CN1853096A - 微量粒子的检测方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测微量粒子的方法和装置。本发明的方法是基于检测抗原－抗体反应产物，并且提供了在10^－15摩尔或10^－18摩尔范围内全程极高的检测灵敏度。

Description

微量粒子的检测方法和装置

本发明提供了一种通过检测抗原-抗体-反应产物而检测微量粒子的方法和装置，所述方法具有在低至10^-15摩尔或10^-18摩尔范围内的极高检测灵敏度。

本领域公知的几种微量粒子检测方法为，例如浊度分析和比浊分析法，也包括称作动态光散射(DLS)的方法。

在浊度分析和比浊分析方法中利用丁铎尔(Tyndall)效应，其中小粒子的照明产生广角散射光。可以通过测量通过所述散射介质之后入射光强度的降低、或者通过确定横向偏转光的强度，来确定所述光的散射。前一种情形指的是比浊分析法或消光测量法，后一种情形指的是浊度测量法或丁铎尔测量法。

称作动态光散射(DLS)法的方法提供另一种途径。在这种方法中，只是观测围绕所述粒子周围光圈上的一个(或一些)位点，但是此外，还分析由于布朗(Brownian)运动而形成的亮度调制(brightness modulation)。通过关注微小的检测体积，尝试降低由于来自多个粒子的散射光的重叠而导致的干涉。因此，粒子极快地通过微小照射体积，使得分析光电子学必须检测明显波动的频率。通过复杂的信号处理提供大量的信息，使得这些系统只是有条件地适用于定量分析。

现有技术的检测方法进一步显示的缺点在于，首先应提到的是，虽然上述方法的检测灵敏度近年来显著提高，但是在多数不同领域仍存在对于具备更高灵敏度的检测方法的迫切需求。此外，现有技术的检测方法仍然需要相对较大量的试样，尤其是在医学技术的方法中，其可能给被检测人施加压力。

因此，本发明的一个目的在于，提供一种检测微量粒子的方法，所述方法相对于现有技术的方法表现出更高的灵敏度。此外，这种方法应需要较少稀释的试样和/或较低最小量的试样，应适用于较大范围的试样分析，并且在初级训练之后对于不具备专门的现有经验的人来说也应该是可以实现的。此外，本发明的一个目的在于，提供一种检测微量粒子的装置。

通过提供一种采用检测抗原-抗体沉淀物来检测微量粒子的方法来达到上述目的，所述方法包括：提供基本上含有具备特定最大粒径的粒子的试样流体，所述粒子具有至少两个抗体结合位点；提供含有抗体的流体，所述流体基本上含有具备特定最大粒径的粒子；将所述试样流体与所述含抗体的流体接触，其产生反应流体，其中当存在具有至少两个抗体结合位点的粒子时，所述抗体可以形成抗原-抗体沉淀物；引导光束通过所述反应流体；当由激光器生成的光通过含所述反应流体的测量单元时，通过使用光电探测器测量在所生成光锥的明-暗(light-dark)边界处的消光来检测信号，所述信号的强度取决于所形成的所述抗原-抗体沉淀物的尺寸和数量。

本发明进一步提供一种检测微量粒子的装置，其包括：光源、测量单元和光电探测器，所述光电探测器设计用于测量当由激光器生成的光通过含流体中粒子的测量单元时在所生成光锥的明-暗(light-dark)边界处的消光。向前散射的光形成锥体，并且将所述光电探测器对准其明-暗边界。激光器和光电探测器基本上轴向对准，尽管这样，但仍有偏差使得所述激光束恰好绕过所述光电探测器。

附图说明

图1a-1d示意性地阐述了当使用二价抗体形成抗原-抗体沉淀物时的过程。

图2a阐述了采用依据本发明的方法的检测结果，其中在使用具有200nm孔径的过滤器过滤之后(但是在添加抗体之前)，测试含有粒子的试样流体。信号对应于直径小于所使用过滤器孔径的粒子。x-轴显示粒径，y-轴显示粒子数目。

图2b阐述了测量反应混合物的检测结果，其通过在同时、单独注入试样流体和抗体流体，且两种流体均使用孔径为200nm的过滤器过滤时获得。在这种反应混合物中发生反应，且形成直径大于所使用过滤器孔径的微沉淀物。x-轴显示粒径，y-轴显示粒子数目。

