EA008859B1 - Способ и устройство для детектирования очень малых количеств частиц - Google Patents

Способ и устройство для детектирования очень малых количеств частиц Download PDF

Info

Publication number
EA008859B1
EA008859B1 EA200600387A EA200600387A EA008859B1 EA 008859 B1 EA008859 B1 EA 008859B1 EA 200600387 A EA200600387 A EA 200600387A EA 200600387 A EA200600387 A EA 200600387A EA 008859 B1 EA008859 B1 EA 008859B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
fluid
particles
antibody
sample
antibodies
Prior art date
Application number
EA200600387A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200600387A1 (ru
Inventor
Константин Одефей
Original Assignee
Вернер, Фридрих
Константин Одефей
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Вернер, Фридрих, Константин Одефей filed Critical Вернер, Фридрих
Publication of EA200600387A1 publication Critical patent/EA200600387A1/ru
Publication of EA008859B1 publication Critical patent/EA008859B1/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/59—Transmissivity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/82—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a precipitate or turbidity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
    • Y10T436/101666—Particle count or volume standard or control [e.g., platelet count standards, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Geophysics And Detection Of Objects (AREA)

Abstract

Изобретение относится к способу и устройству для детектирования очень малых количеств частиц. Заявленный в изобретении способ основан на детектировании продуктов взаимодействия антиген-антитело и обеспечивает очень высокую чувствительность детектирования вплоть до фемтомолярного или аттомолярного диапазона.

