DE2602068A1

DE2602068A1 - Immunologisches reagens

Info

Publication number: DE2602068A1
Application number: DE19762602068
Authority: DE
Inventors: Eugene Achter; Carlton Deaton; Jerome Kremen; Paul Priarone; Rodolfo Rodriguez
Original assignee: Baxter Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1975-01-29
Filing date: 1976-01-21
Publication date: 1976-08-05
Also published as: DK150809B; NO149864B; IL48804A; GB1540097A; ES444543A1; CA1080619A; NL7600697A; IL48804A0; SE441392B; NL183852C; SE7600232L; DE2661010C2; IT1062433B; JPS51101121A; CH613047A5; DK16976A; NO760203L; JPS604938B2; NO149864C; FR2299645B1

Description

PATENTANWÄLTE „ „ _{u u} .... _u

813 Starnberg bei München

K. SIEBERT G. GRÄTTINGER Postia*i«g.Aime>daw_ea 12

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den

Baxter Laboratories, Inc. Anwälte 6620/1

One Baxter Parkway, Deerfield
Illinois 60015 - USA

Immunologisches Reagens

Die Erfindung betrifft ein immunologisches Reagens, das dazu imstande ist, das Ausmaß einer Imrnunofällungsreaktion zu verstärken. Die Erfindung betrifft insbesondere eine immunologische Reagenslösung, die bei einer weiten Vielzahl von immunologischen Untersuchungsmethoden verwendet v/erden kann.

Die Erfindung betrifft auch immunologische Untersuchungsmethoden, und zwar insbesondere solche, bei denen eine Umsetzung eines Antikörpers mit einem Antigen unter Bildung eines Antikörper/Antigen-Komplexes stattfindet, dessen Unlöslichkeitsmachung durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenses bei der Untersuchungsmethode erheblich erhöht wird.

Es gibt zahlreiche inununologische Untersuchungsmethoden mit weit variierender Methodologie, bei ;denen in der '

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Postscheckkonto München 2726-804 - Kreissparkasie Starnberg 66940 - Deutsche Bank Slarnborg 59 17570

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einen oder der anderen Stufe der Untersuchung zu verschiedenen Zwecken die Unlöslichkeitsmachung eines so großen Teils des Antigen/Antikörper-Komplexes wie möglich erforderlich ist. So spielt z.B. die Unlöslichkeitsmachung des Komplexes bei solchen v/ichtigen immunologischen Ui^- tersuchungsmethoden, wie der elektrophoretischen Analyse, der enzymatischen Analyse, der Radioimmunoanalyse (RIA) und der nephelometrischen Analyse, eine wichtige Rolle. Es sind schon viele Anstrengungen gemacht worden, um die Urilöslichkeitsmachung des Komplexes zu erhöhen, um diese Analysenmethoden zu verbessern. Normalerweise %9& £infc Unlöslichkeitsmachung des Komplexes deswegen erfordere lieh, damit das immunologische Reaktiönsprodukt von den nicht-umgesetztea immunplogischen-Reagentien bei der jeweiligen Untersuchung isoliert wird, so daß entweder das isolierte Reaktionsprodukt oder die nicht-umgesetzten Reagentien gesondert analysiert werden können, um eine aussagekräftige diagnostische Untersuchung zu ergeben.

Bei immunologischen Untersuchungsmethoden, die z.B. eine nephelometrische Analyse umfassen, ist es bereits bekannt, Testproben mit einer Lösung eines Polyäthylenglykolpolymeren zu verdünnen, bevor die Probe irikubiert wird und eine Ablesung auf dem nephelometrischen Instrument durchgeführt wird. Obgleich das Polyäthylenglykol die nephelometrische Analyse durch Erhöhung der Konzentration &fr» suspendierten Teilchens verbessert,, bleibt trotzdem iiij^ mer noch^dss^Pirofcl^'* zurück ^ ^Tdaß eins zöfl'ied.eiisteiXiaidii'·*'''^{11 v} *\~*. Analyse von. vielen biologischen Bft^tanjeltmil^if *^3^ffOm$^..' - - Ψ - ■ eines unzureichenden Testbereiches oder einer unzureichenden Empfindlichkeit, die auf eine ungenügende Kon*?.'"

BAD ORIGINAL

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zentration der suspendierten Teilchen in der Testprobe zurückzuführen ist, nicht durchgeführt werden kann. Aufgabe der Erfindung ist es nun, dieses Problem zu lösen, indem ein verbessertes immunologisches Reagens zur Verfügung gestellt wird, das dazu imstande ist, die Unlöslichkeit smachung eines Antikörper/Antigen-Komplexes über diejenige hinaus weit zu verbessern, die durch Polyäthylenglykol allein erhältlich ist. Auf diese Weise soll die Konzentration der suspendierten Teilchen in der Testprobe erhöht werden, wodurch eine Analyse von biologischen Bestandteilen gestattet werden soll, die bei Verwendung von nephelometrischen oder von anderen Untersuchungsmethoden bislang mit Polyäthylenglykol allein nicht möglich ist.

Durch die Erfindung wird nun ein immunologisches Reagens einer Lösung von mindestens einem Polyäthylenglykol zur Verfügung gestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine wäßrige Lösung eines Gemisches aus dem Polyäthylenglykol und einem nicht-ionogenen Netzmittel umfaßt, wobei die wäßrige Lösung beim Gebrauch etwa 3 bis 6 Gew.-% des Gemisches enthält und innerhalb eines solchen Bereiches einen errechneten HLB-Wert (Hydrophilic-lipophilic-Balance) im Bereich von etwa 0,7 bis 1,7 hat. Signifikanterweise kann die wäßrige Lösung, wenn sie nicht "im Gebrauch" ist, beispielsweise für eine immunologische Untersuchungsmethode eine Mischkonzentration von weniger als 3% und mehr als 6% haben. Trotzdem ist sie für die Zwecke der Erfindung geeignet, wenn die Konzentration des Gemisches vor oder während "des Gebrauchs" so eingestellt wird, daß die Konzentration im Bereich von zwischen etwa 3 und 6% liegt. Die hierin verwendete Bezeich-

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nung "beim Gebrauch" soll daher ein Reagens bezeichnen, dessen Mischkonzentration nicht unbedingt im Bereich von etwa 3 bis 6% liegen muß, sofern der Konzentrationsbereich - wenn er außerhalb des angegebenen Bereichs von 3 bis 6% liegt - während oder vor dem Analysenvorgang in diese Grenzen eingestellt wird.

