BRPI0414784B1

BRPI0414784B1 - Método e dispositivo para detectar quantidades muito pequenas de partículas

Info

Publication number: BRPI0414784B1
Application number: BRPI0414784-7A
Authority: BR
Inventors: Odefey Constantin
Original assignee: Werner, Friedrich
Priority date: 2003-09-25
Filing date: 2004-09-09
Publication date: 2018-02-06
Also published as: JP2007506954A; NO20061824L; CY1106648T1; BRPI0414784A; WO2005031325A1; HRP20060118B1; IL174032A0; EA200600387A1; WO2005031325B1; NZ546029A; US20070054417A1; KR20060091305A; UA85560C2; IL174032A; BRPI0414784B8; CN100501385C; AU2004276506A1; ES2285507T3; SI1664747T1; CA2539910C

Abstract

"método e dispositivo para detectar quantidades muito pequenas de partículas". a invenção se refere a um método e a um dispositivo para detectar quantidades muito pequenas de partículas por meio da verificação de produtos de reação, anticorpos, antígenos, através do que o método apresenta uma sensibilidade muito elevada da verificação até em uma escala femtomolar ou atomolar.

Description

(54) Título: MÉTODO E DISPOSITIVO PARA DETECTAR QUANTIDADES MUITO PEQUENAS DE PARTÍCULAS (51) Int.CI.: G01N 21/82; G01N 21/59; G01N 33/543 (30) Prioridade Unionista: 25/09/2003 DE 103 44 924.8 (73) Titular(es): WERNER, FRIEDRICH. ODEFEY, CONSTANTIN (72) Inventor(es): ODEFEY, CONSTANTIN %

« · · • · · · • · · · · • · · · · • · · · · · · • · · · • ·· · · · · * ···· ·· .

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MÉTODO E DISPOSITIVO PARA DETECTAR QUANTIDADES MUITO PEQUENAS DE PARTÍCULAS

A invenção se refere a um método e a um dispositivo cr \ p< ¹t.ar quantidades muito pequenas de partículas por me . í, 'a verificação de produtos de reação, anticorpos, ,1 r,^: menos, por meio de que o método apresenta uma se. s.t. ..idade muito elevada da verificação até em uma es· π j a femtomolar ou atomolar .

Id te rentes métodos para detectar pequenas qu.r.s_i uades de partícula são bem conhecidos no estado da 1 e η. ...ca, por exemplo, métodos nef elométricos e - i„ i ..met r .i eos, bem como métodos designados como dispersão dinamica da luz (DLS) (DLS do inglês dynamic-light ! > sc. c - _e r i ng : .

Em métodos nefelométricos e turbimétricos utiliza- d e i r s de Tyndall, com o qual a iluminação de uma pa ’ cs d.a 1 ibera uma pequena luz difusa de ângulo aberto. A dispersão da luz pode ser determinada tanto pela medição da

2ü i r. is idade do raio de luz incidente após a passagem pelo n e ;. ce dispersão ou pela determinação da intensidade da d. . d-c. er a Imente desviada. No primeiro caso refere-se ao :it t turt imétrico ou de medida de extinção e no segundo x asp. ϊ da r eal nefelometria ou Tyndallometria.

d ^!Jma outra abordagem de procedimento oferece métodos ii. s io chamados de métodos de dispersão dinâmica da luz d’ jS; _ dom estes métodos considera-se somente um (ou : . , -· ponto sobre a esfera de luz que envolve a partícula /'/ * · · * · · · ♦ · · « • ♦· « . : ,-j udicionalmente a modulação de intensidade

t): oe. j movimento molecular Browniano. Focalizando em ’ .ume minúsculo de observação tenta-se reduzir a η o· .i uzes perturbadoras dispersadas por diversas ·. . as. Consequentemente uma partícula atravessa um . . co i ume iluminado muito rapidamente, de modo que o m· rd d i·,:o-e letrônico de avaliação deve reconhecer . :. iu? substanciais de flutuação. Durante

-imert do sinal complexo, muita informação está í ve i, de modo que estes sistemas são aplicáveis condicionalmente à análise quantitativa.

Os métodos de detecção do estado da técnica ro. am, a lém dessas, ainda outras desvantagens. É :ramente mencionado que, embora a sensibilidade de a dos métodos descritos anteriormente tenha ¹ auo sens i velmente nos últimos anos, na maioria das cites áreas persiste uma grande necessidade de métodos :--cçrH um sensibilidade mais elevada. Além disso, os ?tecção do estado da técnica requerem ainda

MílC ;omparativamente elevadas de amostra, o que especialmente vinculado nos métodos médico: < '-sm uma sobrecarga para a pessoa examinada.

Ass ;.m é conseqüentemente uma tarefa da invenção ; disponível um método para a detecção de pequenas :lanes de partícula, o qual possui uma sensibilidade ►drvnda do que os processos do estado da técnica. Além , tal método deve requerer uma diluição menor da ra e/eu uma menor quantidade mínima de amostra, para apropri ada de investigações de amostra em • · ·

3/35..· • · » • ·* · « · · · • ···♦♦ ♦ · · • ·· ♦ · ’π ι π, e também ser praticável após um treinamento 1- ernpregados sem conhecimento precedente especial, mneu-e, esta a provisão de um dispositivo para pequenas quantidades de partícula de acordo com a /tu i 1 arefa é resolvida pela provisão de um método 1- te - t. i r pequenas quantidades de partícula pela •iç/i; ie precipitados de anticorpos-antígenos, o qual cie: ii spouibi. 1 i zar um fluido de amostra, que contém ; -Arm: e partículas com um determinado tamanho de .a máximo, em que as partículas apresentam pelo mis locais de ligação de anticorpos; disponibilizar u dc contendo anticorpos que contém essencialmente .. . as de um determinado tamanho máximo de partícula;

m / f 1 uido de amostra com o fluido que contém : poz, por meio de que é obtido um fluido de reação, s -m t i corpos, na presença de uma partícula com ao f í tosais de ligação de anticorpos, podem formar um

P.ie.u de antígeno-antícorpo; dirigir um raio de luz ’ ; u í luido de reação; apreender, por meio de cef ⁺ ,a , um sinal por meio de uma medida de extinção .mu-.m claro-escuro do cone de luz, o qual se forma l - J-ι passagem da luz produzida pelo laser através a ie rredi çao contendo fluido de reação, onde a força

- nu í e dependente do tamanho e quantidade de ρ i ta ie ue anti corpos-antígenos formado.

A presente invenção proporciona ainda um sir. ivo para verificação de pequenas quantidades de nj.-il compreende: uma fonte de luz, uma câmara • · ·

V3J..· · · · » · • · · 4 • 4 4 4 4 • · · · 4 · <

• · 4 » • 4 4 4 (!< j-fu ι i ção, e um fotorreceptor destinado à execução da m··^. ι.;·: da extinção da fronteira claro-escuro do cone de ; . , qual se forma por meio da passagem da luz produzida pe, c i user através câmara de medição contendo fluido de r- çiu. . A luz refletida forma um cone, em cuja fronteira '-Pi:·· -tcim) está disposto um fotorreceptor. Os lasers e o t < c; : ‘ ceptor estão dispostos essencialmente em um eixo, !e Ι;· udos, entretanto, de tal maneira, que o feixe de 1,1 e··· passa muito próximo ao fotorreceptor.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As Figuras la-ld ilustram esquematicamente métodos ; ií? m n inação de um precipitado de anticorpos-antigeno usando í- m , uorpo bivalente.

