KR100802449B1 - 질량이 매우 작은 입자의 검출 방법 및 장치 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 질량이 매우 작은 입자의 검출 방법 및 장치에 관한 것이다. 본 방법은 항원-항체 반응물의 검출에 기초하며 펨토몰(femtomolar) 또는 아토몰(attomolar) 범위까지의 매우 높은 검출 감도를 제공한다.
Description
본 발명은 항원-항체 반응물을 검출함으로써 질량이 매우 작은 입자를 검출하기 위한 방법 및 장치를 제공하며, 본 방법은 펨토몰(femtomolar) 또는 아토몰(attomolar) 범위까지 매우 높은 검출 감도를 가진다.
질량이 작은 입자를 검출하는 여러 방법이 관련 분야에 알려져 있으며, 예를 들면 탁도 계측법(Nephelometric method) 및 비탁법(turbidimetric method) 뿐만 아니라 동적광산란법(dynamic-light-scattering:DLS) 등이 있다.
탁도 계측법 및 비탁법에서는, 작은 입자에 대한 조사(illumination)가 광각(wide-angle)의 산란된 빛을 형성하는 틴들 효과가 사용된다. 빛의 산란은 입사광이 산란 매질을 통과한 후 그 강도의 감소를 측정하거나 또는 나중에 편향된 빛의 강도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 전자의 경우는 비탁법 또는 감광 측정으로 언급되고, 후자의 경우는 혼탁법 또는 틴들로미터리(tyndallometry)로 언급된다.
동적광산란법(DLS)으로 언급된 방법은 또 다른 접근법이다. 이 방법에서는, 입자를 감싸는 빛 구 상에 한 지점(또는 몇몇 지점)만이 관찰되고, 브라운 운동에 의해 야기된 밝기의 변화가 분석된다. 매우 작은 감시 부피에 집중함으로써, 여러 입자로부터 산란된 빛의 겹침으로 인한 간섭을 줄이고자 한다. 결과적으로, 입자는 작은 조사 부피를 매우 빨리 통과하며, 따라서 광전자를 분석하는 것은 상당한 진동 주파수를 검출하여야 한다. 많은 양의 정보는 복합 신호 처리에 의해 제공되며, 따라서 이러한 시스템은 단지 정량적 분석을 위해서만 조건적으로 유용하다.
종래 기술의 검출 방법은 또 다른 단점을 가진다. 비록 상기 언급한 방법들의 검출 감도가 최근에 상당히 증가하였지만, 다양한 분야에서 더 높은 검출 감도를 가진 검출 방법에 대한 강한 요구가 여전히 존재한다. 또한, 종래 기술의 검출 방법은 상대적으로 많은 양의 샘플을 필요로 하며, 이는 특히 의학 기술 분야에서 검사받는 환자에게 상당한 부담을 줄 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 종래 기술의 검출 방법에 비해 높은 검출 감도를 나타내는 질량이 작은 입자의 검출 방법을 제공하는 것이다. 또한, 이러한 방법은 샘플의 더 적은 희석 및/또는 더 적은 최소량의 샘플을 필요로 하고, 대규모 샘플 분석에 적절하여야 하며, 특별한 선행 기술이 없는 자라도 기초적인 교육 후에 실행할 수 있어야 한다. 또한, 본 발명의 목적은 질량이 작은 입자의 검출의 위한 장치를 제공하는 것이다.
이러한 목적은 항원-항체 침전물의 검출에 의해 질량이 작은 입자를 검출하는 방법을 제공함으로써 달성되는데, 이 방법은 정해진 최대 입자 크기이고 적어도 두 개의 항체 결합 부위를 가진 입자를 필수적으로 포함하는 샘플 유체를 제공하는 단계; 정해진 최대 입자 크기를 가진 입자를 본질적으로 포함하는 항체를 포함하는 유체를 제공하는 단계; 샘플 유체를 항체를 포함하는 유체와 접촉시켜 적어도 두 개의 항체 결합 부위를 가진 입자 존재시에 항체가 항원-항체 침전물을 형성할 수 있는 반응 유체를 형성하는 단계; 그 반응 유체에 광선을 통과시키는 단계; 광검출기로 레이저에 의해 발생된 빛이 반응 유체를 포함하는 측정 셀을 통과할 때 발생하는 빛 원뿔체의 밝고-어두운 경계에서 감광(extinction)을 측정함으로써, 형성된 항원-항체 침전물의 크기 및 수에 따라 강도가 좌우되는 신호를 검출하는 단계;를 포함한다.
본 발명은 또한 광원, 측정 셀, 및 레이저에 의해 발생된 빛이 유체에 입자를 포함하는 측정 셀을 통과할 때 발생하는 빛 원뿔체의 밝고-어두운 경계에서 감광을 측정하도록 형성된 광검출기를 포함하는 질량이 작은 입자의 검출 장치를 제공한다. 앞에서 산란된 빛은 원뿔체를 형성하고, 광검출기는 그 원뿔체의 밝고-어두운 경계에 겨냥된다. 레이저 및 광검출기는, 레이저 빔이 광검출기를 매우 근접하여 통과하도록 오프셋(offset)이 있지만 본질적으로 축을 따라 일렬로 배열된다.
본 발명에 이른 수많은 실험에서, 검출 감도가 관련 분야의 유사한 방법의 감도를 1000배 초과하는 방법이 개발될 수 있었다. 검출 감도의 상당한 증가는 레이저에 의해 발생된 빛이 반응 유체를 포함하는 측정 셀을 통과할 때 발생하는 빛 원뿔체의 밝고-어두운 경계에서 감광을 광검출기로 측정함으로써 신호가 검출되는 조화된 분석 샘플 제조와 관련하여 변형된 물리적 검출 방법 때문이다.
또한, 본 발명은 측정 셀의 부피가 약 30 내지 50 배 감소하게 한다. 반면 종래 관련 분야의 방법에서, 예를 들어 1.6 ㎖ 부피를 가진 측정 셀이 필요하고 본 발명에 따른 방법에서는 마이크로리터 범위(예를 들어, 40 ㎕)를 가진 측정 셀이 사용될 수 있다. 이는 각 샘플들이 예를 들어 같은 투명도, 점성도 등을 가진 동일한 매질을 형성하도록 하기 위하여 희석되어야 하기 때문에 중요한 장점이 되며, 본 발명의 방법에서 샘플은 종래 관련 분야의 방법보다 덜 격렬하게 희석된다.
또한, 본 발명에 따른 방법은 필요한 샘플의 최소량을 줄이는 것이 가능하다. 선행 기술의 방법으로는 100 ㎕ 이상이 필요한 데 반해, 본 발명에 따른 방법은 몇 배 더 작아도 충분하다(예를 들어, 3.5 ㎕).
