JP5592144B2 - 凝固活性測定装置および測定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、プロトロンビン時間(血液凝固時間)に相当する指標である凝固活性を、測定対象が進行する平面流路の表面における屈折率測定に基づいた流速測定から求めるものである。
流路表面の屈折率を測定できる屈折率測定装置としては、例えば、測定対象の流路の反対側から光を入射させる全反射光学系と、2次元領域を一度にあるいは走査しながらモニタする光学系とを有し、かつ測定対象物により大きく吸収されない光波長に対応していればよい。したがって、屈折率測定装置として、2次元に対応した表面プラズモン共鳴測定装置を用いる。
また、ブロッキング剤として凝固活性に影響する因子を含むものを使い、さらに流路方向に沿ってブロッキング剤をアレイ状にスポットとして形成して配置することにより、物理的かつ生化学的に凝固活性を制御しながら、血漿サンプルの凝固機能をより詳細に観測することができる。
測定チップの基板1000上に形成された流路1001の中に満たされた凝固活性化剤1002の中を、投入された血漿1003が進行すると、進行しながら凝固反応が始まる(図1(A)、図1(B))。そして、血漿1003が凝固したところで血漿1003の進行が停止する(図1(C))。
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。図2は本発明の実施の形態に係る測定チップの構造を示す分解斜視図、図3は測定チップの平面図、図4は本発明の実施の形態に係る凝固活性測定装置の構成を示すブロック図である。
本実施の形態の測定チップ100は、略直方体状の外形をなし積層構造を有している。すなわち、水平方向の大きさが16mm×16mmで厚さが1mmのBK7ガラスあるいはプラスチックからなる矩形板状の透明の基板101と、平面視の外形が基板101と略同一に形成され、基板101上に積層される例えば樹脂からなる両面シール状のシート102と、平面視の外形が基板101と略同一に形成され、シート102上に積層されるアクリル筺体103とを備えている。
まず、測定チップ100を凝固活性測定装置のプリズム1の平面上に載置する(図6ステップS1)。
続いて、37℃で1分間温めた凝固活性化剤6μLをピペットによってインレット110から測定チップ100内に投入する(ステップS2)。凝固活性化剤は、インレット110および円孔106を経て流路107〜109中に充填される。シート102に形成された流路107〜109のうち、観測領域の流路107が最も細くデザインされていることから、凝固活性化剤は流路107内に留まる。
各測定チップ100について1回のみ測定を行い、測定を終えた測定チップ100は廃棄される。
データ処理装置6の画像処理部64は、CCDカメラ5から出力された濃淡画像データを取り込み、この濃淡画像データを処理して、光強度プロファイルを画像の1ライン毎に求める。
図8のX方向は図2〜図4のPX方向に対応し、図8のY方向は図2〜図4のPY方向に対応する。このY方向が、血漿の進行方向に相当する。図8の例では、CCDカメラ5が撮影した画像は、X方向が座標0〜479の480ピクセルからなり、Y方向も座標0〜479の480ピクセルからなるものとしている。図8におけるYnは、画像上のある1ラインのY座標を示している。
まず、血漿の流速Vと凝固活性値Cとの関係の求め方について説明する。血漿の流速Vと凝固活性値Cとの関係を求めるには、図7のステップS2で説明したとおり、流路中に凝固活性化剤を充填した測定チップを用い、この測定チップに凝固活性値Cが既知の市販の正常血漿を投入して、本実施の形態の凝固活性測定装置を用いて正常血漿の流速Vを算出すればよい。これにより、血漿の流速Vと凝固活性値Cとの関係式を求めることができる。
V=−23.696Ln(C)+135.89 ・・・(1)
V=−8.3283Ln(C)+58.157 ・・・(2)
本実施の形態の測定チップ100と凝固活性測定装置を用い、正常域血漿、異常域血漿の凝固活性値Cを求めたところ、表1のようになった。
表面プラズモン共鳴測定装置における深さ方向の感度は400nm程度である。したがって、図1(A)〜図1(C)に示したモデルのような凝固塊が形成される様子を、表面プラズモン共鳴測定装置が感度を持つ深さにおいてリアルタイムに追うことができる。血液凝固反応は、本来、血管内皮でおこる表面反応であることから、基板上に生化学的な処理を実施した場での反応を観測することは、より理想的な凝固測定に近づけた環境とも考えられる。
また、本実施の形態では、屈折率を測定する屈折率測定装置として表面プラズモン共鳴測定装置を利用したが、例えばエリプソメトリー装置を利用することもできる。
Claims (2)
- 溶液が流れる流路を備えた測定チップの前記流路の表面における屈折率を測定する屈折率測定装置と、
前記測定チップの流路中に凝固活性化剤が充填された後に前記流路中に血漿が投入されたときに前記屈折率測定装置が求めた光強度プロファイルにより得られる前記屈折率の変化から前記流路中を進行する血漿の流速を算出する流速算出手段と、
前記血漿の流速と凝固活性値との既知の関係に基づいて、前記流速算出手段が算出した流速から凝固活性値を算出する凝固活性値算出手段とを備え、
前記屈折率測定装置は、表面プラズモン共鳴測定装置であり、
前記測定チップに光を照射する光源と、
前記測定チップからの反射光を検出するカメラと、
このカメラが撮像した画像から前記光強度プロファイルを前記画像の1ライン毎に求める画像処理手段と、
この画像処理手段が求めた光強度プロファイルの時系列データから前記測定チップの流路の表面における屈折率の時間変化のデータを、血漿の凝固形態を表すデータとして前記画像の1ライン毎および所定の時間毎に導出する凝固形態導出手段とを備えることを特徴とする凝固活性測定装置。 - 溶液が流れる流路を備えた測定チップの前記流路の表面における屈折率を表面プラズモン共鳴測定装置によって測定する屈折率測定ステップと、
前記測定チップの流路中に凝固活性化剤が充填された後に前記流路中に血漿が投入されたときに前記屈折率測定ステップで求めた光強度プロファイルにより得られる前記屈折率の変化から前記流路中を進行する血漿の流速を算出する流速算出ステップと、
前記血漿の流速と凝固活性値との既知の関係に基づいて、前記流速算出ステップで算出した流速から凝固活性値を算出する凝固活性値算出ステップとを含み、
前記屈折率測定ステップは、
前記測定チップに光を照射する照射ステップと、
前記測定チップからの反射光をカメラで検出する撮像ステップと、
前記カメラが撮像した画像から前記光強度プロファイルを前記画像の1ライン毎に求める画像処理ステップと、
この画像処理ステップで求めた光強度プロファイルの時系列データから前記測定チップの流路の表面における屈折率の時間変化のデータを、血漿の凝固形態を表すデータとして前記画像の1ライン毎および所定の時間毎に導出する凝固形態導出ステップとを含むことを特徴とする凝固活性測定方法。
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