Durch die Erfindung wird auch ein immunologisches Untersuchungsverfahren zur Verfügung gestellt, bei dem eine Umsetzung zwischen einem Antikörper und einem Antigen unter Bildung eines Antikörper/Antigen-Komplexes stattfindet, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man dabei das erfindungsgemäße Reagens verwendet, um das Ausmaß der Unlöslichkeitsmachung des durch die Reaktion gebildeten Antigen/Antikörper-Komplexes erheblich zu erhöhen.

Vorteilhafterweise kann das Reagens in das Testmedium für die Durchführung einer nephelometrischen, enzymatischen, elektrophoretischen oder radioimmunologischen Untersuchung eingeführt werden.

Wenn z.B. eine nephelometrische Untersuchungsmethode zur Analyse von biologischen Bestandteilen in Form von Antikörper/Antigen-Komplexen durchgeführt wird, dann werden zuerst das Reagens und die suspendierten Teilchen der biologischen Bestandteile inkubiert, wonach dann die nephelometrische Analyse durchgeführt wird. Bei dieser Methode wird eine Lichtquelle durch eine flüssige Testprobe geleitet, wodurch die Lichtstrahlen durch die suspendierten Teilchen gerichtet werden. ¥enn die Lichtstrahlen auf die Teilchen auftreffen, dann.werden

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sie mit einem vorgewählten beliebigen Winkel, z.B. einem rechten Winkel, von der Quelle gestreut oder diffundiert und sie werden durch Photozellen aufgenommen. Dieses gestreute Licht wird in ein elektrisches Signal umgewandelt, das direkt proportional zu der Konzentration der teilchenförmigen Stoffe ist, welche auf diese V/eise genau auf der Ablesungsseite eines Instruments gemessen werden kann.

Beispiele für Instrumente, die für nephelometrische Analysen geeignet sind, sind das Hyland-Laser-Nephelometer PDQ (Hyland Laboratories), das Aminco-Fluorkolorimeter (American Instrument Company), das Aminco-Bowman-Spektrophotofluormeter (SPF) und der Autoanalyzer II mit angefügtem Fluornephelometer (Technicon Instruments Corporation) .

Auf diese nephelometrische Weise und durch Verwendung entsprechender Einrichtungen kann der klinische Techniker genaue Bestimmungen kleiner Konzentrationen einer weiten Vielzahl von spezifischen Proteinen durchführen, z.B. der Immunoglobuline IgG, IgA, IgM, von Transferrin, von Komplement C3, von Haptoglobin, von α.-Antitrypsin, von ß-Lipoprotein, von Albumin, von c^-Makroglobulin, von a^-Säureglykoprotein und von verschiedenen anderen biologischen Bestandteilen, wie Triglyzeriden, Lipoproteinen und menschlichen Chorion-Gonadotropinen.

Die wichtigsten Vorteile, die sich aus der Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenses ergeben, sind, (a) daß die Inkubierungszeiten signifikant.verringert werden und

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(b) daß eine größere Konzentration der unlöslich gemachten Komplexteilchen bei einer kürzeren Inkubierungszeit erhalten wird, wodurch ein verbesserter Testbereich und eine verbesserte Empfindlichkeit resultieren. Diese Vorteile gelten für alle beliebigen immunologischen Untersuchungsmethoden, bei denen eine verstärkte Unlöslichkeitsmachung des Antigen/Antikörper-Koiaplexes zu einem Zeitpunkt während der Untersuchung erfolgt. Diese Vorteile gelten auch für immunologische Untersuchungsmethoden, bei denen die Unlöslichkeitsmachungsstufe des Antigen/Antikörper-Komplexes zu irgendeinem Zeitpunkt während des Analysenvorgangs erfolgt.

Wie bereits ausgeführt, sollte die wäßrige Reagenslösung zusätzlich dazu, daß sie beim Gebrauch etwa 3 bis 6 Gew.-?S Polyäthylenglykol und nicht-ionogenes Netzmittel, im Gemisch enthält, auch einen errechneten HLB-Wert von etwa 0,7 bis 1,7 haben.

Der HLB-Wert ist ein eingeführtes Maß für das hydrophilelipophile Gleichgewicht (nachstehend als HLB abgekürzt), eines gegebenen oberflächenaktiven Mittels. Das HLB-System zur Identifizierung von oberflächenaktiven Kitteln wurde von Atlas Chemical Industries, Inc. entwiekelt und ist genauer auf den Seiten 28 bis 36 der Atlas-Firaenschrift "Guide to the Use of Atlas Surfactants and Sorbitol in Cosmetic and Pharmaceutical Products" (1965) beschrieben. Auf diese Veröffentlichung wird hierin ausdrücklich Bezug genommen. Jedes Netzmittel- wird durch eine HLB-Zahl gekennzeichnet. Je niedriger die HLB-Zahl ist, desto lipophiler (oder ölliebender) ist das Netz-

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mittel, während je hoher diese Zahl ist, desto hydrophiler (oder wasserliebender) das Netzmittel ist. Die Bestimmungsmethode für den HLB-Wert eines gegebenen Netzmittels ist bekannt und wird z.B. in einer Firmenschrift von Atlas mit dem Titel "The Atlas HLB System" (Code LD-97) beschrieben. Die HLB-Werte von zahlreichen oberflächenaktiven Mitteln sind auch in der Literatur beschrieben, und insbesondere in der Literatur, die vom Hersteller über das betreffende Netzmittel veröffentlicht wird.

Der HLB-Wert eines Gemisches von oberflächenaktiven Stoffen, wie es in dem erfindungsgemäßen Reagens vorliegt, ist eine Funktion der Konzentration von jedem oberflächenaktiven Stoff in dem Gemisch. Daher muß die Konzentration der einzelnen oberflächenaktiven Mittel bei der Errechnung des HLB-Werts des Gemisches in Betracht gezogen werden. Der HLB-Wert de.s Gemisches wird entsprechend den veröffentlichten Methoden in der Weise errechnet, daß man den HLB-Wert jedes in dem Gemisch vorhandenen oberflächenaktiven Mittels mit der jeweiligen Konzentration in der Mischung multipliziert und indem man die einzeln errechneten Ergebnisse zusammenzählt. Wenn z.B. das erfindungsgemäße Reagens 1 Gew.-?6 Polyäthylenglykol (HLB =20) und 3 Ge\>?.-% eines nicht-ionogenen Netzmittels mit einem HLB-Wert von 30,5 enthält, dann errechnet sich der HLB-Wert des Reagenses wie folgt:

0,01 χ 20 = 0,2

0,03 x 30,5 = + 0,915

1,115 = HLB-Wert des Reagenses.

