DK150809B

DK150809B - Reagens indeholdende polyethylenglycol til immunologiske undersoegelser

Info

Publication number: DK150809B
Application number: DK016976AA
Authority: DK
Inventors: Carlton Deaton; Eugene Achter; Jerome Kremen; Rodolfo Rodriguez; Paul Priarone
Original assignee: Cooper Lab
Priority date: 1975-01-29
Filing date: 1976-01-16
Publication date: 1987-06-22
Also published as: NL183852C; FR2299645A1; DE2602068C2; DK16976A; NL183852B; SE7600232L; NL7600697A; JPS51101121A; FR2299645B1; NO149864C; IT1062433B; NO760203L; GB1540097A; SE441392B; NO149864B; BR7600322A; JPS604938B2; CH613047A5; IL48804A0; DE2661010C2

Description

i 150809

Opfindelsen angår et immunologisk reagens af den i krav l's indledning angivne art.

Der findes et stort antal immunologiske bedømmelsesmetoder baseret på vidt forskellige principper, som på et eller an-5 det trin i undersøgelsen og med forskellige formål gør det nødvendigt at udfælde så meget som muligt af antistof-antigen- komplekset. For eksempel spiller udfældning af komplekset en betydelig rolle i sådanne sædvanlige immunologiske bedømmelsesmetoder som elektroforetisk analyse, en-10 zymatiske bedømmelser, radio-immunologiske bedømmelser (RIA = "Radio^mmunoAssays") og nefelometriske bedømmelser, og der er blevet gjort meget arbejde for at udvikle midler til at forøge udfældningen af komplekser med henblik på at forbedre disse undersøgelsesmetoder. Normalt er kompleks-15 udfældningen nødvendig for at isolere det immunologiske reaktionsprodukt fra de ikke-reagerede immunologiske reagenser, der indgår i den pågældende undersøgelsesmetode, hvorved enten det isolerede reaktionsprodukt eller de ikke-reagerede reagenser kan analyseres hver for sig til opnåel-20 se af en meningsfyldt diagnostisk bedømmelse.

Det er kendt ved en immunologisk bedømmelsesmetode, der omfatter f.eks. en nefelometrisk analyse, at fortynde prøver med en opløsning af polyethylenglycol-polymer, inden både inkubationen af prøven og målingen på det nefelometri-25 ske instrument. Ganske vist medfører anvendelse af poly-ethylenglycol en forbedring af den nefelometriske analyse ved at koncentrationen af suspenderede partikler forøges, men ikke desto mindre står det problem tilbage, at der ikke kan udføres en tilfredsstillende analyse på mange biolo-30 giske materialer, på grund af et utilstrækkeligt afprøvningsområde eller utilstrækkelig følsomhed på grund af en utilstrækkelig koncentration af suspenderede partikler i prøveportionen.

Det er opfindelsens formål at løse det ovenfor omtalte pro- 2 150809 biem ved at tilvejebringe et forbedret immunologisk reagens, som medfører en betydelig forøgelse af udfældningen af anti-stof-antigen-komplekser ud over hvad der har kunnet opnås alene ved anvendelse af polyethylenglycol, og dermed en 5 forøgelse af koncentrationen af suspenderede partikler i prøveportionen, så at det bliver muligt at analysere biologiske bestanddele, som ikke har kunnet analyseres alene ved anvendelse af polyethylenglycol, uanset hvorvidt der anvendes nefelometriske eller andre bedømmelsesmetoder.

10 Det angivne formål opnås ved hjælp af et reagens, som ifølge opfindelsen er sammensat som angivet i krav l's kendetegnende del.

Med fordel kan reagenset indføres i prøvemediet med henblik på udførelse af en nefelornetrisk, enzymatisk, elektrofore-15 tisk eller radioimmunologisk bedømmelse.

Når der f.eks. anvendes en nefelometrisk bedømmelsesmetode til at analysere biologiske bestanddele i form af antistofan tigen-komplekser, foretages der først en inkubation af reagenset og de biologiske bestanddeles suspenderede par-20 tikler, hvorefter den nefelometriske analyse udføres. Ved denne metode bringes stråler fra en lyskilde til at passere gennem en væskeprøveportion, idet lysstrålerne rettes gennem de suspenderede partikler. Når strålerne rammer de suspenderede partikler, spredes eller diffunderes de i en 25 hvilken som helst forud bestemt vinkel, fra lyskilden, og de modtages af fotoceller. Dette spredningslys omdannes til et elektrisk signal, som er direkte proportionalt med partikelkoncentrationen, som derved kommer til udtryk på et måleinstruments skalaskive.

30 Som eksempler på instrumenter, der kan anvendes til nefelometriske analyser, kan nævnes følgende: Hyland Laser Nephelometer PDQ® (Hyland Laboratories), Aminco-Fluoro-colorimeter (American Instrument Company), Aminco-Bowman 3 150809

Spectrophotofluorometer (SPF), samt Auto Analyzer II med påsat Fluoronephelometer (Technicon Instruments Corporation).