A Ei.gura 2a ilustra um resultado de uma verificação cs m I- o método de acordo com a invenção em que foi ·- x it L -ido um fluido de amostra contendo partícula após 1 i ⁷ r ifio com um filtro com um tamanho de poro de 200 nm ?o . η:.-' da adição de anticorpos) . Os sinais correspondem às [ -..? i ;Ί as, cujo diâmetro é menor do que o tamanho do ι i ^: i.r usado. O eixo x indica o tamanho de partícula e a , o número de partículas.

A Figura 2b ilustra um resultado de uma verificação /5 üfi au'¹ foi examinada a mistura de reação obtida depois de • ;s ç ι simultânea separada de soluções de fluido de η ;t i e ie fluido de anticorpos filtrados com um filtro >·ιη· nnanho de poro de 200 nm. Nesta mistura de reação

5/33..· •··· « • · » ' • · »· r c uma reação e são formados micro íons de precipitado, o suem um diâmetro que é maior do que os poros do u utílizado. 0 eixo x indica o tamanho de partícula e ?.( / o numero das partículas.

A figura 3 ilustra um diagrama esquemático de uma : ;âo para execução do método de acordo com a em em ve

CÍC rne i me ' ne i

Durante numerosas tentativas que levaram à i n «- ração, cheqou-se à provisão de um método cuja íu se- sil , J idade se encontra em um fator cerca de 1000 vezes sj: < : : à sensibilidade de métodos comparáveis do estado da ·o· -a i ca. Este grande aumento da sensibilidade é baseado método físico de verificação modificado, em que uma •ação de sinal por meio de uma medida da extinção da ir * m , ra claro-escuro do cone de luz, com a passagem da : i.. rrAuzida pelo laser pela câmara de medição contendo f: 1 : 1/ de reação, ocorre através de um fotorreceptor, em i n --ui çao com uma preparação analítica adaptada da amostrai.

Além disso, a presente invenção possibilita uma ui , icão cie volume da câmara de medição em torno de nm t. u . iprox i ma damente de 30 a 50. Enquanto que com métodos ado da técnica são necessários volumes da câmara de ? dentro da escala de, por exemplo, 1, 6 ml, com o de acordo com a invenção são usadas câmaras de : com um volume dentro da escala de micro1itro (por :χ· ·ηο : >, riO μΐ). Isto torna disponível uma vantagem ;u: 11»'ia i, já que cada amostra deve ser diluída para t· í uma matriz uniforme, a qual apresenta, por exemplo, ; ·- * : u a transparência, viscosidade, etc. , de modo que com

6/3 • · * · · • *··· • « «··· I '·· ·· · • · · · • ·· ♦ · * ····<

ura mérodo de acordo com a invenção, comparado com os métodos do estado da técnica, uma amostra precisa ser menos foi temente diluída.

Adicionalmente, com o método de acordo com a ^ς invenção, torna-se possível reduzir a quantidade mínima de amoscri necessária. Enquanto que métodos do estado da té<. n í ca requerem 100 μΐ, com o método de acordo com a invenção são bastantes quantidades de amostra inúmeras ve/es menores (por exemplo, 3,5 μΐ).

if O termo partícula designa, no presente pedido, caon oisa tridimensional que possua um outro índice rei cat i.vo do que tem o meio portador.

O termo precipitação descreve, no presente pedido, a ocorrência, que em uma reação de antígenos sc:uveis com anticorpos específicos, resulta em uma formaçao de um antígeno do complexo de anticorpos, o qual apinsenta uma solubilidade menor no solvente usado do que o ant igerio usado e/ou anticorpo usados, o qual leva pri mei i amente a uma turbidez da mistura de reação e mais taide a uma sedimentação do complexo de anticorpo-antígeno.

O método de acordo com a invenção torna possível uma det ecção de pequenas quantidades de partícula. Por exempl.-;, com materiais de baixo peso molecular, isto é, com materiais com um peso molecular menor do que 500 g/mol, pooe st¹ r conseguido, utilizando o método de acordo com a invenção, um limite de detecção dentro da escala de femtoe á Como-grama por litro, enguanto gue o limite de detecção air e rira se encontrava geralmente na escala de micro, nano, ou pi co-gr ama por litro. Com materiais com um peso

7/33 • » · · t · · ,/x ‘· i t ; dentro da escala acima de 500 g/mol encontra-se o lÍp. · t .ietecçãc- mais alto, por exemplo, com materiais :ot .! peso molecular de 150.000 g/mol (por exemplo, ant . > IgG) o limite de detecção encontra-se npr οη: idamente a 300 femtog/1. Isso significa que o fluido ia ’ a pode conter partículas na ordem de tamanho de ^:em ' -: i eu ato-mol por litro.

ltm uma primeira etapa inicial do método de acordo . :cm i üvenção ocorre a provisão de um fluido de amostra, n pie O ém essencialmente partículas com um determinado 'am a.n de partícula máximo. Isto pode ser conseguido, por exempla, de duas maneiras. De acordo com uma primeira mr m,n é disponibilizado primeiramente um fluido, que eorr eiM , ssencialmente somente partículas com um determinado m r am u n·. máximo de partícula e mais tarde é fornecida ao t iu tu iirria amostra que contém essencialmente aquelas par - as com um determinado tamanho de partícula máximo.

e ; ao com uma segunda variante o fluido de amostra pode ser ’! · ido, onde primeiro é disponibilizado, uma amostra é í orif-oida ao fluido e mais tarde partículas, que excedem nm iet· -rn; nado tamanho de partícula, são separadas .

í 1. υ , • · s s · máx ant :

que tamanho de partícula máximo das partículas no da amostra e/ou nos outros fluidos, que contêm i ,-ι 1 mente somente partículas de um determinado tamanho t partícula, pode ser selecionado dependendo da desejada. No caso de uma utilização de muitos t i os comuns pode ocorrer a separação de partículas mai ores do que 20-450 nm, preferivelmente maiores - d)0 nm, ma.is especialmente maiores que 200 nm. Tal

8/33 • · · • · • * · » » · * · · • οι· · · · • ♦ · ♦ ·

•.....· • · · · · · · · ··¹ • · · · « • · ·· ♦ separação pode ocorrer, por exemplo, por filtros com um iamanho de poros apropriado de 20-450 nm, preferencialmente de 100-300 nm, mais especificamente de 200 nm ou por outros métodos conhecidos por um especialista. Se a aglutinação í or considerada aproximadamente como superfície, então a iívisão do tamanho do filtro em relação ao número de moléculas, que conduz a produtos de reação detectáveis, corre em quadratura. Se por exemplo for usado um filtro de :Ú0 nm no lugar de um filtro de 200 nm, então são oecessárros aproximadamente somente um quarto das moléculas Je anticorpo-antígeno necessárias no uso de filtro de 200 uni, que devem .reagir uma com a outra, a fim de proporcionar cm resultado detectável. Além disso, por exemplo, ao usar ilitros de 25 nm existe a possibilidade de detectar o 'rímero antigeno-anticorpo-antígeno. Quando usados filtros om tamanho de poro tão pequeno dever ser dada atenção, ntretanto, ao funcionamento cuidadoso, uma vez que poucas coléculas levam a uma reação detectável.