图3示出用于实施依据本发明的方法的装置的示意图。

在多种实现本发明的实验中，可以发展出一种方法，其灵敏度超过现有技术可比方法的灵敏度1000倍。这种灵敏度显著增加的原因在于，与匹配分析试样制备相关的改进物理测试方法，其中当由激光器生成的光通过含所述反应流体的测量单元时，通过使用光电探测器测量在所生成光锥的明-暗边界处的消光来检测信号。

而且，本发明容许测量单元的容积降低约30-50倍。而在现有技术的方法中，需要测量单元具有一定范围的容积如1.6ml，在依据本发明的方法中，可以使用具有容积范围为微升(例如40μl)的测量单元。这是一个重要的优点，因为每个试样必须被稀释，以形成均一基质，例如具有相同的透明度、粘度等，使得在依据本发明的方法中，与现有技术的方法相比，试样不必被大量稀释。

进一步，通过依据本发明的方法，可以降低所需试样的最小用量。而现有技术的方法需要多于100μl，在依据本发明的方法中，小很多倍用量的试样将足够(例如3.5μl)。

在本申请中，术语“粒子”表示具有不同于支撑介质的折射率的任意三维实体。

本申请中使用的术语“沉淀”描述的是，当可溶性抗原与特定抗体反应形成比所使用的抗原和抗体在所使用溶剂中溶解性更低的抗原-抗体-复合物的过程，该反应首先导致所述反应混合物混浊，并且随后导致这种抗原-抗体-复合物沉降。

依据本发明的方法容许检测微量的粒子。例如，通过使用依据本发明的方法，对于低分子量物质，即分子量小于500g/mol的物质而言，检测限可以达到每升10^-15克到10^-18克的范围，但是到目前为止，检测限通常为每升10^-6克、10^-9克、或10^-12克的范围。对于分子量大于500g/mol的物质，检测限较高，例如对于分子量为150,000g/mol的物质(例如IgG抗体)，检测限为约300×10^-15克/升。这就意味着所述试样流体可以含有每升10^-15克或10^-18克数量级的粒子。

在依据本发明方法的第一部分步骤中，提供基本上含有具有特定最大粒径的粒子的试样流体。例如，存在两种实现方式。依据第一种选择，最初提供基本上只含有特定最大粒径的粒子的流体，并且随后，将基本上含有特定最大粒径的粒子的试样添加到所述流体中。依据第二种选择，通过最初提供流体，将试样添加到所述流体中，并且随后将具有大于特定粒径的粒子去除，而获得所述试样流体。

可以根据所期望的应用，选择所述试样流体中和基本上只含有特定最大粒径的粒子的其它流体中粒子的最大粒径。对于多数普通抗体，可以分离出大于20-450nm、更优选大于100-300nm、特别是大于200nm的粒子。例如可以通过具有合适的、相应孔径为20-450nm、更优选为100-300nm、尤其是200nm的过滤器，或者通过其它本领域技术人员公知的方法来实现这种分离。如果作为近似而将凝集视作表面，则过滤器尺寸减半对将形成可检测的反应产物的分子数目的影响为二次方的比例。例如，如果使用100nm过滤器代替200nm过滤器，则为了获得可检测的结果，现在只有约四分之一数目的使用200nm过滤器时所需抗原-抗体分子必须相互反应。进一步，例如，当使用25nm过滤器时其将可以检测到抗原-抗体三聚体。当使用具有这样小孔径的过滤器时，因为少量分子将已经引起可检测的反应，因而操作必须特别小心。

为了发生交联反应，试样流体中所含粒子必须具有至少两个抗体结合位点，并且因此可以作为抗原。图1a到1d示意性地阐述了外源物质或粒子如细菌、病毒、毒素和蛋白质作为抗原，且依据“锁匙原理”与抗体反应(图1b)。二价抗体如IgG抗体将随后结合两个抗原(图1c)。由于每个抗原可以结合多个抗体，因而产生交联(沉淀)，通过依据本发明的方法对其进行检测(图1d)。对于具有更高化合价的抗体来说，产生相似的沉淀。如果所用抗原提供了很大数目的抗体结合位点，那么有利的是，所述交联反应将更可靠地进行。

依据本发明的方法适用于任意抗原，只要其具有至少两个抗体结合位点。优选地，测试的粒子应大于约10nm，且同时它们应该小于所选的最大粒径。小于10nm的分子可以作为半抗原。半抗原是不完全的抗原，亦即，它们的分子不足够大以致难以触发免疫反应或引起凝集。实际上，这些低分子量物质对于抗体的抗体结合位点高度特异，但是它们不能从这个结合位点上突出足够远，以致第二抗体不能结合到它们之上。它们阻断这个特定的抗体，使得不能发生交联反应。更大的抗原如细菌必须在测量之前被化学或物理破坏，其可以通过本领域技术人员公知的各种方法来实现，例如超声、酸、碱、或表面活性剂。以这种方式获得的优点在于，可以由单一的细菌获得多个碎片，并且不必使单个细菌聚集。这样获得的碎片一例如表面蛋白质-依次代表更小的抗原，并且可以触发与合适抗体的特异性可测量的反应。