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Um zu bestimmen, ob ein gegebenes Reagens einen HLB-Wert hat, der in den Bereich von 0,7 bis 1,7 gemäß der Erfindung fällt, kann eine Errechnung auf die obige ¥eise ohne weiteres durchgeführt werden, die auf der Menge jeder Komponente in dem Gemisch aufgebaut ist. Hierzu können entweder die für die jeweiligen Komponenten publizierten HLB-Werte oder die . HLB-Werte, bestimmt nach der AtIas-Methode, verwendet werden.

Die Erfindung zieht die Verwendung einer weiten Vielzahl von nicht-ionogenen oberflächenaktiven Mitteln in Verbindung mit dem Polyäthylenglykol in Betracht, vorausgesetzt, daß (1) die Menge des Gemisches aus dem nicht-ionogenen oberflächenaktiven Mittel und dem Polyäthylenglykol zum Zeitpunkt, zu dem das Reagens bei der Untersuchung verwendet wird, in den Bereich von 3 bis 6 Gew.-/6 fällt und (2) der errechnete HLB-¥ert des Reagenses zum gleichen Zeitpunkt in den Bereich von 0,7 bis 1,7 fällt. Wenn zum Zeitpunkt des Gebrauchs der Anteil des Gemisches aus dem Polyäthylenglykol und dem nicht-ionogenen oberflächenaktiven Mittel weniger als 3%, bezogen auf das Reagens, beträgt, oder wenn das Reagens einen HLB-Wert von weniger als etwa 0,7 hat, dann wird es schwierig, die gewünschte Menge des Antigen/Antikörper-Komplexes bis zu einem Ausmaß unlöslich zu machen, das für eine erfolgreiche Vervollständigung der immunologischen Untersuchung erforderlich ist. Wenn andererseits der Anteil des Gemisches mehr als 6%, bezogen auf die Menge des Reagenses, beträgt oder wenn das Reagens einen HLB-Wert von mehr als etwa 1,7^ hat, dann werden neben den gewünschten Antigen/Antikörper-Komplexen auch andere Proteine unlöslich gemacht, wodurch die Selektivität der

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Analyse zerstört wird und die Ergebnisse bedeutungslos gemacht werden.

Naturgemäß kann die Reagenslösung aus einer Vielzahl von Gründen in solcher Weise hergestellt und geliefert werden, daß sie nicht den erforderlichen Gehalt von 3 bis 6% des Gemisches aus Polyäthylenglykol und nicht-ionogenem oberflächenaktiven Mittel enthält oder den erforderlichen HLB-Wert von 0,7 bis 1,7 hat. Ein solcher Grund könnte z.B. eine schlechte LagerungsStabilität sein. Jedoch erfordern dann, wie oben ausgeführt, solche Lösungen eine Einstellung vor oder zu einem beliebigen Punkt während der Verwendung bei der immunologischen Untersuchungsmethode in den Bereich von 3 bis 6% und auf einen HLB-Wert von etwa 0,7 bis 1,7. Aus diesem Grunde liegen auch Reagentien im Rahmen der. Erfindung, die nicht den erforderlichen Anteil des Gemisches von 3 bis 6% enthalten oder die einen HLB-Wert von etwa 0,7 bis 1,7 nicht aufv/eisen, die aber ohne weiteres vor oder während des immunologischen Testverfahrens auf diese Werte eingestellt werden können, selbst wenn sie am Anfang außerhalb der spezifischen Parameter der Konzentration und des HLB-Bereiches, die während des Analysenverfahrens selbst erforderlich sind, liegen.

So kann es z.B. erforderlich sein, wenn die spezifischen Parameter der Konzentration und der HLB-Werte außerhalb die Bereiche von etwa 3 bis 6% bzw. etwa 0,7 bis 1,7 fallen, eine Verdünnungs-, Konzentrations- oder eine andere Einstellungsstufe vor oder zu einem geeigneten Zeitpunkt während der immunologischen Analyse vorzunehmen, um die Lösung auf einen Gehalt des Gemisches von 3 bis 6% und

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einen errechneten HLB-Wert von 0,7 bis 1,7 zu bringen. In solchen Fällen fällt auch die vertriebene Lösung immer noch unter den Rahmen der vorliegenden Erfindung. Somit konnte das Reagens mit einer Mischkonzentration von mehr als 6%, z.B. 8%, vertrieben werden und es könnte entweder vor oder zu einem geeigneten Zeitpunkt wäh rend der immunologischen Analyse auf den Bereich von 3 bis 6% verdünnt v/erden. Gleichermaßen könnte das Reagens mit einem errechneten HLB-Wert außerhalb des Bereichs von 0,7 bis 1,7 vertrieben v/erden, jedoch mit dem Erfordernis, daß die Reagenslösung vor oder zu einem geeigneten Zeitpunkt während der immunologischen Untersuehungsmethode so geändert wird, daß der errechnete HLB-Wert von 0,7 bis 1,7 erhalten wird.

Das Reagens könnte in bestimmten Fällen auf die richtigen Werte mit dem Antiserum, das beim Test verwendet wird, verdünnt v/erden, während es in anderen Fällen mit der Testprobe oder in manchen Fällen sowohl mit der Testprobe als auch mit dem Antiserum verdünnt v/erden könnte. Der wichtige Punkt liegt darin, daß zu einem Zeitpunkt während der immunologischen Analyse, entweder vor oder zum Zeitpunkt der Antigen/Antikörper-Reaktion, der erforderliche Gehalt von 3 bis 6% des kombinierten Polyäthylenglykols und des nicht-ionogenen oberflächenaktiven Mittels und der erforderliche HLB-Wert von 0,7 bis 1,7 zur Verfügung gestellt werden, damit das erfindungsgemäße Reagens bei der Analyse richtig arbeitet/ Der Zeitpunkt im Analysenverfahren, bei dem diese erforderlichen Parameter zur Verfügung gestellt sein müssen, kann je nach der bestimmten angewendeten Verfahrensweise variieren.