본 출원에서, "입자(particles)"라는 용어는 지지 매질의 굴절률과는 다른 굴절률을 가진 어떤 3차원적 실체를 의미한다.
본 출원에서 사용되는 "침전"이라는 용어는 특정 항체와 수용성 항원의 반응으로 사용되는 항원 및 항체보다 용매에서 더 낮은 용해도를 가진 항원-항체 복합체를 생산하는 과정을 말하며, 우선 이 반응은 반응 혼합물을 흐리게 하고 다음으로 이러한 항원-항체 복합체는 침강한다.
본 발명에 따른 방법으로 질량이 작은 입자를 검출할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 방법을 사용함으로써 지금까지 검출 한계는 통상 리터당 마이크로그램, 나노그램 또는 피코그램 정도이었지만, 리터당 펨토그램 및 아토그램 범위의 검출 한계가 저분자량 물질, 예를 들어 분자량이 500 g/㏖ 이하인 물질로 달성될 수 있다. 검출 한계는 500 g/㏖ 이상의 범위의 분자량을 가진 물질로 더 높고, 예를 들어 검출 한계는 분자량 150,000 g/㏖(예를 들어, IgG 항체)을 가진 물질로 약 300 펨토그램/리터이다. 이는 샘플 유체가 리터당 펨토몰 또는 아토몰 정도의 입자를 포함할 수 있음을 의미한다.
본 발명에 따른 첫 번째 부분 단계에서, 정해진 최대 입자 크기를 가진 입자를 본질적으로 포함하는 샘플 유체가 제공된다. 이를 달성하는데에는 예를 들어 두 가지 방법이 있다. 첫 번째 방법에 따르면, 우선 정해진 최대 입자 크기를 가진 입자들만을 본질적으로 포함하는 유체가 제공되고, 이어서 정해진 최대 입자 크기를 가진 입자를 본질적으로 포함하는 샘플이 그 유체에 첨가된다. 두 번째 방법에 따르면, 샘플 유체는 우선 유체를 제공하고, 그 유체에 샘플을 첨가하며 이어서 정해진 입자 크기를 초과하는 입자들을 제거함으로써 획득될 수 있다.
샘플 유체 및 단지 정해진 최대 입자 크기의 입자만을 본질적으로 포함하는 다른 유체에서 입자의 최대 입자 크기는 원하는 활용 형태에 따라 선택될 수 있다. 많은 통상의 항체에서, 20-450㎚, 더 바람직하게는 100-300㎚ 및 특히 200㎚ 보다 더 큰 입자들로 분리될 수 있다. 이러한 분리는 예를 들어 20-450㎚, 바람직하게는 100-300㎚ 및 특히 200㎚에 대응하는 적절한 입자 크기를 가진 필터로, 또는 관련 분야의 숙련된 자에게 알려진 다른 방법으로 영향을 받을 수 있다. 만약 일 접근법으로 표면의 응집이 고려된다면, 필터 크기를 반으로 줄이는 것은 검출가능한 반응물을 산출하는 분자의 수에 2차 비율로 영향을 미친다. 예를 들어, 200-㎚ 필터 대신에 100-㎚ 필터가 사용된다면, 200-㎚ 필터를 사용할 때 필요한 항원-항체 분자 수의 약 4분의 1만이 검출가능한 결과를 산출하기 위하여 서로 반응하여야 한다. 또한, 예를 들어 25-㎚ 필터를 사용할 때에는 항원-항체-항원 삼량체를 검출하는 것이 가능할 것이다. 이러한 작은 구멍을 가진 필터를 사용할 때, 몇몇 분자들은 이미 검출가능한 반응을 유도할 것이기 때문에 세심한 주의가 필요하다.
교차 결합 반응의 발생을 위하여, 샘플 유체에 포함된 입자는 적어도 두 개의 항체 결합 부위를 가져야 하고 따라서 항원으로서 작용할 수 있다. 도 1a 내지 도 1d는 박테리아, 바이러스, 독소 및 단백질과 같은 외인성 물질 또는 입자가 항원으로 작용하고 "자물쇠-열쇠 원리(lock-and-key principle)"(도 1b)에 따라 항체와 반응하는 것을 개략적으로 도시한다. IgG 항체와 같은 2가 항체는 두 개의 항원에 결합할 것이다(도 1c). 각 항원은 여러 항체와 결합할 수 있기 때문에, 본 발명에 따른 방법에 의해 검출되는 교차 결합(침전)이 발생한다(도 1d). 유사한 침전은 더 높은 수가(valence)를 가진 항체로 발생한다. 만약 사용되는 항원이 더 많은 수의 항체 결합 부위를 제공한다면, 교차 결합 반응이 더 재현성 있게 진행되는 장점이 있다.
본 발명에 따른 방법은 적어도 두 개의 항체 결합 부위를 가지는 한 어떤 항원도 적절하다. 바람직하게는, 시험되는 입자는 약 10 나노미터보다 더 커야 하고 동시에 선택된 최대 입자 크기보다 더 작아야 한다. 10 ㎚보다 더 작은 분자들은 합텐으로 작용할 수 있다. 합텐은 불완전한 항원인데, 즉 그 분자들은 면역 반응을 유발하거나 응집을 유발하기에 충분히 크지 않다. 이러한 저분자량 물질은 사실상 항체의 파라토프(paratope) 결합 부위에 상당히 특정적이지만, 두 번째 항체가 그것들에 결합할 수 있게 그 결합 자리로부터 충분히 돌출하지 않는다. 합텐은 교차 결합이 일어날 가능성이 없게 특정 항체를 차단한다. 박테리아와 같은 더 큰 항원들은 측정 전에 화학적으로 또는 물리적으로 파괴되어야 하는데, 이는 예를 들어 초음파, 산, 염기 또는 계면 활성제에 의해 관련 분야의 숙련된 자에게 잘 알려진 방법으로 달성될 수 있다. 이러한 식으로 단일 박테리아는 다수의 단편으로 분리되고 이는 더 이상 박테리아가 서로 응축하는 것을 방지하는 이점을 제공한다. 얻어진 단편-예를 들어 표면 단백질-은 더 작은 항체를 나타내고 적절한 항체와 특정적으로 측정할 수 있는 반응을 일으킬 수 있다.
또한, 항원은 본질적으로 사용되는 완충 용액에 녹을 수 있어야 하고, 사용되는 장치 및 필터의 벽에 대하여 낮은 접착 친화력을 가져야 한다.
