JP2005315600A - 光学的測定法 - Google Patents

Abstract

【課題】プローブと検体とを接触させることで、プローブ上に形成される結合物を検出する光学的測定法において、脂肪分によるプローブ表面での励起光の散乱・吸収・屈折率変化などによる蛍光検出の妨害を軽減する。
【解決手段】（ａ）検体容器１５中の検体Ｓに油分吸収材を投入する、（ｂ）検体Ｓに糖エステルを添加する、の少なくとも何れかの工程を実施した後に、測定容器１１にプローブ１を移動し、半導体レーザー光源１３からの光束をプローブ１に照射し、プローブ１で得られた検体Ｓ中の測定対象物による蛍光を光検出器１４で抗原抗体反応が阻害されない光量を得る。
【選択図】図２

Description

本発明は、プローブを用いて検体中に含まれる測定対象物を高感度に検出する光学的測定法に関するものである。

検体による光の吸収や発光などの光学的変化を分析手法として利用する光学的測定は、様々な分野において行われている。その場合の多くは、光透過性の容器（セル）に試料を入れ、容器内に光を通過させて観測を行うものである。別の手法として、光透過性の材料から成る光導波路をプローブとし、このプローブに光を導入又は／及び収集して、プローブ表面付近の測定対象物を光学的に観測することも行われている。特に、プローブ内に内部全反射光を伝播させ、その際のプローブ表面に発生するエバネッセント光を励起光とする方法は、プローブ表面近傍における免疫反応を選択的に観測することにおいて優れた方法である。

また、前記の全反射を多重に行わせることにより、励起光をより効率良く用い、感度を向上させることもできる。この多重全反射を利用した測定法の一例としては、ファイバ型光導波路を検体溶液に浸漬して用いる方式が、既に特許文献１において知られている。また、特許文献２においては、内部全反射の効率を高めるために、独特な形状部分を有するファイバ型光導波路が開示されている。これらの例は、装置に対して着脱可能な光学プローブとして使い易いものであり、使い捨て性やコストを考慮して、樹脂を射出成形などの成形法で加工して作製されることが多い。

米国特許４５８２８０９号公報 米国特許６１３６６１１号公報

免疫反応を利用する分析法は、夾雑物の多い検体から特定の測定対象物を選択的かつ簡便に測定する方法として優れており、抗原抗体反応による結合物の直接的又は間接的な測定法として沈降反応や凝集反応などが従来から用いられている。

更に、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、酵素などの標識によって抗原抗体反応を光学的に測定し定量化する標識免疫測定を行うことにより、測定感度が飛躍的に高まっている。標識法による放射免疫測定方法、酵素免疫測定方法、蛍光免疫測定方法などが知られており、幾つかの装置が市販されている。

これらの方法は食品、医療、環境といった分野に普及しつつある。特に食品分野では、食の多様化、外食・中食の普及や流通の発達により、食中毒の発生原因が従来とは異なる傾向にあり、また大規模・広範囲に渡って病原性の強い集団食中毒が発生していることから、食中毒菌への対策として出荷前の迅速かつ高感度な検査等が求められている。

光学的測定においては、免疫反応を高感度かつ選択的に検出することができる一方で、検出される蛍光が何らかの妨害を受けることがある。特に、近年重要度が増している食品検査において、肉・魚介類・牛乳及びこれらの加工品を含む検体に含まれる動物性又は植物性脂肪によって上記の妨害を受けることが分った。

これは非特異吸着やバックグラウンドと呼ばれるような、例えば標識された抗体が特異的な反応によらず、抗原抗体反応が起こるべき部位以外に吸着して検出されるものと異なり、詳細な機構は明らかではないが、検体中に含まれる脂肪分による光導波路表面での励起光の散乱・吸収・屈折率変化などにより、蛍光の検出が妨害されているものである。

本発明の目的は、上述の問題点を解消し、光学的測定における検体に含まれる脂肪による蛍光検出の妨害を軽減し、高感度かつ信頼性の高い光学的測定法を提供することにある。

上記目的を達成するための本発明に係る光学的測定法は、プローブに測定対象物を含む検体を接触させ、前記プローブ上に捕捉される測定対象物を検出する際に、前記検体に油分吸収材を投入する工程又は前記検体に糖エステルを添加する工程の何れかを経ることを特徴とする。