进一步，所述抗原应基本上可溶于所使用的缓冲剂中，并且对于所使用的装置和过滤器的壁来说应具有低吸附亲和力。

依据本发明的方法还包括提供含抗体的流体。

在依据本发明的方法中，原则上可以使用任意期望的抗体。被证实对于依据本发明的方法特别有利的抗体是，例如二价免疫球蛋白G(IgG)或十价免疫球蛋白M(IgM)。依据本领域技术人员公知的方法，这样可以获得具有明确特异性的抗体。属于不同抗体类别的其它抗体也可以使用，这取决于将被检测的粒子的类型。本文中抗体可以是单克隆的或多克隆的。当使用单克隆抗体时，可以引入针对不同抗原的两个单克隆抗体，以产生沉淀。采用与上述对于所述抗原相同的方式，所述抗体也应基本上可溶于所使用的缓冲剂，并且对于所使用的装置和过滤器的壁具有低吸附亲和力。

在依据本发明的方法中，可以以不同的方式来避免不期望的、极度过量的抗原或抗体，例如采用合适的稀释液系列。否则，该极度过量的抗原或抗体可能导致阻止沉淀(所谓的“前带现象”)，因为存在大大过量的抗体，因而每个抗原决定部位(抗原结合位点)将只单价地结合单个抗体，并且不再可能形成交联，或者因为存在极度过量的抗原，因而经常由一个抗体分子和两个抗原分子形成三聚体。

对于制备所述试样流体和制备所述含抗体的流体，原则上可以使用任意气体或液体作为所述流体。优选地，所述流体为液体。通常所述液体为水或本领域公知的缓冲溶液，例如PBS(磷酸盐缓冲盐水)，特别是在基于生化反应的分析方法中更是如此。原则上，所述液体也可以是其它透明液体，例如液态烃、酸或碱。

在依据本发明的方法中，在下一步骤中，将所述试样流体与含抗体的所述流体接触，当存在抗原时，所述抗体可以形成抗原-抗体沉淀物，现在其例如可以通过依据本发明的装置得以检测。

此外，经常关注于检测试样中半抗原的存在。半抗原是不完全的抗原，即它们太小而不能结合多于一个的抗体。具体而言，半抗原可以是药用产品、药品、杀虫剂、环境毒药、甾类激素或霉菌毒素。半抗原特异性结合抗体。但是，它们只是阻断抗体的抗体结合位点，使得不能发生链反应。免疫原(完整抗原)的最小尺寸为5-10kDa，也就是＞30氨基酸残基或长度＞3nm，因为从这样的尺寸出发，至少两个抗体分子可以通过适当可利用的抗原决定部位结合位点与这些抗原结合，并且触发通常导致沉淀的链反应。

半抗原的测定可以例如通过亲水性大分子多间隔物(hydrophilic macromolecularmultispacers，hmM)或通过本领域技术人员公知的相关化合物来影响。在本领域中亲水性大分子多间隔物是公知的，其由亲水性大分子如白蛋白组成。相同的半抗原分子或不同的半抗原分子通过本领域公知的间隔物化学偶合至该亲水性大分子。如果亲水性大分子多间隔物具有至少两个相同的半抗原分子，则其可以用于沉淀。这样的分子可以用于基于取代反应的抗体筛选测试。这样半抗原产生基于下文中举例说明的取代反应的测量概念，其中仅在阴性测试中观察到反应峰，亦即仅通过阴性测试进行反应产物的检测。

当血液或唾液试样用于半抗原例如可卡因检测时，将针对可卡因的抗体添加到稀释的血液或唾液滴中。约一分钟之后，添加少量合成制备的可卡因-hmM，也就是通过间隔物连接到可卡因分子上的亲水性大分子。

当试样中存在可卡因时，可卡因作为半抗原，并且阻断抗体结合位点。随后可卡因-hmM的添加不起作用。当试样中不存在可卡因时，抗体结合位点未被阻断，并且可卡因-hmM的添加导致链的形成，所述链形成可以通过依据本发明的方法采用例如下文所描述的Q-MAP装置测量为粒子生长。

