CN106443002A - 评价在含有机基聚硅氧烷的悬浮液中蛋白质聚集的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在含有机基聚硅氧烷的含水悬浮液内评价或抑制蛋白质聚集的方法，和用包括糖与非离子表面活性剂的含有机基聚硅氧烷的蛋白质溶液涂布的医疗制品。

Description

评价在含有机基聚硅氧烷的悬浮液中蛋白质聚集的方法
本申请是同名发明名称的中国专利申请第200880119613.X号的分案申请，母案国际申请号为PCT/US2008/080721,国际申请日为2008年10月22日。
相关申请的交叉参考
本申请要求2007年10月22日提交的美国临时专利申请序列号60/999920的权益，在此通过参考全文引入。本申请还要求2008年6月25日提交的PCT/US2008/068136的权益，PCT/US2008/068136要求2007年6月25日提交的美国临时专利申请序列号60/937179的权益，这两篇申请在此通过参考全文引入。
技术领域
本发明涉及评价在含有机基聚硅氧烷的悬浮液中蛋白质材料聚集的方法以及用有机基聚硅氧烷和含蛋白质材料的悬浮液表面涂布的医疗组件。
背景技术
治疗性蛋白质对疾病和健康状况，例如糖尿病、癌症、血友病、类风湿关节炎、多发性硬化和心肌梗死提供许多独特和关键的治疗。市场上已经存在许多蛋白质产品，且数百种之多处于临床前和临床开发之中。此外，近来随着“人类化(humanizing)”抗体的强有力方法的到来，在生物技术产品开发上存在新的复苏(resurgence)，因为待研究的治疗人类疾病的抗体产品数量巨大地增加。采用现代基因和蛋白质方法的情况下，每天发现了新的比较安全和比较有效的蛋白质疗法。然而，若蛋白质产品不可能充分地稳定，因此它对人类健康的益处从未实现。典型的蛋白质药物产品的经济可行性所要求的货架期为18－24个月。尤其难以实现这一目标，因为蛋白质在其自然状态下具有相对低的热动力学稳定性。蛋白质的活性取决于其自然的三维结构。另外，甚至在热动力学比所呈现状态(unfolded)的条件(例如在37℃下，中性pH)更极大有利于自然状态下，蛋白质对形成非天然聚集体和沉淀高度敏感。聚集体中的蛋白质的生物活性通常大大下降。更加重要的是，非天然的蛋白质聚集体可引起患者副反应，例如免疫应答或过敏性休克。不可能预期给定蛋白质聚集体诱导负面应答的能力；在没有采用高昂和耗时的临床试验情况下，也不可能测定安全所要求的最大聚集程度。
因此，配方科学的主要目标是设计在极低的水平下保持聚集的配方。一般地，目标是在产品的货架期内，不大于全部蛋白质群的1－2％形成聚集体。甚至在其中蛋白质的物理稳定性看起来最优以便在本体溶液中最小化蛋白质聚集的溶液条件下，可形成可占全部蛋白质群仅仅小的分数的可见和亚可见(subvisible)蛋白质颗粒。存在甚至数量少的蛋白质颗粒可使得产品临床不可接受。蛋白质粒状物尤其是致免疫的。尽管粒状物对于疫苗配方来说是所需的(其中蛋白质分子键合到铝盐颗粒上)，但在治疗蛋白质产品中，对这种颗粒的免疫应答可引起患者严重的负面应答。因此，即使聚集的蛋白质量可能如此小，以致于对产品效力基本上不具有有害影响，但可能大大地牺牲了安全性。
可在加工步骤过程中，例如在小瓶/注射器填充过程中泵送蛋白质溶液时，常规地形成颗粒。在其他情况下，颗粒的形成可能表面上是随机的。例如，可在给出产品批次中，在小部分的小瓶或预填充的注射器内观察到颗粒。其他情况下，填充到给定批次小瓶或注射器内的产品可在大部分容器内形成蛋白质颗粒。遗憾的是，这些颗粒在下游的灭菌过滤步骤出现，且在皮下、皮内或肌内注射过程中不可能通过过滤除去。
硅油在医疗制品中常常用作润滑剂。尽管硅油不易于氧化，但对于预填充的注射器来说，可能出现迁移和粘附，和高拆卸(breakout)和/或松脱(breakloose)力成为问题。表明在一些条件下，甚至在低浓度下，硅油诱导蛋白质聚集。在预填充注射器内制备数种最新商业化的含水蛋白质产品，其中包括红细胞生成素(例如RecormonTM和EprexTM)、干扰素(例如AvonexTM和RebifTM)和类风湿关节炎治疗剂(例如EnbrelTM和HumiraTM)。预填充的注射器的内表面用硅油涂布，以提高注射器的功能，因此配制的蛋白质暴露于硅油表面下。硅油诱导的治疗性蛋白质聚集，从而潜在地导致产品损失和制备成本增加是药物工业所关心的。
需要评估具有含蛋白质材料的含水悬浮液或乳液的方法，以决定在溶液内包括合适的聚集抑制剂来抑制聚集。这些研究的结果将提供公司如何开发抗硅油诱导的蛋白质聚集的蛋白质配方所需的知识方面的建议。另外，期望提供快速配方筛选的实验体系。因此，药物和生物技术公司可遵守合理的配方开发计划，针对每一蛋白质得到快速最佳配方，所述蛋白质将避免硅油诱导的蛋白质聚集问题和患者潜在的负面应答。可测定在开发中测试新的注射器或医疗制品可使用的模型蛋白质和合适的溶液条件。
发明内容
在一些非限定性实施方案中，本发明提供在含有机基聚硅氧烷的悬浮液内含蛋白质材料的聚集的评价方法，该方法包括：(a)提供荧光标记的有机基聚硅氧烷和荧光标记的含蛋白质的材料的含水悬浮液；(b)使用荧光活化的颗粒分类(sorting)，测量荧光标记的有机基聚硅氧烷和荧光标记的含蛋白质材料的相对颗粒荧光强度；和(c)比较荧光标记的有机基聚硅氧烷的相对强度与荧光标记的含蛋白质材料的相对强度。
在一些非限定性实施方案中，本发明提供在含有机基聚硅氧烷的悬浮液中，含蛋白质材料的聚集的评价方法，该方法包括：(a)提供荧光标记的有机基聚硅氧烷和荧光标记的含蛋白质材料的含水悬浮液，其中当荧光标记的有机基聚硅氧烷和荧光标记的含蛋白质的材料各自暴露于由激光器发射的相同波长的光下时，用发射在第一波长范围内的光的第一荧光部分来标记有机基聚硅氧烷，和用发射第二波长范围内的光的第二荧光部分来标记含蛋白质的材料，其中第一波长范围基本上不与第二波长范围重叠；(b)使用荧光活化的颗粒分类，测量荧光标记的有机基聚硅氧烷和荧光标记的含蛋白质的材料的相对颗粒荧光强度；和(c)比较荧光标记的有机基聚硅氧烷的相对强度与荧光标记的含蛋白质材料的相对强度。
在一些非限定性实施方案中，本发明提供在含有机基聚硅氧烷的悬浮液中抑制含蛋白质材料聚集的方法，该方法包括：(a)提供荧光标记的有机基聚硅氧烷和荧光标记的含蛋白质的材料的多种含水悬浮液，其中每一含水悬浮液进一步包括选自非离子表面活性剂和糖类中的至少一种聚集抑制剂，其中(i)至少一种聚集抑制剂在每一含水悬浮液中不同，或者(ii)聚集抑制剂的用量在每一含水悬浮液中不同；(b)使用荧光活化的颗粒分类，测量在每一含水悬浮液内，荧光标记的有机基聚硅氧烷和荧光标记的含蛋白质的材料的相对颗粒荧光强度；(c)对于每一含水悬浮液，比较荧光标记的有机基聚硅氧烷的相对强度与荧光标记的含蛋白质的材料的相对强度；和(d)对于每一含水悬浮液，基于荧光标记的有机基聚硅氧烷的相对强度与荧光标记的含蛋白质的材料的相对强度，选择在包含含蛋白质的材料的悬浮液中所使用的至少一种聚集抑制剂。
在一些非限定性实施方案中，本发明提供医疗制品，它包括：(a)含接收溶液的腔室的容器，其中腔室的内表面在其上具有由含有机基聚硅氧烷的组合物制备的涂层；和(b)包括(i)至少一种含蛋白质的材料，(ii)至少一种非离子表面活性剂与(iii)至少一种糖的溶液。
在一些非限定性实施方案中，本发明提供医疗制品，它包括：(a)含接收溶液的腔室的容器，其中腔室的内表面在其上具有由含有机基聚硅氧烷的组合物制备的涂层；和(b)包括(i)至少一种含蛋白质的材料与(ii)至少一种非离子表面活性剂的溶液。
附图说明
当结合附图阅读时，根据下述具体实施方案的说明，会最好地理解本发明：
图1A是对于含蔗糖、mAb和硅油的配方以及含mAb和硅油的配方来说，作为时间的函数，mAb与硅油吸附/聚集的图表；
图1B是对于含蔗糖、mAb和硅油的配方以及本发明含蔗糖、非离子表面活性剂、mAb和硅油的配方来说，作为时间的函数，mAb与硅油吸附/聚集的图表；
图2A是对于不具有蔗糖或表面活性剂的对照配方来说，FL1强度和FL2强度的荧光强度散射图表；
图2B是对于具有蔗糖的配方来说，FL1强度和FL2强度的荧光强度散射图表；
图2C是对于具有非离子表面活性剂的配方来说，FL1强度和FL2强度的荧光强度散射图表；
图2D是对于本发明具有蔗糖和非离子表面活性剂的配方来说，FL1强度和FL2强度的荧光强度散射图表；
图3A是对于不具有蔗糖或表面活性剂的对照配方来说，硅油液滴的侧面光散射(90°光散射)对正面光散射(180°光散射)的散射图表；
图3B是对于具有蔗糖的配方来说，硅油液滴的侧面光散射(90°光散射)对正面光散射(180°光散射)的散射图表；
图3C是对于具有非离子表面活性剂的配方来说，硅油液滴的侧面光散射(90°光散射)对正面光散射(180°光散射)的散射图表；
图3D是对于本发明具有非离子表面活性剂的配方来说，硅油液滴的侧面光散射(90°光散射)对正面光散射(180°光散射)的散射图表；
图4A是对于含蔗糖、mAb和硅油的配方以及含mAb和硅油的配方来说，作为时间的函数，光遮蔽(obscuration)的图表；
图4B是对于含蔗糖、mAb和硅油的配方以及本发明含蔗糖、非离子表面活性剂、mAb和硅油的配方来说，作为时间的函数，光遮蔽的图表；
图5A是对于含蔗糖、mAb和硅油的配方以及含mAb和硅油的配方来说，作为时间的函数，mAb与硅油吸附/聚集的图表；
图5B是对于含蔗糖、mAb和硅油的配方以及含蔗糖、非离子表面活性剂、mAb和硅油的配方来说，作为时间的函数，mAb与硅油吸附/聚集的图表；
图6是基于正面和侧面光散射，硅油液滴和聚集体分布的假设图表；
图7是对于三种不同的硅油粘度的硅油乳液配方来说，作为时间的函数，光遮蔽的图表；
图8是对于由1000cSt的硅油制备的配方来说，硅油液滴的侧面光散射(90°光散射)对正面光散射(180°光散射)的散射图表；
图9是对于由12,500cSt的硅油制备的配方来说，硅油液滴的侧面光散射(90°光散射)对正面光散射(180°光散射)的散射图表；
图10是本发明制备和分析有机基聚硅氧烷溶液样品的方法的流程图；
图11是对于Pacific BlueTM染料和Nile Red染料来说，作为波长的函数，归一化的荧光激发和发射光谱的图表；
图12A是对于未标记的硅油样品来说，用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表；
图12B是对于用Nile Red染料标记的硅油样品来说，用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表；
图12C是对于用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体样品来说，用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表；