Ved anvendelse af disse nefelometriske instrumenter og principper kan den kliniske tekniker foretage nøjagtige bestem-5 melser af små koncentrationer af et antal vidt forskellige specifikke proteinstoffer, f.eks. ixnmunoglobulinerne IgG,

IgA, IgM, transferrin, komplement C3, haptoglobin, α^-anti-trypsin, β-lipoprotein, albumin, o^-makroglobulin, a^-surt glycoprotein, samt forskellige andre biologiske bestanddele, 10 som f.eks. triglycerider, lipoproteiner, og humane chorio-niske gonadotropiner.

De vigtigste fordele, som opnås ved anvendelse af reagenset ifølge opfindelsen, er a) at inkubationstiderne forkortes væsentligt, og 15 b) at der opnås en højere koncentration af udfældte komplekspartikler ved kortere inkubationstider, og som følge heraf et udvidet undersøgelsesområde og en større følsomhed.

Disse fordele opnås ved en hvilken som helst immunologisk undersøgelsesmetode, som kan forbedres ved at forhøje ud-20 fældningen af antistof-antigen-komplekset på et eller andet trin i undersøgelsen. Fordelen opnås også ved immunologiske bedømmelsesmetoder, som er baseret på et trin med udfældning af antistof-antigen-komplekser på et eller andet stadium under bedømmelsesproceduren.

25 Som angivet i krav 1, bør den vandige reagens-opløsning -ud over at indeholde omtrent 3-6 vægt-% af blandingen af polyethylenglycol og det ikke-ioniske overfladeaktive stof -også udvise en beregnet HLB-værdi på mellem omtrent 0,7 og omtrent 1,7.

30 HLB-værdien er et vel indarbejdet mål for den hydrofil-lipo-file balance (heraf udtrykket "HLB") for et bestemt overfladeaktivt stof. HLB-systemet til identificering af over- 4 150809 fladeaktive stoffer er blevet udviklet af Atlas Chemical Industries, Inc., og er nærmere beskrevet på side 28-36 i Atlas-publikationen med titlen "Guide to the Use of Atlas Surfactants and Sorbitol in Cosmetic and Pharmaceutical 5 Products" (1965). Hvert enkelt overfladeaktivt stof er forsynet med et HLB-tal. Et lavt HLB-tal betyder, at stoffet er forholdsvis lipofilt ("glad for olie"), mens et højt HLB-tal betyder, at stoffet er forholdsvis hydrofilt ("glad for vand"). Metoden til at bestemme HLB-værdien for et hvil-10 ket som helst bestemt overfladeaktivt stof er velkendt, og er beskrevet i f.eks. en Atlas-publikation med titlen "The Atlas HLB System" (Code LD-97).

HLB-værdien for en blanding af overflade-aktive stoffer, således som de findes i reagenset ifølge opfindelsen, er 15 en funktion af koncentrationen af hvert overfladeaktivt stof i blandingen, og der skal derfor ved beregning af blandingens HLB-værdi tages hensyn til HLB-værdierne for de enkelte overfladeaktive stoffer. I overensstemmelse med offentligt kendte og anerkendte metoder beregnes HLB-værdi-20 en for blandingen ved at multiplicere HLB-værdien for hvert overfladeaktivt stof i blandingen med dets koncentration i den pågældende stofblanding, hvorefter de således fremkomne værdier adderes. Dersom reagenset ifølge opfindelsen f.eks. havde et indhold af 1 vægt-% polyethylen-glycol (HLB = 20) 25 og 3 vægt-% af et ikke-ionisk overfladeaktivt stof med en HLB-værdi på 30,5, kan reagensets HLB-værdi udregnes som følger: 0,01 x 20 = 0,2 0,03 x 30,5 = 0,915 30 sum 1,115 (reagensets HLB-værdi)

Med henblik på at afgøre, hvorvidt en blandings HLB-værdi ligger inden for det for reagenset ifølge opfindelsen foreskrevne interval mellem 0,7 og 1,7, kan en udregning af den ovenfor viste art let foretages på grundlag af mængden 5 150809 af hver bestanddel i blandingen og under anvendelse af HLB-værdier, som enten kan være offentliggjort for det pågældende stof eller findes ved at anvende Atlas-metoden.

Inden for opfindelsens rammer kan der anvendes en række vidt 5 forskellige ikke-ioniske overfladeaktive stoffer sammen med polyethylenglycol, under forudsætning af 1) at indholdet af blandingen af ikke-ionisk overfladeaktivt stof og polyethylenglycol er mellem 3 og 6 vægt-% på det tidspunkt reagenset anvendes til bedømmelsen, samt 10 2) at reagensets beregnede HLB-værdi på det samme tidspunkt er mellem 0,7 og 1,7.

