JP2022154826A - ビタミンａの定量方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、肉牛等の飼育現場において血液中のビタミンＡ濃度を迅速、簡便に定量することができるイムノクロマト方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、ａ）生体試料と競合試薬と検体希釈液とを混合して生体試料希釈液を調製する工程、ｂ）前記生体試料希釈液をイムノクロマトストリップに滴下して毛細管現象により展開させる工程、ｃ）前記イムノクロマトストリップのテストラインの呈色を測定して前記ビタミンＡを定量する工程を含む、競合法によるビタミンＡの定量方法であって、前記生体試料希釈液中のポリエチレングリコールの濃度は１～４質量％、塩化ナトリウムの濃度は１～３質量％であることを特徴とする定量方法である。【選択図】なし

Description

本発明は、生体試料中のビタミンＡを定量するイムノクロマト方法に関する。

肉牛、とくに高品質牛肉である和牛生産においては、筋肉中の脂肪交雑を高めることにより肉の評価が上がる。このため、脂肪の分解を促進する機能を持つビタミンＡの給餌量を極端に減少させて脂肪交雑を誘導するビタミンコントロールと呼ばれる飼育管理方法が近年では主流となっている。しかしながら、ビタミンＡの極端な不足は、肝機能低下などによる健康障害を引き起こし、また筋肉水腫や筋炎の発生による肉質低下をきたすことがあり大きな問題となる。このため、牛の栄養状態を知り、前述のような問題発生を防ぐ目的で血液中のビタミンＡ濃度を測定することが行われている。

ビタミンＡ濃度の測定には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が一般に用いられている。しかし、獣医師等が現場で血液を採取し持ち帰った後、検査機関に測定を依頼するケースがほとんどのため検査結果が出るのは数日後であり、もしビタミンＡが不足、あるいは超過していても即時的な対処が出来ないという欠点がある。

例えば、特許文献１および特許文献２には、血清から有機溶剤で抽出したビタミンＡに特定波長の光を照射することにより、ビタミンＡを定量する方法、および測定装置が記載されている。しかしながら、この方法は、採取した血液を遠心して血清を分離した後、エタノールによる血清タンパク質の除去操作、およびヘプタンによるビタミンＡ成分の抽出操作が必要であり、ＨＰＬＣのような大型装置は要らないものの、牛の飼育現場で実施するには操作が煩雑であり、時間や手間が掛かるといった問題がある。

特開２０１０－２３０４４７号 特開２０１５－１６９６２７号

本発明は、肉牛等の飼育現場において血液中のビタミンＡ濃度を迅速、簡便に定量することができるイムノクロマト方法を提供することを目的とする。

本発明者は、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下に示す手段により上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
（１） ａ）生体試料と競合試薬と検体希釈液とを混合して生体試料希釈液を調製する工程、
ｂ）前記生体試料希釈液をイムノクロマトストリップに滴下して毛細管現象により展開させる工程、
ｃ）前記イムノクロマトストリップのテストラインの呈色を測定して前記ビタミンＡを定量する工程、
を含む、競合法によるビタミンＡの定量方法であって、
前記生体試料希釈液中のポリエチレングリコールの濃度は１～４質量％、塩化ナトリウムの濃度は１～３質量％であることを特徴とする定量方法。
（２）前記競合試薬は、ビタミンＡと化合物との複合体を含むことを特徴とする（１）に記載の定量方法。
（３） 前記化合物は、ビオチンであることを特徴とする（２）に記載の定量方法。
（４） 前記イムノクロマトストリップは、試料添加部材、膜担体、吸収部材が順に連接配置されており、前記膜担体は、抗ビタミンＡ抗体が固定されたテストラインを備えることを特徴とする（１）～（３）のいずれかに記載の定量方法。
（５） 前記イムノクロマトストリップは、試料添加部材と膜担体との間に含浸部材が配置されており、前記含浸部材に標識体が含浸されていることを特徴とする（４）に記載の定量方法。
（６） 前記生体試料は、血液または血漿または血清のいずれかであることを特徴とする（１）～（５）のいずれかに記載の定量方法。

