KR20080044848A - 응고 시험 시스템 - Google Patents

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KR20080044848A
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마티아스 스티엔
유리그 빈 요네스
스라드자나 닌치크
엘크 호르스트코테
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에고메디칼 테크놀로지 아게
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Abstract

서로 대향(對向)하는 소정의 거리에 제1 표면 (2a) 및 제2 표면 (4a)이 있는 혈장 또는 전혈 내 응고를 측정하기 위한 시험 요소에 있어서,
상기 두 표면에는 거의 합동형으로 정렬되어 있는 고표면 에너지와 저표면 에너지 영역을 형성하는 실질적으로 동등한 2개의 패턴들이 제공되고, 상기 고표면 에너지의 영역은 검출 영역이 적어도 1개(6a)인 시료 분배 시스템 (6)을 형성하고, 상기 제1 표면 및 제2 표면 (2a, 4a)의 검출 영역(들) (6a, 6'a)에는 적어도 1개의 응고 자극 시약이 제공되는 것인, 시험 요소. 상기 응고 시험 요소는 약 0.5μL의 매우 작은 시료 부피를 가진 건조 시약 시험 스트립에 적절한 통합된 질 조절 시스템이 제공된다. 본 발명의 응고 시험 요소의 생산은 복잡하지 않은 오직 적은 수의 생산 공정을 포함하여 요소의 비용이 많이 들지않는 생산을 가능하게 한다.
응고, 시험, 혈액, 혈장, 시스템

Description

응고 시험 시스템 {COAGULATION TEST SYSTEM}
본 발명은 생리학적 시료 유체 중 혈액의 응고를 측정하는 응고 시험 시스템에 관한 것이다.
혈액 응고 과정은 복잡하고 피브린 섬유 (fibrin fibres)의 생성을 포함하는 다수의 혈액 성분을 포함한다. 섬유는 피브리노겐이라는 단백질 분자의 중합에 의해 형성된다. 피브리노겐은 트롬빈이라는 효소로부터 촉진되고, 이것은 그자체로 효소 프로트롬빈으로부터 촉진된다.
프로트롬빈 시간 시험(PT 시험)은 일반적으로, 혈액 시료가 엉긴 덩어리(clot)이 되는 능력을 확인하기 위하여 실험실, 클리닉, 병원에서 사용된다. 이 시험은 예를 들어, 심장 질환 환자에게 투입되는 항-응고 요법과 수술전(pre-operative) 평가에 사용된다. PT 시험은 칼슘이온 및 트롬보플라스틴과 같은 어떤 반응물의 영향 하에 혈액 시료가 응고되는데 필요한 시간의 길이에 근거한 것이다.
유사하게, 심장 및 혈관 질환으로 고통받거나, 및/또는 기계적인 인공심장 판막을 가진 개인들이 항응고제로 일반적으로 언급되는 혈액을 엷게하는 약물의 매 일 복용 형태로 자주 치료받는다. 혈류에서 항응고제의 양은 효과적으로, 의사에의해 적절한 수준이 유지되도록 해야한다. 혈류 내 부적절한 양의 항응고제의 결과는 매우 심각하고, 발작 (stroke) 또는 출혈 (haemorrhages)을 일으킨다.
이러한 균형을 이루는 환자는 혈액의 응고 능력을 면밀히 모니터할 수 있는 클리닉에 자주, 값비싼, 불편한 방문을 견뎌야만 한다. 모니터링은 국제 통용 지표 (International normalized ration, INR)에 의해 측정된 바와 같이, 주기적인 PT 측정에 의해 맡아진다. 예를 들어, 3 보다 큰 INR은 심각한 출혈의 높은 부담을 초래하고, 반면에, 6의 INR은 3 미만의 INR을 가진 어떤 사람의 것보다 거의 7배 심각한 출혈을 발달시키는 위험이 증가한다. 대조적으로, 2 미만의 INR은 발작의 증가된 위험과 관련있다. 그러므로, 프로트롬빈 시간의 모니터링은 약물 수준이 치료 범위내로 들어오는 것을 보증하기 위해 추천된다.
혈액 내에 피브리노겐 및 프로트롬빈 수준과 같은 성분을 모니터링하는 것에 의해, 의사는 환자의 혈액 응고 능력 또는 다른 임상적인 조건에 관한 의미있는 자료들을 얻을 수 있다. 응고 과정 (coagulation)에 관련된 단백질들은 일반적으로 인자(factor)로써 언급된다. 인자들은 I-XIII로 숫자가 매겨지고, 그 숫자에 의한 인자의 참고는 당업자에게 그 상응하는 단백질로 간주한다.
프로트롬빈의 활성화는 혈액응고 인자 Xa의 작용 결과로써 일어나는 것으로, 이것은 단백질 가수분해 동안 인자 X의 활성화에 의해 형성된다. 인자 X가 Xa를 주는 활성화로 이르는 두가지 분자적 경로가 있는데, 일반적으로, 이것은 혈액 응고를 위한 외부적 및 내부적 경로로 간주된다. 외부적 경로는 손상된 막에 특이적인 조직 인자를 오직 활용하는 반면, 내부적 통로는 혈액을 순환하기 위한 내부적 인자를 오직 활용한다. 이 두 경로들 모두 표면 단백질 및 인지질들과 함께 혈액 응고 과정에 참여하는 효소의 상호작용으로 일어나는 것이다.
환자의 혈액 시료의 외부적 및 내부적 경로들에서 응고 과정을 측정하기 위해, 다양한 실험들이 도입되어 왔다. 예를 들어, 활성 부분적 트롬보플라스틴 시간 (APTT) 시험은 내부적 경로의 응고 인자를 측정한다. 이러한 인자들은 유전, 질병 또는 헤파린 치료법의 효과때문에 비정상적인 인자들 XII, XI, X, IX, VIII, V, II 및 I를 포함한다. 그리하여, APTT 테스트는 전-수술적 스크린 및 헤파린 치료법을 모니터링하기 위하여 유용하다. 유사하게, 트롬빈 시간 (TT) 시험 또는 항응혈약 (warfarin) 치료요법 (상표명: Coumadine®) 또는 이와 관련된 조제약상에 환자를 위한 유용한 진단적 자료를 제공하는 정량적인 피브리노겐 시험을 사용하여 피브리노겐 중합율을 테스트한다.
이전에 언급한 바와 같이, 항응고제 요법을 모니터하기 위해 가장 많이 사용되는 시험은 1-단계 프로트롬빈 시간 시험이다. PT 시험에 의해 측정되는 반응은:
혈액 + 트롬보플라스틴 + Ca++ → 피브린 엉긴 덩어리
트롬보플라스틴은 혈액 표본 내 응고(clotting)를 활성화시키는 인지질-단백질 준비(preparation)인 것이다. 트롬보플라스틴은 서로 다른 제조사들로부터 상업적으로 이용가능하고, 폐, 뇌 또는 태반 추출물로부터 얻을 수 있고, 또한, 합성적으로 제조할 수 있다. 일반적으로, 서로 다른 실험실 사이에 PT 수치는 일치하지 않고, 그리하여 항응고제 요법을 위한 치료 범위를 규명하는데 그런 수치들은 받아들여질 수 없게 만든다.
그러므로, 국제 통용 지표 (INR)이 발전되고, 1980년 초반에 세계 건강 기구에 의해 채택되었다. 통용 지표의 목적은 다양한 트롬보플라스티들 및 응고 분석기들이 동등하게 되도록 표준화하는 것이다. 결과적으로, 그 비(ratio) 아래, 제조자들은 국제 표준 트롬보플라스틴과 동일한 민감도를 가지는 트롬보플라스틴의 상대적인 민감도를 나타내는 각 배치(batch)의 트롬보플라스틴을 국제 민감도 지수 (International Sensitivity Index, ISI)를 선정한다. 예를 들어, 만약 트롬보플라스틴이 참고 트롬보플라스틴과 동일한 민감도를 가진다면, ISI는 1.0이다. 1.0 보다 큰 ISI 지수는 트롬보플라스틴이 참고 트롬보플라스틴에 비해 그만큼 민감하지 않다는 것을 가리킨다. 하기 식은 PT 지수 및 ISI 지수를 이용하여 INR 수치를 계산하는데 이용되는 것이다:
Figure 112008015340083-PCT00001
평균 정상 PT (mean normal PT)는 건강한 개인들로부터 PT 수치를 평균하여 각 실험실에서 결정된 것이다.
1850년대 중반 및 초기로 돌아가 피브린 응고의 형성의 측정 방법은 손으로 하는 것이다. 1910년에, 응고를 거치는 혈액 시료의 점성의 변화를 측정하는 장치가 개발되었다. 그 장치는 응고 시간에 대하여 구상될 수 있는 전압의 방향 표시를 제공하였다. 1920년대에, 광전자적 기술은, 갈바노미터에 의해 측정되는 시료의 광학적 투과율(transmittivity)에서 다양한 변화가 있는 응고 중에 혈액 시료들의 광 투과율의 변화를 측정하는 것으로 유명해졌다. 개선된 광전자적 기술을 이용한 혈액 혈장 의 응고의 추가적인 조사는 1930년 중반에 혈액 응고된 것을 관찰하는 것으로써 광학 밀도 증가를 가지고 이루어졌다. 이것은 엉긴 덩어리 (clot) 형성으로 증가하는 밀도를 나타내는 장치의 발달을 가져왔다.
현재 광학 밀도 검출 시스템은 그러므로, 응고하는 시료의 광학적 밀도 내 증가가 시료를 통하는 빛의 투과율이 감소한다는 원리로 작동한다. 전형적인 광학적 밀도 검출 시스템에서, 시험 혈액 샘플은 투명한 시료 큐벳에 위치되고, 트롬보플라스틴과 같은 응고 자극 시약과 함께 반응된다. 눈에 보이는 또는 거의 적외선 스펙트럼에 가까운 빛 또는 전자-자기 방사는 그리고나서, 시료 엉긴 덩어리(clot)로서 혈장 -시약 혼합물을 통과한다. 피브린 형성을 일으키는 생화학적 변화가 시료 내에 일어나는 때에, 시료의 광학적 밀도는 증가한다. 시료의 광학적 밀도에 대응되는 산출 전압은, 처리 유닛으로 처리한 후, 시료의 응고를 측정가능하게 한다.
피브리노겐 (피브린) 수준 및 광학적 밀도 사이에 관계의 존재가 오래 인식되는 동안, 그 관계를 측정하기 위한 적절한 방법과 본질에 관한 넓은 불일치가 있었고, 수많은 시험 파라미터들이 광학 밀도 자료를 이용하여 피브리노겐 수준을 측정하기 위해 고안되어왔다.
또한, 불규칙한 혈액 응고 시간의 부정적 효과에 대한 증가되는 자각에 따라, 자가(self)-모니터링 및 자가-치료의 허용은 수많은 혈액 응고 모니터들 및 POC (point of care) 시험 및 개인적 용도를 위한 방법들을 발달시켰다. 그러나, 이러한 장치들은 여전히 발달 상태, 경제를 결핍하고 있고, 알려진 편리성은 당뇨병 환자들을 위한 가정 글루코스 모니터링 시스템을 형성한다.