Dersom på anvendelsestidspunktet blandingen af ikke-ionisk overfladeaktivt stof og polyethylenglycol udgør mindre end 3 vægt-% af reagenset, eller dersom dettes HLB-værdi er 15 mindre end omtrent 0,7, bliver det svært at udfælde den ønskede mængde antistof-antigen-kompleks i den udstrækning, der kræves for en vellykket fuldførelse af den immunologiske bedømmelse. Dersom blandingen på den anden side udgør mere end 6 vægt-% af reagenset, eller dennes HLB-værdi er større 20 end omtrent 1,7, udfældes andre proteinstoffer ud over det ønskede antistof-antigen-kompleks, hvorved bedømmelsens skelneevne ødelægges, så at resultaterne ikke kommer til at udgøre mål for de ønskede størrelser.

De relative andele af polyethylenglycol og ikke-ionisk over-25 fladeaktivt stof i blandingen kan varieres inden for vide grænser, hvad der i stor udstrækning afhænger af hvilket overfladeaktivt stof, der anvendes. F.eks. kan blandingen indeholde mellem 10 og 90 vægt-% polyethylenglycol og mellem 90 og 10 vægt-% ikke-ionisk overfladeaktivt stof. Fortrins-30 vis indeholder blandingen mellem omtrent 15 og 85% polyethylenglycol og mellem 85 og 15% ikke-ionisk overfladeaktivt stof.

Til blandingens indhold af polyethylenglycol kan der anven- 6 150809 des en eller flere forskellige typer eller former af poly-ethylenglycol. Den anvendte polyethylenglycol-polymer har i almindelighed en molekylvægt på mellem omtrent 200 og omtrent 10.000, fortrinsvis mellem omtrent 4.000 og omtrent 5 6.000. Disse materialer findes i handelen, f.eks. i form af

CARBOWAX 4,000 eller 6,000 fra Union Carbide, eller PEG

4,000 eller 6,000 fra Dow Chemical Company. Molekylvægtområdet omkring omtrent 4.000 er især foretrukket.

Den af ikke-ionisk overfladeaktivt stof bestående bestand-10 del i blandingen kan være et hvilket som helst ikke-ionisk overfladeaktivt stof, som· i reagensopløsningen vil frembringe en HLB-værdi på mellem 0,7 og 1,7, fortrinsvis mellem omtrent 0,7 og omtrent 1,3 ved en koncentration af blandingen mellem 3 og 6%. Til orientering kan nævnes, at HLB-15 værdien for selve det ikke-ioniske overfladeaktive stof kan ligge et sted i området mellem 10 og 30 eller mere.

Et særligt foretrukket ikke-ionisk overfladeaktivt stof er en blokpolymer af ethylenoxid og polyoxypropylen. Denne særlige polymer, og hvorledes den fremstilles, er omtalt 20 i beskrivelsen til USA-patent nr. 2.674.619. Disse blokpolymerer fremstilles i almindelighed ved kondensation af ethylenoxid med polyoxypropylen-polymer, og kan betegnes med følgende strukturformel: HO(CH2CH20)a (CH3CHCH20)b (CH2CH20)c H.

25 Til anvendelse med opfindelsen indeholder disse blokpolymerer fortrinsvis mindst 50% ethylenoxid i molekylet og udviser en polyoxypropylen-hydrofob-basemolekylvægt på mindst 950, på lignende måde som beskrevet i beskrivelserne til USA-patenterne nr. 3.450.502, 3.577.522 og 3.590.125.

30 Som eksempler på sådanne egnede copolymerer kan nævnes de polyoler, som under betegnelserne F-38 og F-68 PLURONIC® forhandles af Wyandotte Chemicals Corporation. F-38 inde- 7 150809 holder 80% af polyoxy-ethylenhydrofile enheder i molekylet/ og polyoxypropylen-hydrofil-basen har en molekylvægt på 950.

Som ikke-ionisk overfladeaktivt stof foretrækkes især F-38.

F-68 indeholder også 80% polyoxyethylen-hydrofile enheder 5 i molekylet/ men den hydrofobe base har en molekylvægt på 1.750. Den samlede molekylvægt for disse to PLURONIC®-poly-oler er 4.750 henholdsvis 8.750. PLURONIC® L-125 har også vist sig at kunne anvendes. En nærmere beskrivelse af disse polyoler kan findes i bulletinen "The Pluronic Grid", 6. udg., 10 fra Wyandotte Chemical Corporation.

Når der anvendes PLURONIC ikke-ioniske overflade-aktive stoffer, foretrækkes det i almindelighed at anvende en blanding bestående af omtrent 20-40 vægt-% polyethylen-glycol og omtrent 80-60 vægt-% blok-copolymer af ethylenoxid og 15 polyoxypropylen-polymer.