본 발명에 따른 방법은 항체를 포함하는 유체를 제공하는 단계를 더 포함한다.
본 발명에 따른 방법에서, 원칙적으로 원하는 어떤 항체도 사용될 수 있다. 본 발명을 위해 특히 바람직한 것으로 증명된 항체들은 예를 들어 2가 면역글로블린 G(IgG) 또는 10가(decavalent) 면역글로블린 M(IgM)이다. 관련 분야의 숙련된 자에게 알려진 방법에 따르면, 잘 특징지워진 특이성을 가진 항체들은 따라서 획득될 수 있다. 다른 항체 분류에 속한 다른 항체들은 검출될 입자의 형태에 따라 또한 사용될 수 있다. 여기서 항체들은 단클론성 또는 다클론성이다. 단클론성 항체가 사용될 때, 다른 항원으로 향하는 두 개의 단클론성 항체들은 침전을 형성하도록 주입될 수 있다. 항원에 대하여 상기 언급한 것처럼 같은 방식으로, 항체도 사용되는 완충 용액에서 본질적으로 용해될 수 있어야 하고 사용되는 장치 및 필터의 벽에 대하여 낮은 접착 친화력을 가져야 한다.
본 발명에 따른 방법에서, 바람직하지 않은 너무 과도한 양의 항원 또는 항체들은 다른 방식, 예를 들어 적절한 희석으로 방지될 수 있다. 그렇지 않으면, 이러한 과도한 항원 또는 항체들은 침전을 억제(소위, "전지대 현상(prozone phenomenon)")할 수 있는데, 이는 과도한 양의 항체 존재시에 각 에피토프(항원 결합 부위)는 단지 1가적으로 단일 항체에 결합할 것이고 교차 결합은 더 이상 가능하지 않기 때문이며, 또는 과도한 양의 항원 존재시에 종종 삼량체가 하나의 항체 분자와 두 개의 항원 분자로 형성되기 때문이다.
샘플 유체의 제조 및 항체를 포함하는 유체의 제조 모두를 위해서, 원칙적으로 어떤 가스 또는 액체가 유체로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 그 유체는 액체이다. 종종 그 액체는 물 또는 종래 기술, 특히 생화학 반응에 기초한 분석 방법에 알려진 PBS(인산완충식염수)와 같은 완충 용액이다. 원칙적으로, 액체는 어떤 다른 투명한 액체, 예를 들어 액체 탄화수소, 산 또는 염기일 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 다음 단계로 샘플 유체는 항체를 포함하는 유체와 접촉되고, 항원 존재시에 항체는 예를 들어 본 발명에 따른 장치로 검출될 수 있는 항원-항체 침전물을 형성할 수 있다.
이것 외에도, 샘플에서 합텐의 존재를 검출하는 것도 종종 흥미롭다. 합텐은 불완전한 항원이며, 즉 그것들은 하나의 이상의 항체에 결합하기에는 너무 작다. 특히, 합텐은 약제, 마약, 살충제, 환경 오염원, 스테로이드 호르몬 또는 미코톡신일 수 있다. 합텐은 항체에 특정적으로 결합한다. 그러나, 합텐은 연쇄 반응이 일어날 가능성이 없이 단지 항체의 파라토프(paratope) 결합 부위를 차단한다. 면역원(완전한 항원)의 최소 크기는 5 에서 10 kDa, 즉 >30 아미노 잔기 또는 >3 ㎚ 길이이고, 이러한 크기에서 시작하기 때문에 적어도 두 항체 분자들은 적절하게 이용할 수 있는 에피토프 결합 부위를 통해 이러한 항원들과 결합할 수 있고, 종종 침전을 유발하는 연쇄 반응을 유도할 수 있다.
합텐의 결정은 예를 들어 친수성 거대분자 멀티스페이서(hmM) 또는 관련 분야의 숙련된 자에게 잘 알려진 관련 화합물로 달성될 수 있다. 친수성 거대분자 멀티스페이서는 관련 분야에 알려져 있으며, 알부민과 같은 친수성 거대 분자로 구성된다. 같은 합텐 분자 또는 서로 다른 합텐 분자들은 관련 분야에 알려진 스페이서를 통하여 이러한 친수성 거대분자에 화학적으로 연결된다. 만약 친수성 거대분자 멀티스페이서가 적어도 두 개의 동일한 합텐 분자를 가진다면, 그것은 침전을 위해 사용될 수 있다. 이러한 분자는 치환 반응에 기초한 항체 선별 테스트를 위해 사용될 수 있다. 따라서 합텐은 이하에서 예시되는 치환 반응에 기초한 측정 개념을 산출하고, 여기서 반응 피크는 단지 네거티브 테스트(negative test)에서 관찰되며, 즉 반응물의 검출은 단지 네거티브 테스트를 통해 일어난다.
혈액 또는 타액 샘플이 합텐, 예를 들어 코카인에 대해 시험될 때, 코카인으로 향하는 항체는 희석된 혈액 또는 타액 방울에 첨가된다. 약 1분 후에, 축합적으로 제조된 소량의 코카인-hmM, 즉 스페이서에 의해 코카인 분자에 연결된 친수성 거대 분자를 첨가한다.
코카인이 샘플에 존재할 때, 그것은 합텐처럼 작용하고 항체 결합 부위를 차단한다. 코카인-hmM의 연속적인 첨가는 어떤 효과도 보이지 않는다. 샘플에 코카인이 없을 때, 어떤 항체 결합 부위도 차단되지 않으며 코카인-hmM의 첨가는 예를 들어 이하에서 기술될 Q-MAP 장치를 사용하는 본 발명에 따른 방법으로 입자 성장이 측정될 수 있는 체인 형성을 초래한다.
본 발명에 따른 방법에서, 광선, 특히 레이저 빔과 같은 응집성이 있는 빛은 시험될 액체에 조사된다. 이하에서, 본 발명에 따른 방법은 레이저 빔을 언급하며 기술되지만, 이는 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 관련 분야의 숙련된 자에게 알려진 어떤 다른 광원을 제외하는 것은 아니다. 예를 들어, 레이저 빔은 이하에서 구체적으로 기술될 Q-MAP(아토몰 침전물의 정량 측정)로 언급될 본 발명에 따른 장치에서 유래한다. 그러나, 선택적으로 본 발명의 명세서에 기초하고 본 발명의 가르침으로부터 관련 분야의 숙련된 자가 개발할 수 있는 다른 장치도 사용될 수 있다.
