JP2010008361A - 病原体検出チップ及び病原体検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】複数種類の病原体マーカーを簡便にかつ短時間で同時に検出することが可能な病原体検出チップを提供すること。
【解決手段】病原体から放出される病原体マーカーを特異的に検出し得る２種類以上の捕捉物質４が、基板３上に配置され、固定されていることを特徴とする病原体検出チップ。
【選択図】図１

Description

本発明は農場、食品工場、医療などの現場で迅速かつ簡便に病原体の有無の特定を精度よく実施することが可能な病原体検出チップおよび病原体検出方法に関するものである。

人や家畜を含む動物の疾病に対し、効果的な感染・伝染・予防対策を実施するため、中規模・小規模の病院施設や家畜を保有する農場など、現場（オンサイト）で病原体の有無の判断が可能となる簡便な技術への要求がある。

従来、病原体の有無や特定のために用いられてきた手法が培養法である（非特許文献１参照）。培養法は、試料を動物より採取し、専用の培地に塗布後、２４時間以上に渡って試料中に含まれていた病原体（病原菌）を培養して増殖させ、病原菌のコロニー形成数や状態を目視および計数器を用いて計測する方法である。この方法の問題点は、短時間で結果を得ることができないことと、危険性の高い病原菌を増殖させてしまう可能性があるため、病原菌を漏洩するリスクがあり、農場等の現場で実施するには好ましくない。
他に、ＰＣＲ法を用い、病原体のＤＮＡを増幅して特定する方法も用いられている（非特許文献２参照）。ＰＣＲ法は、測定操作は煩雑かつ装置も高価であることから、オンサイトで用いる迅速・簡便診断技術としては不適である。

一方、病原体が動物に感染すると、宿主である動物中にその病原体のマーカーとなる多種類の病原体感染由来物質（病原体マーカー）を放出することが知られている。病原体マーカーとなり得る物質は、病原体の一部や病原体が放出する毒素や酵素が知られる。これら病原体マーカーを生体試料より検出することで、試料の由来する動物が感染している病原体の特定を実施することも可能と考えられる。動物が病原体に感染した場合、感染した動物の健康状態や病原体そのものの遺伝子レベルの差により、生体試料中に放出される病原体マーカーの種類や濃度には差があることもよく知られている。よって、病原体マーカーより病原体の存在有無および特定を実施する場合、複数の病原体マーカーを同時に検査することで、病原体検出の確度が向上することになる。

病原体マーカーとなる分子の従来の測定法にＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked Immunoassay）がある（非特許文献３参照）。ＥＬＩＳＡでは、病原体マーカーを選択的に結合する抗体を用意し、プレートに並ぶ数百μＬの容量を有するウェル内で病原体マーカーの抗体と抗原たる病原体マーカーを含む可能性のある試料とを反応させ、反応物あるいは２次反応物を、存在濃度と相関する吸光・発光物質に化学的に変換して読み取る方法である。最適化されたプロトコルを用いることで、ＥＬＩＳＡは一つのターゲット分子に対し高感度な検出を可能とし、また、一般に９６ウェルプレートを用いることから、多数の試料を一度に測定することができる。ただし、一種類のプレートで測定できる病原体マーカーの種類は一種、あるいは、極めて類似の特性を持つ一群に限られる。特に、食品や製薬製品中に混入可能性のある毒素といった病原体マーカーそのものに重要な意味のある場合、ＥＬＩＳＡを用いた検査が有効である。

しかしながら、ＥＬＩＳＡ測定のためのプレート準備、洗浄、反応に要する操作は煩雑で、準備から測定結果が出るまでに数時間〜２日の時間を要する。複数の異なる特性を持つ病原体マーカーの検出を一度に実施するためには、複数のＥＬＩＳＡプロトコルを順に、あるいは人数をかけて平行して実施することとなり、特にオンサイトにおける迅速・簡易検出技術としては不適である。
家畜共済における臨床病理検査要領、平成１７年改訂 全国農業共済協会編 第９節 細菌検査、６ 分離培養法 p.301-307 Clinical Chemistry，vol.50 no.9 p.1673-1674，2004年 Diagnostic Microbiology and Infectious Disease， vol.42 p.9-15，2002年

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであって、複数種類の病原体マーカーを簡便にかつ短時間で同時に検出することが可能な病原体検出チップを提供することを目的とする。