Description

В настоящем изобретении предложен способ и устройство для детектирования очень малых количеств частиц путем детектирования продуктов взаимодействия антиген-антитело, причем способ обладает очень высокой чувствительностью детектирования вплоть до фемтомолярного или аттомолярного диапазона.
Из уровня техники известно несколько способов детектирования малых количеств частиц, например нефелометрический и турбидиметрический способы, а также способы, называемые динамическим светорассеянием (ДСР).
При нефелометрическом и турбидиметрическом способах используется эффект Тиндаля, при котором освещение малой частицы продуцирует широкоугольное рассеянние света. Рассеяние света может быть определено путем измерения уменьшения интенсивности падающего светового луча после прохождения через рассеивающую среду или путем определения интенсивности света, отклоненного в сторону. Первый случай именуется как способ турбидиметрии или измерения экстинкции, а последней случай присущ нефелометрии или тиндаллометрии.
Способы, именуемые способами динамического светорассеяния (ДСР), дают возможность еще для одного подхода. В этих способах наблюдают только за одной (или несколькими) точками на световой сфере, окружающей частицу, и дополнительно анализируют модуляцию яркости, вызванную броуновским движением. Путем фокусировки на очень маленький контролируемый объем пытаются уменьшить интерференцию вследствие наложения отраженного света с нескольких частиц. В результате частица проходит очень быстро через очень маленький освещенный объем так что анализирующая оптоэлектроника должна обнаружить значительные частоты колебания. Получение большого количества информации обеспечивается путем сложной обработки сигнала, так что эти системы только условно подходят для количественного анализа.
Способы детектирования в соответствии с предшествующим уровнем техники демонстрируют дополнительные недостатки. Во-первых, следует упомянуть о том, что хотя чувствительность детектирования только что описанных способов в последние годы была существенно увеличена, тем не менее, в самых разнообразных областях сохраняется значительная потребность в способах детектирования, обладающих более высокой чувствительностью. Кроме того, способам детектирования в соответствии с предшествующим уровнем техники все же требуются относительно большие количества образцов, что особенно в способах медицинских технологий может вызывать стресс у обследуемого индивида.
Таким образом, задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ детектирования малых количеств частиц, демонстрирующий более высокую чувствительность по сравнению со способами в соответствии с предшествующим уровнем техники. Кроме того, для такого способа должно требоваться меньшее разбавление образца и/или меньшее минимальное количество образца должно быть необходимо для анализов образцов в больших масштабах, и после элементарной тренировки способ должен быть осуществимым персоналом без специального предшествующего опыта. Кроме того, задача изобретения заключается в том, чтобы предложить устройство для детектирования малых количеств частиц.
Эту задача решается тем, что предложен способ детектирования малых количеств частиц путем детектирования преципитатов антиген-антитело, включающий приготовление текучей среды, включающей образец, которая по существу содержит частицы с заданным максимальным размером, причем частицы имеют по меньшей мере два сайта связывания антител; приготовление текучей среды, содержащей антитела, которая содержит по существу частицы с заданным максимальный размером; приведение текучей среды, включающей образец, в контакт с текучей средой, содержащей антитела, что дает реакционную текучую среду, где в присутствии частицы, имеющей по меньшей мере два сайта связывания антител, антитело может образовывать преципитат . антиген-антитело; пропускание светового луча через реакционную текучую среду; детектирование сигнала путем измерения экстинкции фотодетектором на границе свет-тьма конуса света, возникающего тогда, когда свет, генерируемый лазером, проходит через измерительную ячейку, содержащую реакционную текучую среду, причем сила сигнала зависит от размера и количества образовавшихся преципитатов антиген-антитело.
В настоящем изобретении также предложено устройство для детектирования малых количеств частиц, которое содержит: источник света, измерительную ячейку и фотодетектор, который разработан для измерения экстинкции на границе свет-тьма конуса света, возникающего тогда, когда свет, генерируемый лазером, проходит через измерительную ячейку, содержащую частицы в текучей среде. Свет, отраженный вперед, образует конус, и фотодетектор нацелен на его границу свет-тьма. Лазер и фотодетектор являются по существу соосными, хотя отклонение таково, что лазерный луч проходит очень близко с фотодетектором.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1а-1г схематически иллюстрируют процессы, происходящие при образовании преципитата антиген-антитело с использованием двухвалентного антитела.
Фиг. 2а иллюстрирует результат детектирования с использованием способа в соответствии с изобретением, где текучую среду, включающую образец, содержащую частицы, тестировали после фильтрации с использованием фильтра, имеющего размер пор 200 нм (но перед добавлением антител). Сигна
- 1 008859 лы соответствуют частицам, имеющим диаметры меньшие, чем размер пор используемого фильтра. На оси абсцисс представлен размер частиц, на оси ординат представлено количество частиц.
Фиг. 2б иллюстрирует результат детектирования в случае, когда исследовали реакционную смесь, которую получали при одновременной раздельной инъекции растворов текучей среды, включающей образец, и текучей среды с антителами, причем обе текучие среды фильтровали с использованием фильтра, имеющего размер пор 200 нм. В этой реакционной смеси происходит взаимодействие и образуются микропреципитаты, которые имеют диаметры больше чем размер пор используемого фильтра. На оси абсцисс представлен размер частиц, на оси ординат представлено количество частиц.
Фиг. 3 демонстрирует схематичное изображение устройства для практического применения способа в соответствии с изобретением.
В многочисленных экспериментах, приведших к созданию настоящего изобретения, был разработан способ, чувствительность которого превосходит чувствительность сравнимых способов предшествующего уровня техники в 1000 раз. Это значительное увеличение чувствительности является результатом модифицированного способа физического детектирования в сочетании с приведенным в соответствие с ним приготовлением анализируемого образца, при котором сигнал детектируют путем измерения экстинкции фотодетектором на границе свет-тьма конуса света, возникающего тогда, когда свет, генерируемый лазером, проходит через измерительную ячейку, содержащую реакционную текучую среду.
Кроме того, настоящее изобретение создает возможность уменьшения объема измерительной ячейки приблизительно в 30-50 раз. В то время как в способах в соответствии с предшествующим уровнем техники требуются измерительные ячейки, имеющие объемы порядка, например, 1,6 мл, в способе в соответствии с изобретением могут быть использованы измерительные ячейки, имеющие объем порядка микролитров (например 40 мкл). Это представляет собой важное преимущество, поскольку каждый образец должен быть разведен для того, чтобы дать однородную матрицу, которая, например, обладает одной и той же прозрачностью, вязкостью и т. д. Соответственно, в способе в соответствии с изобретением образец должен быть разбавлен в меньшей степени по сравнению со способами в соответствии с предшествующим уровнем техники.
Кроме того, с помощью способа в соответствии с изобретением можно уменьшить минимальное требующееся количество образца. В то время как в способах в соответствии с предшествующим уровнем техники требуется больше чем 100 мкл, в способах в соответствии с изобретением будет достаточно количество образца во много раз меньше (например 3,5 мкл).
В настоящей заявке термин частицы означает любой трехмерный объект, имеющий показатель преломления, отличающийся от показателя преломления несущей среды.
Используемый в настоящей заявке термин преципитация описывает процесс, при котором взаимодействие растворимых антигенов со специфическими антителами приводит к образованию комплекса антиген-антитело, обладающего меньшей - растворимостью в используемом растворителе по сравнению с используемыми антигеном и антителом, причем это взаимодействие сначала приводит к помутнению реакционной смеси, а затем к седиментации этого комплекса антиген-антитело.
Способ в соответствии с изобретением делает возможным детектирование малых количеств частиц. Например, путем использования способа в соответствии с изобретением может быть достигнут предел детектирования в диапазоне фентограммов и аттограммов на литр для низкомолекулярных веществ, т. е. веществ, имеющих молекулярную массу меньше 500 г/моль, тогда как до настоящего времени предел детектирования как правило находился в диапазоне микрограммов, нанограммов или пикограммов на литр. Предел детектирования является более высоким для веществ, имеющих молекулярную массу в диапазоне выше 500 г/моль. Например, для веществ, имеющих молекулярную массу 150000 г/моль (например антитела 1дС), предел детектирования составляет приблизительно 300 фемтограмм/литр. Это означает, что содержание частиц в текучей среде с образцом может иметь порядок величины фемтомоль или аттомоль на литр.
На первой конкретной стадии способа в соответствии с изобретением приготавливают текучую среду, включающую образец, которая по существу содержит частицы, имеющие заданный максимальный размер. Существуют, в частности, два пути осуществления. В соответствии с первой возможностью изначально берут текучую среду, которая по существу содержит только частицы, имеющие заданный максимальный размер, а затем к этой текучей среде добавляют образец, который по существу содержит частицы, имеющие заданный максимальный размер. В соответствии со второй возможностью для приготовления текучей среды, включающей образец, можно сначала взять текучую среду, добавить к этой текучей среде образец и затем удалить частицы, размер которых превышает заданный размер.