En reagensopløsning, som foretrækkes, indeholder omtrent én vægtdel polyethylenglycol med en molekylvægt på omtrent 4.000 og omtrent tre vægtdele af Pluronic F-38-materialet. Reagensopløsningen indeholder omtrent 1% polyethylenglycol 20 og 3% F-38. Opløsningens HLB-værdi kan beregnes som følger: 1% polyethylenglycol: 0,01 x 20+ =0,2 3% F-38 0,03 x 30,5++= 0,915 1,115

Der kan anvendes mange vidt forskellige ikke-ioniske over-25 fladeaktive stoffer sammen med polyethylenglycolen i reagensopløsningen ifølge opfindelsen, forudsat at de ved en blandingskoncentration på mellem 3 og 6% giver en HLB-værdi i det ønskede interval mellem 0,7 og 1,7. For eksempel har TETRONIC®-serien af ikke-ioniske overfladeaktive stoffer, + i litteraturen angives polyethylenglycols HLB-værdi som 20 ++ i litteraturen angives F-38's HLB-værdi som 30,5 8 150809 som kan skaffes fra BASF Wyandotte Corporation og er nærmere beskrevet i dette firmas brochure med titlen "Technical Data on Tetronic® Series Nonionic Surfactants" og i beskrivelsen til USA-patent nr. 2.979.528, vist sig at være 5 velegnede, navnlig de af dem med betegnelserne TETRONIC® 707, 908, 1107, 1307 og 1508. De med TETRONIC® betegnede produkter er baseret på ethylendiamin, og har følgende almene formel:

H (C2H4°> y (C3H60) χχ ^ <C3H6°> x (C2H40> yH

N-CH.-CH_-N

H <C2H40)y(C3H60)x XV1 x <C2H40)yH

10 Molekylvægten for stofferne i TETRONIC®-serien kan variere fra omtrent 1.650 til over 26.000. De mest foretrukne overfladeaktive stoffer af i TETRONIC®-serien har molekylvægte i området fra omtrent 15.000 til omtrent 27.000 og HLB-vær-dier på omtrent 20-30,5. Forholdet mellem polyethylenglycol 15 og TETRONIC® overfladeaktivt stof i blandingen kan - som ovenfor omtalt - varieres inden for vide grænser.

En anden gruppe af anvendelige ikke-ioniske stoffer er den med PLURAFAC® betegnede produktserie, som også markedsføres af BASF Wyandotte, navnlig de med betegnelserne PLURAFAC® 20 17R8, 25R8, D25, A38 og A39. PLURAFAC®-produkterne er lige- kædede, primære aliphatiske oxyalkylerede alkoholer, som er nærmere beskrevet i BASF Wyandotte's brochure med titlen "Technical Data on Typical Physical Properties of PLURAFAC® Nonionic Surfactants". De foretrukne PLURAFAC®-produkter 25 har HLB-værdier på omtrent 10-20, og de kan anvendes i stærkt varierende blandingsforhold med polyethylen-glycol.

Andre egnede ikke-ioniske overfladeaktive stoffer omfatter glycerolmonostearat. Et foretrukket glycerolmonostearat kan skaffes fra Atlas Industries Inc. under handelsnavnet 30 ARLACEL® 165 (HLB = 11,0).

15080S

9

Selvsagt kan der være mere end et enkelt ikke-ionisk overfladeaktivt stof til stede sammen med polyethylen-glycolen, forudsat at blandingen har den foreskrevne koncentration og opløsningen har den foreskrevne HLB-værdi.

5 Når der skal udvælges et ikke-ionisk overfladeaktivt stof til opfindelsens udøvelse, bør der vælges et sådant stof, som også er i stand til at sikre, at reagensopløsningen er klar i det mindste på det tidspunkt reagensopløsningen først anvendes i den immunologiske bedømmelsesproces. For-10 målet hermed er at sikre, at reagenset ikke forstyrrer undersøgelsesresultaterne eller bevirker en ikke-specifik udfældning af den biologiske prøveportions bestanddele eller de i bedømmelsessystemet anvendte biologiske reagenser.

Reagens-systernet ifølge opfindelsen finder en udstrakt an-15 vendeIse til forbedring af et stort antal sædvanlige immunologiske bedømmelsesmetoder, som på et eller andet tidspunkt - uanset med hvilket formål - kræver udførelse af et procestrin, der omfatter udfældning af det antigen-antistof-kompleks, som under bedømmelsesprocessen er dan-20 net ved antigen-antistof-reaktionen. Sådanne bedømmelsesmetoder er velkendte af fagfolk på området, og behøver derfor ikke at omtales nærmere i nærværende beskrivelse. Opfindelsens anvendelighed og nytte ved disse forskellige bedømmelsesmetoder, og detaljerne i sådanne metoder, vil 25 stå klart for fagfolk på dette område ved læsning af nærværende beskrivelse, og det er derfor ikke nødvendigt at give udtømmende gentagelser af disse detaljer og procedurer i nærværende beskrivelse. Reagenset ifølge opfindelsen kan f.eks. anvendes til at forbedre virkningen i et 30 hvilket som helst system, som er baseret på udfældning af antistof-antigen-komplekser til dannelse af en klar supernatant med henblik på fluorescensmåling eller kolorimetri. Reagenset kan eventuelt også anvendes til at fjerne forstyrrende stoffer, som findes i biologiske væsker eller 35 reagenser (f.eks. fedtstoffer, salte,eller fremmede protein- 150809 ίο stoffer) med henblik på nefelometriske, enzymatiske eller andre bedømmelser. Dette opnås ved at fjerne reaktionsdeltagere .