De modo que uma reação do reticulação possa correr, as partículas contidas no fluido da amostra devem deposίta r sobre ao menos dois locais de conexão de mt i. corpos e podem funcionar assim como ant ígeno. As iuguras la até ld ilustram esquematicamente, que material u partícula de corpo-estranho, como por exemplo, tact erras, vírus, toxinas, proteínas, funcionam como cit.á genes e reagem com anticorpos segundo o princípio '' 'have-fechadura (Figura lb) . Um anticorpo bivalente, como i ir exemplo, um anticorpo-IgG, liga desse modo dois cit.ígenos (Figura lc) . Uma vez que cada antígeno pode ligar fI

9/33 • ··· · · • « · · · · • · · · · · ·· · · ···· • · * · • · · · · · · « ···· ·· • · · · • » · ·· · · • ·· a · · ···· a a a · · a a a a a · dínamos anticorpos, ocorre aqui uma reticulação (p oc I citação) , que é captada com o método de acordo com a jn/ençào (Figura ld) . Para anticorpos com valência mais elevada ocorre uma precipitação de maneira similar. Se o ar. i.qeno usado oferecer um número mais elevado de locais disponíveis de ligação de anticorpos, isto oferece assim a va vagem de que, desta maneira, a operação de uma reação de ic< : oo l.ação certamente pode ser mais bem realizada.

método de acordo com a invenção é apropriado para 10 ou.-iisquer antígenos, desde que esses apresentem ao menos gc s ξocais de ligação de anticorpos. Preferivelmente as pa -firulas examinadas devem ser maiores do que ap oximadamente 10 nanômetros e devem ser ao mesmo tempo menores do que o tamanho máximo de partícula selecionado.

[5 Mo.éculas, que podem ser menores do que 10 nm funcionam como naptenos. Haptenos são antígenos incompletos, isto é, ser tamanho molecular não é suficiente, a fim de liberar um·.; resposta imune e/ou causar uma aglutinação. Estes marerrais de baixo peso molecular são altamente específicos em relação ao local de ligação paratopo dos anticorpos, entretanto não se projetam suficientemente para fora deste .locai de ligação, que um segundo anticorpo poderia se ligar a aíes. Eles bloqueiam os respectivos anticorpos, sem que poma ocorrer uma reação de reticulação. Antígenos maiores,

N core por exemplo, bactérias, devem ser destruídos qu rmramente ou fisicamente antes da medida, o que pode ser fe.to por diferentes métodos conhecidos por especialistas, po, exemplo, por um tratamento ultra-sônico, por ácidos, sc rçbos cáusticas, surfactantes. Isto possibilita a

10/33 • · · · • · · · · · · • · · • · ·· · · • · · · ····· • · · · · • · · · · ; ; ¹ riem de que, de apenas uma bactéria podem ser obtidas ο .η. de fragmentos, e não é mais necessário, deixar a : d na r bactérias individuais umas com as outras. Os f ourmmtos de tal maneira obtidos, por exemplo, proteínas 1- .oe r f i cle, apresentam outra vez antígenos menores e p- Jí-m causar, com os anticorpos apropriados, uma reação

-o c : ícamente mensurável.

Ademais, o antígeno deveria ser essencialmente si .. no tampão utilizado e deveria possuir apenas uma p^ r;- i tendência à adsorção nas paredes dos dispositivos e f ; ' ;o ; > i.ã111 .i zados .

O método de acordo com a invenção cobre ainda a pr ’ n ic de um fluido contendo anticorpos.

Com o método de acordo com a invenção em princípio to us ;s anticorpos desejados podem ser usados. Anticorpos qn se mostraram particularmente favoráveis para a execução de ;,o netodo de acordo com a invenção são, por exemplo, a imi.nog I obuJ ina bivalente G (IgG), ou a imunoglobulina dc- η/o,ente M (IgMj . De acordo com métodos conhecidos pelos est ^s ; ii ustas, podem ser obtidos desse modo anticorpos com ler _; sm emda especificidade. Além disso, também anticorpos i: ! ^{1 :} i * es podem ser usados, também dependendo do tipo de par .. ’ , n a ser detectada, os quais pertencem a uma outra ' í ·>>' de anticorpos. Aqui os anticorpos podem ser meu . ’ ;, n.ns ou pol i.c.lonais . Ao usar anticorpos monoclonais ood ii·. · r usados anticorpos monoclonais voltados para dois η i t qer. c diferentes, a fim de originar uma precipitação, cr enormente mencionado no que se refere ao antígeno, -s ; t.rpos também devem ser essencialmente solúveis nos

11/33 • 4 · « · · · 4 ·· · • · · · · • · · ·· · »··· · · *444» : r: pões utilizados e possuir uma pequena tendência à id-orção nas paredes dos dispositivos e filtros utilizados.

Com o método de acordo com a invenção pode ser .vitado, de diferentes maneiras, um excesso muito grande 5 ; desejado de antigenos ou anticorpos, por exemplo, pela z cuçãc de seqüências de diluição apropriadas. Um excesso :61, . t o grande não desejado de antigenos ou anticorpos :eria de outra maneira levar a uma inibição de ; r ,-cipi t.ação (a um denominado efeito prozona), uma vez 10 ::j- ?om um forte excesso de anticorpos cada epitopo (local ;> ligação do antigeno) liga somente um ant i corpo 'roíovalente de e uma ligação cruzada não é mais possível, gue com um excesso demasiado forte de antigeno

g.güentemente é formado trimero de uma molécula de 15 ud i.corpo e de duas moléculas de antigeno.

domo fluido, tanto para a produção de fluido de jtrmstra, quanto para a produção de fluido contendo i:,' icorpos, pode ser usado em princípio qualquer gás ou i i, i i quer 1 íquido . Pref erenciaimente o fluido é um liquido.

. ’ n qüentemente o líquido trata-se de água ou soluções uieão bem conhecidas do estado da técnica, como por ·· ce miplo, ΡΒΞ (phosphate buffered saline, soluções salinas ¹ imoonadas com fos fatos), especialmente se a base para o ido de análise for uma reação bioquímica. Em princípio o ,iguido pode ser adicionalmente, um outro fluido

- i .sparente, por exemplo, hidrocarbonetos líquidos, ácidos ί i.xi V t cJ .

õoin o método de acordo com a invenção o fluido de - t ra em uma etapa seguinte é posto em contato com o %

12/33 • ·· · • · · • » · * • · · · · · * · * * * · · · • · · · · • · · · · * · ···· * · ···· ¹• · · · · ^b’ . u Ld contendo anticorpos, por meio de que os anticorpos nr p i vença de um antígeno podem formar um precipitado de u; v ί·.:ρ uo-ar ticorpo, o qual pode ser agora examinado, por etenip i o, com o dispositivo de acordo com a invenção.

Além disso, é muitas vezes de interesse, o: - r o: anto, determinar a presença de haptenos em uma ipo-?; ; Ί. Hapteno é antígeno incompleto, isto é, são domas i adamente pequenos, para que mais de um anticorpo p,5.:ci .mu ligado. Hapteno podem ser fármacos, drogas, o-, ;' 1 : ias, venenos ambientais, hormônios esteróides ou :mm^! xinas. Haptenos se ligam especificamente em artir-rpos. Entretanto, eles obstruem somente locais de paratopo dos anticorpos, sem que uma reação em possa ocorrer. 0 tamanho mínimo para os imunógenos :cnos completos) é de 5 a 10 kDa, isto é, > 30 r e s i d' pí raie r t. : c l í.c i .

