ES2285507T3

ES2285507T3 - Procedimiento y dispositivo para la determinacion de cantidades de particulas muy pequeñas.

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Publication number: ES2285507T3
Application number: ES04766754T
Authority: ES
Inventors: Constantin Odefey
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-09-25
Filing date: 2004-09-09
Publication date: 2007-11-16
Anticipated expiration: 2024-09-09
Also published as: NO338340B1; JP2007506954A; DE10344924A1; PT1664747E; NO20061824L; IL174032A0; WO2005031325B1; NZ546029A; JP4959330B2; HRP20060118A2; MXPA06003324A; DK1664747T3; SI1664747T1; AU2004276506B2; KR100802449B1; CN1853096A; BRPI0414784B8; PL1664747T3; US20070054417A1; EP1664747B1

Abstract

Procedimiento para la determinación del cantidades de partículas, en el margen femto y attomolar, para la detección de precipitados anticuerpo-antígeno, que comprende: preparación de un fluido de muestra, el cual contiene esencialmente partículas con un tamaño de partícula máximo determinado, presentando las partículas por lo menos dos puntos de unión de anticuerpo; preparación de un fluido que contiene anticuerpos, el cual contiene esencialmente partículas con un tamaño de partícula máximo determinado; contacto del fluido de muestra con el fluido que contiene el anticuerpo, obteniéndose un fluido de reacción, pudiendo formar el anticuerpo, en presencia de una partícula con por lo menos dos puntos de unión de anticuerpo, un precipitado antígeno-anticuerpo; conducción de un rayo de luz a través del fluido de reacción; detección de una señal mediante una medición de extinción en el límite claro-oscuro del cono de luz, el cual se forma durante el paso de la luz generada por el láser a través de la cámara de medición que contiene el fluido de reacción, mediante un fotodetector, dependiendo la intensidad de la señal del tamaño y el número de los precipitados antígeno-anticuerpo formados, y determinándose el número y el tamaño de las partículas mediante la medición del tiempo de transición.

Description

Procedimiento y dispositivo para la determinación de cantidades de partículas muy pequeñas.

La presente invención proporciona un procedimiento y un dispositivo para la determinación de cantidades de partículas en el margen femto y attomolar mediante la detección de productos de reacción antígeno-anticuerpo.

En el estado de la técnica se conocen diferentes procedimientos para la determinación de pequeñas cantidades de partículas, por ejemplo procedimientos nefelométricos y turbimétricos, así como procedimientos designados como dynamic-light-scattering (DLS).

En los procedimientos nefelométricos y turbimétricos se aprovecha el efecto Tyndall, en el cual la iluminación de una pequeña partícula desencadena una luz difusa de gran ángulo. La dispersión de la luz se puede averiguar o bien mediante medición de la disminución de la intensidad del rayo de luz incidente tras el paso a través del medio dispersor o mediante determinación de la intensidad de la luz desviada lateralmente. En el primer caso se habla del método de turbidimetría o medición de la extinción y en el segundo caso de una nefelometría propiamente dicha o de una tyndalometría.

Otra forma de actuar distinta la ofrecen los procedimientos que se designan como procedimientos dynamic-light-scaterring (DLS). En estos procedimientos se observa únicamente un (o unos pocos) punto(s) sobre la bola de luz que comprende la partícula y se evalúa además la modulación de luminosidad provocada por el movimiento molecular browniano. Mediante enfoque sobre un volumen de observación ínfimo se intenta reducir las superposiciones de luz difusa perturbadoras de varias partículas. Como consecuencia de ello, una partícula recorre un volumen iluminado ínfimo muy rápido, de manera que el dispositivo optoelectrónico encargado de la evaluación tiene que reconocer frecuencias de fluctuación notables. Durante el complejo procesamiento de señal se dispone de muchas informaciones, de manera que estos sistemas se pueden utilizar, únicamente de manera condicionada, para el análisis cuanti-
tativo.

Gracias, por ejemplo, a las patentes US nº 5.534.441 y US nº 5.100.805 se conocen procedimientos en los cuales se utiliza la agregación de partículas mediante unión antígeno-anticuerpo para la medición de un cuerpo que hay que analizar. También se conocen, asimismo gracias a la patente US nº 5.534.441, métodos ópticos para la detección de los cuerpos formados al mismo tiempo y que contienen dispersión de luz y también mediciones de transmisión.

Se conocen además procedimientos los cuales determinan el tamaño de una partícula en solución mediante el tiempo de difusión en un cono de luz pequeño (EIGEN M ET AL: "SORTING SINGLE MOLECULES: APPLICATION TO DIAGNOSTICS AND EVOLUTIONARY BIOTECHNOLOGY", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE, WASHINGTON, US, Tomo 91, junio de 1994 (1994-06), páginas 5740-5747).

Los procedimientos de determinación del estado de la técnica adolecen, asimismo, de otros inconvenientes. En primer lugar se menciona que, a pesar de que la sensibilidad de determinación de los procedimientos descritos con anterioridad ha aumentado fuertemente en los últimos años, continua existiendo en diferentes campos una gran necesidad de procedimientos de determinación con una mayor sensibilidad. Además, los procedimientos de determinación del estado de la técnica exigen cantidades de muestra todavía comparativamente grandes lo que, en especial en el caso de procedimientos de técnica médica, puede estar relacionado con molestias para la persona que es sometida a exploración.

La presente invención se plantea, por lo tanto, el problema de proponer un procedimiento para la determinación de pequeñas cantidades de partículas, el cual presente una mayor sensibilidad que los procedimientos del estado de la técnica. Además, un procedimiento de este tipo debería exigir una menor dilución de la muestra y/o una menor cantidad mínima de muestra, ser adecuado para la realización de análisis de muestras a gran escala y, tras un período de formación sencillo, poder ser realizado también por colaboradores que no tengan conocimientos previos especiales. Otro problema que se plantea además la invención es proponer un dispositivo para la determinación de pequeñas cantidades de partículas.

Este problema se resuelve mediante la propuesta de un procedimiento para la determinación de cantidades de partículas, en el margen femto y attomolar, mediante la detección de precipitados antígeno-anticuerpo, el cual comprende: preparación de un fluido de muestra, el cual contiene esencialmente partículas con un tamaño de partícula máximo determinado, presentando las partículas por lo menos dos puntos de unión de anticuerpo; preparación de un fluido que contiene anticuerpos, el cual contiene esencialmente partículas con un tamaño de partícula máximo determinado; contacto del fluido de muestra con el fluido que contiene el anticuerpo, obteniéndose un fluido de reacción, pudiendo formar el anticuerpo, en presencia de una partícula con por lo menos dos puntos de unión de anticuerpo, un precipitado antígeno-anticuerpo; conducción de un rayo de luz a través del fluido de reacción; detección de una señal mediante una medición de extinción en el límite claro-oscuro del cono de luz, el cual se forma durante el paso de la luz generada por el láser a través de la cámara de medición que contiene el fluido de reacción, mediante un fotodetector, dependiendo la intensidad de la señal del tamaño y el número de los precipitados antígeno-anticuerpo formados, y determinándose el número y el tamaño de las partículas mediante la medición del tiempo de transición.