På de fleste af de områder, hvor opfindelsen kan anvendes, 5 blandes den eller de biologiske bestanddele, som skal afprøves, med den vandige reagensopløsning ifølge opfindelsen, hvorefter blandingen inkuberes i et forud bestemt tidsrum, f.eks. omtrent én time ved stuetemperatur (20-25°C), hvorpå der foretages målinger ved hjælp, af dertil indrettede 10 instrumenter, f.eks. et nefelome.ter, når det drejer sig om en nefelometrisk analyse. Resultaterne af målingerne på prøveportionerne sammenlignes med måleresultater fra referenceportioner, så at den ubekendte koncentration kan findes.

Opfindelsen skal i det følgende belyses nærmere ved en række 15 forsøgsresultater.

Forsøgene blev udført for at sammenligne forskelle i graden af udfældning af antigen-antistof-kompleks, opnået i en immunologisk reaktion udført i nærværelse af (1) kombinationen ifølge opfindelsen af polyethylenglycol 20 (PEG) og ikke-ionisk overfladeaktivt stof, (2) PEG alene, og (3) det ikke-ioniske overfladeaktive stof alene.

Fra de fra PEG alene og det ikke-ioniske overfladeaktive stof alene fremkomne data blev den forventede virkning af 25 kombinationen af PEG og ikke-ionisk overfladeaktivt stof beregnet og derpå sammenlignet med den faktisk observerede virkning af kombinationen af PEG og ikke-ionisk overfladeaktivt stof, for derved at bestemme, hvorvidt den iagttagne virkning var i overensstemmelse med den beregne-30 de (eller forventede) virkning, eller ej.

Forsøgene udførtes på følgende måde:

Opløsninger af PEG alene, ikke-ionisk overfladeaktivt stof 11 150809 alene og kombinationen af PEG og ikke-ionisk overfladeaktivt stof tilberedtes ved at opløse PEG og/eller ikke-ionisk overfladeaktivt stof i saltopløsning. Hver opløsning blev derpå underkastet følgende forsøgsrække: 5 (a) opløsningen blev fortyndet i forholdet 1:1 med et anti serum indeholdende den optimale koncentration af specifikt antistof for det antigen, der skulle bedømmes; herved fremkom en opløsning, som i tilfældet af kombinationen ifølge opfindelsen indeholdt 3-6% polymer-10 faststof og havde en HLB-værdi på 0,7-1,7, og som i tilfælde af opløsninger med PEG alene eller ikke-ionisk overfladeaktivt stof alene indeholdt tilstrækkelig polymer i den afprøvede kombination ifølge opfindelsen.

(b) 25 yl af en opløsning, der indeholdt et givet antigen 15 ved et kendt niveau, blev blandet med én ml opløsning ifølge (a), og dette blev gentaget for et antal antigen-opløsninger, hvori det kendte antigen-niveau blev varieret; kontrolportioner tilberedtes på samme måde, dog uden tilsætning af antistof.

20 (c) opløsningen ifølge (b) og kontrolportionen blev derpå anbragt i et Laser Nephelometer PDQ®, et instrument, der forhandles af the Hyland Division of Travenol Laboratories, Inc., Costa Mesa, California, U.S.A., og derpå inkuberet i ti minutter ved stuetemperatur.

25 (d) kontrolportionens og opløsningens procentvise lysspred ning blev derpå iagttaget og optegnet. Instrumentets udlæsefunktion kompenserede automatisk for kontrolportionen. I de tilfælde, hvor der for hver prøve blev taget mere end én aflæsning af lysspredningen, blev 30 resultaterne omdannet til gennemsnit.

Der blev udført forsøg på et stort antal forskellige ikke-ioniske overfladeaktive stoffer. Forsøgsresultaterne fremgår af efterfølgende tabeller 1-6. Hvert data-sæt viser mængden af udfældt antigen-antistof-kompleks som målt ved 35 den med nefelometeret iagttagne lysspredningsgrad. Visse data fra hver tabel er vist grafisk i fig. 1-6 for at gøre 12 150809 forsøgsresultaterne mere overskuelige, idet hver figur har det samme nummer som den pågældende tabel.

Idet tabel 1 tages som eksempel, kan forsøget forklares som følger: 5 Tabel 1 var opstillet med henblik på at undersøge følgende polymer-kombination, der ligger inden for opfindelsens rammer: 1 vægt-% PEG 3 vægt-% PLURONIC F-38 10 eller en samlet polymer-vægtprocent på 4.