혈액 응고 시간을 측정하기 위한 예시적인 방법 및 시스템은 미국특허 4,252, 536에 개시되어 있다. 방법은 혈액 시료 및 시약의 혼합물을 제공하고, 그 혼합물에 빛을 비추고, 그 비춰진 혼합물로부터 산란된 빛의 양을 측정하고, 그것을 나타내는 전기적인 신호를 생성하는 것을 포함한다. 그 다음으로, 측정은 전기 신호 내에 가장 빠른 변화가 일어나고, 그리하여 가장 빠른 변화가 일어나는 것의 1/n의 변화가 있는 첫번째 시간보다 앞서는 종점으로서 측정하는 시간에 전기적 신호로부터 만들어진다, 여기서, n은 1보다 크다. 응고 시간을 측정하는 대부분의 방법은 큐벳에 도입되어, 일정 기간의 시간 이상인 응고 성질을 분석하기 위한 혈장 를 근거로 한다.
유럽 특허 출원 1,162,457은 선택적인 양의 혈액을 받기 위해 3개 시료 웰을 이용하여 응고 기능을 증진시키기 위한 방법으로써 환자에게 투여하기 위한 적절한 응고 촉진 물질을 측정하기 위한 시험 시스템을 개시한다.
미국특허 6,066,504는 혈액 시료의 응고 또는 용해를 신호하는 일정 간격의 시간을 넘는 점도 변화의 정량적인 측정을 제공하는 전극 어셈블리를 개시한다.
유럽특허 974,840은 광학적 측정 수단들을 이용한 생물학적 유체의 성질 또는 검체 농도를 측정하기 위한 유체의 진단 장치를 개시한다.
PCT WO 20047/044560은 비희석된 전체 혈액 시료를 받는 콘테이너, 빛을 발 광하기 위한 빛 발광광원 및 상기 콘테이너로부터 상당한 양의 빛을 측정하기 위한 빛 측정기를 가진 비희석화된 전체 혈액 내 응고 시간의 포토메트릭 측정을 개시한다.
미국 특허 6,084,660은 시료를 도입하기 위한 시료 포트를 한쪽에 갖고, 다른쪽에 측정 영역에 시료를 넣기 위한 낭(bladder)을 갖는 장치로, 전체 혈액 시료가 이 장치로 도입되는 것을 보장하기만 하면, 전체 혈액의 물리적인 성질 또는 검체 농도를 측정하고, 특히 응고 시간을 측정하는, 유체의 의료 진단 장치를 개시한다.
PCT WO2002/086472는 환경의 점도에 근거한 형광 강도에 변화가 있는 형광 분자 로터의 이용을 개시한다. 그 발명자는 또한 액체 점도 또는 막의 측정을 허용하는 탄화수소 사슬 또는 친수성기로 변형된 분자 모터의 클래스와 관련있다.
미국특허 출원 공개 US 2002/0110486A1 및 US 2003/0031594A1은 질 보장 목적을 위해 활용되는 다수의 반응 영역을 포함하는 시험 스트립을 개시한다. 시험 스트립은 약 20μL의 부피를 필요로한다. 그러나, 만약 사용자들이 자주 시험한다면, 응고 요법에 적절한 관리가 요구되는 것처럼, 이러한 많은 양의 시료부피들이 비실행적이고 불이익하다.
PCT/EP 2004002284는 약 0,5μL의 매우 작은 시료 부피를 필요로 하고, 통합된 보정 시스템이 제공되는 적어도 두개의 검출 영역들이 있는 시료 분배 시스템을 갖는 혈액과 같은 생리학적 유체 내 글루코스와 같은 검체의 정량적 측정 및 포토메릭 검출을 위한 건조 시약 시험 요소(dry reagent test element)를 개시한다.
그러나, 혈액 시료의 응고의 측정에 적절하고, 통합된 질 조절 수단이 제공되고, 적은 시료 부피만이 필요한 시험 시스템은 이제까지 존재하지 않았다.
그러므로, 스트립에 혈액을 적용하는 것과 같은 오직 최소한의 단계를 필요로 하고, 그에 따라 '온-스트립'(on-strip) 질 조절을 위한 수단을 포함하는 정확한 시험 결과의 자동적인 계산을 제공하고, 오직 적은 양의 시료를 필요로 하는 전체 혈액 응고를 측정하기 위한 시험 시스템을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명의 또 하나의 목적은, 많고, 복잡한 생산 단계를 포함하지 않고, 그러므로, 자가-모니터링 혈액 응고 및/또는 의사의 작업분야에서, 환자를 돕는 제품에 유용하고 비싸지않은 응고 시험 요소를 위한 생산 공정을 제공한다.
발명의 요약
그리하여, 본 발명은, 서로 대향되는 소정의 거리를 두는 제1 표면 및 제2표면을 가지고, 상기 두 표면들이 거의 합동형으로 정렬된 고표면 에너지 및 저표면 에너지의 영역을 형성하는 거의 실질적으로 동등한 패턴들을 가지고, 이것에 의해 고표면 에너지 영역들이 적어도 1개의 검출 영역이 있는 시료 분배 시스템을 형성하고, 여기서 상기 제1 및/또는 제2 표면의 검출 영역들은 적어도 1개의 응고 자극 시약들이 제공된 것인, 혈장 또는 전체 혈액 샘플 내에 응고를 측정하기 위한 시험 요소를 제공한다.
다른 면에서, 본 발명은 응고 시험 요소를 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 면에서, 본 발명은 응고 시험 요소 및 스트립 질 조절 상에 제공에 의해 세계 표준에 따른 입증된 결과를 제공하기 위해 간단화된 형태를 이용하는 혈액 응고 어세이를 수행하기 위한 계량(meter) 장치로 구성된 응고 시험 시스템을 제공한다.
본 발명의 특징 및 이점을 더 잘 이해하는 것은 후술하는 예시하는 상세한 설명과 첨부된 도면과 관련하여 바람직한 실시예를 참고하여 얻어질 것이다.
본 발명의 상세한 설명
도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 응고 시험 스트립 (1)은 기층 (2), 기층(2)를 덮는 중심층 (3), 및 상기 중심층 (3)을 덮는 커버층(4)를 포함하는 다중층 배열이다. 중심층 (3)은 단절부(5)를 나타내고, 이것은 기층 (2)와 커버층 (4)를 연결하는 속이빈 공동(cavity)을 형성한다. 이러한 공동안에, 응고 시험 스트립의 한쪽 면에 위치한 시료 적용 영역 (9)와 연결되는 시료 분배 시스템 (6)이 위치해있다. 사용자와 접하는 시료 적용 영역 (9)는 바람직하게는, 시료의 쉬운 적용을 위해, 응고 시험 스트립의 한 주요면으로부터 뻗어나가는 볼록커브 (10)에 의해 형성된다. 응고 시험 스트립의 두번째 주요한 면상에 시료 적용 영역 (9, 10)의 반대편에는 생리학적 또는 수용성의 유체가 소정의 검출 영역들 (6a, 6'a)에 분배되는 동안 공기를 교환하게 하는 에어 벤트 (air vent) (11)이 위치해있다 (도 3). 구성은 응고 시험 요소 내에 사용되는 상당한 양의 소정의 검출 영역들과 독립하는 오직 하나의 에어 벤트를 필요로한다는 것을 알려져있다. 고표면 에너지 영역들이 있는 시료 분배 시스템, 시료 적용 영역, 에어벤트, 중심층 및 중심층 내 단절부의 상기 설명된 요소들은 총 응고 시험 요소를 형성하고, 이것은 소정의 검출 영역들에 적용된 생리학적 또는 수성의 유체의 분배를 발휘하기 위한 내부적인 모세관 현상을 일으킨다.
덧붙여, 응고 시험 스트립 (1)은 프로트롬빈 시간 (PT) 및 활성 부분 트롬보플라스틴 시간 (APTT)와 같은 상이한 파라미터들을 측정하기 위한 여러 종류의 시험 스트립들 사이에 구분하는데 유용한 표시 특징부(레지스트레이션 (registration) feature)들 (7,8)을 갖는다. 이것에 의해 다중 검체 미터(meter)는 상이한 파라미터들의 측정에 필요한 스트립 삽입상에 선택가능한 파라미터들이 있는 특별한 프로그램 또는 방법들을 구동하기 위해 명령될 수 있다. 도 3에 나타난 바와 같이, 이것은 도 1 및 도 2의 다중층 정렬을 분해전개도로 나타낸 것으로, 기층(2)은 제1 표면(2a)을 제공하고, 커버층(4)은 제2 표면(4a)을 제공한다. 상기 제1 표면(2a) 및 제2 표면(4a)은 시료분배 시스템(6)이 형성될 것인 영역들로 패턴되어 있다. 상기 시료분배 시스템(6)의 패턴은 소정 개수의 검체 검출 영역 (6a) 및 시료통로(6b)를 포함하고, 이것은 상기 다중층 정렬의 어셈블리와 거의 합동(congruent)하도록 정렬되고 바르게 정합된다. 상기 중심층(3)은 기층(2)의 제1표면(2a)과 커버층(4)의 제2표면(4a) 사이 거리를 결정하고, 상기 기층(2)의 제1표면(2a)과 커버층(4)의 제2표면(4a)과 함께 속이 빈 동공(hollow cavity)을 형성하기 위한 단절부(5)를 가지고 있다. 상기 제1표면 (2a) 및 제2표면(4a) 사이에 형성될 상기 시료분배 시스템(6)은 상기 기층(2)의 제1표면(2a)과 커버층(4)의 제2표면(4a)과 중심층(3)의 단절부(5)에 의해 형성되는 속이 빈 공동 내에 위치된다. 바람직하게, 상기 속이 빈 공동은 실질적으로 시료분배 시스템 보다 의도적으로 더 크다.
중심층의 단절부(5)의 목적은, 오직 시료분배 시스템(6)을 위한 공동을 형성하는 것이므로, 중심층(3)의 단절부(5)는 다른 형태들을 가질 수 있다; 그 예들이 도 4에 나타나 있다. 도 4a는 우산 모양의 응고 시험 요소 공동(12)을 나타내고, 도 4b는 직각의 응고 시험 요소 공동(13)을 나타내고, 도 4c에서는, 시료공동(14)이 원형모양이다. 상기 중심층(3)의 단절부(5)는 소정의 검출 영역들(6a)의 크기 및 시료분배 시스템(6)의 통로들(6b)의 크기에 영향을 받지않고, 그러므로, 필요한 시료부피에 영향을 미치거나 변화를 주지 않는다. 상기 시료분배 시스템(6)과 비교해보면, 도 4에 나타난 공동 형태는 다소 간단하고, 그리하여, 다소 등록 정확도 (레지스트레이션 (registration) accuracy)가 적게 요구되는 빠른 프로세싱과 간단한 펀치 툴(punch tool)들의 적용을 허용한다.
상기 기층(2)의 제1표면(2a)과 커버층(4)의 제2표면(4a)과 중심층(3)의 단절부(5)에 의해 형성되는 공동 내에 위치되는 시료분배 시스템(6)은 상기 표면들 (2a과 4a) 상에 고표면 저표면 에너지의 영역들을 형성함으로써 형성된다. 상기 커버층(4)의 제2표면(4a) 및 상기 기층의 제1표면(2a) 상에 고표면 및 저표면 에너지의 영역들은 서로 거의 합동이 되도록 정렬되고 맞춰진다. 적용된 생리학적 유체 또는 다른 수용성의 샘플들이 오직 고표면 에너지 영역들에만 젖기 때문에, 그것은 그리하여 상기 기층(2)의 제1표면(2a)과 커버층(4)의 제2표면(4a) 사이 및 시료분배 시스템(6)의 소정의 검출 영역들 (6a) 및 흐름 통로(6b) 내에 가두어진다.