Además, la presente invención propone un kit para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de una partícula específica que hay que determinar, presentando la partícula específica por lo menos dos puntos de unión de anticuerpo, comprendiendo el kit: por lo menos un anticuerpo, que puede unirse específicamente con la partícula determinada, y por lo menos un fluido adecuado para acoger la muestra, y un dispositivo para la detección de pequeñas cantidades de partículas, el cual presenta: un láser, una cámara de medición, y un fotodetector, el cual está diseñado para la realización de una medición de extinción en el límite claro-oscuro del cono de luz, el cual se forma durante el paso de la luz generada por el láser a través de la cámara de medición que contiene las partículas en un fluido, estando dispuesto el fotodetector de tal manera con respecto al láser, que el rayo láser pasa justo por delante del fotodetector.

Breve descripción de las figuras

Las Figs. 1a-d ponen de manifiesto, de forma esquemática, los procesos para la formación de un precipitado antígeno-anticuerpo mediante la utilización de un anticuerpo bivalente.

La Fig. 2a muestra un resultado de una detección mediante la utilización del procedimiento según la invención, en el cual se analizó un fluido de muestra que contiene una partícula tras filtración con un filtro con un tamaño de poro de 200 nm (antes de la adición de anticuerpo). Las señales corresponden a partículas cuyo diámetro es menor que el tamaño de filtro utilizado. El eje x indica el tamaño de las partículas y el eje y el número de partículas.

La Fig. 2b muestra un resultado de una detección, siendo analizada la mezcla reactiva, que se obtiene tras una inyección separada simultánea de soluciones del fluido de muestra, filtradas con un filtro con un tamaño de poro de 200 nm, y el fluido de anticuerpo. En esta mezcla reactiva tiene lugar una reacción y se forman microprecipitaciones las cuales presentan un diámetro el cual es mayor que el tamaño de poro de filtro utilizado. El eje x indica el tamaño de las partículas y el eje y el número de partículas.

La Fig. 3 muestra un dibujo esquemático de una instalación para la realización del procedimiento según la invención.

En el transcurso de los innumerables intentos que condujeron a la presente invención, se consiguió preparar un procedimiento, en el cual la sensibilidad está, un factor 1000, por encima de la sensibilidad de procedimientos comparables del estado de la técnica. Este fuerte aumento de la sensibilidad se basa en un procedimiento de detección modificado físicamente en el cual la detección de la señal tiene lugar mediante una medición de extinción en el límite claro-oscuro del cono de luz, el cual se forma durante el paso de la luz generada por el láser a través de la cámara de medición que contiene el fluido de reacción, con un fotodetector en combinación con preparación de muestra analítica adaptada a ello.

Además, la presente invención posibilita una reducción del volumen de la cámara de medición en aproximadamente un factor 30 a 50. Mientras en procedimientos del estado de la técnica se necesitan volúmenes de cámara de medición en el margen de, por ejemplo, 1,6 ml, en el procedimiento según la invención se pueden utilizar cámaras de medición con un volumen en el margen de los microlitos (por ejemplo, 40 \mul). Esto proporciona una notable ventaja dado que para muestra debe ser diluida para la obtención de una matriz uniforme la cual, por ejemplo, presente la misma transparencia, viscosidad, etc., de manera que en un procedimiento según la invención, en comparación con procedimientos del estado de la técnica, una muestra debe ser diluida menos.

Además, con el procedimiento según la invención se consigue reducir la cantidad mínima de muestra que se necesita. Mientras que procedimientos según el estado de la técnica necesitan más de 100 \mul, bastan en el caso del procedimiento según la invención cantidades de muestra varias veces inferiores (por ejemplo 3,5 \mul).

El término "partícula" designa, en la presente solicitud, cualquier formación tridimensional que tiene un índice de refracción diferente al del medio portador.

El término "precipitación" describe, en la presente solicitud, el proceso que, durante una reacción de antígeno soluble con anticuerpos específicos, tiene como resultado una formación de un complejo antígeno-anticuerpo, el cual presenta una solubilidad menor en el disolvente utilizado que el antígeno utilizado o los anticuerpos utilizados lo que, en primer lugar, conduce a un enturbiamiento de la mezcla reactiva y, a continuación, a una sedimentación de este complejo antígeno-anticuerpo.

El procedimiento según la invención posibilita la determinación de pequeñas cantidades de partículas. Por ejemplo, en el caso de sustancias de bajo peso molecular, es decir en sustancias con un peso molecular de menos de 500 g/mol, se podría alcanzar, en caso de utilización del procedimiento según la invención, un límite de determinación en el margen de femto y atto-gramos por litro, mientras que el límite de determinación estaba hasta ahora usualmente en el margen de micro, nano o picogramos por litro. En el caso de sustancias con un peso molecular en el margen de más de 500 g/mol, el límite de determinación es más alto, por ejemplo en sustancias con un peso molecular de 150.000 g/mol (p. ej. anticuerpos IgG) el límite de determinación está aproximadamente en 300 femtog/l. Esto significa que el fluido de muestra puede contener partículas con un orden de magnitud de femto o atto-moles por litro.

En un primer paso parcial del procedimiento según la invención tiene lugar la preparación de un fluido de muestra, el cual contiene esencialmente partículas con un tamaño de partícula máximo determinado. Esto se puede lograr, por ejemplo, por dos caminos. De acuerdo con una primera variante se prepara para ello, en primer lugar, un fluido, el cual contiene, en esencial, únicamente partículas con un tamaño de partícula máximo determinado y, a continuación se añade al fluido una muestra, la cual contiene esencialmente partículas con un tamaño de partícula máximo determinado. De acuerdo con una segunda variante, el fluido de muestra se puede obtener gracias a que, en primer lugar, se prepara un fluido, se añade una muestra al fluido y, a continuación, se separan partículas las cuales superan un tamaño de partícula determinado.

El tamaño de partícula máximo de las partículas en el fluido de muestra o en otros fluidos, los cuales contienen, en esencia, únicamente partículas con un tamaño de partícula máximo determinado, se puede elegir dependiendo de la utilización deseada. En caso de una utilización de muchos anticuerpos habituales puede tener lugar la separación de partículas las cuales son mayores que 20 - 450 nm, más preferentemente mayores que 100 - 300 nm, en particular mayores que 200 nm. Una separación de este tipo puede tener lugar, por ejemplo, mediante filtros con un tamaño de poro correspondiente adecuado de 20 - 450 nm, más preferentemente mayores que 100 - 300 nm, en especial de 200 nm o mediante procedimientos conocidos para un especialista en la materia. Si la aglutinación se considera, de forma aproximada, como superficie, entonces la reducción a la mitad del tamaño de filtro influye de forma cuadrática con respecto al número de moléculas, que suministra productos de reacción determinables. En caso de que, por ejemplo, se utilice un filtro de 100 nm en lugar de uno de 200 nm, entonces se necesita únicamente una cuarta parte de las moléculas antígeno-anticuerpo necesarias en caso de utilización de un filtro de 200 nm, las cuales deben reaccionar entre sí para obtener un resultado detectable. Además existe, por ejemplo en caso de utilización de filtros de 25 nm, la posibilidad de determinar trímeros antígeno-anticuerpo-antígeno. En caso de utilización de filtros con un tamaño de poro pequeño de este tipo hay que poner atención a la realización de un trabajo cuidadoso, dado que ya unas pocas moléculas conducen a una reacción detectable.