本発明に係る光学的測定法によれば、検体中の測定対象物を測定する際に、検体に油分吸収材を投入及び（又は）糖エステルを添加することでプローブ表面での励起光の散乱・吸収・屈折率変化などによる蛍光検出の妨害を軽減することができる。

本発明を図示の実施例に基づいて詳細に説明する。
図１はプローブ１の側面図であり、このプローブ１は例えばポリスチレン樹脂を射出成型して製作され、フランジ部２を境に上部はレンズ部位３とされ、下部は棒状の光導波路４とされ、光導波路４の先端は光吸収部位５とされている。

光導波路４の表面への測定対象物の捕捉方法は、直接的な物理吸着や予め表面に準備された吸着剤による捕捉を用いることができるが、予め表面に固定された測定対象物に特異的に結合する物質による捕捉、より好ましくは抗体による捕捉が選択性の高い方法として望ましい。

図２は基本的な測定光学系の構成図である。測定容器１１にフランジ部２を用いて固定したプローブ１の上方には、ビームスプリッタ１２、半導体レーザー光源１３が配置され、ビームスプリッタ１２のプローブ１側からの光束の反射方向には、図示しないレンズ、フィルタを介して例えばフォトダイオードから成る光検出器１４が配置されている。

測定に際しては、先ずプローブ１を測定光学系とは別に設けられた検体容器１５中に固定することで、光導波路４は検体Ｓが満たされた検体容器１５に浸漬され、測定対象物の捕捉を行う。

次いで、プローブ１を測定容器１１に移動して洗浄し、標識抗体と接触させることで抗原抗体反応の結合物を形成する。そして、半導体レーザー光源１３からの波長６３５ｎｍのレーザー光を、プローブ１に導入し蛍光の集光を行う。導波路４で得られる蛍光は、レンズ部位３からビームスプリッタ１２、レンズ、フィルタを経て、光検出器１４により蛍光信号の光量を測定する。

なお、検体Ｓ中に蛍光性の不純物が存在する可能性がある場合には、本測定に先立って上記と同様な手順を行使し、測定対象物を含まないブランク検体の測定を行ってもよい。

棒状の光導波路４は検体容器１５及び測定容器１１中に配置されるために、浸漬、洗浄などの各種操作が行い易いという長所を持っている。しかし一方で、励起光の反射光、散乱光、或いは吸収や屈折率の変化が蛍光に混入して光検出器１４で収集され易いという短所がある。

この短所は光導波路４の端面の光吸収部位５に黒色体を配置すること、測定光学系中に光学フィルタを導入するなどによってかなり解決されるが、微量な蛍光量を扱う場合には実質的に問題になることが多い。例えば、肉・魚介類及びこれらの加工品を含む検体Ｓに含まれる脂肪が原因となる従来例で説明したような蛍光検出の妨害である。即ち、プローブ１が検体容器１５に浸漬され、測定対象物の捕捉を行った後に、標識抗体と接触させる前に光量の測定を行うと、検体Ｓに浸漬させる前の光量よりも減少するという現象が生じ、更に減少した分の光量は洗浄により元の光量に戻ることが確認されている。

この場合に、ベースラインが不明瞭になるため、標識抗体との接触の後に得られた光量が、抗原抗体反応によるものか、洗浄により元の光量に戻ったものかが判別できなくなる。この影響を軽減させる方法として、測定の前段階で図３のフローチャート図で示すように、検体容器１５中の検体Ｓに、（ａ）油分吸収材を投入する、（ｂ）糖エステルを添加する、の少なくとも何れかの工程を経ることが有効である。

油分吸収材は親油性を有するポリマから成る長繊維不織布或いは極細繊維の吸収体、綿花・パルプなどの天然繊維から成る吸収体、シリカを主成分とする無機質の発泡体等が市販されているが、吸収能力や使用後の廃棄処理方法などの取り扱い上の利便性から、ポリプロピレンの繊維による不織布が好適である。ポリプロピレンの不織布は容器の大きさ・形状に合わせて加工してもよい。例えば、本発明を実施する際に、検体Ｓをコニカルチューブのような円筒状の容器に採取する場合に、不織布は細長く切断したものが良く、ビーカーに採取する場合はビーカーに合わせた大きさに切り取り又はほぐして、検体Ｓとの接触面積がなるべく大きくなるようにすることが好適である。

