JP6476130B2

JP6476130B2 - 敗血症を検出する方法

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Publication number: JP6476130B2
Application number: JP2015548771A
Authority: JP
Inventors: ニコルス，アンソニー
Original assignee: セプシス・リミテッド
Priority date: 2012-12-20
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2019-02-27
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Description

本発明は、一般に、使い捨て可能なアッセイ検査装置の分野に関し、特に、ポイントオブケアアッセイで使用するための使い捨て可能なアッセイ検査装置の分野に関する。本発明は、血液における敗血症のレベルの正確な測定を容易にするための、そのような装置を備えるキットを含む、そのような装置の使用にさらに関する。

敗血症、または毒血症は、感染によって引き起こされる全身の炎症状態によって特徴付けられる潜在的に致命的な病状である。敗血症は、多くの形態をとる広い医学的概念である。感染に対する宿主反応の病態生理学は複雑であり、全身性炎症の兆候および症状は、感染性または非感染性の病因を有することがあり、特異ではない。血液、尿、肺、皮膚、または他の組織中の病原菌またはウィルスに反応して、身体は、全身炎症反応を示すことがあり、ゆくゆくは臓器機能不全および死をもたらす。全身感染を起こした患者は、同様の臨床兆候および感染の検査所見がない患者と区別することが困難であることが多い。感染は、バクテリア、菌類、寄生生物およびウィルスによって引き起こされるものを含めて、多くの原因を有する。

敗血症は、血流中の病原体の存在によって識別され得る。敗血症は、通常、静脈内輸液および抗生物質を用いて治療される。敗血症は、２つ以上のタイプの有機体の存在の結果であり得、深刻な症状が発生する前に、感染の存在をできるだけ早期に識別すること、および、抗生物質が効果的であり、患者がさらなる感染に苦しまないようにするために、治療期間中には患者からの血液サンプルを定期的に監視することの両方が重要である。

感染の細菌学的証拠は、苦痛の臨床兆候と同時に示されないことがある。さらに、感染性のバクテリアの存在を確認するために血液サンプルから微生物を培養することは時間を要し、その結果は、汚染等が原因で不正確なことがある。本明細書において、深刻な感染は、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ：ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）だけでなく、敗血症、重症敗血症、菌血症を伴う敗血症、および敗血性ショックも含み得る。感染の定義に含まれるものには、全身性炎症反応症候群「ＳＩＲＳ（ｓｙｓｔｅｍｉｃｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｒｅｓｐｏｎｓｅｓｙｎｄｒｏｍｅ）」もあるが、ＳＩＲＳは、非感染性の原因だけでなく、感染性の原因も有し得る（これらの両方が本明細書において包含される）。ＳＩＲＳは、最終的には多臓器不全症候群に至る全身性炎症を示し、または全身性炎症に進展し得る。ＳＩＲＳの患者は、感染、外傷、火傷、膵臓炎等から当該症候群を発症し得る。

本明細書において、止血機能障害は、凝固における障害と定義され得る。ＤＩＣと敗血症との両方について、炎症と凝固とを結びつける一般的かつ重複する病態生理学的経路の認識が高まりつつある。特に、無数の戦略が失敗した後では、深刻な敗血症における遺伝子組み換えヒト活性化プロテインＣ（ＡＰＣ：ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＣ）の近年の治療の成功は、このことをさらに裏付けるであろう。ＡＰＣは、凝固補助因子ＶａおよびＶＩＩＩａの不活性化によりトロンビン生成を抑制し、抗炎症性も有すると考えられている。

現行の診断方法の特異性の欠如に起因して、感染、ＳＩＲＳおよび止血機能障害の早期指標またはマーカを発見する必要が引き続きある。早期診断は、患者の回復を大いに高め、この個体群に関連付けられる罹患率および死亡率を低減させ得る。さらに、感染、ＳＩＲＳおよび止血機能障害に対する宿主反応の治療の有効性を監視するための診断マーカまたは診断検査も同様に必要である。

凝固スクリーニングアッセイの時間依存測定プロファイルは、Ｇｉｖｅｎｓらの国際公開第９６／４１２９１号およびＴｏｈらの国際公開第００／４６６０３号において説明されるように、先天性平衡失調、後天性平衡失調および止血機能障害を予測することに関連付けられてきた。そのようなプロファイルは、今では一般的に二相性波形と呼ばれる（本明細書においては、ＢＰＷ（ｂｉｐｈａｓｉｃｗａｖｅｆｏｒｍ）とも呼ばれる）、血栓形成前のプラズマ光透過率における低下を有する活性化部分トロンボプラスチン時間（「ＡＰＴＴ（ａｃｔｉｖａｔｅｄｐａｒｔｉａｌｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎｔｉｍｅ）」）アッセイのプロファイルである。このＢＰＷは、敗血症を含む多くの原疾患において一般的であるＤＩＣを有する重病の患者に関連付けられてきた。凝固器具上の二相性波形は、ＤＩＣを含む止血機能障害の早期診断のための簡単かつ迅速な検査を提供する。