Para que pueda desarrollarse una reacción de reticulación, las partículas contenidas en el fluido de muestra deben disponer por lo menos de dos puntos de unión de anticuerpos y pueden actuar por consiguiente como antígeno. Las Figs. 1a a d muestran, de forma esquemática, que sustancias o partículas extrañas al cuerpo, como por ejemplo bacterias, virus, toxinas, proteínas, actúan como antígenos y reaccionan con un anticuerpo según el "principio llave-cerradura" (Fig. 1b). Un anticuerpo bivalente, como por ejemplo anticuerpo IgG, une al mismo tiempo dos antígenos (Fig. 1c). Dado que cada antígeno pueden unir varios anticuerpos, tiene lugar con ello una reticulación (precipitación) la cual es detectada durante el procedimiento según la invención (Fig. 1d). Para anticuerpos con una valencia mayor tiene lugar una precipitación de forma análoga. Si el antígeno utilizado proporciona un número mayor de puntos de unión de anticuerpos, esto ofrece la ventaja de que de este modo se puede asegurar mejor el desarrollo de una reacción de reticulación.

El procedimiento según la invención es adecuado para antígenos discrecionales, en la medida en que dispongan de por lo menos dos puntos de unión de anticuerpo. Preferentemente las partículas analizadas deberían ser mayores de aproximadamente 10 nanometros y deberían ser al mismo tiempo más pequeñas que el tamaño máximo de partícula seleccionado. Las moléculas que son menores que 10 nm pueden actuar como haptenos. Los haptenos son antígenos incompletos, es decir, su tamaño molecular no es suficiente como para desencadenar una respuesta inmune, respectivamente, causar una aglutinación. Estas sustancias de bajo peso molecular si bien son altamente específicas en el punto de unión paratope del anticuerpo, no sobresalen suficientemente lejos de este punto de unión para que se pueda conectar un segundo anticuerpo a él. Bloquean al correspondiente anticuerpo, sin que pueda producirse una reacción de reticulación. Los antígenos de mayor tamaño, como por ejemplo las bacterias, deben ser desintegrados química o físicamente antes de la medición, lo que puede tener lugar mediante diferentes procedimientos conocidos para el especialista en la materia como, por ejemplo, mediante tratamiento con ultrasonido, ácidos, lejías, agentes tensioactivos. Esto ofrece la ventaja de que de este modo se pueden obtener de una sola bacteria decenas de fragmentos y que ya no es necesario dejar que aglutinen entre sí bacterias individuales. Las fragmentos obtenidos de esta manera, por ejemplo proteínas superficiales, representan de nuevo antígenos menores y pueden provocar, con los anticuerpos adecuados, una reacción que se puede medir específicamente.

Además, el antígeno debería ser soluble esencialmente en el tampón utilizado y debería tener únicamente una pequeña inclinación a la absorción en las paredes de los dispositivos y filtros utilizados.

El procedimiento según la invención comprende además la preparación de un fluido que contiene un anticuerpo.

En el procedimiento según la invención se podrían utilizar en principio todos los anticuerpos que se desee. Los anticuerpos, que han demostrado ser especialmente ventajosos para la realización del procedimiento según la invención son, por ejemplo, la inmunoglobulina G bivalente (IgG), o la inmunoglobulina M decavalente (IgM). De acuerdo con un procedimiento conocido para el especialista en la materia, se pueden obtener con ello anticuerpos con una especificidad determinada. Se pueden utilizar además, dependiendo del tipo de la partícula que hay que determinar, también otros anticuerpos los cuales pertenecen a otra clase de anticuerpos. Al mismo tiempo los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. En caso de utilización de anticuerpos monoclonales se pueden utilizar dos anticuerpos monoclonales, dirigidos a antígenos diferentes, para causar una precipitación. Como se ha mencionado con anterioridad con respecto al antígeno, el anticuerpo debería ser esencialmente soluble en el tampón utilizado y tener una pequeña inclinación a la adsorción a las paredes de los dispositivos y filtros utilizados.

En el procedimiento según la invención se puede evitar un exceso demasiado fuerte de antígeno o anticuerpo indeseado de diferentes maneras, por ejemplo mediante la realización de series de dilución adecuadas. Un exceso de antígeno o anticuerpo demasiado fuerte de este tipo podría conducir a una inhibición de precipitación (a un así llamado "efecto de prozonas"), debido a que en caso de un fuerte exceso de anticuerpos cada epitope (punto de unión de antígeno) une únicamente un único anticuerpo de forma monovalente y ya no es posible una reticulación cruzada, o dado que en el caso de una exceso excesivamente fuerte de antígeno con frecuencia el trímero es formado por una molécula de anticuerpo y dos moléculas de antígeno.

Como fluido, tanto para la fabricación del fluido de muestra como también para la fabricación de fluido que contiene el anticuerpo, se puede utilizar fundamentalmente cualquier gas o cualquier líquido. Preferentemente, el fluido es un líquido. Frecuentemente se trata en el caso del líquido de agua o se soluciones tampón conocidas en el estado de la técnica, como por ejemplo PBS (phosphate buffered saline, solución de sal tamponada con fosfato), en especial cuando el procedimiento de análisis se basa en una reacción bioquímica. Fundamentalmente puede tratarse, en el caso del líquido también de otro líquido transparente, por ejemplo de hidrocarburos, ácidos o lejías.

En el procedimiento según la invención se hace entrar en contacto, en un paso siguiente, el fluido de muestra con el fluido que contiene el anticuerpo, pudiendo formar el anticuerpo en presencia de un antígeno un precipitado antígeno-anticuerpo, el cual se puede determinar por ejemplo con el dispositivo según la invención.

Además es, sin embargo, de gran interés averiguar la presencia de haptenos en una muestra. Los haptenos son antígenos incompletos, es decir, que son demasiado pequeños como para unir más de un anticuerpo. Los haptenos pueden ser, en especial, fármacos, drogas, pesticidas, sustancias dañinas para el medio ambiente, hormonas esteroides o micotoxinas. Los haptenos se unen de manera específica a anticuerpos. Sin embargo, bloquean únicamente el punto de unión paratope del anticuerpo, sin que pueda tener lugar una reacción en cadena. El tamaño mínimo para inmunógenos (antígenos completos) es de 5 a 10 kDa, es decir > 30 restos de aminoácido, es decir > 3 nm de longitud, dado que a partir de este tamaño se pueden acoplar por lo menos dos moléculas de anticuerpo a estos antígenos con puntos de unión epitope correspondientemente existentes y desencadenar una reacción en cadena, la cual conduce de manera múltiple a una precipitación.

