JP5706300B2 - 測定チップ、センサシステムおよび測定方法 - Google Patents
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Description
また、疾病を診断する場合には、ダイアグラムに基づいて疾病を特徴付ける種々のマーカー分子の濃度または濃度比、時間的な変化を測定することによって、疾病の判断や原因の推定などが行われている。一例として、血液の凝固能の検査では、血液凝固系の転換系(例えば、非特許文献2,3参照。)と、活性化経路とが知られており、図18に示すようなダイアグラムが用いられている。このダイアグラムによれば、分子濃度と凝固の状態を測定することにより、凝固能の異常を引き起こしている原因を推定することができる。
上述したようにサンプルに含まれる菌の判別や疾病の診断は、図16〜図18で示したようなダイアグラムに表すことができる。また、糖・脂質・アミノ酸・核酸などの代謝物の経路やサイトカイン類の反応経路も、同様のダイアグラムで表すことができる(例えば、非特許文献5,6参照。)。従来では、このようなダイアグラムに沿ってサンプルに含まれる物質の測定を行っていたが、この測定に要する時間は、(2)ダイアグラムの各ノードを逐次実行するための累積時間、(2)ダイアグラムの各ノードにおける測定時間、によって長くなっていた。
このような構成を採ることにより、(1)については、各捕捉物質を流路に固定して、この流路にサンプルを流通させることによりダイアグラムの各ノードに示される検査を並列に実行することによって、全体の測定時間を短縮することができる。また、(2)については、各ノードにおける個々の検査を、吸着量を経時的に測定することにより吸着速度を算出して、この吸着速度から被捕捉物質の濃度を測定することによって測定時間を短縮することができる。
また、サンプルの前処理にかかる時間を省略するために、サンプルを直接センサに導入することにより、サンプルの粘度、密度の変位、差異等によって生じる流路中の流れの変動を測定し、この測定結果から被捕捉物質の濃度を補正する。
また、ダイアグラムの判定項目が非常に多い場合には、ダイアグラムの中から、最終判断に近い位置の判定項目を選択する。それ以外の判定項目は、エピトープ((epitope) は、抗体が認識する抗原の一部分のこと)の異なる複数のモノクロナル抗体(単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体(免疫グロブリン)分子)を用いるか、ポリクロナル抗体(動物に抗原を投与して得られる抗体分子の総称)を用いるのが好ましい。
さらに、マイクロTAS技術を使ったセンサでは、サンプルの粘度や密度の違いによってマイクロ流路が詰まる可能性がある。このように性状の一定しない生体サンプルを測定する場合には、分散剤、界面活性剤、安定剤等を含むコンディショニングバッファでサンプルを希釈したり、遠心分離やフィルターで大粒径成分を除去したりするなどの方法を採ることが望ましい。
次に、本発明に係る第1の実施の形態について詳細に説明する。
本実施の形態に係るセンサシステムは、牛乳中の菌を判別するためのセンサシステムであって、図1に示すように、自己送液型マイクロ流路チップを構成する測定チップ1と、この測定チップ1を搭載するマルチチャンネル屈曲率センサ(以下、「SPRセンサ」と言う。)20と、この屈曲率センサ20からの出力に基づいて各種演算を行う演算装置30とを備えている。
図2〜図4に示すように、測定チップ1は、平面視略矩形の基板2と、この基板2上に配設されるスペーサ部材3と、このスペーサ部材3上に配設されるキャピラリーポンプユニット4とから構成されている。
このような測定チップ1には、試料液体が導入される導入部11と、この導入部11に一端が接続された測定流路12と、この測定流路12の他端から二手に分岐される分岐流路13と、この分岐流路13に接続して測定流路12の両脇に配置された吸引流路14と、この吸引流路14上に配置されたキャピラリーポンプ15と、このキャピラリーポンプ15の上部に配置された排出部16とが設けられている。なお、排出部16は必ずしも設けられていなくともよい。