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Bei einer nephelometrisehen Analyse ist es z.B. zweckmäßig, das erfindungsgemäße Reagens mit einer Konzentration an Polyäthylenglykol und nicht-ionogenem oberflächenaktiven Mittel von mehr als 6% und mit einem HLB-Wert außerhalb des Bereichs von 0,7 bis 1»7 herzustellen und zu vertreiben. Sodann .wird vor der Verwendung bei der nephelometrischen Analyse das Reagens mit dem Antiserum verdünnt, das bei der Analyse verwendet wird, um eine Konzentration an Polyäthylenglykol und nicht-ionogenem Netzmittel von zwischen 3 und 6%, vorzugsweise etwa 4%, und einen errechneten HLB-Wert im Bereich von 0,7 bis 1,7 zu erhalten.

Die relativen Verhältnismengen von Polyäthylenglykol und nicht-ionogenem oberflächenaktiven Mittel in dem Gemisch können innerhalb weiter Grenzen variiert werden, die stark von dem verwendeten oberflächenaktiven Mittel abhängen. So kann z.B. das Gemisch etwa 10 bis 90 Gew.-% Polyäthylenglykol und 10 bis 90% nicht-ionogenes oberflächenaktives Mittel enthalten. Vorzugsweise enthält das Gemisch etwa 15 bis 85% Polyäthylenglykol und 15 bis 85% nicht-ionogenes oberflächenaktives Mittel.

Als Polyäthylenglykolkomponente des Gemisches können eine oder mehrere unterschiedliche Formen oder Typen von Polyäthylenglykol verwendet.werden. Das Polyäthylenglykolpolymere, das verwendet wird, hat im allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 200 bis etwa 10 000, vorzugsweise von etwa 4000 bis etwa 6000. Diese Materialien sind im Handel erhältlich, z.B. von Union Carbide als Carbowax 4000 oder 6000 und von Dow Chemical Company als PEG 4000 oder 6000. Ein Molekulargewicht von etwa

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4000 wird besonders bevorzugt.

Die nicht-ionogene Netzmittelkomponente des Gemisches kann ein beliebiges nicht-ionogenes oberflächenaktives Mittel sein, das in der Reagenslösung einen errechneten HLB-Wert von 0,7 bis 1,7, vorzugsweise von'etwa 0,7 bis •1,3, bei einer Mischkonzentration von 3 bis 6% liefert. Die HLB-Werte des nicht-ionogenen oberflächenaktiven Mittels selbst können im Bereich von etwa 10 bis 30 oder mehr liegen.

Ein besonders bevorzugtes nicht-ionogenes oberflächenaktives Mittel ist ein Blockcopolymeres aus Äthylenoxid und Polyoxypropylen. Dieses Polymere und seine Herstellung wird in der US-PS 2 674 619 beschrieben. Diese Blockcopolymeren werden im allgemeinen durch Kondensation von Äthylenoxid mit Polyoxypropylenpolynieren hergestellt und sie können durch die folgende Strukturformel dargestellt werden:

HO (CH₂CH₂O )_a (CH₃CHCH₂O)₁₃ (CH₂CH₂O)₀ H.

Für die Zwecke dieser Erfindung enthalten diese Blockcopolymeren zweckmäßigerweise mindestens 50% Äthylenoxid im Molekül und sie haben ein hydrophobes Polyoxypropylen-Basismolekulargewicht von mindestens 950, wie es ähnlicherweise in den US-PS 3 450 502, 3577 522 und 3 590 125 beschrieben wird.

Beispiele für solche geeigneten Blockcopolymeren sind die Produkte F-38 und F-68 Pluronicpolyole von Wyandotte

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Chemicals Corporation. Das Produkt F-38 enthält 80% hydrophile Polyoxyäthyleneinheiten im Molekül und die hydrophobe Polyoxypropylenbasis hat ein Molekulargewicht von 950. F-38 stellt ein "besonders bevorzugtes nicht-ionogenes Netzmittel dar. Das Produkt F-68 enthält 80% hydrophile Polyoxyäthyleneinheiten in dem Molekül, doch besitzt die hydrophobe Basis ein MolekulargeicLcht von 1750. Das Gesamtmolekulargewicht dieser zwei Pluronicpolyole beträgt 4750 bzw. 8750. Auch das Produkt Pluronic L-125 hat sich als geeignet erwiesen. Eine weitere Beschreibung dieser Polyole findet sich in der Firmenschrift von vJyandotte Chemicals Corporation "The Pluronic Grid", 6. Auflage. Auf diese Veröffentlichung wird hierin ausdrücklich Bezug genommen.

Im Falle der nicht-ionogenen Pluronic-Netzmittel wird im allgemeinen ein Gemisch aus etwa 20 bis 40 Gew.-% PoIyäthylenglykol und etwa 80 bis 6O?o Blockcopolymeres von .Äthylenoxid mit Polyoxypropylenpolymerem bevorzugt.

Eine hoch bevorzugte Reagenslösung enthält etwa 1 Gewichtsteil Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von etwa 4000 und etwa 3 Gewichtsteile Pluronic F-38. Diese Lösung kann in einem Kochsalzlösungsmittel (z.B. O,9?6ige NaCl-Lösung) entweder oberhalb oder unterhalb der gewünschten Konzentration von 3 bis 6% hergestellt und erforderlichenfalls auf den gewünschten Wert von 3 bis 6% eingestellt werden. Vorzugsweise wird die Lösung als 8?oige Lösung άψε Polymergemisches in Kochsalzlösung hergestellt, die sodann mit dem Antiserum (vgl. Beispiele 1 und 5) oder mit einem anderen geeigneten Verdünnungsmittel vor dem Einsatz bei dem immunologischen Untersu-

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chungsverfahren verdünnt v/ird. Das so erhaltene verdünnte Reagens enthält etwa V/a Polyäthylenglykol und ~5% F-38. Der HLB-Wert von 1,115 kann wie folgt errechnet werden:

1% Polyäthylenglykol: 0,01 χ 20* =0,2 3% F-38: 0,03 χ 30,5** = 0,915

1,115

* Der HLB-Wert von Polyäthylenglykol aus der Literatur

beträgt 20
** der HLB-Wert von F-38 aus der Literatur beträgt 30,5.