Udfældningsgraden af antigen-antistof-kompleks, frembragt over et bredt område af IgG-koncentrationer af 1% PEG alene, blev først målt nefelometrisk som udtryk ved den procentvise lysspredning. Disse data er opført i kolonne (1) i 15 tabel 1. Derpå blev der på samme måde foretaget målinger af udfældningsgraden af antigen-antistof-kompleks, frembragt over det samme område af IgG-koncentrationer af 3% PLURONIC F-38. Disse data er opført i kolonne (2) i tabel 1. Det resultat, som rent logisk kunne forventes ved at 20 kombinere 1% PEG med 3% PLURONIC F-38 til dannelse af en blanding på tilsammen 4% af de to polymerer, blev derpå beregnet ved at addere disse data i kolonnerne (1) og (2).

De således fremkomne data repræsenterer det forventede eller beregnede resultat, og er opført i kolonne (3) i tabel 1.

25 Den faktiske udfældningsgrad af antigen-antistof-kompleks, frembragt af blandingen af 1% PEG og 3% PLURONIC F-38, blev derpå bestemt ved forsøg. Disse data er opført i kolonne (4) i tabel 1. De forventede resultater (i kolonne (3)) blev derpå sammenlignet med de faktiske resultater 30 (i kolonne (4)), for at se om de passede sammen eller ej.

Denne sammenligning vises bedst grafisk, og til dette for- 13 150809 mål er dataene fra kolonnerne (3) og (4) i tabel 1 vist grafisk i fig. 1.

Ved betragtning af fig. 1 kunne det straks ses, at de faktiske data fra målingerne på blandingen af de to polymerer 5 afviger i væsentlig grad fra de forventede resultater som baseret på målingerne på de enkelte polymerer.

Hvad angår den forventede kurve (svarende til data i kolonne (3)), er det indlysende, at der ikke ville kunne forventes nogen forøgelse af udfældningen af antigen-antistof-10 kompleks i området 0-37,5 mg IgG/dl, idet en forøgelse kun kunne forventes i området 37,5-75 mg IgG/dl. Årsagen hertil fremgår ved undersøgelse af dataene i kolonnerne (1) og (2), hvorfra den forventede kurve blev tegnet. Disse data viser, at kurven for 1% PEG forbliver i alt væsentligt 15 flad over hele området 0-75 mg IgG/dl, mens kurven for 3% PLURONIC F-38 kun er flad i området 0-37,5. Eftersom både kurven for 1% PEG og kurven for 3% PLURONIC F-38 er flade i området 0-37,5, ville man næppe forvente, at kurven for 1% PEG og 3% PLURONIC F-38 skulle være andet end flad i 20 dette område. Alligevel viser de faktiske resultater (kolonne (4)) overraskende, at dette afgjort ikke er tilfældet. Den faktiske kurve er kun flad i området 0-10 mg IgG/dl; derefter begynder den at-stige kraftigt i området 10-37,5, hvor den forventede kurve jo netop er flad.

25 Betydningen af disse resultater er, at den faktiske kurve for polymer-blandingen udviser en stærkt forøget linearitet eller krumliniethed sammenlignet med den forventede kurve.

Som fagfolk på dette område vil kunne indse, er en lineær sammenhæng mellem den procentvise lysspredning og koncen-30 trationen af det antigen eller immun-stof, der undersøges, af væsentlig betydning for en meningsfyldt diagnostisk bedømmelse. Og jo større linearitetsområdet er, desto bredere er bedømmelsens dækningsområde. Af fig. 1 fremgår det således, at tilstedeværelsen af polymer-blandingen af 1% PEG

14 150809 og 3% PLURONIC F-38 under den immunologiske reaktion medfører en uventet, dramatisk forbedring af bedømmelsens immunologiske dækningsområde. Ved hjælp af polymer-kombinationen blev den mindste påviselige mængde IgG sænket 5 til 10 mg IgG/dl, sammenlignet med en mindste påviselig mængde på så meget som 37,5 mg IgG/dl baseret på de individuelle bidrag fra PEG og PLURONIC F-38 hver for sig.

Dette repræsenterer en dramatisk forøgelse i bedømmelsens dækningsområde, som er helt uventet. Fra disse data frem-10 går det således, at kombinationen af 1% PEG og 3% PLURONIC F-38 frembringer en ønsket virkning, som langt overskrider den forventede.

En yderligere uventet fordel er det, at den faktiske kurve i fig. 1 viser højere måleværdier med hensyn til gennem-15 snitlig procentvis lysspredning på nefelometeret. Dette betyder selvsagt en væsentlig forbedring af bedømmelsens følsomhed og reproducerbarhed, og som følge heraf en mere pålidelig bedømmelse.

Lignende og endnu mere dramatiske uventede virkninger kan 20 iagttages i de i tabellerne 2-6 opførte data. Disse data viser tydeligt, at kombinationen af PEG med et andet ikke--ionisk overfladeaktivt stof medfører en forøgelse af bedømmelsesområdets øvre grænse fra 600 til 1200 mg IgG/dl, sammenlignet med hvad der rent logisk kunne forventes ved 25 at kombinere polymererne. I de undersøgte systemer medfører kombinationen af polymererne således en synergistisk virkning.