国際公開第０１／９６８６４号（２００１年１２月２０日）において説明されるように、Ｃ反応性たんぱく（ＣＲＰ：Ｃｒｅａｃｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎ）とリポタンパク質（特に、超低密度リポタンパク質）との間のカルシウム依存性複合体は、二相性波形の基礎となる分子メカニズムとして識別されてきた。複合体は、ＤＩＣを含む出血または血栓症に至り得る他の止血機能障害を有する患者に加えて、敗血症、ＳＩＲＳおよび菌血症を伴う敗血症を有する患者を識別するために使用され得る。さらに、国際公開第０１／９６８６４号は、使用される試薬に応じて、血栓形成の前に、または血栓形成がない場合に沈殿物が形成される、凝固アッセイ、ラテックス凝集法または金ゾルアッセイ、および免疫アッセイによって複合体を検出することを説明する。

二相性波形およびＣＲＰリポタンパク質複合体が、様々な種類の深刻な感染および（ＤＩＣと敗血症を含む）止血機能障害の早期診断における前進を提供する一方で、アッセイをさらに簡略化することへの必要が引き続きあり、そのため、少量の血液を使用して実行されることができ、迅速な読み出しを与える簡単なポイントオブケアバージョンのアッセイが、非常に望ましい。

血液サンプルのためのサンプル注入口と、血漿を分離するためのフィルタと、敗血症の存在下で血漿サンプルにおいて濁度変化を引き起こすための多価カチオン源と、濁度における変化を測定するための透明窓とを有する使い捨て可能なアッセイカートリッジを備えるポイントオブケア敗血症アッセイが開示される。多価カチオンは、二価カチオンであり得る。二価カチオンは、カルシウムであり得る。カチオンは、装置カートリッジの表面上で乾燥され得る。本発明は、サンプルにおける濁度変化を測定するためのリーダ装置器具も含む。リーダ器具は、装置カートリッジを可視光のビーム中に保持し、サンプルの経時的な透過率を測定するように構成される。本装置は、敗血症を測定するために使用され得る。

従来の分光光度計を使用した、敗血症と対照サンプルの検査の結果を示すグラフである。本発明のカード装置上での、同じ敗血症と対照サンプルの結果を示すグラフである。表１および表２に示されるデータのグラフ図である。

血液サンプルのためのサンプル注入口と、血漿を分離するためのフィルタと、敗血症の存在下で血漿サンプルにおける濁度変化を引き起こすための多価カチオン源と、濁度における変化を測定するための透明窓とを備える使い捨て可能なアッセイカートリッジを備えるポイントオブケア敗血症アッセイ方法が開示される。多価カチオンは、三価カチオンまたは二価カチオンであり得る。二価カチオンは、カルシウムであり得る。カチオンは、血漿の添加によってカチオンが再懸濁されるように、装置カートリッジの表面上で乾燥され得る。本発明は、サンプル中の濁度変化を測定するためのリーダ装置器具を含む。リーダ器具は、装置カートリッジを可視光のビーム中に保持し、サンプルの経時的な透過率を測定するように構成される。アッセイは、カチオンが不在の対照群に対して実行され、当該アッセイは、ポイントオブケア装置においては、第２の別個の反応チャンバまたは同じ反応チャンバの別個の部分のいずれかにおいて、同じ装置に対して実行され得る。本装置は、単一のサンプルが測定された後に破棄される単回使用カートリッジであり得る。

敗血症のための既存のアッセイは、二価金属イオンによって誘発される、血漿の濁度における変化を測定する。このアッセイは、マイクロタイタープレートにおいて実行され得る。既存の検査は、塩化カルシウムを使用し、サンプルによる光の透過の経時的な損失を測定する。敗血症を有する患者は、カルシウムの存在下で急速な沈澱を、したがって、濁度の増加に起因する光透過率の低下を誘発する。敗血症を有しない患者においては、溶液が透明なままであり、透過率が変化しない。透過率は、可視スペクトルにおける任意の波長、例えば、４０５〜５８０ｎｍで監視され得る。沈澱／濁度の増加は、急速に発生し、３０〜６０秒で測定され得る。