图12D是对于用Nile Red染料标记的硅油样品和本发明用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体样品来说，用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表；
图13A是对于完好球形的尺寸范围来说，作为颗粒体积的函数，理论颗粒表面积的图表；
图13B是对于用Nile Red染料标记的硅油样品和本发明用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体样品来说，作为颗粒体积的函数，颗粒表面积的图表；
图14A是对于用Nile Red染料标记的硅油样品和本发明用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体样品来说，用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表；
图14B是对于用Nile Red染料标记的硅油样品、本发明用Pacific BlueTM染料和0.03％Tween聚氧乙烯20脱水山梨醇单月桂酸酯非离子表面活性剂标记的CD3抗体样品来说，用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表；
图15A是对于用Nile Red染料标记的硅油样品和本发明用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体样品来说，用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表；
图15B是对于用Nile Red染料标记的硅油样品、本发明用Pacific BlueTM染料和0.03％Tween聚氧乙烯20脱水山梨醇单月桂酸酯非离子表面活性剂标记的CD3抗体样品来说，用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表；
图16A是对于用Nile Red染料标记的硅油样品和本发明用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体样品来说，用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表；
图16B是对于用Nile Red染料标记的硅油样品、本发明用Pacific BlueTM染料和150mM盐标记的CD3抗体样品来说，用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表；
图16C是对于用Nile Red染料标记的硅油样品、本发明用Pacific BlueTM染料和0.5M蔗糖标记的CD3抗体样品来说，用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表；
图16D是对于用Nile Red染料标记的硅油样品；本发明用Pacific BlueTM染料、0.5M蔗糖、150mM盐和0.03％Tween聚氧乙烯20脱水山梨醇单月桂酸酯非离子表面活性剂标记的CD3抗体样品来说，用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表；
图17A是根据本发明，对于用Nile Red染料标记的硅油样品，以及用PacificBlueTM染料标记的CD3抗体样品来说，在10μs的窗延长期(window extension)下测量的用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表；
图17B是根据本发明，对于用Nile Red染料标记的硅油样品，用Pacific BlueTM染料和0.03％Tween聚氧乙烯20脱水山梨醇单月桂酸酯非离子表面活性剂标记的CD3抗体样品来说，在10μs的窗延长期下测量的用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表；
图17C是根据本发明，对于用Nile Red染料标记的硅油样品，以及用PacificBlueTM染料标记的CD3抗体样品来说，在2μs的窗延长期下测量的用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表；和
图17D是根据本发明，对于用Nile Red染料标记的硅油样品，用Pacific BlueTM染料和0.03％Tween聚氧乙烯20脱水山梨醇单月桂酸酯非离子表面活性剂标记的CD3抗体样品来说，在2μs的窗延长期下测量的用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表。
具体实施方案
除了在操作例中以外，或者除非另有说明，在说明书和权利要求中所使用的表达成分用量、反应条件等等的所有数值要理解为在所有情况下用术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，在下述说明书和所附权利要求中列出的数值参数是近似值，它可随本发明寻求获得的所需性能而变化，最起码，且没有尝试限制本申请范围到权利要求等价的范围上，每一数值参数至少应当鉴于所报道的有效数字和通过采用常见的近似技术来解释。
尽管列出本发明宽范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实施例中列出的数值尽可能精确地报道。然而，任何数值固有地含有一些误差，这些误差必然来自于在它们各自的试验测量中出现的标准偏差。此外，当此处列出改变范围的数值范围时，认为可使用包括所引证数值的这些数值的任何结合。
此外，应当理解，此处引证的任何数值范围拟包括此处提出的所有子范围。例如，范围“1－10”拟包括在所引证的最小值1和引证的最大值10之间的所有子范围且包括端值，亦即具有等于或大于1的最小值和等于或小于10的最大值。
尽管不希望束缚于任何理论，但蛋白质颗粒的形成可来自于在外来物质的纳米颗粒和微粒表面上蛋白质聚集体的非均相成核。这些粒状污染物可包括来自小瓶填充泵的金属或有机硅(Silicone)碎片，在玻璃注射器的制备过程中产生的钨微粒，和高温去热解(depyrogenation)工序导致的玻璃纳米颗粒碎片。在一些非限定性实施方案中，本发明的方法可与制备其表面用硅油或有机基聚硅氧烷涂布的预填充的注射器的方法结合使用。为确保塞体当注射产品时光滑、自由行进通过注射器筒体，硅油是所需要的。在硅油处理过的预填充的注射器(它可通过硅油微液滴成核)内形成蛋白质颗粒也可能是所担心的。尽管这种颗粒和可能来自于它们的蛋白质聚集体是普遍存在的，但在文献中基本上没有解决该问题的系统表征和掌控它的机理。在没有这种洞察力的情况下，工业上继续受蛋白质聚集和所致产品的损失、增加的成本以及对患者安全风险的困扰。
可通过使用热动力学稳定剂(例如蔗糖)，抑制均一的蛋白质聚集，其中所述热动力学稳定剂将使天然状态的群组(ensemble)远离结构膨胀的保形并朝向结构最紧凑的物种偏离。稳定剂，例如蔗糖增加蛋白质的热动力学稳定性，因为它们优先从蛋白质分子表面上排除。优先排除的同时蛋白质的化学势增加，这两个因素的大小与暴露于溶剂下的蛋白质的表面积直接成正比且与暴露残渣的侧链的化学性能无关。优先排除溶质将增加在天然状态的群组内最紧凑的天然状态与充分展开的状态或结构膨胀的物种之间的自由能壁垒，因为后者具有较大的表面积，因此有较大的化学势增加。因此，蔗糖使平衡偏离结构膨胀的聚集竞争物种。
除了在蛋白质分子群内物种分布的热动力学调节以外，在溶液内蛋白质-蛋白质的相互作用能是蛋白质聚集动力学的重要决定性因素。蛋白质的部分展开本身不足以引起聚集。它们还必须依照某一装配反应，在该反应中两个或更多蛋白质分子聚集。通过蛋白质-蛋白质的分子间能量，调节这一方法的动力学，这反过来可通过改变溶液条件来变更。这种“胶态”稳定性可涉及二级渗透的维里系数B22。通过蛋白质分子之间的电荷-电荷相互作用，大大地影响这一参数。因此，溶液pH和离子浓度的变化会改变蛋白质-蛋白质的相互作用。
可使用表面积等于颗粒体积2/3的完美液滴的理论模型，估计在有机基聚硅氧烷颗粒表面上粘附的含蛋白质的材料的表面积。参见，J.H.Jett等人，“Quantitation of CellSurface Antigen Density by Flow Cytometry”，4th Annual Symposium of FlowCytometry,Voss,Norway(1979年6月4日)(1979年1月1日公布)(摘要)。通过相关测量曲线的斜率，推导在光学背景存在下，与荧光标记的有机基聚硅氧烷表面有关的荧光标记的蛋白质的检测证明，其中作为具有完美球形的体积的函数，所述斜率值接近于表面积的2/3次方(102/3)的理论值。
在一些非限定性实施方案中，本发明提供在含有机基聚硅氧烷的悬浮液中含蛋白质的材料聚集的评价方法，该方法包括：(a)提供荧光标记的有机基聚硅氧烷和荧光标记的含蛋白质的材料的含水悬浮液(或乳液)；(b)使用荧光活化的颗粒分类(sorting)，测量荧光标记的有机基聚硅氧烷和荧光标记的含蛋白质材料的相对颗粒荧光强度；和(c)比较荧光标记的有机基聚硅氧烷的相对强度与荧光标记的含蛋白质材料的相对强度。
此处所使用的“含蛋白质的材料”是指含至少一种蛋白质的材料。此处所使用的“蛋白质”是大的有机化合物，它包括在线型链内排列且通过相邻氨基酸残基上的羧基和氨基之间的肽键连接在一起的氨基酸，例如纤维蛋白、球蛋白和蛋白质络合物。在本发明中使用的合适的含蛋白质的材料的非限定性实例包括单克隆抗体(mAb或moAb)、单特异抗体(它们是相同的)，因为它们通过一类免疫细胞产生，所述免疫细胞全部是单一母细胞的克隆。合适的单克隆抗体的非限定性实例包括infliximab、basiliximab、阿昔单抗、daclizumab、gemtuzumab、alemtuzumab、rituximab、palivizumab、trastuzumab和etanercept。合适的含蛋白质的材料的其它非限定性实例包括粒细胞克隆刺激因子(例如，NeupogenTM)、红细胞生成素(例如，RecormonTM和EprexTM)，干扰素(例如，AvonexTM和RebifTM)和类风湿关节炎治疗剂(例如，EnbrelTM、HumiraTM和OrenciaTM)。含蛋白质的材料被标记或者具有当暴露于紫外或红外光下时能发荧光的荧光部分固定到其上，正如以下详细地描述的。
在一些非限定性实施方案中，含蛋白质的材料在溶液内的存在浓度为约20－约600μg/ml，或约100－约300μg/ml，基于水溶液的总体积。