本発明の請求項１に記載の病原菌検出チップは、病原体から放出される病原体マーカーを特異的に検出し得る２種類以上の捕捉物質が、基板上に配置され、固定されていることを特徴とする。
本発明の請求項２に記載の病原菌検出チップは、請求項１において、前記捕捉物質のうち、少なくとも１種類の捕捉物質が、基板上の２箇所以上の分割された領域に配置されていることを特徴とする。
本発明の請求項３に記載の病原体検出チップは、請求項１または２において、前記２種類以上の捕捉物質が、前記基板上に直線状に配されていることを特徴とする。
本発明の請求項４に記載の病原体検出チップは、請求項１〜３のいずれかにおいて、前記捕捉物質は、抗体、抗体フラグメント、酵素、抗血清、血球抽出成分、培養上清、腹水、又はインプリンティングポリマーであることを特徴とする。
本発明の請求項５に記載の病原体検出チップは、請求項１〜４のいずれかにおいて、前記病原体が細菌であり、動物を宿主とするものであることを特徴とする。
本発明の請求項６に記載の病原体検出チップは、請求項５において、前記細菌が黄色ブドウ球菌であることを特徴とする。
本発明の請求項７に記載の病原体検出チップは、請求項５において、前記細菌がレンサ球菌であることを特徴とする。
本発明の請求項８に記載の病原体検出チップは、請求項５〜７のいずれかにおいて、前記動物がヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタまたはウマであることを特徴とする。
本発明の請求項９に記載の病原体検出チップは、請求項６において、前記捕捉物質のうち、１種類はエンテロトキシンを特異的に検出し得る捕捉物質であり、もう１種類はプロテインＡを特異的に検出し得る捕捉物質であることを特徴とする。
本発明の請求項１０に記載の病原体検出チップは、請求項７において、前記捕捉物質のうち、１種類は溶血毒素を特異的に検出し得る捕捉物質であり、もう１種類はエキソトキシンを特異的に検出し得る捕捉物質であることを特徴とする。

本発明の請求項１１に記載の病原体検出方法は、検出対象とする２種類以上の病原体マーカーを選択する工程、前記病原体マーカーの各々を特異的に検出し得る２種類以上の捕捉物質を基板上に配置して固定し、病原体検出チップを作製する工程、宿主から採取した試料溶液を前記病原体検出チップに導入する工程、及び前記試料溶液中に含まれる前記病原体マーカーと前記捕捉物質とを吸着させ、生じた反応信号を同時に検出する工程を有することを特徴とする。
本発明の請求項１２に記載の病原体検出方法は、請求項１１において、前記病原体検出チップに、前記捕捉物質のうち、少なくとも１種類の捕捉物質を、前記基板上の２箇所以上の分割された領域に配置することを特徴とする。
本発明の請求項１３に記載の病原体検出方法は、請求項１１または１２において、前記反応信号が、表面プラズモン共鳴信号であることを特徴とする。
本発明の請求項１４に記載の病原体検出方法は、請求項１１〜１３のいずれかにおいて、前記反応信号の解析において、横軸を時間、縦軸を測定シグナルとした際に、下記数式（１）または数式（２）のいずれかを用いて捕捉物質と病原体マーカーとの結合の開始時刻における応答傾きｐ値を求めた後、得られたｐ値を用いて、試料中における病原体マーカーの有無を検出することを特徴とする。ただし、数式（１）において、ΔＭは単位時間あたりにおける病原体マーカー吸着量の増加分、ΔＭｍａｘは病原体マーカーの平衡（最大）吸着量、τは時定数である。また、数式（２）において、ΔＭは単位時間あたりにおける病原体マーカー吸着量の増加分、ΔＭｍａｘは病原体マーカーの平衡（最大）吸着量、τは時定数である。

本発明の請求項１５に記載の病原体検出方法は、請求項１２または１３において、前記反応信号の解析において、横軸を時間、縦軸を測定シグナルとした際に、下記数式（３）または数式（４）のいずれかを用いて捕捉物質と病原体マーカーとの結合の開始時刻における応答傾きｐ値を各領域に対して求めた後、同種の捕捉物質が配されている領域のｐ値を平均化し、平均化されたｐ値を用いて、試料中における病原体マーカーの有無を検出することを特徴とする。ただし、数式（３）において、ΔＭは単位時間あたりにおける病原体マーカー吸着量の増加分、ΔＭｍａｘは病原体マーカーの平衡（最大）吸着量、τは時定数である。また、数式（４）において、ΔＭは単位時間あたりにおける病原体マーカー吸着量の増加分、ΔＭｍａｘは病原体マーカーの平衡（最大）吸着量、τは時定数である。