도 5a는 소수성 “가이드 요소(guiding element)”를 이용한 시료분배 시스템 (6)의 구성을 나타내고 있다. 본 발명의 응고 시험 요소의 일 구체예에서, 기층(2) 및 커버층 (4)는 소수성 층(16)이 코팅되어 있는데, 이는, 시료통로 및 검출 영역이 될 영역은 제외한 것이다. 소수성층(16)은 저표면 에너지를 가진 영역을 형성하고, 이것은 적용된 시료유체(15)에 반발력을 발휘할 것이고, 시료유체(15)를, 그러므로, 시료분배 시스템을 형성할 고표면 에너지의 영역으로 가둔다.
바람직하게는, 상기 소수성층(16)은 생리학적 또는 수용성의 시료유체(15)가 적셔지기 쉬운 친수성 표면(2a, 4a)에 적용된다. 상기 기재된 절차는 친수성 표면을 필요로하고, 이것은, 셀로판 또는 유리와 같은 자연적인 친수성 폴리머, 뿐만 아니라, 일반적인 폴리머들의 소수성 표면 (예들은 아래에서 주어진다)들로부터, 이산화 규소(silicon dioxide), 이산화 에틸렌(silicon dioxide), 에틸렌 글리콜 (ethylene glycol), 피롤 또는 아크릴산과 같은, 진공에서 증발될 수 있는 친수성 모노머들의 물리적 또는 화학적 혈장 증착 또는 코팅 프로세스를 이용하여, 소수성 표면에 친수성을 주는 것에 의해, 생산가능하다. 다음으로, “가이드 요소”의 상기 패턴은 상기 기층 및 커버층들의 친수성 표면들에 소수성 잉크를 프린트하는 것에 의해 실현될 수 있다.
적절한 소수성 잉크는 전형적으로 100° 초과의 결합각을, 전형적으로 25mN/m 미만의 표면 에너지를 가지고, 전형적으로, 소수성 기능, 소수성 첨가제들, 또는 소수성 색소 및 충전제들이 있는 폴리머들, 올리고머들, 모노머들을 포함한다.
도 5b는 친수성 통로를 이용한 시료분배 시스템의 또 다른 구성을 나타낸 것이다. 상기 응고 시험 요소들의 일 구체예에서, 자연적으로 소수성 기층(2) 및 커버층(4)은 친수성층 (17)화합물으로 코팅되고, 이것에 의해 고표면 에너지를 형성한다.
상기 소수성 표면(2a, 4a)에 프린트된 상기 친수성층(17)은 생리학적 또는 수용성의 유체에 의해 매우 적셔지기 쉽다; 그리하여, 상기 시료분배 시스템의 친수성 통로를 형성하는 고표면 에너지 영역들은 시료 유체를 분리되어 있는 검출 영역들에 운송하기 위해, 적용된 생리학적 또는 수용성 시료 유체(15)에 양성 모세관 현상을 발휘한다.
상기 친수성층 (17)은 소수성 표면에 친수제 또는 양성제(amphiphilic agent)가 프린팅된 것에 의해, 실현될 수 있다. 친수성 기능이 있는 잉크는, 물 또는 알코올과 같은 극성 용매에 용해가능한, 고분자 폴리머들과 그 혼합물들의 넓은 선택으로부터 실현될 수 있다. 특히 유용한 것은, 알지네이트(alginate), 셀룰로오스(cellulose), 히드록시에스틸 셀룰로오스(hydroxyethyl cellulose), 고무질(gum), 폴리알코올, 폴리에틸렌-글리콜, 폴리에틸렌-옥사이드, 비닐피롤리돈, 폴리스티렌 설포네이트(polystyrene sulfonate), 폴리설포네이트, 알킬-포스포콜린 알킬-포스포콜린 유도체(alkyl-phosphocholine derivatives) 및 다른 것들; 특히, 유용한 것은 또한, 유기-변형된(organo-modified) 실리콘 아크릴레이트이고, 이것은 유기-변형된 폴리실록산(polysiloxane), 및 불화된(fluorinated) 계면활성제들의 가교가능한(cross-linkable) 종들이다. 적절한 코팅은 물과 전형적으로 35° 미만의 결합각을 제공하고, 전형적으로 50mM/m 초과의 표면 에너지를 제공한다.
상기 프린팅 과정에 기판으로 적절한 기층(2) 및 커버층(4)는 유리, 폴리비닐 아세테이트(polyvinyl acetate), 폴리메틸-메타아크릴레이트 (polymethyl-methacrylate), 폴리-디메틸-실록산(poly-dimetyl-siloxane), 폴리에스터들(polyesters) 및 플루오렌 고리(fluorene rings)를 포함하는 폴리에스터 레진(polyester resins), 폴리스티렌(polystyrenes), 폴리카보네이트(polycarbonate) 및 폴리카보네이트-폴리스티렌 그래프트 코폴리머(polycarbonate-polystyrene graft copolymer), 터미널 변형된 폴리카보네이트(terminal modified polycarbonates), 폴리올레핀 (polyolefin), 시클로올레핀(cycloolefins) 및 시클로올레핀 코폴리머 (cycloolefins copolymer), 및/또는 올레핀-말레이미드 코폴리머(olefin-maleimide copolymer)이다.
상기 기판이 중간 소수성 특징을 가지고 있는 경우에, 그 주변을 둘러싸는 소수성 패턴을 가지는, 친수성 통로들의 프린팅은, 즉, 도 5a 및 도 5b의 구성의 조합은 또한 가능하다.
또 다른 구체예에서 (나타나진 않았으나), 제1표면 또는 제2표면은 친수성/소수성 패턴이 제공되어 있고, 반면에서 대응하는 표면은 소수성 영역들로 둘러싸여진 친수성 픽셀의 균질한 패턴을 제공하고, 이것에 의해, 반친수성(semihydrophilic) 특징 및 반소수성(semihydrophobic) 특징을 갖는 (양성 (amphiphilic) 특징) 표면을 형성하고, 이것은 제1표면의 친수성 및 소수성 패턴을 제2표면의 동등한 친수성 및 소수성 패턴과 정렬시킬 필요성을 제거한다. 이러한 양성 표면의 특성들은 친수성 및 소수성 영역 사이의 전체적인 비(ratio) 및 친수성 픽셀의 기하학적 패턴에 의해 쉽게 고안될 수 있다. 개시된 발명에, 상기 양성 특징, 각각 친수성 픽셀 및 소수성 영역 사이의 비(ratio),는 단지 반대표면이 친수성 특징을 제공한다면, 시료유체가 친수성 픽셀로부터 친수성 픽셀로 진행하는 것이 고안된다. 만약 반대 표면이 소수성 특징을 제공한다면, 응고 시험 요소의 모세관 갭(capillary gap) 내에 유체의 움직임은 정지할 것이다. 이러한 메커니즘은 상기 기재된 방법이 제1표면과 제2표면에 제겅된 시료분배 시스템의 대응하는 패턴의 정확한 등록의 엄격한 요건없이 기능적인 응고 시험 요소를 형성하게 허용한다. 그러나, 바람직하게, 상기 시료분배 시스템의 친수성 통로들 내에 시료유체의 빠른 분배가 되도록, 고표면 및 저표면 에너지의 동등한 패턴이 제1표면 및 제2표면에 제공된다.
또한, 제1표면 및 제2표면에 두께를 약 세배 내지 다섯배 증가시켜, 친수성 층을 단순히 프린팅하는 것에 의해, 또는 모두 동등한 엠보싱(embossing), 또는 에칭(etching)에 의해 저표면 에너지의 영역들로부터 제1 및 제2표면의 고표면 에너지 영역들을 물리적으로 올리는 것이 가능하다. 이러한 올림(elevation) 때문에, 상기 친수성 통로들의 모세관 갭은 둘러싸는 영역과 관련하여 점점 작아지고, 상기 시료유체에 높은 모세관 힘을 발휘한다.
상기 바람직한 구체예의 응고 시험 요소에 포함된 상기 시료분배 시스템을 위한 부피 요건은 매우 낮은 0.5㎕~1.0㎕이고, 검출 영역당 오직 약 100nL~150nL를 요구하고, 고표면 및 저표면 에너지 영역인지는 소수성 가이드 요소 또는 친수성 통로에 의해 또는 상기 조합에 의해 형성된다. 그러나, 기술분야에 당업자에게, 상기 시료분배 시스템의 부피는 소정의 검출 영역의 수에 따라 , 또 다양한 디자인에 따라 다양할 것이라는 것은 자명하다.
도 6은 시료 분배 시스템의 상이한 패턴들을 나타낸 것으로, 이것은 도 5b에 설명된 바와 같이 친수성 통로에 의해 또는, 도 5a에 설명된 바와 같이, 소수성 "가이드 요소"에 의해 실현될 수 있다. 선택된 시료 분배 시스템은 이용된 검출 화학을 위해서 측정되는 선택된 생리학적 파라미터들에 적합할 필요가 있다.
그리하여, 시료 및 표준 측정의 반복은 줄 II 내지 IV에 나타난 실시예와 함께 특정 혈청 또는 전체 혈액 시료에 가능하다. 마찬가지로, 프로트롬빈 시간 및 활성화된 부분 트롬빈 시간과 같은 2개의 응고 파라미터들의 측정을 위하여 줄 IV에 제공된 응고 시험 요소를 이용하는 것이 가능하다.
상기 언급한 바와 같이, 피브린 엉긴 덩어리 (clot)의 형성은 하기 나타낸 봐와 같이 혈액과 트롬보플라스틴 및 칼슘이온과의 반응 사이의 반응에 좌우된다:
트롬보플라스틴 + Ca++ + 혈액 (또는 혈장 ) -> 피브린 엉긴 덩어리 (clot) (반응 1)
반응 (1)이 일어나기 위해, 커버층 (4)의 제2 표면 (4a) 또는 기층 (2)의 제1 표면 (2a)의 시료 분배 시스템 (6)의 검출 영역 (6'a)들은, 그것들이 도 5a 및 도 5bdp 나타난 바와 같이, 조성물들 (18, 19)로 코팅되고, 이것이 혈액 시료에 응고 반응의 촉진 및 검출을 허용한다는 점에서 특징이 있다.
본 발명의 시험 요소의 일 구체예에서, 조성물 (18)은 트롬보플라스틴 (예를 들어, Dade Behring Holding GmbH, Hochster Strasse 70, 65835 Liederbach, Germany로부터 이용가능하다)와 같은 응고 자극 시약을 포함하고, 반면 조성물 (19)는 칼슘 이온을 포함한다. 응고 자극 시약은 검출 영역 내 혈액의 응고를 위한 촉진자이고, 그리하여 투과 (transmission), 흡광 광도 (absorbance photometry), 또는 광 산란에 의한 광학적 성질의 측정을 허용한다.