在依据本发明的方法中，将光束特别是相干光例如激光束照射通过待检测的流体。在下文中，参考激光束来描述依据本发明的方法，但是这并不排除其它本领域技术人员公知的光源，其也可以在依据本发明的方法中使用。例如，从依据本发明的装置中导出激光束，所述装置将在下文中详细描述，该装置也被称为Q-MAP(10^-18摩尔沉淀产物的定量测量)。但是，作为选择，基于本发明公开内容的其它装置也可以使用，其可以由本领域技术人员从本发明的教导出发开发出来。

激光器发射光束通过待检测的液体，并且用于检测其中存在的粒子的数目和尺寸。这可以通过采用光电探测器测量当由激光器生成的光通过含所述反应流体的测量单元时，在所生成光锥的明-暗边界处的消光来进行(其中所述光电探测器可以具有可调节的信号放大器和可调节的操作点)，使得该装置作为“分子光栅”。下文中描述的Q-MAP装置可以例如检测尺寸在20nm-5μm之间的粒子，虽然这种测量不会产生任何关于所检测粒子构成或组分的信息。激光器和光电探测器几乎是同轴的。所述激光束恰好绕过所述光电探测器。向前散射的光形成锥体，并且所述光电探测器对准其明-暗边界。

存在于测试单元中的流体内且通过激光束的每个粒子产生信号，信号数目对应于测试单元中粒子的统计分布。当粒子，即使是非常小的粒子，通过激光焦点中的光锥时，它们阻隔光，如同投射出阴影。测量原始亮度(没有所述粒子阴影)的改变。高速计算机例如奔腾计算机每秒可以分辨高达10,000个粒子通道。小粒子比大粒子移动地更快，所以转变时间是对粒径的直接测量。

如果在同一时间内激光束中存在多个粒子，则只能测量最大的粒子。利用粒子通过激光束的不同速率，可以通过本领域技术人员公知的Stokes-Einstein方程式计算相应的粒径。在这种测量中，重要的并非绝对粒径，而是粒径的改变(由于粒子生长而导致的)。所使用的特定过滤器作为用于确定粒子生长开始的测量。过滤器孔径越大，则沉淀物必须生长得越大，以便能从“背景噪声”中分辨出来。对于100-200nm的过滤器来说，略微生长的粒子将足以产生可检测的信号。因为所述粒子是统计分布的，粒子生长也将总是发生在位于测量单元中心的激光焦点上。

通过测量粒子通过光束所需的转变时间(亮度变化从开始到结束)，测量所述粒子通过激光束的速率。

在此可以观察到，在较清洁的溶液中，更大可能性的是单个、单独的粒子存在于激光束中；或者，在污染较严重的溶液中，更多信号将被重叠，导致灵敏度降低。

信号强度取决于抗原-抗体沉淀物的尺寸和数目。

当抗体浓度恒定时，所测量信号的降低与抗原浓度直接相关。

在依据本发明的检测过程中，可以如下操作：将所有待测试的流体通过具有特定孔径的过滤器注入测量单元，使得在试样流体或抗体流体的单独观测中，仅有表示小于特定粒径的粒子的信号出现在评价中。在依据本发明的方法中，所使用的抗原和抗体均具有小于所述尺寸限制的粒径，并且因而都小于用于分离的过滤器的孔径(例如小于200nm)，使得它们在分离期间不被去除。

图2a中示出利用基于NaCl溶液试样流体而记录的这种图像的例子。在这些图中，沿x轴描述粒径，沿y轴描述粒子数目。如图2a中所示，仅存在至多为特定最大粒径的粒子，并且粒径越大则存在的粒子越少。对于过滤后的基本上只含有特定粒径的粒子的抗体流体，也获得类似检测结果(未显示)。

在同时、单独地注入试样流体和抗体流体之后，在测试单元中发生反应，产生微沉淀物，并且进行抗原-抗体沉淀物尺寸和数目的检测。

图2b中示例性地阐述了这种检测的结果，其中观察到大于特定粒径限制例如200nm的粒子存在。像这样更大粒子的形成表明发生了反应。如果，相反地，没有发生生成更大粒子的反应，那么被检测的液体就不含有相应的抗原。