有机基聚硅氧烷可以是任何有机基聚硅氧烷或硅油，例如涂布医疗制品，例如注射器筒体表面可使用的那些。在一些非限定性实施方案中，在任何固化步骤之前，有机基聚硅氧烷的粘度范围为约100－约1,000,000厘沲(cSt)，或者约1,000cSt－约100,000cSt，或约1,000cSt－约15,000cSt，或约12,500cSt。
在一些非限定性实施方案中，有机基聚硅氧烷包括烷基取代的有机基聚硅氧烷，例如用下述结构式(I)表示：
其中R是烷基和Z是约30－约4500。在一些非限定性实施方案中，式(I)的有机基聚硅氧烷可用下述结构式(II)表示：
其中Z可以如上所述，或者例如可以是约300－约2000，约300－约1800，或约300－约1350。在一些非限定性实施方案中，有机基聚硅氧烷是聚二甲基硅氧烷，例如DOW360聚二甲基硅氧烷或NUSIL聚二甲基硅氧烷，其粘度范围为约100－约1,000,000cSt。
在一些非限定性实施方案中，有机基聚硅氧烷包括一个或更多个可固化或反应性官能团，例如烯基。每一烯基可独立地选自乙烯基、烯丙基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基和癸烯基。本领域的技术人员要理解有机基聚硅氧烷可包括一个或更多个前述任何类型的烯基及其混合物。在一些实施方案中，至少一个烯基是乙烯基。更高级的烯基或乙烯基含量提供更加有效的交联。
在一些非限定性实施方案中，有机基聚硅氧烷可以用下述结构式(III)或(IV)表示：
其中R是烷基、卤代烷基、芳基、卤代芳基、环烷基、硅杂环戊基、芳烷基，及其混合物，X是约60－约1000，优选约200－约320，和y是约3－约25。还考虑共聚物和这些聚合物的混合物。
有用的乙烯基官能的有机基聚硅氧烷的非限定性实例包括：乙烯基二甲基甲硅烷氧基封端的聚二甲基硅氧烷；三甲基甲硅烷氧基封端的乙烯基甲基，二甲基聚硅氧烷共聚物；乙烯基二甲基甲硅烷氧基封端的乙烯基甲基，二甲基聚硅氧烷共聚物；二乙烯基甲基甲硅烷氧基封端的聚二甲基硅氧烷；乙烯基，正丁基甲基封端的聚二甲基硅氧烷；和乙烯基苯基甲基甲硅烷氧基封端的聚二甲基硅氧烷。
在一些实施方案中，可使用选自式II、III和/或IV中的那些硅氧烷聚合物的混合物。例如，该混合物可包括两种不同分子量的乙烯基二甲基甲硅烷氧基封端的聚二甲基硅氧烷聚合物，其中聚合物之一的平均分子量为约1000－约25,000，和优选约16,000，和另一聚合物的平均分子量为约30,000－约71,000，和优选约38,000。一般地，较低分子量的硅氧烷的存在量可以是这一混合物的约20％－约80％，例如约60wt％；和较高分子量的硅氧烷的存在量可以是这一混合物的约80％－约20％，例如约40wt％。
合适的乙烯基官能的有机基聚硅氧烷的另一非限定性实例是三甲基甲硅烷氧基封端的(7.0－8.0％乙烯基甲基硅氧烷)-二甲基硅氧烷共聚物，例如VDT-731乙烯基甲基硅氧烷共聚物，其商购于Gelest Inc.,of Morrisville,PA。
在一些非限定性实施方案中，有机基聚硅氧烷可包括至少两个极性基团。每一极性基团可独立地选自丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、氨基、亚氨基、羟基、环氧基、酯、烷氧基、异氰酸酯基、酚基、聚氨酯低聚物、聚酰胺低聚物、聚酯低聚物、聚醚低聚物、多元醇的基团和羧丙基。本领域的技术人员要理解有机基聚硅氧烷可包括任何上述极性基团中的一种或更多种及其混合物。在一些非限定性实施方案中，极性基团是丙烯酸酯基，例如丙烯酰氧基丙基。在其他实施方案中，极性基团是甲基丙烯酸酯基，例如甲基丙烯酰氧基丙基。具有极性基团的有机基聚硅氧烷可进一步包括一个或更多个烷基和/或芳基，例如甲基、乙基或苯基。
这种有机基聚硅氧烷的非限定性实例包括[15-20％(丙烯酰氧基丙基)甲基硅氧烷]-二甲基硅氧烷共聚物，例如UMS-182丙烯酸酯官能的硅氧烷，其获自Gelest,Inc.ofMorrisville,PA，和PC970丙烯酸酯化有机硅聚合物，其获自Rhodia-Silicones。
在一些非限定性实施方案中，这种有机基聚硅氧烷可用下式(V)表示：
其中R1选自丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、氨基、亚氨基、羟基、环氧基、酯、烷氧基、异氰酸酯、酚基、聚氨酯低聚物、聚酰胺低聚物、聚酯低聚物、聚醚低聚物、多元醇的基团、羧丙基和氟基；和R2是烷基，n的范围为2－4，和x是足以得到润滑剂粘度为约100－1,000,000cSt的整数。
在一些非限定性实施方案中，有机基聚硅氧烷可进一步包括一个或更多个氟基，例如－F或氟代烷基，例如三氟甲基。其他有用的有机基聚硅氧烷包括聚氟代烷基甲基硅氧烷和氟代烷基，二甲基硅氧烷共聚物。
在一些非限定性实施方案中，组合物可进一步包括一种或更多种环状硅氧烷，例如八甲基环四硅氧烷和/或十甲基环五硅氧烷。
在一些非限定性实施方案中，有机基聚硅氧烷可用下述结构式(VI)表示：
其中R是卤代烷基、芳基(例如苯基)、卤代芳基、环烷基、硅杂环戊基、芳烷基及其混合物，和Z是约20－约1800。
在一些非限定性实施方案中，有机基聚硅氧烷包括至少两个侧挂的氢基。含至少两个侧挂氢基的合适的有机基聚硅氧烷的非限定性实例包括沿着聚合物主链具有多个侧挂氢基或多个端基氢基的有机基聚硅氧烷。在一些非限定性实施方案中，有机基聚硅氧烷可用下述结构式(VII)表示：
其中p为约8－约125，例如约30。在其他非限定性实施方案中，有机基聚硅氧烷可用下述结构式(VIII)表示：
HMe2SiO(Me2SiO)pSiMe2H (VIII)
其中p为约140－约170，例如约150－约160。可使用含两种不同分子量材料的这些聚合物的混合物。例如，可混合使用占该混合物约2％－约5wt％平均分子量为约400－约7500，例如约1900的三甲基甲硅烷氧基封端的聚甲基氢硅氧烷与为约98％－95％平均分子量为约400－约37,000和优选约12,000的二甲基氢甲硅烷氧基封端的聚二甲基硅氧烷的混合物。含至少两个侧挂氢基的有用的有机基聚硅氧烷的非限定性实例包括二甲基氢封端的聚二甲基硅氧烷；甲基氢，二甲基聚硅氧烷共聚物；二甲基氢甲硅烷氧基封端的甲基辛基二甲基聚硅氧烷共聚物；和甲基氢，苯基甲基硅氧烷共聚物。
在一些非限定性实施方案中，组合物包括羟基官能的硅氧烷，例如含至少两个羟基的羟基官能的硅氧烷，例如：
其中R2是烷基，n的范围为0－4，和x是足以得到润滑剂粘度为约100－1,000,000cSt的整数。在一些非限定性实施方案中，作为官能度的结果，具有湿固化特征的可湿固化的硅氧烷包括具有例如下述官能团：烷氧基、芳氧基、肟、环氧基、-OOCR、N,N-二烷基氨基、N,N-二烷基氨氧基、N-烷基酰胺基、-O-NH-C(O)-R、-O-C(＝NCH3)-NH-CH3和-O-C(CH3)＝CH2的硅氧烷，其中R是H或烃基。此处所使用的“可湿固化”是指硅氧烷在大气湿气存在下，在环境条件下是可固化的。
可在本发明中使用以上所述的任何有机基聚硅氧烷的混合物。
在一些非限定性实施方案中，有机基聚硅氧烷占溶液的约0.001－约1wt％。
含蛋白质的材料和有机基聚硅氧烷各自用在不同的基本上不重叠的波长的光下发荧光的荧光部分来标记。此外，若存在多于一类的含蛋白质的材料和/或多于一类的有机基聚硅氧烷，则每一种不同类型的含蛋白质的材料和/或每一种不同类型的有机基聚硅氧烷可用在不同的基本上不重叠的波长的光下发荧光的荧光部分来标记。
此处所使用的“不同类型”的含蛋白质的材料是指化学不同的含蛋白质的材料，例如第一种含蛋白质的材料具有至少一个与第二类含蛋白质的材料不同的原子或不同的原子结构。类似地，此处所使用的“不同类型”的有机基聚硅氧烷是指化学不同的有机基聚硅氧烷，例如第一有机基聚硅氧烷具有至少一个与第二类有机基聚硅氧烷不同的原子或不同的原子结构。
为了激发和/或发射特征，选择标记含蛋白质的材料和有机基聚硅氧烷所使用的各荧光部分，最小化光学背景贡献，所述光学背景贡献可来自于在测量其他荧光部分所使用的检测仪内出现的一种荧光部分的光谱发射。
当第一荧光部分和第二荧光部分各自暴露于由激光器发射的相同波长的光下时，用在第一波长范围内发光的第一荧光部分来标记有机基聚硅氧烷，和用在第二波长范围内发光的第二荧光部分来标记含蛋白质的材料，其中第一波长范围基本上不与第二波长范围重叠。
此处所使用的“基本上不重叠”是指选择各荧光染料，以便当通过相同的激光器激发时，其发射光谱具有最小或不具有显著的重叠。在一些非限定性实施方案中，“基本上不重叠”可以是指基于第一波长范围和第二波长范围的全部结合的归一化波长范围，第一波长范围与第二波长范围重叠小于5％，或者小于2％，或者小于1％。例如，当暴露于405nm的紫外激光器下时，可用发射在450nm－650nm范围内不可检测水平的光的Nile Red荧光部分来标记有机基聚硅氧烷，和用发射在340nm－450nm范围内的光的Pacific Blue染料标记含蛋白质的材料。
通过最小化来自用不同荧光部分标记的其他材料的光学背景贡献，这一方法将最大化小量第一荧光标记材料的检测灵敏度。例如，可通过最小化来自荧光标记的有机基聚硅氧烷的光学背景贡献，提高小量标记蛋白质的检测灵敏度。若存在未与周围缓冲液内残留的油滴结合(associated with)的任何游离的标记蛋白质，则这对于检测灵敏度来说是理想的。
现参考单一类型的含蛋白质的材料和单一类型的有机基聚硅氧烷，讨论含蛋白质的材料和有机基聚硅氧烷的标记，但本领域的技术人员要理解使用在显著不同波长下发荧光的部分的相同概念可用于多种含蛋白质的材料和多种有机基聚硅氧烷上。在一些非限定性实施方案中，与蛋白质共轭的荧光部分可选自用紫外(405nm)、蓝(488nm)或红(635nm)激光器激发的部分，只要发射带基本上没有与以上所述的标记有机基聚硅氧烷所选的其他荧光部分或染料的那些重叠即可。
例如，如图11所示，可使用Nile Red标记有机基聚硅氧烷并在宽的范围(450nm－650nm，其最大值在559nm附近)内或575nm－750nm范围激发或发射，以及它们可与蓝色或绿色激光器一起使用。若使用Nile Red标记油，则希望选择在不同的光谱区域内激发并发射的蛋白质用标记物，和使用具有空间分离的激光器的流式细胞计体系进行测量，以获得最优化灵敏度。当用Nile Red标记有机基聚硅氧烷时，标记含蛋白质的材料适合使用的荧光部分的非限定性实例包括基于6,8-二氟-7-羟基香豆素荧光团的Pacific BlueTM染料(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)，它在340nm－450nm的特定范围内，且最大值在403nm附近处激发，且可与紫外激光器一起使用；BD HorizonTM V450(Becton Dickinson)，它在特定范围内(340nm－450nm，且最大值在403nm附近处)激发且可与紫外激光器一起使用；Cyan Fluorescent Protein(CFP)，它在350nm－495nm的特定范围内且最大值在435nm附近处激发且可与紫外激光器一起使用；从Anemonia Majano处得到的AmCyan 108kDa蛋白质(Becton Dickinson)，它在特定范围内(360nm－500nm，且最大值在458nm附近处)激发且可与紫外激光器一起使用；525(Invitrogen Corporation)，它在<300nm到520nm的特定范围内激发且可与紫外激光器一起使用；和545(Invitrogen Corporation)，它在<300nm到540nm的特定范围内激发且可与紫外激光器一起使用。或者，可使用Nile Red标记含蛋白质的材料和可使用以上所述的其他染料之一标记有机基聚硅氧烷。