프로트롬빈 시간 또는 활성화된 부분 트롬빈 시간은 광 흡수도 또는 광 산란의 변화에 의해 모니터될 수 있다. 응고 과정 동안에, 피브리노겐은 적혈구 및 혈소판의 이전에 임의적인 분배를 대부분 관련된 단계로 강요하는 피브린으로 전환되고, 이것에 의해, 적혈구 및 혈소판이 가둬지고, 혈액 엉긴 덩어리 (clot)이 형성되는 동안 서로 피브린 파이버들과 연결된다. 혈액 시료의 물리적 일관성의 이러한 변화는 산란 중심의 감소를 가져오고, 그러므로, 조사되는 혈액 시료의 혼탁도 및 광흡수도 상에 변화를 가져온다. 광 흡수도의 변화를 측정하기 위해, 도 7a에 나타난 검출기 배열은 적절하다.
도 7a는 도 5b에 따른 응고 시험 요소 내에 시료의 광학적 밀도를 측정하기 위한 검출기 배열이다. 이 배열은, 광원 (20)을 포함하고, 이것은 시료 검출 영역의 방향으로 어떤 파장의 빛 (24)을 방출한다. 그 광원 (20)으로부터 발광된 빛은 예를 들어, 디퓨저 (diffuser) 또는 렌즈와 같은 광학적 배열 (21), 조리개 (22), 검출 영역의 기층 (2), 시료 (15) 및 커버층 (4)를 통과하고, 검출기 수단 (23)에 의해 장치의 반대편에서 검출된다.
다른 구체예에서, 응고 시험 요소는 추가적인 질 조절 측정을 제공하기 위해, 하나 이상의 측정을 수행하도록 고안된다. 이 경우, 응고 시험 요소는 적어도 두개, 바람직하게는 3개의 응고 검출 영역들을 제공한다. 바람직하게, 제1 표면 (2a) 상에 모든 검출 영역들 (6'a)는 피브린 엉긴 덩어리 (clot)을 형성하기 위한 화학적 서분들 사이에 반응을 촉진하는 트롬빈과 같은 응고 자극 시약 (18)로 코팅하고, 반면, 예를 들어 6a2와 같은 제2 표면의 하나의 시료 검출 영역은 빠르고 완벽한 응고를 촉진하는 응고 가속제(양성 대조군)를 포함하는 화학적 조성물로 코팅하고, 그리고 6a3과 같은 제2 표면 (4a)의 다른 검출 영역에는 혈액 응고를 막는 응고 저해제 (음성 대조군)를 포함하는 화학적 조성물이 제공된다.
반응 (1)이 일어나기 위해, 상당량의 트롬보플라스틴, 칼슘이온 및, 만약 필요하다면, 응고 저해제 또는 가속제와 같은 질 조절 조성물들을 정확하게 상기 시료 검출 영역들에 투여한다. 잉크 젯 프린팅 기술과 같은 다른 기술들이 당업자에게 널리 알려져 있다고 하더라도, 바람직하게, 상기 투여는 드롭 온 디멘드 (drop on demand) 증착 방법에 의해 수행된다. 시료 검출 영역에 적용된 응고 자극 시약의 정확한 투여는 적절한 반응 절차 및 응고 반응의 종점의 신뢰할만한 계산을 위해서 중요하다. 예를 들어, 예시적인 실시예로, 상당량의 트롬보플라스틴은 각각의 시료 검출 영역에 걸쳐 일정하며, EDTA와 같은 응고 저해제의 농도는 변화가능하다.
본 발명의 시험 요소의 다른 구체예에서, 트롬보플라스틴의 투여에 더하여, 응고 저해제 또는 가속제와 같은 질 조절 조성물 및 칼슘 이온, 형광 검출에 도움을 주는 추가적인 성분이 제1 표면 및/또는 제2 표면 (2a, 4a)의 시료 검출 영역들에 적용가능하다. 만약 상기 검출 영역들이 소위 형광 분자 로터들로 채워진다면, 응고 반응은 형광에 의해 모니터될 수 있다.
형광은 어떤 물질로부터 나온 광의 발산이고, 분자의 첫번째 여기 상태로부터 일어난다. 개시화 공정에서, 그러한 분자는 빛의 흡수에 의해 여기된다. 뒤따르는 몇 나노초동안에, 그 분자는 다시 바닥 상태로 돌아오고, 형광이라고 부르는 빛의 발산에 의해 또는 그 분자의 골격(backbone)의 회전 및 운동에 의해 여기 에너지를 소진한다.
형광은 전형적으로 방향족 분자들로부터 일어난다. 400 내지 800nm 사이의 범위에서 가시광선을 흡수하는 방향족 분자들은 색깔을 나타낸다. 또한, 발색단 (chromophore)은 모든 분자의 흡수 및 발광 성질을 결정하는 염료의 일부이다. 특정 발색단의 발광의 양 또는 강도는 그것의 형광 양자 효율에 의해 정량된다. 형광 양자 효율은 흡수된 양자수에 관한 발광된 양자 수로 정의된다. 일반적으로 사용되는 형광 염료의 넓은 범위는 고정된 양자 효율을 갖고, 이것에 의해 100% 발광 효율에 근접하는 큰 양자 효율을 가진 모든 염료들은 텍사스 레드로 알려져 있는 설포로다민 101 (Sulforhodamine 101)과 같은 가장 밝은 발광을 나타낸다.
발색단의 말단에 가용성 그룹을 갖는 염료는 분자 로터로 알려져 있고, 용매의 점도 상에 형광 양자 효율의 의존성을 나타낸다. 용매의 점도가 증가할수록, 염료의 형광 양자 효율은 증가한다. 이러한 효과는 점도 증가에 의해 낮아지는 발색단의 말단에 가용적이고, 비-경직 (non-rigid)인 그룹의 운동 때문이다. 발색단에 결합하는 측기의 더 많은 운동성은 방해받을수록, 염료 분자는 그 분자의 뼈대의 운동을 통해 바닥 상태로 풀어질 수 없고, 빛의 발산에 의한 여기 에너지를 소진할 수 없다. 용매의 점도에 민감한 형광 염료의 예들로는 크산텐, 옥사진 및 카보피로닌 (carbopyronine) 염료 클래스에서 찾을 수 있다.
그 효과는 점도가 증가함에 의해 낮아지는 디에틸아미노기의 이동성때문으로 돌릴 수 있다. 크산텐 클래스 내에 그러한 염료의 일 예로는 아래 화학 구조와 같이 나타나있는 로다민 B가 있다:
Figure 112008015340083-PCT00002
아래 화학적 구조식은 반응 1의 시약과 접촉에 의해 그 다음에 낮아지는 디에틸아미노기의 운동성의 한 방식으로 나타난다. 그 시약이 피브린 엉긴 덩어리 (clot), 즉, 생리학적 유체의 응고의 형성에 이르기 때문에, 시료의 점도는 증가하고, 다음으로, 분자의 형광을 증가시킨다. 발색단의 말단에 표시된 디에틸아미노기들은 비경직적이고, 결합 주변에 표시된대로 회전한다. 이러한 운동이 응고 때문에 증가되는 점도에 의해 강하게 방해받을 때, 염료의 형광 발광은 증가한다.
Figure 112008015340083-PCT00003
개시된 발명에 관하여, 점도 변화에 민감한 형광 프로브들은 가장 유용하다. 분자적 로터의 추가적인 예들로, 아우라민 O (auramine O), 크리스탈 바이올렛 4 (crystal violet 4), p-N,N-디메틸아미노벤조니트릴 5 (p-N,N-dimetylbenzonitrile 5), p-N,N-디메틸아미노벤조니트릴 6 (p-N,N-dimetylbenzonitrile 6), 주로리디네벤질이데네말로노니트릴 (julolidinebenztlidenemalononitrile), 로다민 19 (rhodamine 19), 로다민 G6, 로다민 B, 옥사진 1 (oxazine 1), 옥사진 4, 옥사진 170이 있다. 그 분자적 구조는 도 8에 나타난 바와 같다.
반응이 형광에 의해 모니터되는 경우에, 광원과 검출 영역들이 서로 반대로 배열되는 것이 아니라, 오히려, 도 7b에 나타난 바와 같이, 최대 민감도를 얻기 위해, 다소 약 90도의 각으로 배열되는 것이 가장 바람직하다. 광원과 검출 수단 사이의 바람직한 각도는 80 내지 120도이고, 하지만 가장 바람직하게는 약 109도이고, 응고 시험 요소는 광학적 검출 배열에, 검출 영역의 서로 다른 표면들에 내부적 반사 (reflection) (또는 좀더 일반적으로 응고 시험 요소의)때문에 배경 노이즈를 줄이기 위해, 기층 및 광원 사이의 각과 커버층 및 검출 수단 사이의 각도가 약 54도로 배치된다. 완전한 작동을 위해, 상기 검출기 (23)는 여기 및 발광 파장 사이의 차별을 두기 위해 광학적 필터들 (21a와 22a)이 있는 광학적 배열 (21 및 22)에 덧붙여서 배치되고, 그리하여, 검출 수단은 광원에 의해 발생되는 광파 (24a)가 아닌 형광 염료로부터 나오는 빛 (24)을 볼 수 있을 것이다. 비록 그럴지라도, 당업자가 실제 각도가 특정 적용, 필요한 감도 및 측정 장치의 계량 (meter)의 조건을 위해 최적화되었다고 알 수 있을 것이다.
응고 시험 요소 (1)은 정확한 프로트롬빈 시간 측정을 위해 필요한 적어도 1개의 검출 영역 (6a)을 가지고, 하지만, 바람직하게는, 검출 영역들 (6a1-6a3)이 활용될 수 있다. 응고 시험 요소 (1)의 물리적 구성은 다양한 검출 영역들에 적용된 화합물의 용액 내에 가용성을 허용한다. 예를 들어, 검출 영역 (6a-6c)은 기층 (2)의 제1 표면 (2a)에 적용된 트롬보플라스틴과 같은 서로 다른 농도의 응고 시약을 갖는 반면, 칼슘 이온 및 형광 분자 로터는 커버층 (4)의 제2 표면 (4a) 상에 적용될 수 있다. 대안적으로, 모든 시약들은 응고 시험 요소 (1)의 커버층 (4)의 제2 표면 (4a) 또는 기층 (2)의 제1 표면 (2a)에 적용될 수 있다.
혈액 또는 혈장과 같은 생리학적 유체가 시료 적용 영역 (9)에 적용되고, 모세관 현상에 의해 검출 영역으로 분배된 후에, 그것은 제2 표면 (4a)의 소정의 검출 영역상에 조성물 (19)에 포함된 EDTA와 같은 잠재적인 응고 억제제 및/또는 분자 로터 뿐만 아니라, 제1 표면 (2a)의 검출 영역상에 조성물 (18)에 포함된 응고 인자 시약을 용해하여, 제2 표면 상에 제공된 칼슘 이온 플러스 추가적인 물질 및 트롬보플라스틴과 같은 응고 억제 시약 및 혈액 또는 혈장 의 혼합물을 형성한다.