레이저는 액체를 통과하는 빛을 방출하고, 액체에 존재하는 입자의 수 및 크기를 측정하는데 사용된다. 이는 레이저에 의해 발생된 빛이 반응 유체를 포함하는 측정 셀을 통과할 때 생기는 빛의 원뿔체의 밝고-어두운 경계에서 감광을 광검출기로 측정함으로써 실행되고(광검출기는 조절할 수 있는 신호 증폭 및 조절할 수 있는 작동점을 가질 수 있다), 본 장치는 "분자 빛 장애(molecular light barrier)"로서 작용할 수 있다. 여기서 기술된 Q-MAP 장치는 비록 시험되는 입자의 구성 또는 조성에 관한 정보는 제공할 수 없지만, 예를 들어 20 ㎚ 내지 5 ㎛ 사이 크기의 입자를 검출할 수 있다. 레이저 및 광검출기는 거의 동축이다. 레이저 빔은 광검출기를 매우 근접하여 통과한다. 앞쪽에서 산란된 빛은 원뿔체를 형성하고, 광검출기는 그 원뿔체의 밝고-어두운 경계를 겨냥한다.
측정 셀의 유체에 존재하고 레이저 빔을 통과하는 각 입자는 신호를 발생시키며, 그 신호의 수는 측정 셀에서 입자의 통계적인 분포에 대응한다. 입자들, 심지어 가장 작은 입자들은 레이저의 중심에서 빛의 원뿔체를 통과할 때, 마치 그림자를 드리우는 것처럼 빛을 차단한다. (입자 그림자 없는)초기 밝기의 변화가 측정된다. 빠른 컴퓨터, 예를 들어 펜티엄 컴퓨터는 초당 10,000 입자 통과를 분간할 수 있다. 작은 입자들은 큰 입자들보다 더 빨리 움직이며, 따라서 통과 시간은 입자 크기에 대한 직접적인 측정치이다.
만약 여러 입자들이 동시에 레이저 빔에 위치한다면, 가장 큰 것만이 측정된다. 입자들이 레이저 빔을 통과하는 서로 다른 속도를 이용하여, 상응하는 입자 크기는 관련 분야의 당업자에게 잘 알려진 스토크-아인슈타인 공식(Stoke-Einstein equation)으로 계산될 수 있다. 이러한 측정에서, 절대 입자 크기보다는 입자 크기(입자 성장에 의해 야기된)의 변화가 더 중요하다. 사용되는 특정 필터는 입자 성장을 결정하기 위한 조치로서 작용한다. 필터 구멍이 크면 클수록, 침전물은 "배경 잡음"으로부터 분간될 수 있도록 점점 더 성장하여야 한다. 100-200 ㎚ 필터로, 매우 적은 성장 입자들이 검출할 수 있는 신호를 발생시키기에 충분할 것이다. 입자들은 통계학적으로 분산되기 때문에, 입자 성장은 측정 셀의 중심에 존재하는 레이저 중심에서 항상 발생할 것이다.
입자들이 레이저 빔을 통과하는 속도는 입자들이 빔을 통과하는데 필요한 통과 시간을 측정함으로써 검출될 수 있다(밝기 변화의 시작에서부터 끝까지).
깨끗한 용액에서 개별적인 각각의 입자들은 레이저 빔에 존재할 것이라는 것을 알 수 있다; 또는 용액이 오염되면 오염될수록, 신호는 더욱 더 겹치게 되고 감도를 감소시키게 된다.
신호 강도는 항원-항체 침전물의 크기 및 수에 따라 좌우된다.
항체의 일정한 농도에서, 측정되는 신호의 감소는 항원의 농도와 직접적으로 관련이 있다.
본 발명에 따른 검출 과정에서, 다음처럼 처리할 수 있다: 시험될 모든 유체들은 정해진 구멍 크기를 가진 필터를 통해서 측정 셀로 주입되고, 샘플 유체 또는 항체 유체의 개별적 관찰에서 정해진 입자 크기보다 작은 입자를 나타내는 신호들만이 나타날 것이다. 본 발명에 따른 방법에서, 사용되는 항체들 및 사용되는 항원들 둘 다는 상기 크기 제한 이하의 입자 크기를 가지고, 따라서 분리를 위해 사용되는 필터의 입자 크기보다 더 작으며(예를 들어, 200 ㎚보다 작음) 분리 동안에 제거되지 않는다.
NaCl 용액에 기초한 샘플 유체로 기록된 이러한 영상의 예는 도 2a에 도시된다. 이러한 영상에서, 입자 크기는 x축에 도시되고 입자의 수는 y축에 도시된다. 도 2a에 도시된 것처럼, 정해진 최대 입자 크기 이상의 입자들만이 존재하고, 더 큰 입자 크기에서는 거의 입자가 존재하지 않는다. 유사한 검출 결과는 단지 정해진 입자 크기의 입자를 포함하는 여과된 항체 유체에서 획득될 것이다(도시하지 않음).
샘플 유체 및 항체 유체의 동시의 분리 주입에 이어, 반응은 측정 셀에서 마이크로침전을 일으키며 발생하고 항원-항체 침전물의 크기 및 수의 검출이 실행된다.
이러한 측정의 결과는 도 2b의 예에 도시되며, 예를 들어 200 ㎚의 정해진 입자 크기 제한보다 더 큰 입자들이 보인다. 따라서 더 큰 입자의 형성은 반응이 일어났음을 보여준다. 대조적으로 만약 더 큰 입자를 생산하는 반응이 일어나지 않았다면 시험된 액체는 대응하는 항원이 없다.
측정은 샘플 유체와 항체 유체를 반응 셀에 채운 후에 어느 때라도 시작할 수 있다. 본 발명의 실시 형태에 따르면, 측정은 주입 속도로 약간의 진동이 측정 셀의 대류의 변화를 초래할 수 있기 때문에 측정 셀을 채운 후에 예를 들어 60초 보다 더 빨리 시작하지 않는다. 예를 들어 60초가 지난 후에, 최대 침전이 얻어진다. 그 이후에 발생하는 측정 신호의 감소는 다른 항원 농도의 개략적인 정량 분석 또는 평가를 가능하게 한다. 여기서 양 반응물의 출발 농도가 중요하다. 이러한 출발 농도가 높으면 높을수록, 침전 최대값의 감소를 검출할 수 있을 때까지 걸린 시간은 점점 더 길어질 것이다.