Eine weite Vielzahl von anderen nicht-ionogenen oberflächenaktiven Mitteln kann ebenfalls dazu verwendet werden, um das Polyäthylenglykol in der erfindungsgemäßen Reagenslösung zu ergänzen, vorausgesetzt, daß diese den gewünschten HLB-Wert von 0,7 bis 1,7 bei einer Mischkonzentration von 3 bis 6% ergeben. Beispiele hierfür sind die nicht-ionogenen Netzmittel der Tetronicreihe von BASF Wyandotte Corporation, die in der BASF-Wyandotte-Firmenschrift "Technical Data on Tetronic Series Nonionic Surfactants" sowie in der US-PS 2 979 528 beschrieben werden. Auf diese Veröffentlichungen v/ird hierin ausdrücklich Bezug genommen. Diese Produkte haben sich als geeignet erwiesen, und zwar insbesondere die Produkte Tetronic 707, 908, 1107, 1307 und 1508. Die Tetronic-Produkte sind auf der Basis von Äthylendiamin aufgebaut und sie besitzen die allgemeine Formel:

N-CH₂-CH₂-N

H (C₂H₄O) ₇ (C₃H₆O) y \ (C₃H₆O) ,(C^O) _yH

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Der Molekulargewichtsbereich der Tetroniclinie kann von etwa 1650 bis über 26 000 variieren. Die mehr bevorzugten Tetronic-Netzmittel haben Molekulargewichte im Bereich von etwa 15 000 bis 27 000 und HLB-Werte von etwa 20 bis 30,5. Das Verhältnis von Polyäthylenglykol zu Tetronic-Netzmittel kann in dem Gemisch wie oben erwähnt weit variiert werden.

Eine v/eitere Familie von geeigneten nicht-ionogenen oberflächenaktiven Mitteln ist die Plurafaclinie von Produkten von BASF Wyandotte, und zwar insbesondere die Produkte Plurafac 17RB, 25R8, D25, A38 und A39. Die Plurafacprodukte sind geradkettige, primäre aliphatische, oxyalkylierte Alkohole, die näher in der BASF-Wyandotte-Firmenschrift mit dem Titel "Technical Data on Typical Physicyl Properties of Plurafac Nonionic Surfactants" beschrieben werden. Die bevorzugten Plurafacprodukte haben HLB-V7erte von etwa 10 bis 20 und sie können in weit variierenden Verhältnissen zu dem Polyäthylenglykol verwendet v/erden.

Ändere geeignete nicht-ionogene Netzmittel sind z.B. Glyzerinmonostearat und die Familie der Alkylarylsulfonate. Ein bevorzugte Glyzerinmonostearat ist von Atlas Industries, Inc. unter dem Viarenzeichen Arlacel I65 (HLB = 11,0) erhältlich. Ein typisches geeignetes Alkylarylsulfonat ist von derselben Firma unter dem Warenzeichen G-33OO (HLB = 11,7) erhältlich.

Die obige Aufzählung von nicht-ionogenen Netzmitteln ist nur beispielhafter Natur, da auch andere Netzmittel unter den Rahmen der Erfindung fallen sollen, vorausge-

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setzt, daß sie ein Reagens liefern, das bei der Verwendung bei einer immunologischen Analysenmethode etwa 3 bis 6% eines Gemisches aus Polyäthylenglykol und dem Netzmittel enthält, das einen auf den Werten der einzelnen Komponenten in der Lösung aufgebauten HLB-Wert von etwa 0,7 bis 1,7 hat und das den Effekt der Steigerung der Unlöslichkeitsmachung des gewünschten Antigen/Antikörper-Komplexes bis zu dem gewünschten Ausmaß ergibt, daß die Analyse verbessert wird, ohne daß unerwünschte Komponenten unlöslich gemacht werden oder ohne daß auf andere V.^Teise nachteilig das Analysenverfahren gestört wird.

Naturgemäß können mehr als ein nicht-ionogenes Netzmittel zusammen mit dem Polyäthylenglykol vorhanden sein, vorausgesetzt, daß die erforderliche Konzentration der Mischung und der HLB-Wert der Lösung erhalten werden.

Bei der Auswahl eines nicht-ionogenen Netzmittels zur Verwendung für die Erfindung sollte ein solches verwendet werden, das die Fähigkeit besitzt, zumindest zu dem Zeitpunkt, v/o die Reagenslösung das erste Mal beim immunologischen Testverfahren verwendet wird, eine klare Reagenslösung zu ergeben. Dies soll gewährleisten, daß das Reagens die Testergebnisse nicht stört oder keine nichtspezifische Ausfällung der Komponenten der biologischen Probe oder der biologischen Reagentien bewirkt, die in dem Untersuchungssystem verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Reagenssystem findet als Verbesserung bei einer Vielzahl von herkömmlichen immunologi-

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sehen Untersuchungsmethoden Anwendung, bei denen zu einem Zeitpunkt oder zu einem anderen Zeitpunkt aus irgendwelchen Gründen die Stufe einer Unlöslichkeitsmachung des Antigen/Antikörper-Komplexes erforderlich ist, der während des Analysenvorgangs durch die Antigen/Antikörper-Reaktion gebildet wird. Solche Analysenmethoden -sind dem Fachmann gut bekannt, und sie brauchen hierin nicht im Detail beschrieben zu werden. Die Anwendbarkeit und die Eignung der Erfindung für diese verschiedenen Untersuchungsmethoden und die Details hinsichtlich der Verwen dung des erfindungsgemäßen Reagenses bei solchen Untersuchungsmethoden liegen für den Fachmann auf der Hand. So kann z.B. das erfindungsgemäße Reagens dazu verwendet v/erden, um ein System zu verstärken, das sich auf der Ausfällung des Antigen/Antikörper-Komplexes aufbaut, wobei eine klare überstehende Flüssigkeit für die Fluoreszenz- oder kolorimetrische Bestimmung gebildet wird. Das Reagens kann auch dazu verwendet werden, störende Substanzen, die in biologischen Flüssigkeiten oder Reagentien gefunden v/erden (z.B. Lipide, Salze und von außen kommende Proteine), für nephelometrische, enzymatische oder andere Untersuchungssysteme zu entfernen. Dies geschieht durch Entfernung der Reaktionsteilnehmer aus der Reaktionslösung zum Zwecke des Haschens und des ¥iedersuspendierens dieser Reaktionsteilnehmer.

Spezifischerweise kann das erfindungsgemäße Reagens dazu verwendet werden, um die relative Konzentration von unlöslichen Antigen/Antikörper-Komplexen zu erhöhen und den Testbereich und die Empfindlichkeit eines gegebenen Analysensystems zu erhöhen. Diese Prinzipien können auf

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die quantitative Lichtstreuung von Immunkomplexen durch Nephelometrie angewendet werden, was derzeit eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung darstellt. Nephelometrische Analysen, bei denen das erfindungsgemäße Reagens verwendet wird, sind für die Analyse von verschiedenen Immunoglobulinen besonders gut geeignet. Es können jedoch auch in anderen Testsystemen, die auf der Ausfällung von Antikörpern aufgebaut sind, diese Reagentien verwendet werden, z.B. bei der Radioimmunodiffusionsanalyse (RID), der enzymatischen Analyse und bei verschiedenen Typen von elektrophoretisehen Techniken, z.B. der Immunoelektrophorese (IEP), der Gegenelektrophorese (CEP) und der Elektroimmunodiffusion (EID).