Una determinación de haptenos puede tener lugar, por ejemplo, con Multispacer macromoleculares hidrófilos (hmM) o con compuestos afines, conocidos para el especialista en la materia. Los Multispacer macromoleculares hidrófilos son conocidos en el estado de la técnica y comprenden una macromolécula hidrófila, como por ejemplo albúmina. A esta macromolécula hidrófila se acoplan químicamente, con Spacer conocidos en el estado de la técnica, las mismas moléculas de hapteno o diferentes moléculas de hapteno. En caso de que un Multispacer macromolecular hidrófilo presente por lo menos dos moléculas de hapteno iguales, entonces puede ser utilizado para una precipitación. Una molécula de este tipo se puede utilizar para un test de búsqueda de anticuerpos, el cual se base en una reacción de desplazamiento. En el caso de los haptenos existe por consiguiente un principio de medición basado en una reacción de desplazamiento, como se describe a continuación a título de ejemplo, viéndose picos de reacción únicamente en las muestras negativas, es decir, que únicamente en caso de muestras negativas tiene lugar una determinación de productos de reacción.

Cuando hay que analizar una muestra de sangre o saliva para un hapteno, por ejemplo cocaína, entonces se añade a las gotitas de sangre o saliva diluidas un anticuerpo, el cual está dirigido contra la cocaína. Después de aproximadamente un minuto se añade una pequeña cantidad de un hmM de cocaína, fabricado sintéticamente, es decir una macromolécula hidrófila, ligada mediante Spacer con moléculas de cocaína.

Si hay cocaína en la muestra, ésta actúa como hapteno y bloquea los puntos de unión de anticuerpos. La adición posterior del hmM de cocaína no tiene efecto. Sin embargo, si no había cocaína en la muestra, entonces fueron bloqueados los puntos de unión de anticuerpos y la adición de hmM de cocaína conduce a una formación de cadena la cual se puede medir, como crecimiento de partículas, con el procedimiento según la invención, por ejemplo con un dispositivo Q-MAP que se describe más adelante.

En el procedimiento según la invención se irradia un rayo de luz, en especial luz coherente, como un rayo láser, a través del líquido que hay que analizar. A continuación se explica el procedimiento según la invención tomando como referencia un rayo de luz láser, lo que no excluye sin embargo que se puedan utilizar en el procedimiento según la invención otras fuentes de luz adecuadas, conocidas para el especialista en la materia. Por ejemplo, se puede preparar un rayo láser del dispositivo según la invención, que se explica a continuación con detalle, el cual se designa también como dispositivo Q-MAP (quantitative measurement of attomolar precipitation-products). Alternativamente se pueden utilizar, sin embargo, también otros dispositivos sobre la base de la exposición de la invención aquí presente, los cuales pueden ser desarrollados por un especialista en la materia partiendo de la enseñanza de la presente
invención.

El láser emite un rayo a través del líquido y determina el número de las partículas que hay en su interior y su tamaño. Al mismo tiempo tiene lugar una medición de extinción en el límite claro-oscuro del cono de luz, el cual se forma durante el paso de la luz generada por el láser a través de la cámara de medición que contiene el fluido de reacción, por parte de un fotodetector (pudiendo presentar el fotodetector una amplificación ajustable de la señal, así como un punto de trabajo ajustable), de manera que el dispositivo actúa como una "barrera de luz molecular". Un dispositivo Q-MAO como el que se describe a continuación puede determinar, por ejemplo, tamaños de partícula comprendidos entre 20 nm y 5 \mum, no pudiendo obtenerse, sin embargo, a partir de esta medición ningún tipo de información sobre la constitución o la composición de las partículas medidas. El láser y el fotodetector están dispuestos aproximadamente en un eje. El rayo láser pasa muy próximo por delante del fotodetector. La luz dispersada hacia delante forma un cono, a cuyo límite claro-oscuro se ajusta el fotodetector.

Cada partícula, que se encuentra en un fluido en la cámara de medición y que pasa el rayo láser, genera una señal, correspondiendo el número de señales a la distribución estadística de las partículas en la cámara de medición. Cuando las partículas, incluso las partículas más pequeñas, pasan en el foco del láser a través del cono de luz, lo ensombrecen, casi como proyección de sombra. Se mide la variación de la luminosidad original (sin sombras de partículas). Un procesador rápido, por ejemplo un procesador Pentium, puede distinguir hasta 10.000 pasos de partícula por segundo. Las partículas pequeñas se mueven con mayor rapidez que las grandes, el tiempo de transición es una medida directa del tamaño de las partículas.

Si varias partículas están al mismo tiempo en el rayo láser, se mide entonces únicamente la mayor. Sobre la base de las diferentes velocidades con las cuales las partículas pasan por el rayo láser, se puede determinar el tamaño de partícula correspondiente mediante la ecuación de Stokes-Einstein, bien conocida por el especialista en la materia. Durante esta medición es menos importante el tamaño absoluto de las partículas que la variación del tamaño de las partículas (la cual es provocada por el crecimiento de las partículas). El filtro empleado en cada caso sirve como medida para la determinación del inicio del crecimiento de partículas. Cuanto mayores sean los poros del filtro, tanto mayores deberán ser los precipitados, para diferenciarse del "ruido de fondo". Para filtros de 100-200 nm basta con muy pocas partículas crecientes, para generar una señal medible. Dado que las partículas están distribuidas de forma estadística, tiene lugar también siempre en el foco láser, el cual está en el centro de la cámara de medición, un crecimiento de partícula.

La velocidad con la cual las partículas pasan el rayo láser se detecta midiendo el tiempo de transición, durante el cual la partícula recorre el rayo (desde el inicio de la variación de luminosidad hasta el final de la misma).

Con ello se demuestra que cuanto más limpia sea la solución, tanto más probable es que existan partículas individuales en el rayo láser, o que cuanto más sucia esté la solución, tanto más se superpondrán las señales, lo que conduce a una sensibilidad reducida.

La intensidad de la señal depende del tamaño y del número de los precipitados antígeno-anticuerpo.

Para una concentración de anticuerpos constante la disminución de la señal de medición está en relación directa con la concentración de antígenos.

Durante una detección según la invención se puede proceder al mismo tiempo, por ejemplo, de la manera siguiente: todos los fluidos que hay que analizar son inyectados, a través de filtros con un tamaño de poro determinado, en la cámara de medición, de manera que durante la detección del fluido de muestra o del fluido de anticuerpo, en cada caso por separado, aparezcan señales únicamente durante una evaluación que muestre partículas las cuales sean menores que un tamaño de partícula determinado. Durante el procedimiento según la invención presentan, tanto los anticuerpos como también los antígenos utilizados, un tamaño inferior al límite de tamaño de partícula determinado y son, por consiguiente, más pequeñas que el tamaño de partícula del filtro (por ejemplo, menores que 200 nm) utilizado para la separación, de manera que no son separadas durante la separación.

