JP2020532711A - ＰｅｒＣＰを含有する抗体製剤を安定化させるための組成物 - Google Patents

Abstract

本開示は、フローサイトメトリー分析に使用することができる製剤および方法を目的としている。本製剤および本方法は、フローサイトメトリーにおいて使用される蛍光色素を安定化させるためのＰｅｒＣＰの使用を伴い、これによって、高温でのおよび／または長期間にわたる製剤の使用および保管が可能となる。

Description

［優先権の主張］
本願は、２０１７年８月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／５５２，５５７号に対する優先権および当該出願の利益を主張するものであり、当該出願の全内容は、参照によって本明細書の一部をなすものとする。

［本発明の分野］
本開示は、安定した結合剤を含む製剤、方法、およびキットを目的とする。

フローサイトメトリーは、個々の細胞の特性を特徴付けし、異種混合物において細胞のタイプを同定するために使用される、強力な方法である。細胞は一般に、細胞培養物または組織試料から懸濁液を調製するステップと、細胞を試験管またはマイクロタイタープレート内で未標識の抗体または蛍光色素標識された抗体とインキュベートするステップとによって、染色される。懸濁液はフローサイトメーターに導入され、細胞のフローにレーザービームが照射される。細胞とレーザービームとの間の相互作用によって生じる蛍光発光および光散乱が検出され、細胞の１つまたは複数の特徴が、測定された蛍光発光および／または散乱に基づいて定量される。

フローサイトメトリーはまた、測定された光学的特性に基づく、個々の細胞の同定、定量、分離、および／または単離を可能にする。この方法は免疫表現型決定として知られており、異種混合物における複数の細胞集団を分析するために使用することができる。免疫表現型決定は、細胞マーカーに結合し得る抗体を、細胞マーカーを含む細胞に導入すること、および任意の得られた蛍光または散乱を、フローサイトメトリーを使用して検出することによって、行うことができる。細胞マーカーが２つ以上の細胞型において発現している場合、複数の抗体を異種混合物に添加して、集団を効果的に区別することができる。このようなケースでは、各抗体は異なる蛍光色素にコンジュゲートされており、それによって複数のマーカーを同時に検出することが可能となる。例えば、第１の蛍光色素にコンジュゲートされた抗体および第２の蛍光色素にコンジュゲートされた抗体を異種混合物に添加し、フローサイトメトリーによって分析して、２つの異なる細胞集団を検出し、測定し、選別することができる。フローサイトメトリープロセスにおける複数の蛍光色素の使用は、マルチカラーフローサイトメトリーとして知られている。一部の場合では、例えば、同様に標識された抗体が異なる細胞型上のエピトープを認識する場合、マルチカラーフローサイトメトリーでは、１つまたは複数の抗体上で同一の蛍光色素を利用する。

様々なタイプの蛍光色素を、フローサイトメトリー法において使用することができる。例えば、一般には有機化合物またはタンパク質である単一の蛍光色素を、結合剤にコンジュゲートさせることができる。フローサイトメトリーにおいて使用される典型的な単一の蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｒ−フィコエリスリン（Ｒ−ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、およびペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）が含まれる。２つの蛍光色素が互いに付着しているタンデム蛍光色素もまた、抗体にコンジュゲートさせることができる。タンデム蛍光色素は、蛍光色素ドナーおよび蛍光色素アクセプターを含む。ドナーが光によって励起すると、ドナーはエネルギーを発し、このエネルギーはアクセプターに移動する。第２の蛍光色素は励起状態に達し、蛍光発光を生じさせ、これが検出され、測定され得る。典型的なドナーには、ＰｅｒＣＰ、Ｒ−ＰＥ、およびＡＰＣが含まれ、その一方で、典型的なアクセプターには、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）蛍光色素およびシアニン蛍光色素が含まれる。タンデム蛍光色素は一般に、単一の蛍光色素よりも強い明るさをもたらす。しかし、タンデム蛍光色素は光感受性であることが多く、細胞標識およびフローサイトメトリー分析の間の光暴露を低減または最少化させることが必要である。

ペリジニン−クロロフィルタンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）は、１００年以上前に最初に開示されたカロテノイド−タンパク質複合体である。ＰｅｒＣＰのペリジニン分子は、青緑色の波長（４７０から５５０ｎｍ）の光を吸収し、エネルギーをクロロフィル分子に効率良く移動させる。ＰｅｒＣＰは、非常に大きい消散係数、高い量子効率、および大きいストークスシフトを有する。ＰｅｒＣＰタンパク質は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）などの蛍光免疫標識利用において一般に使用される。ＰｅｒＣＰおよび関連するコンジュゲートの特性のおかげで、これらの複合体は、ＦＩＴＣ、ＰＥ、および他の蛍光色素でのマルチカラー分析に有用である。

ＰｅｒＣＰは、単独でまたはタンデム蛍光色素において使用することができる。例えば、ＰｅｒＣＰにシアニン（例えば、Ｃｙ５．５）に付着させて、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙタンデム蛍光色素（例えば、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）を形成し得る。ＰｅｒＣＰのシアニンタンデム（例えば、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）は、標準的な４８８ｎｍのレーザーで励起し得る。例えば、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５は、６９４ｎｍの波長で最大蛍光発光を有し、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰは、６７７ｎｍの波長で最大蛍光発光を有する。免疫表現型決定分析では、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ部分は、所望の標的に特異的に結合する抗体に連結し得る。しかし、ＰｅｒＣＰ蛍光色素を使用することの短所は、その固有の不安定性である。ＰｅｒＣＰ製剤は、安定性を維持するために、８℃を下回る温度で典型的には保管される。製剤は高温で分解するため、ＰｅｒＣＰ製剤を使用する場合またはＰｅｒＣＰ製剤を運搬する場合には、細心の注意を払わなくてはならない。ＰｅｒＣＰ製剤の運搬が遅延すると、またはＰｅｒＣＰ製剤をうっかり冷蔵されないままにすると、温度が上昇し、ＰｅｒＣＰ蛍光色素は急速に分解されてしまう。ＰｅｒＣＰ蛍光色素は、既知のラベル表示された濃度を有する液体製剤として消費者に提供されるため、蛍光色素の何らかの分解が、実験誤差を生じさせ得る。このような事象のせいで新たなバッチが必要になり、これは、医学的診断または予後の遅延の原因となり得る。

したがって、ＰｅｒＣＰ蛍光色素の安定性を増大させるための新規な製剤および方法が必要とされている。このような製剤および方法は、フローサイトメトリー分析における蛍光色素の蛍光特性に干渉することなく、ＰｅｒＣＰ蛍光色素の安定性を理想的に増強させる。

一実施形態では、本開示は、安定な製剤を提供する。安定な製剤は、（ａ）結合部分およびコンジュゲートされた蛍光色素を含む少なくとも１つの標識された結合剤、ならびに（ｂ）コンジュゲートされていないペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）またはその断片もしくはバリアントを含み、ここで、製剤は、少なくとも約０．１μｇ／ｍＬの総ＰｅｒＣＰ濃度を有する。一部の実施形態では、コンジュゲートされた蛍光色素は、ＰｅｒＣＰタンデム蛍光色素である。一部の実施形態では、コンジュゲートされた蛍光色素は、ペリジニンクロロフィルタンパク質−シアニン５．５（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）である。一部の実施形態では、コンジュゲートされた蛍光色素は、ＰｅｒＣＰである。一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントは、少なくとも約５０μｇ／ｍＬの濃度である。一部の実施形態では、抗体は、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ３４抗体、または抗ＭＰＯ抗体である。一部の実施形態では、標識された結合剤に対する、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの比は、少なくとも約２：１である。一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰは、完全長ＰｅｒＣＰである。一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントは、別の化学的部分に付着も結合もしていないペリジニンクロロフィルタンパク質複合体である。一部の実施形態では、製剤は、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントを有しない製剤よりも優れた安定性を有する。一部の実施形態では、製剤の蛍光強度は、約２０℃の温度で、約１日間から約１８０日間で約２５％以下の変化を示す。一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの存在下において、標識された結合剤は、製剤の温度が少なくとも約１０℃上昇する場合、約２５％以下の蛍光強度の変化を有する。

別の実施形態では、本開示は、フローサイトメトリーを使用して試料を分析する方法を提供する。本方法は、細胞を含む試料を、（ａ）結合部分およびコンジュゲートされた蛍光色素を含む少なくとも１つの標識された結合剤と、（ｂ）コンジュゲートされていないペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）またはその断片もしくはバリアントとを含む製剤とを接触させて、分析試料を形成させるステップと、フローサイトメトリーを使用して分析試料を分析するステップとを含む。製剤は、少なくとも約０．１μｇ／ｍＬの総ＰｅｒＣＰ濃度を有する。一部の実施形態では、コンジュゲートされた蛍光色素は、ＰｅｒＣＰタンデム蛍光色素である。一部の実施形態では、コンジュゲートされた蛍光色素は、ペリジニンクロロフィルタンパク質−シアニン５．５（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）である。一部の実施形態では、コンジュゲートされた蛍光色素は、ＰｅｒＣＰである。一部の実施形態では、製剤は、少なくとも約７５μｇ／ｍＬのＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの総濃度を有する。一部の実施形態では、本方法はさらに、蛍光色素の蛍光発光に基づいて細胞組成物において細胞を選別することを含む。一部の実施形態では、抗体は、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ３４抗体、または抗ＭＰＯ抗体である。一部の実施形態では、細胞は、ヒト血球である。一部の実施形態では、接触は、少なくとも約２０℃の温度で行われる。

別の実施形態では、本開示は、フローサイトメーターにおいて細胞を分析するためのキットを提供する。キットは、（ａ）結合部分およびコンジュゲートされた蛍光色素を含む少なくとも１つの標識された結合剤、ならびに（ｂ）コンジュゲートされていないペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）またはその断片もしくはバリアントを含む。一部の実施形態では、コンジュゲートされた蛍光色素は、ペリジニンクロロフィルタンパク質−シアニン５．５（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）であり、キットは、少なくとも約２０℃の温度で保管される。

別の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの標識された結合剤を安定化させる方法を提供する。本方法は、安定な製剤を形成させるために、コンジュゲートされていないペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）またはその断片もしくはバリアントを、結合部分およびコンジュゲートされた蛍光色素を含む少なくとも１つの標識された結合剤に添加するステップを含む。安定な製剤は、少なくとも約０．１μｇ／ｍＬの総ＰｅｒＣＰ濃度を有する。