본 발명에 따른 방법을 실행할 때, 검출 동안 배경 소음을 제거하거나 최소화하기 위하여 가능한 한 가장 높은 순도의 유체, 예를 들어 사용 전에 200 ㎚ 크기의 적절한 입자 크기의 필터로 여과된 유체를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 따른 방법에서 사용된 장치의 물질은 가능한 한 가장 적은 양의 입자를 방출하여야 한다. 예를 들어, 측정 셀은 PTFE(폴리테트라플루오르에틸렌)으로 만들어질 수 있다. 또한, 측정 기간은 사용되는 물질(예를 들어, 측정 셀)이 연속적으로 입자를 방출하는 것을 방지하기 위하여 가능한 한 짧게 유지되어야 한다.
또한, 사용되는 항원 또는 항체 용액의 농도는 발생하는 항원-항체 반응이 너무 많은 침전물 또는 너무 큰 침전물을 생산하지 않도록 낮게 유지되어야 하고, 그렇지 않으면 여러 입자들이 동시에 빔에 존재할 수 있고 통과 시간은 검출하기가 매우 어려울 수 있기 때문이다. 본 방법에 따른 방법의 가장 높은 감도는 펨토몰 및 아토몰 범위이다.
본 발명에 따른 방법은 정량적 또는 반정략적(semi-quantitative) 정보를 제공할 수 있다는 것이 특히 바람직하다.
예를 들어, 정량적 기록을 평가하기 위하여 두 가지 방법이 사용될 수 있다. 첫 번째 평가 방법에서, 시간 t1 및 t2(예를 들어, t1 = 120초 및 t2 = 180초)에서 측정된 그래프 아래의 면적(F)은 측정되고, 우수한 근사값 FN은
FN = (Ft1 + Ft2)/2,
식을 통해서 얻을 수 있으며, 입자 수에 대한 정량적 값은 그 면적으로부터 획득할 수 있다. 이러한 상당히 낮은 농도에서, 입자 성장은 선형적이며, 즉 농도를 두 배로 하면 측정된 신호의 넓은 면적이 두 배가 된다.
정량적 정보를 얻기 위한 선택적 및/또는 보충적 방법은 용액을 2분자 반응의 운동역학적 한계에 도달할 때까지 희석하는 것에 기반한다. 100 아토몰 이하의농도에서 반응 입자들의 평균 자유 통로는 너무 크게 되고(>100 ㎛) 어떤 검출할 수 있는 침전도 정해진 측정 기간 동안 발생하지 않을 것이다. 10 나노몰 이상의 농도에서, 너무 과도한 수 및 너무 과도한 반응물 때문에 입체적 방해가 발생하기 시작하고, 또한 위에서 설명한 "전지대 현상(prozone phenomenon)"도 효력이 생긴다. 10 마이크로몰 용액에서, 예를 들어 입자의 평균 자유 통로는 거의 100 ㎚ 이다.
이러한 물리적 종말점에서 검출된 희석의 정도는 단지 온도 및 대류에 좌우되고, 점성은 예를 들어 PBS(인산완충식염수)에서 높은 희석에 관계가 없다. 만약 이러한 두 변수가 일정하게 유지된다면, 출발 용액의 희석의 정도는 시험된 용액 농도의 직접적인 측정치가 될 것이다.
샘플 농도의 정확한 정량적인 측정은 알려진 농도의 의문의 단백질을 포함하는 교정 용액 및 이러한 목적으로 사용되는 당업자에게 잘 알려진 공정을 통하여 본 발명에 따른 방법으로 가능하다.
본 방법의 다른 실시 형태에 따르면, 연속 측정 및/또는 복합 무작위으로 선택된 측정 셀에서 유체의 샘플 측정이 실행될 수 있다. 이러한 식으로 특히 반응의 종말점을 결정하고 기록의 평균값을 계산하는 것이 가능하다. 바람직하게는, 항체를 첨가하기 전 및/또는 샘플을 첨가하기 전에 정해진 값 이상의 입자 크기를 가진 입자가 본질적으로 존재하지 않는 운반 유체는 측정을 받게 된다; 이러한 측정의 결과는 침전물의 측정을 위한 참조값으로서 인용된다.
본 방법에 따른 방법에서, 상대적으로 적은 양의 유체로도 충분할 것이다; 사용되는 유체로부터 정해진 값을 초과하는 입자 크기를 가진 물질들을 제거하기 위한 노력도 줄어들 수 있다. 예를 들어, 사용되는 유체는 상기 물질을 제거하는 필터를 가진 우회로를 통한 밸브 배열을 통해 우회될 수 있다. 사용되는 유체의 여과는 측정을 방해하는 어떤 물질도 존재하지 않도록 하기 위하여 샘플 주입 전 정해진, 미리 정해진 기간 동안 실행될 수 있다. 정해진 값을 초과하는 입자 크기를 가진 샘플의 물질은 급송 지점에 통합되거나 이러한 지점 상부에 배치된 필터에 의해 특히 더욱 더 제거될 수 있다. 따라서 얻어진 샘플 유체는 샘플과 유체에 들어가거나 또는 시스템 도관으로부터 도착할 수 있는 간섭 물질을 제거하기 위하여 샘플의 주입 후에 일정 기간의 시간 동안 여과될 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태에 따르면, 항원을 검출하거나 그렇지 않는 항체의 주입 후에 운반 유체는 다른 항체의 주입 전에 재여과된다. 이는 운반 유체에 들어가서 동시에 측정을 방해할 수 있는 물질을 제거하는 역할을 한다. 또한, 이러한 방식으로 가능하게는 샘플의 다른 성분들을 분석할 수 있게 하기 위하여, 사용되는 유체로부터 검출된 반응물을 제거하는 것이 가능하다.
본 발명에 따른 방법은 수질 분석(성분 및 해로운 물질의 검출), 음식 분석(미생물, 구성 성분의 검출), 생물학적 또는 의학적 시험(예를 들어, 어떤 DNA 또는 RNA 서열, 어떤 박테리아 또는 알레르겐(알레르기 시험)의 검출)의 영역에서 다양하게 활용된다. 그 활용은 또한 친수성 거대 분자 멀티스페이서, 가지형 DNA 센서 또는 정량적 PCR의 영역에서도 가능하다. 본 발명에 따른 방법은 더 구체적으로 BSE 테스트에서 감염성 프리온 단백질 PrPSc의 검출을 위해서도 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 방법으로 지극히 적은 양의 프리온 단백질을 검출할 수 있기 때문에, 본 발명에 따른 방법은 혈액에서 감염성 프리온 단백질 PrPSc의 검출을 위해서도 적절할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 Q-MAP 측정 방법은 다양한 표면에서 서로 다른 단백질의 흡착 행동을 시험하기 위한 빠르고 간단한 가능성을 제공한다. 상당히 광택 있는 표면은 "단백질 흡착값"이 비파괴적으로 검사될 수 있고, 정규 값으로부터의 이탈은 표면 결함을 나타낸다. 따라서, 이러한 식으로 표면 결함은 예를 들어 얇은 증발된 금속 표면에서 간단하고 빠르게 검출될 수 있다.