本発明により、培養という時間および感染拡大のリスクを有する手段、あるいは、ＥＬＩＳＡやＰＣＲに代表されるような測定操作が煩雑な手段を用いなくても、簡便にかつ迅速に複数の病原体マーカーを同時に検出することができ、精度よく病原体の感染の有無を診断することが可能となる。
特に、病原体マーカーと捕捉物質との結合を測定する際に、例えば測定装置として表面プラズモン共鳴測定装置（以下、ＳＰＲ測定装置ということがある）を用いた場合、測定操作が一検体につき１５分程度で終了することから、従来の測定方法と比べ、飛躍的に短時間で病原体の有無を検出することができる。更に、ＳＰＲ測定装置としてポータブルな小型装置を適用可能であることから、オンサイトでの病原体感染の有無を迅速に診断することが可能となる。また、リアルタイムで試料中に含まれる病原体マーカーの濃度の推定が可能となる。

以下、本発明を、図面を参照して詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、本発明の主旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。

図１は、本発明の病原体検出チップ１０を模式的に示した図である。図１（ａ）は、図１（ｂ）における病原体検出チップ１０のＬ−Ｌ断面図、図１（ｂ）は、病原体検出チップ１０の上面図である。
本発明の病原体検出チップ１０は、病原体から放出される病原体マーカーを特異的に検出し得る２種類以上の捕捉物質４が、基板３上に配置され、固定されている。また、基板３の少なくとも捕捉物質４が配された領域αが露呈するように、開口部５ａを設けたシート体５が基板３の一面３ａに配されている。そして、このシート体５上には、開口部５ａを覆うように蓋体６が配され、開口部５ａと外部とを連通する貫通孔６ａ，６ｂが設けられている。以下、病原体検出チップ１０に関して、詳細に説明する。

病原体とは、宿主に対して病原性を有した細菌、ウイルス、寄生虫等であり、本発明における病原体としては、病原菌（病原性細菌）であることが好ましい。この病原菌としては、例えば黄色ブドウ球菌（S.aureus）、表皮ブドウ球菌（例えばS.xylosus）、レンサ球菌等が挙げられる。

病原体マーカーは、これら病原体が宿主に感染した際に、宿主に放出される病原体特有のタンパク質や核酸等の生体成分である。病原体特有のタンパク質としては、例えば病原体が黄色ブドウ球菌や表皮ブドウ球菌等のブドウ球菌であった場合、黄色ブドウ球菌あるいは表皮ブドウ球菌等に特異的なプロテインＡや耐熱性のエンテロトキシン（エンテロトキシンＢ、エンテロトキシンＣ及びエンテロトキシンＤ）、ＴＳＳＴ−１、ロイコシジン、ヘモリシン、スタフィロキナーゼ等が挙げられる。また、病原体がレンサ球菌であった場合、病原体特有のタンパク質としては溶血毒素、エキソトキシン等が挙げられる。

宿主としては、本明細書では動物を指し、ヒトや食用動物である。食用動物としては、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、魚、鳥等であり、このうち、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ等の家畜が好ましい。