μ',ή do aminoácidos, isto é, comprimentos > 3 nm, a partir deste tamanho ao menos duas moléculas de r po podem se acoplar adequadamente, por meio dos de ligação epitopo existentes, a estes antígenos e uma reação em cadeia que frequentemente leva a uma cr iria ção.

dmei especificação de haptenos pode ocorrer, por emp;o, por meio de Multiespaçador macromolecular :í;c f í lico (hmM) ou com outras ligações assemelhadas rio idas dos especialistas. Multiespaçadores oculares hidrofílicos são conhecidos do estado da a o abrangem uma macromolécula hidrofílica, como por q ! o, aibumina. A esta macromolécula hidrofílica as 7 moléculas de hapteno ou moléculas diferentes de cr

13/33 * · · • · · · • · · · · • · ···♦· • · · · • · * · · · • ···· · · · • · · · · • · · ·· · · ···· · · ····· • · · · • · · · _:;a . rí imieamente ligadas com espaçadores conhecidos i io ;:a r écnica . Se um Multiespaçador macromoiecuiar : i·· exibir ao menos duas moléculas iguais de , i-uii ao ele pode ser usado para uma precipitação.

n; . a pode ser usada para um teste de anticorpo em ama reaçao de deslocamento. Com haptenos está r rese rd e um principio de medida baseado em uma reação ,x' ícamento, como descrito abaixo exemplificadamente,

- ·χτ,θ:. te- com prova negativa os picos de reação são ocorre a deve ser exemplo, ou sangue

Depois de x - madamento um minuto é adicionada uma pequena e,.-ia' , riade de hmM de cocaína sinteticamente manufaturada, , uma macr omo 1 écula ligada através de espaçador com ií i j : a s <ia cocaína.

ui < r < : , i ete - e, somente com provas negativas i * --r produtos de reação.

Se uma amostra de saliva ou de sangue e,.am. uudéi para detecção de um hapteno, por - i -.a, jm ant. icorpo é oferecido à saliva

R ;; .. i, Jo, o nua 1 é direcionado à cocaína.

R St- h ou ver cocaína presente na amostra, esta r d . i nu -orno hapteno e obstrui os locais de ligação dos : ' : upos. os hrnM de cocaína adicionados subsequentemente - Rtram efeito. Se, entretanto, nenhuma cocaína estiver i am.st ra, então nenhum local de ligação do anticorpo foi

R- t .o u: d·-·- e a adição de hmM de cocaína conduz a uma iu,K· de cadeia, que pode medida como crescimento de * . u_iU com o método de acordo com a invenção, por / u ·. i ; o cm .. dispositivo Q-MAP descrito abaixo.

14/33 • · * · · · * • * · * · · · • · * · • · ♦ · · « « ···«t <e de laser, oo r dom o método de acordo com a invenção um raio da particularmente luz coerente, como por exemplo, um irradiado através do fluido a ser ouuni nado. Aba ixo é descrito o método de acordo com a noenção em referência ao uso de um raio de luz laser, isto ruii· exclui, entretanto, o emprego de diferentes fontes de i t.. conhecidas por especialistas, apropriadas ao método de a!. < t do com a invenção. Por exemplo, é disponibilizado um ! i xe de laser, daquele descrito abaixo em detalhe, ui sposit :i vo de acordo com a invenção, também designado como usrositjvo Q-MAP (do inglês quantitative measurement of am amolai' precipitation-products - medida quantitativa de o: ouur.os de precipitação atomolares) . Aiternativamente, r ofan t o outros dispositivos que podem ser desenvolvidos um especialista com base no ensino da presente invenção uitrtoóm podem ser utilizados com base nessa divulgação da .c uuonte invenção.

O laser emite um raio através do fluido a ser -x im i nado e determina o número de partículas que existem e-’+ e seu tamanho. Aqui ocorre a medição de extinção da mus.crra claro-escuro do cone de luz, com a passagem da : . oroduzida pelo laser pela câmara de medição contendo inido de reação, por meio de um f otorreceptor (onde o u; í <: oeceptor exibe um reforço ajustável do sinal, bem como :i p cito operacional ajustável·}, de modo que o dispositivo i d’.: Lhe como uma barreira de luz molecular. Um rsitivo Q-MAP como descrito abaixo pode determinar ‘ -o ar.nos de partícula, por exemplo, entre 2 0 nm e 5 pm,

- c, erf.retanto, não podem ser feitas a partir desta

15/33 * t « · • · · * • · · · * · • * · • »« · · · · · « · · · · • « · ·· · · ««»· · * #···* • I · · * ♦ · *· » : i ι q laisquer indicações sobre a condição e/ou ¹ /: : çã·¹ das partículas medidas. Os lasers e o ; - ; f--ceo'ar estão dispostos quase em um eixo. 0 feixe de * . - : passa bastante rente ao fotorreceptor. A luz i a ;s5da ad i ant e í orma um cone, sobre cuja borda luz : est. c: disposto o fotorreceptor.

tiaa partícula que está em um fluido na câmara de rr> i a e a t ra ves sou o feixe de laser produz um sinal, e n r.umerc de sinais corresponde à distribuição

.. sr - : aas pa rt í cuias na câmara de medição. Quando as p : ' .ias, também as menores partículas, se movimentam no i làser pelo cone de luz, escurece-o, quase como uma s .< ‘ i. A mudança de brilho da origem (sem sombra de oar ;:a) e medida. Um computador rápido, por exemplo, um

'.n c í nu: lo Pentium, pode diferenciar até 10.000 ! 3. x. n ,.s de partícula por segundo. As partículas pequenas c , nin i s rapidamente do que as grandes, o tempo de · ; ^f · uma medida direta para o tamanho de partícula.

.- ri. versas partículas forem simultâneas no feixe emente a maior medida. Com base nas s iit erentes com as quais as partículas um ' feixe de laser, pode-se determinar o raminho de partícula através da equação de steiu bem conhecida dos especialistas. Com esta ⁺ amanho de partícula absoluto é de importância que ri mudança de tamanho da partícula (causada ' ;.mertc· das partículas) . O filtro respectivo serve iu p.ira determinação do começo do crescimento da /uuc : maiores são os poros do filtro, maiores

16/33 »· · · · ··«· ·« · k · 3 ·· · · · · · * « · ' · · * · · · · •···· · ···· , · ····· • ··· « · »· n ίm.u.bs devem se tornar, a fim de diferir do ruído ·<)Πι íiltros de 100-200 nm muito poucas * ' re sci mento são suficientes, a fim de ¹ hti ? .í na l mensurável·. Uma vez que as partículas são . ías esta t. ist i camente, também ocorre sempre no foco , ir eent.ro da câmara de medição, um crescimento de

t.

o veiocidade com a qual as partículas atravessam o ί ricaé apreendida, no que é medido o tempo de em que a partícula atravessa completamente o raio cc Ja mudança de brilho até o fim da mesma).

Esta aqui mostrado, que quanto mais limpo é o íe so rjção, mais provavelmente as partículas estão '5 i ndi vidualmente no feixe de laser e/ou, que ma ls suja está a solução, mais os sinais se que leva a uma sensibilidade diminuída.

A tu;u do sinal depende do tamanho e do número de .t ades de antígeno-anticorpo.

(' vs : oncent ração constante de anticorpos a redução : i i ie medição está em conexão direta com a ' mçuu de antígeno.

Durante' uma verificação de acordo com a invenção - pr oceder desse modo, por exemplo, como se segue:

- J.u; a ser examinado é injetado através de filtros terminado tamanho de poro na câmara de medição, de ue d irar:te uma verificação de fluido de amostra ou de de anticorpos, apropriadamente sozinho, somente em s : mus .

avaliação, uma durante que mostram

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• ···· * * · • * · · · «a · a · · ♦ • ·«· · · * ···<

• · · · · a · * ·· * p_; ; ; unas que são menores do que um determinado tamanho de p . r ’ : -u: a. Com o método de acordo com a invenção ambos os ast '^'rpos usados, bem como os antigenos usados apontam nm t π,υΐΡιο abaixo de determinado limite de tamanho de p ; .ulu e são assim menores do que o tamanho de poro do . : usadc· para a separação (por exemplo, menor do que urrA , de modo que com a separação elas não sejam rmnv Ldas .