La Fig. 2a muestra un ejemplo de una imagen que se obtiene durante una detección de este tipo de un fluido de muestra sobre la base de una solución de NaCl. En estas imágenes se indica a lo largo del eje x el tamaño de partícula y a lo largo del eje y el número de partículas. Como puede apreciarse en la Fig. 2a, existen únicamente partículas hasta un tamaño de partícula máximo determinado, disminuyendo el número de partículas cuanto mayor es el tamaño de las partículas. Un resultado de detección análogo se obtendrá para el fluido de anticuerpo (no mostrado) filtrado y que, por consiguiente, contiene esencialmente partículas con un tamaño de partícula determinado.

Tras una inyección separada simultánea del fluido de muestra respectivamente del fluido de anticuerpo tiene lugar una reacción en la cámara de medición con la formación de microprecipitaciones y una detección del tamaño y el número de los precipitados antígeno-anticuerpo formados.

Un resultado de medición de este tipo se muestra, por ejemplo, en la Fig. 2b, donde se puede reconocer la aparición de partículas, las cuales son más grandes que el límite de tamaño de partícula determinado de, por ejemplo, 200 nm. La formación de partículas mayores indica por lo tanto que ha tenido lugar una reacción. Si, por el contrario, no tiene lugar ninguna reacción para dar partículas mayores, el líquido analizado está libre del antígeno correspondiente.

Las mediciones se pueden iniciar en cualquier instante tras el llenado de la cámara de reacción con el fluido de muestra y el fluido de anticuerpo. De acuerdo con una forma de realización de la presente invención se inician las mediciones, por ejemplo, después de 60 segundos tras el llenado de la cámara de medición, dado que ligeras oscilaciones en la velocidad de inyección pueden conducir a diferencias por convección en la cámara de medición. Transcurridos, por ejemplo, otros 60 segundos se ha alcanzado el máximo de precipitación. La disminución de la señal de medición que aparece después hace posible una detección o estimación cuantitativa aproximada de las diferentes concentraciones de antígeno. Aquí la concentración de partida de los dos reactivos juega un papel decisivo. Cuanto mayores son estas concentraciones de partida, tanto más largo se hace el tiempo hasta la disminución medible del máximo de precipitación.

Durante la realización del procedimiento según la invención es ventajoso que los fluidos utilizados presenten una pureza lo mayor posible y, por ejemplo, hayan sido filtrados, con un filtro con un tamaño de poro adecuado, por ejemplo de 200 nm, antes de su utilización, con el fin de eliminar o minimizar un ruido de fondo durante la detección. Además, los materiales de los dispositivos utilizados durante el proceso según la invención deben emitir la menor cantidad de partículas posible. La cámara de medición puede estar hecha, por ejemplo, de PTFE (politetrafluoroetileno). Para impedir que los materiales utilizados (por ejemplo los de la cámara de medición) acaben por emitir partículas con el tiempo, se puede mantener además el tiempo de medición lo más corto que sea posible.

Además, la concentración de las soluciones de antígeno o anticuerpo utilizadas debería ser tan pequeña que, durante una reacción antígeno-anticuerpo que tenga lugar, no se formen demasiados precipitados o demasiado grandes, dado que en caso contrario varias partículas se pueden encontrar al mismo tiempo en la trayectoria de los rayos y se puede establecer únicamente con gran dificultad un tiempo de transición. La mayor sensibilidad del procedimiento según la invención se da en el margen femto y attomolar.

Especialmente ventajoso es que el procedimiento según la invención posibilita también obtener informaciones cuantitativas o semicuantitativas.

Se pueden utilizar por ejemplo dos procedimientos para la evaluación de una detección cuantitativa. En el primer procedimiento de evaluación se determina la superficie (F) situada debajo de la curva de medición para los instantes t1 y t2 (por ejemplo, para el instante t1 = 120 segundos y t2 = 180 segundos) obteniéndose, mediante

F_{N} = (F_{t1} + F_{t2}):2,

un buen valor de aproximación F_{N} para una superficie, a partir del cual se pueden obtener entonces un valor cuantitativo para el número de partículas. Para estas concentraciones extremadamente bajas el crecimiento de las partículas es lineal, es decir que, por ejemplo, doblar la concentración conduce a una superficie el doble de grande de la señal de medición.

Un método alternativo y/o complementario para obtener una información cuantitativa, se basa en que las soluciones se diluyen hasta que se topa con el límite cinético de la reacción bimolecular. Para concentraciones inferiores a 100 attomolar las trayectorias libreas de los reactivos se hacen muy grandes (> 100 \mum) y en el tiempo de medición predeterminado no se produce ninguna precipitación medible. Para concentraciones superiores a 10 nanomolar se inicia el impedimento estérico a causa de productos de reacción demasiado numerosos y demasiado grandes y, además, se inicia el "efecto de prozonas" antes mencionado. Para una solución, por ejemplo 10 micromolar, la trayectoria libre de una partícula es de únicamente 100 nm.

El grado de dilución determinado en este punto final físico depende únicamente de la temperatura y la convección, dado que la viscosidad a estas diluciones tan altas p. ej. en PBS (phosphate buffered saline, solución de sal tamponada con fosfato) no juega ningún papel. Cuando estos dos parámetros se mantienen constantes, la fuerza de la dilución de las soluciones de partida constituye una medida directa de la concentración de las soluciones correspondientes.

Una determinación cuantitativa exacta de la concentración de muestras es posible con el procedimiento según la invención mediante una solución de contraste con una concentración conocida de la proteína en cada caso, utilizándose formas de proceder conocidas para un especialista en la materia.

De acuerdo con otra estructuración del procedimiento se pueden llevar a cabo en la cámara de medición mediciones del fluido continuas y/o a modo de muestra extraída varias veces al azar. Gracias a ello es especialmente posible determinar el punto final de la reacción y formar valores medios de las detecciones. Preferentemente, se somete al fluido portador esencialmente libre de partículas con un tamaño de partícula superior a un valor determinado, antes de la adición del anticuerpo y/o antes de la adición de la muestra, a una medición y el resultado de esta medición se toma como valor de referencia para la medición del precipitado.

En el procedimiento según la invención es suficiente con cantidades relativamente pequeñas de fluido y se puede reducir la complejidad para la retirada del fluido utilizado de sustancias cuyo tamaño de partícula supera un valor determinado. Para la retirada de este tipo de sustancias el fluido utilizado se puede hacer pasar también, por ejemplo, mediante conmutación de dispositivos de válvula, a través de una derivación con un filtro, el cual extrae la sustancias mencionadas mediante filtración. La filtración del fluido utilizado se puede llevar a cabo, antes de la alimentación de la muestra, durante un tiempo concreto predeterminado, para asegurar que no están contenidas ya sustancias que puedan perturbar la medición. De la muestra se pueden retirar sustancias, cuyo tamaño de partícula supera el valor determinado, en especial mediante filtros, los cuales están integrados en los puntos de alimentación o que están dispuestos antes que estos. También tras la alimentación de una muestra se puede filtrar el fluido de muestra obtenido de este modo, durante un tiempo determinado, para retirar sustancias perturbadoras que hayan podido acceder al fluido con la muestra o desde el sistema de conducción.