或者，可通过本领域技术人员公知的各种方式，使用各种亲脂染料，例如1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)、双十八烷基-吲哚碳菁(indocarbocyanine)(DiL)、3,3`-双十八烷基氧基碳菁(carbocyanine)高氯酸盐(DiO)、DiIC18(5)(DiD)、1,1`-双十八烷基-3,3,3`,3`-四甲基吲哚三碳菁(indotricarbocyanine)碘化物(DiR)或任何其他亲脂染料标记有机基聚硅氧烷，具体地利用各种激光器和荧光光谱区域，它们将最小化影响使用光谱其他区域检测荧光标记的蛋白质所要求的任何同时的高灵敏度测量。例如，若使用DiD标记有机基聚硅氧烷(在670nm附近处，红色激光器激发和发射)，则所有激发和发射范围都在可用于检测一种或更多种荧光标记的蛋白质的那些范围之下，从而在标记含蛋白质的材料所使用的发射光谱没有显著重叠的情况下，使得能使用UV、紫外、蓝色或绿色激光器激发的荧光染料。
在一些实施方案中，荧光部分可选自在绿色范围内(525-585nm)的发荧光的部分(通常标记的FL1)，例如FITC异硫氰酸荧光素、Alexa Fluor 488、DyLight 488、GFP Green荧光蛋白质、CFDA-SE二乙酸羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯，PI Phosphoinositide；在橙色范围内(通常FL2)发荧光的部分，例如PE R-Phycoerythrine；在红色范围内(通常FL3)发荧光的部分，PerCP Peridinin Chlorophyll Protein、PE-Cy5R-Phycoerythrin Cyanine 5、PE-Alexa Fluor 700、PE-Cy5.5R-Phycoerythrin Cyanine 5.5；在远红外范围内(通常FL4)发荧光的部分：PE-Alexa Fluor 750、PE-Cy 7；使用红色二极管激光器(635nm)发荧光的部分。
对于扫描的颗粒来说，可使用来自紫外激光器(405nm)、蓝色激光器(488nm)、绿色激光器(532nm)、黄色激光器(561nm)和红色激光器(635nm)激发的荧光染料的正面光散射(FSC，小角光散射)和侧面光散射(SSC，90°光散射)荧光。在一些非限定性实施方案中，根据文献公知的方案(MP 00143,Amine-Reactive Probes,Invitrogen Corporation)，可用Alexa488染料(Invitrogen Corporation，Carlsbad,CA)化学标记含蛋白质的材料。在其他非限定性实施方案中，根据本领域技术人员公知的方法，例如可通过使用获自Invitrogen的合适的商业操作盒，用Pacific BlueTM染料化学标记含蛋白质的材料。为了标记有机基聚硅氧烷，可将Nile Red染料以5mg/ml溶解在有机基聚硅氧烷内。Nile Red，9-二乙基氨基-5-苯并吩嗪-5-酮是极其疏水的染料，其荧光在水中被充分地猝灭。
Pacific BlueTM染料在404nm处具有激发最大值，和在455nm处具有发射最大值，和Nile Red染料在559nm处具有激发最大值，和在637nm处具有发射最大值。Nile Red在紫外激光器波长处基本上不激发，这将最小化来自测量蛋白质颗粒所使用的检测仪内有机基聚硅氧烷的光学背景。相反，当颗粒横穿蓝色激光器时，Pacific BlueTM染料没有激发，从而最小化信号溢出到Nile Red检测仪内。可采用BD FACScanTM流式细胞计分析仪或多激光器BDFACSCantoTM流式细胞计分析仪或BDTMLSR II流式细胞计(Becton,Dickinson andCompany,Franklin Lakes,NJ)，扫描具有化学标记的mAb和染色的有机基聚硅氧烷的悬浮液。
流式细胞法是计数、检测和分类在流体物流内悬浮的微观颗粒的分析方法。它允许同时多参数分析流经光学和/或电学检测装置的单一颗粒的物理和/或化学特征。在流式细胞计中，一个或更多个单色光光束(通常激光器光)聚焦在流体动力学聚焦的含样品的流体物流上。校准多个检测仪到其中物流流经光束的点；其中一个与主要光束在一条直线上(Forward Scatter或FSC)和数个与其(Side Scatter或SSC)和一个或更多个荧光检测仪垂直。根据Mie理论，流经紧密聚焦的光束的每一悬浮颗粒在各方向上散射光，和可使固定到颗粒上的荧光标记物激发，在比光源低的频率下发光。通过检测仪，检测散射和荧光的这一组合。通过分析在每一检测仪处亮度的波动(每一亮度针对各荧光发射峰)，可得到关于每一单独颗粒的物理和化学结构的各类信息。FSC通常与粒度和折射特征很好地相关，且SSC取决于颗粒的尺寸和内部复杂度(即细胞核的形状，颗粒的含量和类型或颗粒粗糙度)。一些流式细胞计形成每一颗粒荧光的图形，散射光并透射光。
流式细胞计每秒能分析数千种颗粒，和多激光器FACS细胞分类器，例如BDFACSAriaTM II和BDTM Influx分类平台(platform)可活跃地分离并分开具有特定性能的颗粒。流式细胞计包括携带并校准细胞的流动池-液体物流(溶液)，以便它们使单一file通过光束以供传感(sensing)；一种或更多种光源，例如汞或氙灯、高功率水冷激光器(氩气、氪气、染料激光器)、低功率空气冷却激光器(氩气(488nm)、红-HeNe(633nm)、绿色-HeNe、HeCd(UV))或二极管激光器(蓝色、绿色、红色、紫外)；产生FSC和SSC以及荧光信号的多检测仪，Analog to Digital Conversion(ADC)体系，线性或对数放大体系，和信号分析用计算机。可以以单一参数直方图(histogram)形式，以二维点图(散射图、密度或轮廓图)形式或甚至以三维等角显示形式，标出通过流式细胞计生成的数据。可画出感兴趣的图形区域，确定感兴趣的群落，和通常通过暗含的Boolean AND逻辑图，以多层门树(hierarchal gate tree)形式结合，其中术语“门”是指在感兴趣的颗粒驻留在其内的一个或更多个结合的感兴趣的区域。当数据具有最多40或50的大的动态范围时，常常以对数标度作图。由于不同的荧光染料的发射光谱重叠，因此，可电学以及计算补偿来自检测仪的信号。然而，尽管这一方法再校准群的中值，但来自起始测量中的光子统计的效果保留，从而导致显著再校准的群内“扩散(spread)”(即，其中来自其他荧光信号的背景贡献显著)。典型地，采用软件，例如BDFACSDiva Software获得数据后，再分析使用流式细胞计获得的数据。
荧光活化的细胞(cell)分类或颗粒分类是流式细胞法的专门类型。它提供颗粒的非均相混合物分类成两种或更多种容器内的方法，其中基于每一细胞的特定的光散射和荧光特征，一次一个细胞。它记录来自单独细胞的荧光信号，且物理分离特别感兴趣的细胞。缩写FACS由Becton Dickinson市售并拥有。
颗粒悬浮液夹带在窄的快速流动的液体物流中心内。布局流动，以便相对于其直径，在颗粒之间平均存在大的分离(Poisson分布)。振动机理引起颗粒物流分成单独的液滴。调节该体系，以便大于一个颗粒在一个液滴内的可能性低。在物流破碎成液滴之前，流体立即流经一个或更多个激光器的交叉点处，在此测量感兴趣的每一颗粒的荧光特征。若要收集颗粒，则在一个或更多个液滴形成和从物流中破碎的时间段期间，施加电荷到流动细胞上。这些荷电的液滴然后下落经过静电偏离体系，基于施加到液滴上的电荷，使液滴转向到目标容器内。
通过使用例如荧光活化的颗粒扫描装置或FACSTM流式细胞计之类的装置，可使用荧光活化的颗粒分类，测定荧光标记的有机基聚硅氧烷和荧光标记的含蛋白质的材料的相对颗粒荧光强度。可将荧光标记的有机基聚硅氧烷的相对强度与荧光标记的含蛋白质的材料的相对强度相比较，并可测定与有机基聚硅氧烷聚集或附聚在一起的含蛋白质的材料量。含蛋白质的材料与有机基聚硅氧烷的“聚集”包括含蛋白质的材料吸附到有机基聚硅氧烷上以及通过有机基聚硅氧烷成核，聚集含蛋白质的材料，且包括有机基聚硅氧烷和含蛋白质的材料之间的任何不可逆的缔合。
可通过荧光活化的颗粒扫描，分析每一溶液，测定颗粒组成。可使用荧光活化的颗粒扫描，分析粒度、形貌和相对颗粒荧光。其他有用的分析包括测定悬浮液的浊度，硅油液滴数量浓度和硅油液滴尺寸分布。可使用PerkinElmer Lambda 35分光光度计(Wellesley,MA)，测定光学密度。在简单且温和搅拌使液滴聚集体解絮凝时，可作为时间和配制条件的函数，在660nm处测量硅油悬浮液的光学密度。在含水滤液中，可测量含蛋白质的材料在280nm处的吸光度，以测定mAb浓度。或者，可采用Coomassie染料结合分析(CoomassiePlusTM Better Bradford Assay Kit,Pierce Biotechnology,Rockford,IL)，测量含蛋白质的材料的浓度。
可使用Coulter LS230激光衍射粒度分析仪(Beckman Coulter,Fullerton,CA)，测量硅油液滴尺寸分布。可测量相对尺寸分布。可在均化之后立即，和在悬浮液制备之后最多2周，作为时间的函数，测量悬浮液的相对尺寸分布。根据硅油液滴的相对尺寸分布和数量浓度，可估计总的硅油表面积。
在一些非限定性实施方案中，可使用FRET(荧光共振能转移或Forster共振能转移)，测定荧光标记的有机基聚硅氧烷和荧光标记的含蛋白质的材料的相对颗粒荧光强度，其中供体荧光部分固定到油上和受体荧光部分固定到蛋白质上。通过使用FRET技术，不会发生来自受体的发射，除非它与油表面极其靠近地接触，这可使得能更加精确地测量。处于激发态下的供体生色团可通过非辐射的长范围偶极-偶极偶联机理，在邻近处(典型地<10nm)转移能量到受体生色团上。为了监控两个分子之间的络合物形成，它们之一用供体标记和另一个用受体标记，和混合这些荧光染料标记的分子。当分子解离时，一旦供体激发，则检测供体发射。另一方面，当由于两个分子之间的相互作用导致供体和受体邻近(1-10nm)时，主要观察到受体发射，因为从供体到受体存在分子间FRET。