別の実施形態では、本開示は、フローサイトメトリーと共に使用され得る安定なビーズ製剤を提供する。安定なビーズ製剤は、（ａ）少なくとも１つのＰｅｒＣＰ標識されたまたはＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５標識されたビーズ、（ｂ）コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアント、および（ｃ）液体を含み、ここで、製剤は、少なくとも約０．１μｇ／ｍＬの総ＰｅｒＣＰ濃度を有する。

本製剤および本方法のこれらのおよび他の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲と組み合わせて、以下の詳細な説明から明らかとなろう。

［定義される専門用語］
本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態のみを記載するためのものであり、限定することを意図したものではないことを理解されたい。定義される用語は、定義された用語の技術的および科学的意味に加えて、一般に理解されるおよび本教示の技術分野において認められるものである。

用語「蛍光色素」は、比色分析によってまたは蛍光分析によって検出され得る部分を指す。用語「コンジュゲートされた蛍光色素」は、結合部分にコンジュゲートされている（例えば、結合部分に連結されているまたは共有結合している）蛍光色素を指す。

用語「安定な」は、化合物または組成物の蛍光特性が大きく変化しない化合物または組成物を指す。一部の実施形態では、安定な化合物または組成物の蛍光強度は、温度が変化する場合（例えば、約４０℃、約３０℃、約２０℃、約１０℃、または約５℃の温度の上昇）、約２５％以下、約１０％以下、約５％以下、約１％以下、または約０．１％以下の変化を示す。

用語「結合部分」は、標的に結合し得る部分を指す。非限定的な例としては、抗体または核酸プローブが含まれる。

用語「標識された」は、蛍光色素が付着している部分（例えば抗体）を指す。

用語「ＰｅｒＣＰの総濃度」または「ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体の総濃度」または「総ＰｅｒＣＰ濃度」は、製剤中のＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの総量（モルまたは質量）を、製剤の全容積で割ったものを指す。ＰｅｒＣＰの総量は、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰおよび／またはその断片もしくはバリアントの量と、標識された結合剤中のＰｅｒＣＰの量との合計である。

用語「コンジュゲートされていないペリジニンクロロフィルタンパク質」または「遊離ＰｅｒＣＰ」は、本明細書において区別せずに使用され、抗体または核酸プローブに結合していないペリジニンクロロフィルタンパク質複合体またはその断片もしくはバリアントを指す。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、また、その通常の意味に加えて、用語「実質的な」または「実質的に」は、当業者にとって許容可能な限度または程度内であることを意味する。例えば、「実質的に取り消される」は、当業者がその取り消しを許容可能であるとみなすことを意味する。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、また、その通常の意味に加えて、用語「ほぼ」および「約」は、当業者にとって許容可能な限度または量内であることを意味する。用語「約」は一般に、示された数値のプラスまたはマイナス１．５％を指す。例えば、「約１０」は、８．５から１１．５の範囲を指し得る。例えば、「ほぼ同一」は、当業者がその項目を比較して同一であるとみなすことを意味する。

本開示では、数値範囲は、その範囲を規定する数値を含む。本開示では、実施形態が特定の特徴を「含む」と記載される場合は全て、本開示は、その特徴「から基本的になる」またはその特徴「からなる」他の実施形態も検討する。化学構造および化学式が例示的な目的のために引き延ばされ得るまたは拡大され得ることを認識されたい。

別段の規定がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。

本教示は、以下の詳細な説明を添付の図面と共に読んだ場合に最も良く理解される。特徴は必ずしも一定の比率で描かれてはいない。

図１Ａ〜１Ｊは、蛍光色素ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５とコンジュゲートした抗ヒトＣＤ１９抗体を含む結合剤である抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５の高速の安定性試験についてのフローサイトメトリーのデータを示すグラフである。図１Ａ〜１Ｅは、抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５で処理した血液のフローサイトメトリー側方散乱プロットを示す。図１Ｆ〜１Ｊは、抗ＣＤ４５／パシフィックブルー散乱プロット上でゲートされたリンパ球のヒストグラムを示す。 図２Ａ〜２Ｄは、４℃および３７℃で保管された抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５の短時間の安定性試験についてのフローサイトメトリーのデータを示すヒストグラムである。 図３Ａ〜３Ｈは、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの非存在下および存在下での、染色された血液から得られたリンパ球のヒストグラムを示す図である。図３Ａ〜３Ｄは、抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５で染色された血液から得られたリンパ球のヒストグラムを示し、図３Ｅ〜３Ｈは、抗ＣＤ３／ＰｅｒＣＰ（ＰｅｒＣＰとコンジュゲートした抗ヒトＣＤ３抗体）で染色された血液から得られたリンパ球のヒストグラムを示す。 図４Ａ〜４Ｈは、様々な濃度で血液を染色するために使用される、抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（５０μｇ／ｍＬ）およびコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰ（１３０μｇ／ｍＬ）を含む製剤の安定性試験についてのフローサイトメトリーのデータを示すヒストグラムである。図４Ａ〜４Ｄは、５０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５および１３０μｇ／ｍＬのコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰを使用する結果を示し、図４Ｅ〜４Ｈは、１２．５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５に３２．５μｇ／ｍＬのコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰを添加した、４倍希釈の同一の試薬を使用した結果を示す。 図５Ａ〜５Ｈは、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの非存在下および存在下での、蛍光色素ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５とコンジュゲートした抗ヒトＣＤ３４抗体を含む抗ＣＤ３４／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５を含む製剤の安定性試験についてのフローサイトメトリーデータを示すヒストグラムである。抗ＣＤ３４／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、試験の前に、３７℃で３日間、５０μｇ／ｍＬの試薬濃度で、１３０μｇ／ｍＬの遊離ＰｅｒＣＰとともに、または遊離ＰｅｒＣＰなしでインキュベートした（明るい方のピーク）。参照を４℃でインキュベートした（暗い方のピーク）。インキュベーションの後、試薬を、１３０μｇ／ｍＬ（図５Ａ〜５Ｄ）および１２．５μｇ／ｍＬ（図５Ｅ〜５Ｈ）の濃度で、それぞれ１３０μｇ／ｍＬおよび３２．５μｇ／ｍＬのコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの存在下で（＋ＰｅｒＣＰ）、またはコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの非存在下で（−ＰｅｒＣＰ）、試験した。 コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの非存在下および存在下での、抗ＣＤ３４／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５を含む製剤の安定性試験についてのフローサイトメトリーのデータを示すヒストグラムである。図６Ａ〜６Ｈの実験は、図５Ａ〜５Ｈの実験を反復したものである。 図７Ａ〜７Ｈは、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの非存在下および存在下での、蛍光色素ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５とコンジュゲートした抗ヒトＭＰＯ抗体を含む抗ＭＰＯ／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５を含む製剤の安定性試験についてのフローサイトメトリーのデータを示すヒストグラムであり、ここで、血液試料は、２人の別個のドナー（すなわち、ドナー１およびドナー２）から得られたものであった。抗ＭＰＯ／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、５０μｇ／ｍＬ（図７Ａ〜７Ｄ）および１２．５μｇ／ｍＬ（図７Ｅ〜７Ｈ）の濃度で、それぞれ１３０μｇ／ｍＬおよび３２．５μｇ／ｍＬのコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの存在下で（＋ＰｅｒＣＰ）、またはコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの非存在下で（−ＰｅｒＣＰ）、試験した。試験の前に、試薬を、３７℃で３日間、５０μｇ／ｍＬの濃度で、１３０μｇ／ｍＬのコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰに添加して、または添加せずにインキュベートした（明るい方の影）。類似の試薬を４℃で保管し、参照として使用した（暗い方の影）。 図８Ａ〜８Ｈは、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの非存在下および存在下での、抗ＭＰＯ／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５を含む製剤の安定性試験についてのフローサイトメトリーのデータを示すヒストグラムであり、ここで、血液試料は、２人の別個のドナー（すなわち、ドナー３およびドナー４）から得られたものであった。抗ＭＰＯ／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、５０μｇ／ｍＬ（図８Ａ〜８Ｄ）および１２．５μｇ／ｍＬ（図８Ｅ〜８Ｈ）の濃度で、それぞれ１３０μｇ／ｍＬおよび３２．５μｇ／ｍＬのコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの存在下で（＋ＰｅｒＣＰ）、またはコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの非存在下で（−ＰｅｒＣＰ）、試験した。図８Ａ〜８Ｈの実験は、図７Ａ〜７Ｈの実験を反復したものである。 図９Ａ〜９Ｈは、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの非存在下および存在下での、蛍光色素ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５とコンジュゲートしたポリクローナルＦ（ａｂ’）２ウサギ抗ヒトラムダ軽鎖を含むポリクローナルＦ（ａｂ’）２ウサギ抗ヒトラムダ軽鎖／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５を含む製剤の安定性試験についてのフローサイトメトリーのデータを示すヒストグラムである。ポリクローナルＦ（ａｂ’）２ウサギ抗ヒトラムダ軽鎖／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、１５０μｇ／ｍＬ（図９Ａおよび９Ｅ）、７５μｇ／ｍＬ（図９Ｂおよび９Ｆ）、３７．５μｇ／ｍＬ（図９Ｃおよび９Ｇ）、ならびに１８．６μｇ／ｍＬ（図９Ｄおよび９Ｈ）の濃度で試験した。ポリクローナルＦ（ａｂ’）２ウサギ抗ヒトラムダ軽鎖／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、遊離ＰｅｒＣＰ無しで（図９Ａ〜９Ｄ）および９０μｇ／ｍＬの遊離ＰｅｒＣＰとともに（図９Ｅ〜９Ｈ）試験した。ポリクローナルＦ（ａｂ’）２ウサギ抗ヒトラムダ軽鎖／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、３日間、３７℃でインキュベートし（明るい方の灰色）、４℃で保管された参照と比較した（暗い方の灰色）。 図１０Ａ〜１０Ｈは、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの非存在下および存在下での、蛍光色素ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５とコンジュゲートしたマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ２２を含むマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ２２／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（アイソタイプＩｇＧ１カッパ）を含む製剤の安定性試験についてのフローサイトメトリーのデータを示すヒストグラムである。マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ２２／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、１００μｇ／ｍＬ（図１０Ａおよび１０Ｅ）、５０μｇ／ｍＬ（図１０Ｂおよび１０Ｆ）、２５μｇ／ｍＬ（図１０Ｃおよび１０Ｇ）、ならびに１２．５μｇ／ｍＬ（図１０Ｄおよび１０Ｈ）の濃度で試験した。マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ２２／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、遊離ＰｅｒＣＰなしで（図１０Ａ〜１０Ｄ）、および１３０μｇ／ｍＬの遊離ＰｅｒＣＰとともに（図１０Ｅ〜１０Ｈ）試験した。マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ２２／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、３日間、３７℃でインキュベートし（明るい方の灰色）、４℃で保管された参照と比較した（暗い方の灰色）。 図１１Ａ〜１１Ｈは、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの非存在下および存在下での、蛍光色素ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５とコンジュゲートしたマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ１ａを含むマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ１ａ／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（アイソタイプはＩｇＧ２ａカッパである）を含む製剤の安定性試験についてのフローサイトメトリーのデータを示すヒストグラムである。マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ１ａ／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、１００μｇ／ｍＬ（図１１Ａおよび１１Ｅ）、５０μｇ／ｍＬ（図１１Ｂおよび１１Ｆ）、２５μｇ／ｍＬ（図１１Ｃおよび１１Ｇ）、ならびに１２．５μｇ／ｍＬ（図１１Ｄおよび１１Ｈ）の濃度で試験した。マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ１ａ／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、遊離ＰｅｒＣＰ無しで（図１１Ａ〜１１Ｄ）および１３０μｇ／ｍＬの遊離ＰｅｒＣＰとともに（図１１Ｅ〜１１Ｈ）試験した。マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ１ａ／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、３日間、３７℃でインキュベートし（明るい方の灰色）、４℃で保管された参照と比較した（暗い方の灰色）。 図１２Ａ〜１２Ｈは、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの非存在下および存在下での、蛍光色素ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５とコンジュゲートしたマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ７を含むマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ７／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（アイソタイプはＩｇＧ２ｂカッパである）を含む製剤の安定性試験についてのフローサイトメトリーのデータを示すヒストグラムである。マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ７／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、１００μｇ／ｍＬ（図１２Ａおよび１２Ｅ）、５０μｇ／ｍＬ（図１２Ｂおよび１２Ｆ）、２５μｇ／ｍＬ（図１２Ｃおよび１２Ｇ）、ならびに１２．５μｇ／ｍＬ（図１２Ｄおよび１２Ｈ）の濃度で試験した。マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ７／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、遊離ＰｅｒＣＰなしで（図１２Ａ〜１２Ｄ）、および１３０μｇ／ｍＬの遊離ＰｅｒＣＰとともに（図１２Ｅ〜１２Ｈ）試験した。マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ７／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、３日間、３７℃でインキュベートし（明るい方の灰色）、４℃で保管された参照と比較した（暗い方の灰色）。