Максимальный размер частиц в текучей среде, включающей образец, и в других текучих средах, которые по существу содержат только частицы заданного максимального размера, может быть выбран в зависимости от желаемого применения. Для множества обычных антител могут быть отделены частицы, превышающие 20-450 нм, более предпочтительно превышающие 100-300 нм и в особенности больше чем 200 нм. Это отделение может быть осуществлено, например, с помощью фильтров, имеющих подходящий соответствующий размер пор, составляющий 20-450 нм, более предпочтительно 100-300 нм и в особенности 200 нм, или при помощи других способов, известных специалистам в данной области техники.
- 2 008859
Если агглютинацию в качестве аппроксимации рассматривать как поверхность, то уменьшение размера фильтра вдвое окажет влияние на количество молекул, которые дадут детектируемые продукты взаимодействия, в квадратичной пропорции. Если, например, использовать фильтр 100 нм вместо фильтра 200 нм, то только приблизительно четвертая часть того количества молекул антинген-антитело, которое требуется при использовании фильтра 200 нм, должна провзаимодействовать друг с другом для достижения детектируемого результата. Кроме того, при использовании фильтров 25 нм может оказаться, например, возможным детектировать тримеры антиген-антитело-антиген. При использовании фильтров, имеющих такой небольшой размер пор, следует соблюдать особенную осторожность, поскольку уже несколько молекул приведут к детектируемому взаимодействию.
Для того, чтобы произошла реакция перекрестного связывания, частицы, содержащиеся в текучей среде, включающей образец, должны иметь по меньшей мере два сайта связывания антител и тем самым быть способными действовать в качестве антигена. Фиг. 1а-1г схематично иллюстрируют тот факт, что экзогенные вещества или частицы, такие как бактерии, вирусы, токсины и белки, действуют в качестве антигенов и взаимодействуют с антителом в соответствии с принципом ключ-замок (фиг. 1б). Двухвалентное антитело, такое как антитело 1дС. будет затем связывать два антигена (фиг. 1в). Поскольку каждый антиген может связываться с несколькими антителами, происходит перекрестное связывание (преципитация), которое детектируют при помощи способа в соответствии с изобретением (фиг. 1г). Аналогичная преципитация происходит с антителами, имеющими большую валентность. Если используемый антиген предоставляет большее количество сайтов связывания антител, возникает преимущество, заключающееся в том, что реакция перекрестного связывания будет протекать с большей вероятностью.
Способ в соответствии с изобретением подходит для любого антигена при условии, что у него имеются по меньшей мере два сайта связывания антител. Предпочтительно тестируемые частицы должны быть больше чем приблизительно 10 нанометров и в то же самое время они должны быть меньше чем выбранный максимальный размер частиц. Молекулы, которые меньше 10 нм, могут действовать в качестве гаптенов. Гаптены представляют собой неполные антигены, т.е. их молекулы недостаточно велики для того, чтобы запустить иммунный ответ или вызвать агглютинацию. Эти низкомолкулярные вещества в действительности высоко специфичны в отношении сайта связывания паратопа антитела, но они не выдаются достаточно далеко от этого сайта связывания для того, чтобы второе антитело было способно связаться с ними. Они блокируют конкретное антитело без возможности протекания реакции перекрестного связывания. Более крупные антигены, такие как бактерии, перед измерениями должны быть разрушены химическим или физическим путем, что может быть осуществлено при помощи нескольких способов, известных специалистам в данной области техники, например при помощи ультразвука, кислот, оснований или поверхностно-активных веществ. Это обеспечивает преимущество, заключающееся в том, что таким путем из одной бактерии получают множество фрагментов, и больше не возникает необходимость обеспечивать отдельным бактериям возможность агглютинировать. Полученные таким образом фрагменты, например поверхностные белки, в свою очередь представляют собой меньшие антигены и могут приводить к возникновению специфически измеряемого взаимодействия с подходящими антителами.
Кроме того, антиген должен быть по существу растворимым в используемом буфере и должен обладать низкой адсорбционной аффинностью в отношении стенок устройства и используемых фильтров.
Способ в соответствии с изобретением дополнительно включает обеспечение текучей среды, содержащей антитела.
В способе в соответствии с изобретением в принципе может быть использовано любое желаемое антитело. Антитела, которые, как показано, являются особенно пригодными для способа в соответствии с изобретением, представляют собой, например, двухвалентный иммуноглобулин О (1дО) или декавалентный иммуноглобулин М (1дМ). В соответствии со способом, известным специалистам в данной области техники, таким образом могут быть получены антитела, обладающие хорошо определенной специфичностью.
Также могут быть использованы другие антитела, которые относятся к другому классу антител, в зависимости от обнаруживаемых частиц. Антитела могут быть моноклональными или поликлональными. При использовании моноклональных антител для получения преципитации могут быть введены два моноклональных антитела, направленные на разные антигены Тем же самым образом как упомянуто выше в отношении антигена, антитело также должно быть по существу растворимым в используемом буфере и обладать низкой адсорбционной аффинностью в отношении стенок устройства и используемых фильтров.
В способе в соответствии с изобретением нежелательного слишком большого избытка антигенов или антител можно избежать различными путями, например при помощи подходящих серий разведений. Иначе такой слишком большой избыток антигенов или антител может привести к ингибированию преципитации (так называемый феномен прозоны), поскольку в присутствии большого избытка антител каждый эпитоп (сайт связывания антигена) будет только моновалентно связываться с одним антителом, и перекрестное связывание не будет больше возможно, либо поскольку в присутствии слишком большого избытка антигенов часто образуются тримеры из молекулы антитела и двух молекул антигена.
- 3 008859
Как для приготовления текучей среды, включающей образец, так и для приготовления текучей среды, содержащей антитела, в принципе в качестве текучей среды может быть использован любой газ или жидкость. Предпочтительно текучая среда представляет собой жидкость. Часто жидкости представляют собой воду или буферные растворы, известные из уровня техники, такие как забуференный фосфатом физиологический раствор (ЗФР), особенно в аналитических способах, основанных на биохимической реакции. В принципе жидкость также может представлять собой любую другую прозрачную жидкость, например жидкие углеводороды, кислоты или основания.
В способе в соответствии с изобретением на следующей стадии текучую среду, включающую образец, приводят в контакт с текучей средой, содержащей антитела, где в присутствии антигена антитело может образовывать преципитат антиген-антитело, который в настоящее время может, например, быть детектирован с помощью устройства в соответствии с изобретением.
Кроме того, часто существует интерес к обнаружению наличия в образце гаптенов. Гаптены представляют собой неполные антигены, т.е. они слишком малы для того, чтобы связываться больше чем с одним антителом. В частности, гаптены могут представлять собой фармацевтические продукты, лекарства, пестициды, яды окружающей среды, стероидные гормоны или микотоксины. Гаптены специфически связываются с антителами. Однако они лишь блокируют сайт связывания паратопа антитела без возможности возникновения цепной реакции. Минимальный размер иммуногенов (полноразмерные антигены) составляет от 5 до 10 кДа, т.е. больше 30 аминокислотных остатков или длину больше 3 нм, поскольку начиная с этого размера по меньшей мере две молекулы антитела могут связываться с этими антигенами посредством соответствующих доступных сайтов связывания эпитопа и запускать цепную реакцию, часто приводящую к преципитации.
Определение гаптенов может быть осуществлено, например, с помощью гидрофильных макромолекулярных мультиспейсеров (ГММ) или родственных соединений, известных специалистам в данной области техники. Гидрофильные макромолекулярные мультиспейсеры известны из уровня техники и состоят из гидрофильной макромолекулы, такой как альбумин. Одинаковые молекулы гаптенов или разные молекулы гаптенов химически соединяют с этой гидрофильной макромолекулой через спейсеры, известные из уровня техники. Если гидрофильный макромолекулярный мультиспейсер имеет по меньшей мере две идентичные молекулы гаптенов, он может быть использован для преципитации. Такая молекула может быть использована для теста на скрининг антител, основанного на реакции замещения. Таким образом, гаптены обеспечивают конценпцию измерений, основанную на реакции замещения, пример которой приведен далее, где реакционные пики наблюдаются только в отрицательном тесте, т.е. детектирование продуктов реакции осуществляется только при помощи отрицательных тестов.
Когда образец крови или слюны должен быть тестирован в отношении гаптена, например кокаина, антитело, которое направлено против кокаина, добавляют к разведенной капле крови или слюны. Приблизительно через одну минуту добавляют небольшое количество синтетически полученного кокаинГММ, т.е. гидрофильной макромолекулы, связанной посредством спейсеров с кокаиновыми молекулами.