Das erfindungsgemäße Reagens kann z.B. dazu verwendet werden, um immunologische Untersuchungen zu verstärken, die sich auf der primären Wechselwirkung einer Antigen/ Antikörper-Coausfällungstechnik aufbauen, die üblicherweise bei der Radioimmunoanalyse (RIA) angewendet wird. Diese gesteigerte Unlöslichkeitsmachungseigenschaft der vorliegenden Erfindung kann auch für verschiedene Methodologien für die Anheftung von Antikörpern oder Antige- nen an inerte Teilchen angewendet werden, die als Träger bei RIA-, nephelometrisehen und fluorometrischen Analysen in bekannter Weise verwendet werden.

Es sind viele radioimmunologischen Untersuchungstechniken bekannt, um relativ geringe Konzentrationen von biologischen Bestandteilen, die in Körperflüssigkeiten gefunden werden, quantitativ zu erfassen. Mit Isotopen markierte Antigene oder Antikörper werden mit dem homologen

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Antigen oder Antiserum umgesetzt, wodurch markierte immune Antigen/Antikörper-Komplexe gebildet werden. Diese Komplexe müssen sodann normalerweise durch einen unlöslichen Träger, ein Ausfällungsmittel oder eine andere bekannte Technik unlöslich gemacht v/erden. Das freie oder nicht-umgesetzte markierte Antigen oder der Antikörper können durch Waschen.entfernt werden. Die radioaktive Konzentration der ausgefällten Komplexe wird sodann durch Gamma- oder Flüssigkeitsszintillierungszählen ermittelt. Ein Beispiel für ein Instrument, das bei Analysen dieser Art verwendet wird, ist der Auto-Gamma-Counter (erhältlich von Nuclear Chicago, Inc.)· Das erfindungsgemäße Reagens ist dabei besonders gut dazu geeignet, um die erforderliche Komplexunlöslichkeitsmachungsstufe zu verstärken, wodurch die Analyse verbessert wird. Beispiel 6 beschreibt die Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenses bei einer radioimmunologischen Untersuchungsmethode .

Es sind auch schon enzymatische Techniken dazu verwendet v/orden, um kleine Konzentrationen von biologischen Bestandteilen in Körperflüssigkeiten quantitativ zu erfassen. Hierbei v/erden mit Enzymen markierte Antigene oder Antikörper mit dem spezifischen Antigen oder Antikörper umgesetzt, wodurch immune markierte Antigen/Antikörper-Komplexe gebildet werden. Diese Komplexe werden durch einen unlöslichen Träger, ein Ausfällungsmittel oder eine andere Technik unlöslich gemacht. Der freie oder nicht-umgesetzte enzymmarkierte Antikörper oder das entsprechende Antigen können durch Waschen entfernt werden. Das gebundene oder umgesetzte Enzym kann sodann eine Reak-

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tion mit einem entsprechenden Substrat eingehen, wodurch eine gefärbte oder fluoreszierende überstehende Lösung erhalten wird, die mit einem Spektrophotometer oder Fluorometer gemessen werden kann. Beispiele für Instrumente, die für diesen Zweck geeignet sind, sind das Beckman-DB-Spektrophotometer (erhältlich von Beckman Instruments, Inc.) und das Aminco-Bowman-Spektrophotofluorometer (erhältlich von American Instrument Company). Das erfindungsgemäße Reagens ist auch dazu geeignet, um die erforderliche Stufe der Unlöslichkeitsmachung des Komplexes zu verstärken, wodurch die Analyse verbessert wird.

Die Eignung des erfindungsgemäßen Reagenses für eine nephelometrische Analyse wurde oben genauer beschrieben. Eine weitere Beschreibung findet sich im Beispiel 5.

Für den Fachmann wird ersichtlich, daß das verbesserte immunologische Reagens gemäß der Erfindung für immunologische Untersuchungsmethoden eine breite Anwendbarkeit hat. Unter Verwendung des verbesserten Reagenses kann der klinische Techniker eine genaue Bestimmung eines breiten Bereiches von Konzentrationen von vielen spezifischen Proteinen durchführen, z.B. von den Immunoglobulinen IgG, IgA, IgM, von Transferrin, von Komplement C3, von Haptoglobin, von α.-Antitrypsin, von ß-Lipoprotein, von Albumin, von cCp-Makroglobulin, von a^ -Säureglykoprotein und von verschiedenen anderen biologischen Bestandteilen, wie Trijodthyonin (T-,), Thyroxin (T^), Triglyzeriden, menschlichen Choriongonadotropinen, Lipoproteinen und vielen anderen Substanzen, deren Bestimmung durch einen gesteigerten Unlöslichkeitsmachungseffekt gemäß der Erfindung verbessert wird.

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Bei den meisten Anwendungsgebieten, auf denen die Erfindung verwendet werden kann, wird der oder die gewünschten biologische(n) Testbestandteil(e) mit der wäßrigen Reagenslösung gemäß der Erfindung vermischt und es wird über eine vorgewählte Zeitspanne, z.B. bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) ungefähr 1 h, inkubiert und sodann auf einer geeigneten Instrumentierung, z.B. einem Nephelometer im Falle einer nephelometrisehen Analyse, abgelesen. Die Ergebnisse dieser Testproben v/erden mit Referenzproben verglichen, um die unbekannte Konzentration zu ermitteln.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Beispiel j[

Eine Reagenslösung wird hergestellt, indem 25 Gewichtsteile Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 4000 mit 75 Gewichtsteilen Pluronic F-38 vermischt werden. Das Gemisch wird in normaler Kochsalzlösung (0,9% NaCl) zu einer Konzentration von 8 Gew.-%, bezogen auf das Gemisch, aufgelöst. Diese Lösung kann entweder, z.B. mit einem Antiserum, zu einer Mischkonzentration von k% (HLB-Verhältnis = 1,115) wie in Stufe 5 des Beispiels 5 vor der Inkubierung verdünnt v/erden und sodann direkt bei der immunologischen Analyse verwendet werden oder sie kann in der 8?oigen Form gehalten werden, bis sie zum Gebrauch fertig ist.