様々な実施形態を記載する前に、本開示の教示が、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって当然のことながら変化し得ることを理解されたい。本教示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用される専門用語は特定の実施形態のみを記載する目的のものであり、限定することを意図したものではないことも理解されたい。

本明細書において開示されているように、多くの値の範囲が提供される。文脈から別段のことが明らかに示されない限り、その範囲の上限と下限との間にある、下限の１０分の１までの各値もまた、具体的に開示されることを理解されたい。任意の言及された値または言及された範囲内にある値と、あらゆる他の言及された値またはその言及された範囲内にある値との間の、より小さな各範囲が、本発明に包含される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立してその範囲内に含まれ得るかまたはその範囲から除外され得、また、言及された範囲内にある任意の具体的に除外された限界の下で、両限界のいずれかがそのより小さな範囲に含まれる、両限界のいずれもそのより小さな範囲に含まれない、または両限界がそのより小さな範囲に含まれる各範囲もまた本発明に包含される。言及された範囲が限界の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。

別段の規定がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において記載されものに類似のまたは同等の任意の方法および材料もまた、本教示の実施または試験において使用することができるが、一部の典型的な方法および材料を以下に記載する。

本明細書において言及される全ての特許および刊行物は、参照することによってその全体が明確に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示に対してであり、本発明の特許請求の範囲がこのような刊行物に先行して特許を付与されていないということを承認するものとして解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は実際の公開日とは異なる場合があり、この公開日は独立して確認することができる。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈から別段のことが明らかに示されない限り、単数形および複数形の両方の指示対象を含む。したがって、例えば、「部分」は、１つの部分および複数の部分を含む。

本開示を読めば当業者には明らかであるように、本明細書において記載および説明される個々の実施形態の各々は、本教示の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得るまたは前記特徴と容易に組み合わされ得る、個別の構成要素および特徴を有する。いかなる列挙される方法も、列挙される事象の順序で、または論理的に可能なあらゆる他の順序で行うことができる。

標識された結合剤の安定性を増大させる製剤および方法が提供される。コンジュゲートされていないペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）またはその断片もしくはバリアントと、結合部分およびコンジュゲートされた蛍光色素を含む標識された結合剤（例えば、蛍光色素にコンジュゲートされた抗体）とを含む製剤は、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰを有しない製剤と比較して、安定性が増大している。ＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントが、ある一定の濃度以上で製剤中にあると、標識された結合剤の安定性が増大することが予想外に発見された。コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントが十分な濃度で存在していると、温度安定性が増大した標識された結合剤が得られる。ＰｅｒＣＰ製剤は一般に、２〜８℃の温度で保管される。本製剤の一部の実施形態の利点は、これらが、標識された結合剤を実質的に分解することなく、８℃を上回る温度（例えば室温）で保管され得ることである。その結果、本開示の製剤の一部の実施形態は、使用前に良好に調製され得る。本製剤の一部の実施形態の別の利点は、標識された結合剤が、安定性を損なうことなく、低濃度にすることができることである。本製剤および本方法は、単一の蛍光色素またはタンデム蛍光色素（例えば、単一のＰｅｒＣＰまたはタンデムＰｅｒＣＰ）を含む様々な蛍光色素を利用し得る。結合部分およびコンジュゲートされた蛍光色素を含む、標識された結合剤は、様々な細胞標的を検出するために使用することができる。

一実施形態では、本開示は、安定な製剤を提供する。安定な製剤は、（ａ）結合部分およびコンジュゲートされた蛍光色素を含む少なくとも１つの標識された結合剤、ならびに（ｂ）コンジュゲートされていないペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）またはその断片もしくはバリアントを含み、ここで、製剤は、少なくとも約０．１μｇ／ｍＬの総ＰｅｒＣＰ濃度を有する。

別の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの標識された結合剤を安定化させる方法を提供する。本方法は、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントを、結合部分およびコンジュゲートされた蛍光色素を含む少なくとも１つの標識された結合剤に添加して、安定な製剤を形成させることを含む。安定な製剤は、少なくとも約０．１μｇ／ｍＬの総ＰｅｒＣＰ濃度を有する。

一部の実施形態では、蛍光色素は、単一の蛍光色素である。一部の実施形態では、蛍光色素は、タンデム蛍光色素である。

一部の実施形態では、蛍光色素は、ＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントを含むか、それから基本的になるか、またはそれからなる。一部の実施形態では、蛍光色素は、ＰｅｒＣＰを含むタンデム蛍光色素である。一部の実施形態では、蛍光色素は、ＰｅｒＣＰ−シアニンを含むタンデム蛍光色素である。一部の実施形態では、シアニンは、イソチオシアニン、ベンズインドジカルボシアニン、インドカルボシアニン、ベンズインドカルボシアニン、インドジカルボ−シアニン、インドトリカルボシアニン、ベンズインドジカルボシアニン、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、ＣＹＡ（３−（イプシロン−カルボキシ−ペンチル）−３’エチル−５，５’−ジメチルオキサカルボシアニン）、およびメロシアニンから選択される。一部の実施形態では、シアニンは、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ７、およびＣｙ７．５から選択される。一部の実施形態では、蛍光色素は、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５である。

一部の実施形態では、蛍光色素は、ＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの最大蛍光発光と異なる波長で最大蛍光発光を有する。例えば、ＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントをシアニンとタンデムで含む蛍光色素は、ＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアント単独の波長と異なる波長で最大蛍光発光を有する。

ＰｅｒＣＰは、ペリジニン、クロロフィル、および脂質に結合したペリジニン−クロロフィルタンパク質を含む。ＰｅｒＣＰタンパク質は、２つのモノマーを有するホモダイマー形態、遺伝子複製を介してホモダイマー形態から生成されるモノマー形態、またはモノマーＰｅｒＣＰの３つのコピーから生成されるトリマー形態で存在し得る。一部の実施形態では、製剤は、ＰｅｒＣＰタンパク質をホモダイマー形態で含む、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはコンジュゲートされた蛍光色素を含む。一部の実施形態では、製剤は、ＰｅｒＣＰタンパク質をモノマー形態で含む、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはコンジュゲートされた蛍光色素を含む。一部の実施形態では、製剤は、ＰｅｒＣＰタンパク質をトリマー形態で含む、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはコンジュゲートされた蛍光色素を含む。一部の実施形態では、製剤は、ＰｅｒＣＰタンパク質をホモダイマー形態、モノマー形態、トリマー形態、またはその組み合わせで含む、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはコンジュゲートされた蛍光色素を含む。一部の実施形態では、ホモダイマー形態、モノマー形態、およびトリマー形態は、異なる遺伝子によって発現される。

ＰｅｒＣＰタンパク質は、様々なアイソフォームまたはバリアントとして存在し得る。例えば、ＰｅｒＣＰタンパク質は、異なる長さ、配列、またはフォールディング構造を有し得る。一部の実施形態では、製剤は、ＰｅｒＣＰタンパク質の１つまたは複数のバリアントを含むＰｅｒＣＰタンパク質を含む、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはコンジュゲートされた蛍光色素を含む。

一部の実施形態では、ＰｅｒＣＰは、ＰｅｒＣＰ断片を含む。一部の実施形態では、製剤は、ＰｅｒＣＰタンパク質の少なくとも１つの断片を含む、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはコンジュゲートされた蛍光色素を含む。一部の実施形態では、製剤は、ＰｅｒＣＰタンパク質と実質的な配列同一性を有するがＰｅｒＣＰタンパク質と同一ではない断片を含む、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはコンジュゲートされた蛍光色素を含む。一部の実施形態では、断片は、完全長ＰｅｒＣＰタンパク質の配列の少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または少なくとも約９９．９％を含む。しかし、ＰｅｒＣＰ断片は、本明細書において記載される使用と矛盾しない任意の長さを有し得る。