15 150809 00 m i h

U

Q

W §

P ιβ o m <n co ^i* H

□ Οι ·'·''

<3« R Η O ID Η H

— gl o\° (N Γ- K 00 +

P

e 04 o\o

iH

'u

4¾ CN

I + iH Ή a) — m „ <u 00 fi op W h 8 u

y I ^ Ο ΰ ΰ Η (M

Q) ηηοΗΗ'ψ !j ^ M ro ·

p. S ι-l I + I I + + H

w Ξ Λ ^ m o\° tjl

H fO -H

to +

ιΗ -Η -H

J .D Ξ X

h a 04 ω

ffl (D -H

S ϋ cig ty * § w i S 8 % $ l π

3 U LD ro LD ΓΟ ΓΟ 00 -P

m Η K K S. ^ H CQ

H 3 γΗΟγΗγΗγΗΓΟ c ffl ' rj Q , CO ffl g ~ g I I i I + + £< S 04 &j θ\° ro

S

^ ^LncnHncMcn <? Η Οι ·— H 00 rH O © Q —s o\° I + + I I t 00 rH ^ ω

iH O

Ό H

ί * • oo r~~ m 0)

O ro 10 co m C

£ ^ ^ ^ < H

O o^cricor'-m <d f H co r>- g

» I

h] > 16 150809 Γ'· ο r- Η S \ ^ Η Η ΡΊ Η CM Ο CM CM 00 — &S Cftp η (Ί η Ί) Η σ> 2 η Η Η fjj + Ο

R

Ac <Λ° s Η Μ & Q) χ ε cm 5 + Φ m η j ; ο tr Γ" •Η X! ^ •π g )s Η Γ' W ΐΛ Λ m ® Q3 ____, §ο ^ κ *. ν κ *· ^ ΜγοΘΚ ν ο ο1 ί1 η οι ί1 · Q'-'HP cm ο* r^- Η cd οο cm 0) S Μ Η Η Η CQ Η ΕΗ ·

^ ο\° jH

• 00 Μ-Ι CM -Η + Ή ils s is0· ί Η ο ο\ο {0 Η Η & .5 3 Η Ο Η 4-> Γ- Η ri « 43 μ ί-1 να in in ιη ιη ω 2 ν ζ χ. k χ χ ε Φ cm Q ο Η ^ co m ο Η Φ £ 2 Η CM 00 CD CM 00 Μ HR HH Ή Ο EH {jj θ\° 00 ίϊ ο* 0 ιη &> Η m cm ιη οί Ο —J Oj ». V. k. k k-' H cn o co cd cn oo

0\0 CM ΟΊ Μ1 M1 CO

iH " Φ 1 i I s • oo Φ

ϋ cd m P

Ci * *» M

Ο ο* t^· in ο ο ο ο Φ

oo γ- in ο ο ο H

T H 00 CO CM Ό

& H I

H > 17 150809 Γ" ο (Η γ—1

X

X §

~ Η I

^ Μ Μ X Η οο Η © 00 Η 00 2 ο\° Η Ν Tf 1Λ Η ffl (χι ΓΟ Η Η + g Κ 0\° t—ι

-Ρ CM

Q) g + Φ ^ % Γ- £ 3 Η μ χ ^ 2 ro μ m m m ^ rQ (V) π Π *.»*»» s ·>. ».

φ ^ 0 g CM Ο CO Ch OO Ο p Km cm r~ ο id ^ · Ρ_ Η Η ι—I ι—I ι—I ΓΟ ω PQ Μ U) · >1 θ\° ϋ) ι—ί ΓΟ ‘ri ΙΗ η *Η + -Η j ί> ^ λ; 1 s * .¾

Ibs ή ρ & α φ tr 2 Η Ο Φ I—Ί —I Γ-Ι -Ρ Η i! X Λ . "$ w .—. η οο ιη ιλ ιη ω g CM g - ' ' Ε Φ'-' Q OHrorocMt^vo ω c κ Η CM ^1* © Η co Ρ

5 Η I—1 Η IW

s i a 0\0

CO

s CD m trs

B Ln cm m σ> O

r—I K K ^ * ^ η σι o co ιο σι oo —.

o\o CN Π Tf Tf co

H

Ί S

v— -H

• 00 Φ

ϋ id in C

S - «. fi 0 ^ r-~ in ο ο ο ο Φ X ror'inooo ·Η

1 πi ro id cm >CJ

% - I

H > 18 150809 r- 0 ro i—i

X

w § CO ti ^-nHH p> λ m m cn — k o o <n o t- H cm 2 o\o H r-i «41 co CO Γ-; |X| rH H ri + 0 &

Pj

o'P

CO

i s

i—I iH

ω ^ iw 0) r-- 3. 2 —- ro

rH

g g X

3 is 3 H co σι m oo rQ ro G Q **

m Ξ g o cm H cti cm c^ H

^ ffiti HrotncriHin & W Η H ^ a (3 p : . > o'P Φ * H ¢1 ,* -3 + ή j ^ a λ S S Pi ® § p o\p iy