Когда в образце присутствует кокаин, он действует в качестве гаптена и блокирует сайты связывания антитела. Последующее добавление кокаин-ГММ не дает эффекта. Когда в образце кокаин отсутствует, никакие сайты связывания с антителом не блокируются, и добавление кокаина-ГММ приводит в результате к образованию цепей, которое может быть измерено в виде роста частиц с использованием способа в соответствии с изобретением, например с использованием описанного здесь устройства количественного измерения аттомолярных количеств продуктов преципитации (КИАПП), описанного далее.
В способе в соответствии с изобретением световой луч, в частности когерентный свет, такой как лазерный луч, пропускают через тестируемую жидкость. Далее описан способ в соответствии с изобретением, относящийся к лазерному лучу, но он также не исключает и других источников света, известных специалистам в данной области техники, также используемых в способе в соответствии с изобретением. Например, лазерный луч может быть получен с использованием устройства в соответствии с изобретением, которое подробно будет описано далее, также называемого КИАПП. Альтернативно, тем не менее, могут быть использованы другие устройства, основанные на описании настоящего изобретения, которые могут быть разработаны специалистом в данной области техники, исходя из идеи настоящего изобретения.
Лазер излучает луч через тестируемую жидкость и используется для определения количества и размера находящихся в ней частиц. Это осуществляют путем измерения с помощью фотодетектора экстинкции на границе свет-тьма конуса света, продуцируемого тогда, когда свет, генерируемый лазером, проходит через измерительную ячейку, содержащую реакционную текучую среду (где фотодетектор может обладать регулируемым усилением сигнала и регулируемой рабочей точкой), так что устройство действует в качестве молекулярного светового барьера. Описанное ранее устройство КИАПП может, например, обнаруживать размеры частиц от 20 нм до 5 мкм, хотя это измерение не может обеспечивать какуюлибо информацию относительно строения или состава обнаруживаемых частиц. Лазер и фотодетектор почти коаксиальны. Лазерный луч посходит очень близко с фотодетектором. Свет, отраженный вперед, образует конус, и фотодетектор нацелен на его границу свет-тьма.
Каждая частица, находящаяся в текучей среде в измерительной ячейке и проходящая через лазер
- 4 008859 ный луч, генерирует сигнал, причем количество сигналов соответствует статистическому распределению частиц в измерительной ячейке. Когда частицы, даже самые маленькие частицы, проходят через конус света в фокусе лазера, они блокируют свет таким образом, как если бы они бросали тень. Измеряют изменение исходной яркости (без тени частиц). Быстрый компьютер, например Реийит, может различать до 10000 прохождений частиц в секунду. Мелкие частицы движутся быстрее крупных, поэтому время прохождения представляет собой непосредственную меру размера частиц.
Если в лазерном луче находится несколько частиц одновременно, измеряют только наибольшую. Используя разные скорости, с которыми частицы проходят через лазерный луч, соответствующие размеры частиц могут быть рассчитаны при помощи уравнения Стокса-Эйнштейна, хорошо известного специалистам в данной области техники. В этом измерении особенно важным является не столько абсолютный размер частиц, сколько изменения размера частиц (вызываемые ростом частиц). Конкретный используемый фильтр служит мерой для определения начала роста частиц. Чем больше поры фильтра, тем более крупные преципитаты должны вырастать для того, чтобы быть отличимыми от фонового шума. При использовании фильтров 100-200 нм достаточно очень небольшого количества растущих частиц для генерирования детектируемого сигнала. Поскольку частицы имеют статистическое распределение, рост частиц всегда также происходит и в лазерном фокусе, то есть в центре измерительной ячейки.
Скорость, с которой частицы проходят через лазерный луч, детектируют путем измерения времени прохождения, необходимого для того, чтобы частица прошла через луч (от начала до конца изменения яркости).
Из представленного здесь очевидно, что в более прозрачном растворе более вероятно существование в лазерном луче индивидуальных отдельных частиц; или, чем более загрязнен раствор, тем больше сигналов будет накладываться, приводя к уменьшенной чувствительности.
Сила сигнала зависит от размера и количества преципитатов антиген-антитело.
При постоянной концентрации антител уменьшение измеряемого сигнала прямо связано с концентрацией антигенов.
В процедуре обнаружения в соответствии с изобретением, можно действовать следующим образом: все тестируемые текучие среды инъецируют в измерительную ячейку через фильтры, имеющие заданный размер пор, так что в отдельном наблюдении за текучей средой, включающей образец, или текучей средой с антителом, при оценке будут появляться сигналы, которые будут показателями частиц меньших, чем заданный размер частиц. В способе в соответствии с изобретением как используемые антитела, так и используемые антигены имеют размеры частиц ниже указанного предела размера, так что они меньше, чем размер пор фильтров, используемых для разделения (например меньше чем 200 нм), и поэтому они не удаляются при разделении.
Пример такого изображения, зарегистрированного для текучей среды с образцом на основе раствора №1С1. представлен на фиг. 2а. На этих изображениях размер частиц представлен вдоль оси абсцисс, количество частиц представлено вдоль оси ординат. На фиг. 2а представлены только частицы до заданного максимального размера частиц, и существует меньшее количесвто частиц, имеющих больший размер. Аналогичный результат детектирования получают для отфильтрованной текучей среды с антителами, по существу содержащей только частицы, имеющие заданный размер частиц (не представлено).
После одновременной раздельной инъекции текучей среды с образом и текучей среды с антителами в измерительной ячейке происходит взаимодействие, приводящее к микропреципитациям, и осуществляют детектирование размера и количества преципитатов антиген-антитело.
Результат таких измерений проиллюстрирован в качестве примера на фиг. 2б, где видно появление частиц, которые больше чем заданный предел размера частиц, составляющий, например, 200 нм. Образование более крупных частиц показывает, таким образом, что взаимодействие произошло. Если, напротив, взаимодействие, продуцирующее более крупные частицы не происходит, то тогда исследуемая жидкость не содержит соответствующего антигена.
Измерения могут быть начаты в любой момент времени после заполнения реакционной ячейки текучей средой с образцом и текучей средой с антителами. В соответствии с воплощением настоящего изобретения измерения начинают, например, не ранее чем через 60 с после заполнения измерительной ячейки, поскольку слабые колебания скорости инъекции могут приводить в результате к различиям конвекции в измерительной ячейке. Еще спустя, например, 60 с достигается максимальная преципитация. Происходящее затем уменьшение измеряемого сигнала делает возможным проведение приблизительно количественного детектирования или оценки различных концентраций антигена. Здесь важны исходные концентрации обоих реагентов. Чем выше эти исходные концентрации, тем дольше будет период времени до того момента, когда уменьшение максимума преципитации станет детектируемым.
При практическом применении способа в соответствии с изобретением удобно использовать текучие среды, имеющие самую высокую возможную чистоту, например текучие среды, профильтрованные перед их использованием через фильтр с подходящим размером пор, составляющим, например, 200 нм, для того, чтобы исключить или минимизировать фоновый шум в процессе детектирования. Кроме того, материалы устройств, используемых в способе в соответствии с изобретением, должны высвобождать наименьшее возможное количество частиц. Например, измерительная ячейка может быть изготовлена из
- 5 008859 политетрафторэтилена (ПТФЭ). Кроме того, период измерения следует делать максимально коротким для того, чтобы предотвратить непрерывное высвобождение частиц используемыми материалами (например измерительной ячейкой).
Кроме того, концентрации используемых растворов антигена или антитела должны быть достаточно низкими для того, чтобы протекающее взаимодействие антиген-антитело не приводило к образованию слишком большого количества преципитатов, или преципитатов, которые являются слишком крупными, поскольку иначе несколько частиц могут одновременно находиться в луче, и будет очень сложно детектировать время прохождения. Наивысшая чувствительность способа в соответствии с изобретением находится в фентомолярном и аттомолярном диапазоне.
Особенным преимуществом является то, что способ в соответствии с изобретением также обеспечивает получение количественной или полуколичественной информации.
Например, для оценки количественных данных могут быть использованы два способа. В первом способе оценки определяют площади (Р) под кривыми, измеренными в моменты времени П и 12 (например в моменты времени 11=120 с и 12=180 с), и хорошее приблизительное значение ΡΝ получают при помощи уравнения
Εν* (Ε(ΐ+Ε(2)/2, для площади, из которой затем может быть получено количественное значение для количества частиц. При таких чрезвычайно низких концентрациях рост частиц является линейным, т.е. удвоение концентрации приведет, например, к удвоению площади измеряемого сигнала.
Альтернативный и/или дополнительный способ получения количественной информации основан на разведении растворов до достижения кинетического предела бимолекулярного взаимодействия. При концентрациях ниже 100 аттомоль средний свободный пробег частиц реагентов становится слишком большим (больше 100 мкм) и не происходит детектируемой преципитации в течение заданного периода измерения. При концентрациях выше 10 нмоль начинают возникать стерические помехи вследствие слишком многочисленных и слишком крупных продуктов реакции и, кроме того, становится эффективным феномен прозоны, раскрытый выше. В 10-микромолярном растворе, например, средний свободный пробег частицы едва составляет 100 нм.