Λ t i gura 2a mostra um exemplo de uma foto tirada io u .; u.: o Lal verificação de um fluido de amostra em base de u ·, Lução de NaCl. Com estas fotos é ilustrado o tamanho o·-; partícula ao longo do eixo x e o número das partículas a ' 1onqo do eixo y. Como evidente na figura 2a, somente as p j- ' ;aulas até um determinado tamanho de partícula máximo

A à ' presentes, por meio de que o número de partículas fhriuj.p quanto maior for o tamanho de partícula. Um r. a-nj ί tado de verificação similar é alcançado para o fluido cf i corpos filtrado e contendo essencialmente somente f c!.cuia de um determinado tamanho de partícula (não ms! rado) .

Após uma injeção simultânea, separada de fluido de ;π.. s; ra e/ou f .1 uido de anticorpos uma reação ocorre na -Ti a r a de medição sob a formação de micro-precipitações e rr..-, mri f icação de tamanho e de número de precipitados de n t i jeno-an ti corpo formados .

Tal resultado da medida é ilustrado, por exemplo, r.í i j.gura 2b, onde a ocorrência das partículas é t mee·” ϊvo L, as quais são maiores do que determinado de t amanho de partícula, por exemplo, 200 nm. A '33 • · · · • · ·· car⁺ícuias maiores indica assim, que ocorreu de ;oníraiiamente nenhuma reação ocorre para c fluido examinado está livre do

m s	ι i o ,r' e s
an t	i q e η o
rm c	1 i das
una ta	i de

, ai, , r a : i j i do de anticorpos. De acordo com uma forma de : eo . ío da presente invenção as medidas são iniciadas, i > mp o >, somente 60 segundos após ter sido cheia a •âr · . U medição, uma vez que leves flutuações na

- ;o de injeção podem levar a diferenças de convecção ,e ,-u ma oe medição. Após, por exemplo, 60 segundos o ,:e precipitado é alcançado. A redução do sinal de mei m; λ que ocorre depois disso torna possível uma ve- i : , ação quantitativa aproximada ou estimação das .· a l u/óes diferentes de antígeno. Aqui a concentração : n : - de arbos os participantes da reação desempenha um t u mrm m. Quanto mais elevadas são estas concentrações m s , ma is longo se torna o tempo até a redução u e- . , : . ]< miáx i mo de precipitação.

da execução do método de acordo com a invenção é : - > 1., se m fluido usado apresentar uma pureza tão alta 1' ι c coss i ve ί e, por exemplo, for filtrado com um filtro ο- i mm iho de poro apropriado, por exemplo, de 200 nm, ai ' c. pie seu uso, a fim de eliminar e/ou minimizar um ; <. , aa i undo durante a verificação. Além disso, os a r ais dos dispositivos de acordo com a invenção usados ¹ ' s > método devem liberar de preferência poucas y .. as . Pi r exemplo, a câmara de medição pode ser feita cz

19/33 • · · · · · · · • · · · · • · · ·· · · ···« · ♦ .....

♦ · · · ♦ • « · · * í -k'FE (poiitetrafluoretileno). A fim de impedir que os m te: ais usados (por exemplo a câmara de medição) liberem r - - · ulas ao longo do tempo, o tempo de medição deve ser im ir do tão curto como possivel.

> Além disso, as concentrações das soluções de . gene ou anticorpo usadas devem ser tão pequenas que na o ' í íÇrjcia de uma reação de antigeno-anticorpo não se r . - > o o? c .1 vam precipitados muito numerosos ou muito grandes, η..,. ^γ'·’Ζ que, de outra maneira, diversas partículas podem se

- ¹ m' rar simultaneamente no trajeto dos raios e o tempo de ; -oo :ção seria determinável somente com muita dificuldade.

Λ -ensíbi I idade mais elevada do método de acordo com a i ?r; ;âo está na escala femto- e atomolar.

É1 de vantagem especial, que o método de acordo com ; menção também torne possível indicações quantitativas f - j semi-quantitativas.

bo1s métodos podem ser usados, por exemplo, para a a ilação de uma verificação quantitativa. Com o primeiro rme eJo de análise a superfície (F) sob a curva de medição é o 'er.minada no ponto de tempo tl e t2 (por exemplo, nos i o s de tempo tl=120 segundos e t2=180 segundos), por m . > de que através da fórmula:

F_n = (Fti ⁺ E*_t2) : 2 * .oi.ido um bom valor aproximado FN para uma superfície, do j ; k enl no um valor quantitativo para o número de i : · ;u 1 as pode ser obtido. Com estas concentrações

20/33 • · « · · · • « · · • · · · • · · · · · • · · • · · · * » · · · · · • · · · • · · · · • · · · · · t • · · · • · · * ·_-'λ amente baixas o crescimento da partícula é linear, ’, por exemplo, o dobro de concentração leva à r ,;.···Γ! Lcíe duas vezes maior de um sinal de medição.

Um método alternativo e/ou suplementar para obter .ii' i adi cação quantitativa, baseia-se em que as soluções : -ur diluídas assim até que se esbarre no 1 imite cinético i u· ação bimolecular. Com concentrações abaixo de 100 a' . mo i ar os comprimentos livres de trajeto dos p, ii j.ipantes da reação tornam-se demasiadamente grandes um) o no tempo dado de medição não ocorre nenhuma o mui t ação mensurável. Com concentrações acima de 10 η n mriolar começa a limitação estérico pelos produtos de r- uouo excessivamente numerosos e grandes e, além disso, i; ma-se o efeito prozona já comentado anteriormente. C ? :ím uma solução, por exemplo, 10 micromolar o c mipr imento livre de trajeto de uma partícula alcança s·..mionre 100 nm.

O grau de diluição determinado neste ponto físico t :m. mii depende somente da temperatura e da convecção, já q :· - viscosidade com diluições elevadas em, por exemplo,

P-i' phosphate buf f ered saline, soluções salinas tamponadas c-m iosfaros) não desempenha nenhum papel. Se estes dois p .ivrmt ros forem mantidos constantes, a força de diluição o í soluções iniciais é uma medida direta para a ; n· muií ração das respectivas soluções.

Uma determinação quantitativa exata da concentração o.-i amostras é possível com o método de acordo com a , ‘ çáo por meie de uma solução de calibração com ο/ ό

21/33 ·· ♦ · · · * · • · ♦ · · • · φ φ * · •» φ · · φ φ · · • φ φ · φ φ φ · · φ • φ φ φ · · · · • · φ φ φ φ · φ · · · · ·*ι· · · · * * · · • · · · · • · * · φ (>ΐ·icent. ração bem conhecida da respectiva proteína .‘adas abordagens conhecidas de um especialista.

onde são

De acordo com uma concretização adicional do método f.(>uem ser feitas medições contínuas e/ou repetidas, de uma rr.ruelra de amostragem aleatória, do fluido na câmara de a·ηo:ção. Desse modo é particularmente possível determinar o >m o terminal da reação e formar valores médios das 7-?m f icações. Apresenta-se já preferivelmente uma medida do hm.hk) portador essencialmente livre de partículas com uma lí) i i me nsáo de partícula acima de certo valor antes da adição c mt1 corpo e/ou antes da adição da amostra e o resultado r.:sfa medida é consultado como valor de referência para a i, o i da do precipitado.