捕捉物質４は、病原体から排出された病原体マーカーと特異的に結合し得るものである。本発明の病原体検出チップにおいては、病原体マーカーと特異的に結合し得る２種類以上の捕捉物質が用いられる。この捕捉物質４としては、例えば抗体や抗体フラグメント、酵素、抗血清、血球抽出成分等を用いることができる。ここで、抗血清としては、上述した宿主由来のものを用いることができる。
血球抽出成分は、例えばカブトガニやアメボサイトのライゼートを用いることができ、アメボサイトに蒸留水を加え、４℃にてテーブル上で一晩旋回して振とうすることで、該アメボサイトを破裂され、その上澄み液を用いることができる。あるいは、カブトガニやアメボサイトの０．０２Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えてホモジナイザーで破砕・抽出し、その上澄み液を採取して用いることができる。
また、捕捉物質４として、培養上清や腹水を用いることができる。培養上清や腹水を用いた際は、これら培養上清や腹水中に存在し、特異抗体を介して病原体マーカーと選択的に吸着をするタンパク質を用いる。
培養上清は、病原体マーカー４の一つをマウスに免疫させて得られるハイブリドーマを培養し、該培養に用いた培養液を、培養上清として用いる。この培養上清を用いる際は、基板３上にあらかじめ抗マウスＩｇＧ抗体を固定し、その上に該培養上清を滴下して、目的とする抗体（マウスに免疫させた病原体マーカーに対する抗体）を、前記抗マウスＩｇＧ抗体を介して基板３上に固定させて用いる。
また、腹水は、病原体マーカー４の一つをマウスに免疫させて得られるハイブリドーマをマウスに移植し、腹水を採取することで得られる。この腹水を用いる際は、培養上清の際と同様に、基板３上にあらかじめ抗マウスＩｇＧ抗体を固定し、その上に腹水を滴下して、目的とする抗体（マウスに免疫させた病原体マーカーに対する抗体）を、前記抗マウスＩｇＧ抗体を介して基板３上に固定させて用いる。
また、捕捉物質４として、病原体マーカーそのものをポリマー内に担持させて作製する合成ポリマー（インプリンティングポリマー）を適用することも可能である。

病原体として黄色ブドウ球菌を検出する際は、上述した黄色ブドウ球菌の病原体マーカー（プロテインＡや耐熱性のエンテロトキシン（エンテロトキシンＢ、エンテロトキシンＣ及びエンテロトキシンＤ）、ＴＳＳＴ−１、ロイコシジン、ヘモリシン、スタフィロキナーゼ）を特異的に検出し得る捕捉物質４を基板３上に配置して固定し、病原体としてレンサ球菌を検出する際は、上述したレンサ球菌の病原体マーカー（溶血毒素、エキソトキシン等）を特異的に検出し得る捕捉物質４を基板３上に配置して固定する。

従来は、１種類の捕捉物質で１種類あるいは多種類の病原体マーカーを検出していたため、試料の状態や測定状況に応じて検出感度に劣る虞があった。本発明によれば、複数の病原体マーカーを別個に検出する捕捉物質４が基板３上に配置されているため、感染の有無をより確度よく検出することが可能となる。

捕捉物質４は、基板３上にアレイ状に配置して固定することができる。２種類以上の捕捉物質４をアレイ状に配置することで、少量の試料溶液で一度に複数種の病原体マーカーの検出が可能となる。
また、２種類以上の捕捉物質のうち、少なくとも１種類の捕捉物質が、２箇所以上の分割された領域に配置されていることが好ましい。各々の領域で得られた測定結果の平均を算出することで、より精確に病原体マーカーの検出を行うことができる。

病原体マーカーの検出に表面プラズモン共鳴測定装置（以下、ＳＰＲ測定装置ということがある）を用いる際は、２種類以上の捕捉物質４は、基板３上に直線状に隣接して配されていることが好ましい。同時に複数の病原体マーカーの検出が可能となり、検出時間の短縮化が図れると共に、測定に必要とする試料溶液の量を削減することができる。
なお、図１は、捕捉物質として４種類（第一捕捉物質４ａ、第二捕捉物質４ｂ、第三捕捉物質４ｃ、第四捕捉物質４ｄ）を用い、第二捕捉物質４ｂ、第三捕捉物質４ｃ及び第四捕捉物質４ｄがそれぞれ、２箇所の分割された領域に直線状に隣接して配された場合を例示したものである。

基板３は、透明性を有した第一基板１と、第一基板１の一面１ｂの少なくとも一部に配された金属薄膜２とから構成されている。第一基板１は、例えばガラス、プラスチック等を用いることができる。また、厚さは、例えば０．５ｍｍ以上８ｍｍ以下である。
金属薄膜２は、例えば金からなり、平板状の薄膜である。本発明の検出チップ１０をＳＰＲ測定装置に適用する際は、エバネッセント波の染みだしが必要であるため、金属薄膜２の厚さは２０ｎｍ以上１００ｎｍ以下とすることが好ましい。