또한, 표면에서 정해진 단백질의 완전한 부동화는 검사될 수 있고, 이는 예를 들어 DNA 분석 및 바이오칩 기술 분야에서 상당히 중요하다.
본 발명에 따른 방법의 다른 가능한 활용은 화학 물질에 의해 발휘된 표면에 대한 영향을 측정하는 것이다. 특히, 표면 처리에 의해 발생하는 변화를 검출하는 전후 테스트는 부식한 표면이 부식하지 않은 표면보다 더 넓은 표면적을 가져 더 많은 양의 항원 물질-예를 들어 단백질-이 이러한 표면에 접착할 것이기 때문에 가시화될 수 있다. 예를 들면, 용액에 존재하는 자유 단백질의 양은 이러한 방식으로 검출될 수 있다.
또한 다른 활용은 본 발명에 따른 방법으로 호스 및 파이프의 내부 상태를 점검할 수 있다는 것이다.
본 발명에 따른 방법의 과정들을 종료한 후에, 항원-항체 침전물은 예를 들어 프로테나아제 K로 용해될 수 있고, 프로테나아제 K(예를 들어, 프리온 및 어떤 아미노산도 포함하지 않는 물질)로 파괴되지 않는 물질의 경우 다른 처리 또는 시험 단계를 거친다.
상기한 것처럼 본 발명에 따른 방법의 더욱 더 중요한 장점은 정량 검출을 실행할 수 있다는 것이다. 또한, 본 방법은 완전히 자동화될 수 있어 노동비의 상당한 감소를 초래하며 비용면에서 상당히 효과적일 수 있다.
또한, 본 방법에 따른 방법은 생체 유체 또는 배설물 및 특히 혈액에서 매우 적은 양의 병원균을 검출할 수 있다. 이는 적은 양의 혈액, 예를 들어 작은 혈액 방울(약 10-20 ㎕)은 외과 의사나 숙련된 간호사의 도움없이 모세관으로 손가락 끝이나 귓볼에서 쉽게 채취할 수 있기 때문에 중요한 장점이 된다. 이러한 시험은 약국, 양로원 또는 재활 시설에서 쉽게 행해지고, 그 결과 특정 박테리아에 의한 감염 여부에 관한 정보는 간단하고 빠르게 제공된다. 샘플링 및 본 발명에 따른 방법에서 본 방법에 따른 장치의 작동 둘 다는 어떤 의학적인 실습이나 상당히 숙련된 자를 필요로 하지 않는다는 점에서 본질적으로 바람직하다. 선택적으로, 마약 또는 약물과 같은 혈액에 존재하는 다른 물질들은 물론 이러한 특정 항체를 사용하는 테스트에 의해 검출될 수 있다.
상업적인 측정 장치에서 항체에 대한 항원의 비율은 2-3 배 이상 차이가 나면 안되지만, 항원과 항체 사이의 이상적인 혼합 비율에서 이탈이 100 배 인 경우라도 Q-MAP를 가지고 여전히 측정이 가능하다(항체의 일정한 농도에서, 항원의 이상적인 농도는 1%까지 낮아지고 10,000%까지 올라간다. 역으로 항원의 일정한 농도에서도 동일하게 실행된다). 분자들의 입체적 방해가 적은 펨토몰 및 아토몰 범위에서 "하이델베르그 그래프"로부터의 이러한 흥미로운 이탈로 인해, 시간을 소비하는 희석은 불필요하게 된다.
본 발명에 따른 방법은 특히 저장된 샘플을 시험하기에 적절하고, 이는 특히 저장된 혈액(HIV 또는 간염)의 테스트 및 BSE 테스트 샘플을 위해 중요하다. 본 발명에 따른 방법으로, 시간당 약 50 측정이 실행될 수 있고, 이는 하루에 8 내지 10 시간을 일할 때 적어도 하루에 400 테스트 또는 일 년에 80,000 측정 이상을 실행함을 의미한다. 따라서, 년간 800,000-8,000,000 샘플들은 10-100 샘플들이 각 측정을 위해 저장되어 있을 때 단지 단일 측정 장치로 시험될 수 있다.
저장된 혈액을 시험할 때, 10개의 서로 다른 항체들(10개의 다른 질병에 대하여)은 예를 들어 이러한 혈액이 사용될 수 있는지를 평가하기 위하여 동시에 혈액에 첨가될 수 있다. 양성 반응의 경우, 저장된 혈액은 폐기되어야 하고, 이는 오염이 예를 들어 HIV 또는 간염에 의한 것이든지 상관이 없기 때문이다. 어떤 원인이 사실상 양성 반응을 유발했는지를 알기 위해서 항체들을 개별적으로 주입할 수 있다. 예를 들어 저장된 혈액의 100개의 용기로부터 혈액을 취하고 10개의 서로 다른 항체들을 동시에 사용함으로써 모든 100개의 용기로부터 혈액을 사용하기에 적절한지 어떤지를 60초의 단일 측정으로 확인할 수 있다.
이러한 적은 양의 물질만으로 충분하고 펨토몰 또는 아토몰 범위에서도 적절히 높은 감도를 가진 테스트는 아직까지 관련 분야에 알려져 있지 않으며 이는 중요한 발전이다.
또한, 본 발명은 컴퓨터 프로그램 제품이 컴퓨터, 네트워크 장치 또는 특히 분석 검출 장치에서 실행될 때 본 발명에 따른 방법이 실행될 수 있도록 하기 위하여 컴퓨터 판독 부재에 저장된 프로그램 코드 수단을 포함하는 상기 컴퓨터 프로그램 제품을 포함한다. 본 발명은 컴퓨터 프로그램 제품이 컴퓨터, 네트워크 장치 또는 특히 분석 검출 장치(예를 들어, 본 출원에 기술된 검출 장치)에서 실행될 때 본 발명에 따른 방법이 실행되도록 하기 위하여 서버로부터 다운로드할 수 있는 프로그램 코드를 포함하는 상기 컴퓨터 프로그램 제품을 제공한다.
본 발명은 또한 Q-MAP(아토몰 침전물의 정량적 측정) 장치로 언급된 질량이 작은 입자의 검출을 위한 장치에 관한 것이다.
이러한 장치는 광원, 즉 바람직한 광원으로 사용되는 레이저를 포함한다.