なお、糖エステルが信号の妨害を軽減する詳細な機構は明らかではないが、次のように考えられる。即ち、糖エステルはショ糖のヒドロキシル基と脂肪酸のカルボキシル基とが反応して得られるショ糖脂肪酸エステルで、ショ糖１分子に対して脂肪酸１〜８分子が反応したモノエステル〜オクタエステルの混合物である。

モノエステルは親水基である非結合型のヒドロキシル基が多く、或る濃度以上で親水基を外に親油基を内に向けて会合してミセルを形成して、油相を水相に可溶化させると考えられる。このとき、水に難溶性のジエステルやトリエステルが混在していても、モノエステルと共にミセルを形成すると考えられる。このとき、モノエステルが５０％以上で可溶化能が現れ始め、モノエステル含量が９５％以上の糖エステルで信号の妨害を最小限に抑えることができることが確認されている。

糖エステルはミセルを形成し始める濃度（ｃｍｃ）よりも高い濃度で可溶化の効果が現れると考えられ、本発明に用いた糖エステルのｃｍｃは０．００８％であるが、信号の妨害を軽減する効果が現れるのは、０．１質量％以上であった。また、糖エステルの添加量が多くなるほど、検体Ｓへの浸漬により減少する光量が小さくなることが分ったが、添加量が多過ぎると糖エステルは表面が溶解して固まり混和させ難くなり、また本来検出されるべき抗原抗体反応を阻害する可能性があるため、１０質量％以下となるように添加することが望ましい。

糖エステルは検体量に対して所望の濃度となるように、粉末状のまま或いは水に分散させた懸濁液として用いることが好適である。更に、油分吸収材又は／及びショ糖脂肪酸エステルと検体Ｓとは十分に混和させることが好ましい。また、上記処理は容器内で行われるのが一般的であるが、油分吸収材又は／及びショ糖脂肪酸エステルの検体Ｓへの添加のタイミングは特に制限されない。例えば、検体容器１５に油分吸収材又は／及びショ糖脂肪酸エステルを投入してから検体Ｓを添加しても、検体容器１５に検体Ｓを採取してから油分吸収材又は／及びショ糖脂肪酸エステルを添加してもよい。また、油分吸収材及びショ糖脂肪酸エステルの双方を添加する際には、添加の順序は特に制限されることはない。

検体Ｓとしては、肉・魚介類・牛乳及びこれらの加工品等を希釈液と共にフィルタを備えた専用バッグに入れ、ストマッカー法等により均質化した後に、フィルタを通過して繊維質の成分を取り除いたものを採取して用いるのが好適である。ただし、牛乳は液体のまま希釈液を加えずに使用してよい。

［実験例１］油分吸収材により処理した検体における抗原抗体反応測定
プローブ１の光導波路４の表面にEscherichia coli Ｏ１５７：Ｈ７抗体（Kirkegaard & Perry Lab.Inc社製）を固定し、光導波路４の表面の抗体の未結合部を、グリセリンの５０％水溶液によりブロックしたものを用いた。検体Ｓとして、牛ひき肉に９倍量のＴＳＢ培地（日水製薬：トリプトソーヤブイヨン）を加えて、ストマッカー法により均質化し、フィルタ濾過を経たものに菌濃度１．１×１０⁵ＣＦＵ／ｍｌとなるよう不活化したEscherichia coli Ｏ１５７：Ｈ７を加えたものを用いた。１１ｍｌの検体Ｓに、油分吸収材（ポリプロピレン製不織布を２×１５ｍｍに切断）０．２ｇを投入し、十分に混和させた後に油分吸収材を取り除いたものを測定用試料とした。

（ア）始めに、測定前の信号を得るために、光導波路４を測定容器１１内に配置し、０．５％ポリオキシメチレンソルビタンモノラウレートを含む０．０１Ｍりん酸緩衝液を満たして測定を行った。

（イ）非特異的吸着分による信号を得るために、光導波路４を測定容器１１の２μｇ／ｍｌの蛍光標識抗体（Amersham Biosciences社製：Ｃｙ５ bisfunctional reactive dyeにより抗体を標識）を含む緩衝液に浸漬して、２５℃で５分間静置した。光導波路４を緩衝液により洗浄し、緩衝液で測定容器１１を満たして蛍光信号を３回測定した。これによって非特異的吸着分による僅かな信号増加と飽和を予め確認した。