在将试样流体和抗体流体填充至反应单元之后，任何时刻都可开始进行所述测量。依据本发明的一个实施方案，在装填测量单元之后例如不早于60秒钟时开始所述测量，这是因为注射速率的微小波动可能导致测量单元中对流的不同。在另一个60秒之后，例如，获得最大沉淀。随后发生的测量信号下降容许获得不同抗原浓度的近似定量检测或估计。此时，两种反应物的起始浓度都是重要的。这些起始浓度越高，则直至可检测到沉淀最大值下降所需的时间就越长。

当实施依据本发明的方法时，有利的是，使用尽可能纯的流体，例如在它们使用之前，采用具备合适孔径如200nm的过滤器过滤后的流体，以消除或最小化检测过程中的背景噪声。此外，在依据本发明的方法中所用装置的材料应释放尽可能少量的粒子。例如，所述测量单元可由PTFE(聚四氟乙烯)制备。而且，可以将测量持续时间尽可能缩短，以阻止所使用的材料(例如测量单元)持续释放粒子。

此外，所使用的抗原或抗体溶液的浓度应较低，以使发生的抗原-抗体反应不会产生太多的沉淀、或者太大的沉淀，否则在光束中可能同时存在多个粒子，并且非常难以检测转变时间。依据本发明的方法的最高灵敏度在10^-15摩尔-10^-18摩尔范围内。

特别有利的是，依据本发明的方法也能产生定量或半定量的信息。

例如，可以使用两种方法来评价定量记录。在第一种评价方法中，确定在时间t1和t2(例如t1＝120秒，和t2＝180秒)时所测量的曲线下的面积(F)，对于从中可以随后获得粒子数目定量值的区域，通过

                            F_N＝(F_t1+F_t2) /2获得良好近似值F_N。在这些极低浓度下，粒子生长是线性的，也就是例如浓度加倍将导致所测量信号面积加倍。

一种获得定量信息的可选和/或补充方法是，基于将溶液稀释直到达到双分子反应的动力学极限。在低于100×10^-18摩尔浓度下，反应物粒子的平均自由行程变得很大(＞100μm)，并且在特定测量时间内将不会发生可检测的沉淀。在浓度大于10×10^-9摩尔时，由于反应产物过量且过大导致开始发生位阳现象，此外，上文解释的“前带现象”变得有效。例如在10微摩尔的溶液中，粒子的平均自由行程仅为100nm。

在这个物理终点所检测的稀释度仅仅取决于温度和对流，因为在高度稀释液如PBS(磷酸盐缓冲盐水)中粘度是不相关的。如果上述两个参数保持恒定，那么初始溶液的稀释度将是所检测溶液浓度的直接测量。

采用依据本发明的方法，通过含有已知浓度的被考查蛋白质的校准溶液，可以精确定量测定试样的浓度，并且为此目的采用本领域技术人员公知的程序。

依据所述方法的另一实施方案，可以对测量单元中流体进行连续测量和/或多个任意选择的试样测量。以这种方式，特别是可以确定反应的终点和计算记录的平均值。优选地，在添加抗体之前和/或在添加试样之前，对基本上不含有粒径大于特定值的粒子的载体流体进行测量；并且将这种测量的结果引证为沉淀物测量的参考值。

在依据本发明的方法中，相对少量的流体将足够；并且可以减少用于从所使用流体中去除那些粒径大于特定值的物质的操作。例如，所使用的流体也可以通过阀门装置转向，经旁路利用过滤器去除所述物质。所使用流体的过滤可以在引入试样之前进行特定、预定时间，从而确保其中不保留干扰测量的物质。试样中粒径大于特定值的物质具体可以通过集成在进料点或布置在这些点上游的过滤器来去除。所得的试样流体甚至可以在引入试样之后的一定时间内被过滤，以去除可能与该试样一起进入流体或可能来自管道系统的干扰性物质。

依据所述方法的另一实施方案，将引入抗体之后已经或尚未检测到抗原的载体流体，在引入另一种抗体之前再次过滤。这是为了去除同时已进入载体流体且可能干扰测量的物质。此外采用这种方式，可以从所使用的流体中去除被检测的反应产物，使得可以进一步分析试样中可能的组分。

依据本发明的方法适用于水溶液分析(组成和有害物质的检测)、食品技术(微生物、组成的检测)领域中、生物学或医学测试(如特定DNA或RNA序列、特定细菌或过敏原(过敏测试)的检测)中的各种应用。也能够应用于亲水性大分子多间隔物、支化DNA传感器或定量PCR中。更特别地，依据本发明的方法也可以用于BSE测试中传染性朊病毒蛋白质PrP^Sc的检测。由于在依据本发明的方法中，可以检测极少量的这种朊病毒蛋白质，因此依据本发明的方法也适用于血液中传染性朊病毒蛋白质PrP^Sc的检测。