이러한 장치의 측정 셀은 본질적으로 입자를 방출하지 않고 빛, 특히 레이저 빔이 통과하게 하는 물질로 만들어져야 한다. 이러한 물질은 당업자에게 알려져 있다. 측정 셀은 예를 들어 PTFE(폴리테트라플루오르에틸렌)으로 만들어질 수 있다. 측정 셀은 100 ㎕ 보다 적은, 바람직하게는 30-50 ㎕ 및 더 바람직하게는 40 ㎕의 부피를 가진다.
본 발명에 따른 장치는 더 구체적으로 조절할 수 있는 신호 증폭 및 조절할 수 있는 작동점을 위해 적절한 광검출기를 포함한다.
그 광검출기는 예를 들어 열 검출기, 광다이오드, 특히 광전도체 검출기, 광전지 검출기, 전자사태 다이오드, 다이오드 어레이, 광증폭기로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 검출 장치로 구체적으로 20 ㎚ 내지 5 ㎛ 사이의 입자들이 측정된다.
또한, 본 발명은 적어도 두 개의 항체 결합 부위를 가진 검출될 정해진 입자, 예를 들어 단백질 또는 호르몬의 정성적 및/또는 정량적 검출을 위한 키트를 제공한다. 그 키트는 상기에 기술한 검출 장치, 정해진 입자에 특정적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 항체 및 샘플을 수용하기에 적절한 적어도 하나의 유체를 포함한다. 이러한 키트는 사용자의 특정 요구에 따라 디자인될 수 있고 결합 구성 요소 뿐만 아니라 즉시 매우 쉽게 그 키트를 가지고 본 발명에 따른 검출을 실행할 수 있는 설명서를 포함한다. 예를 들어, 이러한 키트는 적은 양의 혈액에서 특정 병원균의 검출을 위해 사용될 수 있고 또는 상기한 활용에서 표면 연구를 위해 사용될 수 있다.
도 3의 상세한 설명
이하에서 본 발명은 첨부된 개략적이고 예시적인 그러나 제한적이지 않는 본 발명에 따른 방법을 실행하기 위한 장치에 대하여 더욱 더 상세히 설명한다.
샘플 교환기(1)는 다른 항원 용액(예를 들어, 혈액 샘플) 뿐만 아니라 다른 항체 용액을 각각의 혼합 용기(2, 3)로 주입할 수 있고 샘플은 여러 가능한 병원균에 대하여 연속적으로 시험될 수 있다. 항원 및 항체 용액 각각을 위한 혼합 용기(2,3)는 각각의 용액의 희석 뿐만 아니라 측정 셀을 완충 용액(PBS) 또는 항체 용액으로 헹구기 위해 유용하다.
필터(4)는 교환할 수 있고 예를 들어 200 ㎚의 입자 크기를 가진다. 밸브(5)는 용액들이 검출 장치로 검출이 연속적으로 단일 시간 또는 무작위적으로 다수의 시간에 걸쳐 실행되는 측정 셀(6)로 개별적으로 또는 함께 흐를 수 있도록 개폐될 수 있다.
펌프(7)는 예를 들어 모든 용액을 인출하기 위한 작은 진공 펌프이다. 그 펌프는 밸브(5)에 연결되고, 측정 후에 측정 셀의 내용물을 폐기물 수용기(8)로 펌프질한다. 그 수용기(8)는 예를 들어 소독제 또는 살균제를 포함하여 모든 가능한 유해 물질들이 즉시 무해하게 된다.
만약 주입된 항체가 샘플의 항원과 반응하여 항원-항체 침전물을 형성한다면, 정해진 값을 초과하는 크기를 가진 입자들이 형성된다. 이러한 침전물은 여전히 운반 유체에 존재하는 정해진 값 이하의 크기를 가진 입자에서의 신호와는 상당히 다른 신호를 발생시킨다. 결과적으로, 이러한 반응물은 검출 장치에 의해 독특하게 검출된다. 검출 결과로부터 특정 물질이 샘플에 존재함을 알 수 있고 필요하다면 그 농도도 상기한 방법에 따라 결정될 수 있다.
만약 첫 번째 항체 용액의 주입 후에 검출 장치가 정해진 입자 크기 이상의 어떤 입자도 검출하지 않으면 또는 사용되는 항체와 특정적으로 반응하지 않는 다른 항원들이 샘플에 존재한다고 생각되면, 다른 항체 용액이 다음으로 주입될 수 있다. 이것에 선행하여, 검출되었던 어떤 침전물은 필요하다면 측정 셀에서 씻겨질 수 있다.
도 1a-1d는 2가 항체를 사용하여 항원-항체 침전물을 형성하는 과정을 걔략적으로 도시한 도면;
도 2a는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 입자를 포함한 샘플 유체가 (항체를 첨가하기 전에) 200 ㎚의 구멍 크기를 가진 필터로 여과된 후에 시험된 검출 결과를 도시한 도면으로, 신호는 사용된 필터의 구멍 크기보다 작은 직경을 가진 입자에 대응하고, x축은 입자 크기를 나타내며 y축은 입자의 수를 나타내는 도면;
도 2b는 200 ㎚의 구멍 크기를 가진 필터로 여과된 샘플 유체 및 항체 유체의 동시, 분리 주입에서 얻어진 반응 혼합물이 시험된 검출 결과를 도시한 도면으로, 상기 반응 결과물에서 반응이 발생하여 사용된 필터 구멍 크기보다 더 큰 직경을 가진 마이크로 침전물이 형성되며, x축은 입자 크기를 나타내고 y축은 입자의 수를 나타내는 도면; 및
도 3은 본 발명에 따른 방법을 실행하기 위한 장치의 개략도이다.
다음의 예는 본 발명을 설명하는 역할을 한다. 그러나, 본 발명의 보호 범위는 이하의 예의 주제에 한정되지 않는다.
예 1 :
BSE
혈액 테스트
독일에서 축우의 수는 약 1,500만 마리이다. 독일에서는 해마다 죽은 동물의 뇌에 대한 2백만 내지 3백만 BSE 테스트(ELISA 및 웨스턴 블록)가 실행된다. 현재, 빠른 BSE 테스트(ELISA 및 웨스턴 블록)도 6-8 시간이 걸린다. 본 발명에 따른 방법으로 BSE 병원균은 살아 있는 동물에서 단지 혈액 한 방울로 2분 이내에 검출될 수 있고 비용도 다소 줄어든다.