本発明の一態様は、二価カチオンがマイクロタイタープレートの表面上で乾燥され、未希釈血漿サンプルの添加によって再懸濁され得ることである。この乾燥されたカチオン源は、反応チャンバまたはポイントオブケア装置のチャネルにも適用され得る。カチオン濃度のウィンドウは、１０ｍＭよりも大きく、例えば、１０〜１００ｍＭであり得る。カチオンは、金属イオン、例えば、カルシウムイオンであり得る。濃度が述べられる場合、言及される濃度は、透過率／濁度が測定されている再水和サンプルの濃度である。

ポイントオブケア装置は、サンプルが全血として適用されることを必要とし、そのため、当該装置は、細胞物質を除去し、血漿のみが反応チャンバに入るようにするためのフィルタなどの手段を含むことができなければならない。本装置は、適切なフィルタに取り付けられ得る注入口、例えば、注射器用のルアー注入口が適用され得る。フィルタは、読み出されるべきリーダ内に装置が入る前にフィルタが除去され得るように、装置自体ではなく、注射器に取り付けられ得る。そのため、本発明は、フィルタに適した、または全血から血漿を分離する他の方法に適した接続部をカートリッジが有することを必要とするが、当該フィルタは、装置と物理的に一体である必要はない。全血が装置に適用されなければならず、装置は血漿を取得するための手段を含まなければならず、したがって、装置は、フィルタを含むか、または直接着脱され得るフィルタを使用して血液サンプルが血漿に変化され得る手段を有しなければならない。フィルタは、血液サンプルが装置に適用される位置に取り付けられなければならないが、一旦血液サンプルが適用されると除去され得る。フィルタは、フィルタの除去が不可能となるように、装置と一体とすることができる。

血液サンプルは、アッセイ装置への添加の前に発生する沈澱を防止するために、未希釈の全血として適用され、または、例えば、クエン酸塩を用いて処理され得る。装置への血液の適用後、サンプルは、さらなる希釈なしに処理される。血液サンプルは、例えば、装置に直接適用され得るフィンガ−プリックとして取得されることができ、または注射器での採血として取得され得る。血液が注射で採血される場合、血漿を取得するための濾過は、サンプルが装置に入る時に実行され得る。

フィルタは、例えば、赤血球の移動を遅らせるための繊維性マトリクスから形成され得る。適切な材料は、発泡体、（ホウケイ酸塩などの）ガラス繊維、ゾル−ゲルフィルタ、濾紙などのクロマトグラフ媒体またはニトロセルロースなどの膜、ポリスルホンまたはポリエステルを含む。いくつかの実施形態において、フィルタは、試薬を、例えば、水性サンプルからの不要な成分に結合し、または不要な成分を除去するための抗体またはビーズなどの結合剤を含み得る。フィルタは、１つまたは複数の前処理剤、沈澱剤、界面活性剤／洗浄剤、アッセイ用試薬、染料、遮断薬またはリガンド結合阻害剤も含み得る。遮断薬およびリガンド結合阻害剤は、水性サンプルの特定の成分、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ：ＨｕｍａｎＳｅｒｕｍＡｌｂｕｍｉｎ）のアッセイとの干渉を制限し得る。したがって、フィルタは、例えば、抗ＨＳＡ抗体などのＨＳＡ抽出手段、または、例えば、沈澱、固定等を使用する任意の他の手段を含み得る。

本装置は、二価カチオンなどの予め組み込まれた多価カチオン源を含まなければならない。予め組み込まれるとは、血漿サンプルが導入される前にカチオンが装置内に存在しなければならないことを意味する。カチオンは、１つまたは複数の反応チャンバに存在し得る。カチオンは、濡れた形態または乾燥した形態で存在し得る。カチオンは、２つ以上の反応チャンバを有し得る装置の一部のみにおいて存在し得る。カチオンは、２つ以上のチャンバを有する装置の１つのチャンバにおいて存在し得る。例えば、装置は、２つの反応チャンバを有することができ、それらのうちの１つがカルシウムを含む。２つ以上のチャンバは、サンプルがアッセイ装置に導入される中央サンプル注入部から放射状に伸び得る。フィルタは、中央部に位置してもよく、または、サンプルは、サンプル注入口に入る前に濾過済みであってもよい。カチオンが乾燥した形態である場合、反応チャンバの一部のみがカチオンを含み得、したがって、反応と対照との両方が１つのチャンバにおいて測定され得る。カチオンが言及される全ての場合において、カチオンは、カルシウムまたはマグネシウムを含む金属イオンであり得る。カチオン濃度のウィンドウは、１０ｍＭよりも大きく、例えば、１０〜１００ｍＭであり得る。