Beispiel 2

Das Beispiel 1 wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß

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ein Polyathylenglykol mit einem Molekulargewicht von 6000 anstelle der äquivalenten Menge des Materials mit einem Molekulargewicht von 4000 verwendet wird.

Beispiel 3

Das Beispiel 1 wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß PIuronic F-68 anstelle der äquivalenten Menge von F-38 verwendet wird.

Beispiel 4

Beispiel 1 wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Produkte Tetronic 707, 908, 1107, 1307, 1508, Plurafac 17R8, 25R8, D25, A38 und A39, Pluronic L-125, Arlacel 165 und G-3000 anstelle von F-38 in variierenden Mengen bei einer Versuchsreihe zur Herstellung einer weiten Vielzahl von Reagenslösungen verwendet werden.

Beispiel 5

Die immunologischen Reagenslösungen, hergestellt in den Beispielen 1 bis 4, werden bei gesonderten nephelometrischen Analysen von Immunoglobulinen (IgA, IgG, IgM), von Komplement C3 und von Transferrin verwendet. Dabei wird jede Analyse wie folgt durchgeführt:

1. Referenzkontrollen Nr. 1, 2, 3» 4,· 5, 6 (mit bekannter Zusammensetzung) für jeden biologischen Bestandteil werden 1 : 100 in Kochsalzlösung verdünnt .

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2. Die Bestimmungsproben werden in ähnlicher Weise in Kochsalzlösung 1 : 100 verdünnt.

3. Vorverdünnte Antiseren für IgG, IgM, IgA, C3 und Transferrin v/erden jeweils mit dem 8^igen Gemisch des immunologischen Reagenses von Beispielen 1, 2, 3 und 4 (je nach dem Einzelfall) 1 : 2 verdünnt und durch Umkehren gemischt, wodurch eine h%ige Konzentration des Polyäthylenglykols und des nicht-ionogenen oberflächenaktiven Mittels in der Lösung und ein errechneter HLB-¥ert von 0,7 bis 1,7 in allen Fällen erhalten werden.

4. Das Antiserum wird durch ein 0,45 η -Milliporenfilter filtriert.

5. Eine Reihe von Reagensgläschen (Wegwerf-Kulturröhrchen mit den Abmessungen 10 mm χ 75 mm) sowie geeignet markierte Blind-, Referenzkontrollproben Nr. 1, 2, 3, 4, 5, 6 und Bestimmungsproben werden hergestellt.

6. In jedes Röhrchen werden 1 ml des verdünnten Gemisches des Antiserums und des Reagenses, hergestellt in Stufe 3, gegeben.

7. Zu den entsprechenden Röhrchen werden 25 λΐΐ der Referenzprobe und der Verdünnungen der Bestimmungsproben für IgG, IgA und Transferrin (100 ill für IgM und C3) gegeben.

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8. Das entsprechende Blindröhrchen erhält dementsprechend 25 oder 100 iil Kochsalzlösung.

9. Die Röhrchen werden durch Umkehren vermischt und 1 h bei Raumtemperatur (20 bis 25 C) inkubiert.

10. Blindproben werden hergestellt, indem 1 ml der filtrierten Reagentien der Beispiele 1 bis 4 (je nach dem Einzelfall), hergestellt wie in Stufe 3» verwendet wird, mit der Ausnahme, daß die 8^ige Lösung mit Kochsalzlösung anstelle mit Antiserum verdünnt wird. Die Blindproben werden in identisch markierte Röhrchen wie in den vorherigen Stufen 5 und 6 gegeben.

11. Die gleichen Referenz- und Probevolumina werden zu jedem Röhrchen wie zuvor in Stufe 7 gegeben.

12. Alle Röhrchen werden in einem Laser-Nephelometer PDQ™ (Hyland Laboratories) für d zentuale Lichtstreuung abgelesen.

φίντ
PDQ (Hyland Laboratories) für die relative pro-

13· Die Blindproben werden abgelesen und elektronisch von den Reaktionswerten durch das Instrument abgezogen.

14. Die Referenzergebnisse werden auf lineares graphisches Papier als relative prozentuale Lichtstreuung gegen die Konzentration der Referenzproben aufgetragen .

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15· Die Vierte für die Bestimmungsproben werden bestimmt, indem sie aus der Referenzkurve abgelesen werden.

Die bei dieser Probe verwendeten immunologischen Reagentien gemäß der Erfindung lieferten eine erheblich größere Ausfällung des Antigen/Antikörper-Komplexes, eine größere Linearität über einen weiteren Bereich und eine größere Empfindlichkeit als ein Reagens, das nur Polyäthylenglykol allein enthält.

Beispiel 6

Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung des immunologischen Reagenses gemäß der Erfindung bei der radioimmunologischen Bestimmung von menschlichem thyroidstimulierenden Hormon (HTSH).

Eine Probe des erfindungsgemäßen immunologischen Reagenses wurde hergestellt, indem 8,4 ml einer 5%igen Lösung von Polyäthylenglykol in O,9?oiger Kochsalzlösung mit 20 ml 6%iger nicht-ionogener Netzmittelösung von Pluronic F-38 vermischt wurden. Das Volumen des Gemisches wurde sodann mit O,9?oiger Kochsalzlösung auf 30 ml eingestellt, wodurch eine Endreagenskonzentration von 1,4$ Polyäthylenglykol und 4,2% F-3S erhalten wurde.

Die radioimmunologische Untersuchung wurde wie folgt vorgenommen:

0,050 ml Kaninchenanti-HTSH, absorbiert mit menschlichem Choriongonadotropin (HCG), wurden mit 0,200 ml HTSH-

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Standards variierender Stärke vermischt. 0,50 ml eines Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,4 wurden sodann zu dem Gemisch gegeben und das Gemisch wurde 2 h bei 37°C inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden 1,00 ml HTSH, markiert

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mit J , zugesetzt und das Gemisch wurde weitere 3 h bei 37 C inkubiert. 0,1 ml des wie oben hergestellten Reagenses gemäß der Erfindung wurden sodann zugegeben und das Gemisch wurde 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Aufgrund der Verdünnung des Reagenses nach Zugabe zu dem Gemisch wurde die Konzentration von Polyäthylenglykol und F-38 von 1,4 bzw. 4,2% auf 1 bzw. 3 Gew.-% vermindert. Das Gemisch wurde hierauf 10 min bei 1000 χ 9 zentrifugiert. Wenn ein Waschen der zentrifugierten Feststoffe erforderlich ist, muß die Waschlösung die gleiche Konzentration enthalten wie das erfindungsgemäße Reagens zu dem Zeitpunkt, wo das Reagens zuerst in der Analyse verwendet wird, d.h. Λ% Polyäthylenglykol und 3% F-38. Die überstehende Flüssigkeit wurde sodann dekantiert und der Niederschlag wurde gezählt. Dieses Vorgehen wurde für eine Vielzahl von unterschiedlichen HTSH-Standards wiederholt und eine Standardkurve wurde hergestellt, indem die Zählungen der verschiedenen Niederschläge gegen die Konzentration des entsprechenden HTSH-Standards aufgetragen wurden.