Степень разведения, детектируемая в этой физической конечной точке, зависит только от температуры и конвекции, поскольку вязкость не имеет значения при высоких разведениях, например, в ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор). Если эти два параметра поддерживать постоянными, то степень разведения исходных растворов будет представлять собой непосредственную меру концентрации исследуемых растворов.
Точное количественное определение концентрации образцов возможно с использованием способа в соответствии с изобретением путем калибровки раствора, содержащего известную концентрацию интересующего белка, и с этой целью применяют способы, известные специалистам в данной области техники.
В соответствии с еще одним воплощением способа могут быть осуществлены непрерывные измерения и/или измерения множества случайно выбранных образцов текучей среды в измерительной ячейке. Таким образом, в частности, можно детектировать конечную точку реакции и рассчитывать средние значения регистрируемых данных. Предпочтительно уже перед добавлением антител и/или перед добавлением образца несущую текучую среду, которая по существу не содержит частиц, имеющих размер больше заданного значения, подвергают измерению; и результат этого измерения приводят в качестве референсного значения для измерений преципитата.
В способе в соответствии с изобретением достаточны относительно небольшие количества текучей среды; и могут быть уменьшены усилия, прикладываемые для удаления из используемой текучей среды веществ, имеющих размер частиц, превышающий заданное значение. Например, используемая текучая среда также может быть отведена через клапанную конструкцию посредством байпаса с фильтром, удаляющим указанные вещества. Фильтрация используемой текучей среды может быть осуществлена в течение заданного заранее определенного периода времени перед введением образца таким образом, чтобы гарантировать, что в ней не останутся никакие вещества, повлияющие на измерения. Вещества в образце, имеющие размер частиц, превышающий заданную величину, могут быть удалены частным образом при помощи фильтров, которые встроены в точки подачи или располагаются выше от этих точек. Полученная таким образом текучая среда с образцом может даже быть профильтрована в течение определенного периода времени после введения образца для того, чтобы удалить мешающие вещества, которые могут попасть в текучую среду с образцом или могут попасть из системы трубок.
В соответствии с еще одним воплощением способа несущую текучую среду после введения антитела, которое привело к обнаружению антигена или не привело к обнаружению антигена, повторно фильтруют перед введением другого антитела. Эта операция служит для удаления веществ, которые проникли тем временем в несущую текучую среду и могут повлиять на измерения. Таким путем, кроме того, возможно удалить детектированный реакционный продукт из используемой текучей среды для того, чтобы сделать возможным анализ других компонентов образца.
-6008859
Способ в соответствии с изобретением подходит для различных применений в областях анализа воды (детектирование компонентов и вредных веществ), пищевой технологии (детектирование микроорганизмов, компонентов), в биологических или медицинских тестах (например детектирование определенных последовательностей ДНК или РНК, определенных бактерий или аллергенов (тесты на аллергены)). Применения возможны также в областях гидрофильных макромолекулярных мультиспейсеров, разветвленных ДНК сенсоров или количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Способ в соответствии с изобретением также может быть использован, в частности, для детектирования инфекционного прионного белка РтР8с в тестах на губкообразную энцефалопатию крупного рогатого скота (ГЭКРС). Поскольку в способе в соответствии с изобретением могут быть детектированы чрезвычайно малые количества этого прионного белка, способ в соответствии с изобретением также подходит для детектирования инфекционного прионного белка РтР8с в крови.
Кроме того, способ измерения КИАНН в соответствии с изобретением обеспечивает быструю простую возможность для тестирования адсорбционного поведения различных белков на различных поверхностях. Таким образом, хорошо отполированные поверхности могут быть проверены без разрушения в отношении величины адсорбции белка, где отклонения от расчетного значения будут указывать на дефект поверхности. Таким образом могут быть обнаружены дефекты поверхности быстрым и простым путем, например на тонких напыленных металлических поверхностях.
Кроме того, может быть протестирована полнота иммобилизации данных белков на поверхностях, которая весьма важна, например, в области анализа ДНК и биочиповой технологии.
Еще одно возможное применение способа в соответствии с изобретением заключается в определении влияния, оказываемого химическими соединениями на поверхность. В частности, могут быть предусмотрены тесты «до и после», детектирующие изменения, возникающие в результате обработки поверхности, поскольку корродированная поверхность имеет большую площадь поверхности по сравнению с некорродированной поверхностью, и поэтому большее количество антигенного материала, например белков, может адсорбироваться на этой поверхности. Таким образом может быть детектировано, например, количество свободных белков, оставшихся в растворе.
Еще одно применение основано на том факте, что с помощью способа в соответствии с изобретением можно проверить состояние внутренних поверхностей шлангов и трубок.
После прекращения процедуры способа в соответствии с изобретением преципитаты антигенантитело могут быть растворены, например, протеиназой К, в случае веществ, не разрушаемых протеиназой К (например прионов и веществ, не содержащих аминокислот), и затем подвергнуты дополнительной обработке или тестированию.
Еще одно важное преимущество способа в соответствии с изобретением, как подробно описано ранее, заключается в том, что оно также дает возможность для осуществления количественного детектирования. Кроме того, способ может быть полностью автоматизирован, что ведет к очевидному уменьшению трудовых затрат, поэтому предложенный способ может быть сравнительно рентабельным.
Кроме того, способ в соответствии с изобретением дает возможность для детектирования очень малых количеств патогенов в текучей среде организма или в экскретах, и в частности, в крови. Это обеспечивает важное преимущество, поскольку небольшие количества крови, например небольшую каплю крови (приблизительно 10-20 мкл), легко отобрать из кончика пальца или мочки уха при помощи капиллярной трубки без необходимости привлечения врача или обученной медицинской сестры. Такие тесты легко осуществить в аптеке или дома у пожилых людей или в реабилитационных центрах, например, таким образом просто и быстро получают информацию о том, присутствует ли инфекция данной бактерии. Особенно существенно, что и отбор образцов, и работа устройства в соответствии с изобретением, при помощи которого реализуют способ в соответствии с изобретением, не требуют какого-либо персонала, прошедшего медицинскую подготовку или имеющего высокую квалификацию. Альтернативно, другие вещества в крови, такие как лекарства или средства терапии, безусловно могут быть детектированы при помощи такого теста с использованием специфических антител.
В то время как в имеющемся в продаже измерительном оборудовании соотношение антигена к антителу не должно отличаться больше чем в 2-3 раза, с использованием КИАНН измерения еще возможны, когда отклонение от идеального соотношения смешивания антигена и антитела оставляет 100. (При постоянной концентрации антител идеальная концентрация антигенов была уменьшена до 1% и увеличена до 10000%. То же самое происходило, наоборот, при постоянной концентрации антигенов). Вследствие такого интересного отклонения от кривой Гейдельберга в фемтомолярном и аттомолярном диапазоне, которое вызывается низким стерическим затруднением молекул, исчезает необходимость в трудоемких сериях разведений.
Способ в соответствии с изобретением особенно подходит для тестирования объединенных образцов, что представляет особенный интерес для тестирования хранящейся крови (в случае вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) или гепатитов) и для тестирования образцов на ГЭКРС. Посредством способа в соответствии с изобретением может быть осуществлено приблизительно 50 измерений в час, что означает, что может быть осуществлено по меньшей мере 400 тестов в день или больше чем 80000 измерений в год при работе в течение 8-10 ч в день. Таким образом, 800000-8000000 образцов в год может быть
- 7 008859 протестировано с помощью всего лишь одного измерительного устройства, когда 10-100 образцов объединяют для каждого измерения.
При тестировании хранящейся крови 10 различных антител (против 10 различных заболеваний) может, например, одновременно быть добавлено к крови для оценки того, может ли эта кровь быть использована. В случае положительной реакции хранящаяся кровь должна быть забракована, поскольку не имеет значения, возникло ли заражение вследствие, например, ВИЧ или гепатита. Когда дополнительно возникает необходимость узнать, какой именно агент вызвал положительную реакцию, антитела могут быть введены отдельно. Путем объединения, например, крови из 100 контейнеров с хранящейся кровью и одновременного использования 10 различных антител, в одном измерении, длящемся приблизительно 60 с, можно выяснить, подходит ли кровь изо всех 100 контейнеров для применения.
Тест, для которого достаточно такое небольшое количество продукта и который обладает соответствующей высокой чувствительностью вплоть до фемтомолярного или аттомолярного диапазона, не известен из предшествующего уровня техники и представляет собой существенный прогресс.