「乾燥した形態」という用語の使用は、全体として実質的に液体または水分を含まないか、またはこれらが使い果たされた形態に維持される成分を指す。つまり、成分は、アッセイの手順の前にアッセイの手順とは別個に再構成されるのではなく、アッセイ自体の動作によって再構成されるまで溶液に存在しない。したがって、水性サンプル自体は、乾燥した１つまたは複数の試薬を再構成し、それによって、別個の再構成バッファおよび再構成工程の必要性を排除する。

装置の反応チャンバは、閉チャネルを備え得る。反応チャンバは、流路であり得る。反応チャンバは、定義された体積を有し得る。反応チャンバの体積は、例えば、１０〜５０マイクロリットル（μＬ）であり得る。チャネルの寸法は、例えば、高さと奥行きが０．５ｍｍ〜２ｍｍ、長さが１〜３ｃｍであってもよい。チャネルの寸法は、例えば、高さが約１．５ｍｍ、奥行きが約１．５ｍｍ、長さが約２ｃｍであってもよい。

反応チャンバまたはチャネルは、両親媒性ポリマーを含み得る。両親媒性ポリマーは、流体流を促進し、および／または水溶液と、例えば、両親媒性ポリマーの被覆内に組み込まれる「乾燥した」成分、または両親媒性ポリマーの被覆上もしくは被覆下の層としての「乾燥した」成分との混合を促進するために使用され得る。両親媒性ポリマーの使用は、例えば、米国特許第６，４８５，９８２号において開示されるものなどの多孔質材料を用いる従来の「ウィッキング（ｗｉｃｋｉｎｇ）」と比較して、流体の側方流動が改善されるという利点も有する。従来技術のウィッキング方法は、毛管作用により液体が吸い込まれる紙または膜などの支持媒体の使用に依存する。両親媒性ポリマーの使用は、膜などの支持媒体の必要性を除去し、液体が、毛管作用単独によるよりも、例えば、微細管、表面、疎水性表面等に沿って、より大きな距離またはより大きな速度で進み得るという効果を有する。したがって、両親媒性ポリマーの使用によって、毛細管流動速度が増加し、および／または、流体は、毛管作用単独によって期待される距離よりも大きい距離を流れる／進む。

両親媒性ポリマーは、流体流経路を被覆するために使用され得る。あるいは、両親媒性ポリマーは、流れ経路の表面上の被覆またはフィルムの形態であり得、または、流れ経路の空間もしくは空洞内の粉末、ペレット、微小粒子、ナノ粒子、ピコ粒子もしくは充填物であり得る。両親媒性ポリマーが空洞内の充填物である場合、両親媒性ポリマーは、当該空洞を完全に充填し得、または、例えば、間隙を有する部分的な充填物であり得る。両親媒性ポリマーは、流れ経路を、例えば、流体流が発生し得る疎水性表面上の通路または進路として形成し得る。例えば、両親媒性ポリマーは、「通路（ｔｒａｃｋｓ）」および／または層を形成するために、平面などの表面上に（インクジェット印刷またはバブルジェット（登録商標）印刷などによって）印刷され、塗布され、噴霧され、または適用され得る。試薬は、混合などによって、両親媒性ポリマーと組み合わされてもよく、または、両親媒性ポリマーの上、下または側方に層として配置されてもよい。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）は、両親媒性ポリマーである。ＰＥＧの有用な分子量は、約６００から１０，０００Ｄａまで、および約１０００Ｄａから３０００Ｄａまでを含む。ポリエチレンオキサイド（ＰＥＯ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｏｘｉｄｅ）またはポリオキシエチレン（ＰＯＥ：ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ）としても知られるポリエチレングリコールは、エチレンオキサイドのオリゴマーまたはポリマーである。ＰＥＧは、３００ｇ／ｍｏｌから１０，０００，０００ｇ／ｍｏｌまでの広範囲な分子量にわたって利用可能である。ＰＥＧは、以下の一般構造を有する。

ＨＯ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−０−）_ｎ−Ｈ
数字は、ＰＥＧの平均分子量を示すために、ＰＥＧの名称にしばしば含まれる。例えば、ｎ＝８０のＰＥＧは、約３５００ダルトンの平均分子量を有し、ＰＥＧ３５００と名付けられるであろう。