Als die Standardkurve einmal aufgestellt worden war, wurde sodann die Untersuchung mit den Bestimmungsproben nach der oben beschriebenen Arbeitsweise vorgenommen, mit der Ausnahme, daß der HTSH-Standard durch die Testprobe ersetzt wurde- Der HTSH-Wert bei der Testprobe konnte sodann ohne weiteres vom Ort der Ausfällungszählung auf der Standardkurve ermittelt werden.

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Die Verwendung der erfindungsgemäßen Reagenslösung steigerte das Ausmaß des Niederschlags, der gebildet wurde, im Vergleich zu der Verwendung eines Reagenses, bei
dem nur Polyäthylenglykol allein verwendet worden" war.
Hierdurch wurde eine verbesserte radioimmunologische
Untersuchung erhalten.

Geeignete nephelometrische Untersuchungsergebnisse können auch ohne das Vorhandensein des Polyäthylenglykols, z.B. mit einer wäßrigen Lösung, die etwa 4 Ge\r.-% des
Blockcopolymeren aus Äthylenoxid und Polyoxypropylenpolymerem enthält, erhalten werden. Jedoch wird das oben beschriebene Gemisch aus Blockcopolymerem und Polyäthylenglykol zur Erzielung optimaler Ergebnisse bevorzugt.

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Claims

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Patentansprüche

ι 1 λ Immunologisches Reagens, welches in Lösung mindestens ein Polyäthylenglykol enthält, dadurch gekennzeichnet , daß das Reagens eine wäßrige Lösung eines Gemisches des Polyäthylenglykols mit einem nicht-ionogenen oberflächenaktiven Mittel darstellt, wobei die wäßrige Lösung beim Gebrauch etwa 3 bis 6 Gew.-/6 des Gemisches enthält und innerhalb dieses Bereichs einen errechneten HLB- (Hydrophil-lipophil-Gleichgewichts-) ¥ert im Bereich von etwa 0,7 bis 1,7 aufweist.
2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch g ek e η η zeichnet , daß der berechnete HLB-Wert außerhalb des Bereiches von 0,7 bis 1,7 liegt, wenn die Konzentration des Gemisches sich außerhalb des Bereiches von 3 bis 6% befindet,
3. Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung zur Einstellung der Konzentration des Gemisches in den Bereich von 3 bis 6% - wenn sie am Anfang nicht in diesem Bereich liegt - ein Antiserum enthält.
4. Reagens nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß das nichtionogene oberflächenaktive Mittel (a) ein Blockcopolymeres aus Äthylenoxid und Polyoxypropyleii, (b) ein geradkettiger primärer aliphatischer oxyalkylierter Al-

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kohol, (c) Glyzerinmonostearat, (d) ein Alkylarylsulfο-nat oder (e) ein Polyol gemäß der US-PS 2 979 528 ist.
5· Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3> dadurch gekennzeichnet , daß das Polyäthylenglykol ein Molekulargewicht von etwa 4000 bis 6000 aufweist und daß das nicht-ionogene oberflächenaktive Mittel ein Blockcopolymeres aus Äthylenoxid und Polyoxypropylen ist und daß der HLB-Wert der Lösung etwa 0,7 bis 1,3 beträgt.
6. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß die wäßrige Lösung ein Gemisch aus etwa 20 bis etwa 40 Gew.-?o Polyäthylenglykol und etwa 80 bis etwa 60 Gew.-?S eines Blockcopolymeren von Äthylenoxid und einem Polyoxypropylenpolymeren enthält.
7. Reagens nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Gemisches etwa 4 Gew.-% beträgt und daß das Gemisch etwa 25 Gevr.-% Polyäthylenglykol und etv/a 75 Gew. -% des Blockcopolymeren enthält.
8. Immunologische Untersuchungsmethode mit einer Reaktion eines Antikörpers mit einem Antigen unter Bildung eines Antikörper/Antigen-Komplexes, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Reagens nach einem der vorstehenden Ansprüche verwendet, um die Unlöslichkeitsmachung des durch die Reaktion gebildeten Antigen/Antikörper-Komplexes erheblich zu erhöhen.

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9. Methode nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß man das Reagens zur Durchführung einer nephelometrischen, enzymatischem elektrophoretischen oder radioimmunologischen Analyse verwendet.
10. Methode nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß man das Antigen, den Antikörper und das Reagens inkubiert,.um den Antikörper/Antigen-Komplex zu erzeugen, bevor man eine nephelometrische Analyse durchführt, indem man Lichtstreuungsmessungen vornimmt, die eine Funktion der Teilchenkonzentration des Antikörper/Antigen-Komplexes sind.
11. Methode nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man das Reagens, den Antikörper und das Antigen in Form von Immunoglobulinen inkubiert, um einen Antikörper/Antigen-Komplex von unlöslich gemachtem Immunoglobulin zu bilden, bevor man eine nephelometrische Analyse durchführt, indem man Lichtstreuungsmessungen, die einer Funktion der Teilchenkonzentration des unlöslich gemachten Immunoglobulins entsprechen, durchführt, wobei die Unlöslichkeitsmachung durch das Reagens verstärkt wird.
12. Immunologisches Reagens, dadurch gekennzeichnet , daß es eine wäßrige Lösung von etwa 4 Gew.-% eines Blockcopolymeren aus Äthylenoxid und einem Polyoxypropylenpolynieren darstellt.

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13· Nephelometrisches Verfahren zur Untersuchung bzw. Bestimmung von biologischen Bestandteilen, dadurch gekennzeichnet , daß man die biologischen Bestandteile in dem Reagens nach Anspruch 12 inkubiert, bevor man Lichtstreuungsmessungen durchführt, die eine Funktion der Konzentration der biologischen Bestandteile sind, die durch das Reagens unlöslich gemacht wurden.

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