本発明により、肉牛の飼育現場において血液中のビタミンＡ濃度を迅速、簡便に測定することが可能なビタミンＡの定量方法が提供される。

本発明の測定方法を実施するためのイムノクロマトストリップの一例を示す模式図である。 本発明の測定方法を実施するためのイムノクロマトストリップをハウジングケースに収容した一例を示す模式図である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、ａ）生体試料と競合試薬と検体希釈液とを混合して生体試料希釈液を調製する工程、ｂ）前記生体試料希釈液をイムノクロマトストリップに滴下して毛細管現象により展開させる工程、ｃ）前記イムノクロマトストリップのテストラインの呈色を測定して前記ビタミンＡを定量する工程を含む、競合法によるビタミンＡの定量方法であって、前記生体試料希釈液中のポリエチレングリコールの濃度は１～４質量％、塩化ナトリウムの濃度は１～３質量％であることを特徴とする定量方法である。

（ビタミンＡ）
本発明において、ビタミンＡは、レチノール、レチナール、レチノイン酸、レチニルエステルなどのレチノイド類を指す。また、ビタミンＡは、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）、プレアルブミンと複合体を形成したものであってもよい。

（生体試料）
本発明において、対象となる生体試料は、全血でも血清でも血漿でもよく、特に制限はない。動物種も、ウシの他、ヒト、ウマ、イヌ、ネコなどの血液を測定対象とすることが出来る。

（競合試薬）
本発明において、競合試薬は、生体試料中の遊離またはタンパク質に結合した状態のビタミンＡと競合することが出来、かつ標識物質により検出が可能であれば特に制限はない。競合試薬としては、ビタミンＡと化合物との複合体を用いるのが好ましい。複合体とすることによりビタミンＡが安定し、また性能の良い抗体が入手し易いことから好ましい。化合物としては、牛血清アルブミン、卵白アルブミンやビオチンなどが挙げられ、これらの中でもビオチンが好適に用いられる。詳細な理由は不明だが、ビタミンＡと低分子量であるビオチンとの複合体は、ビタミンＡとアルブミン等の高分子化合物との複合体よりも、生体試料中のビタミンＡに対して競合原理が働きやすいと推測している。また、ビタミンＡと低分子化合物との複合体は、ビタミンＡと牛血清アルブミンなどのタンパク質との複合体よりも製造コストを低く抑えられるメリットもある。

なお、ビタミンＡは、不安定な化合物であり、光や熱によって二重結合の異性化が起こりやすく、また酸や空気、金属イオンとも反応しやすいため、容易に分解してしまう畏れがある。そのため、競合試薬は低温、暗所にて使用時まで保存するのが好ましい。保存温度としては４℃以下が好ましく、－２０℃以下がより好ましく、－８０℃以下がさらに好ましい。したがって、競合試薬は、使用時（前）に生体試料、検体希釈液と混合して使用するのが好ましい。なお、この場合、競合試薬は凍結乾燥等された状態であってもよいし、溶液の状態であってもよい。また、競合試薬を予め検体希釈液に混合、低温保管したものを使用してもよい。

（イムノクロマト展開）
生体試料、競合試薬、および検体希釈液とを混合して調製した生体試料希釈液を試料添加部材６の試料滴下部１０に滴下した際、膜担体３の上流側の端部に連接した含浸部材２に予め含浸させた標識体が、該混合液と混合して膜担体３へとクロマト展開されるように、配置しておくことが好ましい。あるいは、標識体をイムノクロマトストリップ８とは別の適当な容器内で、生体試料及び検体希釈液と混合して混合液とした後、この混合液をイムノクロマトストリップ８の試料添加部材６に滴下して膜担体３にクロマト展開させても構わない。展開開始後は、５～１２分の間に測定を実施することが望ましい。この間に測定を行えば、ビタミンＡと、競合試薬（ビタミンＡと化合物の複合体）との競合反応が最も効果的に起き、ビタミンＡの濃度変化に応じた測定値の変化がテストラインにおいて得られ、ビタミンＡ濃度の違いが測定値に的確に反映されるため好ましい。即ち、生体試料中のビタミンＡ濃度を正確に測定することが出来る。５分未満では、テストライン上の抗ビタミンＡ抗体と生体試料中ビタミンＡまたは競合試薬（ビタミンＡと化合物の複合体）との反応が充分でないため測定値が低く、また、生体試料中ビタミンＡの濃度の違いを正確に反映する測定値を得ることが出来ないことがある。また、１２分を超えると、抗ビタミンＡ抗体に対する非特異的な反応が増加するため、生体試料中ビタミンＡの濃度に応じた正確な測定値変化が得られなくなることがある。