ここで、マッチングシート5は、測定チップ1をSPRセンサ20に搭載する際に、マッチングシート5が接触するプリズム21および基板2の屈折率に整合したシリコン系のゴムやゲル状の透明シートから構成される。本実施の形態においては、2液混合タイプで硬化後の屈折率が1.53の透明シリコンゴムを基板2の下面に滴下し、塗布しすることにより、厚さ0.1mmのマッチングシート5を形成した。このようなマッチングシート5を設けることにより、容易にプリズム21と測定チップ1を光学的に接着することができ、迅速な測定チップの交換が可能になり、また、プリズム21面上の埃を測定チップの交換の度に除去できる。
また、金属膜6は、基板2上面に形成された金属の薄膜から構成される。本実施の形態においては、蒸着によってチタンを基板2上面に設けることにより、厚さ約50ナノメートルの金属膜6を形成する。
また、キャピラリーポンプユニット4には、スペーサ部材3における分岐溝3cおよび矩形孔3dに対応するようにして円柱孔4cが形成されており、より詳細には、分岐溝3cに対応する箇所には、分岐溝3cの幅方向に1つが配設されてるように円柱孔4cが形成されており、さらに、矩形孔3dに対応する箇所には、矩形孔3d上に二次元的に配設されるように円柱孔4cが形成されている。なお、分岐溝3cに対応する箇所には、分岐溝3cの幅方向に2つ以上の円柱孔4cが配置されていてもよい。
ここで、円柱孔4cの径は、試料液体に対して毛細管現象が発現する大きさとされている。これにより、複数の円柱孔4cが毛細管現象により試料液体を吸引するキャピラリーポンプ15として機能することとなる。
この際、キャピラリーポンプユニット4の連通部分4bとスペーサ部材3の円形孔3aとが重なり合うことにより、試料液体が導入される導入部11が形成される。
また、スペーサ部材3の流路溝3bの下方が基板2上面の金属膜6、流路溝3bの上方がキャピラリーポンプユニット4の下面によってそれぞれ閉塞されることにより、導入部11に導入された試料液体が流通する測定流路12が形成される。
同様にして、スペーサ部材3の分岐溝3cの上方がキャピラリーポンプユニット4の下面によって閉塞されることで、測定流路12を通った試料液体が流通する分岐流路13が形成される。また、スペーサ部材3の矩形孔3dの上方がキャピラリーポンプユニット4の下面によって閉塞されることで、キャピラリーポンプ15によって試料液体が吸引される吸引流路14が形成される。
これにより、導入部11に導入された試料液体は、測定流路12、分岐流路13および吸引流路14内を毛細管現象により進行していくことになる。また、分岐流路13および吸引流路14に到達した試料液体は、毛細管現象により貫通孔13cに吸い上げられる。すると、測定流路12内を試料液体が所定の流速で移送されることとなる。この測定流路12を通過する際にSPR装置20により表面プラズモン共鳴現象を利用した測定が実施される。この表面プラズモン共鳴現象を利用した測定は、測定対象のサンプルが接触した金属(本実施の形態においては金属膜6)の表面における、エバネッセント波と表面プラズモン波との共鳴を用いるものである。したがって、金属膜6上の測定流路12の領域がSPR装置20による観測領域となる。
本実施の形態においては、後述するように、牛乳中の菌を判別するための9個の捕捉物質スポット101を設けている。
また、捕捉物質スポット101および非捕捉物質スポット102は、免疫測定で用いられるブロッキング剤で形成されている。例えば、DSファーマバイオメディカル(登録商標)社製ブロックエースを用いることができる。
被捕捉物質と捕捉物質のスポットは、そのスポット内では均一な屈折率を有することが望ましい。
また、捕捉物質スポット101および非捕捉物質スポット102を形成した後に、基板2上に非特異吸着を防ぐブロッキング処理を施して、捕捉物質スポット101および非捕捉物質スポット102の上にブロッキング剤が設けられた状態とするようにしてもよい。
SPRセンサ20は、図1に示すように、光源22からプリズム21を介して測定チップ1に対して光を照射し、CCDカメラ23によって測定チップ1により反射された反射光の強度を測定することで、測定チップ1上に生じるエバネッセンス波と表面プラズモンとの共鳴角度を測定する。これらの測定結果は、演算装置30に出力される。なお、図1において、符号24は、光源22からの光を透過するレンズ、符号25は、測定チップ1から反射された反射光を透過するレンズを示している。このようなSPRセンサ20に対して、測定チップ1はプリズム21上にマウントされた状態で用いられる。このようなSPRセンサ20を用いることにより、測定チップ1の測定流路12中の流速を測定することができる(例えば、非特許文献7参照。)。