바람직하게, 소정의 검출 영역들에 적용된 응고 자극 시약들은 혈액과 같은 생리학적 유체에 의해 쉽게 용해가능하고, 모든 성분의 빠른 확산 혼합을 허용하기 위해 서로 가깝게 위치하고, 그리하여 응고 반응을 형성하는 빠른 포토메트릭 측정을 가속화 하기 위해 검출 영역들에 포함된 성분들의 빠른 반응을 가능하게 한다.
만약 둘 이상, 바람직하게는 3개의 시료 분배 시스템 내 배열된 시료 검출 영역들이 있다면, 예를 들어, 6a1과 같은 하나는 프로트롬빈 시간 또는 활성화된 부분 프롬보플라스틴 시간을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 6a2와 같이 추가적으로 시료 검출 영역은 제2 표면 (4a) 상에 응고 억제제를 이용하여 또는 제1 표면 (2a)상에 응고 자극제를 생략하여, 음성 대조군을 제공하도록 배치될 수 있고, 이것에 의해, 6a3과 같은 추가적인 시료 검출 영역은 심지어 혈액이 응고 결핍이 있더라도, 혈액 응고를 미미킹(mimicking)하는 젤링제 (gelling agent)와 같은 응고 가속제를 사용하는 양성 대조군을 제공하도록 배치될 수 있다. 그리하여, 측정 장치의 처리수단은 시료의 측정 결과와 잘못된 측정을 가리키거나 분명한 결과를 허용하는 두개의 제공된 기준과 비교한다.
도 9는 형광 프로브 및 검출 보조제로써 분자 로터를 이용한 응고 시간의 개략적인 측정 및 평가를 나타낸다. 이 도면은 혈액 시료 (27)과 관련된 측정 신호와 혈액 엉긴 덩어리 (clot)의 충분한 형성 후 성취가능한 최대의 형광을 제공하는 양성 표준 (26)과 비응고된 혈액 시료와 관련된 최소의 형광 신호를 제공하는 음성 표준 (25)과의 비교를 나타낸다. 시료 적용 영역 (9)상에 전체 혈액 시료를 적용한 후에, 혈액 시료 (15)는 도 3에 나타난 바와 같이, 상이한 시료 검출 영역들 (6a/6'a)로 시료 분배 시스템에 의해 형성되는 모세관 현상에 의해 이동된다. 시료가 기층 (2)의 제1 표면 (2a) 상에 제공된 응고 자극 시약을 용해할 것이고, 시료 검출 영역 (6'a1)에 채워진 후에, 즉시 시작하는 응고 반응을 허용한다. 측정 장치의 검출 유닛은 혈액 시료의 도입을 레지스터(register)하고, 그리하여 검출 장치의 처리 수단은 응고 반응의 시간 해결된 평가를 허용하는 것을 개시할 수 있다.
앞서 언급한 바와 같이, 6a2와 같은 하나의 시료 검출 영역은 시료 검출 영역 6a1 내 혈액 샘플의 측정 신호와 아무런 응집 반응을 나타내지 않는 혈액 시료의 측정 신호를 비교하는 수단을 제공하는 음성 표준으로 배치될 수 있다. 이러한 행동은 시료 검출 영역 (6'a2)내에 비응고 자극 시약의 증착에 의해 또는 시료 검출 영역 (6a2) 상에 응고 억제제의 증착에 의해 달성될 수 있다. 전형적인 응고 억제제는 리티늄 헤파린 및 EDTA의 소디윰염 또는 포타슘염이다.
반면에, 양성 표준은 응고 반응을 가속화시키는 것에 의해 또는 서로 다른 가교제가 있는 충분히 형성된 혈액 엉긴 덩어리 (clot)의 점도를 미미킹(mimicking)하는 것에 의해 실현될 수 있고, 이것은 비병원성 혈액 시료 보다 더 빠른 반응을 제공한다. 그리하여, 시료 검출 영역 6a1 내에 혈액 시료가 응고되기 전에 양성 표준 수치가 달성가능하다. 이런 종류의 가교는 제2 층 (4)의 제2 표면 (4a)상에 정확한 농도의 알지네이트를 제공하는 것이 달성될 수 있다. 혈액 시료 내로 칼슘 이온과의 반응 및/또는 기층의 제1표면에 제공된 추가적인 칼슘 이온 때문에 알지네이트는 혈액과 혼합될 것이고, 응고된 것을 겔화(gel)할 것이다. 그러나, 당업자는 다른 젤링제들도 적용가능할 것이고, 또한 이 반응에 유용할 것을 인식할 것이다.
반응동안, 측정 장치의 처리 수단은 시료 검출 영역 (6a1)의 해독을 음석 표준 (25) 및 양성 표준 (26)과 비교할 수 있다. 혈액 시료의 신호 측정, 시료 검출 영역 (6a1)에 의해 제공된, 양성 표준과 같은 크기에 달하자마자 (도 9의 숫자 (28)로 나타난) 측정 장치의 처리 유닛은 타이머를 멈추고 최종 결과를 평가할 수 있다. 또한, 처리 유닛은, 분석이 정화하게 수행되고, 사용자/환자에게 의미있는 자료를 제공한다는 것을 증명하기 위해, 처리 유닛은 몇몇 추가적인 품질 체크를 수행할 수 있다. 이러한 면에서, 처리 유닛은 양성 및 음성 표준들의 실제로 측정 수치를 비교하면, 이것은 최소한 및 전-프로그램화된 수치에 의해 분리될 필요가 있다. 만약, 상기 두 신호의 크기가 작아진다면, 장치는 측정이 성공적이지 못하다는 에러 메세지를 나타낸다. 또한, 장치는 응고 반응의 경사도 (27)을 계산할 수 있고, 그것을 다시 의사들에 의해 측정된 가장 극단 수치로 기재하는 몇몇 미리 프로그램화된 생리학적 수치들과 비교한다.
스펙트럼의 넓은 범위를 넘어 예를 들어, 광원으로서 할로겐 램프를 사용하는 것에 의해, 시료의 혼탁도를 모니터링하는 동안, 만약 시료 변화들이 흡광도에 의해 모니터된다면, 스펙트럼의 좁은 부분으로 모니터링 윈도우(window)가 제한되는 것은 유용하다. 도 10은 500 내지 700nm 사이의 전체 혈액의 스펙트럼을 나타낸 것이다. 스펙트럼의 우세한 특징은 520 내지 600nm 사이의 헤모글로빈 이중 피크(40)이다. 주로, 하나는 전체 혈액 스펙트럼의 주어진 부분에서 흡광도에 의해 응집반응의 진행을 측정할 수 있고, 숫자 (41)에 의해 나타난 600nm의 헤모글로빈 흡광도 범위의 바깥쪽 파장 길이에서 반응이 모니터된다면, 기술적인 측정 장치 상에 그것은 덜 요구될 것이다.
도 11은 600nm에서 흡광도에 의해 응고 반응의 예시적인 측정을 제공한다. 혈액은 시료 적용 포트 (9)를 통해 응고 시험 요소에 도입되고, 빛의 투과는 빠르게 줄어들고, 각각, 흡광도는 숫자 42에 의해 나타난 것처럼 빠르게 증가한다. 다음으로, 기층 (2)의 제1 표면 (2a)의 시료 검출 영역 (6'a)에 제공된 응고 조성물은 용해되고, 응고 반응은 상기 조직 인자 (조직 프롬보플라스틴)과 혈액 또는 혈장 시료와의 반응에 의해 개시된다. 여기에서 이 지점은 t=0으로 규정하고, 처리 유닛은 측정 자료를 기록하는 것을 시작할 것이다. 사건들 (42 및 43) 사이에 시간 주기 (period)는 지연 상태 (lag phase)로 이해될 수 있고, 시약들의 충분한 용해와 혈액 또는 혈장 시료와의 혼합은 성취되고, 조직 트롬보플라스틴은 외부적 경로의 일련의 응고인자를 유발시킨다. 일련의 인자 VII, 인자 X, 인자 V, 인자 II의 활성화를 볼 수 있다. 응고 캐스캐이드 (cascade)의 마지막 단계는 피브리노겐이 피브린으로 변환되는 사건 (43 및 44) 사이에서 모니터될 수 있다. 자주 피브린 엉긴 덩어리 (clot)은 안정적이지 않고, 안정기 (44)에 접어든 후에 나빠지기(deteriorating) 시작한다. 악화율 (deterioration) 및 양은 엉긴 덩어리 (clot) 내에 피브린 파이버의 양에 좌우되고, 환자마다 다양하게 변화한다. 일반적으로, 높은 점도의 혈액 시료는 낮은 점도의 혈액 시료보다 늦은 악화 (deterioration)를 나타낸다.
상기 실시예에 따른 프로트롬빈 시간의 결과 및 일반적으로 측정의 결과는 시간 주기 t1을 가리키는 사건들 (42-43) 사이 및 다음의 일반적인 식 1에 따르는 시간 주기 t2를 가리키는 사건들 (43-44) 사이를 평가하여야만 한다:
Figure 112008015340083-PCT00004
식 1
인자 a 및 b는 시간 주기 t 1 및 t 2 의 시간 주기에 비례하는 중량을 주기 위해 필요하고, 이것은 항상 f PT에 의해 주어진 결과 PT에 다른 비율들 때문이다. 이것에 의해 t 1 은 조직 인자의 용해를 주도하는 응고 조성물의 무활성 성분들의 종류에 의해 더욱 영향받고, t 2 는 칼슘 이온 농도 및 적용된 조직 인자 그 자체의 활성에 의해 대부분 영향받는다. 추가적으로, 시간 주기 t 1 및 t 2 모두는 반응 온도에 의해 조절되고, 이것은 이상적으로 37℃에 가깝게 맞춰져야 하고, 낮은 온도 형태는 응고 시간을 늘리게 될 것이다. 그러나, 손으로 하는 장치를 위해, 사람은 항상 운반가능성, 에너지 소비 및 실험 수행 사이에서 가장 좋은 해답을 찾아야만 할 것이다.
도 12는 본 발명에 연결되는 사용을 위한 미터 (80)의 간단화된 블록 다이어그램을 나타낸 것이다. 미터 (80)는 MAXQ 2000 마이크로 콘트롤러 (Dallas Semiconductor Corporation, 4401 South Beltwood Parkway, Dallas, Texas, USA로부터 이용가능한)와 같은 처리 유닛 주변에 고안될 수 있다. 처리 유닛 (81)은 다음의 조절 기능을 제공한다: (1) 전체 시스템의 시간 재기; (2)광 검출 수단으로부터 자료 처리하기; (3) 측정된 자료로부터 PT 시간 계산하기; 및 (4) 표시 수단 (83)에 PT 시간 또는 INR 수치를 산출하기. 기억 회로는 자료와 프로그램을 구동하는 처리 유닛을 저장한다. 표시 수단 (83)은 액체 크리스탈 또는 LED 디스플레이와 같은 다양한 형태를 취한다. 미터 (80)는 시작-정지 스위치를 또한 포함하고, 바람직한 경우, 시료를 적용하거나, 해독하거나 등을 위해 가리키기 위한 들을 수 있는 또는 눈에 보이는 시간 산출을 제공할 수 있다.