一般に、ＰＥＧは、ある分子量分布を有する分子を含む。様々な分子量を有するＰＥＧは、それらの粘度などの様々な物理的性質に起因して、種々の用途における使用法を見出すが、それらの化学的性質は、ほぼ同一である。重合プロセスに使用される開始剤に応じて、ｍＰＥＧと略される単管能性メチルエーテルＰＥＧ（メトキシポリ（エチレングリコール））などの様々な形態のＰＥＧも利用可能である。ＰＥＧは、様々な形状でも利用可能である。分岐したＰＥＧは、中心コア群から生じる３〜１０個のＰＥＧ鎖を有する。星形ＰＥＧは、中心コア群から生じる１０〜１０００個のＰＥＧ鎖を有する。櫛形ＰＥＧは、通常、１つのポリマー骨格にグラフトされる複数のＰＥＧ鎖を有する。ＰＥＧは、ＰＥＧ化として知られる工程において他の分子とも共有結合され得、ＰＥＧ化は、例えば、ＰＥＧの流体流特性を試薬混合に使用する場合に有利となり得る。

両親媒性ポリマーのさらなる例は、両親媒性ポリペプチド、つまり、ポリペプチドが新水面と疎水面との両方を有するように、二次構造を有するポリペプチドである。他の両親媒性ポリマーは、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ：ｐｏｌｙｖｉｎｙｌａｌｃｏｈｏｌ）およびイオン性ポリマーを含む。

チャネルは、その長さの一部に沿った乾燥カチオン源を含み得る。カチオンは、サンプル注入口から最も離れたチャネルの一部に存在し得る。

カチオンは、多価有機化合物の形態で供給され得る。有機化合物は、ポリマー、例えば、ポリリシンであり得る。有機化合物は、装置の表面上で乾燥され得る。

カチオンが金属イオンである場合、カチオンは、分散、安定性および再懸濁を助けるためのポリマー試薬を用いて乾燥されて装置の表面になり得る。ポリマー試薬は、ポリエチレングリコール、例えば、メチルポリエチレングリコールであり得る。あるいは、金属イオンは、マイクロカプセル化され得る。カチオンは、血漿サンプルの添加時に迅速な再懸濁を可能とする形態で乾燥されなければならない。

カートリッジの反応チャンバは、可視光を透過する視界窓を備えなければならない。この窓は、４８０ｎｍにおいて透過性を有し得る。透明窓の光路長は、０．５ｍｍから１０ｍｍであり得る。透明窓の光路長は、０．５ｍｍから２ｍｍであり得る。光路長は、１ｍｍまたは１．５ｍｍであり得る。

本装置は、プラスチックまたはガラスから作られ得る。透明窓は、透明プラスチックから作られ得る。乾燥試薬は、表面のうちの１つに予め吸収され得、次いで、本装置は、当該乾燥装置を包含するように組み立てられ、定義された反応チャンバを形成する。例えば、乾燥試薬は、テープ形態で準備されてもよく、このテープは、定義された体積の密閉反応チャンバを形成するように開チャネルを封止するために使用されてもよい。

反応チャンバは、血漿サンプルが毛管作用によって吸い込まれるサイズであり得る。あるいは、チャンバは、サンプルが吸引によって吸い込まれるように、負の気圧下で封止され得る。反応チャンバは、流体が入るにつれて空気が逃げることを可能にするための排気口を有し得る。

リーダ装置
反応チャンバを含むカートリッジ装置は、リーダ装置上で測定され得る。リーダ装置は、反応カートリッジを保持することができ、可視光源を含むべきである。光源の波長は、４０５〜５８０ｎｍ、例えば、４８０ｎｍであり得る。光源は、電球、レーザまたは発光ダイオード（ＬＥＤ）であり得る。リーダは、励起波長を選択するための励起フィルタを備え得る。リーダは、サンプルを透過する透過率を検出するための測定要素を含み得る。リーダは、測定要素に到達する光の量を最小限にするためのピンホールを含み得る。測定要素は、フォトダイオードであり得る。

アッセイリーダのハウジングは、通例、アッセイカートリッジと機能的に連通して配置されることができるように適合される。例えば、アッセイカートリッジ装置は、リーダ内に挿入され、リーダ上に配置され、またはリーダに取り付けられ、リーダは、スロットなどのドッキング手段、またはアッセイ装置が適当に挿入され、配置され、もしくは取り付けられることを可能にするためのアラインメント手段を備え得る。

ピンホールは、例えば、直径３ｍｍであり得る。ピンホールは、直径３ｍｍ未満であってもよい。ピンホールは、直径０．５〜１ｍｍであってもよい。ピンホールは、直径０．５ｍｍ、０．８ｍｍまたは１ｍｍであってもよい。