また、基板３の一面３ａには、少なくとも捕捉物質４が配された領域αが露呈するように開口部５ａを設けたシート体５が配されている。そして、このシート体５上には、開口部５ａを覆うように蓋体６が配され、開口部５ａと外部とを連通する貫通孔６ａ，６ｂが設けられている。貫通孔６ａ（インレット６ａ）より試料溶液が開口部５ａに導入され、その後、貫通孔６ｂ（アウトレット６ｂ）より試料溶液が排出される。この開口部５ａと貫通孔６ａ，６ｂとは、試料溶液を通す流路として働く。試料溶液の送液用に、周辺装置として小型の送液ポンプ装置を用いるほか、吸収パッドや毛細管現象を利用した試料を送液する機構を備えたチップを用いることができる。

試料溶液としては、生体試料や、生体試料から得られた培養物、及びこれらから抽出した試料溶液であってもよい。生体試料としては、例えば乳や唾液、血液、尿、母乳等が挙げられる。

シート体５としては、例えばＰＤＭＳ、ポリアクリル酸、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、シラン架橋ポリオレフィン等のポリマーが適用可能である。また、その厚さは例えば１０μｍ〜１ｍｍ程度である。

蓋体６としては、シート体５と同様に例えばＰＤＭＳ、ポリアクリル酸、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、シラン架橋ポリオレフィン等のポリマーが適用可能である。この蓋体６に形成された貫通孔（インレット６ａ及びアウトレット６ｂ）の大きさとしては、例えばその直径が０．５ｍｍ〜２ｍｍ程度である。

＜病原体マーカーの検出＞
病原体マーカーの検出に用いる測定装置としては、金属薄膜２が配された基板３上において、タンパク質の吸着現象を測定できる装置が適用できる。この装置としては、例えば全反射光学系を有しアレイを個々に測定可能な紫外光測定装置、赤外光測定装置を用いることもできるが、望ましくは、ＳＰＲ測定装置を用いる。
ＳＰＲ測定装置を用いた場合、検出感度に優れるため、測定操作が一検体につき１５分程度で終了することから、従来の病原体検出方法と比べ、飛躍的に短時間で病原体の有無を検出することができる。また、操作が簡便であることから作業性に優れている。そのため、短時間で測定できることと合わせ、所定時間内により多くの試料溶液を測定することができる。また、リアルタイムで病原体マーカーの検出が行えることから、測定中に試料溶液中に含まれる病原体マーカーの濃度の推定が可能となる。
特に、ＳＰＲ測定装置として小型のポータブルタイプのＳＰＲ測定装置を用いることで、オンサイトでの迅速診断が可能となる。

図２は、本発明の病原体検出チップ１０と、測定装置としてＳＰＲ測定装置２０とを用いて病原体マーカーを検出する際の様子を模式的に示した図である。

ＳＰＲ測定装置２０は、金などの金属薄膜２表面から数百ｎｍの範囲の屈折率の変化を検出できるもので、光を試料の反対面２ａからある角度で入射し、そのエバネッセンス波と表面プラズモンとが共鳴する角度を測定する。
より具体的には、光源２１から発した出射光２５はくさび形の光に集光し、半円柱状のプリズム２２に入射する。プリズムの底部には、屈折率を合わせるためのマッチングオイルを介して被測定部分βを配置し、この被測定部分βに全反射の条件下で光を照射する。金属薄膜２の捕捉物質が配された側に生じるエバネッセンス波と表面プラズモン波とは、ある入射角で共鳴を起こす。この時、ＣＣＤカメラ２４によって反射光２６の強度を測定すると、共鳴が起こる角度で反射率の低い谷が観察される。共鳴が起こる角度は、金属薄膜２表面２ｂの屈折率に依存するため、病原体マーカーと捕捉物質とが結合すると金属薄膜２表面２ｂの屈折率が変化し、谷の現れる角度が変化する。この経時変化を測定することにより、試料溶液中における病原体マーカーの有無あるいは濃度を検出することができる。