Кроме того, настоящее изобретение включает компьютерный программный продукт, включающий средства программного кода, хранящиеся на машиночитаемом носителе, для осуществления способа в соответствии с изобретением, когда этот компьютерный программный продукт реализуется на компьютере, сетевом устройстве или устройстве, в частности устройстве для аналитического детектирования. Настоящее изобретение также предлагает компьютерный программный продукт, включающий программный код, загружаемый с сервера, для осуществления способа в соответствии с изобретением, когда компьютерный программный продукт реализуется на компьютере, сетевом устройстве или устройстве, в частности устройстве для аналитического обнаружения (например устройстве детектирования, описанного в настоящей заявке).
Настоящее изобретение также относится к устройству для детектирования малых количеств частиц, также именуемому устройством КИАПП (количественное измерение аттомолярных продуктов преципитации).
Такое устройство содержит источник света, причем в качестве предпочтительного источника света используют лазер.
Измерительная ячейка такого устройства должна быть изготовлена из материала, который по существу не высвобождает частиц, и который дает возможность для прохождения светового луча, в частности лазерного луча. Такие материалы известны специалистам в данной области техники. Измерительная ячейка может быть изготовлена, например, из политетрафторэтилена (ПТФЭ). Измерительная ячейка имеет объем меньше 100 мкл, предпочтительно 30-50 мкл, более предпочтительно 40 мкл.
Устройство в соответствии с изобретением более предпочтительно содержит фотодетектор, выполненный с возможностью регулируемого усиления сигнала и регулируемой рабочей точки.
Фотодетектор может быть выбран, например, из группы, состоящей из детекторов инфракрасного излучения, фотодиодов, в частности детекторов на фотосопротивлении, фотоэлектрических детекторов, лавинных диодов, диодных матриц, фотоумножителей.
Детекторное устройство в соответствии с изобретением более конкретно дает возможности для определения частиц от 20 нм до 5 мкм.
Дополнительно настоящее изобретение также предлагает набор для качественного и/или количественного детектирования подлежащей детектированию частицы, например белка или гормона, причем указанные частицы имеют по меньшей мере два сайта связывания антитела. Набор включает детекторное устройство, описанное выше, по меньшей мере одно антитело, способное к специфическому связыванию с указанной частицей, и по меньшей мере одну подходящую текучую среду для приема образца. Такой набор может быть разработан для конкретных потребностей пользователя и содержит соответствующие компоненты, а также соответствующее описание для пользователя, который незамедлительно и очень легко будет способен осуществлять детектирование в соответствии с изобретением с применением этого набора. Например, такой набор может быть использован для обнаружения конкретного патогена в небольшом количестве крови или для исследований поверхности в применениях, описанных ранее.
Подробное описание фиг. 3.
Далее изобретение более подробно будет разъяснено при помощи прилагаемого схематичного, приведенного в качестве примера, но не ограничивающего объем изобретения изображения установки для осуществления способа в соответствии с изобретением.
Устройство для смены образцов 1 может инъецировать разные растворы антигенов (например образцы крови), а также разные растворы антител в соответствующие смешивающие ячейки 2 и 3 таким образом, что образец может быть протестирован последовательно в отношении нескольких возможных возбудителей. Смешивающие ячейки 2 и 3 для растворов антигена и антитела, соответственно, пригодны не только для разбавления соответствующих растворов, но также для ополаскивания измерительной ячейки буфером (ЗФР) или раствором антитела.
Фильтры 4 являются взаимозаменяемыми и имеют размер пор, составляющий например 200 нм. Клапан 5 может переключаться так, что растворы могут поступать раздельно или совместно в измерительную ячейку 6, в которой последовательно, одновременно или несколько раз в произвольной после
- 8 008859 довательности осуществляют детектирование с помощью детектирующего устройства.
Насос 7 представляет собой, например, небольшой вакуумный насос для всасывания всех растворов. Он согласован с клапаном 5, и после измерений выкачивает содержимое измерительной ячейки в резервуар для отходов 8. Этот резервуар может быть снабжен, например, дезинфицирующей или бактерицидной жидкостью, так что все потенциально опасные вещества могут сразу же быть превращены в безопасные.
Если введенное антитело взаимодействует с антигеном из образца с образованием преципитата антиген-антитело, то формируются частицы, которые имеют размер частиц, превышающий заданное значение. Эти преципитаты генерируют сигнал, который значительно отличается от сигналов, поступающих с частиц, имеющих размер меньше заданного значения, которые все еще могут присутствовать в несущей текучей среде. Следовательно, эти продукты реакции однозначно детектируются при помощи детектирующего устройства. Из результатов детектирования следует, что конкретное вещество присутствует в образце и, когда необходимо, также может быть определена его концентрация в соответствии со способами, описанными ранее.
Если после инъекции раствора первого антитела детектирующее устройство не детектирует частиц, имеющих размер выше заданного, или если предполагают, что в образце присутствуют дополнительные антигены, которые специфически не взаимодействуют с используемым антителом, затем может быть введен раствор другого антитела. Перед этим любые преципитаты, которые были детектированы, могут, если необходимо, быть смыты из измерительной ячейки.
Следующие примеры служат для пояснения настоящего изобретения.
Однако объект согласно примерам никоим образом не предназначен для ограничения объема настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1. Тестирование крови на ГЭКРС.
Поголовье крупного рогатого скота в Германии насчитывает приблизительно 15 миллионов. Ежегодно в Германии проводят от двух до трех миллионов тестов на ГЭКРС (твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А) и вестерн-блоттинг) на образцах мозга мертвых животных. В настоящее время быстрый тест на ГЭКРС (ЕЫ8А или вестерн-блоттинг) занимает 6-8 ч. С использованием способа в соответствии с изобретением патоген ГЭКРС может быть детектирован у живого животного с использованием всего одной капли в течение двух минут, стоимость уменьшается до несравненно меньшего значения.
Пример 2. Проверка хранящейся крови на новый вариант болезни Крейтцфельдта-Якоба (иуСГО).
Ряд мероприятий осуществляют для защиты населения от всевозможных рисков передачи иуСГО с кровью. Наиболее перспективная стадия представляет собой тестирование каждой сдачи крови в отношении инфекции, а также гепатитов и синдромов приобретенного иммунодефицита (СПИД). Тем не менее, патоген обнаруживается в незначительных количествах у больных. В предшествующем уровне техники не существует надежных тестов. Способ в соответствии с изобретением способен детектировать патоген в крови или продуктах на основе крови.
Пример 3. Применение в пищевой промышленности.
Микотоксины представляют собой высокотоксичные продукты распада некоторых грибов. Микотоксины представляют собой гаптены и поэтому могут быть детектированы качественно и количественно с помощью описанного здесь способа измерения.
Для скрининг-тестов, например, целых судовых грузов кофе, чая, муки или орехов будет достаточным качественный тест, который может быть осуществлен непосредственно на месте в течение приблизительно двух минут.
Образец мяса должен быть тестирован в отношении приблизительно 15 соответствующих гормонов для того, чтобы проверить, не подвергалось ли животное противозаконному откорму с использованием гормонов. Гормоны также представляют собой гаптены и могут быть детектированы качественно и количественно с помощью способа в соответствии с изобретением.
Тесты на гормоны необходимы также, например, в тестах на беременность и тиреоидных тестах.
Крупные скотобойни обрабатывают 2000-3000 голов крупного рогатого скота в месяц, следовательно, для выявления противозаконного откорма необходимо приблизительно 50-100 случайным образом отобранных образцов. В настоящее время цена теста на гормоны (включая 15 разных гормонов) составляет 600 евро на кусок мяса. Соответственно, в мясных магазинах тестируют только 5-10 случайным образом отобранных образцов в месяц, что слишком мало для выявления нелегального откорма. В переговорах с крупными скотобойнями выявлена заинтересованность выполнять в десять раз больше более дешевых тестов (приблизительно 60-70 евро за кусок мяса), основанных на способе в соответствии с изобретением. Обычные тесты на гормоны не дают возможности достичь такой цены.
Пример 4. Обнаружение пестицидов.
Мономеры тубулина представляют собой небольшие индивидуальные белковые сферические тела, вырастающие до длинных цепей посредством взаимодействия с переносчиком энергии гуанозинтрифосфатом (ОТР). Ингибиторы и другие токсины препятствуют такому росту цепи или предотвращают его.
- 9 008859
Индивидуальные цепи переплетаются с образованием канатоподобных структур, так называемых протофиламентов. Эти протофиламенты в свою очередь соединяются с образованием микротрубочек, которые играют решающую роль в клеточном делении. Влияя на образование цепей из мономеров, можно контролировать клеточное деление и уничтожать вредителей.
Опять же, этот способ также обеспечивает возможность детектирования остатков растительных пестицидов в пище и таким образом обеспечивать улучшенную защиту потребителя. Описанный здесь рост цепей и его предотвращение непосредственно могут быть измерены с использованием способа в соответствии с изобретением.