（競合法）
本発明において、生体試料中のビタミンAは競合法により定量するのが好ましい。ビタミンAのような低分子化合物は、２種類の抗体でサンドイッチすることが難しいため、競合法をとることが好ましい。即ち、生体試料、競合試薬（ビタミンＡと化合物との複合体）、および検体希釈液を混合して得られた生体試料希釈液をイムノクロマトストリップ上に滴下、展開することにより、生体試料中のビタミンA及び競合試薬は、テストラインを成す抗ビタミンA抗体に競合的に捕捉される。捕捉された複合体を、化合物に対する抗体を持つ標識物質により呈色させ、テストライン上のシグナルを得ることにより定量することが出来る。競合試薬は、生体試料１ｍｌに対して１０ｎｇ～１０μｇ添加するのが好ましい。生体試料、特に肉牛の血漿中ビタミンＡ濃度は２００ｎｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌであることから生体試料中のビタミンＡ濃度と競合試薬の添加量の差が大きすぎると競合が上手くいかず定量性が低下することがある。

（検体希釈液）
本発明において、検体希釈液は、生体試料を希釈したり、赤血球を溶血させたり、生体試料を展開させるための展開液として使用する。検体希釈液は、緩衝剤、界面活性剤、競合反応調整剤などを含む。

本発明において、緩衝剤は、目的とするｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、グッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシン）等が挙げられる。

本発明において、界面活性剤は、イムノクロマトストリップ上での生体試料（希釈液）の展開性を向上させ、かつ免疫反応に影響しない非イオン性界面活性剤を含むことが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。また、前記界面活性剤は単独で用いても二種以上を組み合わせて用いてもよい。また、前記界面活性剤の濃度は、０．００１質量％～１．０質量％が好ましく、０．００５質量％～０．５質量％がより好ましく、０．０１質量％～０．３質量％がさらに好ましい。濃度が低すぎると、生体試料希釈液が展開しにくくなることがあり、濃度が高すぎると、テストラインのシグナル強度が低くなることがある。

本発明において、競合反応調整剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いるのが好ましい。検討の結果、検体を希釈するための検体希釈液にポリエチレングリコールを添加することにより、競合反応を効率良く行えることを見出した。また、その効果を発揮する濃度については、検体を希釈した後の試料（生体試料希釈液）において１～４質量％である。また、使用するポリエチレングリコールの数平均分子量は、好ましくは２０００～１６０００であり、より好ましくは５０００～１００００である。数平均分子量が小さい場合、本発明に適した充分な抗原抗体反応の促進作用が得られないことがある。また、数平均分子量が大きい場合、同様に、抗原抗体反応の促進作用が得られないとか、生体試料希釈液の粘性が高くなり、イムノクロマトストリップ上の展開性が低下することがある。

本発明において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、エチレングリコールが重合した構造をもつ高分子化合物（ポリエーテル）である。数平均分子量約２００（ＰＥＧ２００）から約２００００（ＰＥＧ２００００）のものが市販されており、数平均分子量６００以下では液体、同１０００以上では固体となる。また、毒性が低い、異なる分子量のものを任意に混合することができる、水や多くの有機溶剤に優れた溶解性を示す、などの特性を有する。

本発明ではさらに、検体希釈液に塩化ナトリウムを添加することにより、競合反応の特異性を上げることが出来る。具体的には、生体試料希釈液中の塩化ナトリウムの濃度が１～３質量％となるように添加しておくことが好ましい。

本発明において、前記検体希釈液を用いて生体試料を希釈する際の希釈倍率は、１０倍～１０００倍が好ましく、３０倍～５００倍がより好ましく、５０倍～３００倍がさらに好ましい。前記希釈倍率とすることにより、生体試料中の夾雑物の影響を抑制すことができるため、より正確にビタミンＡの測定が可能となる。