まず、病原体マーカーの検出にあたり、感染の有無を調べたい病原体と、病原体の同定に用いる病原体マーカーとを決定する。例えば牛乳房炎の診断に適用する場合では、主要な病原体の一つが黄色ブドウ球菌となるため、黄色ブドウ球菌に特異的なプロテインＡや耐熱性エンテロトキシン（例えばエンテロトキシンＢ、エンテロトキシンＣ、エンテロトキシンＤなど）を病原体マーカーとして設定する。
次に、これら病原体マーカーを特異的に検出し得る捕捉物質４として、例えば抗体等を金属薄膜２（金薄膜）の表面２ｂに固定する。抗体を基板３上に固定する方法としては、抗体を含む溶液を金属薄膜２上に滴下することで、該抗体のチオール基が金薄膜２と共有結合し、固定することができる。その後、シート体５と蓋体６とを基板３に設置し、貫通孔（インレット）６ａから試料溶液を導入し、金属薄膜２表面２ｂにおける屈折率の変化（シグナル）を取得する。

その後、捕捉分子４が配された領域における金属薄膜２表面２ａのシグナルの時間的変化をデータ処理し、該データ処理で得られた吸着速度に依存する値を求め、これらの値の比較により、病原体マーカー検出の有無を評価する。
以下に、シグナルの時間的変化のデータ処理について述べる。

抗原抗体反応を含む病原体マーカーと捕捉物質４との吸着現象は、吸着サイト（捕捉物質４）への吸着物（病原体マーカー）の吸着量が測定できる場合、吸着物がある一定濃度で存在すると、その吸着量は吸着時間に伴い吸着式にのっとって増加していくと考えられる。
例えばＬａｎｇｍｕｉｒ型の吸着式を使うと、吸着サイトの濃度が一定の条件にある場合、すなわち、抗体が固定化された病原体検出チップのように、吸着サイトが基板３上に固定されている場合、単位時間あたりの吸着量の増加分ΔＭは、平衡（最大）吸着量ΔＭｍａｘと時定数τを使って次の数式（５）のように表される。

また、Ｌａｎｇｍｕｉｒ式以外として、次式の数式（６）で表される擬２次速度式を用いてもよい。

捕捉分子４それぞれの応答を、上記いずれかの式にフィッティングし、捕捉物質４と病原体マーカーとの結合の開始時刻における応答傾きを求めて、この値をパラメータｐ値とする。この際、ｐ値は吸着物の濃度に依存する値である。

ある特定の病原体マーカーに対する捕捉物質４のアレイによる測定で、捕捉物質４それぞれに対するｐ値が得られたとき、測定装置における測定下限界値を超えた有意値であるかを調べる。なお、測定装置における測定下限界値は、あらかじめ測定装置の性能テストにより求めておく値である。また、ｐ値が異常に高い値（例えば、１×１０^１以上）を示した場合も、異常値として有意性が無いと判断される。すなわち、ｐ値の範囲が、測定限界値以上１×１０^１未満となった際に、ｐ値は有意である。本発明で用いる病原体検出チップにおいて、１の病原体に由来する複数の病原体マーカーをそれぞれ特異的に検出し得る捕捉物質が基板上に固定してあるため、一つでもｐ値として有意である病原体マーカーが検出された場合、試料溶液の由来する動物が検出対象である病原体に感染していると判断される。
ここで、ｐ値の上限が１×１０^１であるのは、１×１０^１以上の極めて反応速度の大きい抗原抗体反応が存在した際は、金属薄膜表面における捕捉物質と病原体マーカーとの結合による屈折率の変化が、高濃度の病原体マーカーを含有した試料溶液そのもの（バルク）を金薄膜表面に導入した際に生じる屈折率の変化と同レベルとなってしまうためである。すなわち、屈折率の変化が、病原体マーカーと捕捉物質との結合によるものなのか、試料溶液そのものによるものなのかが区別し難くなる。

また、捕捉物質４として、同じ種類の捕捉物質４を基板３上に複数固定化することで、同種の捕捉物質４が配されている領域から得られるｐ値の平均を取ることが可能となり、より精度の高い検出が可能となる。なお、検出する病原体マーカーを同じとする捕捉物質４を、複数個所アレイに含めることも、検出の確度を上げるために有効となる。