サンプルは、測定されるべきフォトダイオードから１〜１０ｃｍの間に保持され得る。サンプルは、測定されるべきフォトダイオードから３〜６ｃｍに保持されてもよい。

リーダは、継続的に、または定義された時点において、透過率を記録可能であり得る。リーダは、ある期間、例えば、１２０秒間にわたる透過率の記録をプロットするための解析ソフトウェアも含むことができる。リーダは、定義された時点で測定を行い得る。リーダは、３つ以上の定義された時点、例えば、１０秒、３０秒および６０秒で測定を行い得る。リーダは、検査結果を生成するためにユーザ入力が必要とされないように構成され得る。

使用方法
敗血症のためのポイントオブケアアッセイの使用法が、本明細書に含まれる。当該使用法は、
ａ）全血のサンプルを取得するステップと
ｂ）血漿を取得するためのフィルタおよび多価カチオン源を備えるポイントオブケア装置に血液サンプルを添加するステップと、
ｃ）血漿の濁度における変化を測定するステップと、
ｄ）光透過率の低下と敗血症の存在とを相関させるステップと、
を含む、敗血症を検出する方法を含む。

ポイントオブケア装置は、上述された特徴のうちのいずれかを有し得る。測定は、上記に定義されたリーダ器具上で行われ得る。

キット
本発明の別の態様において、敗血症アッセイを実行するための構成要素のパッケージを備えるキットが提供される。

本キットは、（ｉ）例えば、フィンガ−プリックサンプルによって、または注射器吸引を介して、血液サンプルを採取する前に患者の皮膚を殺菌するための手段（従来の手段は、アルコールなどの滅菌剤、またはビスビグアナイドなどの抗菌剤、例えば、水溶液またはアルコール溶液内に可溶性塩としてのクロルヘキシジンを含む、一片の布またはガーゼである）と、（ｉｉ）好適にはセーフティスリーブを備える従来のランセット装置などの皮膚貫通手段（あるいは、針が、シリンダおよびプランジャを含む従来の注射器アセンブリの一部であってもよい）と、（ｉｉｉ）本発明の第１の態様に係るアッセイ装置と、（ｉｖ）皮膚の刺創を覆うためのガーゼまたは絆創膏と、（ｖ）本装置の使用法に関する詳細を提供する教育用説明書と、（ｖｉ）血液接触を回避するための使い捨て可能な手袋と、（ｖｉｉ）アッセイリーダと、などの多くの構成要素のうちの１つまたは複数を備え得る。

検査データおよび実例
１．ＰｈｉｌｌｉｐｓのＰＵ８７３０分光光度計上で実行されたアッセイ
１．５ｍｍの経路長を有する分光光度計セルが、アッセイを検査するために使用された。吸光度は、４８０ｎｍに設定された。ブランク測定のために、２μｌのＰＢＳが、二相性血漿サンプル（１８μｌ）に添加された。この混合物は、よく混合され、セル（２０μｌ）に添加された。次いで、ドアが占められ、測定は、１０秒ごとに最大で４分間行われた。次いで、セルは、ＰＢＳを用いて洗浄され、乾燥された。このプロセスは、ＰＢＳを１００ｍＭのＣａＣｌ_２（２μｌ）に置換して繰り返された。

この全手続きが、検査される血漿サンプルの各々について繰り返された。

２．反応チャネルを有するプロトタイプ装置プラットフォーム上で実行されたアッセイ
透明な反応チャンバが、敗血症濁度アッセイを効果的に監視するために構築された。プロトタイプカードを実現するために、二片のトパーズプラスチックが、ＣａｄｉｌｌａｃＰｌａｓｔｉｃＬｉｍｉｔｅｄ（８０１０ＭＣ．１７５）によって提供される透明フィルムを含めて使用された。一片は、半分に切断され、１ｍｍのチャネル（約１ｍｍの光路長）が、カードの長さに沿って作られた。次いで、これは、光が所望のリードエリアを通過できるように黒色のマスキングテープにより分割された。

サンプルの準備
ブランク測定（バッファ内のサンプル）が行われることを必要とするアッセイに起因して、カード上の反応チャンバは、ブランク検査後に洗浄されなければならなかった。反応は非常に素早く生じるため、ブランクサンプル測定を行い、次いで、そのままの状態でカルシウムを添加することは不可能である。したがって、サンプルは、以下のように準備される。