Com o método de acordo com a invenção começa-se com ! > piau f Idades de fluido relativamente pequenas e a ueess idade de separação de materiais do fluido usado, cujo unanho de partícula exceda um determinado valor, pode ser riu 7. ί da. Para a remoção de tais materiais, o fluido usado >;r sem conduzido, por exemplo, também por mecanismos de dt ma de comutação para um desvio com um filtro, que iota os materiais mencionados. A filtração do fluido

,.-:0:.1 poae ser realizada antes de alimentar a amostra por m dado período de tempo a fim de garantir que nenhum ,‘,a.e.'iai perturbador de medida esteja presente. Da amostra b d«! ser removidos materiais cujo tamanho de partícula sm-p determinado valor, especialmente por filtros, os p. a: estão integrados e/ou dispostos nos locais de .oil.ação. Também após a alimentação da amostra tal . η.;' in do amostra obtido pode ser filtrado por um

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I · ·· · · >« · · .....

I · · · » · ·

Γΐ ’Ο num- t empo, para remover materiais perturbadores, os : u riam chegar com o fluido de amostra ou vir da l·¹ s’s t ema, be acordo com um arranjo adicional do método, o [oi ¹ ador, após a adição de um anticorpo, que tenha _; .Η',πο a uma detecção de um antigeno, é filtrado /fc:, ó que um outro anticorpo seja adicionado, moer,, são removidos materiais que tenham surgido . rc e r . m rio fluido portador e que poderíam perturbar a ;. A . érr disso, é possível desse modo, remover um -· ,> reação detectado do fluido usado, a fim de sor possíveis componentes adicionais da amostra.

método de acordo com a invenção se destina a > is aplicações no campo da análise de água (detecção de c : mi s poi uentes e conteúdo) , tecnologia de alimento \ár de microorganismos, materiais contidos) ou testes T gim-s ou médicos (por exemplo, detecção de certas o b<u. dr RNA ou DNA, bactérias ou alergenos (testes de ; :i ;' ' . Também são possíveis aplicações no campo de • . -usp.n/ador macromolecular hidrofílico, provas de ramos Nt u PCR quantitativo. 0 método de acordo com a '/-!' rode ser usado especialmente também para a

- <uo je proteína Príon infecciosa PrP^Sc em teste de BSE foi ipatia espongiforme bovina). Uma vez que com o Io ;ie acordo com a invenção quantidades extremamente .o-js o^ proteína Príon podem ser detectadas, o método : cri ocm a invenção é apropriado também para detectar iociut rroteína Príon PrP^Sc infecciosa.

<à

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* · • « 1 ♦ · · I • · · · · · · • · » · • ·· · · • t · · · » · • · · * • ·· ·

Além disso, o método de medição de acordo com a : vr ão oferece uma possibilidade rápida e simples de : s ⁺ r· o comportamento de adsorção de proteínas diferentes >.<. i-up:rfícies diferentes. Superfícies muito polidas podiam c ·. ·estadas não destrutivas então para um valor de a inu 'ao de proteína, por meio de que os desvios de valor c:-e ado apontam um defeito de superfície. Assim desta c ! a a, por exemplo, podem ser simplesmente e rapidamente d· 1 e; ¹ ados defeitos de superfícies vaporizadas metálicas

C' . Çi C:!3 .

Ma i s ainda a imobilização completa de determinadas P o’> 1 nas na respectiva superfície pode ser examinada do η - nm modo, o que é, por exemplo, de importância elevada no r j<o ie análise de DNA e na tecnologia de bioplaquetas.

Uma possibilidade possível mais adicional de <i ·. y icão do método de acordo com a invenção pode ser t soe! ia no fato de que pode ser determinada a influência de I adu· os químicos em uma superfície. Especialmente, por com , n, podem ser considerados testes antes-depois para o o a o - ar mudanças causadas por um tratamento de superfície, : t que uma superfície corroída apresenta uma superfície !- i : ío que uma superfície não corroída e assim uma ' nm idade maior de material de antígeno, por exemplo, t - et·.- ; nas, é adsorvível a esta superfície. Assim, por n, pode ser determinada a quantidade de proteínas : íy/ío s remanescentes na solução.

Ai nda uma outra possibilidade de aplicação é ; ne iu em que o método de acordo com a invenção

24/33 • ·♦ •embér. que a composição da superfície interna u tubulações seja testada.

onc1usão do método de acordo com a invenção de antígeno-anticorpo podem ser ic, pur exemplo, com proteinase K por substâncias v se 'mm destruídas por Proteinase K (por exemplo, • substineias, que não contêm nenhum aminoácido) , e suomet Ldos a etapas adicionais de investigação ou de t .ceruí .

'.ma vantagem importante adicional do método de - 1 ?om a invenção é que este, como descrito em detalhe -¹ ‘ormente, também possibilita verificações v ativas. Além disso, o método pode ser executado : amenre automaticamente, o que leva a uma economia s . cei ^m custos com mão de obra, de modo que é assim i dt um método comparativamente realizável em termos

Muis a inda, o método de acordo com a invenção torna ve i ίΐτι,ι jet.ecção de patogênicos de fluidos ou . vidos eo rpóreos, sangue em particular, em quantidades pequenas. Isto representa uma vantagem muito ; ¹ srp e, porque? quantidades pequenas de sangue, por ¹ p .o, uma pequena gota de sangue (aproximadamente 10 a . i. * , pede ser extraída simplesmente da ponta do dedo ou ebu Io da orelha com uma pequena agulha, sem que seja sar ; <., para isto um médico ou uma enfermeira treinada. '..esses podem ser feitos, por exemplo, simplesmente em

Firmaoía ou ainda em asilos para idosos ou centros ae :í^r vcão e ser fornecida simplesmente e rapidamente uma

25/33 • 4 · · • 4 4 4

4 4 4 44

4 4 • 44 4 4 j soore se uma infecção com uma determinada ia presente. Especialmente é vantajoso, que ι imostragem quanto a execução do método de acordo . i noviça o com o dispositivo de acordo com a invenção - 'que. t pessoal treinado ou altamente qualificado, cir 1 vamente naturalmente também podem ser determinadas i h'.s substâncias no sangue com . ' i o-;, p< r exemplo, teste para v^r e 11 r cs .

anticorpos drogas ou

Enguan t.o que com os instrumentos comerciais de a relação entre antígeno e anticorpo não pode mais? do que um fator de 2 a 3, com Q-MAP são is unda medidas, mesmo se da proporção da mistura :ni n: antígeno e anticorpo se desvia até 100 vezes. ;ma Tesira concentração de anticorpos a concentração b' mc í geno seja reduzida a 1% e aumentada até c sesm.j acontecendo também na situação inversa com •·?ί,.·>·ηΐ ração de antígeno) . Este desvio interessante rva le He idelberger na escala de femtomolar e

n.ué causado pelas menores deficiências ac moIrculas, torna supérfluas as longas séries método de acordo com a invenção é especialmente -to: : r c Jo para uma investigação de amostras derramadas !'c :·, que e interessante especialmente para cr - ίc c · de unidades de sangue armazenadas (por '»-o i , a respeito de HIV ou hepatite) e amostras de tesze u- E t- d cm c método de acordo com a invenção podem ser . ;·ι.Ξ -₃p rc ximadamente 50 medidas por hora, o que {

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• » · · · • « *· · s i gn i.f iea, que em um dia de 8 alO horas ao menos 400 investigações por dia e/ou as mais de 80.000 medidas por 3 .o podem ser realizadas. Com 10 a 100 amostras derramadas i ,nt as para cada medida assim podem ser examinadas 800.000 i 8. 000.000 de amostras por ano com apenas um instrumento d- medição.