此外，依据本发明的Q-MAP测量方法提供了快速、简易检测不同蛋白质在各种表面上吸附行为的可能性。这样，可以非破坏性地核实高度抛光表面的“蛋白质吸附值”，其中偏离额定值将表示表面存在缺陷。这样，采用这种方式，可以以简易且快速的方式检测如薄膜蒸发金属表面的表面缺陷。

此外，可以测试表面上特定蛋白质的完全固定，这在如DNA分析和生物芯片技术中是非常重要的。

依据本发明的方法的其它可能应用在于，确定表面上由化学品带来的影响。具体而言，例如可以观察检测由表面处理所产生变化的前后测试，因为腐蚀表面具有比未腐蚀表面更大的表面积，这样更大量的抗原材料例如蛋白质-将吸附在该表面上。例如可以以这种方式检测溶液中残留的自由蛋白质的量。

然而，另一应用是基于以下事实：利用依据本发明的方法，可以检查软管和导管内表面的状况。

在结束依据本发明方法的过程之后，抗原-抗体沉淀物可以例如在物质不被蛋白酶K破坏的情形下(如不含氨基酸的蛋白感染素和物质)利用蛋白酶K而溶解，随后可以进行进一步的处理或测试步骤。

如上文中详细描述的那样，依据本发明方法的另一重要优点在于，其也能够进行定量检测。此外，所述方法是完全自动化的，其带来人工成本的明显降低，使得所提供的方法可以是同等节省成本的。

此外，，依据本发明的方法能够检测体液或排泄物中尤其是血液中的微量病菌。这代表了重要的优点，因为少量的血液例如小血滴(约10-20μL)，很容易从指尖或耳垂使用毛细管来获得，而不需要医师或经专门训练的护士。这样的测试容易例如在药房或老年人家中或康复机构中进行，从而简易且快速地提供是否存在特定细菌感染的信息。特别有利的是，利用根据本发明的装置的制样和操作可以实现依据本发明的方法，所述装置均不需要任何经医学训练的或高资格的人员。作为选择，通过这种测试，使用特定抗体当然可以检测血液中其它物质，如药品或药物。

虽然在商业测量装置中，抗原与抗体的比率不必差别大于2-3倍，但是当偏离抗原与抗体之间理想混合比率100倍时，使用Q-MAP仍能进行测量。(在抗体浓度恒定时，抗原的理想浓度降低到1％和升高到10,000％。相反，当抗原浓度恒定时，同样如此。)由于这种由分子的低位阻现象引起的对于10^-15摩尔和10^-18摩尔范围内的“Heidelberger曲线”的有趣偏离，导致耗时的稀释液系列变得不必要了。

依据本发明的方法，特别地适用于测试成批试样，尤其对于测试储存的血液(对于HIV或肝炎)和BSE测试样品感兴趣。采用依据本发明的方法，可以每小时进行约50次测量，这意味着如每天工作8-10小时则可以每天进行至少400次测量或每年进行80,000次以上的测量。这样当每次联合测量10-100个试样时，则可以只通过一台测量装置每年测试800,000-8,000,000个试样。

当测试储存的血液时，例如可以同时将10种不同抗体(对应于10种不同抗原)加入血液中，以确定这种血液是否可以被使用。在阳性反应情形下，储存的血液必须被抛弃，因为其不能确定是否受到例如HIV或肝炎的污染。此外，当感兴趣的是知道哪种试剂实际触发了阳性反应时，随后可以单个引入抗体。例如通过从100个储存血液容器中组合该血液，并且同时使用10种不同抗体，可以通过需要约60秒的单个测量发现所有100个容器中的血液是否适合使用。

到目前为止，这样的微量产物即足够且具有低至10^-15摩尔或10^-18摩尔范围内的相当高灵敏度的测试在本领域内是非公知的，并且代表了重要的进步。

此外，本发明包括计算机程序产品，其包括储存于计算机可读介质中的程序代码方法，当该计算机程序产品在计算机、网络装置或装置、特别是分析检测装置上执行时能实现依据本发明的方法。本发明进一步提供计算机程序产品，其包括可从服务器下载的程序代码，当该计算机程序产品在计算机、网络装置或装置、特别是分析检测装置(例如本申请所述检测装置)上执行时能实现依据本发明的方法。