예 2 : 새로운 변형 크로이츠펠트-야콥병(
Creutzfeldt
-
Jakob
Disease:
nvCJD
)에 대한 저장된 혈액 검사
혈액을 통한 nvCJD 전달의 상상할 수 있는 위험으로부터 사람들을 보호하기 위한 여러 활동이 존재한다. 가장 가능성 있는 방법은 간염이나 에이즈와 같은 감염에 대하여 각 혈액 기부를 테스트하는 것이다. 그러나, 병원균은 아픈 사람에게서 미량이 존재한다. 종래 관련 분야에서는 어떤 신뢰할 수 있는 테스트가 존재하지 않는다.
본 발명에 따른 방법은 혈액 또는 혈액 제품에서 병원균을 검출할 수 있다.
예 3 : 음식 산업에서의 활용
미코톡신은 어떤 곰팡이의 상당히 독성이 있는 분해물이다. 미코톡신은 합텐이고 따라서 상기한 측정 방법으로 정성적 및 정량적으로 검출될 수 있다.
예를 들어 커피, 차, 밀가루 또는 견과의 전체량의 선별 시험을 위하여, 약 2분 이내에 현장에서 실행될 수 있는 정성 분석이면 충분할 것이다.
고기 샘플은 동물이 호르몬에 의해 불법적으로 사육되었는지를 밝히기 위하 여 약 15가지 적용할 수 있는 호르몬에 대하여 시험될 수 있다. 호르몬 역시 합텐이고 본 발명에 따른 방법으로 정성적 및 정량적으로 검출될 수 있다.
호르몬 테스트는 예를 들어 임신 테스트 및 갑상선 테스트에서 필요하다.
큰 도살장은 한 달에 2000-3000 마리 축우를 처리하고, 약 50-100 마리의 임의의 샘플들은 불법 사육을 밝히기 위하여 필요하다. 현재, 호르몬 테스트(15개의 다른 호르몬을 포함하여)의 비용은 고기 조각당 600 유로이다. 따라서, 달마다 단지 5-10마리의 임의의 샘플은 푸줏간 가게에서 시험되고, 이는 거의 불법적인 사육을 발견하지 못한다. 큰 도살장과의 대화에서, 본 발명에 따른 방법에 기초하여 10배 정도 더 싸게(고기 조각당 약 60-70 유로) 실행하는 것에 대하여 관심을 보였다. 종래 호르몬 테스트는 이 가격으로 실행하는 것이 불가능하다.
예 4 : 살충제 검출
튜뷸린 단량체는 에너지 벡터 GTP와의 반응에 의해 긴 체인으로 성장하는 작은 개별 단백질 구형체이다. 저해제 또는 다른 독소들은 이러한 체인 성장을 방해하거나 억제한다. 개별 체인은 로프와 같은 구조, 소위 프로토필라멘트를 형성하도록 얽힌다. 이러한 프로토필라멘트는 세포 분화에서 결정적인 역할을 하는 마이크로튜브를 형성하도록 결합된다. 단량체의 체인 형성을 간섭함으로써, 세포 분화를 제어할 수 있고 병원균을 죽일 수 있다.
역으로, 이러한 방법은 음식에서 식물 살충제 잔류물을 검출할 가능성을 제공하고, 따라서 소비자 보호를 향상시킨다. 상기한 체인 성장 및 그 방지는 본 발 명에 따른 방법으로 직접적으로 측정할 수 있다.
Claims (12)
- 정해진 최대 입자 크기이고 적어도 두 개의 항체 결합 부위를 가진 입자를 필수적으로 포함하는 샘플 유체를 제공하는 단계;정해진 최대 입자 크기를 가진 입자를 필수적으로 포함하는 항체를 포함하는 유체를 제공하는 단계;상기 샘플 유체를 상기 항체를 포함하는 유체와 접촉시켜 적어도 두 개의 항체 결합 부위를 가진 입자 존재시에 항체가 항원-항체 침전물을 형성할 수 있는 반응 유체를 형성하는 단계;상기 반응 유체에 광선을 통과시키는 단계; 및광검출기로 레이저에 의해 발생된 빛이 상기 반응 유체를 포함하는 측정 셀을 통과할 때 발생하는 빛 원뿔체의 밝고-어두운 경계에서 감광(extinction)을 측정함으로써, 형성된 항원-항체 침전물의 크기 및 수에 따라 강도가 좌우되는 신호를 검출하는 단계;를 포함하는 항원-항체 침전물을 검출함으로써 질량이 작은 입자를 검출하는 방법.
- 제1항에 있어서,펨토몰(femtomolar) 또는 아토몰(attomolar) 범위까지의 검출 감도를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,상기 정해진 최대 입자 크기를 가진 입자를 포함하는 샘플 유체를 제공하는 단계는:a) 유체를 제공하는 단계;상기 유체에 샘플을 주입하는 단계; 및정해진 최대 입자 크기를 가진 입자만을 포함하는 샘플 유체를 얻기 위하여 정해진 입자 크기를 초과하는 입자를 분리하는 단계; 또는b) 정해진 최대 입자 크기를 가진 입자를 포함하는 유체를 제공하는 단계; 및정해진 최대 입자 크기를 가진 입자를 포함하는 샘플 유체를 얻기 위하여 상기 정해진 최대 입자 크기를 가진 입자를 포함하는 유체에 샘플을 주입하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제3항에 있어서,정해진 최대 입자 크기를 초과하는 크기를 가진 입자의 분리는 여과에 의해 달성되고, 여과에 사용되는 필터는 20 - 450 ㎚의 구멍 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 필터는 100 - 300 ㎚의 구멍 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 필터는 200㎚의 구멍 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,상기 항체로서 적어도 두 개의 단클론성 항체 또는 하나의 다클론성 항체가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,상기 항체는 면역글로블린 G 또는 면역글로블린 M으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,입자의 분량이 정량적(quantitatively) 또는 반정량적(semiquantitatively)으로 검출되게 하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,항체의 농도가 일정한 경우, 측정된 신호의 감소는 항원의 농도와 직접적으로 관련이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법을 실행하기 위한 컴퓨터 프로그램이 저장된 컴퓨터로 판독가능한 매체.
- 검출될 정해진 입자의 정성적 및/또는 정량적 검출을 위한 키트로서, 상기 정해진 입자는 적어도 두 개의 항체 결합 부위를 가지고, 상기 키트는:정해진 입자에 특정적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항체;샘플을 수용하기에 적절한 하나 이상의 유체; 및레이저,측정 셀, 및상기 레이저에 의해 발생된 빛이 유체 내에 입자를 포함하는 상기 측정 셀을 통과할 때 발생하는 빛 원뿔체의 밝고-어두운 경계에서 감광(extinction)을 측정하도록 형성된 광검출기를 포함하는 질량이 작은 입자의 검출 장치;를 포함하는 키트.
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