（イムノクロマトストリップ）
イムノクロマトストリップの具体例としては、図１に示すようなイムノクロマトストリップ８が挙げられる。図１において、１は粘着シート、２は含浸部材、３は膜担体、４はテストライン、５はコントロールライン、６は試料添加部材、７は吸収部材を示している。膜担体３は、幅５ｍｍ、長さ２５ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターからなり、同じく幅５ｍｍの粘着シート１の中ほどに貼り付けられている。膜担体３には、クロマト展開の始点側、すなわち図１の左側（以下「上流側」とする。また、反対の右側を「下流側」とする。）の末端から下流側３～１５ｍｍの位置に抗ビタミンＡ抗体が線状に固定され、競合試薬（ビタミンＡと化合物との複合体）と生体試料中のビタミンＡを競合的に捕捉するためのテストライン４が形成されている。さらに、膜担体３の上流側の末端から下流側８～２５ｍｍの位置にコントロールライン５が設けられている。なお、テストラインはコントロールラインよりも上流側に位置し、テストラインとコントロールラインとの距離は３ｍｍ以上１０ｍｍ未満とするのが好ましい。コントロールライン５は、分析対象物質であるビタミンＡの存否に係わらずイムノクロマト反応が行われたことを確認するためのものである。コントロールライン５は、例えば、標識体に結合している抗体（ＩｇＧ）に対する抗体を固定化することによって形成することができる。

（テストライン）
本発明において、膜担体には、テストラインおよびコントロールラインが設けられている。テストラインに固定化する抗体は、ビタミンＡに特異的に結合することが出来る抗ビタミンＡ抗体であればよく、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、反応特異性の観点から、モノクローナル抗体であることが好ましい。ビタミンＡは低分子化合物であり十分な複雑性を備えていないため、通常では免疫応答を誘発できない。このため、免疫した動物に抗体を産出させるには、オボアルブミンなどのキャリアタンパク質にビタミンＡを化学結合したものを免疫原として用いる必要がある。また、アジュバントを混合して免疫原を注入すると、免疫応答強度が上がり、よい抗体を得る可能性が高まる。ポリクローナル抗体は、ウサギやマウスなどに免疫して得られた抗血清から精製して得ることが出来る。モノクローナル抗体は、例えば、ビタミンＡとオボアルブミンの結合物を適当なアジュバントとともにマウスのような動物に免疫したのち、免疫された動物の脾細胞とミエローマ細胞とを融合し、融合細胞のみが増殖出来る選択培地で培養し、増殖した細胞を前記ビタミンＡとの結合物などを使用して、たとえば酵素標識免疫法などにより選別することにより取得することができる。

（コントロールライン）
コントロールラインには、標識体中の化合物を特異的に結合する抗体が固定化されている。例えば、抗ウサギＩｇＧ抗体や抗マウスＩｇＧ抗体などを膜担体に固定化することによって形成することができる。コントロールラインを用いることにより、標識体が膜担体の最下流部まで移動したこと、即ち、イムノクロマト反応が（正常に）行われたことを確認することができる。

（膜担体）
膜担体３は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いるが、生体試料に含まれるビタミンＡをクロマト展開可能で、かつ、テストライン４を形成する抗体等の物質を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース系膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。

（含浸部材）
含浸部材２は、ガラス繊維を用いるが、これに限定されるものではなく、例えば、濾紙、ニトロセルロース膜、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック不織布なども使用できる。含浸部材２は、後述する標識体を含む懸濁液を前記ガラス繊維等の部材に含浸せしめ、これを乾燥させることなどによって作製できる。なお、本発明において、含浸部材はあってもなくてもよい。含浸部材を用いる際には、競合試薬に対する抗体に標識物質を結合した標識体を予め含浸させた含浸部材を試料添加部材と膜担体との間に配置させて用いることができるが、前記競合試薬に対する抗体に標識物質を結合した標識体を含有させた検体希釈液を用いる場合には、含浸部材は不要である。

（標識体）
本発明において、イムノクロマトストリップは、含浸部材を設けてもよいし、設けなくてもよい。含浸部材を設ける場合には、標識体を含侵させておくのが好ましい。含浸部材を設けない場合は、標識体は検体希釈液等に予め含めておけばよい。標識体は、ビタミンＡに結合した化合物に対する抗体に標識物質を結合させて得ることが出来る。抗体は、ビタミンＡに結合した化合物に対する抗体であればよく、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、反応特異性の観点からモノクローナル抗体であることが好ましい。