また、被捕捉物質と捕捉物質の反応は固定されている捕捉物質の厚さと同程度の液体の厚さの流速が実効的である。したがって、SPRセンサ20により測定すべき流速は、測定流路12の捕捉物質固定面から100ナノメートル程度の極薄層とすることが望ましい。
演算装置30は、図1に示すように、I/F部31と、吸着速度算出部32と、流速算出部33と、濃度算出部34と、判定部35と、記憶部36とを備えている。
次に、本実施の形態に係るセンサシステムによる判別動作について説明する。本実施の形態では、測定チップ1に流すサンプルとして牛乳を用いた。この測定チップ1を用いた測定の特徴は、サンプルである菌に感染した牛乳を前処理することなく送液でき、サンプルを構成する分子の分布から感染菌に特徴的な分子を抗体で選び出し、その吸着反応をリアルタイムに測定し、経時変化量から被捕捉物質の濃度を推定し、その結果サンプル中の菌を迅速に判定できることである。本実施の形態では、牛乳中に含まれていると考えられる連鎖球菌族(Streptococcus spp)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌属(Coagulase-negative Staphylococcus spp)を測定対象とし、図16,図17のダイアグラムから9個の判定ステップ(ノード)を選択した図7に示すダイアグラムを作成した。さらに、このダイアグラムに基づいて捕捉物質を選択し、この捕捉物質から図5を参照して説明した方法により9個の捕捉物質スポット101a〜101iを作成した。具体的には、被捕捉物質であるα溶血素(α-Hemolysin)に対する捕捉物質として抗α溶血素(抗α-Hemolysin)、β-Hemolysinの2個の被捕捉物質(SPEB、SPEC)に対する捕捉物質として抗SPEB、抗SPECの2個を選択している。また、被捕捉物質であるコアグラーゼ(Coagulase)に対する捕捉物質としてプロトロンビン(Prothrombin)、黄色ブドウ球菌の病原因子(Staphylococcus aureus virulence factors)における被捕捉物質としてprotain A、SEB、SEDの3個を選択し、これらの捕捉物質として抗protain A、抗SEB、抗SED、ヒトIgGの4個を選択している。また、被捕捉物質である連鎖球菌の病原因子(Streptococcus virulence factor)に対する捕捉物質として、抗連鎖球菌の病原因子(抗Streptococcus virulence factor)を選択するとともに、ブロッキング剤(阻害剤:Blocking reagent)を選択した。このため、捕捉物質は合計で9個となる。このようにして作成した実際の測定チップ1を図8に示す。
なお、図5のダイアグラムにおいては、便宜上判別を「+」と「−」で表しているが、本実施の形態においては、各ノードにおける判定では定量的な値が得られている。
なお、濃度は、捕捉物質スポット101の両側の被捕捉物質スポットでの反応速度を基準として算出するので、図10A,図10Bに示すように負の値として算出されることがある。また、サンプルの流速が遅い場合には捕捉物質に対する非捕捉物質の吸着が拡散律速になるが、どのような流速であっても正しく被捕捉物質の濃度を計算できるように、本実施の形態では、初期吸着速度から濃度を求める際に拡散律速となる場合を考慮したモデルを用いている。
なお、測定対象の主成分とは、捕捉物質を製造または設計する際に、捕捉対象とする分子のことである。動物に免役させて作製する抗体の場合には、その抗原となる分子が主成分である。また、人工的に設計するアプタマーの場合には、設計の際に使う捕捉対象分子のことである。
次に、本発明の第2の実施の形態について説明する。本実施の形態は、サンプルとして血液を用いて血液の凝固系を測定するものであり、上述した第1の実施の形態と捕捉物質スポット101を構成する捕捉物質およびこの捕捉物質に捕捉される非捕捉物質が異なるものである。したがって、上述した第1の実施の形態と同等の構成要素については同じ名称および符号を付し、適宜説明を省略する。
101を測定チップ1の測定流路12に固定し、この測定流路12に血清サンプルを流通