처리 유닛 (81)은 미터 (80) 응고 측정과 함께, 만들어 질 수 있도록 소프트웨어를 이용하여 프로그램될 수 있다. 광원 (20)으로부터 발광된 빛은 광학적 배열 (21)을 통해 통과하고, 검출 수단 (23)에 의해 검출된다. 처리 유닛(81)으로 프로그램된 소프트웨어는, PT 수치를 표준화하여 상이한 트롬보플라스틴 및 응고 분석기들이 동등해지기 위해, 1980년대 중반에 조직된, 국제 표준 지수 (international normalized ratio)로써 응고 시간을 계산하기 위한 알고리즘을 더 포함한다. 그 표현은 아래와 같다:
Figure 112008015340083-PCT00005
식 2
여기서, ISI는 국제 민감도 지수 (international sensitivity index)이고, PT 환자는 환자로부터 혈액 시료를 위한 응고 시간이고, 평균 정상 PT는 20여명 개인들의 평균 PT 시간이다. ISI 수치는 트롬보플라스틴의 상이한 제조들에 의해 주어진다.
본 발명에 따른 응고 시험 요소 (1)을 사용하는 방법은 도 12에 나타난 바와 같이, 미터의 블록 다이어그램을 참고하여 이해될 수 있다. 사용자는 그 위에서 통합될 수 있는 '만들기 위한 밀어넣기 (push to make)' 스위치를 일으킴으로써, 자동적으로 활성화되는 미터 (80)의 스트립 홀더 (82)내로 응고 시험 요소 (1)을 삽입한다. 요소상에 고안된 레지스트레이션 피쳐 (registration feature)는 요소 (1)이 올바른 위치에 위치되는 것을 보장하기 위해, 스트립 홀더 (82) 상에 레지스트레이션 피쳐와 연결된다. 임의적으로, 미터 (80)는 스위치를 누르는 사용자에 의해 활성화될수 있다. 따라서, 사용자는 핑거 프릭을 사용하고, 삽입되는 응고 시험 요소 (1)의 적용 영역 (9)으로 전혈을 적용한다.
본 발명에서 일어나는 시험에 필요한 혈액의 부피는 약 1μL 순이다. 소수성 표면에 프린트된 친수성제는 생리학적 또는 수용성의 유체에 의해 매우 적셔지기 쉽기때문에, 시료 분배 시스템의 친수성 경로를 형성하는 고표면에너지 영역들도 시료 유체를 분리된 검출 영역들에 운반하기 위해 적용된 생리학적 시료 유체 상에 양성 모세관현상을 일으킬 수 있을 것이다. 그러므로, 생리학적 시료는 각각의 검출 영역 (6a-c)에 빠르게 분배될 것이고, 그안에 응고 자극 시약을 활성화시킨다.
다음으로, 응고 시험 시간은 응고가 일어난 지점을 주기위해 광학적 성질들이 처리되고, 일어나기 위한 응고를 하게하는 응고 과정에서 검출 영역 (6a-6c) 내 시약은 은 도움을 주기 때문에, 응고 시험 시간이 시작한다.
응고 시험 요소의 제작 방법
본 발명의 응고 시험 요소는 스트립 형태로 바람직하게는 제작되는 것이며, 프린팅, 펀칭, 및 라미네이팅의 기술분야에 당업자에게 알려진 방법에 의해 쉽게 제작가능하다. 응고 시험 요소의 디자인은 간단하고 비용 경제적인 생산 공정을 허용하고, 이것은 바람직하게 하지만, 필수적으로 연속적인 본질은 아니다.
제작방법의 첫번째 공정에서, 시료 분배 시스템의 패턴 (6)은 기판 상에 높고 저표면 에너지 영역을 형성하는 것에 의해 형성된다. 첫번째 실시예에서, 제1 및 제2 표면들 (2a, 4a)에 시료 통로 (6b) 및 검출 영역들 (6a, 6'a)을 형성하는 고표면 에너지 영역은 기판의 소수성 표면에 친수성 조성물을 적용하는 것에 의해 형성된다. 앞서 설명한 바와 같이, 소수성 "가이드 요소"의 패턴을 친수성 표면에 적용함으로써, 고표면 및 저표면 에너지의 영역의 영역들을 형성하는 것 또한 가능하다. 바람직한 경우로, 기판은 상업적으로 이용가능한 투명한 폴리머 필름의 중간적인 소수성 특징을 갖는 것이고, 그것에 의해 시료 분배 시스템 및 시료 검출 영역들의 저표면 및 고표면 에너지 영역들은 바로 밑에 친수성 통로를 프린팅하는 것에 의해 형성되거나, 소수성 가이드 요소의 소수성 패턴에 의해 둘러싸인다.
기판은 유리, 폴리비닐 아세테이트, 폴리-메틸-메타아크릴레이트, 폴리-디메틸-실록산, 폴리스티렌, 폴리에스터 및 풀루오렌 고리를 포함하는 폴리에스터 레진, 폴리카보네이트 및 폴리카보네이트-폴리스티렌 그래프트 코폴리머, 터미널 (terminal) 변형된 폴리카보네이트, 폴리올레핀, 시클로올레핀 및 시클로올레핀 코폴리머, 및/또는 올레핀-말레이미드 코폴리머와 같은 재료로 형성될 수 있다.
소수성 기판상에 친수성 패턴의 적용 및/또는 친수성 기판 상에 소수성 "가이드 요소"의 적용 또는 이들의 조합은, 비접촉식 인쇄법, 분무법, 침지법, 또는 혈장 증착법, 특히 플렉소그라피법 (flexography), 석판 인쇄법, 그라비어법, 고체 잉크 피복법, 또는 잉크-젯-프린팅법에 의하여 수행된다.
그러나, 바람직한 제작방법은 플렉소그라피법으로, 이것은 로타리 프레스 (rotary presses) 상에 고해상 프린팅을 허용하고, 높은 속도의 생산을 뒷받침해준다. 그것은 폴리머 필름 기판상에 프린팅을 위한 정립된 기술이고, 패캐징 산업에서 널리 이용되고 있다. 도 8a 및 도 8b에 나타난 광학적 검출 공정은 친수성 패턴을 위한 낮은 점성을 가진 투명하고 분명한 잉크를 필요로한다. 낮은 점성의 가진 잉크는 얇은 심지어 약 2-4 마이크론의 코팅을 달성하는데 선호된다. 잉크의 광학적 윈도우는 화학 반응의 광학적 검출에 적절한 파장 범위에서 필요로 한다. 소수성 성질은 별도로 하고, 이러한 요건은 다소 엄격하고, 바람직한 색깔로 응고 시험 요소를 장식하는데 쓰일수 있고, 그리하여 비 투명한 잉크는 이러한 단계에 선호된다. 응고 시험 요소의 제작을 위한 4개의 칼라 플렉소그래피 인쇄 기계의 작동은 확립된 실행이고, 어떠한 작동적인 문제도 제공하지 않는다. 리쏘그라피 장치도 이와 같다.
응고 시험 요소의 제조를 위한 대부분의 편의는 잉크를 근거로 한 용매이고, 이것들은 다양한 제조자들로부터 많이 다양하게 이용가능하다. 또한, 모든 그러한 이용가능한 잉크는 요구되는 파라미터로 최적화하기 위한 색소 및 추가적인 첨가제로 미세하게 조절가능하다. 이러한 잉크들의 많은 것들은 니트로셀룰로오스 에탄올 또는 폴리비닐 부티랄 에탄올 혼합물에 근거하고, 예를 들어, Sun Chemical Inc. (35 Waterview Boulevard, Parsippany, NJ, USA) 또는 Flint Ink Inc. (4600 Arrowhead Drive, Ann Arbor, MI, USA)로부터 얻을 수 있다.
비록 용매에 근거한 또는 UV 경화 잉크가 응고 시험 요소를 제작하는데 적용될지라도, 전자빔 (EB) 경화 잉크는 몇몇 바람직한 성질을 갖는다. 이 잉크들은 기계적 및 화학적 요소들에 매우 높은 저항성을 제공하고, 100% 폴리머, 임의적으로, 색소와 함께 포함하되, 폭발성 유기 용매 및 광개시제를 포함하지 아니하고, 이것들은 센서 화학의 안정성에 영향을 주는 것을 입증되어왔다. 수행 특징에서 이러한 긍정적인 결과는 가교된 폴리머 필름을 형성하고, 표면을 관통하기 위한 전자들의 능력으로부터 유래된다.
EB 경화에 사용되는 잉크는 아크릴 모노머들 및 올리머들의 폴리머화 능력을 이용한다. 아크릴 화학은 현대 잉크에 특별한 중요성을 갖는다. (6 J.T. Kunjappu. "The Emergernce of Polyacrylates in Ink Chemistry," Ink World, February, 1999, p.40). 가장 간단한 아크릴 화합물인 아크릴산의 구조는 식 (I)과 같다.
CH2=CH-COOH (I)
아크릴 부분의 이중 결합이 전자와 반응하는 동안 열리고 (개시), 사슬을 형성하는 다른 모노머들과 반응하는 자유 라디칼을 형성하여 (연장), 고분자량 폴리머에 이르게한다. 이전에 설명한 것처럼, 방사(radiation) 그 자체가 어떠한 개시 종들도 코팅내에 남기지 않는 자유 라디칼을 형성하기 때문에, 방사 유도 중합(polymerization)은 외부 개시제가 필요없다.
2-페녹시에틸 아크릴레이트 및 이소옥틸 아크릴레이트와 같은 간단한 아크릴레이트 부터, 비스페놀 A, 에폭시 아크릴레이트 및 폴리에스터/폴리에테르 아크릴레이트 (R. Golden. J. Coatings Technol., 69 (1997), p.83)와 같은 프리-폴리머에 이르기까지 다양한 아크릴 모노머들이 EB 경화에 이용가능하다. 이러한 경화 기술은 용매 및 다른 잉크에 의해 요구되는 경화 화학의 필요없이, 이것은 디자인 공정을 복잡하게 할 수있고, 바람직한 화학적 및 물리적 성질에 초점을 맞춘 "기능적 잉크"의 디자인을 가능하게 해준다.
일반적으로 적절한 소수성 잉크는 모노머들, 올리고머들, 및 이소옥틸 아크릴레이트, 도데실 아크릴레이트, 스티렌 또는 실리콘 유도체와 같은 소수성 기능을 갖는 프리폴리머들, 부분적으로 불화된 탄소 사슬을 갖는 시스템, 그리고 추가적인 소수화 첨가제 및/또는 TEGO 프로브 시리즈 (Probe Series) (TEGO Chemie Service, Essen Germany)에 속하는 소수화제 (hydrophobing agent)와 같은 필러, 코퍼 프탈로시안 (copper phthalocyans), 카본, 그래피타이트와 같은 소수성 색소, 실리콘 변형 건식 실리카, 또는 PTFE 파우더, 및 PTFE 그라뉼과 같은 소수성 필러들을 포함한다. 매우 다양한 첨가제, 색소 및 필러들 때문에, 상기 제시한 화합물들은 오직 예시적인 특징들일 것이다.