在一些非限定性实施方案中，含水悬浮液进一步包括至少一种非离子表面活性剂。该非离子表面活性剂可降低硅油的聚结速度。因此，当非离子表面活性剂存在时，悬浮油滴更长时间地保持在溶液内。
合适的非离子表面活性剂的非限定性实例包括炔类二元醇，烷醇酰胺，烷醇胺，烷基酚类，脂肪酸，脂肪醇，脂肪酯，甘油酯，单十二烷基醚，酚类衍生物，泊洛沙姆、poloxamine、聚氧乙烯酰基醚、聚氧乙烯二醇十二烷基醚、山梨醇、脱水山梨醇衍生物及其混合物。在一些非限定性实施方案中，非离子表面活性剂是选自脱水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯及其混合物中的脱水山梨醇衍生物。在一些非限定性实施方案中，非离子表面活性剂是聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯，例如Tween聚氧乙烯20脱水山梨醇单月桂酸酯，也称为Polysorbate 20。其他有用的聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯包括Polysorbate21、Polysorbate40、Polysorbate60、Polysorbate61、Polysorbate65、Polysorbate80、Polysorbate81、Polysorbate85或Polysorbate120。
在溶液内非离子表面活性剂的用量范围可以是约0.001－约0.5wt％，基于水溶液的总重量。
在一些非限定性实施方案中，含水悬浮液进一步包括至少一种糖。糖可提高有机基聚硅氧烷聚结的速度，以便可获得较少的有机基聚硅氧烷表面积吸引含蛋白质的材料。合适的糖类包括单糖、二糖、三糖、低聚糖及其混合物。合适的糖类的非限定性实例包括蔗糖、乳糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖及其混合物。
溶液内糖的用量范围可以是约0.005-约10wt％，基于水溶液的总重量。
糖和非离子表面活性剂的结合存在可进一步降低含蛋白质的材料的聚集。在一些非限定性实施方案中，该溶液可包括至少一种糖和至少一种非离子表面活性剂，例如聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯和蔗糖，其用量或浓度例如如上所述。
在一些非限定性实施方案中，该方法进一步包括提供荧光标记的有机基聚硅氧烷和荧光标记的含蛋白质的材料的多种含水悬浮液，其中每一含水悬浮液进一步包括选自非离子表面活性剂和糖类中的至少一种聚集抑制剂，其中至少一种聚集抑制剂的浓度在每一含水悬浮液内不同，从而使用荧光活化的颗粒分类，测量每一含水悬浮液内荧光标记的有机基聚硅氧烷和荧光标记的含蛋白质的材料的相对颗粒荧光强度；并针对每一含水悬浮液，比较荧光标记的有机基聚硅氧烷的相对强度与荧光标记的含蛋白质的材料的相对强度。
在一些非限定性实施方案中，该方法进一步包括提供荧光标记的有机基聚硅氧烷和荧光标记的含蛋白质的材料的多种含水悬浮液，其中每一含水悬浮液进一步包括选自非离子表面活性剂和糖类中的至少一种聚集抑制剂，其中至少一种聚集抑制剂在每一含水悬浮液内不同，从而使用荧光活化的颗粒分类，测量每一含水悬浮液内荧光标记的有机基聚硅氧烷和荧光标记的含蛋白质的材料的相对颗粒荧光强度；并针对每一含水悬浮液，比较荧光标记的有机基聚硅氧烷的相对强度与荧光标记的含蛋白质的材料的相对强度。在每一溶液内聚集抑制剂化学不同或者类型不同，例如是不同的糖类和/或不同的非离子表面活性剂。
参考图10，示出了本发明制备和分析有机基聚硅氧烷溶液样品的方法的流程图。可如上所述以及以下实施例A中详细地描述的，制备并分析该溶液。
在一些非限定性实施方案中，该方法进一步包括针对每一含水悬浮液，基于荧光标记的有机基聚硅氧烷的相对强度与荧光标记的含蛋白质的材料的相对强度的比较，选择至少一种聚集抑制剂以供在包括含蛋白质的材料的悬浮液中使用。
在一些非限定性实施方案中，本发明提供在含有机基聚硅氧烷的悬浮液内抑制含蛋白质的材料聚集的方法，该方法包括：(a)提供荧光标记的有机基聚硅氧烷和荧光标记的含蛋白质的材料的多种含水悬浮液，其中每一含水悬浮液进一步包括选自非离子表面活性剂和糖类中的至少一种聚集抑制剂，其中(i)至少一种聚集抑制剂在每一含水悬浮液内不同，或者(ii)聚集抑制剂的用量在每一含水悬浮液内不同；(b)使用荧光活化的颗粒分类，测量在每一含水悬浮液内，荧光标记的有机基聚硅氧烷和荧光标记的含蛋白质的材料的相对颗粒荧光强度；(c)针对每一含水悬浮液，将荧光标记的有机基聚硅氧烷的相对强度与荧光标记的含蛋白质的材料的相对强度相对比；和(d)针对每一含水悬浮液，基于荧光标记的有机基聚硅氧烷的相对强度与荧光标记的含蛋白质的材料的相对强度的比较，选择至少一种聚集抑制剂以供在包括含蛋白质的材料的悬浮液中使用。
通过一种或更多种上述方法，可测定在医疗制品中使用的糖和非离子表面活性剂的合适结合物(及其合适浓度)，所述医疗制品在与包括含蛋白质的材料的溶液接触的表面上使用了有机基聚硅氧烷涂层。
在一些非限定性实施方案中，本发明提供医疗制品，它包括(a)含接收溶液的腔室的容器，其中腔室的内表面在其上具有由含有机基聚硅氧烷的组合物制备的涂层；和(b)包括(i)至少一种含蛋白质的材料，(ii)至少一种非离子表面活性剂与(iii)至少一种糖的溶液。
此处所使用的“医疗制品”是指可用于医药治疗的制品或装置。医疗制品的非限定性实例包括注射器组件、药物操作盒、无针注射器、液体分配器件和液体计量器件。在一些实施方案中，医疗制品是含注射器腔室或筒体的注射器组件(以供接收例如包括含蛋白质的材料的溶液)和密封元件。
可由玻璃、金属、陶瓷、塑料、橡胶或其结合物形成腔室。在一些非限定性实施方案中，由一种或更多种烯烃聚合物，例如聚乙烯、聚丙烯、聚(1-丁烯)、聚(2-甲基-1-戊烯)和/或环状聚烯烃制备腔室。例如聚烯烃可以是脂族单烯烃的均聚物或共聚物，脂族单烯烃优选具有约2－约6个碳原子，例如聚丙烯。在一些非限定性实施方案中，聚烯烃可以是基本上线型，但任选地可含有侧链，例如在常规低密度聚乙烯中所出现的。在一些非限定性实施方案中，聚烯烃为至少50％全同立构。在其他实施方案中，聚烯烃在结构中有至少约90％全同立构。在一些非限定性实施方案中，可使用间同立构聚合物。在一些实施方案中，可使用环状聚烯烃。合适的环状聚烯烃的非限定性实例包括降冰片烯聚合物，例如在美国专利中所公开的Nos.6,525,144、6,511,756、5,599,882和5,034,482(均为Nippon Zeon)，7,037,993、6,995,226、6,908,970、6,653,424和6,486,264(均为Zeon Corp.)，7,026,401和6,951,898(Ttcona)，6,063,886(Mitsui Chemicals)，5,866,662，5,856,414，5,623,039和5,610,253(Hoechst)，5,854,349和5,650,471(Mitsui Petrochemical and Hoechst)以及在"Polycyclic olefins"中所描述的，process Economics Program(July 1998)SRIConsulting，前述每一篇在此通过参考并入。合适的环状聚烯烃的非限定性实例包括获自Mitsui Petrochemical的ApelTM环状聚烯烃，获自Ticona Engineering Polymers的TopasTM环状聚烯烃，获自Zeon Corporation的ZeonorTM或ZeonexTM环状聚烯烃，以及获自Promerus LLC的环状聚烯烃。
聚烯烃可含有小量，通常约0.1－10％通过与合适单体共聚，引入到组合物内的额外的聚合物。可添加这种共聚物到组合物中，以提高最终组合物的其他特征，且这种聚合物可以是例如聚丙烯酸酯，聚苯乙烯和类似物。
在一些非限定性实施方案中，腔室可由聚烯烃组合物构造，所述聚烯烃组合物包括辐射稳定添加剂，以赋予容器辐射稳定性，例如有助于容器辐射稳定性的迁移(mobilizing)添加剂，例如在转让给Becton,Dickinson and Company的美国专利Nos.4959402和4994552中所公开的那些，在此通过参考并入。
与腔室接触的医疗制品中的其他组件是密封元件。密封元件可由任何弹性或塑性材料形成。在医疗器件和药物包装中，在许多重要和关键的应用中使用弹性体。作为一组材料，它们独特的特征，例如挠性、回弹性、延伸性和可密封性证明尤其非常适合于例如导管、注射器尖端、药物小瓶制品、管道、手套和软管之类的产品。典型地在医疗应用中使用三种主要的合成热固性弹性体：聚异戊二烯橡胶、硅橡胶和丁基橡胶。在这三种橡胶当中，丁基橡胶是制品最常见的选择，因为它具有高的清洁度和抗渗透性，这使得橡胶能保护对氧气和水敏感的药物。
可用于本发明方法的合适的丁基橡胶包括异丁烯(约97－98％)和异戊二烯(约2－3％)的共聚物。可用氯或溴来卤化丁基橡胶。合适的丁基橡胶硫化胶可提供由其形成的制品良好的耐磨蚀性，优良的不透气性，高的介电常数，优良的抗老化和阳光性，和优异的振动吸收和振动阻尼质量。合适的橡胶塞体的非限定性实例包括获自于WestPharmaceuticals,American Gasket Rubber,Stelmi,and Helvoet Rubber&PlasticTechnologies BV的那些。
其他有用的弹性体共聚物没有限制地包括热塑性弹性体，热塑性硫化胶，苯乙烯类共聚物，例如苯乙烯-丁二烯(SBR或SBS)共聚物，苯乙烯-异戊二烯(SIS)嵌段聚合物或苯乙烯-异戊二烯/丁二烯(SIBS)，其中在苯乙烯嵌段共聚物内苯乙烯的含量范围为约10％－约70％，和优选约20％－约50％。合适的苯乙烯-丁二烯塞体的非限定性实例获自Firestone Polymers,Dow,Reichhold,Kokoku Rubber Inc.,和Chemix Ltd。其他合适的热塑性弹性体获自例如GLS,Tecknor Apex,AES,Mitsubishi和Solvay EngineeredPolymers。弹性体组合物可没有限制地包括抗氧化剂和/或无机增强剂，以保护弹性体组合物的稳定性。
在一些实施方案中，密封元件可以是例如塞体、O形环、活塞尖端或柱塞。注射器的活塞尖端或柱塞典型地由可压缩的回弹材料，例如橡胶制成，因为橡胶能在活塞和注射器的内壳之间提供密封。注射器活塞，例如在患者的护理和治疗中所使用的其他设备必须满足高性能标准，例如能在活塞和注射器的筒体之间提供紧密的密封的能力。
将有机基聚硅氧烷涂层施加到腔室和/或密封元件的至少一部分滑动表面上。在一些实施方案中，用以下所述的涂层涂布腔室，和密封元件未涂布或者用聚二甲基硅氧烷涂层涂布。在其他实施方案中，密封元件用以下所述的涂层涂布，和腔室未涂布或者用聚二甲基硅氧烷涂层涂布。在其他实施方案中，腔室和密封元件二者均用以下所述的涂层涂布。