De acuerdo con otra estructuración del procedimiento el fluido portador es, tras la adición de un cuerpo, la cual ha conducido o no ha conducido a la determinación de un antígeno, filtrado de nuevo hasta que se añade otro anticuerpo. Gracias a esto se pueden retirar sustancias que hayan entrado durante el tiempo intermedio en el fluido portador, las cuales podrían perturbar la medición. Además, es posible gracias a ello retirar del fluido utilizado un producto ya determinado, para analizar eventuales otros componentes de la muestra.

El procedimiento según la invención es adecuado para gran variedad de utilizaciones en el ámbito de la analítica del agua (determinación de sustancias que contiene y de sustancias nocivas), de la tecnología de los alimentos (determinación de microorganismos, sustancias que contienen) o en los tests biológicos o médicos (p. ej. determinación de determinadas secuencias de DNA o RNA, bacterias o de alérgenos (test de alergia)). Además, son posibles también utilizaciones en el campo de Multi-Spacer macromoleculares hidrófilos, sondas Branch-DNA o una PCR cuantitativa. El procedimiento según la invención se puede utilizar en especial también para la determinación de la proteína de priones PrP^{Sc} infecciosa en tests BSE. Dado que en el procedimiento según la invención se pueden demostrar cantidades extremadamente pequeñas de esta proteína de prión, el procedimiento según la invención es adecuado también para la determinación de la proteína de prión PrP^{Sc} infecciosa de sangre.

Además, el procedimiento de medición Q-MAP según la invención ofrece una posibilidad más rápida y sencilla de probar el comportamiento de absorción de diferentes proteínas en distintas superficies. De este modo se pueden comprobar, sin destrucción, superficies altamente pulidas en cuanto a un "valor de absorción de proteínas", indicando las desviaciones con respecto a un valor teórico un defecto de la superficie. De este modo se pueden determinar, por ejemplo en superficies de metal delgadas aplicadas por vaporización, defectos de la superficie de forma sencilla y rápida.

Además, se puede comprobar además la completa inmovilización de determinadas proteínas en la superficie correspondiente lo que, por ejemplo, tiene una gran importancia en el campo de la analítica de DNA y de la tecnología de biochips.

Otra posibilidad de utilización posible adicional del procedimiento según la invención pueden basarse en que se puede determinar la influencia de productos químicos sobre una superficie. En especial se consideran por ejemplo test antes-después para la determinación de variaciones mediante una tratamiento superficial, dado una superficie caustificada presenta una superficie mayor que una que no esté caustificada y, por consiguiente, se puede absorber una mayor cantidad de material de antígeno, por ejemplo proteínas, sobre esta superficie. Con ello se puede, por ejemplo, determinar la cantidad de las proteínas que han quedado libres en solución.

Otra posibilidad de utilización se basa en que el procedimiento según la invención posibilita que se pueda comprobar la constitución también de la superficie interior de mangueras y tubos.

Tras la finalización del procedimiento según la invención se pueden disolver las precipitaciones antígeno-anticuerpo, por ejemplo mediante proteinasa K, en sustancias que no son destruidas por la proteinasa K (p. ej. priones y sustancias las cuales no contienen aminoácidos), y que deben ser sometidas a otros tratamientos o análisis.

Otra ventaja importante del procedimiento según la invención es, como se ha descrito con anterioridad de forma detallada, que hace posible también detecciones cuantitativas. Además, el procedimiento se puede llevar a cabo de manera completamente automática, lo que conduce a un claro ahorro de costes laborales de manera que, por consiguiente, se propone un procedimiento que se puede realizar de forma comparativamente económica.

Además, el procedimiento según la invención hace posible la determinación de agentes patógenos en líquidos o excreciones corporales, en especial sangre, en cantidades muy pequeñas. Esto supone una ventaja muy importante dado que pequeñas cantidades de sangre, por ejemplo una pequeña gotita de sangre (aprox. 10-20 \mul), se pueden tomar de forma sencilla en la yema del dedo o un lóbulo de la oreja con un tubito, sin que sea necesario un médico o una enfermera formada. Este tipo de tests se pueden llevar a cabo, por ejemplo, de forma sencilla en una farmacia o también en una residencia de ancianos o instalaciones de rehabilitación y suministran, de forma sencilla y rápida, una información acerca de si existe una infección con una bacteria determinada. Especialmente ventajoso es que tanto la toma de la muestra como también la realización del procedimiento según la invención con el dispositivo según la invención no requiere de colaboradores con formación médica o altamente cualificados. Alternativamente, se puede determinar con un test de este tipo naturalmente también otras sustancias en la sangre con anticuerpos específicos, por ejemplo drogas o medicamentos.

Mientras que en los aparatos de medición usuales en el comercio la relación entre antígeno y anticuerpo no puede diferir más de un factor 2-3, con el Q-MAP son posibles mediciones también cuando se difiere de la relación de mezcla ideal entre el antígeno y el anticuerpo en un factor 100. (Para una concentración de anticuerpos que permaneció invariable se disminuyó la concentración de antígeno hasta el 1% y se aumentó hasta el 10.000%. Se llevó a cabo lo mismo a la inversa también con una concentración de antígeno invariable). Esta desviación interesante con respecto a la "curva de Heidelberger", en el margen femto y attomolar, la cual es originada por los impedimentos estéricos de las moléculas, hace que sean innecesarias series de dilución que requieren mucho tiempo.

El procedimiento según la invención es especialmente adecuado para el análisis de muestras reunidas lo que es de especial interés para análisis de conservas de sangre (por ejemplo con respecto a VIH o hepatitis) y muestras de test BSE. Con el procedimiento según la invención se pueden llevar a cabo, aproximadamente, 50 mediciones por segundo, lo que significa que durante un días de 8-10 horas se pueden llevar a cabo por lo menos 400 análisis al día, respectivamente más de 80.000 mediciones al año. En caso de 10-100 muestras reunidas por cada medición se pueden analizar por lo tanto 800.000 - 8.000.000 muestras al año con únicamente un aparato de medición.

Durante un análisis de conservas de sangre, se pueden añadir por ejemplo 10 anticuerpos diferentes (contra 10 enfermedades diferentes) de una sola vez a una conserva de sangre para determinar si esta conserva de sangre puede utilizarse. En caso de una reacción positiva hay que tirar las conserva de sangre, dado que da igual si está infectada por ejemplo con VIH o hepatitis. Si, además, es interesante saber cual es el agente que ha desencadenado la reacción positiva, entonces los anticuerpos se pueden añadir individualmente. Cuando, por ejemplo, se reúnen 100 conservas de sangre y se utilizan al mismo tiempo 10 anticuerpos distintos, se pueden determinar, con tan solo una medición, la cual dura aproximadamente 60 segundos, si se pueden utilizar la totalidad de las 100 conservas de sangre.