一部の実施形態では、ＰｅｒＣＰは、野生型ＰｅｒＣＰタンパク質と比較した少なくとも１つのアミノ酸の欠失、挿入、または置換を有するＰｅｒＣＰバリアントを含む。一部の実施形態では、ＰｅｒＣＰバリアントは、野生型ＰｅｒＣＰタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または９５％を超えるアミノ酸同一性を有する。しかし、ＰｅｒＣＰバリアントは、本明細書において記載される使用と矛盾しない、野生型ＰｅｒＣＰタンパク質との任意の程度のアミノ酸同一性を有し得る。一部の実施形態では、アミノ酸同一性の程度は、デフォルトパラメータを用いてＢＬＡＳＴＰを使用して決定することができる。

一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはコンジュゲートされた蛍光色素は、完全長ＰｅｒＣＰタンパク質を含む。

クロロフィルに対するペリジニンのモル比は、ＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントにおいて変化し得る。一部の実施形態では、クロロフィルに対するペリジニンのモル比は、約１：１から約６：１である。一部の実施形態では、クロロフィルに対するペリジニンのモル比は、約３：１から約６：１である。一部の実施形態では、クロロフィルに対するペリジニンのモル比は、約３：１から約４：１である。一部の実施形態では、クロロフィルに対するペリジニンのモル比は、約４：１である。一部の実施形態では、クロロフィルに対するペリジニンのモル比は、約６：１である。一部の実施形態では、クロロフィルに対するペリジニンのモル比は、約３：１である。

一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントは、別の化学的部分に付着も結合もしていないペリジニンクロロフィルタンパク質複合体またはその断片もしくはバリアントである。一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントは、別の化学的部分に共有結合によって付着していないペリジニンクロロフィルタンパク質複合体またはその断片もしくはバリアントである。

コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントは、任意の適切な量で使用することができる。一部の実施形態では、製剤は、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントを、少なくとも約０．１μｇ／ｍＬの濃度で含む。したがって、一部の実施形態では、製剤は、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントを、少なくとも約０．１μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１μｇ／ｍＬ、少なくとも約５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約２０μｇ／ｍＬ、少なくとも約２５μｇ／ｍＬ、少なくとも約３０μｇ／ｍＬ、少なくとも約４０μｇ／ｍＬ、少なくとも約５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約６０μｇ／ｍＬ、少なくとも約７５μｇ／ｍＬ、少なくとも約８０μｇ／ｍＬ、少なくとも約９０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、少なくとも約１１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１２０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１２５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１３０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１７５μｇ／ｍＬ、または少なくとも約２００μｇ／ｍＬの濃度で含む。一部の実施形態では、製剤は、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントを、約０．１μｇ／ｍＬから約２５０μｇ／ｍＬの濃度で含む。一部の実施形態では、製剤は、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントを、約１０μｇ／ｍＬから約５００μｇ／ｍＬの濃度で含む。一部の実施形態では、製剤は、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントを、約２５μｇ／ｍＬから約２５０μｇ／ｍＬの濃度で含む。一部の実施形態では、製剤は、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントを、約５０μｇ／ｍＬから約２００μｇ／ｍＬの濃度で含む。

一部の実施形態では、結合部分は抗体である。抗体は、抗ヒト抗体、抗マウス抗体、抗ラット抗体、抗ヤギ抗体、または抗非ヒト霊長類抗体であり得る。

一部の実施形態では、結合部分は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、または組換え抗体である。一部の実施形態では、結合部分は、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、またはＩｇＥ抗体である。一部の実施形態では、結合部分は、キメラ抗体またはヒト化抗体である。

一部の実施形態では、抗体は、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ１ａ抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ７抗体、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ１０抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ１６ｂ抗体、抗ＣＤ１８抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ２４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３５抗体、抗ＣＤ３６抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ３９抗体、抗ＣＤ４１抗体、抗ＣＤ４２ｂ抗体、抗ＣＤ４３抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ４８抗体、抗ＣＤ４９ｄ抗体、抗ＣＤ５０抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ５３抗体、抗ＣＤ５４抗体、抗ＣＤ５５抗体、抗ＣＤ５５抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ５７抗体、抗ＣＤ５９抗体、抗ＣＤ６１抗体、抗ＣＤ６４抗体、抗ＣＤ６６抗体、抗ＣＤ６８抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＣＤ７９アルファ抗体、抗ＣＤ８２抗体、抗ＣＤ８７抗体、抗ＣＤ９０抗体、抗ＣＤ１１７抗体、抗ＣＤ１４２抗体、抗ＣＤ２３６抗体、抗ＣＤ２３９抗体、抗ＣＤ２４０抗体、抗ＣＤ２４１抗体、および抗ＣＤ２４２抗体から選択される。

一部の実施形態では、抗体は、抗ＭＰＯ抗体である。

一部の実施形態では、結合部分は、アビジンまたはストレプトアビジンであり、これらの実施形態は、ビオチンにコンジュゲートされた一次抗体（ビオチン化抗体）と共に使用するために適している。

本開示の製剤および方法は、標識された結合剤を低濃度で含む製剤を安定化させるために特に有用である。一部の実施形態では、標識された結合剤は、約２００μｇ／ｍＬ未満の濃度で溶液中に存在する。したがって、一部の実施形態では、標識された結合剤は、約２００μｇ／ｍＬ未満、約１７５μｇ／ｍＬ未満、約１５０μｇ／ｍＬ未満、約１２５μｇ／ｍＬ未満、約１００μｇ／ｍＬ未満、約７５μｇ／ｍＬ未満、約５０μｇ／ｍＬ未満、または約２５μｇ／ｍＬ未満の濃度で溶液中に存在する。一部の実施形態では、標識された結合剤は、約０．０１μｇ／ｍＬから約２５０μｇ／ｍＬの濃度で溶液中に存在する。一部の実施形態では、標識された結合剤は、約１μｇ／ｍＬから約２００μｇ／ｍＬの濃度で溶液中に存在する。一部の実施形態では、標識された結合剤は、約０．１μｇ／ｍＬから約１００μｇ／ｍＬの濃度で溶液中に存在する。一部の実施形態では、標識された結合剤は、約０．１μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬの濃度で溶液中に存在する。しかし、本開示の標識された結合剤は、任意の適切な濃度で使用することができる。

コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントおよび標識された結合剤は、標識された結合剤を安定化させるために必要な任意の適切な比で使用することができる。一部の実施形態では、標識された結合剤に対する、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの比は、約０．１：１から約１００：１である。一部の実施形態では、標識された結合剤に対する、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの比は、約０．１：１から約２０：１である。したがって、一部の実施形態では、標識された結合剤に対する、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの比は、約０．１：１から約２０：１、約０．５：１から約２０：１、約１：１から約２０：１、約１：１から約１５：１、約１：１から約１０：１、約１：１から約８：１、約１：１から約５：１、または約２：１から約８：１である。一部の実施形態では、標識された結合剤に対する、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの比は、少なくとも約１：１である。したがって、一部の実施形態では、標識された結合剤に対する、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの比は、少なくとも約１：１、少なくとも約１．５：１、少なくとも約２：１、少なくとも約２．５：１、少なくとも約３：１、少なくとも約３．５：１、少なくとも約４：１、少なくとも約４．５：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、または少なくとも約８：１である。

一部の実施形態では、製剤は、少なくとも約０．１μｇ／ｍＬのＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの総濃度を有する。したがって、一部の実施形態では、製剤は、少なくとも約０．１μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１μｇ／ｍＬ、少なくとも約５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約２０μｇ／ｍＬ、少なくとも約２５μｇ／ｍＬ、少なくとも約３０μｇ／ｍＬ、少なくとも約４０μｇ／ｍＬ、少なくとも約５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約６０μｇ／ｍＬ、少なくとも約７５μｇ／ｍＬ、少なくとも約８０μｇ／ｍＬ、少なくとも約９０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、少なくとも約１１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１２０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１２５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１３０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１７５μｇ／ｍＬ、または少なくとも約２００μｇ／ｍＬのＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの総濃度を有する。一部の実施形態では、製剤は、約０．１μｇ／ｍＬから約２５０μｇ／ｍＬのＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの総濃度を有する。一部の実施形態では、製剤は、約２５μｇ／ｍＬから約５００μｇ／ｍＬのＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの総濃度を有する。一部の実施形態では、製剤は、約５０μｇ／ｍＬから約５００μｇ／ｍＬのＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの総濃度を有する。一部の実施形態では、製剤は、約１００μｇ／ｍＬから約４００μｇ／ｍＬのＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの総濃度を有する。

一部の実施形態では、製剤は溶液である。一部の実施形態では、製剤は水性溶液である。一部の実施形態では、製剤は、有機溶媒を含む溶液である。

本開示の製剤は、さらなる構成要素を含み得る。一部の実施形態では、製剤は、緩衝液、防腐剤、界面活性剤、またはその組み合わせを含む。一部の実施形態では、防腐剤は、イソチアゾリノンを含む。一部の実施形態では、防腐剤は、アジ化物塩を含む。一部の実施形態では、防腐剤は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属のアジ化物を含む。一部の実施形態では、防腐剤は、アジ化ナトリウムを含む。

一部の実施形態では、製剤は、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌを含む緩衝液を含む。一部の実施形態では、製剤は、塩化ナトリウムを含む緩衝液を含む。一部の実施形態では、製剤は、ウシ血清アルブミンを含む緩衝液を含む。一部の実施形態では、製剤は、約０．０１Ｍから約０．２ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、約０．０１Ｍから約０．４Ｍの塩化ナトリウム、約０．１ｍＭから約１００ｍＭのアジ化ナトリウム、および約０．１％から約５％ウシ血清アルブミンを含む。

一部の実施形態では、製剤は、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ＮａＣｌ、アジ化ナトリウム、およびウシ血清アルブミンを含む緩衝液を含む。一部の実施形態では、製剤は、約０．０２Ｍから約０．０８ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、約０．０５Ｍから約０．２Ｍの塩化ナトリウム、約５ｍＭから約２５ｍＭのアジ化ナトリウム、約０．５％から約２％ウシ血清アルブミンを含む。一部の実施形態では、製剤は、約６．５から約７．５のｐＨを有する。

一部の実施形態では、製剤は、少なくとも２つの標識された結合剤を含む。一部の実施形態では、製剤は、少なくとも３つの標識された結合剤を含む。一部の実施形態では、製剤は、少なくとも４つの標識された結合剤を含む。一部の実施形態では、製剤は、少なくとも５つの標識された結合剤を含む。このような実施形態では、様々な標識された結合剤の蛍光色素は、同一であっても異なっていてもよい。

一部の実施形態では、製剤は、少なくとも１つの標識された結合剤およびコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントを含み、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントを有しない製剤よりも優れた安定性を有する。