標識物質は特に制限はなく、例えば、呈色（蛍光を含む）標識物質、酵素標識物質などが挙げられるが、迅速に検査結果が得られることから呈色標識物質であることが好ましい。呈色標識物質としては、コロイド金属および着色ラテックス粒子、着色セルロース粒子などが挙げられる。コロイド金属の代表例としては、白金コロイド、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、パラジウムコロイド、金ナノロッド、金ナノプレート、銀ナノプレートなどが挙げられる。コロイド金属の粒子の大きさは通常、直径３～１００ｎｍ程度とされる。着色ラテックスの代表例としては、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラテックス、ポリメタクリル酸メチル、アクリル酸重合体などが挙げられる。ラテックス粒子の粒径としては特に制限されないが、粒径２５～５００ｎｍのものが好ましい。この他に、市販されている着色セルロース粒子なども使用出来る。セルロース粒子の粒径としては特に制限されないが、粒径１００～５００ｎｍのものが好ましい。蛍光標識物質としてはポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリビニルトルエン、シリカなどの材質からなるものを例示することができ、蛍光色素としてはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、シアニンおよびその誘導体などを例示することができる。

前記着色セルロース粒子の色は、特に限定されないが、例えば赤色、青色、黄色、緑色、黒色、白色、蛍光色が挙げられる。これらの中でも、バックグラウンドのヘモグロビン由来の赤色の影響を受けにくい青色、黒色が好ましく、青色がより好ましい。このようなセルロース系着色微粒子としては、旭化成社製の着色セルロースナノビーズ（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標））が挙げられるが、この中でもＮａｖｙ（ＢＬ１）、Ｄａｒｋ Ｎａｖｙ（ＢＬ２）、Ｂｌａｃｋ（ＫＲ１）が好ましく、Ｎａｖｙ（ＢＬ１）、Ｄａｒｋ Ｎａｖｙ（ＢＬ２）がより好ましい。

また、標識物質表面への非特異結合を抑えるためにブロッキング剤を用いて処理するのが好ましい。ブロッキング剤は、ポリエチレングリコールやタンパク質を用いるのが好ましい。タンパク質としてはＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインなどが好ましい。これらのブロッキング剤は市販されているものがあればそれを用いても良いし、別途公知の方法で製造しても良い。分子サイズも特に制限されないが、平均分子量で１００ｋＤａ以下が好ましい。一般的にブロッキング剤の分子サイズが小さいほど検出粒子１粒子に対するタンパク質の結合量が増加し感度などの性能が高くなる。

（試料添加部材）
試料添加部材６は、例えば、多孔質ポリエチレンおよび多孔質ポリプロピレンなどの多孔質合成樹脂のシートまたはフィルム、あるいは、濾紙および綿布などのようなセルロース製の紙または不織布などを用いることができる。

（吸収部材）
吸収部材７は、液体をすみやかに吸収、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、およびポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等を挙げることができるが、特に濾紙が好適である。

イムノクロマトストリップ８は、図１に示されるように、膜担体３を粘着シート１の中ほどに貼着し、該膜担体３の上流側の末端の上に、含浸部材２の下流側の末端を重ね合わせて連接するとともに、この含浸部材２の上流側部分を粘着シート１に貼着して作製できる。さらに、含浸部材２の上面に試料滴下部（試料添加部材）６の下流側部分を載置するとともに、該試料添加部材６の上流側部分を粘着シート１に貼着し、また、膜担体３の下流側部分の上面に吸収部材７の上流側部分を載置するとともに、該吸収部材７の下流側部分を粘着シート１に貼着せしめてイムノクロマトストリップ８を構成している。

イムノクロマトストリップは、これを保護するため、また、取り扱いがし易いように、プラスチック製のハウジングケース９などに収容されていてもよい（図２）。このケースは、例えば、イムノクロマトストリップの試料添加部材６およびテストライン４およびコントロールライン５の上部に、試料滴下部１０と判定部（判定窓）１１が開口されていることが好ましい。