させ、サンプルが測定流路12を流れる際の流速とサンプル中の物質と各捕捉物質との吸
着速度を測定することにより、測定時間を短縮することができる。
Claims (7)
- 基板表面に形成された金属膜と、
この金属膜上に形成された流路と、
前記流路内の前記金属膜上に固定され、被捕捉物質を特異的に捕捉する捕捉物質により形成された捕捉物質スポットと、
前記流路内の前記金属膜上に固定され、前記被捕捉物質を捕捉しない非捕捉物質により形成された非捕捉物質スポットと
を備え、
前記捕捉物質スポットと前記非捕捉物質スポットとは、前記流路の延在方向に所定間隔を隔てて互い違いに複数配置されて捕捉物質アレイを形成し、
前記捕捉物質は、前記流路を流れる流体中の測定対象に関係する生体物質の相互作用を示すダイアグラムの各ノードに関わる物質からなり、
前記ノードの上流では、想定しうる菌の集合に対してカバー範囲が広い前記補足物質が選択され、前記ノードの下流では、想定しうる菌の集合に対してカバー範囲が狭い前記補足物質が選択される
ことを特徴とする測定チップ。 - 請求項1記載の測定チップにおいて、
前記捕捉物質は、抗α溶血素、抗β溶血素、プロトロンビン、抗黄色ブドウ球菌病原因子およびhIgG、抗連鎖球菌属病原因子並びに阻害剤である
ことを特徴とする測定チップ。 - 請求項1記載の測定チップにおいて、
前記捕捉物質は、20-merのDNAである
ことを特徴とする測定チップ。 - 基板表面に形成された金属膜、この金属膜上に形成された流路、前記流路内の
前記金属膜上に固定され、被捕捉物質を特異的に捕捉する捕捉物質により形成された捕捉物質スポット、および前記流路内の前記金属膜上に固定され、前記被捕捉物質を捕捉しない非捕捉物質により形成された非捕捉物質スポットを備えた測定チップと、
前記流路を流れる流体の流速を測定する流速測定手段と、
前記流体中の物質と前記捕捉物質との吸着速度を測定する吸着速度測定手段と
を備え、
前記捕捉物質スポットと前記非捕捉物質スポットとは、前記流路の延在方向に所定間隔を隔てて互い違いに複数配置されて捕捉物質アレイを形成し、
捕捉物質は、前記流路を流れる流体中の測定対象に関係する生体物質の相互作用を示すダイアグラムの各ノードに関わる物質からなり、
前記ノードの上流では、想定しうる菌の集合に対してカバー範囲が広い前記補足物質が選択され、前記ノードの下流では、想定しうる菌の集合に対してカバー範囲が狭い前記補足物質が選択される
ことを特徴とするセンサシステム。 - 請求項4記載のセンサシステムにおいて、
前記流速測定手段および前記吸着速度測定手段は、前記金属膜表面における屈折率に基づいて測定を行う
ことを特徴とするセンサシステム。 - 請求項4または5記載のセンサシステムにおいて、
前記流速測定手段および前記吸着速度測定手段の測定結果に基づいて、前記被捕捉物質それぞれの濃度を測定する濃度測定手段と、
流体中に含まれる被捕捉物質の濃度と測定対象との関係を記憶する記憶手段と、
前記濃度測定手段による測定結果と、前記記憶手段に記憶された前記関係とに基づいて、前記流体中に含まれる測定対象を判別する判別手段と
をさらに備えたことを特徴とするセンサシステム。 - 基板表面に形成された金属膜、この金属膜上に形成された流路、および、前記流路内の前記金属膜上に固定され、被捕捉物質を特異的に捕捉する捕捉物質により形成された捕捉物質スポット、および前記流路内の前記金属膜上に固定され、前記被捕捉物質を捕捉しない非捕捉物質により形成された非捕捉物質スポットを備えた測定チップの前記流路を流れる流体の流速を測定する流速測定ステップと、
前記流体中の物質と前記捕捉物質との吸着速度を測定する吸着速度測定ステップと
を有し、
前記捕捉物質スポットと前記非捕捉物質スポットとは、前記流路の延在方向に所定間隔を隔てて互い違いに複数配置されて捕捉物質アレイを形成し、
前記捕捉物質は、前記流路を流れる流体中の測定対象に関係する生体物質の相互作用を示すダイアグラムの各ノードに関わる物質からなり、
前記ノードの上流では、想定しうる菌の集合に対してカバー範囲が広い前記補足物質が選択され、前記ノードの下流では、想定しうる菌の集合に対してカバー範囲が狭い前記補足物質が選択される
ことを特徴とする測定方法。
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