用由含一种或更多种有机基聚硅氧烷的组合物制备的涂层涂布腔室和/或密封元件。可通过任何合适的方法，例如浸涂、刷涂、喷涂和类似方法，实现施加涂层到腔室的内表面或者密封元件的外表面上。可纯粹地施加组合物，或者可在溶剂，例如低分子量有机硅、无毒氯化或氟化烃，例如1,1,2-三氯-1,2,2-三氟乙烷，氟利昂或常规的烃溶剂，例如烷烃、甲苯、石油醚和其中认为毒性不严重的类似物内施加组合物。随后通过蒸发除去溶剂。涂层可以是任何方便的厚度，和在实践中，厚度由例如所施加的量，润滑剂的粘度，和施加温度之类的因素决定。由于经济原因，优选以实践中尽可能薄的形式施加涂层，因为较厚的涂层没有实现显著的优势。涂层的确切厚度不是关键的和非常薄的涂层，即1或2微米的涂层显示出有效的润滑性能。尽管对于可操作性来说不是必须的，但希望涂层的厚度基本上均匀。涂层在施加之后，可以部分或全部交联，或者部分交联固定到基底上，然后在随后的时间段内充分交联。
可对涂布的腔室和/或涂布的密封元件进行氧化处理，例如等离子体处理。可在任何常见的真空或大气压等离子体发生设备内进行等离子体处理。可使用任何合适的电离等离子体，例如通过辉光放电或电晕放电生成的等离子体。可由各种气体或其混合物生成等离子体。常用气体包括空气、氢气、氦气、氨气、氮气、氧气、氖气、氩气、氪气和氙气。可使用任何气体压力，例如大气压或5mm Hg或以下，例如约0.1－约1.0mm Hg。在一些实施方案中，例如大气压氧化方法，电离等离子体直接从小的端口引入到腔室内或者通过随后由密封元件密封的开口引入。涂布的密封元件的外表面可类似于电流电晕或等离子体处理方法，直接处理。在其他实施方案，例如真空基设备内，可在涂布的密封元件或者涂布的腔室周围激发等离子体，并允许等离子体扩散到腔室和密封元件特征内。或者，可在敞开的腔室内，通过合适地控制电极位置，激发等离子体。在氧化处理之后，处理过的腔室和/或处理过的密封元件可用同位素(例如γ辐射线)、电子束或紫外辐射线进行热处理或者辐照。或者，可借助烘箱或者射频(RF)，热处理已处理过的腔室和/或处理过的密封元件。在烘箱交联的情况下，温度范围可以是约120℃－约140℃，和在烘箱内的停留时间通常为约30－约40秒，这取决于精确的配方。若使用RF技术，则线圈应当传导足够的热量，以获得约150℃－约200℃的基底表面温度。在这些温度下，固化要求仅仅约2－约4秒。
在一些实施方案中，通过用同位素、电子束或紫外辐射线，至少部分交联涂层。这一技术的优点同样是可用于医疗应用上的灭菌。电离辐射形式的辐射灭菌常常用于医院的医疗器件，例如导管、外科物品和关键的护理工具上。γ辐射线通过氧化生物组织产生杀微生物效果，因此提供简单、快速和有效的灭菌方法。使用或者来自于Co-60(60Co)同位素源或者来自于机器发生的加速电子源的γ射线。当待灭菌的材料在暴露的60Co源周围移动确定的时间段时，实现充分的暴露。医疗制品灭菌最常用的剂量是约5－约100kGy，例如5－50kGy。
在一些实施方案中，可在以上所述的交联的有机基聚硅氧烷涂层上施加厚度为约0.3－10，优选约0.8－4.0μm的表面润滑剂层。表面润滑剂可以是粘度为约100－1,000,000；100－60,000；或优选约1000－12,500cSt的常规的硅油(有机基聚硅氧烷)。可通过以上所述的任何常规的方法，施加表面润滑剂层。施加表面润滑剂的优选方法是通过喷涂表面润滑剂在溶剂，例如氯仿、二氯甲烷或优选氟氯烃，例如FREONTM TF内的约4wt％的溶液或者在其内浸涂注射器筒体。表面润滑剂可任选地通过氧化处理和/或辐射轻度交联。
在其中腔室和密封元件二者均用有机基聚硅氧烷涂布的一些实施方案中，涂布腔室的有机基聚硅氧烷的粘度可以大于涂布密封元件的有机基聚硅氧烷的粘度。例如，涂布腔室的有机基聚硅氧烷的粘度可以是12,500cSt，而涂布密封元件的有机基聚硅氧烷的粘度可以是1000cSt。在其他实施方案中，涂布腔室的有机基聚硅氧烷的粘度可以等于或小于涂布密封元件的有机基聚硅氧烷的粘度。例如，涂布腔室的有机基聚硅氧烷的粘度可以是12,500cSt，而涂布密封元件的有机基聚硅氧烷的粘度可以是100,000cSt。
在一些实施方案中，对涂布的制品进行灭菌处理。当今可获得许多灭菌技术使医疗器件灭菌，消灭活的有机物，例如细菌、酵母、霉菌和病毒。医疗器件所使用的常用的灭菌技术包括高压釜、环氧乙烷(EtO)或γ辐射线，以及最近引入的牵涉低温气体等离子体和气相灭菌剂的体系。
医疗制品的腔室至少部分用含下述的溶液填充，所述溶液包括：(i)至少一种含蛋白质的材料；(ii)至少一种非离子表面活性剂；和(iii)至少一种糖。以上详细地描述了该溶液的组分和用量。一般地，可在填充腔室之前，过滤该溶液，例如通过经0.22微米的过滤器过滤，并在本领域技术人员众所周知的无菌条件下，分配到无菌腔室内。
下述实施例更特别地描述了本发明，这些实施例仅仅阐述本发明，因为在其内的许多改性和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
实施例
实施例A
这一实施例研究了蔗糖和非离子表面活性剂(20聚氧乙烯20脱水山梨醇单月桂酸酯非离子表面活性剂)对traztuzumab单克隆抗体(mAb)聚集和对硅油液滴特征的影响。在这一研究中，没有尝试区分mAb对硅油的吸收与因硅油成核导致的mAb聚集。相反，在硅油和mAb之间任何不可逆的缔合简称为“聚集”。
在这一研究中分析四个配方，如表1详述。通过荧光活化的颗粒扫描，分析每一配方，测定颗粒组成。对于这些配方子组来说，进行比较充分的分析。测量悬浮液浊度、硅油液滴数量浓度和硅油液滴尺寸分布。在过滤之后，在含水滤液中测量traztuzumab的浓度。
通过深入渗析(Pierce Slide-A-Lyzer,3500MWCO)，在10mM乙酸钠，pH5.0内交换重组人类单克隆抗体(rhmAb)(trastuzumab,Genentech,Inc.)的溶液。混合合适体积的蔗糖和/或polysorbate 20(Tween 20)的单独的溶液与纯化的溶液成最终1mg/ml的mAb浓度。如合适的结果部分所述，系统地变化配方添加剂(蔗糖、NaCl和表面活性剂)的浓度。所有化学品为试剂级或更高。
表1
通过高压均化，生成医疗级硅油(约0.5％v/v)在含水缓冲液(10mM乙酸钠，pH5.0)内的悬浮液。添加聚二甲基硅氧烷医疗流体(Dow Corning 360,1000cSt)到含水缓冲液中，并一次通过高压均化器(商购于Avestin,Inc.的Emulsiflex C5Homogenizer)。在均化之后立即通过混合含配方添加剂的mAb溶液与硅油在缓冲液内的悬浮液，生成分析用最终悬浮液。
在改变培育时间段之后，过滤悬浮液(Whatman Anotop 10,0.02μm注射器过滤器)，分离水相和油相。就在过滤之前，保持悬浮液约2分钟，允许油滴在过滤器膜附近沉降。作为测试相分离程度的对照，在用Nile Red染料标记硅油之后，测量含水硝酸盐的荧光。在628nm处不显著的荧光测量证明充分地分离。
采用PerkinElmer Lambda 35分光光度计(Wellesley,MA)，测量两类样品的光学密度。在简单并温和地搅拌，使液滴聚集体解絮凝之后，在660nm处，作为时间和配制条件的函数，测量均匀的硅油悬浮液的光学密度。在含水滤液内，测量在280nm处的mAb吸收度，以测定mAb的浓度。或者，采用Coomassie染料结合分析(Coomassie PlusTM Better BradfordAssay Kit,Pierce Biotechnology,Rockford,IL)，测量mAb浓度。
使用Coulter LS230激光衍射粒度分析仪(Beckman Coulter,Fullerton,CA)，测量硅油的液滴尺寸分布。在均化之后立即，和在悬浮液制备之后最多2周，作为时间的函数，测量悬浮液的相对尺寸分布。根据硅油液滴的相对尺寸分布和数量浓度，估计总的硅油表面积。
可使用荧光活化的颗粒扫描分析粒度、形貌和相对颗粒荧光。通过该技术分析仅仅阈值尺寸(>1μm直径)颗粒。对于扫描颗粒来说，测量正面光散射(FSC,180°光散射)、侧光散射(SSC，90°光散射)、绿色荧光强度(FLl,525-585nm)和红色荧光强度(FL2,585-600nm)根据文献公知的工序(MP 00143,Amine-Reactive Probes,Invitrogen Corporation)，采用Alexa488染料(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)，化学标记trastuzumab分子。为了标记硅油，将Nile Red染料以5mg/ml溶解在硅油内。Nile Red，9-二乙基氨基-5-苯并吩嗪-5-酮是极端疏水的染料，其荧光在水中被充分地猝灭。Alexa488染料的发射最大值为519nm，和Nile Red染料的发射最大值为628nm。采用BD FACScanTM流式细胞计分析仪(Becton,Dickinson and Company,FranklinLakes,NJ)，扫描具有化学标记的mAb和染色的硅油的悬浮液。
trastuzumab与硅油液滴在悬浮液内相互作用的程度取决于配制环境和培育时间。图1A和1B示出了mAb与硅油的缔合。符号是通过起始mAb浓度和滤液内mAb浓度之差测量的三个同样的样品的算术平均。误差柱(bar)代表±1标准偏差。在所有系列中，mAb浓度为1mg/ml。在两个图片中，正方形表示具有0.5M蔗糖、mAb和硅油的配方。在图1A中，三角形表示具有仅仅mAb和油的配方。在图1B中，三角形表示具有0.5M蔗糖、0.005％Tween非离子表面活性剂、mAb和油的配方。
在悬浮、培育和过滤之后，在足够长的培育时间下，具有蔗糖的配方含有比不具有蔗糖的那些配方更高的mAb浓度。因此，存在蔗糖会长时间降低mAb聚集，如图1A所示。图1B比较了在图片1A中所示的具有蔗糖的配方与含有蔗糖和非离子表面活性剂的配方。添加非离子表面活性剂进一步降低mAb与硅油缔合。
通过测量含标记的mAb和标记的硅油的颗粒的荧光强度，可更好地理解配方添加剂对mAb聚集的影响。图2A－2D示出了两个波长带的荧光强度散射图表。在图2A－2D中，FL1强度与Alexafluor 488标记的mAb浓度直接成正比。FL2荧光强度与Nile Red标记的硅油体积直接成正比。FL1和FL2强度大致与粒度成比例，从而包括大于1个数量级的尺寸范围。优化实验设定值，以便在图2A中，mAb和硅油的相对强度相当。对于所有其他配方来说，保持这些设定值(图2B-2D)。因此，在图片内的趋势和之间的比较是有意义的；绝对强度值是没有意义的。坐标轴的单位是任意的。直方图表示颗粒强度分布。直方图的标度范围为0－0.5。图2A－2D描绘了具有1mg/ml mAb和硅油以及下述各种蔗糖与表面活性剂的各种结合物的配方：A没有蔗糖也没有表面活性剂；B：0.5M蔗糖；C0.005％Tween非离子表面活性剂；和D0.5M蔗糖和0.005％Tween非离子表面活性剂。