一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの存在下での標識された結合剤は、製剤の温度が、３５〜１５０日間かけて少なくとも約１０℃上昇する場合、例えば、約４℃から約１４℃まで３５〜１５０日間かけて上昇する場合、約２５％以下の蛍光強度の変化を有する。一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの存在下での標識された結合剤は、製剤の温度が少なくとも約２０℃、７〜１８０日間かけて上昇する場合、例えば、約４℃から約２４℃まで７〜１８０日間かけてまたは２０〜７５日間かけて上昇する場合、約２５％以下の蛍光強度の変化を有する。一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの存在下での標識された結合剤は、製剤の温度が少なくとも約３０℃、１〜１０日間かけて上昇する場合、例えば、約４℃から約３７℃以上まで１〜１０日間かけてまたは１〜３日間かけて上昇する場合、約２５％以下の蛍光強度の変化を有する。

一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの存在下での標識された結合剤は、製剤の温度が少なくとも約１０℃、３５〜１５０日間かけて上昇する場合、例えば、約４℃から約１４℃まで３５〜１５０日間かけて上昇する場合、約２０％以下の蛍光強度の変化を有する。一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの存在下での標識された結合剤は、製剤の温度が少なくとも約２０℃、７〜１８０日間かけて上昇する場合、例えば、約４℃から約２４℃まで７〜１８０日間かけてまたは２０〜７５日間かけて上昇する場合、約２０％以下の蛍光強度の変化を有する。一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの存在下での標識された結合剤は、製剤の温度が少なくとも約３０℃、１〜１０日間かけて上昇する場合、例えば、約４℃から約３７℃以上まで１〜１０日間かけてまたは１〜３日間かけて上昇する場合、約２０％以下の蛍光強度の変化を有する。

一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの存在下での標識された結合剤は、製剤の温度が少なくとも約１０℃、３５〜１５０日間かけて上昇する場合、例えば、約４℃から約１４℃まで３５〜１５０日間かけて上昇する場合、１０％以下の蛍光強度の変化を有する。一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの存在下での標識された結合剤は、製剤の温度が少なくとも約２０℃、７〜１８０日間かけて上昇する場合、例えば、約４℃から約２４℃まで７〜１８０日間かけてまたは２０〜７５日間かけて上昇する場合、１０％以下の蛍光強度の変化を有する。一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの存在下での標識された結合剤は、製剤の温度が少なくとも約３０℃、１〜１０日間かけて上昇する場合、例えば、約４℃から約３７℃以上まで１〜１０日間かけてまたは１〜３日間かけて上昇する場合、１０％以下の蛍光強度の変化を有する。

一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの存在下での標識された結合剤は、製剤の温度が少なくとも約１０℃、３５〜１５０日間かけて上昇する場合、例えば、約４℃から約１４℃まで３５〜１５０日間かけて上昇する場合、５％以下の蛍光強度の変化を有する。一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの存在下での標識された結合剤は、製剤の温度が少なくとも約２０℃、７〜１８０日間かけて上昇する場合、例えば、約４℃から約２４℃まで７〜１８０日間かけてまたは２０〜７５日間かけて上昇する場合、５％以下の蛍光強度の変化を有する。一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの存在下での標識された結合剤は、製剤の温度が少なくとも約３０℃、１〜１０日間かけて上昇する場合、例えば、約４℃から約３７℃以上まで１〜１０日間かけてまたは１〜３日間かけて上昇する場合、５％以下の蛍光強度の変化を有する。

一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの存在下での標識された結合剤は、製剤の温度が少なくとも約１０℃、３５〜１５０日間かけて上昇する場合、例えば、約４℃から約１４℃まで３５〜１５０日間かけて上昇する場合、１％以下の蛍光強度の変化を有する。一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの存在下での標識された結合剤は、製剤の温度が少なくとも約２０℃、７〜１８０日間かけて上昇する場合、例えば、約４℃から約２４℃まで７〜１８０日間かけてまたは２０〜７５日間かけて上昇する場合、１％以下の蛍光強度の変化を有する。一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの存在下での標識された結合剤は、製剤の温度が少なくとも約３０℃、１〜１０日間かけて上昇する場合、例えば、約４℃から約３７℃以上まで１〜１０日間かけてまたは１〜３日間かけて上昇する場合、１％以下の蛍光強度の変化を有する。

一部の実施形態では、製剤は、蛍光強度が約２５％以下しか変化しないという点で、約２０℃の温度で少なくとも約１８０日間安定である。一部の実施形態では、製剤は、蛍光強度が約２０％以下しか変化しないという点で、約２０℃の温度で少なくとも約１８０日間安定である。一部の実施形態では、製剤は、蛍光強度が約１０％以下しか変化しないという点で、約２０℃の温度で少なくとも約１８０日間安定である。一部の実施形態では、製剤は、蛍光強度が約５％以下しか変化しないという点で、約２０℃の温度で少なくとも約１８０日間安定である。したがって、一部の実施形態では、製剤は、蛍光強度が約２５％以下、約２０％以下、約１０％以下、または約５％以下しか変化しないという点で、約２０℃の温度で少なくとも約１８０日間、少なくとも約１５０日間、少なくとも約１２０日間、少なくとも約１００日間、少なくとも約９０日間、少なくとも約８０日間、少なくとも約７５日間、少なくとも約７０日間、少なくとも約６０日間、少なくとも約５０日間、少なくとも約４５日間、少なくとも約４０日間、少なくとも約３０日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約７日間、少なくとも約５日間、少なくとも約４日間、少なくとも約３日間、少なくとも約２日間、または少なくとも約１日間安定である。

一部の実施形態では、製剤は、蛍光強度が約２５％以下しか変化しないという点で、約２０℃の温度で約１日間から約１８０日間安定である。一部の実施形態では、製剤は、蛍光強度が約２０％以下しか変化しないという点で、約２０℃の温度で約１日間から約１８０日間安定である。一部の実施形態では、製剤は、蛍光強度が約１０％以下しか変化しないという点で、約２０℃の温度で約１日間から約１８０日間安定である。一部の実施形態では、製剤は、蛍光強度が約５％以下しか変化しないという点で、約２０℃の温度で約１日間から約１８０日間安定である。したがって、一部の実施形態では、製剤は、蛍光強度が約２５％以下、約２０％以下、約１０％以下、または約５％以下しか変化しないという点で、約２０℃の温度で約１日間から約１８０日間、約１日間から約１５０日間、約１日間から約１２０日間、約１日間から約１００日間、約１日間から約８０日間、約１日間から約６０日間、約１日間から約４５日間、約１日間から約３０日間、約１日間から約１４日間、約１日間から約７日間、約１日間から約４日間、約７日間から約１８０日間、約１４日間から約１８０日間、または約３０日間から約１８０日間安定である。

一部の実施形態では、製剤は、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントと、ＰｅｒＣＰ−シアニン（例えば、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）にコンジュゲートされた蛍光色素を含む標識された結合剤とを含む。一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアント、およびコンジュゲートされた蛍光色素のＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントは、同一の種から単離される。一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアント、およびコンジュゲートされた蛍光色素のＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントは、異なる種から単離される。一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアント、およびコンジュゲートされた蛍光色素のＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントは、構造的に異なる。一部の実施形態では、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアント、およびコンジュゲートされた蛍光色素のＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントは、構造的に同一である。

一部の実施形態では、蛍光色素は、ストレプトアビジンまたはアビジンにコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ストレプトアビジンにコンジュゲートされたＰｅｒＣＰまたはタンデムＰｅｒＣＰを含む標識された結合剤は、ビオチン化一次抗体と組み合わせて使用される。

別の実施形態では、本開示は、フローサイトメトリーを使用して試料を分析する方法を提供する。本方法は、分析試料を形成させるために、細胞を含む試料を、（ａ）結合部分およびコンジュゲートされた蛍光色素を含む少なくとも１つの標識された結合剤と、（ｂ）コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントとを含む製剤と接触させるステップと、フローサイトメトリーを使用して分析試料を分析するステップとを含む。一部の実施形態では、製剤は、少なくとも約０．１μｇ／ｍＬの総ＰｅｒＣＰ濃度を有する。

試料は、任意の細胞型または細胞調製物を含み得る。一部の実施形態では、試料は、細胞培養物である。一部の実施形態では、試料は、細胞懸濁液である。例えば、細胞懸濁液の細胞は、固形組織に由来し得る。

一部の実施形態では、試料は、血球を含む。一部の実施形態では、試料は、ヒト血球を含む。一部の実施形態では、試料は、リンパ球などの白血球を含む。一部の実施形態では、試料は、骨髄細胞を含む。一部の実施形態では、試料は、リンパ器官に由来する白血球（例えば、リンパ節または脾臓）を含む。一部の実施形態では、試料は、治療または診断の目的で使用される操作された細胞などの、操作された細胞を含む。一部の実施形態では、試料は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む。

一部の実施形態では、本方法はさらに、蛍光色素の蛍光発光に基づいて細胞組成物において細胞を選別することを含む。一部の実施形態では、本方法はさらに、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して細胞選別を行うことを含む。

一部の実施形態では、分析中の細胞は、代謝プロセスを阻止し、細胞質および核が結合剤にアクセスできるようにするために、固定され、次いで、少なくとも１つの標識された結合剤で染色される。

一部の実施形態では、標識された結合剤は、一次抗体を認識する二次抗体である。

本開示の本製剤および本方法は、高温で保管された場合に蛍光色素のシグナル強度が損なわれるという課題に対処する。本開示の製剤および方法は、様々な温度での製剤の取り扱いおよび保管を可能にする。一部の実施形態では、製剤は、少なくとも約１０℃の温度で試料と接触させられる。したがって、一部の実施形態では、製剤は、少なくとも約１０℃、少なくとも約１５℃、少なくとも約２０℃、少なくとも約２５℃、少なくとも約３０℃、少なくとも約３５℃、少なくとも約４０℃、または少なくとも約４０℃の温度で試料と接触させられる。

一部の実施形態では、本方法は、マルチカラーフローサイトメトリー方法である。

フローサイトメーターを操作するための方法、およびそのようにして得られたデータを分析するための方法は変更が可能であり、このような変更は本分野において既知であり、一般的である。