本发明还涉及检测微量粒子的装置，也称为“Q-MAP”(10^-18摩尔沉淀产物的定量检测)装置。

这样的装置包括光源，激光器被用作优选的光源。

这种装置的测量单元应由基本上不释放粒子且容许光束、特别是激光束通过的材料制备。这种材料是本领域技术人员公知的。例如，测量单元可以由PTFE(聚四氟乙烯)制备。测量单元具有小于100μl的容积，优选30-50μl，特别是40μl。

依据本发明的装置具体包括适合可调节信号放大器和可调节操作点的光电探测器。

光电探测器可以选自，例如热探测器、光电二极管、特别是光电导探测器、光致电压探测器、雪崩式二极管、二极管阵列、光电倍增器。

依据本发明的检测装置具体容许检测20nm-5μm之间的粒子。

此外，本发明也提供定性和/或定量检测待测特定粒子如蛋白质或激素的试剂盒，所述特定粒子具有至少两个抗体结合位点。该试剂盒包括上文中所述的检测装置、至少一种能够特异性结合到特定粒子的抗体和至少一种容纳试样的合适流体。这样的试剂盒可以为使用者的特定需要而设计，并且含有匹配组件以及相应的使用者说明书，使用者使用这种试剂盒将能够快速且非常容易地实现依据本发明的检测。例如，这样的试剂盒可以用于检测微量血液中的特定病菌，或者用于上述应用中的表面研究。

图3的详细说明

下面，将借助于所附示意性、作为例证的但并非限制性的装置图来详细说明本发明。

试样变换装置1可以将不同种类的抗原溶液(例如血液试样)和不同种类抗体溶液注入各自的混合容器2和3中，使得对于各种可能的细菌可以连续地进行试样检测。混合器2和3分别用于抗原和抗体溶液，不仅适用于各自溶液的稀释，也适用于采用缓冲剂(PBS)或抗体溶液漂净测量单元。

过滤器4是可更换的，并且孔径为例如200nm。阀门5可以开关，使得溶液可以单独或共同流入测量单元6，在测量单元中采用测量装置连续、单次、或任意多次进行测试。

泵7例如是一种小型真空泵，用于抽取所有溶液。其与阀门5协同工作，并且在测量之后，将测量单元内的物质泵送到废物回收器8。这种回收器可以提供有例如消毒或杀菌的液体，使得可以立即将所有潜在的危险物质无害化。

如果引入的抗体与来自试样的抗原反应形成抗原-抗体沉淀物，则形成粒径大于特定值的粒子。这些沉淀物产生显著区别于粒径低于特定值且可能仍然存在于载体流体中的粒子的信号。因此，通过检测装置可以唯一地检测出这些反应产物。从这些检测结果出发，得到在试样中存在特定物质，并且如果需要，依据上文中描述的方法，可以确定它的浓度。

如果在注入第一种抗体溶液之后，检测装置未检测到大于特定粒径的粒子，或者如果进一步证实试样中存在与所使用抗体未特异性反应的抗原，则随后可以引入另一种抗体溶液。在这之前，如果需要可以将已经检测的任意沉淀物从测量单元中冲洗掉。

以下实施例用于解释本发明。但是，并非是将本发明的保护范围限定于这些实施例的主题名称。

实施例

实施例1：BSE血液测试

在德国家畜数量为约1500万头。在德国每年要对死亡动物的脑进行200万到300万次BSE测试(ELISA和Western Blot)。目前，BSE快速测试(ELISA或Western Blot)需要6-8小时。采用依据本发明的方法，可以在2分钟内，只使用一滴血液来检测活动物体内的BSE病原体，成本降低到只是其一小部分。

实施例2：检查储存血液的新变种Creutzfeldt-Jakob疾病(nvCJD)

存在各种自身用于保护群体免受nvCJD通过血液传播的可能风险的作用。最有前景的措施是，测试每个捐献血液是否受到如肝炎和艾滋病的感染。但是，患者体内只存在微量的病原体。现有技术中还不存在可信赖的测试。

依据本发明的方法，能够检测血液或血液产品内的病原体。

实施例3：食品工业中的应用

霉菌毒素是特定真菌类的高毒性降解产物。霉菌毒素为抗原，因此可以采用上述测量方法定性和定量地检测。

对于如整船咖啡、茶叶、面粉、或坚果的筛选测试，现场可以进行的定性检测在约两分钟内就足够。

为了发现动物是否已用激素非法催肥，对一个肉类试样必须测试约15种可能使用的激素。激素也是抗原，并且液可以采用依据本发明的方法同时定性和定量地对其检测。例如在验孕和甲状腺测试中也需要激素测试。