＜病原体検出チップの作製＞
図１に示す病原体検出チップを作製した。ＢＫ７ガラス上に金薄膜を５０ｎｍの厚さで形成して基板を作製した。その後、基板（金薄膜）上に捕捉物質として抗エンテロトキシンＢ抗体、抗エンテロトキシンＣ抗体、抗エンテロトキシンＤ抗体、抗プロテインＡ抗体を図３に示すように固定化した。図３において、抗エンテロトキシンＢ抗体が４Ｂ、抗エンテロトキシンＣ抗体が４Ｃ、抗エンテロトキシンＤ抗体が４Ｄ、抗プロテインＡ抗体が４Ａである。
抗体の基板への固定化は次のように行った。ぞれぞれの抗体を含む緩衝液を、各液滴が混じり合わないように滴下し、３０分以上、軽く振動させながら固定化させた。滴下はピペットを用いた手技による方法、あるいは、スポット装置を使用する方法のいずれかを使った。次に、抗体を含む緩衝液を取り除いて、緩衝液で抗体が固定化された基板の表面を洗浄した後、ブロッキング剤（Protein-Free T20（TBS）Blocking Buffer）を滴下し、６０分以上のブロッキングを実施した。

＜病原体マーカーの測定＞
測定装置には、図２に示すような小型の表面プラズモン共鳴測定装置を用いた。また、試料溶液としては、牛乳中にエンテロトキシンＢ，エンテロトキシンＣ，エンテロトキシンＤ、プロテインＡを各々既知濃度混入させた試料を調整したものを用いた。シリンジポンプを用い５μＬ・ｍｉｎ^−１の流速で、試料をチップのインレットから導入し、基本性能を測定した。その結果の一例を図４に示す。図４において、横軸は時間、縦軸は測定シグナル強度を示している。なお、測定装置の測定下限界値は８．０×１０^−３であった。

図４は、１μｇ／ｍＬのプロテインＡを混入させた牛乳を試料溶液として用いたものの結果である。実線はフィッティング曲線、点線は時刻０における傾き、すなわちパラメータｐを表す直線である。得られた応答からＬａｎｇｍｕｉｒ型の吸着式を用いてパラメータｐを求めたところ、パラメータｐは０．２４９６であった。ｐが８．０×１０^−３ 以上かつ１．０×１０^１以下であることから、有意であると判断できる。

次に、図３と同様な捕捉物質アレイを有する病原体検出チップを用い、黄色ブドウ球菌に感染した試料溶液６種類（試料１〜６）と無感染試料溶液２種類（試料溶液７〜８）を測定した。その結果を図５に示す。また、試料１〜８におけるｐ値の結果を表１に示す。
なお、図５は、黄色ブドウ球菌に感染した試料溶液（試料２）を用いた際の結果である。図５において、横軸は時間、縦軸は測定シグナル強度を示している。また、測定装置の測定下限界値は８．０×１０^−３であった。また、表中、ＳＥＢはエンテロトキシンＢを、ＳＥＣはエンテロトキシンＣを、ＳＥＤはエンテロトキシンＤを、ＰｒｏＡはプロテインＡをそれぞれ意味している。

表１から、無菌試料（試料７，８）に対してはどの病原体マーカーについても検出されなかった。感染試料については、６種類全ての試料について感染と判断された。２種の抗原によって感染と判断されたものが３試料（試料１，２，６）、１種の抗原によって感染と判断されたものが３試料（試料３，４，５）であった。このように、従来では仮に抗エンテロトキシンＢに対する抗体のみを用いて検出を行った場合では、感染試料１〜６のうち、試料６のみ陽性と検出される場合であっても、捕捉物質として抗体を複数種類、病原体検出チップに備えることにより、病原体の検出精度の向上が図れる。

本発明の病原体検出チップ及び病原体検出方法を用いることで、病原体の検出精度の向上が図れると共に、オンサイトでの迅速な検出が可能となる。

本発明の病原体検出チップの一例を模式的に示した図である。 病原体検出チップと表面プラズモン共鳴測定装置とを用いた病原体の検出概要を模式的に示した図である。 実施例における抗体の配置を模式的に示した図である。 プロテインＡ１μｇ／ｍＬに対する応答曲線を示した図である。 黄色ブドウ球菌感染試料におけるＳＰＲ測定結果の一例を示したグラフである。

符号の説明

１ 第一基板、２ 金属薄膜、３ 基板、４ 捕捉物質、５ シート体、５ａ 開口部、６ 蓋体、６ａ 貫通孔（インレット）、６ｂ 貫通孔（アウトレット）、１０ 病原体検出チップ、２０ ＳＰＲ測定装置、２１ 光源、２２ プリズム、２３ 偏光子、２４ ＣＣＤカメラ、２５ 出射光、２６ 反射光、α 捕捉物質が配された領域、β 被測定部分。