Eh o CO Co a a 5 5 ί 53 Ώ η d Λ χ +3 m cm η η οο σ t οο m

S OOiHr-'COOCTlrH S

g g H ™ «s

s s 1 S

0\0 H s ^ ^ CM IP S' rH Qj ^ ^ -- O Η Ό* (O H O O ·—'

cJP HCM’^’t'Hin CO

CO H ^ ^ o

1 S

• °0 Φ g s

O ^Γ'ΐροοοο CD

jjjcot'inooo H

T iH CO CO CM »P

4 ri I

H > 19 150809

OO

o in

rH

tø

tø S

W H

^ Η ω oo in ^ r μ ** v '-'tø o co oo oo ro od o

Æo\o rH CO OO ΙΟ H O

tø Η Η N

+ tø o\o 00 i

-P CO

I +

rH iH

(D — m Q) 00 £ o — m

rH

£ Eh X! α^-Ν§§ n id id r- io

Tj 00 CO Q *.«·* - ·> ' φ — HE o vd oo vd •«tf vo oo j-ι 2 h Hoor'-Hinin ·

P. Ηί rH rH IH

to m h > 0\0 Ol H H i! to + m -H Ή

jj jj ^ X

I s * .¾ S o o\o Ή

fl o oo {Q

a ft jl t7>

CD 00 4J

-H O <V

rH LO rH

-P rH Ή

f! r— tø +J

m CM Η O lo lo N to 'i tø

S *—' ry >, ^ s ^ H

m q in 'f oo oo ΰ o ® g g H 00 ^ ^ £j OH $ o\°

H G

»w-r ^ ^ co m & rH tø v *· >— OrH-^OOrHOO ^

d0 rH CO ^ Γ" rH m CO

00 H —' Φ

P Q

^ "i s *

• 00 S

Ό io in p G *» *· w 0 ^ in o o o o Φ

14 ro m o o o -H

1 H 00 10 co. Ό

% H I

H > 20 150809

CO

ro <; « s cq □ o m —- η P o oi in ro -¾ o o η σι oo ro t''

S o\° h m σι H

ft m + 0 & ft 0\0

H

H s rH «Η ω ~

MH

<D 00 £ 7 * s 'c —.. M ti o in in 'p ro G S h n io h r-m m -— 63(¾ * k k v < ^

M SS HHHOOCMt^OO

Q. ØM Γ0 ID

ω pq ft i i i i i + > 0\0 &>

Η Γ0 jH

0} +

id -Η -H

H i S * i 8 S ft

tn oo -P

•H ro (D

3 * H

2 — n in m 4-1 m cm C γοογοοοΓ'Γ'Οοη rø

0 -—- ij_i C

S S ι-ΗΗΗΟΟΟΓ-'-'φ ffl SK CM S-l

S 5 I I I 1 I + ‘H

0 pjj 1-1 Φ o\o c5 in in in in tp

— H cMOiHiHinrocncM O

oooooHcn-a* ^ 0\o ro rH ^ ω 1 3 • r- m gj o m h m p

β * *» *» H

0 cnoop-inoooo a)

Hrot^mooo -H

T H ro io cm ό

1 H I

H >

Claims

150809

1. Immunologisk reagens af den art, der indeholder en vandig opløsning af et antistof eller antigen og mindst én polyethylenglycol, kendetegnet ved, at det 5 tillige indeholder mindst ét ikke-ionisk overfladeaktivt stof, idet mængden af glycol og overfladeaktivt stof er således valgt, at den vandige opløsning indeholder mellem 3 og 6 vægtprocent af glycol og overfladeaktivt stof, og at den beregnede HLB-værdi (Hydrofil-Lipofil-Balance) lig-10 ger mellem 0,7 og 1,7, når reagensets koncentration ligger mellem de angivne værdier.

2. Reagens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den vandige opløsning indeholder et antiserum.

3. Reagens ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet 15 ved, at den vandige opløsning er en blanding af polyethylenglycol og en blanding af overfladeaktive stoffer omfattende a) en blok-copolymer af ethylenoxid og polyoxypropylen, b) .ligekædede primære aliphatiske oxyalkylerede alkoholer, c) glycerolmonostearat, eller 20 d) polyoler med formlen H <c2h40)y(C3H60)χ^ (c3h60)x(c2h40)yH x N-CH2~CH2-N^ B<C2H40yC3H60)x^ <C3H60)X<C2H40)yH

4. Reagens ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at polyethylenglycolen har en molekylvægt på mellem 4000 og 6000, og at det ikke-ioniske overfladeaktive stof 25 er en blok-copolymer af ethylenoxid og polyoxypropylen, og at opløsningens HLB-værdi er fra 0,7 til 1,3, når reagensets koncentration ligger i det i krav 1 nævnte område.

5. Reagens ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at den vandige opløsning indeholder en blanding bestå-