친수성 기능을 가진 잉크는 에탄올 및 물에 용해가능한 폴리머들 및 폴리머 혼합물들의 다양한 선택으로부터 실현가능하다. 유용한 것은 알지네 폴리머 및 폴리머 유도체, 코폴리머, 알지네이트, 셀룰로오스와 셀룰로오스 에스터, 히드록시에틸 셀룰로오스, 검, 아크릴산, 폴리비닐알콜, 폴리에틸렌-글리콜, 폴리에틸렌옥사이드, 비닐피롤리돈, 폴리스티렌 술포네이트, 폴리(메틸 비닐 에테르/말레산), 비닐피롤리돈/트리메틸암모늄 코폴리머, 및 알킬-포스포콜린 유도체에 근거한 화합물들이다. 또한, 최적화는 유기-변형 실리콘 아크릴레이트 첨가제, 이것은 유기-변형된 폴리실록산의 가교가능한 종들, 및 불화된 계면활성제와 함께 달성가능하다. 일반적으로 적절한 코팅은 전형적으로 35° 미만의 물과의 접촉각 및 50mN/m 초과의 표면 에너지를 제공한다.
생산 공정의 두번째 공정은 시료 검출 영역에서 일정한 층을 형성하는 프린트가능한 및/또는 분배가능한 잉크를 생산하기 위한 추가적인 작용제 및 응고 자극인자를 포함하는 응고 조성물의 도포(applying)를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 기층 (2)의 제1 표면 (2a)에 트롬보프라스틴의 양은 정확하게 잉크 젯 프린팅과 같은 적절한 방법을 이용하여 투여한다. 실제로, 다른 투여 기술들도 본 발명의 목적에 따라 이용가능하다는 것은 당업자에게 자명하다.
반대의 표면의 모든 대응되는 시료 검출 영역들은 만약 기대되는 검출 형태를 위해 필요하다면 검출 보조자로서 형광 분자 로터 및 EDTA 또는 다른 응고 억제제, 알지네이트 또는 다른 응고 가속제를 적절한 양을 포함하는 필요한 품질 조절 조성물로 채워질 수 있다.
하지만, 소정의 시료 검출 영역들 (6a1 내지 6a3)에 적용된 응고 자극 시약의 총량, 농도 수준 각각은 다양하게 논의된 응고 시험 요소들의 민감도 및 다이나믹 영역에 대한 책임이 있고, 그 뿐만 아니라, 적용된 품질 조절 화합물의 정밀도 및 농도 수준은 테스트 결과의 정확도에 대한 책임이 있고, 상기 요소, 화합물 및 성분의 정확한 양과 함께 응고 테스트 요소를 제공하는 것이 본 적용에 주요한 것이다. 이러한 정확한 양은 (예를 들어, Vermes Technik GmbH & Co.KG, Palnkamer Str. 18-20, D-83624 Otterfing, Germany로부터 이용가능한) 미세 분배 시스템을 이용하여 수행가능하다. 이 코팅 조성물은 시료 유체의 도입 후에, 빠르고 잔기 자유로운 재구성을 허용하기 위한 액체 시료에 의해 매우 용해가능도록 제조되어야 한다.
다음 공정은 라미네이션 절차를 포함하는 것으로, 여기서, 시료 분배 시스템의 제1 및 제2 표면들을 나타내는 기층 및 커버층은 중심층에 라미네이트되고, 그것에 의해 기층 및 커버층의 제1표면 및 제2표면 사이의 거리를 결정한다. 중심층은 시료 분배 시스템이 기층 및 커버층의 제1 및 제2 표면상에 형성되는 영역들에 시료 분배 시스템을 위한 공동 (cavity)을 형성하기 위한 단절부 (discontinuity)를 제공한다. 기층 및 커버층의 제1 및 제2 표면 상에 형성된 높고 저표면 에너지의 패턴들은 제1 표면 및 제2 표면 사이에 기능적인 시료 분배 시스템을 형성하는 것이 가능하도록 거의 합동형으로 정렬되어야만 한다.
기층 및 커버층들의 정확한 xy-레지스트레이션 (registration)은 요소의 기능을 위한 중요한 과제가 되는 것으로, 만약 이 레지스트레이션 (registration)이 달성되지 않으면, 시료 분배 시스템은 적절하게 기능하지 않을 것이고, 특정된 시료 부피에 관하여 더 높은 다양성을 갖게 될 것이다. 좋은 수행을 위해서, 레지스트레이션 (registration) 허용(tolerance)은 친화성 통로의 너비의 +/-5% 내여야 한다.
도 13은 응고 시험 요소의 평면도 (top view, 왼쪽), 및 단면도 (오른쪽)와 레지스트레이션 질의 효과를 나타낸 것이다. 13a의 경우에, 시료 분배 시스템은 제1 표면 (2a) 및 제2 표면 (4a)의 친수성 통로들이 잘 정렬되어 적절하게 결합되어 있다. 부적절하게 정렬된 응고 시험 요소들의 결과는 도 13b에 나타나 있다. 비록, 기층 (2) 및 커버층 (4) 사이의 스페이서(spacer)가 13a 및 13b에서 동일하지만, 시료 유체가 시료 분배 시스템의 소수성 가이드 요소를 부분적으로 덮기 때문에, 시료 부피가 잘못하여 b의 경우 확장되어있다. 그 효과는 응고 시험 요소 내에 시료 유체에 의해 야기되고, 이것은 가장 바람직한 에너지 상태를 얻기 위해 공기에 접촉하는 표면 영역을 최소화하고, 그러므로, 소수성 영역의 효과가 우선시된다.
다른 구체예에서, 도 13c에 나타난 바와 같이, 커버층 (4)의 시료 분배 시스템은 기층 (2)의 시료 분배 시스템 보다 약 10% 작게 디자인되어, 응고 시험 요소의 총 시료 부피는 기층 시료 분배 시스템의 연장에 의해 정해지고, 이것은 요구되는 시료 부피의 정확도에 타협하지 아니하고, 제조동안 레지스트레이션 (registration) 공정을 위한 높은 인내(tolerance)를 허용한다.
중심층의 적용(application)은, 이것은 바람직한 80 마이크론의 두께를 가진 이중면 접착 테이프. 대안으로, 동등한 두께에 증착된 속건성 접착제 (hot melt adhesive)일 수 있는 것으로, 친수성 통로와 비교하여 재료 내에 상대적으로 큰 단절부 때문에 덜 요구된다. 레지스트레이션 (registration)은 특히 분당 수십 미터까지 몇미터로 기판이 진행하는 연속적인 생산 라인에 특히 중요하다. 기판 팽창 및 웹 텐션(web tension)은 x-방향 (웹 이동의 방향)의 레지스트레이션 (registration)을 웹 이동의 수직인 y-방향보다 더 어렵게한다.
제1 표면 및 제2 표면의 패턴의 정확한 레지스트레이션을 제공하는 가용성의 폴리머 필름의 제조방법이 도 14에 나와있고, 이것은 연속적인 웹 생산 공정의 일부를 나타낸 것이다. 도 14a에 따른 첫번째 생산공정은, 기층 및 커버층의 시료 분배 시스템 (6)의 패턴이 하나의 웹 기판 (49)에 프린트되고, 이것은 생산된 응고 시험 요소의 물질을 나타낸다. 도 14에 나타난 바와 같이, 시료 분배 시스템 (6)의 프린트된 패턴은 두개의 시료 분배 시스템이 대칭선으로부터 좌우가 서로 반대되도록 웹 기판 (49)상에 정렬된다. 임의적으로, 시료 분배 시스템은 시료 적용 영역을 형성하는 영역들에 연결될 수 있다. 그리하여, 소정의 검출 영역들 (6a, 6'a)의 위치는 서로 상대적으로 고정되어 있고, 물질 팽창 및 웹 텐션에 의해 영향받지않고 남아있다.
점선 (50)은 응고 시험 스트립들을 분리하기 위한 장래의 절취선들을 가리키는 것이고, 반면 점선 (51)은 스트립 작품(artwork)의 대칭선 및 웹 기판의 장래 접힘선을 가리킨다.
응고 시험 요소의 유체적 통로를 프린팅한 후, 시료 분배 시스템의 검출 영역들 (6a, 6'a)은 필요한 조성물로 코팅된다. 예를 들어, 응고 시험 요소의 제2 표면을 나타내는, 웹 기판 (49)의 높은 줄의 검출 영역들 (6a)은 품질 조절 조성물로 코팅된다. 품질 조절 코팅 조성물의 하나 (예를 들어, 6'a1)는 응고를 촉진 또는 억제하여 응고 분석의 소정의 결과를 가져오는 활성 화합물을 포함하지 않고, 반면 응고 시험 요소의 제1 표면을 나타내는, 웹 기판 (49)의 낮은 줄의 검출 영역들 (6'a)은 인식 요소를 포함하는, 응고 반응을 개시하는 조직 트롬보플라스틴을 포함하는 응고 조성물로 코팅된다. 조직 트롬보플라스틴 보다 다른 화합물이 시료 검출 영역 (6'a)에 코팅되는 특별한 경우는, 다른 응고 인자들의 기능성을 측정하기 위해 다른 위치들에서 응고 경로를 유발하고 활성화할 것이다.
그로부터, 추가적인 층은 예를 들어, 기층 (2)의 표면 (2a)과 같이 표면들의 하나에 라미네이트 되고, 도 14b에 나타난 바와 같이 응고 시험 요소의 중심층 (52)을 나타낸다. 중심층 (52)은 이중면 접착 테이프 또는 속건성 접착제로 형성될 수 있고, 이것은 최종 어셈블리 단계 후에, 응고 시험 요소들에 시료 분배 시스템을 위한 공동을 형성하기 위한 시료 분배 시스템(6)을 노출하는 돌파(breakthrough) (5)를 제공한다.
본 발명의 응고 시험 요소는 그리고나서, 예를 들어, 폴딩 아이런 (folding iron) 또는 다른 적절한 장치의 도움을 받아, 도 14c에 나타난 바와 같이, 대칭선 (51)을 따라 두 면이 접힘에 의해 결합되고, 도 14d에 나타난 바와 같이, 접히고 라미네이트된 웹(53)을 형성한다. 다음으로, 프레스 롤러 (press roller)는 중심층, 기층 및 커버층 사이에 타이트한 연결을 확보할 수 있다.
최종적으로, 라미네이트된 웹 (53)은 바람직한 제품 형태가 되도록 잘리거나, 펀치되고, 라인 (50)은 분리공정 전에 웹(53) 상에 최종적인 응고 테스트 스트립의 예시적인 형태를 나타낸 것이다. 도 14에서 설명된 제조 방법과 함께, 기판의 가장 위 부분은 웹의 x 방향에 레지스트레이션을 놓아두는(loosing) 위험 없이 밑 부분으로 접힐 수 있고, 단일 시트 공정과 비교하여 시료 분배 시스템을 형성하는 제1 및 제2 표면들의 올바른 레지스트레이션을 얻기 위해 쉬운 방법을 제공한다.
기층 및 커버층이 본 발명의 개념에 영향을 미치지 아니하는 상기 논의된 구체예에서 교환가능하다는 것은 당업자에게 자명하다.
본 발명은 즉석 진단 및 가정 진단에 적절한 작고, 간단하게 손으로 다룰수있는 계량 (meter) 장치 및 응고 시험 요소로 구성된 혈장 및 전혈의 응고 특징을 측정하기 위한 시험 시스템을 제공한다. 응고 시험 요소는 약 0.5㎕의 매우 작은 부피로 건조 시약 시험 스트립에 통합된 품질 조절 시스템이 제공된다. 진보한 응고 시험 요소의 생산은 비싸지 않은 요소의 생산을 가능하게하는 복잡하지 않은 적은 수의 생산 공정을 오직 포함한다.