Claims (15)

1. 病原体から放出される病原体マーカーを特異的に検出し得る２種類以上の捕捉物質が、基板上に配置され、固定されていることを特徴とする病原体検出チップ。
2. 前記捕捉物質のうち、少なくとも１種類の捕捉物質が、基板上の２箇所以上の分割された領域に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の病原体検出チップ。
3. 前記２種類以上の捕捉物質が、前記基板上に直線状に配されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の病原体検出チップ。
4. 前記捕捉物質は、抗体、抗体フラグメント、酵素、抗血清、血球抽出成分、培養上清、腹水、又はインプリンティングポリマーであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の病原体検出チップ。
5. 前記病原体が細菌であり、動物を宿主とするものであることを特徴とする請求項１〜４に記載の病原体検出チップ。
6. 前記細菌が黄色ブドウ球菌であることを特徴とする請求項５に記載の病原体検出チップ。
7. 前記細菌がレンサ球菌であることを特徴とする請求項５に記載の病原体検出チップ。
8. 前記動物がヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタまたはウマであることを特徴とする請求項５〜７のいずれかに記載の病原体検出チップ。
9. 前記捕捉物質のうち、１種類はエンテロトキシンを特異的に検出し得る捕捉物質であり、もう１種類はプロテインＡを特異的に検出し得る捕捉物質であることを特徴とする請求項６に記載の病原体検出チップ。
10. 前記捕捉物質のうち、１種類は溶血毒素を特異的に検出し得る捕捉物質であり、もう１種類はエキソトキシンを特異的に検出し得る捕捉物質であることを特徴とする請求項７に記載の病原体検出チップ。
11. 検出対象とする２種類以上の病原体マーカーを選択する工程、
    前記病原体マーカーの各々を特異的に検出し得る２種類以上の捕捉物質を基板上に配置して固定し、病原体検出チップを作製する工程、
    宿主から採取した試料溶液を前記病原体検出チップに導入する工程、
    及び前記試料溶液中に含まれる前記病原体マーカーと前記捕捉物質とを吸着させ、生じた反応信号を同時に検出する工程を有することを特徴とする病原体検出方法。
12. 前記病原体検出チップに、前記捕捉物質のうち、少なくとも１種類の捕捉物質を、前記基板上の２箇所以上の分割された領域に配置することを特徴とする請求項１１に記載の病原体検出方法。
13. 前記反応信号が、表面プラズモン共鳴信号であることを特徴とする請求項１１または１２に記載の病原体検出方法。
14. 前記反応信号の解析において、横軸を時間、縦軸を測定シグナルとした際に、下記数式（１）または数式（２）のいずれかを用いて捕捉物質と病原体マーカーとの結合の開始時刻における応答傾きｐ値を求めた後、得られたｐ値を用いて、試料中における病原体マーカーの有無を検出することを特徴とする請求項１１〜１３のいずれかに記載の病原体検出方法。
    

    

    （ただし、ΔＭは単位時間あたりにおける病原体マーカー吸着量の増加分、ΔＭｍａｘは病原体マーカーの平衡（最大）吸着量、τは時定数である。）
    

    

    （ただし、ΔＭは単位時間あたりにおける病原体マーカー吸着量の増加分、ΔＭｍａｘは病原体マーカーの平衡（最大）吸着量、τは時定数である。）
15. 前記反応信号の解析において、横軸を時間、縦軸を測定シグナルとした際に、下記数式（３）または数式（４）のいずれかを用いて捕捉物質と病原体マーカーとの結合の開始時刻における応答傾きｐ値を各領域に対して求めた後、同種の捕捉物質が配されている領域のｐ値を平均化し、平均化されたｐ値を用いて、試料中における病原体マーカーの有無を検出することを特徴とする請求項１２または１３に記載の病原体検出方法。
    

    

    （ただし、ΔＭは単位時間あたりにおける病原体マーカー吸着量の増加分、ΔＭｍａｘは病原体マーカーの平衡（最大）吸着量、τは時定数である。）
    

    

    （ただし、ΔＭは単位時間あたりにおける病原体マーカー吸着量の増加分、ΔＭｍａｘは病原体マーカーの平衡（最大）吸着量、τは時定数である。）

Images