图2A－2D各自相当于具有表1中相同字母的配方。因此，左面的两个图片(图2A和2C)代表不具有蔗糖的配方。右面的两个图片(图2B和2D)代表含有蔗糖的配方。从顶部到底部，图片表示不含表面活性剂(图2A和2B)和非离子表面活性剂(图2C和2D)。
图2A示出了含有仅仅mAb和硅油的配方的颗粒强渡。散射图表在尺寸数量级方面是线性的(约1－10微米)，从而表明对于不同尺寸的颗粒来说，mAb浓度与硅油体积之比恒定。添加Tween非离子表面活性剂(图2C)没有显著影响FL1或FL2强度。当引入蔗糖到配方中时(右面图片)，荧光强度范围大大地压缩。而且，结合存在蔗糖和Tween非离子表面活性剂大大地降低mAb的聚集：大于一半的颗粒显示可忽略不计的FL1强度(图2D)。在图2B中，多个数据趋势表明两个或更多个不同的颗粒群。
在散射图表中与线性的偏离证明油滴尺寸增加，存在其中颗粒生长不是线性的状况。反而对于基本上相同尺寸的颗粒，出现表面粗糙度差别。尽管不打算束缚于任何理论，但非线性、非球形颗粒生长的一种可行的解释是，在没有立即凝结的情况下，通过添加较小液滴，颗粒生长。这一“乳状液(creaming)”效果产生多-液滴聚集的颗粒。荧光扫描允许测量当颗粒聚集时，抗体/油对颗粒的贡献。
当颗粒尺寸增加时(相应于红色和绿色强度增加)，抗体与油之比通常保持恒定。这支持了下述假设：较小的油滴结合，形成较大的多-液滴颗粒。当液滴聚集形成较大颗粒时，吸附到小的硅油液滴的表面上的抗体分子表明保持与硅油缔合。
图3A－3D是对于相同的四个配方A-D(参见表1)来说，硅油液滴在含有蔗糖与表面活性剂的各种结合物的含水mAb配方(1mg/ml)内的侧面光散射(90°光散射)对正面光散射(180°光散射)的散射图表。正面光散射强度主要受粒度影响，而侧面光散射强度受粒度和表面粗糙度影响。坐标轴单位是任意的。直方图表示颗粒分布。直方图的标度范围为0－0.5。图3A－3D描绘了具有蔗糖和表面活性剂的各种结合物的1mg/ml mAb和硅油的配方：A没有蔗糖也没有表面活性剂；B：0.5M蔗糖；C0.005％Tween非离子表面活性剂；和D0.5M蔗糖和0.005％Tween非离子表面活性剂。如图3B和3D所示，添加蔗糖大大地降低平均粒度(x轴)和表面粗糙度(y-轴)。
图4A和4B中描绘了硅油凝结的相对速度。图4A和4B示出了在具有悬浮化的硅油的mAb配方内光遮蔽的时间依赖性。在简单旋转解絮凝和破乳(decream)悬浮液之后，分析每一配方的样品。归一化每一配方的起始时间点到相同值。符号是三种同样的样品的算术平均和误差柱代表±1的标准偏差。在图4A和4B每一幅图中，mAb的浓度为1mg/ml。在图4A和4B中，正方形表示具有0.5M蔗糖、mAb和硅油的配方。在图4A中，三角形表示具有仅仅mAb和油的配方。图4A比较了有和无蔗糖的含mAb和硅油的配方。如图4A所示，蔗糖提高硅油的凝结速度。在图4B中，三角形表示具有0.5M蔗糖、0.005％Tween非离子表面活性剂、mAb和油的配方。图4B比较了具有蔗糖的配方与具有蔗糖和非离子表面活性剂的配方。如图4B所示，Tween非离子表面活性剂降低硅油的凝结速度。因此，当存在Tween非离子表面活性剂时，悬浮的油滴在溶液内保持时间更长，和当存在蔗糖时，保持时间短。
在每一时间点处估计每一配方内的硅油表面积之后，可计算表面积归一化的mAb聚集(图5A－5B)。图5A－5B每一幅图相当于图1的相同图片，不同在于改性导致硅油表面积不同。符号是在起始mAb浓度与滤液内mAb浓度之差测量的三个同样的样品的算术平均。各差值除以配方-与时间-具体硅油表面积之和。误差柱代表±1的标准偏差。在图5A和5B每一幅图中，mAb的浓度为1mg/ml。在所有图片中，虚线表示单层覆盖率的估计，和正方形表示具有0.5M蔗糖、mAb和硅油的配方。在图5A中，三角形表示具有仅仅mAb和油的配方。在图5B中，三角形表示具有0.5M蔗糖、0.005％Tween非离子表面活性剂、mAb和油的配方。通过归一化硅油表面积，在蔗糖存在下足够长的时间，mAb聚集实际上增加，如图5A所示。在含有蔗糖和Tween非离子表面活性剂的配方中，mAb/油的缔合水平保持低和相对恒定(图5B)。
如上图所示，配方添加剂可影响硅油液滴的凝结，mAb暴露于硅油下的水平和mAb聚集。而且，两种或更多种配方添加剂的结合效果有时比各自单独的效果更显著。具体地，含有蔗糖与Tween非离子表面活性剂二者的配方有效地降低mAb与硅油的缔合，和添加蔗糖到配方中会显著改变硅油液滴的特征。
尽管不希望束缚于任何理论，但认为蔗糖降低mAb与硅油缔合的机理是凝结驱动。在上述实施例中，蔗糖增加硅油凝结速度，如图4A所示。当液滴凝结时，总的硅油表面积下降。由于在具有蔗糖的配方内可获得下降的表面积，因此在足够长的时间内mAb聚集速度下降(图1A)。令人感兴趣的是，蔗糖增加mAb/硅油缔合的程度/硅油表面单位(图5A)。甚至这样，总的聚集速度因提高的凝结得到改进。因此，添加蔗糖到治疗性mAb配方中不仅对mAb的稳定，而且潜在地对降低其暴露于硅油表面是有益的。
添加Tween非离子表面活性剂到含蔗糖的配方中可进一步降低mAb/油的缔合水平。这一效果在短时间内特别明显(图4B)。令人感兴趣的是，通过共同存在蔗糖，提高Tween非离子表面活性剂在抑制mAb/油缔合中的有效性，如图2C和2D所示。在不存在蔗糖的情况下，具有Tween非离子表面活性剂的配方的荧光强度散射图表(图2C)没有显著不同于不具有Tween非离子表面活性剂的配方(图2A)。然而，当蔗糖和非离子表面活性剂均存在于配方内时(图2D)，mAb/油的缔合下降得到提高。
蔗糖和Tween非离子表面活性剂一起防止mAb聚集的机理不同于单独的蔗糖。根据图4B，显而易见的是，添加Tween非离子表面活性剂到含蔗糖的配方中将减慢油的凝结速度。根据液滴尺寸和数量浓度的测量，在均化之后最多2周，悬浮化的硅油表面积保持相对恒定。具有蔗糖和Tween非离子表面活性剂的配方抑制mAb聚集，从而与具有蔗糖但不具有Tween非离子表面活性剂的次最好的配方相比，显示出几乎2倍的聚集下降(图5B)。
由于不具有mAb的硅油悬浮液的光散射点图表几乎与图3和4所示的那些相同，因此，散射图表曲线主要揭露关于硅油液滴特征，亦即絮凝和凝结的信息。受蔗糖驱动的硅油凝结和乳化速度的增加影响这些点状图表。与不具有蔗糖的配方相比，在具有蔗糖的配方中，液滴较小，具有较小的表面复杂度，和具有比较紧密的尺寸范围。
在图3中不具有蔗糖的配方中，限定(constrained)的数据趋势是令人感兴趣的。假设尺寸变化的完好光滑的球形颗粒产生线性趋势，条件是优化校正垂直的光散射。偏离线性的变化表明与球形形状的偏离。尽管不希望束缚于任何理论，但认为在这一研究中观察到的偏离来自于液滴絮凝，但没有直接的凝结。因此，由较小球形液滴组成的大颗粒显示出未与球形颗粒一起存在的表面复杂度。图6是基于正面光和侧面光散射的硅油液滴和聚集分布的假设图表。线性趋势(虚线)来自于变化直径的球形液滴。可通过液滴聚集但没有立即凝结，解释在散射图表曲线中与线性的偏离。
存在液滴始终一致的聚集(即没有快速凝结的絮状物)可解释在这一研究中观察到的其他现象。通过层状流式光遮蔽(可能诱导解絮凝)测量的粒度分布一致地揭露了与通过荧光活化的颗粒扫描测量结果相比，液滴尺寸更加紧密的范围。另外，在不具有蔗糖的许多配方中，mAb浓度与硅油体积之比在宽的粒度范围内相对恒定。在缓慢地凝结的情况下，一旦絮凝，则所吸附的mAb没有必然从硅油表面排出(expel from)。然后mAb浓度可随着硅油聚集体积而不是表面积线性增加。
可通过颗粒单独的群落的存在，解释在FL1相对于FL2散射图表中的细分(divided)趋势。在具有蔗糖的配方中出现这些趋势(图2B)。取决于配制条件，可存在数种颗粒群的结合：在不具有硅油的情况下，mAb聚集，在具有硅油核的情况下，mAb聚集，和在mAb吸附到液滴表面上的情况下，硅油液滴聚集。Mab聚集体的疏水袋(pocket)可使NileRed染料从硅油中剥落。或者，硅油液滴可充当mAb聚集的核。
在硅油存在下，含有蔗糖与Tween非离子表面活性剂的治疗性mAb配方显著降低mAb聚集。具有仅仅蔗糖的配方在较小的程度上降低mAb聚集，这可能由于硅油凝结速度增加所致。由于表明硅油污染诱导蛋白质聚集，因此对于暴露于硅油下的产品来说，降低蛋白质聚集的成功的配制策略可能是重要的。添加蔗糖到治疗性蛋白质配方中可降低蛋白质暴露于硅油表面下。如上述实施例所示，含有蔗糖和非离子表面活性剂的配方可抑制硅油诱导的蛋白质聚集。
实施例B
在悬浮液内，油粘度对油负载的影响
如表2所示，在有和无非离子表面活性剂的情况下，添加医疗级硅油到水溶液中。下表2中列出了在每一样品内，硅油的浓度和粘度。图7通过在600nm处光学密度的测量，间接地示出了油粘度对油负载的影响。在600nm处的光学密度(OD600)是悬浮化的油粘度的间接测量值。如图7和表2所示，较低的油粘度反映较高的起始OD600，这反过来允许较高的油负载。如图8和9所示，对于所测试的样品来说，不同粘度(1000cSt对12,500cSt)的聚二甲基硅氧烷的悬浮油滴的凝结行为不存在定性(qualitative)差别。
表2
实施例C
如以上实施例A所示，通过在硅油内以5mg/ml溶解Nile Red染料，标记硅油。在该研究中所使用的单克隆抗体是标准的可商购的PacificMouse Anti-human CD4mAb(clone RPA-T4,Becton,Dickinson and Company)。Pacific染料的发射最大值为455nm。Nile Red染料的发射最大值为628nm，然而，在R-phycoerythrin(PE)常用的检测仪内出现显著的Nile Red染料发射信号，且是这一实施例C的Nile Red标记的样品所使用的发射检测仪。如以上实施例A所示，制备具有Pacific标记的mAb和Nile Red标记的硅油的悬浮液，并采用BD TM LSR II Flow Cytometer分析仪(Becton,Dickinson andCompany)，针对Pacific检测(450/50BP滤光器)，采用紫外激光器激发(405nm)，和针对Nile Red检测(585/42BP滤光器)，采用蓝色激光器激发(488nm)，从而进行分析。使用脉冲区域，进行所有的荧光测量，以确保针对每一颗粒测量总的荧光。为了合适地表明在宽的动态范围内的荧光分布(40多)，并允许合适地显示0和负值，在BD Diva Software中使用双指数转换(Logicle,DR Parks,WA Moore,Stanford University)。