ブランク混合物
５μｌのＰＢＳバッファが、４５μｌの二相性血漿サンプル（サンプル番号０３５２７８）に添加された（サンプルは、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＬｉｖｅｒｐｏｏｌのＣｏｌｉｎＤｏｗｎｅｙによって提供された）。この反応混合物が混合され、２０μｌがプロトタイプカードに添加された。次いで、これは、１分間にわたり、ピコ電流計（μＡに設定）からの定期的な読み出しを行うプロトタイプリーダ上で測定された。次いで、このカードは除去され、ＰＢＳを用いて洗浄され、乾燥された。

反応混合物
５μｌの１００ｍＭのＣａＣｌ_２が、４５μｌの二相性血漿サンプル（０３５２７８）に添加された。この混合物は、２０μｌがカードに添加され、リーダソフトウェア上の「連続モード（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｍｏｄｅ）を使用して３分間にわたり測定される前に、再度素早く混合された。次いで、このカードは、再度検査する前に、除去され、ＰＢＳを用いて洗浄され、乾燥された。

この全手続きは、８個の二相性サンプルおよび３つの標準のサンプルについて、以下のように繰り返された。

サンプル参照番号は、本研究において、以下のように使用された。

二相性
３６０９２５３７２２６５２４２４４０５７８４０５７９５２０３１５３３８８３０７８５
標準
１２３２８８９１２３９９３１１２３２９３４
図１は、従来の分光光度計上で測定されたサンプルを示す。図２は、プロトタイプカード装置上で測定された同じサンプルを示す。全体的に、プロトタイプ装置上のデータは、チャネル装置と分光光度計セルとの間で同値を示す。２つのプラットフォーム間の全体的な傾向は、一貫しているように見える。信号の損失は、２つのサンプル５２０３１および５３３８８を例外として、同程度である。しかしながら、両方法は、同じ臨床的結論に至るであろう。経路長はカード上では１ｍｍではなく１．５ｍｍであったため、増加された経路長に起因して、若干より大きな透過損失が分光光度計において存在する。

初期反応経路のタイミングも、カードまたはセルのいずれかへの添加前のサンプルの「オフライン」混合に起因して、困難であった。これは、信号における損失を見る際に重要である最初の２０〜４０秒の反応を注意深く監視することを極めて困難なものにする。「標準（ｎｏｒｍａｌ）」サンプルの信号における損失および／または増加が見られる理由も不明確である。これは反応の全体的な規模においては無視できるが、使用後のカードの洗浄工程がチャンバに微量のカルシウム沈殿物を残し、信号における変化を生じさせていることがあり得る。これは、単回使用の使い捨て可能なカード上では発生しないであろう。

リーダパラメータの最適化および検査
反応カード、ブランクサンプルおよび血漿サンプルの準備は、上記に示されるように実行された。

リーダの仕様
・白色ＬＥＤが、光源として使用された。

・４８０ｎＭの狭帯域トップハットフィルタが、波長を制御するために使用された。

・ダイオードが、ピコ電流計に接続された。

・次いで、ダイオードを含む段が、ダイオードとサンプルとの間に３ｃｍまたは６ｃｍの距離を与えるように配置された。

・０．５ｍｍの除去ピンホール（ｒｅｊｅｃｔｉｏｎｐｉｎｈｏｌｅ）が光路に追加された。

・次いで、この構成が検査された。

結果は、ピンホールを使用して、またサンプルと測定要素（検出器）との間の距離を増加させることによって、リーダ上での検査の精度が改善されることを示す。

アッセイは、最適化されたリーダ構成において、サンプル０３５２７８とカルシウムなしのサンプル（光路長０．８ｍｍ、サンプルから検出器までの距離６ｃｍ、除去ピンホール１ｍｍ）の２つの時間プロファイルを記録するために繰り返された。

