного стекла и закупоривали пробками из серого бутилкаучука для лиофилизации. Лиофилизацию проводили с использованием лиофилизатора модели Virtis Gensis. Продукт замораживали при температуре хранения -60°C в течение 10 часов и затем температуру хранения повышали до -40°. Первичную сушку проводили при температуре хранения -10°C и давлении в камере 100 мм рт.ст. в течение 20 часов. Вторичную сушку достигали при температуре хранения 25°C с давлением в камере 100 мм рт.ст. в течение 10 часов. Флаконы закупоривали в вакууме.

Затем флаконы восстанавливали с использованием 1 мл стерильной WFI для получения композиции, содержащей 100 мг/мл натализумаба. Образцы анализировали сразу после лиофилизации и через 2 нед. хранения в лиофилизированной форме при 40°С. В обоих случаях время восстановления было немедленным. Восстановленные растворы были чистыми и бесцветными с отсутствием частиц вещества. Образцы содержали более чем 99% мономера по SEC, без высокомолекулярных агрегатов или низкомолекулярных видов. Через 2 недели хранения при 40°С, образец показал 94% эффективность относительно эталона (требования 80-125%).

Все цитируемые патенты и публикации, относящиеся к настоящей заявке, включены в данное описание в виде ссылки полностью для любых целей.

Claims (31)

1. Стабильная водная фармацевтическая композиция, включающая иммуноглобулин, фосфатный буфер, полисорбат, и хлорид натрия, где иммуноглобулин представляет собой моноклональное антитело натализумаб и рН композиции составляет 6,0±0,5.

2. Композиция по п.1, в которой полисорбат представляет собой полисорбат 80.

3. Композиция по п.2, в которой полисорбат 80 присутствует в количестве от около 0,001% до около 2,0% (мас./об.).

4. Композиция по п.3, в которой полисорбат 80 присутствует в количестве около 0,02% (мас./об.).

5. Композиция по п.1, в которой иммуноглобулин присутствует в количестве от около 0,1 мг/мл до около 200 мг/мл.

6. Композиция по п.5, в которой иммуноглобулин присутствует в количестве около 1,7 мг/мл.

7. Композиция по п.5, в которой иммуноглобулин присутствует в количестве около 5 мг/мл.

8. Композиция по п.5, в которой иммуноглобулин присутствует в количестве около 20 мг/мл.

9. Композиция по п.1, где композиция находится в фиксированном объеме, и иммуноглобулин присутствует в количестве около 50 мг/мл.

10. Композиция по п.9, в которой иммуноглобулин связывает альфа-4 интегрин.

11. Композиция по п.1, в которой полисорбат представляет собой полисорбат 80 и присутствует в количестве около 0,02% (мас./об.) и где композиция стабильна при температуре от около 2°С до около 8°С в течение, по меньшей мере, 6 месяцев.

12. Композиция по п.11, в которой натализумаб присутствует в количестве от около 20 мг/мл до около 150 мг/мл.

13. Композиция по п.1, где композиция является изотонической.

14. Композиция по п.1, в которой антитело присутствует в количестве от около 1 мг/мл до около 150 мг/мл.

15. Композиция по п.14, в которой антитело присутствует в количестве около 1,7 мг/мл или около 50 мг/мл.

16. Композиция по п.1, в которой антитело присутствует в количестве от около 15 мг/мл до около 50 мг/мл.

17. Композиция по п.1, в которой композиция дополнительно включает гистидин.

18. Композиция по п.17, в которой полисорбат представляет собой полисорбат 80.

19. Способ лечения пациента с состояниями, опосредованных альфа-4 интегрином, различной тяжести терапевтическим количеством иммуноглобулина, включающий введение композиции по п.1 указанному пациенту, где указанное состояние лечат введением композиции.

20. Способ получения стабильной композиции по п.1, включающий смешивание фосфата натрия, хлорида натрия, полисорбата и натализумаба, и доведение рН смеси фосфорной кислотой до рН 6,0±0,5.

21. Способ по п.20, где фосфат натрия присутствует в количестве около 10 мМ, хлорид натрия присутствует в количестве 150 мМ, полисорбат представляет собой полисорбат 80 и присутствует в количестве около 0,02% (мас./об.).

22. Способ по п.20, где натализумаб присутствует в количестве от около 20 мг/мл до около 200 мг/мл.

23. Способ по п.22, где натализумаб присутствует в количестве около 150 мг/мл.

24. Способ по п.20, где натализумаб в композиции по п.1 является лиофилизированным.

25. Способ по п.24, где полисорбат представляет собой полисорбат 80 и присутствует в количестве около 0,02% (мас./об.).

26. Способ по п.24, где композиция дополнительно включает гистидин.

27. Способ по п.20, где натализумаб является лиофилизированным в растворе, включающем 5 мМ гистидина, 20 мг/мл сахарозы и 0,02% полисорбата 80 при рН 6, и где натализумаб присутствует в концентрации 20 мг/мл.

28. Изделие, включающее контейнер, содержащий стабильную композицию по любому из пп.1-18.

29. Способ лечения пациента с состояниями, опосредованных альфа-4 интегрином, различной тяжести, включающий одновременное или последовательное введение пациенту терапевтически эффективной комбинации композиции по любому из пп.1-16 и соединения или средства для лечения в отношении этого состояния.

30. Применение стабильной композиции по любому из пп.1-16 для получения лекарственного средства для лечения состояний, опосредованных альфа-4 интегрином, различной тяжести у пациента, где лекарственное средство является эффективным для лечения указанного состояния.

31. Применение стабильной композиции по любому из пп.1-16 для получения лекарственного средства для лечения состояний, опосредованных альфа-4 интегрином, различной тяжести у пациента, где лекарственное средство является комбинацией композиции по любому из пп.1-16 и соединения или средства для лечения, и где указанное лекарственное средство является эффективным для лечения указанного состояния.