別の実施形態では、本開示は、フローサイトメトリーと共に使用され得る安定なビーズ製剤を提供する。安定なビーズ製剤は、（ａ）少なくとも１つのＰｅｒＣＰ標識されたまたはＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５標識されたビーズ、（ｂ）コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアント、および（ｃ）液体を含み、ここで、製剤は、少なくとも約０．１μｇ／ｍＬの総ＰｅｒＣＰ濃度を有する。一部の実施形態では、液体は、水性液体である。一部の実施形態では、液体は、有機溶媒である。一部の実施形態では、安定なビーズは、ＣａｌｉＢＲＩＴＥビーズである。一部の実施形態では、ビーズは、ラテックスビーズである。一部の実施形態では、ビーズは、ポリメタクリル酸メチルビーズである。一部の実施形態では、製剤は、アジ化物塩を含む。

別の実施形態では、本開示は、フローサイトメーターにおいて細胞を分析するためのキットを提供する。キットは、（ａ）結合部分およびコンジュゲートされた蛍光色素を含む少なくとも１つの標識された結合剤、ならびに（ｂ）コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントを含む。

一部の実施形態では、キットは、構成要素（ａ）および（ｂ）を別個の容器内に含む。したがって、一部の実施形態では、キットは、結合部分およびコンジュゲートされた蛍光色素を含む少なくとも１つの標識された結合剤を第１の容器内に、またコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントを第２の容器内に含む。

一部の実施形態では、キットはさらに、例えばフローサイトメトリーに適切な１つまたは複数のさらなる化合物を含む。一部の実施形態では、キットは、緩衝液、防腐剤、界面活性剤、またはその組み合わせを含む。一部の実施形態では、さらなる化合物は、同一または別個の容器内に提供される。

一部の実施形態では、キットは、キットの構成要素を使用するための指示を含む。一部の実施形態では、キットは、別個の構成要素を混合するための指示、構成要素および／または混合物のための適切な条件、および／または組成物を混合するための適切な器を含む。

一部の実施形態では、キットは、（ａ）結合部分およびコンジュゲートされた蛍光色素を含む少なくとも１つの標識された結合剤と、（ｂ）コンジュゲートされていないペリジニンクロロフィルタンパク質複合体またはその断片もしくはバリアントとを含む製剤を含む、「予め混合された」容器を含む。

［実施例１］
この実施例は、標識された結合剤の安定性に対する温度および保管の影響を示す。

ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５にコンジュゲートされた抗ＣＤ１９抗体（すなわち、抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＤＡＫＯ）の高温下での安定性を、高速の安定性試験を使用して調べた。健康なドナーの血液を、抗凝固性のＥＤＴＡの存在下で、抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５で染色した。１００μＬの血液アリコートを抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５と混合し、２〜８℃で、暗所で３０分間、インキュベートした。２ｍＬポーションのＦＡＣＳ ｌｙｓｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を血球組成物と混合し、１０分間、暗所にて、周囲温度でインキュベートした。処理した血球を３００×ｇで５分間、周囲温度で遠沈させた。上清を除去した。細胞を２ｍＬのＰＢＳ中で洗浄し、遠沈させ、０．４ｍＬのＰＢＳ中で再懸濁させた。試料を、Ｎａｖｉｏｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して分析した。細胞を、抗ＣＤ４５／パシフィックブルー（ＤＡＫＯ）で共染色した。リンパ球を、側方散乱／パシフィックブループロットでゲートした。

結果を、未処理細胞および抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５を用いて４℃で処理した細胞と比較した。細胞を、２４℃で７５、１３１、および１８７日間保管した２５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５溶液で処理した（図１Ｅ）。

実験のプロットを図１Ａ〜１Ｊで示す。図１Ａ〜１Ｅは、４℃または２４℃で、示された日数にわたり保管された抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５により処理された血液のフローサイトメトリー側方散乱プロットを示す。図１Ｇ〜１Ｊは、抗ＣＤ４５／パシフィックブルー散乱プロットでゲートされたリンパ球のヒストグラムを示す。図１Ｂおよび１Ｇで示すように、４℃で保管された抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５で細胞を処理すると、ヒストグラム上に、抗ＣＤ１９陽性リンパ球とＣＤ１９陰性リンパ球との良好な分離がある。図１Ｃおよび１Ｈは、一体となったピークによって証明されるように、抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５を２４℃で７５日間保管すると、ＣＤ１９陽性リンパ球およびＣＤ１９陰性リンパ球のピークの分離が不十分となることを示す。図１Ｄ、１Ｅ、１Ｉ、および１Ｊは、ＣＤ１９陽性リンパ球のピークがヒストグラムから消えていることを示す。この結果は、抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５が高温では長時間安定ではないことを示す。

［実施例２］
この実施例は、標識された結合剤の短時間の安定性に対する温度および濃度の影響を示す。

高温での抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５の安定性を、短時間の安定性試験を使用して調べた。実験の前に、ＤＡＫＯから入手した抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５および別の販売者から入手した抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５を、４℃および３７℃で２．５日間、２１５μｇ／ｍＬおよび２５μｇ／ｍＬの濃度で保管した。健康なドナーの血液を、保管された抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５で染色し、実施例１の手順を使用してフローサイトメトリーによって分析した。

リンパ球のヒストグラムを図２Ａ〜２Ｄに示し、図中、４℃および３７℃での実験で得られたシグナルは重なっている。図２Ｂおよび２Ｃは、蛍光強度の中央値が、希釈製剤（すなわち、２５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）とインキュベーションした後の方が、濃縮製剤よりも、すなわち、３７℃で濃縮製剤（２１５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）としてインキュベートし、フローサイトメトリーによる試験の直前に２５μｇ／ｍＬに希釈した場合よりも、大きく低下したことを示す。図２Ｄで示すように、別の販売者から入手した抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５でもシグナルの低下が観察され、このことは、観察された抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５の安定性がその入手元に依存するものではないことを示唆している。この結果は、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートの安定性が製剤の濃度に依存することを示す。

［実施例３］
この実施例は、本開示の実施形態に従った、様々な濃度のコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの存在下での、結合剤と単一の蛍光色素とのコンジュゲートおよび結合剤とタンデム蛍光色素とのコンジュゲートの安定性を示す。

コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの存在下での、抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５およびＰｅｒＣＰにコンジュゲートされた抗ＣＤ３抗体（すなわち、抗ＣＤ３／ＰｅｒＣＰ）の安定性を調べた。実験の前に、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの存在下で、抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（２５μｇ／ｍＬ）および抗ＣＤ３／ＰｅｒＣＰ（２５μｇ／ｍＬ）を、２週間、４℃および３７℃で保管した。コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰ（渦鞭藻綱の種（Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ ｓｐ．）から単離された、Ｐｒｏｚｙｍｅ Ｉｎｃ．から入手したＰｈｙｃｏＰｒｏ（商標）（ＰＢ４０））を、異なる濃度（すなわち、０、７５、１００、および２００μｇ／ｍＬ）で使用した。健康なドナーの血球を、保管した蛍光色素で別個に処理し、実施例１の手順を使用してフローサイトメトリーによって分析した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。

リンパ球のヒストグラムを図３Ａ〜３Ｈに示し、図中、４℃および３７℃で保管された製剤を使用した実験のシグナルは重なっている。図３Ａ〜３Ｄは、抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５で染色された血液のリンパ球のヒストグラムを示し、一方、図３Ｅ〜３Ｈは、抗ＣＤ３／ＰｅｒＣＰで染色された血液のリンパ球のヒストグラムを示す。

図３Ａで示すように、３７℃で保管された抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを使用すると、ＣＤ１９陽性リンパ球とＣＤ１９陰性リンパ球との間の分離は変化する。図３Ｅは、３７℃で保管された抗ＣＤ３／ＰｅｒＣＰコンジュゲートを使用すると、ＣＤ３陽性リンパ球のシグナルが消えたことを示す。しかし、図３Ｂおよび３Ｆで示すように、各蛍光色素を７５μｇ／ｍＬのコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの存在下で保管すると、抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５および抗ＣＤ３／ＰｅｒＣＰの両方で、ヒストグラムは、４℃および３７℃で類似していた。図３Ｃ、３Ｄ、３Ｇ、および３Ｈは、ＰｅｒＣＰの濃度を１００μｇ／ｍＬおよび２００μｇ／ｍＬに上昇させると、抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５および抗ＣＤ３／ＰｅｒＣＰの両方で安定性がさらに増大したことを示す。何らかの特定の理論に拘束されることは望まないが、抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５および抗ＣＤ３／ＰｅｒＣＰの両方がコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの存在下で安定性の増大を示すため、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰは、抗体−ＰｅｒＣＰコンジュゲートのＰｅｒＣＰタンパク質を安定化させる可能性が高いと考えられる。

［実施例４］
この実施例は、本開示の実施形態に従った、様々な濃度の標識された結合剤およびコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰを有する製剤の安定性を示す。

異なる濃度の抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５およびコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰ（渦鞭藻綱の種から単離された、Ｐｒｏｚｙｍｅ Ｉｎｃ．から入手したＰｈｙｃｏＰｒｏ（商標）（ＰＢ４０））を有する製剤の安定性を調べた。試験は、２人の異なるドナー（すなわち、ドナー１およびドナー２）の血液を使用して行った。実施例１で開示した手順を使用して、細胞を抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５で処理し、フローサイトメトリーを介して分析した。

抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５の運搬に対するコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの影響を、運搬シミュレーションを使用して調べた。運搬シミュレーションレジメでは、抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５の試料を−２０℃で１６〜２４時間凍結し、４℃で２〜８時間解凍し、−２０℃で１６〜２４時間凍結し、４℃で２〜８時間解凍し、３７℃で１６〜２４時間インキュベートし、そして２５℃で７日間インキュベートした。

リンパ球のヒストグラムを図４Ａ〜４Ｈに示す。図４Ａ〜４Ｄは、５０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５および１３０μｇ／ｍＬのコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰを使用した結果を示し、図４Ｅ〜４Ｈは、１２．５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５および３２．５μｇ／ｍＬのコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰを使用した結果を示す。この結果は、試験した製剤が高温で良好な安定性を有することを実証する。この結果はまた、試験した製剤が、周囲温度で輸送するために十分に安定であることを示唆する。

［実施例５］
この実施例は、本開示の実施形態に従った、様々な濃度の標識された結合剤およびコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰを有する製剤の安定性を示す。

ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５にコンジュゲートされた抗ＣＤ３４抗体（すなわち、抗ＣＤ３４／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）の高温下での安定性を調べた。実験の前に、抗ＣＤ３４／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５製剤を、４℃または３７℃で３日間、保管した。抗ＣＤ３４／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５を、７０％ＫＧ１ａ（ＣＤ３４陽性）細胞および３０％Ｕ９３７（ＣＤ３４陰性）細胞の細胞懸濁液の表面染色に使用した。抗ＣＤ３４／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、５０μｇ／ｍＬおよび１２．５μｇ／ｍＬの濃度で、それぞれ１３０μｇ／ｍＬおよび３２．５μｇ／ｍＬのコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰ（渦鞭藻綱の種から単離された、Ｐｒｏｚｙｍｅ Ｉｎｃ．から入手したＰｈｙｃｏＰｒｏ（商標）（ＰＢ４０））の存在下で（＋ＰｅｒＣＰ）、またはコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの非存在下で（−ＰｅｒＣＰ）試験した。各試料について、１００万個の細胞を含有する１００μＬの細胞懸濁液を製剤と混合し、３０分間、２〜８℃で、暗所で染色した。２ｍＬのＦＡＣＳ ｌｙｓｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加した。試料を混合し、１０分間、周囲温度で、暗所でインキュベートした。細胞を５分間、３００×ｇで、周囲温度で遠沈させた。上清を除去し、細胞を２ｍＬのＰＢＳ中で１回洗浄し、遠沈させ、そして、０．４ｍＬのＰＢＳ中で再懸濁させた。試料をＮａｖｉｏｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）に供した。各実験をさらに３回繰り返した。

実験のヒストグラムを図５Ａ〜６Ｈに示す。コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰを有しない製剤で染色したＣＤ３４陽性細胞で、蛍光強度の中央値が低下した。逆に、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの存在下で、抗ＣＤ３４／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５で染色した細胞は、製剤を４℃および３７℃で保管しても、類似のヒストグラムとなる。この結果は、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰが抗ＣＤ３４／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５の安定性を増大させることを実証する。

［実施例６］
この実施例は、本開示の実施形態に従った、様々な濃度の標識された結合剤およびコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰを有する製剤の安定性を示す。

ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５にコンジュゲートされた抗ＭＰＯ抗体（すなわち、抗ＭＰＯ／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）の高温下での安定性を調べた。抗ＭＰＯ／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５を使用して、４人の健康なドナーの血液を染色した。抗ＭＰＯ／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、５０μｇ／ｍＬおよび１２．５μｇ／ｍＬの濃度で、１３０μｇ／ｍＬのコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰ（渦鞭藻綱の種から単離された、Ｐｒｏｚｙｍｅ Ｉｎｃ．から入手したＰｈｙｃｏＰｒｏ（商標）（ＰＢ４０））の存在下で（＋ＰｅｒＣＰ）、またはコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの非存在下で（−ＰｅｒＣＰ）試験した。使用する前に、試薬を、４℃または３７℃で３日間、５０μｇ／ｍＬの濃度で、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰとともに、または、ＰｅｒＣＰ無しで保管した。各試料について、血液を、細胞内染色手順を使用して染色した。各試料について、５０μＬの血液を１００μＬのＩｎｔｒａＳｔａｉｎ試薬Ａ（ＤＡＫＯ）と混合し、１５分間、周囲温度で固定した。ＥＧＴＡを抗凝固剤として使用した。２ｍＬのＰＢＳを添加し、細胞を３００×ｇで５分間、周囲温度で遠沈させた。上清を除去した。細胞を再懸濁させ、原形質膜を１００μＬのＩｎｔｒａＳｔａｉｎ試薬Ｂ（ＤＡＫＯ）で透過処理した。染色製剤を添加し、細胞を１５分間、周囲温度で、暗所でインキュベートした。２ｍＬのＰＢＳを添加し、細胞を遠沈させ、０．４ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させ、そしてＮａｖｉｏｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。細胞をＣＤ４５／パシフィックブルー（ＤＡＫＯ）で共染色し、顆粒球を、側方散乱／パシフィックブループロットでゲートした。

顆粒球の実験のヒストグラムを図７Ａ〜８Ｈに示し、図中、４℃および３７℃の製剤についての実験のシグナルは重なっている。４つのドナー試料は、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰを有しない製剤で染色したＭＰＯ陽性細胞について、蛍光強度の中央値の低下を示した。逆に、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの存在下で、抗ＭＰＯ／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５で染色した細胞は、４℃および３７℃で保管された製剤で類似のヒストグラムとなった。結果は、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰが抗ＭＰＯ／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５の安定性を増大させることを実証する。

［実施例７］
この実施例は、本開示の実施形態に従った、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰ断片またはそのバリアントを使用するための手順を示す。

ＰｅｒＣＰの天然のバリアントおよび断片は、褐虫藻（Ｚｏｏｘａｎｔｈｅｌｌａｅ）（シャコガイ属の種）、アンフィディニウム・カルテレ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｃａｒｔｅｒａｅ）（プリマス４５０）、カコニア・ニエイ（Ｃａｃｈｏｎｉｎａ ｎｉｅｉ）、ゴニオラックス・ポリエドラ（Ｇｏｎｙａｕｌａｘ ｐｏｌｙｅｄｒａ）、グレノジニウム（Ｇｌｅｎｏｄｉｎｉｕｍ）の種、アンフィジニウム・ライノセファレイウム（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｒｈｙｎｏｃｅｐｈａｌｅｉｕｍ）、およびギムノディニウム・スプレンデンス（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ ｓｐｌｅｎｄｅｎｓ）を含む様々な生物の抽出物から単離することができる。例えば、多様なアミノ酸配列を有するＰｅｒＣＰ複合体を、アンフィディニウム・カルテレなどの渦鞭毛藻で見出すことができる。ＰｅｒＣＰバリアントはまた、参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈｕｌｔｅら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１０、８９、９９０−９９７）において記載されているように、インビトロでの再構成系を使用して生産することができる。一部の実施形態では、ＰｅｒＣＰの断片は、タンパク質修飾（例えば、ＰｅｒＣＰタンパク質のタンパク質分解性の修飾）のための化学的または酵素的方法を使用して作製することができる。一部の実施形態では、ＰｅｒＣＰの断片またはバリアントは、ＰｅｒＣＰタンパク質の断片またはバリアントをコードするようにＰｅｒＣＰのＤＮＡ配列を変化させるための標準的な遺伝子工学技術を使用することによって作製することができる。例えば、一部の実施形態では、ＰｅｒＣＰの断片またはバリアントの発現をコードする修飾された配列は、インビトロでの合成、例えば、化学的ＤＮＡ合成または酵素介在性のＤＮＡ合成を使用して作製することができる。ＰｅｒＣＰの断片をコードする配列は、所望の断片を生成するために選択された増幅プライマーを使用することによって酵素的に作製することができる。一部の実施形態では、突然変異生成または所望の突然変異を含有するプライマーでの増幅を使用して、バリアントタンパク質を生成することができる。一部の実施形態では、ＰｅｒＣＰの断片またはバリアントは、参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｍｉｌｌｅｒら（Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５、８６、２２９−２４０）によって記載されているような、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの組換え発現のための非藻類宿主を使用して作製することができる。一部の実施形態では、ＰｅｒＣＰの断片またはバリアントは、標準的な遺伝子工学技術を使用して作製することができる。結合剤の安定性に対するＰｅｒＣＰ断片またはバリアントの影響は、本明細書において記載される方法のいずれかを使用して評価することができる。

製剤は、結合部分およびコンジュゲートされた蛍光色素を含む１つまたは複数の標識された結合剤と、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰ断片またはバリアントとを組み合わせることによって形成させることができる。例えば、抗ＣＤ１９／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５は、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰ断片またはバリアントと組み合わせることができる。ＰｅｒＣＰ断片またはバリアントは任意の適切な濃度で使用することができる。例えば、製剤は、ＰｅｒＣＰ断片またはバリアントを約２５μｇ／ｍＬから１５０μｇ／ｍＬの濃度で含み得る。製剤は、形成の直後に使用しても、長期間にわたり保管してもよい。例えば、製剤は、最長１８０日間、保管することができる。製剤は、使用の前に、任意の適切な温度で保管することができる。例えば、製剤は、使用の前に、約４℃を上回る温度（例えば、約４℃から約４０℃）で保管することができる。

コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰ断片またはバリアントと１つまたは複数の標識された結合剤とを含む製剤は、任意の適切な分析プロセスにおいて使用することができる。例えば、製剤は、フローサイトメトリー方法において使用することができる。このようなケースでは、１つまたは複数の細胞を含む試料を、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰ断片またはバリアントと１つまたは複数の標識された結合剤とを含む製剤と接触させる。分析試料は、フローサイトメトリーを使用して分析する。例えば、細胞懸濁液を、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰ断片またはバリアントと１つまたは複数の標識された結合剤とを含む製剤と接触させ、その後、細胞を染色する。溶解溶液を分析試料に添加してもよく、分析試料がインキュベートされ得る。分析試料はフローサイトメーターでランされ得、細胞の１つまたは複数のパラメータに関する情報またはデータを提供するヒストグラムが生成される。

［実施例８］
この実施例は、本開示の実施形態に従った、様々な濃度の標識された結合剤およびコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰを有する製剤の安定性を示す。

血液を、様々な濃度のポリクローナルＦ（ａｂ’）２ウサギ抗ヒトラムダ軽鎖／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、およびＣＤ１９／ＦＩＴＣ試薬で染色した。リンパ球をまず、前方／側方散乱ドットプロット上でゲートした。Ｂ細胞を、ＦＩＴＣ／側方散乱ドットプロット上でＣＤ１９陽性リンパ球としてゲートした。図９は、Ｂ細胞のＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５ヒストグラムを示す。

図９Ａ〜９Ｈは、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの非存在下および存在下での、蛍光色素ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５とコンジュゲートしたポリクローナルＦ（ａｂ’）２ウサギ抗ヒトラムダ軽鎖を含むポリクローナルＦ（ａｂ’）２ウサギ抗ヒトラムダ軽鎖／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５を含む製剤の安定性試験についてのフローサイトメトリーのデータを示すヒストグラムである。ポリクローナルＦ（ａｂ’）２ウサギ抗ヒトラムダ軽鎖／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、１５０μｇ／ｍＬ（図９Ａおよび９Ｅ）、７５μｇ／ｍＬ（図９Ｂおよび９Ｆ）、３７．５μｇ／ｍＬ（図９Ｃおよび９Ｇ）、ならびに１８．６μｇ／ｍＬ（図９Ｄおよび９Ｈ）の濃度で試験した。ポリクローナルＦ（ａｂ’）２ウサギ抗ヒトラムダ軽鎖／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、遊離ＰｅｒＣＰとともに（図９Ａ〜Ｄ）、および９μｇ／ｍＬの遊離ＰｅｒＣＰとともに（図９Ｅ〜９Ｈ）試験した。ポリクローナルＦ（ａｂ’）２ウサギ抗ヒトラムダ軽鎖／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、３日間、３７℃でインキュベートし（明るい方の灰色）、４℃で保管された参照（暗い方の灰色）と比較した。９０μｇ／ｍＬの遊離ＰｅｒＣＰを添加した試薬（図９Ｅ〜９Ｈ）の安定性は、３７℃で、遊離ＰｅｒＣＰを添加していない試薬（図９Ａ〜９Ｄ）よりも高い。