（競合試薬の調製）
ビタミンＡ（レチナール、ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ．Ｉｎｃ．、ＭＢＳ６０２３２２４）を、Ｂｉｏｔｉｎ－ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（同仁化学、Ｂ３０３）を用いて、ビオチン化することにより、ビタミンＡ－ビオチン複合体（競合試薬）を調製した。調製後、使用時まで－３０℃にて保存した。

（検体希釈液の調製）
リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４、ナカライテスク社、２７５７６－２１）にＴｒｉｔｏｎＸ－１００（シグマアルドリッチ社、１０７８９７０４００１）、ポリエチレングリコール♯６０００（ナカライテスク、Ｃｏｄｅ：１０２００－２５）、塩化ナトリウムを加えて溶解し、検体希釈液を調製した。

（抗ビオチン抗体結合セルロース粒子の調製）
セルロース粒子液（旭化成、ＢＬ１、１質量％）をｐＨ７．０の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ）に懸濁させ、これに抗ビオチン抗体（ＳＩＧＭＡ、Ｂ３６４０）を加えて混合し、３７℃で１２０分間静置して、抗体をセルロース粒子表面に結合させた。更に、セルロース粒子表面への非特異結合を抑えるために、１質量％カゼインを添加し、３７℃で６０分間静置してブロッキング処理を行った。この後、洗浄操作を行った後、１質量％スクロース含有ｐＨ７．４のＰＢＳに懸濁して、抗ビオチン抗体結合セルロース粒子液を調製した。

（イムノクロマトストリップの作製）
（１）含浸部材の作製
８ｍｍ×１５０ｍｍの帯状のガラス繊維不織布に、上記で得られた抗ビオチン抗体結合セルロース粒子液を０．５ｍｌ含浸させた。室温で乾燥させた後に、８ｍｍ×５ｍｍの大きさに切断し、含浸部材とした。

（２）膜担体の作製
抗ビタミンＡ抗体（Ｃｌｏｕｄ－Ｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐ．、ＰＡＤ０５１Ｇｅ０１）を１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した後、これを２５ｍｍ×３００ｍｍのニトロセルロース製メンブレンフィルターに１．０μｌ／ｃｍの量で線状に塗布してテストラインを調製した。
次に、抗ウサギＩｇＧ抗体（ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ．Ｉｎｃ．、ＭＢＳ５３９７８０）を１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した後、上記ニトロセルロース製メンブレンフィルターに１．０μｌ／ｃｍの量で線状に塗布してコントロールラインを調製した。
テストラインおよびコントロールラインを調製後、５０℃で３０分間乾燥させ、２５ｍｍ×５ｍｍの大きさに切断し、膜担体とした。

（３）イムノクロマトストリップの作製
図１に示すように、粘着シート１の上に、試料添加部材６、膜担体３、含浸部材２、吸収用部材７を配置し、イムノクロマトストリップを作製した。

（感度）
ビタミンＡ濃度が５ｎｇ／ｍｌとなるように、ウシ血液検体を検体希釈液を用いて希釈した。このサンプルを上記イムノクロマトストリップに展開し、１０分後のテストラインにおける吸光度測定値（Ａ_５）とした。次に、検体希釈液のみを同様に展開し、１０分後のテストラインにおける吸光度測定値を（Ａ_０）とした。（Ａ_０）と（Ａ_５）の吸光度差を濃度差で除した値、即ち、（（Ａ_０）－（Ａ_５））／（５－０）を算出し、これを感度とした。
１ｎｇ／ｍｌの濃度差を充分分別可能な２０ｍＡｂｓ以上を〇（ｇｏｏｄ）、１０ｍＡｂｓ以上２０ｍＡｂｓ未満を△（ａｖｅｒａｇｅ）、１０ｍＡｂｓ未満を×（ｂａｄ）とした。

（実施例１）
血液１０μｌに検体希釈液６９０μｌを添加して希釈し、さらに競合試薬（ビタミンＡ－ビオチン複合体）５ｎｇを添加して生体試料希釈液を調製した。ＰＥＧおよびＮａＣｌの終濃度はそれぞれ１質量％、１質量％であった。得られた生体試料希釈液を前記調製したイムノクロマト試験片の試料滴下部に１００μＬ滴下し、展開させた。滴下より１０分後に、イムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス社製Ｃ１００６０－１０、測定モード：青色系ライン測定モード）を用いてテストラインの呈色を測定した。