Claims (11)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ детектирования малых количеств частиц путем детектирования преципитатов антигенантитело, включающий приготовление текучей среды, включающей образец, которая, по существу, содержит частицы с заданным максимальным размером, имеющие по меньшей мере два сайта связывания антител;
    приготовление текучей среды, содержащей антитела, которая, по существу, содержит частицы, имеющие заданный максимальный размер;
    приведение текучей среды, включающей образец, в контакт с текучей средой, содержащей антитела, что дает реакционную текучую среду, где в присутствии частиц, имеющих по меньшей мере два сайта связывания антител, антитела могут образовывать преципитат антиген-антитело;
    пропускание светового луча через эту реакционную текучую среду;
    детектирование сигнала путем измерения экстинкции фотодетектором на границе свет-тьма конуса света, который возникает тогда, когда свет, генерируемый лазером, проходит через измерительную ячейку, содержащую реакционную текучую среду, причем сила сигнала зависит от размера и количества образовавшихся преципитатов антиген-антитело.
  2. 2. Способ по п.1, который имеет чувствительность детектирования, доходящую до фемтомолярного или аттомолярного диапазона.
  3. 3. Способ по любому из пп.1-2, при котором стадия приготовления текучей среды, включающей образец, которая, по существу, содержит частицы, имеющие заданный максимальный размер, включает:
    а) предоставление текучей среды, введение в эту текучую среду образца и отделение частиц, превышающих заданный размер, с получением текучей среды, включающей образец, которая, по существу, содержит только частицы, имеющие заданный максимальный размер, или
    б) предоставление текучей среды, которая, по существу, содержит частицы, имеющие заданный максимальный размер, и введение образца в эту текучую среду, которая, по существу, содержит частицы, имеющие заданный максимальный размер, с получением текучей среды, включающей образец, которая, по существу, содержит частицы, имеющие заданный максимальный размер.
  4. 4. Способ по любому из пп.1-3, при котором отделение частиц, имеющих размер, превышающий заданный максимальный размер, осуществляют путем фильтрации, причем фильтр имеет размер пор предпочтительно 20-450 нм, более предпочтительно 100-300 нм и особенно предпочтительно 200 нм.
  5. 5. Способ по любому из пп.1-4, где в качестве антител используют по меньшей мере два моноклональных антитела или одно поликлональное антитело.
  6. 6. Способ по любому из пп.1-5, где антитело выбрано из группы, состоящей из иммуноглобулина С или иммуноглобулина М.
  7. 7. Способ по любому из пп.1-6, обеспечивающий возможность количественного или полуколичественного детектирования числа частиц.
  8. 8. Способ по любому из пп.1-7, где при постоянной концентрации антител уменьшение измеряемого сигнала прямо зависит от концентрации антигенов.
  9. 9. Компьютерный программный продукт, включающий средства программного кода, хранящиеся на машиночитаемом носителе, для осуществления способа по любому из пп.1-8, когда этот компьютерный программный продукт реализуется на компьютере, в сетевом устройстве или в каком-либо устройстве, в частности устройстве для аналитического детектирования.
  10. 10. Компьютерный программный продукт, включающий программный код, загружаемый с сервера, для осуществления способа по любому из пп.1-8, когда этот компьютерный программный продукт реализуется на компьютере, в сетевом устройстве или в каком-либо устройстве, в частности устройстве для аналитического детектирования.
  11. 11. Набор для качественного и/или количественного детектирования определенной подлежащей детектированию частицы, которая имеет по меньшей мере два сайта связывания антител, содержащий: по меньшей мере одно антитело, которое способно специфически связываться с данной частицей, по меньшей мере одну подходящую текучую среду для введения образца и устройство для детектирования малых количеств частиц, включающее лазер, измерительную ячейку и фотодетектор, разработанный для осуществления измерения экстинкции на границе свет-тьма конуса света, который возникает тогда, когда свет, генерируемый лазером, проходит через измерительную ячейку, содержащую частицы в текучей среде.
EA200600387A 2003-09-25 2004-09-09 Способ и устройство для детектирования очень малых количеств частиц EA008859B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10344924A DE10344924A1 (de) 2003-09-25 2003-09-25 Verfahren und Vorrichtung zum Nachweis sehr geringer Partikelmengen
PCT/EP2004/052109 WO2005031325A1 (de) 2003-09-25 2004-09-09 Verfahren und vorrichtung zum nachweis sehr geringer partikelmengen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200600387A1 EA200600387A1 (ru) 2006-10-27
EA008859B1 true EA008859B1 (ru) 2007-08-31