［実施例９］
この実施例は、本開示の実施形態に従った、様々な濃度の標識された結合剤およびコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰを有する製剤の安定性を示す。

血液を、様々な濃度のマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ２２／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（アイソタイプＩｇＧ１カッパ）試薬で染色した。リンパ球を、前方／側方散乱ドットプロット上でゲートした。図１０は、４℃の参照（暗い方の灰色）または３７℃で３日間保管した試薬（明るい方の灰色）のいずれかの、マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ２２／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（アイソタイプＩｇＧ１カッパ）で染色した血液で得られた、リンパ球のＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５ヒストグラムを含む。試薬は、遊離ＰｅｒＣＰを添加していないか（図１０Ａ〜１０Ｄ）、または１３０μｇ／ｍＬの遊離ＰｅｒＣＰを含有していた（図１０Ｅ〜１０Ｈ）。

図１０Ａ〜１０Ｈは、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの非存在下および存在下での、蛍光色素ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５とコンジュゲートしたマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ２２を含むマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ２２／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（アイソタイプＩｇＧ１カッパ）を含む製剤の安定性試験についてのフローサイトメトリーのデータを示すヒストグラムである。マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ２２／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、１００μｇ／ｍＬ（図１０Ａおよび１０Ｅ）、５０μｇ／ｍＬ（図１０Ｂおよび１０Ｆ）、２５μｇ／ｍＬ（図１０Ｃおよび１０Ｇ）、ならびに１２．５μｇ／ｍＬ（図１０Ｄおよび１０Ｈ）の濃度で試験した。マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ２２／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、遊離ＰｅｒＣＰ無しで（図１０Ａ〜１０Ｄ）、および１３０μｇ／ｍＬの遊離ＰｅｒＣＰとともに（図１０Ｅ〜１０Ｈ）試験した。マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ２２／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、３日間、３７℃でインキュベートし（明るい方の灰色）、４℃で保管された参照（暗い方の灰色）と比較した。１３０μｇ／ｍＬの遊離ＰｅｒＣＰを添加した試薬（図１０Ｅ〜１０Ｈ）の安定性は、３７℃で、遊離ＰｅｒＣＰを添加していない試薬（図１０Ａ〜１０Ｄ）よりも高い。

［実施例１０］
この実施例は、本開示の実施形態に従った、様々な濃度の標識された結合剤およびコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰを有する製剤の安定性を示す。

ＨＰＢ−ＡＬＬ（ＣＤ１ａ陽性）細胞およびＤａｕｄｉ（ＣＤ１ａ陰性）細胞の混合物を、様々な濃度のマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ１ａ／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５で染色した。細胞を、前方散乱／側方散乱ドットプロット上でゲートし、側方散乱（Ｈ）／側方散乱（Ａ）プロット上でシングレットとしてさらにゲートした。染色手順の前に、試薬を３日間、３７℃で保管し（明るい方の灰色）、参照試薬は４℃で保管した（暗い方の灰色）。試薬は、遊離ＰｅｒＣＰを添加していないか（図１１Ａ〜１１Ｄ）、または１３０μｇ／ｍＬの遊離ＰｅｒＣＰを含有していた（図１１Ｅ〜１１Ｈ）。

図１１Ａ〜１１Ｈは、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの非存在下および存在下での、蛍光色素ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５とコンジュゲートしたマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ１ａを含むマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ１ａ／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（アイソタイプはＩｇＧ２ａカッパである）を含む製剤の安定性試験についてのフローサイトメトリーのデータを示すヒストグラムである。マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ１ａ／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、１００μｇ／ｍＬ（図１１Ａおよび１１Ｅ）、５０μｇ／ｍＬ（図１１Ｂおよび１１Ｆ）、２５μｇ／ｍＬ（図１１Ｃおよび１１Ｇ）、ならびに１２．５μｇ／ｍＬ（図１１Ｄおよび１１Ｈ）の濃度で試験した。マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ１ａ／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、遊離ＰｅｒＣＰ無しで（図１１Ａ〜１１Ｄ）および１３０μｇ／ｍＬの遊離ＰｅｒＣＰとともに（図１１Ｅ〜１１Ｈ）試験した。マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ１ａ／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、３日間、３７℃でインキュベートし（明るい方の灰色）、４℃で保管された参照（暗い方の灰色）と比較した。１３０μｇ／ｍＬの遊離ＰｅｒＣＰを添加した試薬（図１１Ｅ〜１１Ｈ）の安定性は、３７℃で、遊離ＰｅｒＣＰを添加していない試薬（図１１Ａ〜１１Ｄ）よりも高い。

［実施例１１］
この実施例は、本開示の実施形態に従った、様々な濃度の標識された結合剤およびコンジュゲートされていないＰｅｒＣＰを有する製剤の安定性を示す。

血液を、様々な濃度のマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ７／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５試薬で染色した。リンパ球を、前方／側方散乱ドットプロット上でゲートした。図１２は、４℃の参照（暗い方の灰色）または３７℃で３日間保管した試薬（明るい方の灰色）のいずれかの、マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ７／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５で染色したリンパ球のＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５ヒストグラムを含む。試薬は、遊離ＰｅｒＣＰを添加していないか（図１２Ａ〜１２Ｄ）、または１３０μｇ／ｍＬの遊離ＰｅｒＣＰを含有していた（図１２Ｅ〜１２Ｈ）。

図１２Ａ〜１２Ｈは、コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰの非存在下および存在下での、蛍光色素ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５とコンジュゲートしたマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ７を含むマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ７／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（アイソタイプはＩｇＧ２ｂカッパである）を含む製剤の安定性試験についてのフローサイトメトリーのデータを示すヒストグラムである。マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ７／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、１００μｇ／ｍＬ（図１２Ａおよび１２Ｅ）、５０μｇ／ｍＬ（図１２Ｂおよび１２Ｆ）、２５μｇ／ｍＬ（図１２Ｃおよび１２Ｇ）、ならびに１２．５μｇ／ｍＬ（図１２Ｄおよび１２Ｈ）の濃度で試験した。マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ７／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、遊離ＰｅｒＣＰ無しで（図１２Ａ〜１２Ｄ）および１３０μｇ／ｍＬの遊離ＰｅｒＣＰとともに（図１２Ｅ〜１２Ｈ）試験した。マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ７／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートを、３日間、３７℃でインキュベートし（明るい方の灰色）、４℃で保管された参照（暗い方の灰色）と比較した。１３０μｇ／ｍＬの遊離ＰｅｒＣＰを添加した試薬（図１１Ｅ〜１１Ｈ）の安定性は、３７℃で、遊離ＰｅｒＣＰを添加していない試薬（図１１Ａ〜１１Ｄ）よりも高い。

Claims (23)

1. （ａ）結合部分およびコンジュゲートされた蛍光色素を含む、少なくとも１つの標識された結合剤、ならびに（ｂ）コンジュゲートされていないペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）またはその断片もしくはバリアントを含む安定な製剤であって、少なくとも約０．１μｇ／ｍＬの総ＰｅｒＣＰ濃度を有する製剤。
2. 前記コンジュゲートされた蛍光色素がＰｅｒＣＰタンデム蛍光色素である、請求項１に記載の製剤。
3. 前記コンジュゲートされた蛍光色素がペリジニンクロロフィルタンパク質−シアニン５．５（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）である、請求項２に記載の製剤。
4. 前記コンジュゲートされた蛍光色素がＰｅｒＣＰである、請求項１に記載の製剤。
5. 前記コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントが、少なくとも約５０μｇ／ｍＬの濃度である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製剤。
6. 前記標識された結合剤が、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ３４抗体または抗ＭＰＯ抗体を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製剤。
7. 前記標識された結合剤に対する、前記コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの比が、少なくとも約２：１である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製剤。
8. 前記コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰが完全長ＰｅｒＣＰである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製剤。
9. 前記コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントが、別の化学的部分に付着も結合もしていないペリジニンクロロフィルタンパク質複合体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製剤。
10. コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントを有しない製剤よりも、優れた安定性を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の製剤。
11. 前記製剤の蛍光強度が、約２０℃の温度において、約１日間から約１８０日間で約２５％以下の変化を示す、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製剤。
12. コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの存在下での前記標識された結合剤が、前記製剤の温度が少なくとも約１０℃、３５〜１５０日間かけて上昇する場合、約２５％以下の蛍光強度の変化を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の製剤。
13. 分析試料を形成させるために、細胞を含む試料を、（ａ）結合部分およびコンジュゲートされた蛍光色素を含む少なくとも１つの標識された結合剤と（ｂ）コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントとを含む製剤と接触させるステップと、フローサイトメトリーを使用して分析試料を分析するステップとを含む、フローサイトメトリーを使用して試料を分析する方法であって、前記製剤が、少なくとも約０．１μｇ／ｍＬの総ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）濃度を有する、方法。
14. 前記コンジュゲートされた蛍光色素がＰｅｒＣＰタンデム蛍光色素である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記コンジュゲートされた蛍光色素がペリジニンクロロフィルタンパク質−シアニン５．５（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記コンジュゲートされた蛍光色素がＰｅｒＣＰである、請求項１３に記載の方法。
17. 前記製剤が、少なくとも約７５μｇ／ｍＬのＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントの総濃度を有する、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 蛍光色素の蛍光発光に基づいて細胞組成物において細胞を選別することをさらに含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記標識された結合剤が、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ３４抗体または抗ＭＰＯ抗体を含む、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記細胞がヒト血球である、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記接触が少なくとも約２０℃の温度で行われる、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の方法。
22. （ａ）結合部分およびコンジュゲートされた蛍光色素を含む少なくとも１つの標識された結合剤、ならびに（ｂ）コンジュゲートされていないＰｅｒＣＰまたはその断片もしくはバリアントを含むキット。
23. 前記コンジュゲートされた蛍光色素がペリジニンクロロフィルタンパク質−シアニン５．５（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）であり、前記キットが少なくとも約２０℃の温度で保管される、請求項２２に記載のキット。