标记的CD3抗体与硅油液滴在悬浮液内相互作用的程度取决于配制环境和培育时间。图12A－12D示出了mAb与未标记的硅油和用Nile Red标记的硅油二者的缔合。在含有mAb的所有样品中，mAb的浓度为2μg/ml。
现参考图13A和13B，作为Nile Red信号的函数，来自标记的mAb的Pacific信号的斜率(图13B)非常接近于作为体积的函数，表面积的理想理论值(图13A)。理论上，对于完美的球形来说，表面积与体积的斜率为102/3(100.667)，和所观察到的斜率为100.603，这与在油滴或颗粒外部上存在mAb的预期一致，这与在油颗粒的内部捕获或分布相反。若mAb以线性方式随Nile Red标记的油滴一起分布，则在对数图表上或者在双指数显示的对数部分上，斜率几乎为1.0。
图14A和14B示出了非离子表面活性剂对硅油颗粒与mAb颗粒相分离和硅油与mAb颗粒聚集的影响。图14A是对于用Nile Red染料标记的硅油样品和本发明用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体样品来说，用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表。图14B是对于用Nile Red染料标记的硅油样品、本发明用Pacific BlueTM染料和0.03％Tween聚氧乙烯20脱水山梨醇单月桂酸酯非离子表面活性剂标记的CD3抗体样品来说，用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表。在数字基线校正之后，相对荧光值基本上合计为分数且表明信号强度，其中不具有可检测信号的群具有接近于0的中心趋势和一半的负值与一半的正值，双指数转换是归一化转换的变化，它允许基于最模糊的群(dimmest population)的变化、log的平稳过渡(transition)和相当于标准对数标尺的大多数显示范围，在标尺的低端显示0和负值。如图14B所示，Tween非离子表面活性剂有效地抑制mAb/油缔合。
图15A和15B示出了非离子表面活性剂对硅油颗粒与mAb颗粒相分离和硅油与mAb颗粒聚集的影响。图15A是对于用Nile Red染料标记的硅油样品和本发明用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体样品来说，用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表。图15B是对于用Nile Red染料标记的硅油样品、在将标记的蛋白质暴露于油滴下之后添加的本发明用Pacific BlueTM染料和0.03％Tween聚氧乙烯20脱水山梨醇单月桂酸酯非离子表面活性剂标记的CD3抗体样品来说，用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表。如图15B所示，Tween 非离子表面活性剂有效地抑制mAb/油缔合。
图16A－16D示出了非离子表面活性剂、盐和糖对硅油颗粒与mAb颗粒相分离和硅油与mAb颗粒聚集的影响。图16A是对于用Nile Red染料标记的硅油样品和本发明用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体样品来说，用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表。图16B是对于用Nile Red染料标记的硅油样品、本发明用Pacific BlueTM染料和150mM NaCl盐标记的CD3抗体样品来说，用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表。通过图16A(不具有盐的配方)和16B(具有盐的配方)的比较表明，存在NaCl盐没有抑制mAb/油缔合。
图16C是对于用Nile Red染料标记的硅油样品、本发明用Pacific BlueTM染料和0.5M蔗糖标记的CD3抗体样品来说，用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表。通过图16A(不具有蔗糖的配方)和16C(具有蔗糖的配方)的比较表明，存在蔗糖没有抑制mAb/油缔合。
图16D是对于用Nile Red染料标记的硅油样品；本发明用Pacific BlueTM染料、0.5M蔗糖、150mM盐和0.03％Tween聚氧乙烯20脱水山梨醇单月桂酸酯非离子表面活性剂标记的CD3抗体样品来说，用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表。通过图16A(不具有盐、蔗糖或非离子表面活性剂的配方)和16D(具有盐、蔗糖和Tween非离子表面活性剂的配方)的比较表明，存在盐、蔗糖和Tween非离子表面活性将抑制mAb/油缔合。
在荧光活化的颗粒扫描中，电子脉冲窗是计时窗(窗门)，它允许信号在规定的时间框架内加工。通常在数据获取过程中，它在守恒的恒定值下设定(根据制造商关于特定仪器的说明，常常比最小要求的长数微秒)，以确保脉冲的完全一体化。对于有和无非离子表面活性剂的样品来说，在10μs和2μs处评价降低时间到仅仅完全一体化信号所要求的时间对最终校正体系的影响(通过调节窗延长期)。图17A是根据本发明，对于用Nile Red染料标记的硅油样品，以及用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体样品来说，在10μs的窗延长期下测量的用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表。图17B是根据本发明，对于用Nile Red染料标记的硅油样品，用Pacific BlueTM染料和0.03％Tween聚氧乙烯20脱水山梨醇单月桂酸酯非离子表面活性剂标记的CD3抗体样品来说，在10μs的窗延长期下测量的用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表。图17C是根据本发明，对于用Nile Red染料标记的硅油样品，以及用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体样品来说，在2μs的窗延长期下测量的用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对Nile Red标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表。图17D是根据本发明，对于用Nile Red染料标记的硅油样品，用Pacific BlueTM染料和0.03％Tween聚氧乙烯20脱水山梨醇单月桂酸酯非离子表面活性剂标记的CD3抗体样品来说，在2μs的窗延长期下测量的用Pacific BlueTM染料标记的CD3抗体的相对荧光强度(y-轴)对NileRed标记的硅油的相对荧光强度(x-轴)的图表。通过图17A和17C，以及图17B和17D分别比较表明，降低窗延长期从10μs到2μs将降低这两种染料尺寸变化的群系数(CV)。
参考本发明的特定实施方案的具体细节，描述了本发明。这些细节不打算视为限制本发明的范围，除非它们包括在所附权利要求内。

Claims (7)

1.在含有机基聚硅氧烷的悬浮液内含蛋白质的材料的聚集的评价方法，该方法包括：
(a)提供荧光标记的有机基聚硅氧烷和荧光标记的含蛋白质的材料的含水悬浮液，其中所述荧光标记的有机基聚硅氧烷的有机基聚硅氧烷的粘度为100-1000000cSt；
(b)使用荧光活化的颗粒分类(sorting)，测量荧光标记的有机基聚硅氧烷和荧光标记的含蛋白质材料的相对颗粒荧光强度；和
(c)比较荧光标记的有机基聚硅氧烷的相对强度与荧光标记的含蛋白质材料的相对强度，
其中含水悬浮液进一步包括至少一种非离子表面活性剂；
含水悬浮液进一步包括至少一种糖；
所述非离子表面活性剂和糖作用为聚集抑制剂。
2.权利要求1的方法，其中荧光标记的含蛋白质的材料包括至少一种含蛋白质的材料，所述含蛋白质的材料是单克隆抗体。
3.权利要求1的方法，其中用发射在第一波长范围内的光的第一荧光部分来标记有机基聚硅氧烷，和用发射第二波长范围内的光的第二荧光部分来标记含蛋白质的材料，其中第一荧光部分和第二荧光部分各自暴露于激光器发射的相同波长的光下，其中第一波长范围基本上不与第二波长范围重叠。
4.权利要求1的方法，其中用Nile Red荧光部分来标记有机基聚硅氧烷，所述Nile Red荧光部分发射在450nm－650nm范围内不可检测水平的光，和用Pacific Blue染料来标记含蛋白质的材料，所述Pacific Blue染料当暴露于405nm的紫外激光器下时发射在340nm－450nm范围内的光。
5.权利要求1的方法，进一步包括提供荧光标记的有机基聚硅氧烷和荧光标记的含蛋白质的材料的多种含水悬浮液，其中每一含水悬浮液进一步包括选自非离子表面活性剂和糖类中的至少一种聚集抑制剂，其中至少一种聚集抑制剂的浓度在每一含水悬浮液中不同；使用荧光活化的颗粒分类，测量在每一含水悬浮液内，荧光标记的有机基聚硅氧烷和荧光标记的含蛋白质的材料的相对颗粒荧光强度；和对于每一含水悬浮液，比较荧光标记的有机基聚硅氧烷的相对强度与荧光标记的含蛋白质的材料的相对强度。
6.在含有机基聚硅氧烷的悬浮液中抑制含蛋白质材料聚集的方法，该方法包括：
(a)提供荧光标记的有机基聚硅氧烷和荧光标记的含蛋白质的材料的多种含水悬浮液，其中每一含水悬浮液进一步包括选自非离子表面活性剂和糖类中的至少一种聚集抑制剂，其中(i)至少一种聚集抑制剂在每一含水悬浮液中不同，或者(ii)聚集抑制剂的用量在每一含水悬浮液中不同，且其中所述荧光标记的有机基聚硅氧烷的有机基聚硅氧烷的粘度为100-1000000cSt；
(b)使用荧光活化的颗粒分类，测量在每一含水悬浮液内，荧光标记的有机基聚硅氧烷和荧光标记的含蛋白质的材料的相对颗粒荧光强度；
(c)对于每一含水悬浮液，比较荧光标记的有机基聚硅氧烷的相对强度与荧光标记的含蛋白质的材料的相对强度；和
(d)对于每一含水悬浮液，基于荧光标记的有机基聚硅氧烷的相对强度与荧光标记的含蛋白质的材料的相对强度的比较，选择在包含含蛋白质的材料的悬浮液中使用的至少一种聚集抑制剂；
其中所述聚集抑制剂由非离子表面活性剂和糖类组成。
7.一种医疗制品，它包括：
(a)含接收溶液的腔室的容器，其中腔室的内表面在其上具有由含有机基聚硅氧烷的组合物制备的涂层，其中所述有机基聚硅氧烷的粘度为100-1000000cSt；和
(b)包括(i)至少一种含蛋白质的材料，(ii)至少一种非离子表面活性剂与(iii)至少一种糖的溶液。
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