Em uma investigação de unidades de sangue a:mazenadas, podem ser adicionados, por exemplo, 10 a_i terentes anticorpos (contra 10 doenças diferentes) a uma u, ) iade de sangue armazenado de uma vez, a fim de fnrminar se esta unidade de sangue armazenado é d :;ízável. Com uma reação positiva a unidade de sangue armazenado deve ser descartada, desde que é indiferente se a 1 a está contaminada com HIV ou hepatite, por exemplo. Se, Hem disso, for de interesse, determinar qual agente .:ourou a reação positiva, assim os anticorpos podem ser a;', 'ionados individualmente. Se, por exemplo, forem usadas ' .cidades derramadas juntas de sangue armazenado e ao tjfsjnc tempo 10 anticorpos diferentes, assim pode com s<mente uma medida, que dura aproximadamente 60 segundos, síí determinado, se todas as 100 unidades de sangue uíHzenado são utilizáveis.

Um teste, onde uma quantidade de produto tão pequena é suficiente e que apresenta uma sensibilidade : .ní. jrmemente elevada na escala femto- ou atomolar, não é u.ntiecido do estado da técnica até então e representa assim m ^regresso importante.

Além disso, a presente invenção compreende um j i..d o de programa de computador, cujo programa engloba

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	2^/33 ... . • « • · • 9 · « • ·	9 9 9 9 • · 9 • 9 · · • 9 9 9 9 · • 9 9 • 9« ♦	· ···· ·· • · · · · · • · · » ·· • · · · · · · « · · · · • · · ··	• • • 9 9 99 « • 9
imos de código, que	são armazenados	em um	meio lido	por
mputador, a fim de	poder executar o	método	de acordo	com
s .nvenção, quando o	produto de programa de	computador	em

un computador, um dispositivo de rede ou um dispositivo, especiaimente um dispositivo analítico de verificação é cq erado. Mais ainda, a presente invenção torna também d.sponível um produto de programa de computador, o qual contém um código de programa e pode ser baixado de um servidor, a fim de poder executar o método de acordo com a uvenção, quando o produto de programa de computador é operado em um computador, um dispositivo de rede ou um dispositivo, especialmente um dispositivo analítico de verificação (por exemplo, um dispositivo de verificação descrito no presente pedido).

A presente invenção se refere ainda a um

5spos it ivo para detectar pequenas quantidades de oirtícula, o qual também é designado como dispositivo de QMAP (quantitative measurement of attomolar precipitation ρ r oduct s) .

Tal dispositivo envolve uma fonte de luz, onde de preferência é usado um laser como fonte de luz.

A câmara de medição de tal dispositivo deve ser fr i ta de um material, que não libera essencialmente nenhuma partícula e torna possível uma passagem de um raio da luz, especiaimente de um feixe de laser. Tais materiais são bem ssnhecidos pelos especialistas. Por exemplo, a câmara de medição pode ser feita de PT FE (politetrafluoretileno). A osmara de medição possui um volume menor do que 3 00 μΐ, p:eferiveimente de 30 a 50 μΐ, em especial acima de 40 μΐ.

• ·

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Λ · ) * ··*·· • « · · ··« ·« · • ···· ·· · « · · · · • · · ·· · · .··· · · ·*·«· • · * · · spos it ivo de acordo com a invenção compreende i i meriia um fotorreceptor, que apresenta uma < í!t!

de sinal ajustável e um ponto operacional !otorrereptor pode ser selecionado, por exemplo, que consiste de detectores térmicos, fotodiodcs, irar detectores foto-condutores, detectores f oto, α í.odos de avalanche, disposição de diodo, fotoíca.iOi es.

Um dispositivo de verificação de acordo com a ccào torna especíalmente possível uma determinação de ; m±as entre 20 nm e 5 pm.

AdieLonalmente a presente invenção coloca também um

k	cara c c _; p a r	detecí 11 cu 1. a
	γ^!· ror	mó n t o,
ί	. η ι e no;	0 o o u s
	, . ,.c.;	. t. ... V 0 <
		_c ι n t ί o c
0	^; ’ t. : 'η ina'..	.ia part
	c ' ^f i s a ç à o d a
¹	c * , cha:	rmente

para determinadas necessidades de um ’ i o, e contém componentes apropriados e uma descrição -spondentemente coordenada para o usuário, que com este ic acordo com a invenção pode realizar identificações . rjcamenue e de maneira muito simples. Por exemplo, um η f pode ser usado na determinação de um determinado jen o em uma quantidade pequena de sangue ou naquelas :acões descritas para testar superfícies.

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DESCRIÇÃO DETALHADA DA FIGURA 3 invenção será descrita abaixo em maiores .s, com base em um diagrama esquemático de uma jçáo, exemplificativa e não restritiva, para realizar i de acordo com a invenção.

trocador de amostra (1) pode injetar tanto c ecs .soluções de antígeno (por exemplo, amostras de , quanto soluções diferentes de anticorpos nas : vas vasilhas de mistura (2) e/ou (3), a fim de ί í sucessivamente uma amostra após a outra para i s aqentes diferentes. As vasilhas de mistura (2) ) para soluções de anticorpos e/ou antígeno podem não apenas para diluição de respectivas soluções, rnbém para enxaguar a câmara de medição com solução ί. ΡΒΞ) ou de anticorpos.

Y _: A íris a t <

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sanqua:

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pos ; ο^! e/o i ( ser ¹ : r ma s r a camccc ^;>a í .

ccrmc v ma; v..i

() ona» , ama a.

OlS! ín ' vác· C^ς cee ac;

rned .. ca despe i <

des r a cs filtros (4) são permutáveis e apresentam, por

, tamanho	de poro de 200	nm. A válvula	(5) pode ser
s de tal	maneira, que	as soluções	podem fluir
ia Emente ou juntas para	a câmara de	medição (6) ,

ϊ ό rmanentemente, simplesmente ou diversas vezes de cie·! ra aleatória, ocorre uma verificação com o ‘ ivo de verificação.

A bomba (7) é, por exemplo, uma bomba pequena de ac suga todas as soluções para dentro. Ela está . cia com a válvula (5) e bombeia após ocorrência da conteúdo da câmara de medição para o recipiente de (8) . Isto pode ser fornecido, por exemplo, com ant; e e/ou fluido germicida, a fim de tornar todos i s possivelmente perigosos imediatamente inócuos.

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Se o anticorpo alimentado reagir com um antigeno da amost ra para um precipitado de antígeno-anticorpo, formamse- partículas com um tamanho de partícula gue excede o v-_:.;.or determinado. Estes precipitados produzem um sinal, que se distingue claramente dos sinais de partículas pessivelmente ainda existentes no fluido portador com um tamanho de partícula abaixo do valor determinado. Estes produtos de reação são detectados conseqüentemente cáramente pelo dispositivo de verificação. Dos resultados (0 de detecção, verifica-se que um certo material está contido n - amostra e se necessário, de acordo com os métodos ó(-.sc.r '.tos anteriormente, também pode ser determinada sua quant .Ldade.

Se depois da injeção de uma primeira solução de i5 ar 11corpos no dispositivo de verificação nenhuma partícula acima de determinado tamanho de partícula foi detectada ou sc outros antigenos não detalharam com o anticorpo uίίIízado uma reação específica na amostra, mais tarde uma outra solução de anticorpos pode ser alimentada. Antes, se necessário, os precipitados detectados podem ser removidos por enxágüe da câmara de medição.

Os seguintes exemplos servem à explanação presente invenção. Uma limitação do escopo de proteção da presente invenção pelo conteúdo dos exemplos não é pietendida, entretanto, de nenhuma maneira.