（実施例２）
ＰＥＧおよびＮａＣｌの終濃度をそれぞれ２質量％、１．８質量％とした以外は、実施例１と同様にして生体試料希釈液を調製した。得られた生体試料希釈液を前記調製したイムノクロマト試験片の試料滴下部に１００μＬ滴下し、展開させた。滴下より１０分後に、イムノクロマトリーダーを用いてテストラインの呈色を測定した。

（実施例３）
ＰＥＧおよびＮａＣｌの終濃度をそれぞれ４質量％、３質量％とした以外は、実施例１と同様にして生体試料希釈液を調製した。得られた生体試料希釈液を前記調製したイムノクロマト試験片の試料滴下部に１００μＬ滴下し、展開させた。滴下より１０分後に、イムノクロマトリーダーを用いてテストラインの呈色を測定した。

（比較例１）
ＰＥＧおよびＮａＣｌの終濃度をそれぞれ０．１質量％、０．１質量％とした以外は、実施例１と同様にして生体試料希釈液を調製した。得られた生体試料希釈液を前記調製したイムノクロマト試験片の試料滴下部に１００μＬ滴下し、展開させた。滴下より１０分後に、イムノクロマトリーダーを用いてテストラインの呈色を測定した。

（比較例２）
ＰＥＧおよびＮａＣｌの終濃度をそれぞれ５質量％、４質量％とした以外は、実施例１と同様にして生体試料希釈液を調製した。得られた生体試料希釈液を前記調製したイムノクロマト試験片の試料滴下部に１００μＬ滴下し、展開させた。滴下より１０分後に、イムノクロマトリーダーを用いてテストラインの呈色を測定した。

（比較例３）
ＰＥＧおよびＮａＣｌの終濃度をそれぞれ２質量％、０．１質量％とした以外は、実施例１と同様にして生体試料希釈液を調製した。得られた生体試料希釈液を前記調製したイムノクロマト試験片の試料滴下部に１００μＬ滴下し、展開させた。滴下より１０分後に、イムノクロマトリーダーを用いてテストラインの呈色を測定した。

（比較例４）
ＰＥＧおよびＮａＣｌの終濃度をそれぞれ０．１質量％、２質量％とした以外は、実施例１と同様にして生体試料希釈液を調製した。得られた生体試料希釈液を前記調製したイムノクロマト試験片の試料滴下部に１００μＬ滴下し、展開させた。滴下より１０分後に、イムノクロマトリーダーを用いてテストラインの呈色を測定した。

本発明により、肉牛の生産現場において血液中のビタミンＡ濃度を迅速、簡便に測定するビタミンＡイムノクロマトキットを提供することが可能となる。

１ 粘着シート
２ 含浸部材
３ 膜担体
４ テストライン
５ コントロールライン
６ 試料添加部材
７ 吸収部材
８ イムノクロマトストリップ
９ ハウジングケース
１０ 試料滴下部
１１ 判定部（判定窓）

Claims (6)

1. ａ）生体試料と競合試薬と検体希釈液とを混合して生体試料希釈液を調製する工程、
   ｂ）前記生体試料希釈液をイムノクロマトストリップに滴下して毛細管現象により展開させる工程、
   ｃ）前記イムノクロマトストリップのテストラインの呈色を測定して前記ビタミンＡを定量する工程
   を含む、競合法によるビタミンＡの定量方法であって、
   前記生体試料希釈液中のポリエチレングリコールの濃度は１～４質量％、塩化ナトリウムの濃度は１～３質量％であることを特徴とする定量方法。
2. 前記競合試薬は、ビタミンＡと化合物との複合体を含むことを特徴とする請求項１に記載の定量方法。
3. 前記化合物は、ビオチンであることを特徴とする請求項２に記載の定量方法。
4. 前記イムノクロマトストリップは、試料添加部材、膜担体、吸収部材が順に連接配置されており、前記膜担体は、抗ビタミンＡ抗体が固定されたテストラインを備えることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の定量方法。
5. 前記イムノクロマトストリップは、試料添加部材と膜担体との間に含浸部材が配置されており、前記含浸部材に標識体が含浸されていることを特徴とする請求項４に記載の定量方法。
6. 前記生体試料は、血液または血漿または血清のいずれかであることを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載の定量方法。

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