（ウ）抗原抗体反応による信号を得るために、１０ｍｌの検体Ｓを満たした検体容器１５に光導波路４を浸漬し、検体容器１５を１００ｒｐｍで５分間回転させてから緩衝液により洗浄し、緩衝液で測定容器１１を満たして標識前の信号を得た。

（エ）光導波路４を測定容器１１中の２μｇ／ｍｌの蛍光標識抗体を含む緩衝液に浸漬して、２５℃で５分間静置した。光導波路４を緩衝液により洗浄し、緩衝液で測定容器１１を満たして標識後の蛍光信号を得た。

［実験例２］糖エステルにより処理した検体における抗原抗体反応測定
実験例１と同様にして用意したプローブ１及び検体Ｓを用い、１０ｍｌの検体Ｓに糖エステル（第一工業製薬：ＤＫエステルＳＳ）０．１ｇを添加し、十分に混和させたものを測定用試料として、実験例１と同様に（ア）〜（エ）の操作を行った。

［実験例３］油分吸収材及び糖エステルにより処理した検体における抗原抗体反応測定
実験例１と同様にして用意したプローブ１及び検体Ｓを用い、１１ｍｌの検体Ｓに油分吸収材０．２ｇ及び糖エステル０．１ｇを添加し、十分に混和させた後に油分吸収材を取り除いたものを測定用試料として、実験例１と同様に（ア）〜（エ）の操作を行った。

［比較例］上記の何れの処理も行わなかった検体における抗原抗体反応測定
実験例１と同様にして用意したプローブ及び検体Ｓを用い、検体Ｓには上記実験例の何れの処理も行わず、そのまま測定用試料として、実験例１と同様に（ア）〜（エ）の操作を行った。

図４は実験例１〜３及び比較例における測定データのグラフ図を示している。検体処理を行わなかった比較例では、上記操作（ウ）において検出の妨害となる脂肪分の付着による散乱等と思われる蛍光信号の低下が観測されたが、脂肪分の除去処理を行った実験例１〜３では信号の低下が小さく抑えることができた。

特に、油分吸収材と糖エステルの双方を使用した実験例３では、単独で使用した実験例１、２よりも信号の低下を極めて小さく抑えることができた。また、何れの実験例でも、上記操作（エ）において、測定対象物であるEscherichia coli Ｏ１５７：Ｈ７による蛍光信号を得ることができ、油分吸収材及び糖エステルは抗原抗体反応を阻害することはなかった。

プローブの側面図である。 測定光学系の構成図である。 フローチャート図である。 実施例及び比較例における測定データのグラフ図である。

符号の説明

１ プローブ
２ フランジ部
３ レンズ部
４ 光導波路
５ 光吸収部位
１１ 測定容器
１２ ビームスプリッタ
１３ 半導体レーザー光源
１４ 光検出器
１５ 検体容器

Claims (7)

1. プローブに測定対象物を含む検体を接触させ、前記プローブ上に捕捉される測定対象物を検出する際に、前記検体に油分吸収材を投入する工程又は前記検体に糖エステルを添加する工程の何れかを経ることを特徴とする光学的測定法。
2. 前記プローブの表面に測定対象物を捕捉させ、更に蛍光性発色団を有する標識抗体を結合し、前記プローブ内に励起光を導入して発生したエバネッセント光によって前記蛍光性発色団を励起し、前記プローブ内を伝播して収集された光量を測定することによって、前記プローブ上に形成された抗原抗体反応による結合物を検出することを特徴とする請求項１に記載の光学的測定法。
3. 前記油分吸収材は親油性ポリマから成る繊維であることを特徴とする請求項１又は２に記載の光学的測定法。
4. 前記糖エステルはショ糖脂肪酸エステルであることを特徴とする請求項１〜３の何れか１つの請求項に記載の光学的測定法。
5. 前記糖エステルはモノエステルの含量が９５％以上であるショ糖脂肪酸エステルであることを特徴とする請求項１〜４の何れか１つの請求項に記載の光学的測定法。
6. 前記糖エステルは０．１〜１０質量％の濃度となるように添加することを特徴とする請求項１〜５の何れか１つの請求項に記載の光学的測定法。
7. 前記検体は肉・魚介類・牛乳及びこれらの加工品を含むことを特徴とする請求項１〜６の何れか１つの請求項に記載の光学的測定法。

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