도 1은 시험 스트립 형태로 제공된 본 발명에 따른 응고 시험 요소의 일 구체예의 투시도를 나타낸 것이다.
도 2는 시료 분배를 확대하여 나타낸, 도 1에 따른 구체예의 투시도를 나타낸 것이다.
도 3은 세 층을 분리하여 나타낸, 도 1에 따른 장치의 분할된 투시도를 나타낸 것이다.
도 4는 제1 표면 및 제2 표면과 함께 시료 공동(cavity)를 형성하는 중심층의 단절부의 서로 다른 형태를 나타낸 것이다.
도 5a는 소수성 가이드 요소에 의해 구성되는 시료 분배 시스템의 검출 영역의 단면도를 나타낸 것이다.
도 5b는 친수성 통로를 이용하여 시료 분배 시스템의 검출 영역의 다른 실시 예의 단면도이다.
도 6은 상이한 패턴의 통로들 및 서로 다른 평가 방법에 적절한 검출 영역들이 있는 시료 분배 시스템의 상이한 실시예들을 나타낸 것이다.
도 7a는 광 발산기 및 시료의 광 흡광도 변화를 측정하는데 적절한 검출기 배열과 연결하여 도 5b의 시료 분배 시스템을 단면에서 나타낸 것이다.
도 7b는 공급된 시료 유체의 혼탁(turbidity)을 측정하거나, 시료에 추가된 분자 로터의 형광 신호의 변화를 측정하기 위해 배치된 검출기 수단들과 연결하여 도 5b의 시료 분배 시스템을 단면에서 나타낸 것이다.
도 8은 상이한 분자 로터들 및 그들의 분자 구조를 나타낸 것이고;
도 9는 실행된 양성 및 음성 품질 대조군을 가진, 응고 결과들의 개략적인 평가를 나타내는 그래프이다.
도 10은 전체 혈액의 광학적 스펙트럼 500 내지 700nm를 나타낸 것이다.
도 11은 트롬보플라스틴 (Thromborel S®)에 의해 개시된 혈액 응고 반응의 진행을 600nm에서 모니터한 것을 나타내는 그래프를 제공한다.
도 12는 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 예시 계량 (meter)의 간단화된 블록 다이아그램을 나타낸 것이다.
도 13은 시험 요소 및 위의 시료 부피상에 라미네이션 공정 동안 레지스트레이션 (registration) 실패의 영향을, 각각의 실시예의 단면도로 나타낸 것으로, 이것은 시험 스트립 품질의 절충없이, 기층 및 커버층의 레지스트레이션 (registration)을 위한 높은 인내 (tolerance)를 허용한다.
도 14는 스트립 형태인 응고 시험 요소들의 생산 공정을 나타낸 것이다.

Claims (21)

  1. 서로 대향(對向)하는 소정의 거리에 제1 표면 (2a) 및 제2 표면 (4a)이 있는 혈장 또는 전혈 중의 응고를 측정하기 위한 시험 요소에 있어서,
    상기 두 표면에는 거의 합동형으로 정렬되어 있는 고표면 에너지와 저표면 에너지 영역을 형성하는 실질적으로 동등한 2개의 패턴들이 제공되고, 상기 고표면 에너지의 영역은 검출 영역이 적어도 1개(6a) 있는 시료 분배 시스템 (6)을 형성하고, 상기 제1 표면 및 제2 표면 (2a, 4a)의 검출 영역(들) (6a, 6'a)에는 적어도 1개의 응고 자극 시약이 제공되는 것인 시험 요소.
  2. 제1항에 있어서, 상기 시료 분배 시스템 (6)은 적어도 2개의 응고 검출 영역 (6a1, 6a2)를 포함하는 것인 응고 시험 요소.
  3. 제2항에 있어서, 상기 적어도 1개의 응고 검출 영역에는 시료 유체의 빠르고 완전한 응고를 촉진시키는 응고 가속제를 함유하는 조성물 (양성 대조군)이 제공되는 것인 응고 시험 요소.
  4. 제2항에 있어서, 상기 적어도 1개의 응고 검출 영역에는 시료 유체의 응고를 억제하는 응고 저해제를 함유하는 조성물 (음성 대조군)이 제공되는 것인 응고 시험 요소.
  5. 제2항에 있어서, 상기 시료 분배 시스템 (6)은 적어도 3개의 응고 검출 영역을 포함하고, 상기 적어도 1개의 응고 검출 영역에는 시료 유체의 응고를 가속하는 조성물 (양성 대조군)이 제공되고, 적어도 1개의 응고 검출 영역은 시료 유체 내에 응고를 억제하는 조성물 (음성 대조군)이 제공되는 것인 응고 시험 요소.
  6. 제1항 내지 제5항 중 적어도 어느 하나의 항에 있어서, 상기 응고 자극 시약(들)은 트롬보플라스틴 및/또는 칼슘 이온인 것인 응고 시험 요소.
  7. 제2항 내지 제6항 중 적어도 어느 하나의 항에 있어서, 상기 시료 유체의 응고를 가속하는 조성물 (양성 대조군)은 젤화제 (gelling agent)를 포함하는 것인 응고 시험 요소.
  8. 제2항 내지 제7항 중 적어도 어느 하나의 항에 있어서, 상기 시료 유체의 응고를 억제하는 조성물은 리튬 헤파린 및/또는 EDTA를 포함하는 것인 응고 시험 요소.
  9. 제1항 내지 제8항 중 적어도 어느 하나의 항에 있어서, 상기 검출 영역(들) (6a, 6'a)의 제1 표면 및 제2 표면 (2a, 4a)의 적어도 1개에는 투과 또는 흡광 광도 측정법에 의하여 응고 반응을 측정할 수 있는 화합물이 제공되는 것인 응고 시 험 요소.
  10. 제1항 내지 제9항 중 적어도 어느 하나의 항에 있어서, 상기 검출 영역(들) (6a, 6'a)의 제1 표면 및 제2 표면 (2a, 4a)의 적어도 1개에는 형광법에 의하여 응고 반응을 측정할 수 있는 화합물(들)이 제공된 것인 응고 시험 요소.
  11. 제10항에 있어서, 상기 형광법에 의해 응고 반응을 측정할 수 있는 화합물(들)은 형광 분자 로터(들)인 것인 응고 시험 요소.
  12. - 적어도 1개의 소정의 검출 영역 (6'a)이 있는 가진 친수성 시료 분배 시스템을 형성하는 고표면 에너지 영역인 제1 표면 (2a)를 가진 기층 (2)에 고표면 에너지 및 저표면 에너지 영역을 형성하는 공정과,
    - 제2 표면 (4a)를 가진 커버층 (4)에 고표면 에너지 및 저표면 에너지 영역의 대응하는 패턴을 형성하는 공정과,
    - 상기 제1 표면 (2a)의 및/또는 제2 표면 (4a)의 소정의 검출 영역(들) (6a)를 적어도 1개의 응고 자극 시약으로 피복하는 공정과,
    - 상기 제1층 및 제2층 (2, 4)의 제1 표면 및 제2 표면 (2a, 4a)에 고표면 에너지 영역에 의하여 형성된 시료 분배 시스템용 공동(空洞)을 제공하는 단절부 (5)를 가진 중심층 (3)의 대향부(對向部)에 상기 제1 표면층 및 제2 표면층을 도포하는 공정
    을 포함하는 응고 시험 요소의 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    - 추가의 응고 검출 영역 (6a2)의 제1 표면 및 제2 표면 (2a, 4a)의 적어도 1개는 시료 유체의 빠르고 완전한 응고를 촉진하는 응고 가속제를 함유하는 조성물로 피복하는 공정과,
    - 다른 응고 검출 영역 (6a3)의 제1 표면 및 제2 표면 (2a, 4a)의 적어도 1개는 시료 유체 중의 응고를 저해하는 응고 억제제를 함유하는 조성물로 피복하는 공정
    을 더 포함하는 응고 시험 요소의 제조 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 응고 검출 영역(들)의 제1 표면 및 제2 표면 (2a, 4a)의 적어도 1개는 형광에 의한 응고 반응을 측정할 수 있는 화합물(들)로 피복하는 공정을 더 포함하는 응고 시험 요소의 제조 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 고표면 에너지 영역들은 제1 표면 및 제2 표면들 (2a, 4a)에 물에 불용성인 친수성 용액을 도포하는 것에 의하여 형성되는 것인 응고 시험 요소의 제조 방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 저표면 에너지 영역 들은 제1 표면 및 제2 표면들 (2a, 4a)에 소수성 용액들을 도포하는 것에 의하여 형성되는 것인 응고 시험 요소의 제조 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 친수성 및/또는 소수성 용액(들)은 플렉소그라피법 (flexography), 석판 인쇄법, 그라비어법, 고체 잉크 피복법, 또는 잉크-젯-프린팅법에 의하여 제1 표면 및 제2 표면들 (2a, 4a)에 프린트되는 것인 응고 시험 요소의 제조 방법.
  18. 제12항 내지 제17항 중 하나의 항에 있어서, 상기 응고 촉진 시약(들) 및/또는 품질 조절 조성물(들) 및/또는 형광 검출 보조제(aid)는 미세 접촉 인쇄 또는 미세 분배에 의해 제1 및/또는 제2 표면들 (2a, 4a)의 검출 영역들 (6a, 6'a)에 피복되는 것인 응고 시험 요소의 제조 방법.
  19. - 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 따른 응고 시험 요소와,
    - 소정의 검출 영역(들)에 위치된 혈청 또는 전혈 시료 유체 중의 흡광도 또는 형광의 변화를 검출하는 검출 수단과,
    - 광검출 수단으로부터 자료를 처리하고, 응고 시간 및/또는 INR 수치를 계산하기 위한 처리 수단들과,
    - 사용자에게 산출 수치를 나타내기 위한 표시 수단
    을 포함하는 혈장 또는 전혈 시료 중의 응고를 측정하기 위한 응고 시험 시 스템.
  20. - 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 따른 응고 시험 요소에 혈청 또는 전혈 시료를 도포하는 공정과,
    - 상기 응고 시험 요소를 검출 및 처리하는 수단들을 포함하는 계량 장치에 삽입하는 공정과,
    - 표시 수단에서 산출 수치를 해독하는 공정
    을 포함하는 혈청 또는 전혈 시료 유체 중의 응고를 측정하는 방법.
  21. 서로 대향하는 소정의 거리에 제1 표면 및 제2 표면이 있는 혈청 또는 전혈 시료 유체 중의 응고를 측정하기 위한 응고 시험 요소에 있어서,
    상기 제1 표면 및 제2 표면들 중 1개에 친수성/소수성 패턴이 제공되고, 상기 대응하는 표면은 소수성 표면에 둘러싸인 친수성 픽셀의 균일한 패턴을 제공하여 반(半)친수성 및 반(半)소수성 특징을 가진 표면을 형성하고, 상기 친수성 및 반친수성 표면은 적어도 1개의 검출 영역을 가진 시료 분배 시스템을 형성하고, 상기 제1 표면 및 제2 표면의 검출 영역(들)에 적어도 1개의 응고 자극 시약이 제공되는 것인 응고 시험 요소.
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