Un test, en el cual basta con una cantidad tan pequeña de producto, y que presenta una sensibilidad correspondientemente alta hasta el margen femto o attomolar, no se conoce hasta ahora en el estado de la técnica y supone un importante avance.

Además, la presente invención comprende un producto de programa de ordenador el cual comprende medios de código de programa, los cuales están almacenados en un medio legible por un ordenador, para poder llevar a cabo el procedimiento según la invención, cuando el producto de programa de ordenador se hace funcionar en un ordenador, un dispositivo de red o un dispositivo, en especial un dispositivo de detección analítico. Además, la presente invención proporciona un producto de programa de ordenador el cual comprende un código de programa y que se puede descargar de un servidor con el fin de poder llevar a cabo el procedimiento según la invención, cuando el producto de programa de ordenador se hace funcionar en un ordenador, un dispositivo de red o un dispositivo, en especial un dispositivo de detección analítico (por ejemplo, un dispositivo de detección descrito en la presente solicitud).

La presente invención se refiere además a un dispositivo para la determinación de pequeñas cantidades de partículas, el cual se designa también como dispositivo Q-MAP (quantitative measurement of attomolar precipitation-products).

Un dispositivo de este tipo comprende una fuente de luz, utilizándose como fuente de luz preferentemente un láser.

La cámara de medición de un dispositivo de este tipo debería estar fabricada con un material el cual, esencialmente, no emita partículas y que haga posible el paso de un rayo de luz, en especial de un rayo láser. Este tipo de materiales son conocidos para un especialista en la materia. Por ejemplo, la cámara de medición puede estar formada con PTFE (politetrafluoroetileno). La cámara de medición presenta un volumen de menos de 100 \mul, preferentemente de 30-50 \mul, en especial de 40 \mul.

El dispositivo según la invención presenta en especial un fotodetector el cual presenta una amplificación ajustable de la señal y un punto de trabajo ajustable.

El fotodetector se puede seleccionar, por ejemplo, de entre el grupo constituido por detectores térmicos, fotidiodos, en especial detectores de fotoconductor, detectores fotovoltaicos, diodos de avalancha, redes de diodos, fotomultiplicadores.

El dispositivo de detección según la invención posibilita, en particular, una determinación de partículas entre
20 nm y 5 \mum.

Además, la presente invención proporciona un kit para una determinación cualitativa y/o cuantitativa de una determinada partícula que hay que demostrar, por ejemplo una proteína o una hormona, presentando las partículas determinadas por lo menos dos puntos de unión de anticuerpos. El kit comprende un dispositivo de detección, como se ha descrito con anterioridad, por lo menos un anticuerpo, el cual puede unir específicamente con la partícula determinada, y por lo menos un fluido adecuado para el alojamiento de la muestra. Un kit de este tipo se puede concebir especialmente para las necesidades determinadas de un usuario y contiene componentes ajustados entre sí y una descripción correspondiente para el usuario, el cual con este kit puede llevar a cabo detecciones según la invención de forma inmediata y de una manera muy sencilla. Por ejemplo, un kit de este tipo se puede utilizar para la determinación de un agente patógeno determinado en una pequeña cantidad de sangre o para las utilizaciones, descritas con anterioridad, para el análisis de superficies.

Descripción detallada de la figura 3

La invención se explica a continuación a partir del dibujo esquemático adjunto, a título de ejemplo, que no es limitador, de una instalación para llevar a cabo el procedimiento según la invención.

El cambiador de muestras 1 puede inyectar tanto diferentes soluciones de antígeno (p. ej. muestras de sangre), como también diferentes soluciones de anticuerpo en los recipientes de mezcla 2 respectivamente 3 correspondientes, para analizar una muestra consecutivamente para diferentes agentes posibles. Los recipientes de mezcla 2 respectivamente 3 para las soluciones de antígeno o anticuerpo no solo pueden servir para la dilución de las soluciones correspondientes, sino también para el lavado de la cámara de medición con tampón (PBS) o solución de anticuerpo.

Los filtros 4 se pueden cambiar y presentan, por ejemplo, un tamaño de poro de 200 nm. La válvula 5 puede estar conectada de tal manera que las soluciones pueden fluir, de forma individual o conjunta, en la cámara de medición 6, en cuyo interior tiene lugar, de forma permanente, de manera sencilla o múltiple, a modo de muestra extraída varias veces al azar, una detección con el dispositivo de detección.

La bomba 7 es, por ejemplo una pequeña bomba de vacío la cual aspira todas las soluciones. Está coordinada con la válvula 5 y bombea, una vez realizada la medición, el contenido de la cámara de medición al recipiente de desperdicios 8. Éste puede estar dotado con un líquido desinfectante o germicida, para hacer inocuas inmediatamente todas las sustancias posiblemente peligrosas.

Si el anticuerpo alimentado reacciona con un antígeno de la muestra para dar un precipitado antígeno-anticuerpo, se forman partículas con un tamaño de partícula que sobrepasa el valor determinado. Estos precipitados generan una señal la cual se diferencia con claridad de las señales de partículas eventualmente existentes todavía en el fluido portador con un tamaño de partícula inferior al valor determinado. Como consecuencia de ello, los productos de reacción se determinan unívocamente mediante el dispositivo de detección. De la determinación resulta que una determinada sustancia está contenida en la muestra y, en su caso, se puede, de acuerdo con los métodos descritos con anterioridad, determinar también su contenido.

Si, tras la inyección de una primera solución de anticuerpo el dispositivo de detección no demuestra partículas por encima de un tamaño de partícula determinado o se sospechan otros antígenos, que no dan una reacción específica con los anticuerpos utilizados en la muestra, se puede alimentar a continuación otra solución de anticuerpos. Antes se pueden retirar de la cámara de medición, en su caso, precipitados determinados mediante lavado.

Los ejemplos siguientes sirven para la explicación de la presente invención. Sin embargo, no se tiene la intención de limitar el ámbito de protección de la presente invención al objeto de los ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1

Test de sangre BSE

La cabaña bovina en Alemania asciende a aproximadamente 15 millones. En Alemania se llevan a cabo de 2 - 3 millones de test BSE (ELISA y Western Blot) con los cerebros de animales muertos. Un test rápido BSE (ELISA o Western Blot) dura un tiempo de 6 - 8 horas. Con el procedimiento según la invención se puede determinar el agente BSE en el animal vivo con tan solo una gota de sangre en el lapso de dos minutos, los costes suponen únicamente una fracción.