図３は、表１および表２に示されるデータのプロットを示す。結果は、チャネルフォーマットにおいて敗血症濁度アッセイを監視することを可能にするために、リーダが受けた様々な最適化工程および変形工程を示す。二相性血漿サンプルは、カルシウムの不在時には透過率の損失を示さない。グラフから、除去ピンホールの追加およびサンプル／検出器間の距離の増加が、このフォーマットにおけるアッセイの分解能を改善したことは、明らかである。
（項目１）
血液サンプルのためのサンプル入口と、前記血液サンプルから血漿を分離するためのフィルタと、敗血症の存在下で前記血漿サンプルにおいて濁度変化を引き起こすための多価カチオン源を含む反応チャンバと、濁度における前記変化を測定するための透明窓とを有する使い捨て可能なアッセイカートリッジを備えた装置を使用する、敗血症を検出する方法。
（項目２）
前記装置は、使い捨て可能な単回使用装置である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記多価カチオンは、二価カチオンである、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記二価カチオンは、金属イオンである、項目１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
前記金属は、カルシウムである、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記カチオンは、前記装置の表面上の乾燥した金属として提供された、項目１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記装置は、定義された体積の反応チャンバを備えた、項目１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記反応チャンバの前記体積は、１０〜５０マイクロリットル（μｌ）である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記窓は、４８０ｎｍにおいて透過性を有する、項目１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記透明窓の光路長は、０．５ｍｍから１０ｍｍである、項目１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記透明窓の前記光路長は、０．５ｍｍから２ｍｍである、項目１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記装置は、前記二価カチオン源を含まない第２の反応チャンバを備えた、項目１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記二価カチオンは、前記血漿が添加された場合に、前記反応チャンバにおいて１０ｍＭよりも大きい終末濃度において存在する、項目１乃至１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記カチオンは、水溶性ポリマーの層において乾燥された、項目６に記載の方法。
（項目１５）
前記ポリマーは、ポリエチレングリコールまたはメチルポリエチレングリコールである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記カチオンは、前記反応チャンバの前記表面の一部のみにおいて乾燥された、項目６に記載の方法。
（項目１７）
前記装置は、可視光源を備えたリーダ器具を使用して測定された、項目１乃至１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記リーダ器具は、前記サンプルを透過する光の量を検出するための測定要素を備えた、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記測定要素は、フォトダイオードである、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記リーダ器具は、前記測定要素と前記サンプルとの間にピンホールを備えた、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
血漿を取得するためのフィルタおよび多価カチオン源を備えたポイントオブケア装置に血液サンプルを添加するステップと、前記血漿の濁度における変化を測定するステップと、光透過率の低下と敗血症の存在とを相関させるステップとを含む、敗血症を検出するための方法。

Claims

血液サンプルのためのサンプル入口と、前記血液サンプルから血漿を分離するためのフィルタと、多価カチオン源を含んだ乾燥した物質を含む反応チャンバであって、前記乾燥した物質は前記反応チャンバの表面の一部のみに存在し、前記多価カチオンは敗血症の存在下で前記血漿サンプルにおいて濁度変化を引き起こす、反応チャンバと、濁度における前記変化を測定するための透明窓とを有する使い捨て可能なアッセイカートリッジを備えた装置を使用する、敗血症を検出する方法であって、前記方法は、血液サンプルを前記装置に追加し、前記多価カチオンによって生じた前記血漿の、前記カチオンが存在しない同じ前記反応チャンバの別個の部分で取得した測定値の対照群に対する、前記濁度変化を測定し、前記血漿サンプル内の濁度の増加に基づく光透過率の低下を検出することを含む、敗血症を検出する方法。
前記装置は、使い捨て可能な単回使用装置である、請求項１に記載の方法。
前記多価カチオンは、二価カチオンである、請求項１に記載の方法。
前記二価カチオンは、金属イオンである、請求項３に記載の方法。
前記金属は、カルシウムである、請求項４に記載の方法。
前記装置は、定義された体積の反応チャンバを備えた、請求項１に記載の方法。
前記反応チャンバの前記体積は、１０〜５０マイクロリットル（μｌ）である、請求項６に記載の方法。
前記窓は、４８０ｎｍにおいて透過性を有する、請求項１に記載の方法。
前記透明窓の厚さは、０．５ｍｍから１０ｍｍである、請求項１に記載の方法。
前記透明窓の前記厚さは、０．５ｍｍから２ｍｍである、請求項１に記載の方法。
前記装置は、前記二価カチオン源を含まない第２の反応チャンバを備えた、請求項１に記載の方法。
前記二価カチオンは、前記血漿が添加された場合に、前記反応チャンバにおいて１０ｍＭよりも大きい終末濃度において存在する、請求項１に記載の方法。
前記カチオンは、水溶性ポリマーの層において乾燥された、請求項１に記載の方法。
前記ポリマーは、ポリエチレングリコールまたはメチルポリエチレングリコールである、請求項１３に記載の方法。
前記装置は、可視光源を備えたリーダ器具を使用して測定された、請求項１に記載の方法。
前記リーダ器具は、前記血漿サンプルを透過する光の量を検出するための測定要素を備えた、請求項１５に記載の方法。
前記測定要素は、フォトダイオードである、請求項１６に記載の方法。
前記リーダ器具は、前記測定要素と前記血漿サンプルとの間にピンホールを備えた、請求項１６に記載の方法。