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EXEMPLOS

Exemplo 1: Teste de Sangue para BSE

A população de gado bovino na Alemanha atinge ,c r > i.madamente '15 milhões. 2 a 3 milhões de testes de BSE < : EA e Western Blot) são realizados anualmente na m-vna r:c.s cérebros de animais mortos. Um teste de BSE r rapioo (ELISA ou Western Blot) leva atualmente de 6 a o js. Tom o método de acordo com a invenção o agente de

B : animíal vivo com somente uma gota de sangue pode ser o- — c ’ ido lentro de dois minutos, a somente uma fração do ’ 1 c; ie cus⁺:os .

Exemplo : Teste de unidades do sangue armazenado ρ«.·ι i.-ença nova de Creutzfeld Jakob (nCJK) tara proteger s população contra o risco concebível ie μ-· , transmissão de nCJK através do sangue, são ' O ' .ias medidas diferentes. A etapa a mais promissora * x . —n. 'estar cada doação individual de sangue contra a xx .. ; . como ó o caso da hepatite e da AIDS. Mas o agente π-i - -a sxmer.t.e em quantidades muito pequenas nos pacientes.

cj ^restes de confiança no estado da técnica.

mé^.cdo de acordo com a invenção pode detectar o cjqe- ~ c sangue e/ou em produtos do sangue.

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• · · * , * · · · * • · · .» ·

Exemplo 3: Aplicações na indústria de gêneros a.imenticics

As micotoxinas constituem-se em produtos altamente 'oxicos da decomposição de fungos. As micotoxinas são captenos e com o método de medição descrito acima é enseqüentemente detectável gualitativamente e saant i t <it i vamente .

Em investigações de seleção para cargas inteiras, exemplo, de c i_entemente um café, chá, farinha ou teste qualitativo, que nozes e pode ser ra 1 ment e realizado em aproximadamente dois minutos .

A rim de determinar, se um animal era ilegalmente dado com hormônios, uma amostra da carne deve ser

U · em relação a aproximadamente 15 diferentes numônios aplicáveis. Também os hormônios são haptenos e j qua111 ar ivamente e quantitat ivamente detectaveis com o u¹’ >do de acordo com a invenção. Também em testes de .j. uriez .? investigações da tiróide, por exemplo, são

t) n- .manos, do mesmo modo, testes de hormônio.

Uma vez que os grandes abatedouros processam 2.000 -. 000 cabeças de gado por mês, aproximadamente 50 a 100 o.'·: ¹ ras são necessárias, a fim de detectar engorda ilegal.

ι.-·· ^; uneamem e preço para um teste de hormônio (para 15 t .'vnios d; t o rentes) é de 600 euros por unidade de carne.

: qúent emente somente 5 a 10 amostras por mês são n ; . i nadas por açougue, o que é muito pouco para detectar ] t n . b n. Em discussões com grandes abatedouros foi

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. mihzâOÍj um interesse em um número 10 vezes maior de m-ues mais baratos (para aproximadamente 60 a 70 euros por < idade ie carne) com base no método de acordo com a s./ençã ;. os iestes convencionais de hormônio não alcançam > - .·- a preço de forma nenhuma.

Exemplo 4: Detecção de agentes agrotóxicos

Monômeros de tubulina são pequenos glóbulos i maiduais de proteína, que por uma reação com o portador de energia GTP cresce em longas cadeias. Limitadores e r : as toxinas obstruem e/ou impedem este crescimento de a.s ia. As cadeias individuais se entrelaçam como corda : manda- estruturas denominadas protof ilamentos. Este !^s ΐ ' jíi.amento por sua vez é conectado a microtúbulos, um : d - : ueeisivo na divisão celular. Pelo impedindo dos m iv-un.s aa formação de cadeia, afeta-se a divisão celular m í a - se o pa rasita.

Znver sarr.ente esse método oferece também a ; Lí Lidado de procurar resíduos de agrotóxicos no mGm e de assegurar assim uma proteção adicionai ao o· inbdor. dom o método de acordo com a invenção pode-se *' ι direfamente o crescimento de cadeia descrito acima impedimento do mesmo.

1/3

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para detectar pequenas quantidades de partícula pela verificação de precipitados de anticorpos-antígenos, cujo método é caracterizado por compreender:

5 disponibilizar um fluido de amostra, que contém essencialmente partículas com um determinado tamanho de partícula máximo, em que as partículas apresentam pelo menos dois locais de ligação de anticorpos;

disponibilizar um fluido contendo anticorpos que contém 10 essencialmente partículas de um determinado tamanho máximo de partícula;

contatar o fluido de amostra com o fluido que contém os anticorpos, por meio de que é obtido um fluido de reação, onde os anticorpos, na presença de uma

15 partícula com ao menos dois locais de ligação de anticorpos, podem formar um precipitado de antígenoanticorpo;

dirigir um raio de luz através do fluido de reação; apreender, por meio de fotorreceptor, um sinal por meio

20 de uma medida de extinção na fronteira claro-escuro do cone de luz, o qual se forma através da passagem da luz produzida pelo laser através da câmara de medição contendo o fluido de reação, onde a força do sinal é dependente do tamanho e quantidade de precipitados de

25 anticorpo-antígeno formados.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que possui uma sensibilidade de detecção na escala de tamanho de femto-molar ou ato-molar.

Petição 870170002942, de 16/01/2017, pág. 7/9

2/3
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a etapa de disponibilizar um fluido de amostra que contém essencialmente partículas com um determinado tamanho máximo de partícula compreende:

5 a) fornecer um fluido, fornecer uma amostra ao fluido e separar as partículas que excedem um determinado tamanho de partícula para produção de um fluido de amostra que contenha essencialmente apenas partículas com um determinado tamanho máximo de

10 partícula, ou

b) fornecer um fluido que contenha essencialmente partículas com um determinado tamanho máximo de partícula e fornecer uma amostra ao fluido, a qual contém essencialmente partículas com um determinado

15 tamanho máximo de partícula para produção de um fluido de amostra que contenha essencialmente partículas com um determinado tamanho máximo de partícula.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a separação das

20 partículas com um tamanho acima do determinado tamanho de partícula máximo ocorre através de filtração, o filtro apresentando preferivelmente tamanho de poro de 20 a 450 nm, mais preferencialmente de 100 a 300 nm e especialmente de 200 nm.

25 5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é usado como anticorpo pelo menos dois anticorpos monoclonais ou um anticorpo policlonal.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações

30 anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é

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3/3 selecionado do grupo consistindo em imunoglobulina G ou imunoglobulina M.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o método permite
5 uma verificação quantitativa ou semi-quantitativa da quantidade de partículas.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que, com concentração constante de anticorpos, a redução do sinal de

10 medição está em conexão direta com a concentração de antígeno.
9. Kit para detecção qualitativa e/ou quantitativa de uma determinada partícula a ser detectada, onde a determinada partícula apresenta ao menos dois locais de ligação de

15 anticorpos, caracterizado por compreender:

ao menos um anticorpo que pode se ligar especificamente à determinada partícula e ao menos um fluido apropriado para admissão da amostra, e um dispositivo para verificação de pequenas quantidades

20 de partícula, o qual apresenta:

um laser, uma câmara de medição, e um foto-receptor, o qual está disposto para execução de uma medida de extinção na fronteira claro-escuro do

25 cone de luz que é formado pela passagem da luz produzida pelo laser pelas partículas em uma câmara de medição contendo um fluido.

Petição 870170002942, de 16/01/2017, pág. 9/9 intigcn nntíbody • · • · · • · »· » • · ♦ ♦ · * • * • ·· • * • · • « · · · • a ntiyo na ntibody eoinplex nggregation

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