Ejemplo 2

Comprobar conservas de sangre con respecto a la nueva enfermedad de Creutzfeld-Jakob (nCJK)

Para proteger a la población de un riesgo imaginable de una transmisión de nCJK a través de la sangre, se ofrecen diferentes medidas. El paso más prometedor sería comprobar cada donación individual de sangre en cuanto a esta infección, como en los casos de la hepatitis y el SIDA. Sin embargo, el agente aparece en los enfermos en cantidades muy pequeñas. En el estado de la técnica no existen test fiables.

El procedimiento según la invención está en condiciones de demostrar el agente en la sangre o en productos de la sangre.

Ejemplo 3

Utilizaciones en la industria alimentaria

Las micotoxinas son productos de descomposición altamente venenosos de determinados hongos. Las micotoxinas son haptenos y se pueden determinar por ello de forma cualitativa y cuantitativa con los procedimientos de medición arriba descritos.

En análisis de screening de, por ejemplo, cargas completas de barco de café, té, harina o nueces es suficiente con un test cualitativo el cual se puede llevar a cabo in situ, aproximadamente en dos minutos.

Para determinar si un animal ha sido engordado de manera ilegal con hormonas, hay que analizar una muestra de carne con respecto a aproximadamente 15 hormonas diferentes que pudieran estar en cuestión. Las hormonas son también haptenos y se pueden determinar, de forma cualitativa y cuantitativa, con el procedimiento según la invención. Para los test de embarazo y los análisis del tiroides se necesitan también, por ejemplo, asimismo test de hormonas.

Dado que los grandes mataderos procesan al mes 2.000-3.000 vacas, se necesitan aproximadamente 50-1.000 muestras extraídas al azar, para detectar el engorde ilegal. Por el momento el precio de un test de hormonas (para 15 hormonas diferentes) es de 600 Euros por trozo de carne. Por este motivo las carnicerías llevan extraen únicamente 5-10 muestras al azar al mes, lo que es muy poco para detectar un engorde ilegal. En conversaciones con grandes mataderos se mostró un interés por un número 10 veces mayor de test económicos (por aprox. 60-70 Euros por trozo de carne) sobre la base del procedimiento según la invención. Los test de hormonas convencionales no alcanzan en ningún caso este precio.

Ejemplo 4

Demostración de plaguicidas

Los monómeros de tubulina son pequeñas bolitas de albúmina individuales, las cuales mediante reacción con el portador de energía GTP crecen para formar largas cadenas. Las sustancias inhibidoras y otras toxinas entorpecen o impiden este crecimiento de cadena. Cadenas individuales se anudan dando estructuras en forma de cuerdas, los así llamados protofilamentos. Estos protofilamentos se conectan, por su parte, para dar microtúbulos, los cuales juegan un papel decisivo durante la división celular. Impidiendo a los monómeros la formación de cadenas se influye sobre la división celular y se mata al parásito.

A la inversa, este procedimiento ofrece también la posibilidad de encontrar residuos de plaguicidas en alimentos y garantizar de este modo una mayor protección del consumidor. Con el procedimiento según la invención se puede medir directamente el crecimiento de cadena descrito con anterioridad o el impedimento del mismo.

Claims

1. Procedimiento para la determinación del cantidades de partículas, en el margen femto y attomolar, para la detección de precipitados anticuerpo-antígeno, que comprende:

preparación de un fluido de muestra, el cual contiene esencialmente partículas con un tamaño de partícula máximo determinado, presentando las partículas por lo menos dos puntos de unión de anticuerpo;

preparación de un fluido que contiene anticuerpos, el cual contiene esencialmente partículas con un tamaño de partícula máximo determinado;

contacto del fluido de muestra con el fluido que contiene el anticuerpo, obteniéndose un fluido de reacción, pudiendo formar el anticuerpo, en presencia de una partícula con por lo menos dos puntos de unión de anticuerpo, un precipitado antígeno-anticuerpo;

conducción de un rayo de luz a través del fluido de reacción;

detección de una señal mediante una medición de extinción en el límite claro-oscuro del cono de luz, el cual se forma durante el paso de la luz generada por el láser a través de la cámara de medición que contiene el fluido de reacción, mediante un fotodetector, dependiendo la intensidad de la señal del tamaño y el número de los precipitados antígeno-anticuerpo formados, y determinándose el número y el tamaño de las partículas mediante la medición del tiempo de transición.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa de preparación de un fluido de muestra, que contiene esencialmente partículas con un tamaño de partícula máximo determinado, comprende:

a): preparar un fluido,

: añadir una muestra al fluido, y

: separar partículas las cuales superan un tamaño de partícula determinado, para la obtención de un fluido de muestra el cual contiene, en esencia, únicamente partículas con un tamaño de partícula máximo determinado, o

b): preparar un fluido, el cual contiene esencialmente partículas con un tamaño de partícula máximo determinado, y

: añadir una muestra al fluido, la cual contiene esencialmente partículas con un tamaño de partícula máximo determinado, para la obtención de un fluido de muestra, el cual contiene esencialmente partículas con un tamaño de partícula máximo determinado.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores 1 ó 2, en el que la separación de las partículas con un tamaño por encima de un tamaño de partícula máximo determinado, tiene lugar mediante filtración, presentando el filtro preferentemente un tamaño de poro de 20 - 450 nm, más preferentemente 100 - 300 nm, en particular de 200 nm.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores 1 a 3, en el que se utilizan por lo menos dos anticuerpos monoclonales o un anticuerpo policlonal.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores 1 a 4, en el que el anticuerpo se ha seleccionado de entre el grupo constituido por inmunoglobulina G o inmunoglobulina M.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores 1 a 5, en el que el procedimiento posibilita una detección cuantitativa o semicuantitativa de la cantidad de partículas.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores 1 a 6, en el que para una concentración de anticuerpo constante la disminución de la señal de medición está en relación directa con la concentración de antígeno.

8. Producto de programa de ordenador, que comprende unos medios de código de programa, los cuales están guardados en un medio legible por un ordenador, para la realización del procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, cuando el producto de programa de ordenador funciona en un ordenador, un dispositivo de red o un dispositivo, en particular de un dispositivo de detección analítico.

9. Producto de programa de ordenador, que comprende un código de programa y que se puede descargar de un servidor, para la realización del procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, cuando el producto de programa de ordenador funciona en un ordenador, un dispositivo de red o un dispositivo, en particular de un dispositivo de detección analítico.

10. Kit para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de una partícula determinada que hay que determinar, presentando la partícula específica por lo menos dos puntos de unión de anticuerpo, comprendiendo el kit:

por lo menos un anticuerpo, que puede unirse específicamente con la partícula determinada, y por lo menos un fluido adecuado para acoger la muestra, y

un dispositivo para la detección de pequeñas cantidades de partículas, el cual presenta:

un láser,

una cámara de medición, y

un fotodetector, el cual está diseñado para la realización de una medición de extinción en el límite claro-oscuro del cono de luz, el cual se forma durante el paso de la luz generada por el láser a través de la cámara de medición que contiene las partículas en un fluido, estando dispuesto el fotodetector de tal manera con respecto al láser, que el rayo láser pasa justo por delante del fotodetector.