较大的屠宰场每月处理2000-3000头家畜，因此，为了查处非法催肥，需要约50-100个随机试样。目前，激素测试的价格(包括15种不同激素)是每份肉类600欧元。因此，屠宰店内每个月只随机测试5-10个试样，这远不足以查处非法催肥。在与大型屠宰场的交流中，感兴趣的是可以进行成本低十多倍的基于依据本发明的方法的测试(每份肉类为约60-70欧元)。传统的激素测试不可能达到这种价格。

实施例4：杀虫剂的检测

微管蛋白单体是小的单个蛋白质球体，通过与能量载体GTP反应生长为长链。抑制剂和其它毒素阻碍或阻止这种链生长。单个链缠结形成绳状结构，即所谓的原丝。这些原丝依次联合，形成微管蛋白，其在细胞分裂中起到决定性作用。通过干扰单体的链形成，可以控制细胞分裂和杀死有害物。

相反，本方法也提供检测食品中植物杀虫剂残留物的可能性，因而提供增强的消费者保护。采用依据本发明的方法，上述的链生长和所述保护都是可以直接检测的。

Claims (12)

1、一种通过检测抗原-抗体沉淀物而检测微量粒子的方法，其包括：

提供基本上含有具备特定最大粒径的粒子的试样流体，所述粒子具有至少两个抗体结合位点；

提供含有抗体的流体，所述流体基本上含有具备特定最大粒径的粒子；

使所述试样流体与所述含抗体的流体接触，其产生反应流体，当存在具有至少两个抗体结合位点的粒子时，所述抗体可以形成抗原-抗体沉淀物；

引导光束通过所述反应流体；

当由激光器生成的光通过含所述反应流体的测量单元时，通过使用光电探测器测量在所生成光锥的明-暗边界处的消光来检测信号，所述信号的强度取决于所形成的抗原-抗体沉淀物的尺寸和数量。

2、权利要求1的方法，其中所述试样流体含有每升10^-15摩尔或10^-18摩尔数量级的粒子。

3、前述权利要求中任一项的方法，其中提供基本上含有具备特定最大粒径的粒子的试样流体的步骤包括：

a)提供流体，

将试样引入所述流体，和

分离超过特定粒径的粒子，以获得基本上只含有具备特定最大粒径的粒子的试样流体，或

b)提供基本上含有具备特定最大粒径的粒子的流体，和

将试样引入所述基本上含具备特定最大粒径的粒子的流体，以获得基本上含有具有特定最大粒径的粒子的试样流体。

4、前述权利要求中任一项的方法，其中利用过滤器来进行尺寸超过特定最大粒径的粒子的分离，所述过滤器孔径优选为20-450nm，更优选为100-300nm，尤其是200nm。

5、前述权利要求中任一项的方法，其中将至少两种单克隆抗体或一种多克隆抗体用作所述抗体。

6、前述权利要求中任一项的方法，其中所述抗体选自免疫球蛋白G或免疫球蛋白M。

7、前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法容许定量地或半定量地检测粒子的数量。

8、前述权利要求中任一项的方法，其中当抗体浓度恒定时，所测量信号的降低与抗原的浓度直接相关。

9、一种含有储存于计算机可读介质中的程序代码方法的计算机程序产品，当所述计算机程序产品在计算机、网络装置或装置、特别是分析测试装置中被执行时，所述计算机程序产品用于实现权利要求1-8中任一项的所述方法。

10、一种含有可从服务器下载的程序代码的计算机程序产品，当所述计算机程序产品在计算机、网络装置或装置、特别是分析测试装置中被执行时，所述计算机程序产品用于实现依据权利要求1-8中任一项的所述方法。

11、一种用于检测微量粒子的装置，其包括：

激光器，

测量单元，和

光电探测器，其设计用于当由所述激光器生成的光通过含流体中粒子的测量单元时测量所生成光锥的明-暗边界处的消光，

其中，所述光电探测器具有可调节的信号放大器和可调节的操作点。

12、一种用于定性和/或定量检测待测特定粒子的试剂盒，其中所述特定粒子具有至少两个抗体结合位点，所述试剂盒包含：

至少一种能够特异性结合至所述特定粒子的抗体，和

至少一种用于容纳所述试样的合适流体，和

用于检测微量粒子的装置，所述装置包含：

激光器，

测量单元，和

光电探测器，其用于当由所述激光器生成的光通过含流体中粒子的测量单元时测量所生成光锥的明-暗边界处的消光。

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