Family

ID=34384313

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200600387A EA008859B1 (ru) 2003-09-25 2004-09-09 Способ и устройство для детектирования очень малых количеств частиц

Country Status (25)

Country Link
US (1) US7547554B2 (ru)
EP (1) EP1664747B1 (ru)
JP (1) JP4959330B2 (ru)
KR (1) KR100802449B1 (ru)
CN (1) CN100501385C (ru)
AT (1) ATE360812T1 (ru)
AU (1) AU2004276506B2 (ru)
BR (1) BRPI0414784B8 (ru)
CA (1) CA2539910C (ru)
CY (1) CY1106648T1 (ru)
DE (2) DE10344924A1 (ru)
DK (1) DK1664747T3 (ru)
EA (1) EA008859B1 (ru)
ES (1) ES2285507T3 (ru)
HK (1) HK1091901A1 (ru)
HR (1) HRP20060118B1 (ru)
IL (1) IL174032A (ru)
MX (1) MXPA06003324A (ru)
NO (1) NO338340B1 (ru)
NZ (1) NZ546029A (ru)
PL (1) PL1664747T3 (ru)
PT (1) PT1664747E (ru)
SI (1) SI1664747T1 (ru)
UA (1) UA85560C2 (ru)
WO (1) WO2005031325A1 (ru)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8697029B2 (en) * 2002-04-18 2014-04-15 The Regents Of The University Of Michigan Modulated physical and chemical sensors
US9068977B2 (en) * 2007-03-09 2015-06-30 The Regents Of The University Of Michigan Non-linear rotation rates of remotely driven particles and uses thereof
US9487592B2 (en) * 2008-10-24 2016-11-08 Fujifilm Corporation Immobilization substrate and method for producing the same
US9176152B2 (en) 2010-05-25 2015-11-03 Arryx, Inc Methods and apparatuses for detection of positional freedom of particles in biological and chemical analyses and applications in immunodiagnostics
FR2963103B1 (fr) * 2010-07-22 2012-08-24 Commissariat Energie Atomique Procede d'estimation de la quantite d'entites deposees sur des microparticules en suspension dans une solution, dispositif associe et utilisation de ce dispositif
US8846331B2 (en) 2010-08-27 2014-09-30 The Regents Of The University Of Michigan Asynchronous magnetic bead rotation sensing systems and methods
WO2012142179A2 (en) 2011-04-11 2012-10-18 The Regents Of The University Of Michigan Magnetically induced microspinning for super-detection and super-characterization of biomarkers and live cells
US9797817B2 (en) 2012-05-03 2017-10-24 The Regents Of The University Of Michigan Multi-mode separation for target detection
CN103267956A (zh) * 2013-05-17 2013-08-28 南通大学 一种磁响应特性检测系统
US9983110B2 (en) 2013-11-04 2018-05-29 The Regents Of The University Of Michigan Asynchronous magnetic bead rotation (AMBR) microviscometer for analysis of analytes
EP3147028B1 (de) 2015-09-25 2019-06-19 Constantin Odefey Verfahren und system zur magnetischen trennung von nano-beads

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5100805A (en) * 1989-01-26 1992-03-31 Seradyn, Inc. Quantitative immunoassay system and method for agglutination assays
US5534441A (en) * 1989-08-23 1996-07-09 Canon Kabushiki Kaisha Optically measuring an immunologically active material by degree of agglutination of an antigen-antibody reaction product

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4444879A (en) * 1981-01-29 1984-04-24 Science Research Center, Inc. Immunoassay with article having support film and immunological counterpart of analyte
JPH0545282A (ja) * 1991-08-09 1993-02-23 Kurabo Ind Ltd 自動臨床分析システム
JP3283078B2 (ja) * 1992-12-04 2002-05-20 興和株式会社 免疫学的測定装置

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5100805A (en) * 1989-01-26 1992-03-31 Seradyn, Inc. Quantitative immunoassay system and method for agglutination assays
US5534441A (en) * 1989-08-23 1996-07-09 Canon Kabushiki Kaisha Optically measuring an immunologically active material by degree of agglutination of an antigen-antibody reaction product

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EIGEN M. ET AL.: "SORTING SINGLE MOLECULES: APPLICATION TO DIAGNOSTICS AND EVOLUTIONARY BIOTECHNOLOGY", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE. WASHINGTON, US, vol. 91, June 1994 (1994-06), pages 5740-5747, XP002029412, ISSN: 0027-8424, the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2005031325B1 (de) 2005-06-02
US7547554B2 (en) 2009-06-16
DE502004003637D1 (de) 2007-06-06
EP1664747B1 (de) 2007-04-25
CY1106648T1 (el) 2012-01-25
EP1664747A1 (de) 2006-06-07
HK1091901A1 (en) 2007-01-26
NO20061824L (no) 2006-04-25
BRPI0414784B1 (pt) 2018-02-06
KR20060091305A (ko) 2006-08-18
UA85560C2 (ru) 2009-02-10
AU2004276506A1 (en) 2005-04-07
MXPA06003324A (es) 2006-06-08
HRP20060118A2 (en) 2006-05-31
IL174032A0 (en) 2006-08-01
CA2539910C (en) 2012-06-19
NO338340B1 (no) 2016-08-08
ES2285507T3 (es) 2007-11-16
EA200600387A1 (ru) 2006-10-27
JP4959330B2 (ja) 2012-06-20
IL174032A (en) 2010-05-17
WO2005031325A1 (de) 2005-04-07
PT1664747E (pt) 2007-05-31
PL1664747T3 (pl) 2007-10-31
HRP20060118B1 (en) 2011-12-31
JP2007506954A (ja) 2007-03-22
BRPI0414784B8 (pt) 2021-07-27
BRPI0414784A (pt) 2006-11-21
NZ546029A (en) 2008-12-24
CA2539910A1 (en) 2005-04-07
US20070054417A1 (en) 2007-03-08
CN1853096A (zh) 2006-10-25
CN100501385C (zh) 2009-06-17
ATE360812T1 (de) 2007-05-15
DE10344924A1 (de) 2005-05-04
AU2004276506B2 (en) 2009-11-12
KR100802449B1 (ko) 2008-02-13
DK1664747T3 (da) 2007-08-20
SI1664747T1 (sl) 2007-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2022069520A (ja) 凝集の検出および測定のための方法
NO338340B1 (no) Fremgangsmåte og innretning for deteksjon av meget små partikkelmengder
RU2638913C2 (ru) Системы и способы для обнаружения частиц в полезном агенте
DE102005026839A1 (de) Verfahren und Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung von Analyten in flüssigen Proben
JP2008510161A (ja) 液体中の細菌の検出
US20240011884A1 (en) Systems and methods for identifying protein aggregates in biotherapeutics
NO149864B (no) Immunologisk reagens.
Doubrovski et al. Ultrasonic wave action upon the red blood cell agglutination in vitro
EP2997396B1 (fr) Procédé d'évaluation par biodosimétrie de la dose d'irradiation reçue par un individu ayant été soumis a un rayonnement ionisant
JPH02170053A (ja) 微生物の検出方法及び装置
Tahari Fluorescence correlation spectroscopy: Ultrasensitive detection in clear and turbid media
JP3916189B2 (ja) イムノアッセイ用試薬及びイムノアッセイ
JPH07502123A (ja) 抗原及び核酸の検出
CN103097893B (zh) 甘油磷脂的稳定化方法及使用该方法的试剂
CN112236511A (zh) 在微流体通道中的从溶液中分离后的细胞测量
CN107991478A (zh) 一种spr生物传感器及其应用于zen免疫检测的方法
JPS63274870A (ja) 免疫センサー、その形成方法および免疫センサーによる抗原の濃度の測定方法
Salina et al. Multi-spot, label-free detection of biomarkers in complex media by reflectionless surfaces
JP2016183966A (ja) 標的物質の測定方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU